JPH04500527A - 生物活性を有する分子の小粒子の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 生物活性を有する分子の小粒子の製造方法発明の背景 本発明は、超音波エネルギーを用いて低温度で生物学的分子の粒子を製造する方 法に関する。

物質の安定かつ均一な分散が必要とされる。制御された薬物の送達などの用途に 用いるため、生物活性を有するタンパクなどの分子を高分子マトリックス中に取 り入れることが望ましい場合が多い。特に、タンパクのような生物活性を有する 物質の粒径を小さくすることは、製剤設計において重要な事柄である。

例えば、制御された薬物送達系に用いられる注射用高分子微小球を調製する際、 その微小球は、直径が５０μｎ］以下でなければならない。薬物粒子を、微小球 のマトリックス全体に均一に分散させるには、薬物粒子の直径が微小球自体の直 径より著しく小さくなければならない。このような系に充填される粒子の直径が 小さいとより望ましい放出機構が得られ。

これらの系ではよくみられることであるが最初に多量の薬物が放出されること〔 バースト効果（ｂｕｒｓｔ　ｅｆｆｅｃｔ）　］をなくする働きをする。薬物送 達制御手段中の生物学的分子の粒径を制御することによって、　Ｂｒｏｗｎら、 　”Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｒｅ１ｅａｓｅｏｆ　Ｉｎ５ｕｌｉｎ　ｆｒｏｍ　 Ｐｏｌｙｍｅｒ　Ｍａｔｒｉｃｅｓ″、旧ａｂｅｔｅｓ、　３５巻、６８４−６ ９１頁、　１９８６年、に記載されているように、これらの系からの薬物の放出 速度を変えることもできる。

薬剤の用途に用いられる化合物の最も小さな粒子は、噴霧乾煙、粉砕、すり砕き および凍結乾燥およびふるい分けのような従来の手法を用いて調製される。これ らの各手法によれば１問題の物質の粒径を小さくすることができるが、その直径 は微小球放出制御系用には充分に小さくない場合が多い。

またこれらの方法には他の欠点もある。噴霧乾燥法によれば粒径を５μｍ以下に 小さくすることができるが、生物活性を有するタンパクは７その工程において不 活性化し得る。これは、水と空気との界面における変性、および溶媒を蒸発させ るために生じる熱にさらされるためである。また噴霧乾燥法は、効率が悪く、装 置の広い表面に物質が付着することによって多量の物質が失われる。

粉砕およびすり砕き法によれば直径が５μｍにすぎない粒子を製造し得るが、多 くの粒子は粒径が著しく大きい。粉砕およびすり砕き法はともに多量の物質を必 要とするので、これらの方法は、少量でしか得られないことが多い高価な生物活 性を有するタンパクにはあまり適用できない。粉砕およびすり砕き法はまたタン パクを変性させ得る。凍結乾燥した粉末をふるい分けする方法は１粒径が約７０ μｍ以上にもなる。

それゆえ２本発明の目的は、生物学的分子の小粒子を製造する方法を提供するこ とにある。

本発明の他の目的は、生物活性を有する物質の放出を制御するための高分子マｌ −ＩＪフックス中均一に分散させ得る生物活性を有−４る分子の粒子を提供する こ古にある。

直径が約０，１〜ｌＯμ■】の範囲にあり、もとの生物学活性の７０〜９５％を 越える活性を保持する生物活性を有する分子の小粒子を製造する方法であって、 生物活性を有する分子の粒子の収率が８０％以」−である方法。この方法は、タ ンパクのような巨人性ｔ、またはステ１１イド、アミノ酸もしくは合成薬物のよ うな９Ｌり小さな分子を包含する生物活性を有する分子の調製物の粒径を、該分 子の活性を保持しながら小さくするのに利用され得る。またこの方法は、糖類の ような生物活性を持たない他の分子、またこれらの分子とタンパクとの混合物の 粒径を小さくするのにも利用され得る。

これらの化合物の粒径を小さくする方法には２つの主要な工程がある。第１工程 では１問題の分子を溶媒に溶解し、低温の液化ガス中に噴霧する。次に液化ガス を蒸発させると。

溶媒と問題の物質とを含有する凍結球形粒子が残留する。凍結乾燥によっで凍結 球形粒子から溶媒を除去すると１粒径が１０〜６０μｍの範囲の多孔性球体が生 成する。これらの粒子は。

大きい粒子が望ましい場合にはそのまま使用され得るが、一方、小粒」′・が望 ましい場合には、非溶媒中に懸濁させ、超音波エネルギーまたは他の機械的な力 に暴露して９球体を破壊して約０．１〜１０μｍの範囲の直径を有する小粒子に することができる。この多孔性球状粒子もしくは小粒子は、ポリマーもしくは薬 学的担体の溶媒溶液中に懸濁させ、薬物放出系に用いるため封入される。なぜな ら、これらの粒子は７マトリツクス全体に均一に分散され、再現性があり制御可 能な放出機構が得られるからである。

第１図は１本発明の方法により、生物学的分子の多孔性球体が生成するのを示す 概略図である。

第２図は９本発明の方法により、第１図の多孔性球体から生物学的分子の小粒子 が生成するのを示す概略図である。

第３図は１本発明の方法を用いて得られた。セイヨウワサビペルオキシダーゼの 粒径（μｍ）と超音波処理時間（秒）との関係を示すグラフである。

第４図は１本発明の方法を用いて、デキストラン粒子を調製したときの、デキス トラン粒子の平均粒径（μｍ）とデキストランの溶液中の濃度（％、　Ｗ／Ｖ） との関係を示すグラフである。

第５図は、新鮮なヘモグロビン、本発明の粒径減少法により処理したヘモグロビ ン、および６Ｍ塩酸グアニジン中で変性させたヘモグロビンの、波長に対する。

吸光度の２次導関数のスペクトルを示す。

発明の詳細な説明 生物学的分子の小粒子を形成するための従来法の多くは。

直径の大きな粒子を生じさせていくらかの物質を損失することになるか、または 生物活性を著しく失うがである。これに対して２本発明の方法によれば、出発物 質の８０％以上が保持されるだけでなく、もとの生物活性の７０％を越える活性 ９通常はもとの生物学的活性の９０〜９５％を越える活性を保持しながら、生物 学的分子の粒子の大きさが小さくなる。

この方法に使用され得る物質としては、タンパク、天然もしくは合成の多糖類お よび糖類のような炭水化物、ヌクレオチド類、ならびに高範囲の分子量を有する その他の生物活性を有する無機および有機の分子がある。生物学的に有用なポリ ペプチドの代表的な例としては、特に、核タンパク類、糖タンパク類およびリポ タンパク類が含まれる。次のような多くのタンパク群が本発明の方法に用いられ るのに適切である：抗体類；酵素類；ホルモン活性を有するポリペプチド類；リ ンホカイン、モノカインおよびサイトカインのような免疫調節物質類；成長調節 タンパク類；血液タンパク類；ならびにウィルス、細菌および寄生虫のワクチン 用の抗原。本発明の方法に使用され得る他の生物学的分子の例には、ステロイド 類、脂質類９合成および天然の薬物ならびにアミノ酸が含まれる。

本発明の方法は、第１図および第２図に概略図として示される。

第１図に示すように、生物活性を有する分子をまず溶媒に溶解させて、約０．１ 〜２５％（Ｗ／Ｖ）の範囲の濃度の溶液１０を調製する。その溶媒は凍結乾燥す ることができるものでなければならない。溶媒は純水でもよく、または特定のｐ Ｈもしくはイオン強度に緩衝化されていてもよい。溶媒は有機溶媒であってもよ い。溶液は、単一の種類の分子、２種以上の分子の混合物、生物活性を有する分 子と安定剤との混合物、またはそれらの組合わせを含有していてもよい。ある分 子の粒径を著しく小さくするためには、その分子は、溶媒のみならず緩衝剤の塩 が凍結乾燥条件下で揮発性である媒体中にＵ濁させねばならない。凍結乾燥によ って除去される揮発性の緩衝剤の例には、炭酸水素アンモニウムなどのアンモニ ウム塩が含まれる。

次に溶液１０は噴霧され、生成した液滴は、超音波ノズル圧力ノズル、空気圧ノ ズルおよび回転ノズルのようないくつかのデバイダ１４のいずれか１つを用いて 、低温の液化ガス１２中に噴霧される。液化ガス１２は、液体アルゴン（−１８ ５，６℃）。

液体窒素（−１９５，８℃）、液体酸素（−１８２，９℃）、または噴霧粒子を 直ちに凍結させて凍結粒子１５にするようなその他の液体ガスであり得る。

これらの液滴は、低温の液化ガスに入ると直ちに凍結する。

液化ガス１２は、溶媒が凍結したままの温度で蒸発させることによって除去され 、溶媒と生物活性を有する分子との凍結液滴１６が残る。凍結した溶媒は、凍結 乾燥することにより液滴１６から除去させ、多孔質の球体１８が生じる。これら の球体は、その噴霧に用いられる技術によって直径を変えることができるが、一 般に約１０〜９０μｍの範囲にある。

この技術はタンパクに対して特に有用である。揮発性の緩衝塩を用いると、タン パクを含有する溶液の凍結球体を凍結乾燥した後に残る唯一の個体はタンパク自 体である。もともと揮発性緩衝剤が占めていた空間に空隙が残る。これらの空隙 によって、タンパク含有粒子の粘着性が最小になり、タンパク粒子を小片に破砕 することができる。

（以下余白） 多孔性球体１８は、いくぶん大きな粒径が望ましい場合には。

さらに処理することなく使用され得る。この多孔性球体は。

高分子薬物放出処方物を調製するのに有用である。球体１８が溶解しないポリマ ー／溶媒系に球体を懸濁させた場合には。

球体１８の安定な懸濁液２２が得られる。多孔性球体を懸濁させるのに使用され 得る非溶媒の選択は、ポリマー／溶媒系のみならず球体を形成する分子の性質に よっても決まる。タンパクに対する非溶媒の例は、アセトン、酢酸エチル、塩化 メチレン、クロロホルムおよびテトラ１ドロフランである。多孔性球体の非溶媒 は、該ポリマーに対しては溶媒でなければならない。タンパクが溶解しないポリ マー／溶媒の溶液の例には、ポリ　（乳酸）／塩化メチレン、ポリ　（乳酸−グ リコール酸）　（ｐｏｌｙ（ｌａｃｔｉｃ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｃ　ａｃｉｄ ）　］　／酢酸エチル、おヨヒエチレンー酢酸ビニルコポリマー／塩化メチレン がある。

このような懸濁液は、注射用の微小球体もしくは移植用マトリックスの形態の放 出制御系とすることができる。これらの系は生体侵食性であっても・非侵食性で あってもよい。

また多孔性粒子は、投薬用のエリキシル剤、肺もしくは鼻上皮へ送達するための エアロゾル噴霧剤、坐剤１錠剤および経皮放出系にも取り入れることができる。

第２図に示すように、多孔性球体１８のサイズは１球体１８を。

エタノール、アセトン、塩化メチレンもしくは酢酸エチル。

または該分子が溶解しない他の溶媒のような非溶媒２０に球体１８を懸濁させる ことによりさらに小さくされる。懸濁液２２は。

超音波エネルギー、またはホモジナイゼーションのようなその他の分散エネルギ ー源に、冷却を続けながら種々の時間。

暴露されて多孔性球体が粉砕される。一般に、所定の直径の粒子を製造するのに 必要なエネルギーを超えたエネルギーを粒子に与えることは望ましくない。懸濁 液２２が超音波エネルギーに暴露される時間が長い程１粒子２４の大きさは小さ くなる。この方法によれば１球体１８の大きさが小さくなり、直径が約０．１〜 １０μｍの範囲の粒子２４が得られる。

粒子を構成する分子の非溶媒であり、かつ特定のポリマーの溶媒であるものを選 択することにより、この工程を変化させて、ポリマー溶液による小粒子の均一な 分散液を調製し。

次にその粒子をポリマーマトリックス内に封入もしくはカプセル化することがで きる。

次に粒子２４は、ａｉ過、遠心分離またはふるい分けのような当業者に既知の従 来の方法により、超音波処理懸濁液２６から取り出される。その粒子がポリマー ／溶媒系で大きさが小さくなったならば、当業者に既知の方法を用いて、微小球 のようなデバイスに成形するか、または錠剤、エリキシル剤、エアロゾル噴霧剤 、坐剤もしくは経皮デバイスに加工され得る。

本発明は、下記の実施例によってさらに理解されるであろう。これらの実施例は 本発明を限定するものではない。

実施例１：超音波処理時間の関数としての、５μｍ未満の直径を有する西洋ワサ ビペルオキシダーゼ粒子の製造酵素である西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ ）　（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、米国、ミズリー州、セントルイ ス）の２５０　ｍｇの試料を、ｐｌ（が７，２の０．０５１　ＩＪン酸緩衝液１ ０ｍｆｆに溶解させた。

その溶液を、超音波ノズル（ＳｏｎｏＴｅｋ　Ｃｏｒｐ、、　８７００−６０Ｍ Ｓ型）により、攪拌中の液体窒素の容器内に噴霧した。次に、凍結した噴霧球体 を含有する液体窒素を、−８０℃の凍結室内に。

液体窒素が蒸発するまで約１〜２時凹入れた。次に凍結タンパク球を、少なくと も１２時間、凍結乾燥機（Ｖｉｒｔｉｓ　ＣｏｍｐａｎｙＩｎｃ、、　１０−Ｍ Ｒ−ＴＲ型）に入れて多孔性粒子を調製した。凍結乾燥後、　ｆｌＲＰ球の直径 を光学顕微鏡で測定して、２５〜３５μｍであることがわかった。

凍結乾燥した微小球の５０ｍｇの試料を、５ｍ１．の１．００％エタノール溶液 に懸濁させ、氷水洛中で０℃に冷却した。冷却を続けながら、　ＨＲＰ多孔性粒 子は、各種の時間、超音波プローブ（Ｖｉｒｔｉｓ　Ｃｏｍｐａｎｙ　Ｉｎｃ、 、　Ｖｉｒｓｏｎｉｃ　３００）に暴露した。試料は。

粒子径をＭｉｃｒｏｔｒａｃ　Ｍｏｄｅｌ　７９９５　Ｓｍａｌｌ　Ｐａｒｔｉ ｃｌｅ　Ａｎａｌｙｚｅｒ　（１、ｅｅｄｓ　ａｎｄ　Ｎｏｒｔｈｒｕｐ）で測 定した。第３図は、超音波処理の時間の関数としてプロットされた平均粒径（粒 子のサイズ）を示す。粒径は、１００秒後には５μｍ未満に低下する。

ＨＲＰの活性を、凍結乾燥工程と超音波処理工程の後に測定した。酵素活性を測 定するのに使用した方法は、　ｐ−アニシジＥｎｚｙｍｅ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｗ ｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ、　０．０．編集、　Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ　Ｂｉｏｃ ｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐ、、米国、ニューシャーシー州、フリーホールド、２ ５４頁、　１９８８年、に記載されている。）ＩＲＰは９粒径減少ゾＬ）セスの 各工程の後、そのも古の活性の９０％以−ＬＧ保持しでｊ）す１、これＨ，Ｉ粒 径減少プロセスがＩＩＲＰの活性に最小限度の影ｗｊ、か与えないこ古を示しで いる５゜の製造 ｐＨ５，２の１．０５Ｍクエン酸−リン酸緩衝液に溶解さ仕たインシフリン亜鉛 （Ａｎ＋ｅｒｉｅａｎ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｈｅｎ＋ｉｃａ！、Ｉ ｎｃ、。

米国、マザ１ユーセッッ州、ナティック）を用いて、実施例１の工程を繰返しま た。、５分間の超音波処理後の平均粒径は３．２±２．５μｍであった。

カタラ−ゼ（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）を用いて実施例１の工程 を繰返した。５分間の超音波処理後の平均粒径は４．５±３゜３μｍであった。

ｌ、ターゼ粒子の製造 スーパーオキシトジスムターゼ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａ ｌＣｈｅｍ　ｉｃａ　Ｉｓ、夏ｎｃ、　）を使用して実施例１の工程を繰返した 。５分間の超音波処理の後の平均粒径は２．７±２．１μｍであった。

Ｓ００の活性を、凍結乾燥工程と超音波処理工程の後に測定した。酵素活性を測 定するのに用いた方法は、スーパーオキシドアニオンによるニトロブルーテトラ ゾリウノ・の還元を阻害するＳＯＤの性質に基づいた方法である。この検定法は 、　Ｗｉｎｔｅｒｂｏｕｒｎｅら、”Ｔｈｅ　Ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｒ ｅｄ　Ｃｅ１ｌ　５ｕｐｅｒｏｘｉｄｅ口ｉｓｍｕｔａｓｅ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ ’、　Ｊ、　Ｌａｈ−［１ｉｎ、　Ｍｅｄ、、　８５巻、３３７頁や１９７５年 、に詳細に記載されている。凍結乾燥工程の後、ＳＯＤはそのもとの活性の９４ ％を有していた。超音波処理段工程後には、　ＳＯＤはぞのもとの活性の９１％ を有している。このことは１粒径減少プロセスがＳＯＤの活性に対し５−Ｃ最少 限度の影Ｗしか与えないことを示す。

使用した高分子が脱イオン水に溶解させたヘパリン（ｆｌｉｏｓｉｎｔｈ、　Ｉ ｎｃ、）であること以外は、実施例１に記載どおりの条件下で実施例１の工程を 繰返した。５分間の超音波処理後の平均粒径は６．９±４．０μｍであった。

造 ウシヘモグロビン（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）を用いて実施例２ の工程を繰返した。５分間の超音波処理後の平均粒径は１．８±１．３μｍであ った。

有するヘモグロビン粒子の製造 ヘモグロビン溶液を液体アルゴン中に噴霧した後凍結乾煙することを除いて、実 施例６に記載の条件で実施例６の工程を繰返した。５分間の超音波処理後の平均 粒径は３．６±２．８μｍであった。

実施例８：ｐＨの関数としての、５μｍ未満の直径を有するＩＩＲＰ粒子の製造 ｐＨが異なる３種の緩衝液、すなわちクエン酸／リン酸緩衝液（ｐ）１５．２） 、リン酸緩衝液（ｐＨ７，２）　、およびトリス緩衝液（ｐ）１９．１）を用い てＨＲＰを溶解させたことを除いて、実施例１に記載したとおりの条件で実施例 の工程を繰り返した。凍結乾燥した粒子を５分間超音波処理し１粒径を測定した 結果を表１に示す。

表１＝緩衝液のｐｉｆの関数としての、超音波処理されたＨＲＰの粒径 （以下余白） 実施例９：最初のデキストランの濃度の関数としての、５μｍ未満の直径を有す るデキストラン粒子の製造２０、１０．　５．　１．２．５および０．５％の濃 度のデキストラン（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　ｍｗ　４０，２ ００）を用いて実施例１の工程を繰返した。これらの試料を１００％エタノール 中に懸濁させ５分間超音波処理した後、その粒径を測定した。

第４図は、高分子球を調製するのに用いられたデキストラン溶液の濃度の関数と した。デキストランの平均粒径を示す。

その結果は、０．５〜５％のデキストラン溶液を用いた場合に最小の粒子が製造 されるということを証明している。

ｌ、ターゼーデキストラン粒子の製造 ＳＯＤの試料１２５ｍｇとデキストランの試料１２５ｍｇとを、　ｐＨ５，２の ０．０５Ｍクエン酸−・リン酸緩衝溶液に溶解させた。得られた水溶液を液体窒 素中に噴霧し、実施例１に記載されているように処理した。５分間の超音波処理 の後の平均粒径は６．９±６．５μｍであった。

実施例１１：緩衝成分として炭酸水素アンモニウムを用いて行う４μｍ未満の直 径を有するヘモグロビン粒子の製造 ０、０５Ｍ炭酸水素アンモニウム溶液の５ｄに溶解させた１２５ｍｇのウシヘモ グロビンを、実施例１の工程にしたがって噴霧し凍結乾燥することによって粒子 に成形した。粒子の走査型電子顕微鏡写真（ＳＢＭ＞は、外側に膜を有し、内側 がスポンジ状である球体を示し、直径は１５〜７０μｍであった。炭酸水素アン モニウムのみを含有する対照の溶液もまた。実施例１に記載したように噴霧し凍 結乾燥した。凍結乾繰後に固体の残渣がなかったので、これらの条件下では緩衝 塩が揮発することが証明された。

ヘモグロビン粒子を酢酸エチルに懸濁させ、水浴で冷却しながら超音波を照射す ることによって破砕した。得られた粒子゛をＬｅｅｄｓ　＆　Ｎｏ自ｈｒｕｐ　 １Ａｉｃｒｏｔｒａｃ　ｓｍａ口ｐａｒｔｉｃｌｅ　ａｎａｌｙｚｅｒを用いて 粒径の分析を行った結果、平均粒径は３．７±２．８μｍであった。超音波処理 粒子のＳＵＭは、長さが１．０μｍのオーダーで厚みが０．１μｍの扁平で凹凸 のある板状粒子を示した。

実施例１２：ホモジナイゼーションによる。直径が７μｍ未満のヘモグロビン粒 子の製造 実施例１１で調製したヘモグロビンの球形粒子の一部を、酢酸エチル中に懸濁さ せ、超音波照射の代わりに、ホモジナイザー（Ｂｒｉｎｋｍａｒｉｎ　Ｉｎｓｔ ｒｕｍｅｎｔｓ　Ｃｏ、、スイス）を用いてホモジナイズした。得られた破砕粒 子の粒径分析の結果、８０秒のホモジナイゼーション後の有効直径については７ ．２±３，７μｍの粒度分布を示した。３００秒のホモジナイゼーションの後の 粒度分布は６．６±３．７μｍであった。

ホモジナイズしたヘモグロビン粒子を酢酸エチル中に７日間貯蔵した後、溶媒を デカントしヘモグロビンを室温で減圧乾燥した。得られた固体を０．２Ｍ　！Ｊ ン酸す）　ＩＪウム（ｐＨ７，７）に溶解させ、そのヘムの吸光度と、新しく溶 解させたウシヘモグロビンおよび６Ｍ塩酸グアニジンで変性させたヘモグロビン のヘムの吸光度を、　ｌｌｅｗｌｅｔｔ　Ｐａｃｋａｒｄ　ｄｉｏｄｅ　ａｒｒ ａｙ　ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒを用いて比較した。スペクトルの特 徴を強調するために、波長に対する吸光度の二次導関数を各試料について得た。

その結果を第５図に示す。そのスペクトルは、新鮮なヘモグロビンと、ここに記 載した方法で処理したヘモグ［１ビンの試料については同一であり、変性したパ ＼モグロビンの曲線とは著しく異なることを示し９粒子を小さくするプロ七スが タンパク分子に有意な変化を起こさないことを示している。

実施例１３：緩衝液成分として炭酸水素アンモニウムを用いて行う、３μｍ未満 の直径を有する西洋ワづビペルオキシダーゼ粒子の製造 西洋ワザビベルオキジダーゼの凍結粒子を調製し、実施例１１でヘモグロビンに ついて記載した超音波粉砕法に付した。

得られた粒子の有効直径の粒度分布は２．８±２．２μｍであった。実施例１に 記載した方法で検定した結果、　ＨＲＰ粒−ｒは。

この工程中でその活性の９０％を保持した。

実施例１４：緩衝成分として炭酸水素アンモニウムを用いて行う、２μｍ未満の 直径を有するウシ血清アルブミンの粒子の製造 水１ｍ１当たり０．４．２０および１００ｍｇの炭酸水素°γアンモニウム含有 する溶液に、ウシ血清アルブミン＜ＢＳＡ）を２５＋＋＋ｇ　ＢＳＡ／Ｉｎｆ！ の濃度で懸濁させ、タンパクの粒子を、実施例１１でヘモグロビンについて記載 したようにして調製した。光学顕微鏡によれば、　１００ｍｇ炭酸水素炭酸水素 アンモニウム溶液中ＢＳＡの溶液から調製したＢＳＡ粒子は、著しく糸状で軽い ストランドのタンパクを含有していた。その他の炭酸水素アンモニウム溶液中の ＢＳＡから調製された粒子は、糸状であったがより高密度であった。

１ｄ当たり炭酸水素アンモニウム１００ｍｇを含む溶液から調製した試料を９酢 酸エチルに懸濁させ、超音波照射で粉砕した。得られた調製物は、直径が１．７ μｍ未満の粒子が６０％を越える粒度分布を示した。光学顕微鏡によると、はと んどすべての粒子が１μｍ未満の粒径であった。

実施例１５：　３．５μｍ未満の直径を有するグリシン粒子の製造グリシン（Ｂ Ｍ　５ｃｉｅｎｃｅ）の２．５％溶液を脱イオン水で調製した。この溶液を、実 施例１の方法にしたがって、超音波処理し、凍結し、凍結乾燥した。光学顕微鏡 によって、平均直径が２４．４±１４．６μｍの多孔性粒子が認められた。これ らの多孔性粒子を４分間超音波処理することによって破砕して平均直径が３．２ ±１．９μｍの粒子を調製した。本実施例は、グリシンのような低分子量化合物 （７５，０７ダルトン）の粒径を小さくするのにこの粒子が有用なことを示す。

実施例１６：　１，４ジオキサンを用いて行う、５μｍ未満の直径を有するテス トテロンの粒子の製造 テストテｏ７　（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）を２．５％含有する １、４ジオキサンの溶液を使って実施例１の工程を繰返した。得られた粒子は平 均粒径が５．４±２．９μｍであったが、小粒子のステロイドを有機溶媒中で製 造するこの方法の有効なことをウシ血清アルブミ：／　（ＢＳＡ）　（Ｓｉｇｍ ａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）の１．９９４ｇの試料を８０ｍ１の脱イオン水 に溶解させ超音波ノズルを通じて液体窒素中に噴霧し、凍結乾燥した。多孔性球 体の粒径は２０〜３０μｍの範囲にあった。

これらのＢＳＡ粒子の試料を、　１０％（ｗ／ｖ）のエチレン−酢酸ビニル（Ｌ ＩＳＩ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）を含有する塩化メチレン溶液に懸濁させ− Ｃ，５，１０および２０重量％のタンパクを含有する混合物を得た。これらの溶 液はすべてＢＳＡの安定した分散物を含有し、　ＢＳＡは時間が経過しても溶液 の底に沈降しなかった。

溶媒が多孔性粒子内に拡散して１粒子の密度がポリマー−溶媒の溶液の密度と等 しくなると考えられる。

生物学的に活性で小直径の粒子を製造するこの方法の改変と変形は１本発明の」 二記の詳細な説明から当業者には明らかである。そのような改変および変形は、 添付の請求の範囲に含まれる。

（以下余白） ↓ １間Ｃ秒う 、二、　シ久　４１￥７４（ 国際調査報告 一一轟一組ゆ−−ＱＰ口ｌυＳ　９０１０２４２１国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．生物活性を有する分子で構成され，約１０〜９０μｍの直径を有する多孔性 粒子の製造方法であって，炭水化物，多糖類，ヌクレオチド，無機化合物，有機 分子，ペプチド，タンパク，核タンパク，糖タンパクおよびリポタンパクでなる 群から選択される生物活性を有する分子の，凍結乾燥によって除去され得る溶媒 による溶液を提供する工程；該溶液を，容器内の液化ガス中に噴霧して，生物活 性を有する分子を溶媒と組合せて含有する凍結液滴を調製する工程；該液化ガス を，凍結粒子の入った容器から除去する工程；および 凍結乾燥によって粒子から溶媒を除去して多孔性粒子を調製する工程； を包含する方法。 ２．前記液化ガスが，窒素，アルゴンおよび酸素でなる群がら選択される，請求 項１に記載の方法。 ３．水性溶媒を選択する工程；およびそのｐＨ，イオン強度，および溶液中に溶 解した生物活性を有する分子の濃度を調整する工程；をさらに包含する，請求項 １に記載の方法。 ４．凍結乾燥により除去され得る揮発性塩類を，前記溶液の緩衝剤に使用する， 請求項３に記載の方法。 ５．前記溶液が超音波ノズルにより噴霧される、請求項１に記載の方法。 ６．ポリ（乳酸）／塩化メチレン，ポリ（乳酸−グリコール酸）／酢酸エチル， およびエチレン−酢酸ビニルコポリマー／塩化メチレンでなる群から選択される ポワマー−溶媒の溶液中に，１０〜９０μｍの直径の多孔性粒子を懸濁させる工 程を，さらに包含する，請求項１に記載の方法。 ７．１０〜９０μｍの直径を有する生物活性を有する分子の多孔性粒子を，該生 物活性を有する分子に対する非溶媒中に懸濁させることにより，約０．１〜１０ μｍの直径を有する生物活性を有する分子の粒子を調製する工程をさらに包含す る，請求項１に記載の方法。 ８．懸濁液中の粒子を破砕して直径が約０．１〜１０μｍの粒子を調製する工程 をさらに包含する請求項７に記載の方法。 ９．前記０．１〜１０μ血の粒子を前記非溶媒から回収する工程をさらに包含す る，請求項８に記載の方法。 １０．前記０．１〜１０μｍの粒子をポリマーマトリックス内に組み込む工程を さらに包含する，請求項８に記載の方法。 １１、約１０〜５０μｍの直径を有する生物活性を有する分子の多孔性粒子であ って，その粒子を調製する前の溶液中の分子の活性の７０％を越える活性を有す る分子を含有し，次の工程により調製される多孔性粒子； 炭水化物，多糖類，ヌクレオチド，無機化合物，有機分子，ペプチド，タンパク ，核タンパク，糖タンパクおよびリポタンパクでなる群から選択される生物活性 を有する分子の，凍結乾燥によって除去され得る溶媒による溶液を提供する工程 ；該溶液を，容器内の液化ガス中に噴霧して，生物活性を有する分子を溶媒と組 合せて含有する凍結粒子を調製する工程；該ガスを，該凍結粒子の入った容器か ら除去する工程；および 該溶媒を，該粒子から凍結乾燥によって除去し，直径が約１０〜５０μｍの生物 活性を有する分子の多孔性粒子を調製する工程。 １２．さらに、ポリマーマトリックスを含有する，請求項１１に記載の多孔性粒 子。 １３．前記ポリマーマトリックスが，ポリ（乳酸），ポリ（乳酸−グリコール酸 ），エチレン−酢酸ビニル，コポリマーおよびその混合物で形成される，請求項 １２に記載の多孔性粒子。 １４．約０．１〜１０μｍの直径を有する生物活性を有する分子の粒子であって ，該粒子を調製する前の溶液中の分子の活性の７０％を越える活性を有する分子 を含有し，次の工程により調製される，粒子； 炭水化物，多糖類，ヌクレオチド，無機化合物，有機分機，ポリペプチド，核タ ンパク，糖タンパクおよびリボタンパクでなる群から選択される生物活性を有す る分子の，凍結乾燥によって除去され得る溶媒による溶液を提供する工程；該溶 液を，容器内の液化ガス中に噴霧して，生物活性を有する分子を溶媒と紺合せて 含有する凍結粒子を調製する工程；該ガスを凍結粒子の入った容器から除去する 工程；該溶媒を凍結乾燥によって粒子から除去して多孔性粒子を調製する工程； 該多孔性粒子を，該生物活性を有する分子の非溶媒中に懸濁させる工程；および 該多孔性粒子を，約０．１〜１０μｍの直径を有する粒子に破砕すること。 １５．さらにポリマーマトリックスを含有する，請求項１１に記載の多孔性粒子 。 １６．前記ポリマーマトリックスが，ポリ（乳酸），ポリ（乳酸−グリコール酸 ），エチレン−酢酸ビニル，コポリマーおよびその混合物で形成される，請求項 １５に記載の多孔性粒子。