JPH04500607A - 新しい免疫学的レパートリーの開発法 - Google Patents

新しい免疫学的レパートリーの開発法

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JPH04500607A JP2508759A JP50875990A JPH04500607A JP H04500607 A JPH04500607 A JP H04500607A JP 2508759 A JP2508759 A JP 2508759A JP 50875990 A JP50875990 A JP 50875990A JP H04500607 A JPH04500607 A JP H04500607A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 新しい免疫゛学的レパートリ−の開発法（関連分野） 本発明は所定の活性を有するレセプターをコードする遺伝子を単離する方法に関 する。
（関連技術） リガンドとレセプターの間の結合現象は生物系において多くの重要な役割を果し ている。このような現象の例にはオキシヘモグロビンを形成するデオキシヘモグ ロビンに対する酸素分子の結合およびたんばく賞とトリプシンのようなプロテア ーゼのように基質とこれに作用する酵素の結合がある。さらに生物学的結合現象 の例には抗体に対する抗原の結合およびいわゆるＣＲＩレセプターに対する補体 要素Ｃ３の結合が含まれる。
また多くの薬剤や他の治遼剤も結合現象に依存すると考えられる。たとえばモル ヒネのような麻酔剤は脳の特定のレセプターに結合すると報告されている。麻酔 剤アゴニストおよびアンタゴニストはそれらの結合部位をモルヒネのような薬剤 と競合すると報告されている。
モルヒネやその誘導体などの人工の薬剤のようなリガンドやエンドルフィンおよ びホルモンのような天然に生物系に存在するリガンドは生物系に天然に存在する レセプターと結合する。よってこれらは本明細書において一緒に扱かわれている 。このような結合はたんばく質がトリプシンやパパインのような酵素によって加 水分解され、また脂肪がグリセリンと３つのカルボン酸に切断されるように特に アミドおよびエステル結合の加水分解を含む生物よび脂肪の形成におけるアミド およびエステル結合形成を導くのと同機ト、炭素−炭素結合および炭素−Ｍ素結 合の形成を導き得を推動物における代表的レセプター生成系は免疫系である。＊ 乳類の免疫系は抗体の形でおそら（：１．０Ｘ１０’以上のレセプター特異性を 生成し得ろことからもっとも多様な生物学的系の１つである。事実多くの現代的 生物学的および医学的研究はこのレパートリ−の開発を月差している。この千年 間広範な免疫学的レパートリ−の出力を利用する能力が劇的に増加した。コラ− （にｏｈｌｅｒ）およびミルスタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）によるハイブリドー マ法の開発はモノクローナル抗体すなわち免疫応答の間に誘導される抗体のレパ ートリ−から単一の特異性をもつ抗体組成物を生産し得る。
不幸にもモノクローナル抗体を生成する現在の方法は特定の免疫原によって誘導 される全ての抗体応答を有効に探索し得ない。
個々の動物では、たとえばジニトロフェノールのような小さくて比較的堅い免疫 原に対して特異的な抗体を生成し得る少なくとも５〜１０，０００種のＢ細胞ク ローンが存在する。さらに抗体の多様性の生成の際の体細胞変異過程のため、基 本的に無限の特異的抗体分子が生成し得る０種々の抗体のこの巾広い潜在能力と は対照的に、一般に現在のハイブリドーマ法は融合当り数百個の各モノクローナ ル抗体しか生成しない。
ハイブリドーマ法によるモノクローナル抗体生産の別の難点にはハイプリドーマ 培ＩＩ物の遺伝的不安定性および低い生産性がある。後者２つの問題を克服する １つの方法は目的とする特定のハイブリドーマ由来の免疫グロブリン産生遺伝子 を原核性発現系にクローン化することである。たとえばロビンソン（Ｒｏｂｉｎ ｓｏｎ）等、ＰＣＴ　ＷＯ３９１００９９；ウィンター　（讐１ｎｔｅｒ）等、 ヨーロッパ特許出１１ｉ第０２３９４００号；リーディング（Ｒｅａｄｉｎｇ） 、　Ｕ−３，特許第４，７１４．６８１号；およびキャビン−（Ｃａｂｉｌｌｙ ）等、ヨーロッパ特許出ａ第０１２５０２３号参照。
を推動物の免疫学的レパートリ−には触媒活性を有する免疫グロブリンをコード する遺伝子が含まれることが最近分った。トラモンタノ　（Ｔｒａｓｏｎｔａｎ ｏ）等、Ｓｃｉ、２３４．１５６６　１５７０（１９８６）；ボラ７ク　（Ｐｏ ｌｌａｃｋ）等、Ｓｃｉ、、２３４．１５７０−１５７３　（１９８６）；ジヤ ツジＵａｎｄａ）等、Ｓｃｉ、、２４１゜１１８８−１１９１　（１９８８）； およびジヤツジ（Ｊａｎｄａ）等、Ｓｃｉ、、２４４，４３７−４４０　（１９ ８９）、化学反応を触媒し得る、すなわち酵素のような作用をし得る抗体分子の 存在またはこれらを作るレパートリ−を誘導する能力はほぼ２０年前ｗ、ｐ。
ジェンクスによってすでに？！濁されていた（化学および酵素学における触媒作 用、マグロ−ヒル版、Ｎ、Ｙ、（１９６９））。
初期に免疫学的レパートリ−からの触媒性抗体の単離に失敗した理由およびそれ らの実際の発見から今日まで多くのものを単離することに失敗したことは望まし い活性に関するレパートリ−の大部分をスクリーニングできないことにあると考 えられている。
別の理由は触媒作用とは反対に本賞的に中和過程に参加するよう設計された高ア フィニティー抗体の生産を指向するハイブリドーマ法のような現在使用可能なス クリーニング技術の傾向にあると考えられている。
（本発明の詳細な説明） 本発明は所定の活性を有するレセプターをこれまで以上に広い保存的レセプター コード遺伝子レパートリ−からスクリーニングする新しい方法を提供し、それに より先に述べたハイブリドーマ法の欠点を克服し得る。
１つの態様においては保存的レセプターコード遺伝子レパートリーの冥質的部分 を含む保存的レセプターコード遺伝子ライブラリーを合成する。好ましいＢｇに おいては保存的レセプターコード遺伝子ライブラリーは少なくとも約１０１種、 好ましくは少なくとも約１０４種、そしてより好ましくは少なくとも約１０５種 のレセプターコード遺伝子を含んでいる。
この遺伝子ライブラリーは出発物質に依存して２つの方法のいずれかにより合成 し得る。
出発物質が多量のレセプターコード遺伝子であるときそのレパートリ−に対し２ つの別個のプライマー伸長反応を行った。第１のプライマー伸長反応はそのレパ ートリ−内に保存されるヌクレオチド配列（多くの遺伝子に共有されている）に ハイブリダイズすることにより第１反応を開始し得る第１ポリヌクレオチド合成 プライマーを使用する。第１プライマー伸長は種化の保存的レセプターコードホ モログ相補体（レパートリ−中の遺伝子に相捕的な核酸Ｉりを生成する。
テンプレートとして相補体を用いた第２プライマー伸長反応は多くの異なる保存 性レセプターコードＤＮＡホモログを生産する。
第２プライマー伸長反応は多くの相補体に保存されるヌクレオチド配列にハイブ リダイズすることにより第２反応を開始し得る第２ポリヌクレオチド合成プライ マーを使用する。
出発物質が保存的レセプターコード遺伝子の多くの相補体である場合、そのレパ ートリ−について上述した第２プライマー伸長反応を行う、もちろんもし保存的 レセプターコード遺伝子およびそれらの相補体のレパートリ−が存在するなら両 方法を組合せることができる。
保存的レセプターコードＤＮＡホモログ、すなわち所定のリガンドを結合し得る レセプターをコードする遺伝子がそのライブラリーから分離し単離遺伝子となる 。一般にこれはそのライブラリーの程々の保存的レセプターコードＤＮＡホモロ グを発現するため発現ベクターにｌ！能的に結合させることにより行なわれる。
このようにして作ったレセプター発現ベクターを適合宿主細胞すなわち発現する ようベクターに機能的に結合した遺伝子を発現し得る細胞に導入する。そのトラ ンスホーマントをレセプターコードＤＮＡホモログをコードするレセプターを発 現する条件下で培養する。このトランスホーマントをクローン化し、そのクロー ンを所定のリガンドを結合するレセプターの発現についてスクリーニングする。
レセプターに対するリガンドの結合を検出するのに適した方法ならどれでも使用 し得る。望ましい活性を発現するトランスホーマントはその集団から分離されそ の単離遺伝子を生産する。
別の態様において本発明は少なくとも約１０１、好ましくは少なくとも約１０４ 、より好ましくは少なくとも１０’の保存的レセプターフードＤＮＡホモログの 単離混合物を含む遺伝子ライブラリーに関する。その多（は保存的抗原決定基を 共有し、ている。
そのホモログはその生物学的活性を維持する水やリン酸緩衝液などのようなイン ビトロの取扱いに通した培地中に存在することが好ましい。
本発明は本方法で生産され、ここで述べているように好ましくはモノマーかダイ マーの所定の活性、好ましくは触媒活性を有するレセプターにも関する。
（図面の簡単な説明） 図は本公開の一部を構成している。
第１図は基本的構造を示す免疫グロブリン分子の模式図である。
重鎮の円形領域は可変領域（ＶＭ　）を表わしており、その領域の生物学的活性 （リガンド結合）部分を含むポリペプチドおよびそのポリペプチドをコードする 遺伝子は本発明の方法で往産される。
配列ＬＯ３，Ｌ３５．Ｌ４７およびＲ４８はどの既存のサブグ・ループにも分類 し得なかった。
第２八図　ヒ）ＩｇＧ（ＩｇＧ１サブクラス）のＨ鎖の模式図。
番号付けは左のＮ端から右のＣ端の方向である。各々約６０個のアミノ酸残基に またがる鎖内ジスルフィド結合（Ｓ−３）を含む４個のドメインの存在に注意せ よ、記号ＣＨＯは炭水化物を意味している０重（Ｈ）鎖のＶ領域（■、）は３つ の超可変ＣＤＲをもつ点で■、に似ている。
第２Ｂ図　ヒ）Ｋｌｉの模式図（パネル１）０番号付けは左のＮ端から右のＣ端 への方向である。ｖＬおよびＣ，ドメイン中はぼ同数のアミノ酸残基にまたがる 鎖内ジスルフィド結合（Ｓ　−Ｓ）に注意せよ、パネル２は■Ｌドメイン中の相 補性決定領域（ＣＤＲ）の位置を示している。ＣＤＨの外側のセグメントはフレ ームワークセグメント（ＦＲ）である。
第３図　ホスホリルコリンに特異的な１９個のマウスモノクローナル抗体のｖ、 ！領域のアミノ酸配列、ＨＰとはそのたんばく賞がハイブリドーマの産物である ことを表わしている。その他はミエローマたんばく賞である（ギアハート　（Ｇ ｅａｒｈａｒｔ）等、Ｎａｔｕｒｅ。
２９１．２９．１９８１より）。
第４図　ＦＩＴＣで免疫化したマウスの膵臓由来のｍＲＮＡのＰＣＲ増巾の結果 を示している。レーンＲ１７〜Ｒ２４はユニークな５′プライマー（２〜９、第 １表）および３′プライマー（１２、第１表）を用いた増巾反応に対応して５す 、Ｒ１６’はイノシンを含む５′プライマー（１０、ｉ１Ｍ’）および３′プラ イマー（１２、第１表）を用いたＰＣＲ反応を示している。ＺおよびＲ９は増巾 のコン上ロールである。コントロールＺはプラスミド（ＰＬＲ２）由来の■。の 増巾を示しまたＲ９はプライマー１１および１３　（第１表）を用いた膵臓のｍ ＲＮＡの不変領域の増巾を示している。
第５図　ヌクレオチド配列はラムダｚＡＰ中のＰＣＲ増巾したｖＸ領域のｅＤＮ Ａライブラリー由来のクローンのものである。
Ｎ末端の１１０塩基をリストした。下線のヌクレオチドはｃＤＲＩ（相補的決定 領域）を示している。
第６図　ラムダＺａｌ）ｍＶ＋＋　（バネ／Ｌ／　Ａ　）およびラムダＺ　ａｐ 　Ｖ　Ｌ（パネルＢ）発現ベクターを作製するためにラムダＺＡＰに挿入した合 成り　Ｎ　Ａ挿入物の配列、■８およびＶ、コードＤＮＡホモログを発現するた めにこのベクターに必要とされるものにはシャインダルガルノリボゾーム結合部 位、モウバ（Ｍｏｕｖａ）等（Ｊ’、Ｂｉｏｌ。
Ｃｈｅｍ、、２５５．　２７．　１９８０）によって報告されている細胞周辺腔 に発現たんば←質を送り出すのに必要なリーダー配列および発現ベクターにｖ、 ｌおよび■、ホモログを結合するのに用いる種々の制限酵素部位が含まれる。ま た■８発現ベクター配列には可変領域！鎖（■９バ７クボーン）に典型的に見ら れるアミノ酸をコードする短かい核酸配列を含む、このｖ、ｌバックボーンはＸ ｈｏｌおよび５ｐｅｌに機能的に結合するｖ、ＤＮＡホモログと同様に直ぐ上流 に正しい読み枠で存在する。ＶＬＤＮ八ホモへグはＮｃｏｌおよび５ｐｅｌ制＠ 酵素部位のところで■、配列（パネルＢ）と機能的に結合しており、したがって ■。バックポーン領域は■。
ＤＮＡホモログがｖＬベクターに機能的に結合したとき欠失する。
第７図　＆Ｂｍ発現ベクターラムダＺａρＩＩＶＩＩ　（Ｖｌ１発現ベクター） の主要な特徴が示されている。第６図からの合成りＮＡ配列がラムグＺａｐＩＩ 由来のＴ、ポリメラーゼプロモーターとともに上に示しである。ラムダ°Ｚａｐ ＩＩ中の挿入物の方向が示されている。
ＶＭＤＮＡホモログはＸｈｏｌおよび５ｐｅｌｌＩｌ限部位に挿入され、転写に より、クローニング部位の丁度３′側に位置するデカペプチドのエピトープ（ｔ 　ａ　ｇ）を生成する。
第８図　ｍｍ発現ヘクターラムダＺａｐＵＶｔ　（ＶＩ発現”’ター）の主要な 特徴が示されている。第６図に示した配列はラムダＺａｐＩ［のＴ、ポリメラー ゼプロモーターと一緒に上に示しである。
ラムダＺａｐ中の挿入物の方向が示しである。ＶＬＤＮＡホモログはシ璽−ト　 （Ｓｈｏｒｔ）等（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉ＋ｂ　Ｒｅｓ、　１６　、　７５８ ３−７６００．１９８８）によって報告されているインビボ切除操作によって作 製されたファージミドに挿入される−　ＶＬ　ＤＮＡホモログはこのファージミ ドのＮｃｏＩおよび５ｐｅｌクロ一ニング部位に挿入する。
第９図　修正した細面発現ベクターラムダＺａｐＩＩＶＬＩ１．このベクターは 以下の合成りＮＡ配列： を予め制限酵＠５ａｃＩおよびＸｈｏｌで消化したラムダＺａｐＩＩに挿入する 。この配列にはシャインダルガルノ配列（リボゾーム結合部位）、発現プラスミ ドを細胞周辺腔に送るリーダー配列およびこのベクターに提供される５ａｃｌお よびＸｂａＴ制限酵素部位にｖＬＤＮＡホモログを機能的に結合させる適当な核 酸配列が含まれる。
第１０図　ラムダＺａｐＩＩに挿入してラムダｖｔ　ＩＩ発現ベクターを作る合 成りＮＡ上セグメント配列０種々の特徴および制限エンドヌクレアーゼｔＵｆｆ ｉ部位が示しである。
第１１図　ｖＨおよびＶ、を発現するためのベクターが別々におよび合せて示し である。これらのベクターの種々の基本的要素が示しである。軽鎖ベクターある いはＶ２発現ベクターはｖ）＋発現ベクターと合せて発現のために同じプロモー ターと機能的に結合する両■９およびＶ、を含む組合せベクターを作製し得る。
第１２図　■８およびＶＬＤＮＡホモログを含む大腸菌から免疫沈殿した標識た んばく質が示されている。レーンｌにはｖ、ｌまたはＶ、ＤＮＡホモログを含ま ない大腸菌から免疫沈殿したバンクグランドたんばく質が示されている。レーン ２にはＶｌｌ　ＤＮＡホモログのみを含む大腸菌から免疫沈殿したｖＭたんばく 質が含まれている。レーン３および４ではｖＨおよび■、の両方のＤＮＡホモロ グを含む大ｍ菌から免疫沈殿したｖＸたんばく質とＶ、たんばく賞の共振動の様 子が示されている。レーン５にはＶｌｌおよびＶＬＤＮＡホモログから発現され るｖ、Ｉたんばく賞とＶしたんばく質の存在が２つの区別可能なたんばく質種に より示されている。レーン５にはマウス腹水中に存在する抗大ｕＩｍ抗体により 免疫沈殿するバンクグランドたんばく質が含まれる。
第１３図　カルボキシアミド基質（式２）を加水分解する抗体を誘導する遷移状 態アナログ（式ｌ）、グルタリルスペーサーおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミ ドリンカ−付加物を含む式１の化合物はたんばく賞キャリヤーＫＬＨおよびＢＳ Ａにハプテンを結合させるのに用いられる形状である。一方式３の化合物はイン ヒビターである。ホスホナミデートの１！能はアミド結合の加水分解の遷移状態 の立体−電子的構造の模倣である。
第１４図　ＮＰＮで免疫化したマウスの膵臓ｍＲＮＡからのＦｄおよびカフバ領 域のＰＣＲ増巾を示している。増巾は軽煩配列（第２表）または重鎮配列（第１ 表）の増巾に特異的なプライマーとｍＲＮＡの逆転写で得られるＲＮＡ　ｃＤＮ Ａハイブリットヲ用い例１８で述べる方法で行った。レーンＦｌ−ＦＢは８個の ５′プライマー（プライマー２−９、第１表）の１つおよびユニークな３′プラ イマー（プライマー１５、第２表）を用いた重鎮増巾反応の産物を示している。
５′プライマー（プライマー３−６、および１２、第２表）および適当な３′プ ライマー（プライマー１３、第２表）を用いた軽ｆｆ　（ｋ）の増巾はレーンＦ ９〜Ｆ１３に示しである。全てのレーンに見られる７　００　ｂｐのバンドはＦ ｄおよびに頷填の増巾がうまく行ったことを示している。
第】５図　抗原結合に関するファージライブラリのスクリーニングが例１８ｃに 従って示されている。Ｆａｂ（フィルターＡ、Ｂ）。
重鎮（フィルターＥ、Ｆ）および軽鎖（フィルター〇、Ｈ）発現ライブラリーの 二回のプラークリフトをプレート当り約３０，０００プラークの１！！度でＮＰ Ｎと結合した”’　Ｉ　１ｆｆｉＢ　Ｓ　Ａに対しスクリーニングした。フィル ターＣおよびＤはテキスト中でＤＩＩＡしてブ体の２度にわたる二次スクリーニ ングを示している。
スクリーニングには橿ツ的プラークリフト法を使用した。プラークで怒染したＸ ＬＩブルー細胞を１５０−プレート上、３７℃で４時間インキュベートし、１０ ５Ｍイソプロピルチオガラクトシドに浸したニトロセルロースフィルターを重ね ることによりたんばく賞の発現を誘導した後このプレートを２５℃で８時間イン キュベートした。同じ条件を用いた２回目のインキュベーンテンの際に２枚のフ ィルターを得た。それからこれらのフィルターをＰＢＳ中１９４のＢＳＡ？Ｗｆ ｉ中１時間でブ中ソ時間、その後１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中ＮＰＮに結合したｌｔＪ 標戯ＢＳＡ熔Ｗ１．（２×１０’　ｃｐＩｌａｌｌ−’　；　Ｂ５Ａ４度０．１ 　Ｍ　；　Ｂ　Ｓ　Ａ分子当り約１５個のＮＰＮ）と２５℃で１時間振とうしな がらインキュベーンテンした。バンクグランドはストックの放射能標ｍＢｓＡ溶 液を　・１００．０００ｇ１５分間の予備遠心および挿入物のないファージ、を 怒染させた細菌を含むプレート由来のプラークリフトとこの溶液をプレインキユ ベーシッンすることにより減少した。標識後フィルターは一晩のオートラジオグ ラフの現像前にＰＢＳｌｏ、０５％トウィーン２０で（り返し洗浄した。
第１６図　競合的阻害で示されるように抗原結合の特異性は例１８Ｃで示される 。ポジティブプラークからのプラークリフトにインヒビターＮＰＨの濃度を漸次 上げながら”’Ｉ−ＢＳＡ−ＮＰＮを作用させた。
この実験で第１５図に見られるようなＮＰＮ結合に関連する多くのファージを細 菌グランド上に直接スポットした（スポット当り約１００個）、それからこのプ レートにＩ　ＰＴＧ浸漬フィルターを重ね、２５℃で１９時間インキュベートし た。標識溶液中に種々の濃度のＮＰＮを含めること以外は第１５図について先に 述べた方法と同様に目’Ｉ−ＢＳＡ−ＮＰＮ中でのインキュベーンテン前にＰＳ Ｂ中１％ＢＳＡ中でフィルターをブロックした。他の条件および操作は第１５図 と同様である。中程度のアフィニティーをもつファージの結果は図に２つづつ示 しである。同様の結果が有効インヒビター濃度範囲にいくらか差がある他の４つ のファージについても得られている。
第１７図　例１８Ｄに従かい抗原結合たんばく賞の特性が示されている。濃縮し 部分的に精製したＮＰＮ結合結合−ローン°菌上滑をゲル濾過で分離し各フラク シヨンからの一部を、ＢＳＡ−ＮＰＮでコートしたマイクロプレートに入れた。
アルカリホスファターゼに結合した抗デカペプチド（−−−）または抗カッパ鎖 （−）抗体のいずれかを添加後発色させた。矢印は既知のＦａｂフラグメントの 溶出位１を示している。この結果は抗原結合が重鎮および軽鎖の両方を含む５０ ｋＤたんばく賞の性賀であることを示している。
２個のＮＰＮポジティブクローンの単一プラーク（第１５図）をピックアップし 重ｌｌＩおよび軽鎖挿入物を含むプラスミドを切り出した（１９）、Ｌ培地５０ ０■！培養物に切り出したプラスミドを含む飽和培養物３謬ｌを接種し、３７℃ で４時間インキュベートした。最終濃度が１ｍＭとなるようにＩ　ＰＴＧを添加 したんばく質の誘導を行ない、その培養物を２５℃で１０時間インキュベートし た。細胞上清２００ｍｌを２．ｚにまで濃縮し、ＴＳＫ０４０００カラムにかけ た。溶出フラクシ四ンの５０μｌをＥＬＩＳＡで検定した。
ＥＬ　Ｉ　ＳＡ分析ではマイクロプレートをＢＳＡ−ＮＰＮＩμｇ／ｓｊでコー ティングし、５０μｌのサンプルを５０μｌのＰＢＳ　−−トウイー７２０　（ ０，０５％）　−ＢＳＡ　（０，１％）と混ぜたものを添加した後このプレート を２５℃で２時間インキュベートする。
ＰＢＳ−）ウィーン２Ｏ−ＢＳＡで洗浄後、適当な濃度のアルカリボスフ１ター ゼと結合したウサギ抗デカペプチド抗体（２０）およびヤギ抗マウスカフバ軽鎖 （サウザンバイオテク）溶液５０μｌを加え、２５℃で２時間インキュベートし た。さらに洗浄後、５０μｌのｐ−ニトロフェニルホスフェ−）　（５０ｍＭ　 ＭｇＣｊｚを含む０．１　Ｍ　）リス（ｐＨ９，５）中１票ｇ／ＬＯを加え、そ のプレートを１５〜３０分間インキュベートしてから４０５ｎ−のＯＤを測定す る。
第１８図　選択可能なりｌＩ発現ベクターを作るためにラムダＺａｐｎＶ＋＋に 挿入しくパネル人）また選択可能な■１発現ベクターを作るために例１７に従っ てラムダＺａｐｎＶＬに挿入する（パネルＢ）合成りＮＡ挿入物の配列。
第１９図 （Ａ）選択可能なＶ４発現ベクターの主要な特徴をパネルＡに示す、第１８図Ａ の合成りＮＡ配列の特徴をラムダＺａｐｉｌのＴ３ポリメラーゼプロモーターと 一緒に上に示した。ラムダＺａｐＨ中の挿入物の方向も示しである。■、ｌＤＮ ＡホモログはＸｈｏｌおよび５ｐｅｌ制限酵素部位に挿入しである一Ｖ１１ＤＮ ＡホモログはＸｈｏｌおよび５ｐｅＩ部位に揮大してあり、その転写はクローニ ング部位の丁度３′側に位置するデカペプチドエピトープ（ｔ　ａ　ｇ）を生成 する。
（Ｂ）細菌発現ベクターラムダＺａｐＩＩＶ、（Ｖｍ発現ベクター）の主要な特 徴を示す、第６図の合成りＮＡ配列はラムダＺａｐＩ［のＴ、ポリメラーゼプロ モーターと一緒に上に示しである。ラムダＺａｐＩＩ中の挿入物の方向も示しで ある。Ｖ、ｌ　ＤＮＡホモログはＸｈｏＴおよび５ｐｅＩ制限酵素部位に挿入さ れている。ｖＮＤＮＡはＸｈｏｌおよび５ｐｅＩ部位に挿入されており、その転 写はクローニング部位の丁度３′側に位置するデカペプチドエピトープ（ｔ　ａ 　ｇ）を生成する。
第２０図　ｖ、ｌおよび■１の発現を組合せたベクターの１つを示している。こ れらのベクターの種々の基本的要素が示されている６選択マーカー（ＳｕｐＦ） も示されている。
（本発明の詳細な説明） Ａ、定義 ヌクレオチド：糖（ペントース）、リン酸および窒素複素環塩基からなるＤＮＡ またはＲＮＡの単量体ユニット、塩基は糖にグリコシド結合で結合しておりこの 塩基と垢の組合せ物はヌクレオシドと呼ばれる。ヌクレオシドがペントースの３ ・′または５′位にリンＩ！１！基を含んでいるときこれをヌクレオチドと呼ぶ 。
塩基対（ｂｐ）：　二本１ｉｆＤＮＡ分子中のアデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）ま たはシトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）の対、ＲＮＡではチミンの代りにウラシル が用いられている。
核酸：　−末鎖または二本鎖のヌクレオチドのポリマー。
遺伝子：　そのヌクレオチド配列がＲＮＡまたはポリペプチドをコードしている 核酸。
相補的塩基：　ＤＮＡまたはＪ’？ＮＡが二本鎖構造をとる時に通常対を作るヌ クレオチド。
相補的ヌクレオチド配列：　−末鎖のＤＮＡまたはＲＮＡに相補的で最終的に水 素結合で特異的にこれにハイブリダイズする一本ｌｌＤＮＡまたはＲＮＡ中のヌ クレオチド配列。
保存的：　所定の配列の相補体に非ランダム的にハイブリダイズする場合そのヌ クレオチド配列は所定の配列に対し保存的である。
ハイブリダイゼーシヨン：　相補的塩基対間に水素結合ができる二重鎖またはへ テロ二重鎖を形成する実質的に相補的なヌクレオチド配列の対合、それは競合的 に阻害され得る２つの相補的ポリヌクレオチド間の特異的、すなわち非ランダム の相互作用である。
ヌクレオチドアナログ：　構造的にＡ、　Ｔ、　Ｇ、　Ｃ，まタハＵと異なるが 核酸分子中で正しい７クレオチドと置き換われるほと類似しているプリンまたは ピリミジンヌクレオチド。
ＤＮＡホモログ：　所定の保存的ヌクレオチド配列および所定のリガンドを結合 し得るレセプターをコードする配列を有する核酸。
抗体：　本明細書で使用している種々の文法型の゛抗体゛という言葉は免疫グロ ブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的活性部分すなわち抗体結合部位 またはバラトープを含む分子を意味する０代表的抗体分子には本来の免疫グロブ リン分子、実質的免疫グロブリン分子およびＦ　ａｂ、　Ｆ　ａｂ　’、Ｆ（ａ ｂ’）ｚおよびＦ（Ｖ）として知られている領域を含む免疫グロブリン分子の一 部分が含まれる。
抗体結合部位：　抗体結合部位とは抗原と特異的に結合（免疫反応）する重鎖お よび軽鎖の可変および超可変領域を含む抗体分子の構造８ｉ域である。禮々の文 法型の免疫反応という語句は抗原決定基含有分子と抗体分子またはその一部分の ような抗体結合部位を含む分子との間の特異的結合を意味する。
モノクローナル抗体；　罹々の文法型で用いられるモノクローナル抗体という語 句は特定の抗原と免疫反応し得る抗体結合部位を唯一種しか持たない抗体分子群 を意味する。したがってモノクローナル抗体は一般にそれが免疫反応を起こす抗 原に対する唯一の結合アフィニティーを示す、それゆえモノクローナル抗体には 種々の抗原に各々免疫特異性を示す複数の抗体結合部位をもつ抗体分子、たとえ ば二特異的モノクローナル抗体も含まれる。
Ｂ、方法 本発明は保存的遺伝子のレバー）　ＩＪ−がら所定の活性、好ましくは触媒活性 を有するレセプターをコードする遺伝子を単離する方法に関する。このレセプタ ーとしてはポリペプチドでも、トランスファＲＮＡ５酵素活性を示すＲＮＡなど のＲＮＡでもよい。
このレセプターは酵素、抗体分子またはその免疫学的に活性な部分、細胞レセプ ター、もしくは保存的遺伝子、すなわち長さが少なくとも１０ヌクレオチドの保 存的ヌクレオチド配列を含む遺伝子群の１つによってコードされる細胞粘着たん ばく質などのポリペプチドであることが好ましい。
代表的保存的遺伝子群には免疫グロブリン、クラスＩまたは■の主要組織適合性 複合体抗原、リンパ球レセプター、インテグ°ノンなどをコードするものがある 。
いくつかの方法を用いて保存的遺伝子のレパートリ−に属する遺伝子を同定し得 る。たとえばＪＬ離した遺伝子を但ストリンジエンシー条件下ハイブリダイゼー ションプローブとして用いるサウザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）、Ｊ、　Ｍｏ１．　 Ｂｉｏｌ、　９８．５０３　（１９８５）　）の方法によりゲノムＤＮＡ中に存 在する保存的遺伝子のレパートリ−の他のメンバーを検出することができる。も しハイブリダイゼーシヨンプローブとして用いた遺伝子が多重ｌ！Ｊｐｉエンド ヌクレアーゼフラグメントにハイブリダイズしたなら、その遺伝子は保存的遺伝 子のレバート１ノーの１員である。
（免疫グロブリン） 免疫グロブリンまたは抗体分子はＩｇＤ、ＩｇＧ、１．Ａ、ＩｇＭおよびＩｇＥ などいくつかの型の分子を含む非常に大きな分子群である。一般に抗体分子は２ 本の重鎮（Ｈ）および軽ｆｉ　（Ｌ）からなり重鎖には可変（Ｖ）および不変（ Ｃ）ｎ域が存在する。免疫グロブリンのくつかの領域には免疫グロブリンのレパ ートリ−を単離するのに有効な保存的配列が含まれている０代表的保存的配列を 示すアミノ酸および核酸配列データは免疫グロブリン分子に関してカバ７　）　 （Ｘａｂａｔ）等によって編集されているじ免疫学的に興味のあるたんばく質の 配列”　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆＢｅａｌｔｈ、ベセスダ 、ＭＤ、１９８７）。
ＨｔＩのＣ領域は特定の免疫グロブリン型を決定する。それゆえ、Ｈ値のＣ領域 から、ここで定義されているような保存的配列を選択すれば選択したＣｗＩ域の 免疫グロブリン型のメンバーををする免疫グロブリン遺伝子のレパートリ−が調 製される。
一般にＨまたはＬＭのｙ　９１域には４つのフレームワーク（Ｆ　Ｒ）領域が含 まれ、各々は保存配列を含む比較的低い可変性を含んでいる。■Ｘ鎖のＦＲＩお よびＦＲ４（ＪｐＪＩ域）フレームワーク領域由来の保存的配列の使用は好まし い代表的態様であり、例で取り上げている。一般にフレームワーク領域はいくつ かまたは全ての免疫グロブリン型に保存されており、したがってここに含まれる 保存的配列はいくつかの免疫グロブリン型を有するレパートリ−の調製には特に 適している。
（主要組ｍ適合性複合体） 主要組織適合性複合体（ＭＭＣ）はクラスエ、クラス■またはクラスＩＭＨＣ分 子と呼ばれる数クラスの分子番含む広いたんばく質群をコードする大きな遺伝子 座である。ポール（Ｐａｕｌ）等、基礎免疫学、レーベンプレス版、ＮＹ、　ｐ ｐ、３０３．−３７８（１９８４）。
クラスＩＭＨＣ分子はその抗原が重鎖と非ＭＨＣコード軽鎖からなる保存的群を 示す移植抗原の多重グループである。その重鎖にはＮ、Ｃ１，Ｃ２、メンブレン および細胞′ｊｔ９Ｍ域と呼ばれるいくつかの領域が含まれる０本発明に有用な 保存的配列は主にＮ。
Ｃ１およびＣ２ｔＪｌ域に見られ、カバ７）　（Ｈａｂｉｔ）等（上述）の報告 では“不変残基”の連続的配列と呼ばれている。
クラスＩＩＭＨＣ分子にはアルファおよびベータ額からなり、免疫応答に関与す る多重的抗原の保存的群が含まれる。各々アルファおよびベータ鎖をコードする 遺伝子にはＭＨＣクラス■アルファまたはベータ鎖のレパートリ−を止座するの に適している保存的配列が含まれている０代表的保存的ヌクレオチド配列にはＡ １領域のアミノ酸残基２６〜３０．Ａ２領域の残基１６１−１７０およびメンブ レン領域の残基１９５〜２０６、アルファ鎖の全てをコードするものが含まれる 。また保存的配列は、各々アミノ酸残基４１〜４５．１５０〜１６２および２０ ０〜２０９をコードするヌクレオチド配列であるベータ鎖のＢｌ、Ｂ２およびメ ンブレン領域中に存在する。
（リンパ球レセプターおよび細胞表面抗原）リンパ球にはＴａｌ胞レセプター、 Ｔｈｙ−１抗原およびモノクローナル抗体０ＫＴ４　（ｌｅｕ　３）　、０ＫＵ Ｔ５／８　（ｌｅａ　２）、０ＫＵＴ３．０ＫＵＴＩ　（ｌｅｕ　１）　、０Ｋ ＴＩ　１　（ｌｅｕ　５）、０ＫＴ６および０ＫＴ９によって限定される抗原を 含む多（のＴ細胞表面抗原を含む細胞表面上の何種類かのたんばく質群が含まれ る。ボール（Ｐａｕｌ）　、上述、ｐｐ、４５Ｂ−４７９゜Ｔ細胞レセプターと はＴ、ｉＨ胞裏表面存在する一部の抗原結合分子に対して用いられるＩ！句であ る。一群としてのＴ細胞レセプターはその多様性において免疫グロブリンと同様 の多裂的結合特異性を示す、成熟Ｔ細胞レセプターはアルファおよびベータ鎖か らなりその各々ｉよ可変（Ｖ）および不変（Ｃ）領域を有している。
Ｔ細胞レセプターが遺伝子組織および機能においてもつ免疫グロブリンに対する 類領性は、Ｔ細胞レセプターが保存的配列の領域を含んでいることを示している 。ライ　（Ｌａｉ）等、Ｎａ　Ｌｕｒｅ、３３１゜５４３−５４６　（１９８Ｂ ）。
代表的保存的配列にはアルファ頂のアミノ酸残基８４〜９０、ベータ鎖のアミノ 酸残基１０７〜１１５およびガンマ鎖のアミノ酸残？５９１〜９５および１１１ 〜１１６をコードする配列が含まれる。カバット、（Ｋａｂａｔ）等、上述、ｐ 、２７９゜（インテグリンおよび粘ｆ） ａｌｌ胞粘着に関する粘着性たんばく質はインテグリンと呼ばれる大きな関連た んばく賞群のメンバーである。インテグリンはベータおよびアルファサブユニッ トからなるヘテロダイマーである。
インテグリン群のメンバーには細胞表面糖たんばく賞血小板レセプター〇ｐＩＩ ｂ−ｍご、ビトロネクチンレセプター（ＶｎＲ）、フィブロネクチンレセプター （ＦｎＲ）および白血球粘着レセプターＬＦＡ−１，Ｍａｃ−１、Ｍｏ−１およ び６０，３が含まれる。
ローサチ（Ｒｏｕｓｈａｂｔｉ）等、５ｃｉｅｎｃｅ、　２３８　、　４９１　 ４９７（１９８７）、ｉ酸およびたんばく質配列データはこれらの群のメンバー 中、特にＧｐｎｂ−１［［ａＶｎＲおよびＦｎＲのベータ鎖、およびＶｎＲ，Ｍ ａｃ−１，ＬＦＡ−１，ＦｎｒおよびＧｐＩＩｂ−ｍａのアルファサブユニー／ 　）に保存的配列領域が存在することを示している。スズキ（Ｓｕｚｕｋｉ）等 、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ。
８３．８６１４−８６１８．１９８６；ギンスバーグ（Ｇｉｎｓｂｅｒｇ）等、 Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、２６２．　５４３７−５４４０．　１９８７゜以 下ＯＩＩ論は本発明の方法が免疫グロブリン遺伝子レパートリ−から保存的レセ プターコード遺伝子を単離するのに使用し得ることを示している。この議論は制 限するものでなく機能的に関連するレセプターをコードする保存的遺伝子群から １つの遺伝子を単離するのに使用し得る原則の応用を示すものである。
−ｉにこの方法は以下の要素を合せ持っている。
１、免疫学的レパートリ−の実質的部分を含む核酸の単離。
２、免疫グロブリンｖ６および、またはＶＬＳＩ域遺伝子を含むポルヌクレオチ ドセグメントをクローニングするためのポリヌクレオチドブライマーの！ｌｉ製 。
３、　レパートリ−からの複数の異なるｖＭおよびｖＬ遺伝子を含む遺伝子ライ ブラリーの調製。
４、別個でも同じ細胞中でもよいし、かつ同じ発現ベクターでも異なるベクター によってもよい、原核または真核性の過当な宿主におけるＶ８および、またはｖ Ｌポリペプチドの発現。
５、所定の活性に関する発現ポリペプチドのスクリーニングおよびスクリーニン グ過程で同定されるＶＭおよび、または■、コード遺伝子の分離。
本発明によって生産されるレセプターは競合的に阻害され得ることで示されてい る抗原、酵素基質などに特異的な結合部位をもつ構造を有している。ある態様に おいて、本発明のレセプターは所定の抗原に特異的に結合しその抗原と単離され る複合体の結合部位の間に十分強い結合をもつ複合体を形成する抗原結合部位を 合ポリペプチドであるときそのアフィニティーは一般に１０’Ｍ″１以上であり 、通常は１０”以上であり好ましくは１０”Ｍ”以上である。
別の態様において本発明のレセプターは基質と結合し３、その基質から産物を形 成する。触媒性レセプターのりガント結合部位のトポロジーが所定の活性に関し その基質へのアフィニティー（会合定数、ｐＫａ　）よりもより重要であるだろ うが一方本触媒性しセブターは所定の基質に対し一般に１０３Ｍ−’以上、通常 １０ｓまたは１０’Ｍ−’以上で好ましくは１０’Ｍ−’以上の会合定数を有し ている。
本発明によって産生されるレセプターはへテロニ量体であり、それゆえ通常各ポ リペプチド単独、すなわちモノマーのアフィニティーまたは会合定数とは異なり 好ましくは高くなる所定の基質に対する結合アフィニティーまたは会合定数を有 する構造を共に存している２つの異なるポリペプチド鎖から成っていることが好 ましい、異なるポリペプチド鎖の１つまたは両方は免疫グロブリンの軽鎖および 重鎮の可変領域に由来する。典型的に軽鎖（ＶＬ）および重ｆｉ　（Ｖ、　）の 可変領域からなるポリペプチドは所定のりガントの結合に一緒に使用される。
本発明によって産生されるレセプターは単量体同様多量体でも、ホモ体でもヘテ ロ体でも活性であるがヘテロニ量体が好ましい。
たとえば、本発明で産生されるｖＭおよびＶＬ　リガンド結合ポリペプチドはう まくヘテロニ量体を形成しヘテロニ量体の活性を調節し得るし、またはへテロニ 量体にユニークな活性を生成し得る。
個々のリガンド結合ポリペプチドはｖＸおよび■１と呼びまたへテロニ量体はＦ ｖと呼ぶ。
しかし、ｖＨＨ合ポリペプチドはｖ、Ｉに加えて実質的に全ての、または一部の 重鎮不変領域を含んでいるＩＩＶＬ結合ポリペプチドはＶＬに加えて、実質的に 全ての、または一部の軽鎖不変領域を含んでいる０重鎮不変ＮＭの一部を含む■ ９結合ポリペプチドと実質的に全ての軽鎖不変領域を含むＶＬ結合ポリペプチド からなるヘテロニ量体はＦａｂフラグメントと呼ばれる。Ｆａｂの生産はＦｖと 比較されるようにＦａｂ中に含まれる付加的不変領域配列がｖＨおよびＶＬの相 互作用を安定化し得ることからある状況では有利となり得る。このような安定化 はＦａｂに抗原に対するより高いアフィニティーを提供し得る。さらにＦａｂは 当分野でより一般的に使用されており、従ってＦａｂを特異的に認識するのに使 用可能な市販の抗体もある。
個々のｖＭおよび■、ポリペプチドは一般に約１２０アミ°ノ酸残基よりも小さ く、一方一般に６０アミノ酸残基以工で、通常には約１００アミノ酸残基以上で ある。ｖＭは約１１０〜約１２５アミノ酸ＴＡ基長であることが好ましく一方■ １は約９５〜約１１５アミノ酸残基長であることが好ましい。
アミノ酸残基配列は関連する特定のイディオタイプにより巾広く変化する。通常 、約６０〜７５アミノ酸残基で隔てられジスルフィド結合で結合している少なく とも２つのシスティンが存在する０本発明で産生されるポリペプチドは通常免疫 グロブリンの重鎖および、または軽鎖の可変領域のイディオタイプの実賀的コピ ーであるがある状況ではポリペプチドは望ましい活性に改善するためアミノ酸残 基配列にランダム突然変異を含んでいる。
ある状況ではＶオおよびｖＬポリペプチドに共有結合による架橋を提供すること が望ましく、このことはカルボキシル末端にシスティン残基を提供することで行 なわれる。このポリペプチドは通常免疫グロブリンネ変領域を含まないように調 製するが、ＤＮＡ合成プライマーの有利な選択に基づき少量のＪｉ域が含まれる ことがある０通常り領域が■。の転写物に含まれる。
別の状況では■、およびＶ。を結合するペプチドリンカ−を提供し、■ｏおよび Ｖ、からなる−末鎖抗原結合たんばく賞を形成することが望ましい、この−末鎖 抗原結合たんばく質は車−たんばく重鎖として合成される。このような−末鎖抗 原結合たんぽ（譬はバード（Ｂｉｒｄ）等（Ｓｃｉｅｎｃｅ、　２４２．　４２ ３　４２６　（１９８Ｂ））によって報告されている０適当なペプチドリンカ− 領域の設計はロバート・ランドナー（Ｒｏｂｅｒｔ　Ｌａｎｄｎｅｒ）により未 口特許第４．７０４．６９２号に報告されている。
このようなペプチドリンカ−は発現ベクターに含まれる核酸配列の一部として設 計し得る。このペプチドリンカ−をコードする核酸配列はＶ。およびｖＬＤＮ八 ホモへグの間にあり、発現ベクターにＶＸおよびＶＬ　ＤＮＡホモログを機能的 に結合させるのには制限エンドヌクレアーゼ部位が使用される。
またこのようなペプチドリンカ−は種々の遺伝子ライブラリーを調製するのに用 いるポリヌクレオチドブライマーの一部である核酸配列にコードし得る。このペ プチドリンカ−をコードする核酸配列は遺伝子ライブラリーを作るのに使用する いくつかのポリヌクレオチドブライマーに付随する核酸配列に由来するペプチド リンカ−をコードする核酸配列またはプライマーの１つに結合する核酸から作り 得る。
一般にｖ、ｌおよびｖＬポリペプチドのＣ端領域はＮ端よりも配列の多様性が大 きく、また本戦術に基づき、天然の■８およびＶ。
鎖を変化させるよう修正できる。また、合成ポリヌクレオチドを用い超可変領域 の１つ以上のアミノ酸を変化させ得る。
１、レパートリ−の単離 免疫学的遺伝子レパートリ−の実買的部分を含む核酸の組成物を調製するためｖ ＩＩおよび、またはＶＬポリペプチドをコードする遺伝子源が必要である。その 遺伝子源は異種の抗体産生細胞群、すなわちリンパ球（Ｂ細胞）、好ましくはを 推動物の循環器系または肺臓に存在するような転位Ｂ細胞群であることが好まし い（転位Ｂ細胞とは免疫グロブリン遺伝子の転座すなわち転位が起った細胞でこ れは隣接して存在する免疫グロブリン遺伝子Ｖ、　ＤおよびＪ領域転写物を含む ｍＲＮＡの存在で証明される）。
ある場合に核酸源として種々の年令、健康および免疫応答のを推動物由来の細胞 （ソース細胞）を使用することによるなど所定の活性についてそのレパートリ− をふり分けることが望ましい。
たとえば転位Ｂ細胞採集前に健康な動物を反復し免疫化すると高アフィニティー のりガント結合ポリペプチドを産生ずる遺伝物質に冨んだレパートリ−が得られ る。逆に、その免疫系が最近チャレンジを受けていない健康な動物由来の転位Ｂ 細胞の採集は高アフィニティｖＮおよび、または■Ｌポリペプチドの産生にバイ アスがかかっていないレパートリ−が生成する。
核酸を得るための細胞集団の遺伝的異種性が大きければ大きいほど本発明の方法 に従がうスクリーニングに使用し得る免疫学的レパートリ−の多様性も大きくな ることに注意しなければならない、したがって種々の個体からの細胞、特に免疫 学的に有意な年令差のある細胞および種々の株、種族または種由来の細胞をうま く組合せてそのレパートリ−の異暑性を高めることができる。
このように好ましいＢＰＪにおいてソース細胞はを推動物、好ましくはそれに対 する活性がめられている抗原性リガンドすなわち所定の抗原で免疫化または部分 的に免疫化した哺乳類から得られる。免疫化は従来のように行った。動物中の抗 体濃度は目的とするレパートリ−の豊富さに従かう望ましい免疫化段階を測定す ることによりモニターし得る。一般的に部分的免疫化を行った動物は１回の免疫 化のみが行なわれ、その細胞を応答が検出された直後に採集する。十分に免疫化 した動物は最高値を示し、このことは宿主動物に通常２〜３週間間隔で１回以上 の注射をくり返すことで得られる０通常、最後の注射後３〜５日目にそのｐｓ臓 を取り出し、その約９０パーセントが転位Ｂ細胞である肺細胞の遺伝的レパート リ−を標準法で単離する＊　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ門ｏ１ ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　、オースベル（Ａｕｓａｂｅｌ）等、曙、ジッ ンウィリー・アンド・サン社版、ＮＹ、Ｖ、および■１ポリペプチドをコードす る核酸はＩｇＡ、１．［）、１．Ｅ、ＩｇＧ＊たはＩ　ｇ　Ｍ−、最も好ましく は１．ＭおよびＩＫＧ産生細胞から誘導し得る。免疫グロブリン可変遺伝子を多 様性集団としてクローニングし得るゲノムＤＮＡのフラグメントの調製法はよく 知られている。たとえばバーマン（Ｒｅｒｒ＊ａｎｎ）等、？Ｉｅｔｈｏｄｓ　 ｉｎ　Ｅｎｚｙａｏｌ、１５２．　１８０−１８３　（１９８７）ｉフリ７シヤ ウフ（Ｆｒｉｓｃｈａｕｆ）　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌ、１５２． １８’３−１９０　（１９８７）　、フリ７シヤウフ（Ｆｒｉｓｃｈａｕｆ）、 Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｗｏｌ、１５２．　１９０−１９９（１９８７ ）、およびジレラ（Ｄｉｌｅｌｌａ）等、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏ ｌ。
１５２．１９９−２１２　（１９８７）参照、（ここで引用している参考文献中 の事項は参考として提示されている）。
望ましい遺伝子レパートリ−は可変ｖｉ域の転写物を示すメツセンジャーＲＮＡ または可変領域を発現する遺伝子を含むゲノムから単離し得る。他の非転位Ｂリ ンパ球由来のゲノムＤＮＡを用いる際の困難はイントロンで分離されている可変 領域コード配列を並置することにある。適正なエクソンを含むＤＮＡフラグメン トを単離し、イントロンを切除し、さらにエクソンを正しい順序で正しい方向に スプライスしなければならない、多くの場合このことは困難であり、その結果転 位Ｂ細胞を用いる別の方法はＣ，ＤおよびＪ免疫グロブリン遺伝子領域が隣り合 うよう転位するような方法であり、この方法によりその配列は全可変′１！域に 、関して連続的となる（イントロンなし）。
ｍＲＮＡを用いる場合、細胞をＲＮａｓｅ阻害条件下で溶解する。
１つの態様における第１ステツプはオリゴｄＴセルロースカラムへのハイブリダ イゼーションによる全細胞ｍＲＮＡの単離である。
重鎮および、または軽鎖ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの存在は、適当な遺 伝子の一本Ｅｌ　Ｄ　Ｎ　Ａとのハイブリダイゼーションにより検定し得る＊Ｖ ＭおよびｖＬの不変９Ｘ域をコードする配列をポリヌクレオチドプローブとして 用いると便利であり、その配列は使用可能なものから得ることができる。たとえ ばアーリー（１！ａｒｌｙ）およびブード（１’１ｏｏｄ）、　Ｇｅｎｅｔｆｃ 　Ｅｒ＋ｇｉｎｅｅｒｉＩｌ１ｇ＋セントロ−（Ｓｅｔｌｏｈ）およびホレンダ ー（Ｈｏｌｌａｅｎｄｅｒ）　ＩＪＡ、第３−ｔｌ、ブレナムパブリッシングコ ーボレーシデン、ＮＹ、（１９８１）、ｐｐ。
１５７−１８８、およびカバフト（Ｋａｂａｔ）等、“免疫学的に興味のある配 列”　、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ、、ベセ スダ、ＭＤ（１９８７）参照、好ましい態様においてまず細胞性ｍ　ＲＮ　Ａに ついてｖ翼および■Ｌココ−ｍＲＮＡを濃縮する。一般に濃縮は全ｍ　ＲＮ　Ａ 　ｙ４製物またはその部分精製ｍＲＮＡを本発明のポリヌクレオチド合成プライ マーを用いたプライマー伸長反応にかけることにより行なわれる。
２、ポリヌクレオチドブライマーの調製プライマー、プローブおよびプライマー 伸長により合成される核酸フラグメントまたはセグメントに関し本明細書で用い ている１ポリヌクレオチド”という言葉は２つ以上、好ましくは３つ以上のデオ キシリボヌクレオチドまたはりボヌクレオチドからなる分子を意味する。その正 確な大きさは多くの因子に依存しまたその事自体が使用する条件に依存する。
本明細書で用いている°プライマー′という語は核酸の制限消化物から精製され る場合も合成的に作られる場合もある核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物の合 成が誘導される条件下、すなわちヌクレオチドおよび重合に必要なりＮＡポリメ ラーゼ、逆転写ｆＩＩ素などの試薬の存在下および適当な温ＩおよびｐＨに置か れたときに合成の関殆点として働き得るポリヌクレオチドを意味する。
効率が最高となるためにはこのプライマーは一本鎖であることが好ましいが二本 鎖でもよい、もし二本鎖ならプライマーをまず伸長反応に使うまえに鎖を解離し ておく、このプライマー中レオキシリボヌクレオチドであることが望ましい、プ ライマーは重合用の試薬の存在下伸長反応物の合成を開始するのに十分な長さ長 さをもっていなけれｔｉならない、プライマーの正しい長さは温度およびプライ マーの起源などを含む多くの因子に依存する。たとえば標的配列の複雑性に依存 して通常ポリヌクレオチドブライマーは１５〜２５以上のヌクレオチドを含むが より少ないヌクレオチドからなることもある。一般に短かいプライマー分子はテ ンプレートと十分に安定なハイブリッド複合体を形成するためにより低い温度を 必要とする。
ここで使用されるプライマーは合成もしくは増巾される各特異的配列をもつ鎖に １実質的に”相補的となるように選択される。
このことはそのプライマーが各々のテンプレート鎖に非ランダムにハイブリダイ ズするのに十分な相補性を有していなければならない、それゆえ、このプライマ ー配列はテンプレートの配列を正確に反映しているものではない、たとえば非相 補的ヌクレオチドフラグメントも、そのプライマー配列の別の部分がその鎖に実 質的に相補的であるならそのプライマーの５′末端に結合し得る。
一般にこのような非相補的フラグメントはエンドヌクレアーゼ制限部位をコード している。別にもしプライマー配列が合成または増巾される鎖の配列と実質的に 相補的てそれと非ランダム的にハイブリダイズし、それによりポリヌクレオチド 合成条件下伸長産物を形成するなら非相補的塩基またはより長い配列はそのプラ イマー中に点在し得る。
ポリヌクレオチドブライマーはたとえばホスホトリエステルまたはホスホジエス テル法など適当な方法でｔＡ製し得る（ナラング（Ｎａｒａｎｚ）等、門ｅｔｈ 、　［ｉｎｚｙｍｏｌ、６８．　９０　（１９７９）　：米国特許第４，３５６ ，２７０号およびブラウン（Ｂｒｏｗｎ）等、門ｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｓｏｌ、　 ６　Ｂ＋１０９　（１９７９））。
プライマーのヌクレオチド配列の選択は目的とするレセプターモコードする領域 からの核酸における距離、使用する第２プライマーに対する核酸上のハイブリダ イゼーシッン部位、それがハイブリダイズするレパートリ−中の遺伝子の数など の因子に依存する。
たとえばプライマー伸長により■８コードＤＮＡホモログを作るため、プライマ ーのヌクレオチド配列は機能性（結合し得る）ポリペプチドが得られるようにｖ ）ｌコード領域に実質的に隣接する部位で多数の免疫グロブリン重鎖遺伝子とハ イブリダイズするように選択する。多種類のｖＭコード核酸配列とハイブリダイ ズするにはプライマーは種々の饋内に保存されているヌクレオチド配列に実質的 に相補的でなければならない、このような部位には不変領域、可変領域フレーム ワーク領域、好ましくは第３フレームワーク頚域、リーダー領域、プロモーター 領域、５ｇ域などに含まれるヌクレオチド配列がある。
モジＶ、コードおよびＶ、コードＤＮＡホモログをポリメラーゼチェーンリアク シラン（ＰＣＲ）増巾で生成する場合、増巾する核酸の各コード鎖用に２つのプ ライマーが用いられる。第１プライマーはナンセンス（マイナスまたは相補）！ １の一部であり、レパートリ−内のＶＮ　（プラス）頓に保存されるヌクレオチ ド配列にハイブリダイズする。■、コードＤＮＡホモログを生成するためには第 １プライマーを選んで免疫グロブリン遺伝子のＪＷｉ３１ｉ、ＣＨＩ領域、ヒン ジ領域、ＣＨ２領域またはＣＨ３領域内に保存される領域にハイブリダイズ（す なわち相補的である）させる。
■ＬコードＤＮＡホモログを生成するためには第１プライマーを選んで免疫グロ ブリン軽鎖遺伝子のＪ領域または不変領域内に保存される領域にハイブリダイズ （すなわち相補的）させる、第２プライマーはコード（プラス）鎖の一部であり マイナス鎖に保存されるヌクレオチド配列にハイブリダイズする。■おコードＤ ＮＡホモログを生成するためには第２プライマーを選んでリーグ領域または最初 のフレームワーク領域をコードする領域内のような■９コード免疫グロブリン遺 伝子の５′端に保存されるヌクレオチド配列にハイブリダイズさせる。Ｖ、Ｉお よびＶ、コードＤＮＡホモログ両方の増巾には第２プライマーの保存的５′側ヌ クレオチド配列はロー（Ｌｏｈ）等により報告されている方法により（Ｓｃｉ、 ２４３＋２１７−２２０　（１９８９））外から付加した配列に相補的であるこ とに注意せよ。第１および第２プライマーのいずれかまたは両方はエンドヌクレ アーゼ制限部位を示すヌクレオチド配列を含み得る。この部位は増巾される免疫 グロブリン遺伝子とは異なり得て一般にそのプライマーの５′末端またはその近 傍にある。
また本発明のプライマーはＤ　Ｎ　Ａ依存ＲＮＡポリメラーゼプロモーターまた はその相［配列を含む、たとえばクリーブ（Ｋｒｔｅｇ）等、ＮｕｃｌｅｉｃＡ ｃｉｄｓＲｅｓ、１２．　７０５７−７０　（１９８４）　；スタジア（Ｓｔｕ ｄｊｏｒ）等、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｌｏｌ、１８９．　１１３−１３０（１９８ ６）；およびモレキュラークローニング；ラボラトリ−マニュアル、第２編、マ 二アチス（Ｍａｎｉａｔｉｇ）等線、コールドスプリングハーバ−１ＮＹ（１９ ８９）参照。
ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むプライマーを用いるときその プライマーは増巾するポリヌクレオチド鎖にハイブリダイズし、かつＤＮＡ依存 ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの第２のポリヌクレオチド舖は大腸菌ＤＮＡポ リメラーゼｌまたは大腸ＷＤＮＡポリメラーゼのクレノーフラグメントなどの誘 導試剤を用いて完全なものとなる。ＲＮＡポリヌクレオチドとＯＮＡポリヌクレ オチドの間を往復することにより出発ポリヌクレオチドが増巾する。
またプライマーにテンプレート配列またはＲＮ　Ａ指向ＲＮＡポリメラーゼの複 製開始部位を含めることもある。典型的ＲＮＡ指向ＲＮＡポリメラーゼにはりザ ルディ　（Ｌｉｚａｒｄｉ）等により報告されているＱβレプリカーゼが含まれ る（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｆｆｉｙ＋　６．１１９７−１２０２　（１９８８ ））。
ＲＮ人指ｒｉｉ］ＲＮＡポリメラーゼはテンプレート配列または複製開始部位を 含む少ないテンブレー）ＲＮＡ［から大量のＲＮＡＩ！ｊを生成する。一般にこ れらのポリメラーゼはフレマー（Ｋｒａａｅｒ）等Ｕ、　Ｍｏ１．　Ｂｊｏｌ、 ８９．　７１９−７３６　（１９７４）　）により報告されているようにテンプ レート鎖を１００万倍に増巾する。
３、遺伝子ライブラリーの調製 単離したレパートリ−内に含まれる■９および、または■、遺伝子をクローニン グすなわち実質的に再生するのに用いる戦術は当分野でよく知られているように レパートリ−を作り上げている核酸のタイプ、ｎｉ性および純度に依存する。他 の因子にはその遺伝子が増巾および、または変異を受けるかどうかが含まれる。
１つの戦術においてその目的はｍＲＮＡおよび、またはゲノムＤＮＡのセンス鎮 などポリヌクレオチドコード鎖からなるレパートリ−から■。および■１コード 遺伝子をクローン化することである。もしそのレパートリ−が二本鎖ゲノムＤＮ Ａの形体であるならば通常まず一般的には融解により１本鎖に変性される。その レパートリ−を所定のヌクレオチド配列を有する第１ポリヌクレオチド合成プラ イマーで処理することにより第１プライマー伸長反応を行う、この第１プライマ ーはレパートリ−内に保存されている長さ少なくとも約１０ヌクレオチド、より 好ましくは少なくとも約２０ヌクレオチドのヌクレオチドにハイブリダイズする ことにより第１プライマー伸長反応を開始し得る。この第１１ライマーは核酸の コードまたはセンス鎖にハイブリダイズすることからしばしばセンスプライマー と呼ばれる。さらに第２プライマーは核酸の非コードまたはアンチセンス鎖、す なわちコード鎖に相補的な鎖にハイブリダイスすることから°アンチセンス鎖１ と呼ばれる。
第１プライマー伸長は好ましくは所定量のレパートリ−の核酸を好ましくは所定 量の第１プライマーと混合し第１プライマー伸長反応混合物を作ることにより行 う、この混合物をポリヌクレオチド合成条件下に第１プライマー伸長反応産物が 形成するのに十分な一般的には所定の時間維持することにより多種多様なＶ、コ ードＤＮＡホモログ相補体が生成する。それからこの相補体を所定のヌクレオチ ド配列をもつ第２ポリヌクレオチド合成プライマーで処理することにより第２プ ライマー伸長反応を行う、この第２プライマーはたとえば′！ＪＪ１プライマー 伸長反応によって生産されたものなどの多９ｆｌＶヨコード遺伝子相補体に保存 される好ましくは長さ少なくとも約１０ヌクレオチド、より好ましくは長さ少な くとも約２０ヌクレオチドのヌクレオチド配列にハイブリダイズすることにより 第２反応を開始し得る。このことは好ましくは所定量の相補的核酸と好ましくは 所定量の第２プライマーを混合し第２プライマー伸長反応１合物を作ることによ り行う、この混合物を第１プライマー伸長反応産物の形成に十分な一般的には所 定の時間ポリヌクレオチド合成条件に維持することで多種のＶ。
および、または■、コードＤＮＡホモログを含む遺伝子ライブラリーを作る。
多数の第１および、または多数の第２プライマーを各増巾で使用し得るし、また 第１および第２プライマーの個々のペアも使用し得る。どちらの場合でも第１お よび第２プライマーの同じまたは異なる組合せ物を使用した増巾産物を合せて遺 伝子ライブラリーの多線性を増加し得る。
別の＠術ではその目的はｍ、ＲＮＡを逆転写反応にかけることにより生産される ポリヌクレオチドまたはゲノム二本鎖のアンチセンス鎖などのレパートリ−のポ リヌクレオチド相補体を提供するこをによりそのレパートリ−から■イーおよび 、またはＶ、コード遺伝子をクローン化することである。これらの相補体を生成 する方法はよく知られでいる。この相補体に対し上述の第２プライマー伸長反応 、すなわち多種のＶ９コード遺伝子相補体に保存されているヌクレオチド配列に ハイブリダイズし得るポリヌクレオチド合成プライマーを用いたプライマー伸長 反応と同じプライマー伸長反応を行う。
このプライマー伸長反応はいくつかの適当な方法で行なわれる。
一般に好ましくはｐＨ７〜９、もっとも好ましくは約８の緩衝液中で行う０モル 数で過剰のプライマー（ゲノム核酸については通常約１０”：１プライマー：テ ンプレート）をテンプレート頷を含むバッファに添加する。この過程を効率よく 行うためには大モル過剰のプライマーを用いるのが好ましい。
またデオキシリボヌクレオチド三リンａｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ。
ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰを適当量このプライマー伸長（ポリヌクレオチド合成） 反応混合物に入れ、９０℃〜１００℃で約１〜１０分間、好ましくは１〜４分間 加熱する。加熱後この溶液を室温まで冷却する。このことでプライマーのハイブ リダイゼーシヲが起こる。冷却した混合物にプライマー伸長反応を誘導または触 媒する適当な試薬を入れ、この分野でよく知られている条件下で反応を進行させ る。この合成反応は室温から誘導試薬がもはや有効にｉ能しなくなる温度までの 範囲で進行する。したがってたとえばＤＮＡポリメラーゼを誘導試薬として用い ると一般にその温度はせいぜい約４０℃である。
誘導試薬としてはプライマー伸長産物の合成を遂行するよう機能するならどのよ うな化合物でもシステムでもよく、これには酵素も含まれる。本目的のための酵 素には、たとえば大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ■、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのク レノーフラグメント、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、その他使用可能なりＮＡポリメ ラーゼ、逆転写酵素および熱的に安定な酵素も含む、各核酸鎖に相補的なプライ マー伸長産物を形成するようにヌクレオチドを正しく結合していく酵素が含まれ る。一般にこの合成は各プライマーの３′端から開始しテンプレート鎖に沿って 合成が止まるまで５′方向に進行していき、種々の長さの分子を生成する。しか しながら上述と同様のプロセスを用いながらその５′端から合成を開始し、上述 の方向に進行する誘導試薬もある。
またこの誘導試薬はＲＮＡプライマー伸長産物の合成を遂行する化合物またはシ ステムでもよく、これには酵素が含まれる。好ましい態様においてその誘導試薬 にはＴ４ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼまたはＳ　Ｐ　６　ＲＮ ＡポリメラーゼなどのＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼがある。これらのポリメラ ーゼは相補的なＲＮＡポリヌクレオチドを生成する。チャンバリン（Ｃｈａｍｂ ｅｒｌｉｎ）等（Ｔｂｅ　Ｅｎｚｙｍｅ、　Ｐ、ボイアー（Ｂｏｖｅｒ）、　ｐ ｐ、８７−１０８、アカデミツクプレス、ニューヨーク（１９８２）　）によて 報告されているようにＲＮＡポリメラーゼは高ターンオーバー速度で出発ポリヌ クレオチドを増巾する。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのもう１つの利点はｃＤＮＡの １部を１つ以上の変異原オリゴヌクレオチド（ポリヌクレオチド）で置換し、こ の部分的にミスチド合成に変異を導入し得ることである（ジョイス（Ｊｏｙｃｅ ）等、Ｎａｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｃｌｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、１７　、　７１１− ７２２　（１９８９）　。
転写に基づく増巾システムはギンゲラス（Ｇｉｎｇｅｒａｓ）等ＣＰＣＢプロト コール、方法と応用へのガイド、ｐｐ、２４５−２５２、アカデミツクプレス、 サンディエゴ、ＣＡ　（１９９０））によって報告されている。
もし誘導試薬がＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼで、それゆえ、リボヌクレオチド 三リン酸を含んでいるなら、十分な量のＡＴＰ。
ＣＴＰ、ＧＴＰおよびＵＴＰをプライマー伸長反応混合物に添加し、この溶液を 上述のように処理する。
新しく合成された鎖およびその相補鎖は二本鎖を形成しこのプロセスの次のステ ップに使用し得る。
先にｖｌ論した第１および、または第２プライマー伸長反応をうまく使用しレセ プターの中にレセプターの免疫学的検出および、またはｔａに宵用な所定のエピ トープを組込むことができる。このことは４ｉ／１．１および、または第２ポリ ヌクレオチド合成プライマーまたは発現ベクターを用い所定のアミノ酸残基配列 をレセプターのアミノ酸残基配列の中に組込むことによって行う、。
レパートリ−内の多種多様な■１およびＶ、コード遺伝子に対しｖｌ、Ｉおよび 、または■、コードＤＮＡホモログを作った後一般的にはそのホモログを増巾す る。■６および、またはＶ、コードＤＮＡホモログは自己複製ベクターへの岨込 みなどの従来技術で増申し得るがまず、それらのＤＮＡホモログをベクターに挿 入する荊にこれらをポリメラーゼチェーンリアクンジン（ＰＣＲ）にかけ増巾し た方が好ましい、事実好ましい戦術では遺伝子ライブラリーの作製に用いた第１ および、または第２プライマー伸長反応はポリメラーゼチェーンリアクンジンの 第１および第２１ライマー伸長反応である。
一般的にＰＣＲはポリヌクレオチド合成と形成された二本鎖の変性を含むサイク ルを回す、すなわち１つの混合物内で上述の第１および第２プライマー伸長反応 を同時に行うことにより行う。
ＤＮＡホモログを増巾する方法およびシステムはムリス（Ｍｕｌｌ　ｉｓ）等（ 米国特許第４，６８３，１９５号および第４，６８３，２０２号）により報告さ れている。
好ましい態様においては増巾反応に第１および第２プライマー１対が使用される 。各々種々のプライマ一対を用いた種々の増巾に由来する増巾反応産物を合せる 。
しかし、本発明は共増巾（２対のプライマーの使用）および多重増巾（約８．９ または１０対までのプライマーの使用）によるＤＮＡホモログ産物にも関する。
一般にＰＣＲ増巾で得たＶ、およびｖＬコードＤＮＡホモログは二本鎖であり、 かつ各末端近傍にエンドヌクレアーゼ制限部位のヌクレオチド配列を有している 。それらの末端近傍に制限部位をもつＶ、およびＶ、コードＤＮＡホモログの１ つ以上のエンドヌクレアーゼによる消化で所定の特異性を有する粘着末端をもつ ホモログができる。
好ましい態様においてはこのＰＣＲ工程はライブラリーのｖＮおよび、または■ 、コードＤＮＡホモログを増巾するだけでなくライブラリーに変異を誘導しより 異質性の高いライブラリーを提供する。まずＰＣＲは当分野でよく知られている 多くの因子により木質的に変異原的性質を有することに注意しなければならない 。
第２に上述のＵ、Ｓ、特許第４，６８３．１９５号で報告されているような変化 を誘導する変異に加えて、他の変異を誘導するＰＣＲも使用し得る。たとえば、 ＰＣＲ反応混合物、すなわち第１および第２プライマー伸長反応混合物を合せた ものは伸長反応産物に取り込まれる１つ以上のヌクレオチドの量を変えてｖ４製 する。このような条件ではＰＣＲ反応は特定の塩基の涸渇の結果伸長産物内にヌ クレオチド置換を起こす、同様にＸ回のサイクルを行うのに十分な量でほぼ等モ ル量のヌクレオチドで最初のＰＣＲ反応混合物を作りついでたとえば２Ｘのよう なＸ過剰で反応サイクルをまわす、別に、通常増巾されるレパートリ−の核酸中 には見られないイノシンなどのヌクレオチド誘導体を反応混合物中に入れること によりＰＣＲ反応反応度異を誘導し得る。つづくインビボ増巾の際、このヌクレ オチド誘導体は置換ヌクレオチドに置き換えられ点突然変異が誘導される。
４、Ｖ＋ｔまたはＶ、ＤＮＡホモログの発現上述の方法で作られたライブラリー 中のｖ９および、またはＶＬ　ＤＮＡホモログは増巾および、または発現のため ベクターに機能的に結合する。。
本明細書で用いられているように“ベクター”とは機能的に結合するもう１つの 核酸を別の遺伝的環境から転移し得る核酸分子である。１つの好ましいベクター はエビソーム、すなわち染色体外複製可能な核酸分子である。好ましいベクター は自己複製およびそれが結合している核酸の発現が可能なものである。Ｉ！能的 に結合する遺伝子の発現を行ない得るベクターを“発現ベクター“と呼ぶ＊ＶＮ および、または■１コードＤＮＡホモログを機能的に結合するベクターの選択は 当分野ではよく知られているように望ましいｍ脆性、たとえば複製またはたんば く賞発現およびトランスホームされる宿主細胞に依存するがこれらは組換えＤＮ Ａ分子の構築技術に木質的な制限となる。
好ましい態様において使用するベクターは原核性レプリコン、すな０ち自己複製 およびＴＢ面宿主細胞などトランスホームされた原核性宿主細胞中で染色体外で その組換えＤＮＡ分子を維持する能力を有するＤＮＡ配列が含まれる。このよう なレプリコンは当分野でよく知られている。さらに原核性レプリコンを含むこれ らの態様は、その発現が薬剤耐性のような選択的利点をトランスホームした宿主 細面に付与する遺伝子も含んでいる。典型的細面薬剤耐性遺伝子はアンピシリン またはテトラサイクリンに対する耐性を付与するものである。
原核性レプリコンを含むベクターにはトランスホームを受けた大Ｗｉｌｌ菌など 細菌宿主細胞中でｖ、Ｉおよび、またはｖＬコードホモログを発現（転写および 翻訳）し得る原核性プロモーターも含んでいる。プロモーターとはＲＮＡポリメ ラーゼの結合を可能にし転写を開始させるＤＮＡ配列で形成される発現コントロ ール要素である。細面宿主に適合するプロモーター配列は一般に本発明のＤＮＡ セグメントを挿入するのに便利な制限部位を含むプラスミドベクター中に提供さ れる。これらのベクタープラスミドにはバイオラドラボラトリ−（リッチモンド 、ＣＡ）から市販されているｐｕｃｓ、Ｉ）ＵＣ９，ｐＢＲ３２２およびｐＢＲ ３２９およびファルマシア（ビス力タウェイ、ＮＪ）から市販されているｐＰＬ およびｐＫＫ２２３がある。
真核細胞に適合する発現ベクター、好ましくはを推動物細胞に適合するものも使 用し得る。真核細胞発現ベクターもこの分野ではよく知られており、い（つかの 業者から市販されている。一般にこのようなベクターは目的とするＤＮＡホモロ グの挿入用に便利な制限部位を含んでいる。このようなベクターにはｐｓＶｌ、 およびｐＫｓＶ−１０（７ｙルア：＞７）　、ｐＢＰＶ−１／ｐＭＬ２ｄ（イン ターナシラナルバイオテクノロジー）およびｐＴＤＴＩ（八ＴＣＣ，Ｎｏ、　３ １’２５　Ｓ）がある。
好ましい態様において使用される真核細胞発現ベクターには真核細胞中で有効な 選択マーカー、好ましくは薬剤耐性選択マーカーが含まれている。好ましい薬剤 耐性マーカーは発現によってネオマイシン耐性となる遺伝子、すなわちネオマイ シンホスホトランスフェラーゼ（ｈ　ｅ　ｏ）遺伝子である。サウザーン（Ｓｏ ｕｔｈｅｒｎ）等、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、１．　３２７− ３４１　（１９８２）　。
本発明はｖＭおよび、またはＶ、コードＤＮＡホモログの遺伝子の発現用のレト ロウィルス発現ベクターの使用にも関する９本明細書で用いられているように“ レトロウィルス発現ベクター”とはレトロウィルスゲノムのロングターミナルリ ピート（ＬＴＲ）領域由来のプロモーター配列を含むＤＮＡ分子を意味する。
好ましい態様において一般に発現ベクターは真核細胞中好ましくは複製不能なレ トロウィルス発現ベクターである。レトロウィルスベクターの構築および使用法 はソルジ（Ｓｏｒｇｅ）等（Ｍｏ１．Ｃｅｌ。
Ｂｉｏｌ、、４．１７３０−１７３７　（１９８４））により報告されている。
相補的な粘着末端を介してＤＮＡをベクターに機能的に結合する多くの方法が開 発されてきている。たとえば相補的粘着末端を先にｌＩ論したように適当に設計 したポリヌクレオチド合成プライマーを用いてプライマー伸長反応の際に■舅お よび、または■ＬコードＤＮＡホモログに作ることができる。そのベクターおよ び必要ならばＤＮＡホモログを制限酵素で切断しＤＮＡホモログの末端に相補的 な末端を作る。このベクターおよびＤＮＡホモログの相補的粘着末端をｉ能的に 結合させ１つの三木’ＪＤＮＡ分子とする。
好ましいＬｉ碌においては多様なライブラリーのｖ、ｌおよびＶＬコードＤＮＡ ホモログをインビトロでランダムに結合し、個々のベクターからポリジストロニ ックな発現を可能にする。すなわち二本鎖Ｄ　Ｎ　Ａ発現ベクターの多様性集団 ができる。そこでは単一のプロモーターのコントロール下各ベクターは１つの■ 。コードＤ　Ｎ　Ａホモログおよび１つの■１コードＤＮＡホモログを発現する がその集団の多様性は異なるｖ８およびｖＬコードＤＮＡホモログの組合せによ る。インビトロでのランダムな組合せは両方に共通な各々の制限部位の位置によ り互いに区別可能な２つの発現ベクターを用いて行ない得る。そのベクターは本 明細書に述べられてるようなラムダＺａｐ由来のベクターのように線状二本１［ ＤＮＡであることが好ましい、第１のベクターではその部位はプロモーターとポ リリンカーの間、すなわちポリリンカーの５′側（発現の方向で上流）であるが プロモーターの３′側（発現の方向で下流）に位置する。第２ベクターではポリ リンカーはプロモーターと制限部位の間にあり、すなわち制限部位はポリリンカ ーの３′側にあり、かつそのポリリンカーはプロモーターの３′側にある。
好ましいＬＬ様では各々のベクターはりボゾーム結合配列およびリーダー配列を 有しており、その配列はプロモーターおよびポリリンカーの間に位置するがもし 制限部位がプロモーターとポリリンカーの間にあるならそれは共有される制限部 位の下流（３′側）に位Ｉする。またベクターは停止コドンをポリリンカーの下 流で、もし制限部位がポリリンカーの下流にあるときは共有される制限部位の上 流に含むことが好ましい、第１および、または第２のベクターはペプチドｔａｇ をコードするヌクレオチド配列を含み得る。
一般にこのｔａｇ配列はポリリンカーの下流でもし停止コドンがあるならその上 流に位！する。好ましいｔｉｎではベクターはそのベクターの一部分、すなわち 特定のラムダアームの存在を選択し得る選択可能マーカーを含んでいる。典型的 選択マーカーは当分野でよく知られている。このようなマーカーの例には抗生物 質耐性遺伝子、遺伝的選択セーカー、マンバーサブレフッ５ンなどの変異サプレ ッサーなどがある。一般に選択可能マーカーｔよプロモーターの上流および、ま たは第２の制限部位の下流に位置する。好ましい＆ｉ様においては１つの選択可 能マーカーはｖＨコードＤＮＡホモログを含む第１ベクターのプロモーターの上 流に位置する。
第２の選択可能マーカーは■、コードＤＮＡホモログを含むベクターの第２制限 部位の下流に位置する。■舅コードベクターおよびＶ、コードベクターが第１制 限部位を介してランダムに結合するとき両■。およびｖＬおよび両選択可能マー カーを含むベクターが選択されるならばこの第２選択可能マーカーは第１マーカ ーと同じものでも異なるものでもよい。
一般にポリリンカーは１つ以上、好ましくは少なくとも２つの制限部位を含んで いる。そしてそれら各々はそのベクターにユニークなものでかつ別のベクターに 共有されていないことが好ましい、すなわちそれが第１ベクターにあるなら、第 ２ベクターにない方がよい、ポリリンカー制限部位は、リーダー、ｔａｇまたは 停止コドン配列が存在するのと同じ読み枠でベクター中にｖＸまたはｖＬコード ＤＮＡホモログをライゲージシンし得るよう配向させる。
ランダムな組合せは一般的にはポリリンカー内の制限部位で第１ベクターにｖＨ コードＤＮＡホモログをライゲージシンすることにより行う、同様にＶＬコード ＤＮＡホモログは第２ベクターにライゲージシンされ、それにより２つの多様性 発現ベクター集団ができる。どちらのタイプのＤＮＡホモログ、すなわちｖＮま たはＶ、がどちらのベクターにライゲージシンしても問題ないが・たとえば全て のｖ、４コードＤＮＡホモログが第１または第２ベクターのいずれかとライゲー ジシンし、かつ全てのＶＬコードＤＩＪＡホモログが第１または第２ベクターの いずれかとライゲージシンすることが望ましい、それから両集団のメンバーを共 有される制限部位を一般的には同じ酵素で両集団を消化することにより切断する 。生成した産物はメンバーの粘着末端が他のメンバーの粘着末端と相補的である ような制限フラグメントの２つの多様性集団である。この２つの集団の制限フラ グメントを互−いにランダムにライゲージシンする。すなわちランダムな集団間 ライゲージ５ンを行ない同じ読み枠に存在しかつ第２のべ゛ゲタ゛；のプロモー ターのコントロール下のｖつコードおよびｖＬコードＤＮＡホモログを各々有す るベクターの多様性集団を作る。もちろん２つの集団からのメンバーのライゲー ジシンで再生する共有される制限部位での切断と再ライゲージテンにより組換え が可能である。
生成した構築物を適当な宿主に導入し別々にまたは組合せてｖ８および、または ｖＬコードＤＮＡホモログを増巾および、または発現させる。同じもしくは別々 のベクターで同じ生物内で共発現させたとき、機能性Ｆνが生成するｅＶＭおよ びｖＬポリペプチドを別の生物中で発現させる場合は各ポリペプチドを単離し適 当な媒体中で合そることによりＦｖが形成される。Ｖ、および、またはｖＬコー ドＤＮＡホモログ含有構築物を導入した細胞宿主は本明細書で“トランスホーム されたもの”または１トランスホーマント”と呼ぶ。
この宿主細胞は原核生物でも真核生物でもよい、細菌細胞は好ましい原核性宿主 細胞であり一般にベセスダリサーチラボラトリーズ社（ベセスダ、ＭＤ）から市 販されてる大腸１１ＤＨ５株などの人腸凹が用いられる。好ましい真核性宿主細 胞にはイーストおよび哺乳類細胞が含まれ、マウス、ラット、モンキーまたはヒ トの細胞系列などを推動物細胞が好ましい。
本発明の組換えＤＮＡ分子による適当な宿主細胞のトランス未−メーシヲンは一 般的に使用されるベクターのタイプに依存した方法で行う、原核性宿主細胞のト ランスホーメーシッンに関してはたとえばコーエン（Ｃｏｈｅｎ）等、Ｐｒｏｃ 、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ。
６９．２１１０　（１９７２）；およびマニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等、Ｍ ｏｌ＠ｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉ口ｇ、ラボラトリ−マニュアル、コールドスプリ ングハーバ−、ＮＹ（１９８２）参照、ｒＤＮＡを含むレトロウィルスベクター によるを推動物のトランスホーメーションに関してはソルジ（Ｓｏｒｇｅ）等、 Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　４．　１７３０−１７３７（１９８４）、 グラハム　（Ｇｒａｈａａ＋）等、Ｖｉｒｏｌ、５２．　４５６（１９７３）： およびウィグラー（Ｗｉｇｌｅｒ）等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。
Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７６．１３７３−１３７６　（１９７９）参照。
５、ＶＷおよび、またはＶ、ポリペプチドの発現に関するスクリーニング うまくトランスホームした細胞、すなわちベクターに４ｉＩ能的に結合した■８ および、またはＶ、コードＤＮＡホモログを含む細胞はりガントへのレセプター の結合またはそのレセプター好ましくは活性部位をコードするポリヌクレオチド の存在を検出する過当な従来技術により同定し得る。好ましいスクリーニング法 には直接的にしろ間接的にしろ検出可能なシグナルがレセプターとリガンドの結 合により生成する方法である。このようなシグナルにはたとえば複合体の生成、 触媒反応産物の形成、工Ｊルギーの放ンスホーメーシヲンした細胞をクローン化 し、モノクローナルコロニーを調製し得る。コロニーから細胞を収穫し、溶解後 、それらのＤＮＡについてサウザーン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）　（Ｊ、　Ｍｏ１． 　Ｂｉｏｌ、　９　Ｂ　＋５０３　（１９７５））またはベレフト（Ｂｅｒｅｎ 　ｔ）等（Ｂｉｏｔｅｃｈ。
３．２０８　（１９８５）の方法に従かいｒＤＮＡの存在を試験する。
ｖ、ｌおよび■、コードＤＮＡホモログの存在を直接検定するのに加えてトラン スホーメーシッンは特に■６および、または■。
ポリペプチドが所定のエピトープを含む場合など従来の免疫学的方法により確認 される。たとえばトランスホームした細胞サンプルいついて所定のエピトープに 対する抗体を用い、そのエピトープの存在を検定する。
６、ｖ、および、またはＶ、コード遺伝子ライブラリ一本発明は好ましくはここ で述べられているプライマー伸長反応またはプライマー伸長反応の組合せで生成 され、少なくとも約１０３、好ましくは少なくとも１０４、そしてより好ましく は約１０’の異なる■。および、またはＶＬコードＤＮＡホモログを含む遺伝子 ライブラリーに関する。このホモログはたとえばプライマー伸長反応試薬および 、または基質、ゲノムＤＮＡセグメントなどの物質を実質的に含まないことが好 ましい。
好ましいＬｉ様においてライブラリー中に存在するホモログの実質的部分はベク ターに機能的に結合しており、好ましくは発現のために発現ベクターに機能的に 結合している。
このホモログは水や緩衝剤を含む水などインビトロでの取扱いに通した媒体中に 存在することが好ましい、この媒体はホモログの往動学的活性の維持に適合して いるべきである。さらに、このホモログは合理的頻度でホモログに適合する宿主 細胞にトランスホーメーソッンすることが十分可能な１度で存在するべきである 。
さらにこのホモログはこれでトランスホームした適合する宿主細胞中に存在する ことが好ましい。
Ｄ９発現ベクタ一 本発明はとりわけ本発明の方法を行うのに有用な種々の発現ベクターに関する。
各々の発現ベクターはラムダＺａｐの新しい誘導体である。
１、　ラムダＺａｐＩ［ ラムダＺａｐＵは例６に述べられてるようにベクターラムダＺａｐのラムダＳ遺 伝子をラムダｇｔｌｏベクター由来のラムダＳ遺伝子に置き換えることにより調 製する。
２、　ラムダＺａｐｌＩＶ）１ ラムダＺａｐｆｌＶＨは第６Ａ図に示した合成りＮＡ配列を上述のラムダＺａｐ ｌ［ベクターに挿入することにより調製する。この挿入ヌクレオチド配列は都合 よくリボゾーム結合部位（シャインダル効率的に誘導する。ラムダＺａｐｆｆＶ 、の調製は例９でより詳細に述べており、またその特徴を第６Ａ図および第７図 に示した。
３、　ラムダＺａｐＩＩＶ１ ラムダＺ　ａｐ　Ｖ　Ｌは例１２で述べているようにラムダＺａｐＩ［に第６Ｂ 図で示した合成りＮＡ配列を挿入することにより調製する。
ラムダＺａｐＩＩＶ１の重要な特徴は第８図に示した。
４、ラムダＺａｐＩＩＶＬＩ［ ラムダＺａｐＩ［ＶＩ　１１は例１１に述べているようにラムダＺａｐｎに第１ ０図に示した合成りＮＡ配列を挿入することにより調製する。
上述のベクターは大腸菌宿主に適合する。すなわちこれらは発現のために機能的 に結合された遺伝子によりコードされるたんぼく賞を細胞周辺腔へ分泌するよう に発現し得る。
例 以下の例は本発明の詳細な説明するものであり、これを制限するものではない。
１、　ポリヌクレオチド選択 免疫グロブリンたんばく質ＣＤＲをコードするヌクレオチド配列は非常に可変性 が高い、しかしｖ、ｌ　ドメインに隣接する非常に保存的配列をもつ領域がいく つかある。たとえば実質的に保存されるヌクレオチド配列、すなわち同じプライ マー配列にハイブリダイズする配列を含む、それゆえ、保存的配列にハイブリダ イズし、ベクターに合成されたＤＮＡフラグメントを機能的に結合するのに適し た制限部位を生成するＤＮＡホモログ中に組込むポリヌクレオチド合成（増巾） プライマーを構築した。特定するとそ１７１ＤＮＡホモログはラムダＺａｐｎベ クター（ストラタジーンクローニングシステム、ラジ５う、ＣＡ）のＸｈｏｌお よびＥｃｏＲＩ部位に挿入した。ｖＮドメインの増巾には３′プライマー（第１ 表のプライマー１２）をＪｘｎ域のｍＲＮＡに相補的となるように設計した。全 ての場合、５′プライマー（第１表、プライマー１〜１０）は保存的Ｎ末端領域 中の第１１１ｃＤＮＡ（アンチセンス頷）に相補的となるように選んだ、最初の 増巾は５つの部位で縮退している３２個のプライマー（第１、プライマー１）の 混合物で行う、ハイブリドーマｍＲＮＡは混合プライマーで増巾し得たが肺臓か らのｍＲＮＡを増巾する最初の試みは種々の結果を生じた。それゆえ、混合５′ プライマーを用いた増巾以外にいくつかの方法を比較した。
最初の方法は混合プライマーブールの個々のメンバーに対応する多重ユニークプ ライマー（そのうちの８個は第１表に示した）を！ｌＩ築することであった。第 １表のプライマー２〜９は５個の縮退位置の３つに２つの可能なヌクレオチドを 組込むごとにより構築した。
第２の方法はタカハシ（丁ａｋａｈａｓｈｉ）等（Ｐｒｏｃ、　Ｎａ１１．　Ａ ｃａｄ、　Ｓｃｉ。
（ＵＳＡ＞８２．１９３１−１９３５　（１９８５））およびオー゛ンカ　（Ｏ ｈｔｓｕｋａ）等（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、２６０．　２６０５−２６０ ８（１９８５））の研究に基づき可変部位の４つにイノシンを含むプライマー（ プライマー１０．第１表）を構築するものである。
このプライマーはマーチン（Ｍａｒｔｉｎ）等、Ｎｕｃ、　Ａｃ１４ｓ、　Ｒｅ ｓ、　１３＋８９２７　（１９８５）により議論されているように縮退しておら ず、かつ同時に非保存的部位でのミスマツチのネガティブ効果を最小限にする利 点を有している。しかしイノシンヌクレオチドの存在がクローン化した■。領域 中に望ましくない配列を組み入れ後増巾されたフラグメントに残っている１つの 部位には含まれてガンマ１１！ｌｍ　ＲＮ　Ａの第１不変領域ドメインの一部に 相補的となるように設計した（プライマー１５および１６、第１表）、これらの プライマーは重鎮のｖ、ｌおよび第１不変領域ドメインのアミノ酸をコードする ポリヌクレオチドを含むＤＮＡホモログを生成する。これらのＤＮＡホモログは ＦｖではなくＦａｂフラグメントを作るのに用いられる。
本発明はＩｇＭ、ＩｇＥおよびＩｇＡなど免疫グロブリン重鎮の別のクラスの同 じ＄Ｉ域にハイブリダイズするよう設計されたユニークな３′プライマーにも関 する。また、特定のクラスのＣＨ，不変領域の特定の領域にハイブリダイズし、 かつ別のクラスの重鎮または軽鎖不変領域を有する■や　ドメインを発現し得る 発現ベクターにこのプライマーを用いて増巾したｖＮ　ドメインを転移するのに 通したオーバー３′プライマーにも関する。
肺臓またはハイブリドーマｍ　ＲＮ　Ａ　７）・ろ不変領域ＩｇＧ内の保存性の 高い領域にハイブリダイズする一組のプライマーを増巾するコントロールとして 重鎖遺伝子を構築した。その５′プライマー（プライマー１１、第１表）はＣ１ ２領域中のｃＤＮＡに相補的であり、一方３′プライマー（プライマー１３、第 １表）は０ｗ３８１Ｍ中のｍＲＮＡに相補的である。これらのプライマーおよび テンプレートの間にミスマツチはないと考えている。
ＶＬＣＤＲをコードするヌクレオチド配列は可変性が高い、し、７！ｌ）シ、コ し、ｖＬフレームワーク領域およびＶ、リーダー／プロモーターを含む■ＬＣＤ Ｒドメインに隣接する保存的配列のｓ１域がいくつかある。それゆえ、この保存 的配列にハイブリダイズしかつ、Ｎｃｏｌおよび５ｐａｒで切断したｐＢｌｕｅ ｓｃｒｉｐＬ　ＳＫ−ベクターへの増巾したフラグメントのクローニングを可能 にする制限部位を組込む増巾プライマーを構築した。Ｖ、ＣＤＲドメインの増巾 のためにＪＬＳ！域内のｍＲＮＡに相補的であるような３′プライマー（プライ マー１４、第１表）を設計した。５′プライマーは保存的Ｎ末端領域中の第１鎖 ｃＤＮＡに相補的となるように選択した。
ｖ、ＣＤＲドメインの増巾用の２番目の増巾用プライマーセントである５′プラ イマー（プライマー１〜８、第２表）は保存的Ｎ末端領域中の第１鎖ｃＤＮＡに 相補的となるように設計した。
またこれらのプライマーは５ａｃｌ制限工ンドヌ多レアーゼ部位を導入しＶＬ　 ＤＮＡホモログのＶ、■発現ベクターへのクローニングを可能にする。３’ｖｔ 増中プライマー（プライマー９、第２表）はｊ、領域中のｍＲＮＡに相補的であ り　かつＶＬ　ＤＮＡホモログをＶＬ　ｎ発現ベクターに挿入するときに必要な Ｘｂａｌ制限エンドヌクレアーゼ部位を導入するよう設計した（第３図）。
さらに３’ＶＬ増巾プライマーをカッパまたはラムダ−ＲＮＡいずれかの不変領 域にハイブリダイズするよう設計した（プライマー１０および１１、第２表）、 これらのプライマーはカッパまたはラムダ鎖の不変領域アミノ酸をコードするポ リヌクレオチド配列を含むＤＮＡホモログの生成を可能にする。これらのプライ マーはＦ、よりむしろＦａｂフラグメントの生成を可能にする。
Ｆａｂを構築するためのカッパ軽鎖配列の増巾に使用するプライマーを第２表に 示す、これらのプライマーを用いた増巾は５個の別々の反応で行なった。それぞ れの反応には５′プライマー１つ（プライマー３〜６および１２）および３′プ ライマー１つ（プライマー１３）が含まれている。残りの３′プライマー（プラ イマー９）はＦｖフラグメントを構築するのに用いた。５′プライマーは５ａｃ ｌ制限部位を含んでおり、また３′プライマーはＸｂａＴ制限部位を含んでいる 。
Ｆａｂ構築のための重１１Ｆｄフラグメント増巾に用いるプライマーを第１表に 示す、増巾は８個の別々の反応で行った。各々の反応は５′プライマー１つ（プ ライマー２〜９）および３′プライマー１つ（プライマー１５）を含む、単一反 応の増巾で使用する５′プライマーは縮退プライマー（プライマー１）または４ つの縮退部位にイノシンを組込んだプライマー（プライマー１０、第１表、プラ イマー１７および１８、第２表）である、残りの３′プライマー（プライマー１ ４、第２表）はＦνフラグメントの構築に使用した。５′プライマーの多くはＸ ｈｏ１部位を有し、また３′プライマーは５ｐｓｌ制限部位を有する。
ヒト重鎖可変ｇ域を増巾するように設計されたｖ８増巾プライマーを第２表に示 す。５′重鎖プライマーの１つは縮退ヌクレオチド部位にイノシン残基を含み、 単一プライマーの多くの可変領域配列へのハイブリダイズを可能にしている０種 々のＩｇＧ　ｍＲＮＡの不変領域にハイブリダイズするように設計されたプライ マーも第２表に示す。
ラムダおよびカッパ両アイソタイプのヒト軽鎖可変領域にハイブリダイズするよ うに設計された■１増巾プライマーも第２表に示した。
ここで用いられかつ第１〜４表に示された全てのプライマーおよび合成ポリヌク レオチドはリサーチジェネティクス社（ハンツビル、ブライマ）から購入するか またはアプライドパイオシステ合成した。
り　膿　哨　リ　い　膿　い　リ　い　の　りの　Ｃの　膿　の　の　リ ２、ＦＩＴＣ３”ム　７ハ’）　ニ１．　”Ｌｚバー　）１−（７）螢光性イソ チオシアネート（ＦＩＴＣ）をレセプター結合のためのリガンドとして選択した 。抗ＦＩＴＣレセプターについて暗号化する遺伝子に関して、免疫遺伝子レパー トリ−１即ちｖＭ暗号遺伝子レパートリ−及び■Ｌ暗号遺伝子レパートリーを免 疫化により富化することを更に決めた。これは、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　Ａ　Ｌ ａｂｏ−ｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ　％　バーロウ（）ｌａｒｌｏｗ）及びロウ （Ｌａｗｓ）　編集、コールド・スプリング−、Ａ−バー（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉ ｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ）、ＮＹ　（１９８８年）に記載された技術を用いてＦＩＴ Ｃをキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ，）に連鎖することにより行な った。簡単に言えば・キーホールリンペットヘモシアニン１０．０腸ｇ及びＦＩ ＴｃＯ０５■ｇを、０、ＩＭの炭酸ナトリウム、ｐＨ９，６を含む緩衝液ＩＩＩ Ｉｔに添加し、４℃で１８〜２４時間攪拌した。未結合ＦＩＴＣをセファデック ス（Ｓｅｐｈａｄ＠ｘ）　Ｇ　−２５によるゲル濾過により除去した。
ＫＬＨ−Ｆ　ＩＴＣ複合体は、複合体１００μｇをリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ ）２５０μｌに添加することによりマウスに注射するために調製した１等容量の 完全フロインドアジュバントを添加し、全溶液を５分間乳化した。１２９Ｇ、Ｘ 、マウスにエマルシラン３００μｌを注射した。注射は２１ゲージ針を用いて幾 つかの部位で皮下で施した。ＫＬＨ−ＦＩＴＣによる第二の免疫化を２週間後に 行なった。この注射液は、以下のようにして調製した。
ＫＬＨ−Ｆ　ＩＴＣ５０ＭｇをＰＢ５２５０μＥ中で希釈し、等容量の明ばんを ＫＬＨ−Ｆ　ＩＴＣ溶液に添加した。マウスに２３ゲージ針を用いて溶液５００ μｌを腹腔内に注射した。１ケ月後、マウスにＰＢＳ中で２００μｌに希釈され たＫＬＨ−ＦＩＴＣ複合体５０μｌの最後の注射を施した。この注射は３０ゲー ジ針を用いて尾部側版中に静脈内に施した。この最後の注射の５日後に、マウス を犠牲にし、全ａ胞ＲＮＡをそれらの肺臓から分離した。
ホスホネートエステルに免疫特異的な抗体を生産するハイブリドーマＰＣＰ８Ｄ １１を、ペニシリン及びストレプトマイシンを補給した１０％のウシ胎児血清を 含むＤＭＥＭ培地（ギブコ・ラボラトリイズ（Ｇｉｂｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｉｅｓ）、グランドアイランド、ＮＹ）中で培養した。約５ＸｌＯ”個のハイブ リドーマ細胞を回収し、リン酸塩緩衝食塩水中で２回洗浄した。全細胞ＲＮＡを これらの分離ハイブリドーマ細胞から調製した。
３、ｖ゛　−レパート１−の　■ 全細胞ＲＮＡを、製造業者の指示及びストラタゲン・クローニング・システムズ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎａ　Ｃｌｏｎｔｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）（う・ジタラ（Ｌ ａ　Ｊｏｌｌａ）、ＣＡ）により製造されたＲＮＡ分離キットを用いて、クロム シジンスキイ（Ｃｈｏ＋ｍｃｚｙｎｓｋｉ）らにより記載されたＲＮＡ１ｌ！で 免疫化された一匹のマウスの肺臓から調製した。葛単に言えば、免疫化されたマ ウスから肺臓を除去した直後に、組織をガラスホモジナイザーを用いて４．ＯＭ のグアニンイソチオシアネート、０、２５　Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７， ０、及び０．１Ｍの２−メルカプトエタノールを含む変性溶液１０ｍｌ中で均一 にした＊　ｐＨ４，０の２Ｍの濃度の酢酸ナトリウム１ｍｊを、均一にした膵臓 と混合した。また、予めＨｚ　Ｏで飽和されたフェノールｌ■ｌを、均一にした 膵臓を含む変性溶液に添加した。クロロホルム−イソアミルアルコール（２４： 　１　ｖ／ｖ）混合物２閤ｌをこの均−液に添加した。均−液を１０秒間激しく 混合し、氷の上に１５分間保ヮた。その後、均−液を厚肉の５０ｍＡのポリプロ ピレン遠心分離管（フィッシャー・サイエンティフィック・カンバニイ（Ｆｉｓ ｈｅｒ５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｃｏｓ＋ｐａｎｙ）　、ビフッパーグ、ＰＡ）に 移した。その溶液を４℃で１０．ＯＯＯＸｇで２０分間遠心分離した。上部のＲ ＮＡを含む水層を新しい５０■ｌのポリプロピレン遠心分離管に移じ、等容量の イソプロピルアルコールと混合した。この溶液を少な（とも１時間−２０℃に保 ってＲＮＡを沈殿させた。沈殿したＲＮＡを含む溶液を４℃で１０．ＯＯＯＸｇ で２０分間遠心分離した。ベレット化した全細胞ＲＮＡを集め、上記の変性溶液 ３■Ｅに溶解した。イソプロピルアルコール３ｍｊを再懸濁した全細胞ＲＮＡに 添加し、激しく混合した。この溶液を一２０℃で少なくとも１時間保ってＲＮＡ を沈殿させた。沈殿したＲＮＡを含む溶液を４℃で１０．ＯＯＯＸｇで１ｏ分間 遠心分離した。ベレット化したＩＩＮＡを７５）６のエタノールを含む溶液で１ 回洗浄した。ベレット化したＲＮＡを減圧下で１５分間乾燥し、ついでジメチル ピロカーボネート（ＤＥＰＣ）で処理した水（ＤＥＰＥ−Ｈ，Ｏ）中で再懸濁し た。
長いポリ人道を含む配列に関して富化されたメツセンジャーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ ）を、１１ｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎ ｕ−虹、マニアナアス（Ｍａｎｉａｔｉａｓ）　ら、編集、コールド・スプリン グ・ハーバ−１ＮＹ、（１９３２年）に記載された方法を用いて全細胞ＲＮＡか ら調製した。Ｐｉ！単に言えば、上記のように調製された１個の免疫化マウスＩ ｌｌ！！臓から分離された全ＲＮＡの半分をＤＥＰＣ−−Ｈｔ○ｌ＊Ｚ中に再懸 濁し、６５℃で５分間保った。１［）Ｏ＋＊Ｍのトリス−ＨＣＺ、ＩＭの塩化ナ トリウム、２．０ｍＭの二ナトリウムエチレンジアミンテトラＭａ　（ＥＤＴＡ ）　、ｐ［ｔ７．５、及び０．２％のナトリウムドブノルスルフニー）　（ＳＤ Ｓ）からなる２Ｘの多い塩添加緩衝液１−１を再懸濁したＲＮＡに添加し、混合 物を室温に冷却させた。その後、・Ｈ合物を、オリゴｄＴを０．１Ｍの水酸化ナ トリウム及び５ｍＭのＥＤＴＡを含む溶液で洗浄しついでカラムをＤＥＰ’Ｃ− Ｈ，○で平衡にすることにより前もってｔｉｅされたオリゴ−ｄＴ（コラボレイ ティブ・リサーチ（Ｃｏｌｌａ−ｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）型２ま たは型３）カラムに適用した。溶出液を無菌ポリプロピレン管に藁め、溶出液を ６５℃で５分間加熱した後に同カラムに再度適用した。その後、オリゴｄＴカラ ムを、５０−Ｍのトリス−ＨＣ１ｐＨ７，５，５００１１１Ｍの塩化ナトリウム 、１ｓ＋ＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７，５及び０．１％のＳＤＳからなる多い塩添加緩 衝液２ｍＡで洗浄した。その後、オリゴｄＴカラムを、５ＯＮＭのトリス−）Ｉ Ｃｊ！、ｐＨ７゜５．１００ｍＭの塩化ナトリウム、１ｍＭのＥＤＴＡ及び０． １％のＳＤＳからなるＩＸの培地塩謹衝液２１１１で洗浄した。メツセンジャー ＲＮＡを、１０−Ｍのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，５，１ｓＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７ ，５及び０．０５％のＳＤＳからなる緩衝液ｌ１１１でオリゴｄＴカラムから溶 出させた。この溶液をフェノール／クロロホルムで抽出し、その後１００％のク ロロホルムで１回抽出することによりメツセンジャーＲＮＡを精製した。メツセ ンジャーＲＮＡをエタノール沈殿により濃縮し、ＤＥｐｃ−Ｈ，ｏ中で再Ｅ濁し た。
上記の方法により分離されたメンセンジャーＲＮＡは複数の異なる■、暗号ポリ ヌクレオチド、即ち、約１０“より大きい異なる■ｌＩ暗号遺伝子を含む。
４、　−のＶ。　＋３ボ１ヌクレオチドのｔ％＋ｌ単一の■８に関して暗号化す るポリヌクレオチドを、全細胞ＲＮＡを実施例２で調製されたモノクローナルハ イブリドーマ細胞から抽出した以外は、実施例３に従って分離した。この様にし て分離されたポリヌクレオチドは単一■８に関して暗号化する。
５　旦下」」口υ幻１鼠 ＰＣＲ増幅に関する調製に際し、上記の実施例に従って調製されたｍＲＮＡをプ ライマー延長反応によるｃＤＮＡ合成の鋳型として使用した。典型的な５０μｌ の転写反応中に、水中の肺臓またはハイブリドーマｍＲＮＡ５〜１０μｇを、ま ず３′ｖ８プライマー（プライマー１２、表１）　５００ｎｇ、（５０，０ｐモ ル）で６５℃で５分間ハイブリッドを形成した。続いて、混合物を１，５ｍＭの ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰＳｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ、４０＋ｎＭのトリス−ＭＣＩ、ｐ Ｈ８，０，８ｓＭのＭｇＣｊｔ　、５０＋ｏＭのＮａＣｌ　、及び２ａ＋Ｍのス ペルミジンに調節した。モロニー−マウス白血病ウィルス逆転写酵素（ストラタ ゲン・クローニング・システムズ）、２６単位を添加し、溶液を３７℃で１時間 保った。
ＰＣＲ増幅を、逆転写反応の生産物（ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　／　ＲＮ　Ａハイブリッ ド約５μｇ）、３’Ｖ＊プライマー（表１のプライマー１２）３００ｎｇ、夫々 の５　’　Ｖ）Ｉプライマー（表１のプライマー２〜１０）３００ｎ＆、２００ ｍＭのｄ　Ｎ　Ｔ　Ｐの混合物、５０ｍＭのＫＣｌ１０ｍＭのトリス−ＨＣｊ％ Ｐ）１８．３．１５１ＩＭのＦＩｇＣｌｔ　、０．１％のゼラチン及びＴａｑＤ ＮＡポリメラーゼ２単位を含む１００μｌの反応中で行なった０反応混合物を鉱 油でオーバーレイし、４０サイクルの増幅にかけた。夫々の増幅サイクルは、９ ２℃で１分間の変性、５２℃で２分間のアニーリング、ついで７２℃で１．５分 間のプライマー延長（伸長）によるポリヌクレオチド合成を伴なっていた。増幅 したＶＭｌ暗号ＤＮＡ同族体含む試料を、フェノール／クロロホルムで２回抽出 し、クロロホルムで１回抽出し、エタノールで沈殿させ、１０ｍＭのトリス−Ｍ ＣＩ、（ｐＨ，７，５）及び１■ＭのＥＤＴＡ中で一７０℃で貯蔵した。
特異な５′プライマー（２〜９、表１）を使用して、を効なりＩｌ暗号ＤＮＡ同 族体合成及び肺臓ｍＲＮＡからの増幅を第３図中、レーンＲ１７〜Ｒ２４で示さ れるように行なった。増幅したｃＤＮＡ（Ｖ　ｌ暗号ＤＮＡ同族体）が予想され るサイズ（３６０ｂｐ）の主用バンドとして見られる。夫々の反応中の増幅した ■。暗号ポリヌクレオチドフラグメントの強さは明らかに類似し、これらのプラ イマーの全てが増幅を開始するのにほぼ同等に有効であることを示す、これらの プライマーによる増幅の収率及び品質は再現性があった。
また、イノシンを含むプライマーは肺臓ｍＲＮＡから増幅したｖ１１暗号ＤＮＡ 同族体を再現性よく合成し、その他の増幅した！：ＤＮＡ（第４図、レーンＲ１ Ｇ）の強さと類似する強さの予想されるサイズのフラグメントの生産をもたらし た。この結果は、イノシンの存在がまた有効なりＮ、Ａ同族体合成及び増幅を可 能にすることを示した。このようなプライマーが複数の■圓暗号ＤＮＡ領域のプ ライマー（プライマー１１及び１３、表１）から得られた増幅生産物は一層強く 、増幅がおそらく鋳型とプライマー（第４図、レーンＲ９）との間の高度の相同 性のために一層存効であったことを示す、これらの結果に基いて、ｖＩｌ暗号遺 伝子ライブラリーを８つの増幅の生産物からつくり、夫々異なる５′プライマー を用いて行なった。夫々のプライマー延長反応からの生産物の等しい部分を混合 し、その後、混合生産物を使用してｖ、ｌ暗号ＤＮＡ同族体を含むベクターのラ イブラリーをつくった。
ｖＬのＤＮＡ同族体を、上記のように調製した精ｇｍＲＮＡから調製した。ＰＣ Ｒ増幅に関する調製に際し、上記の実施例に従って調製したｍＲＮＡＧｃＤＮＡ 合成の鋳型として使用した。典型的な５０μｌの転写反応に於いて、まず水中の ｌ！＋！！臓またはハイブリドーマｍＲＮＡ５〜ｌｏμｇを６５℃で５分間３’ ＶＬプライマー（プライマー１４、！！！１）３００ｎｇ　（５０，０ｐ−Ｅル ）　で７二−リングした。続いて、混合物を１．５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ。
ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ、４０ｔＭ＋７１）リス−ＨＣｌ、ｐＨ８，０゜８ｍＭ のＨｇＣ１ｔ　−Ｓ　ＯｍＭのＮａＣＪ　、及び２１１Ｍのスペルミジンに調節 した。マロニー−マウス白血病ウィルス逆転写酵素（ストラタゲン・クローニン グ・ソスナムズ）、２６単位を添加し、溶液を３７℃で１時間保った。ＰＣＲの 増幅を、上記のようにして生産したｃＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド約５μｇ−３ ’Ｖｔプライマー（表１のプライマー１４）３００ｎｇ、５’ＶＬプライマー（ 表１のプライマー１５）３００ｎｇ、２０（１ｔＭのｄＮＴＰの混合物、５０１ μｌＭのＫＣＩ、１０領Ｍのトリス−ＨＣｊ！、ｐＦ１８．３．１５５ＭのＭｇ Ｃ１ｘ　、０．１％のゼラチン及び２単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼを含む１ ００μｌの反応中で行なった０反応混合物を鉱油でオーバーレイし、４０サイク ルの増幅にかけた。夫々の増幅サイクルは９２℃で１分間の変性、５２℃で２分 間のアニーリング及び７２℃で１．５分間の伸長を伴なっていた。増幅試料をフ ェノール／クロロホルムで２回抽出し、クロロホルムで１回抽出し、エタノール で沈殿させ、ｌｏｓＭのトリス−ＭＣＩ、ｐＨ７，５及び１ｇ＋ＭのＥＤＴＡ中 で一７０℃で貯蔵した。
６、　ベク　一部へのＤＮＡ１）　の ■、配列に冨むライブラリーをクローニングするための調製に際し、ＰＣＲ増幅 生産物（２，５１℃ｇ／　３０　ｕ　ｌの１５０ｍＭのＮａＣｉ、８ｍＭのトリ ス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）−６ｍＭのｌ′１ｇＳＯ４、ｌ細ＭのＤＴＴ、２０ ０ｗｇ／ｍ１のウソ血清アルブミン（ＢＳＡ）　１．３７℃、を制限酵素Ｘｈｏ （１２５卓位）及びＥｃｏＲｌ　（１０ＬＪ）で偵化し１％のアガロースゲルで 精製した。増幅反応の生産物の混合物を要するクローニング実験に於いて、等容 １ｉ（５０μ！、１〜１０μｇの濃度〉の夫々の反応混合物を増幅の後で制限消 化の前に組合せた。消化したＰＣＲ増幅牌臓膵臓ＮＡのゲル電気泳動後に、約３ ５０ｂｐｓのＤＮＡフラグメントを含むゲルの領域を切除しミ透析膜に電気溶出 し、エタノールで沈殿させ、１Ｏ島Ｍのトリス−ＨＣｌ、、ｐＨ１，５及び１ｍ ＭのＥＤＴＡ中で１０ｎｇ／ｐｌの最終濃度に再懸濁した。その後、等モル量の インサートを、ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏｌにより前もって切断されたラムダＺＡＰ ”ＩＩベクター（ストラタゲン・クローニング・シスラムダ、う・ジヲラ、ＣＡ ）１ｐｇに５℃で一夜でつないだ、連鎖混合物の一部（１μりを、ギガバンク・ ゴールド（Ｇｉｇａｐａｃｋ　Ｇｏｌｄ）包装抽出物（ストラタゲン・クローニ ング・シスラムダ、う・ジョラ、ＣＡ）を用いて室導で２時間包装し、包装物質 をＸＬＩ−ブルー宿主細胞に塗布した。そのライブラリーは３０％未満の非組換 えバンクグラウンドを含む２Ｘ１０’個のＶ、同族体からなることを測定した。
上で使用したベクター、即ちラムダＺａｐｎは、もとのラムダＺａｐの全ての特 性を保持し６個の特異なりローニング部位、融合タンパク質形賞発現、及びイン サートをファージミド（ブルースフリブ）ＳＫ−）の形態で迅速に切除する能力 を含むがＳＡＭ１００突然変異を欠如し、ＸＬ、−ブルーを含む多くのノン−サ ップ（Ｍａｎ−３ｕｐ）　Ｆ採土での増殖を可能にするもとのラムダＺａｐの誘 導体（ＡＴＣＣ＃４０，２９８）である、ラムダＺａｐＩＩは、シテート（Ｓｈ ｏｒｔ）　ら著、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、１６１！、７５８３ 〜７６０　ＯＮ、、１９８８年に記載されたように、ラムダＺａｐを制限酵素Ｎ ｃｏｌで消化することにより生産された４２５４塩基対（ｂｐ）ＤＮＡフラグメ ント中に含まれるラムダＳ遺伝子讐置換するととによりつくった。この４２５４ ｂρＤＮＡフラグメントを、ベクターを制限酵素Ｎ（：０１で消化した後、ラム ダｇｔｌ　Ｏ（ＡＴＣＣ＃４０．１７９）から分離されたラムダＳ遺伝子を含む ４２５４ｂｐＤＮＡフラグメントで置換した。ラムダｇｔｌＯから分離された４ 　２５４ｂｐＤＮＡフラグメントを、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉ ｎ　１１ｏｌｅ−ｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏ　、アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら 、編集、ジッン・ウィリイ・アンド・サップ（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　 ５ｏｎｓ）　、Ｎ　Ｙ、１９８７年に記載されたこのような操作のための標準プ ロトコル及びＴ４ＤＮＡリガーゼを用いてもとのラムダＺａｐベクターにつない だ。
■Ｌ配列に冨むライブラリーをクローン化する調製に際し、ＰＣＲ増幅生産物２ 　ｐ　ｇ　（２，５ｍｇ／３０　μｍの１５０＋ｏＭのＮａＣｊ！、８μ！Ｍの トリス−ＨＣｆ　（ｐＨ７，５）　、６ｔＭのＭｇＳＯ４，１ｍＭのＤＴＴ、２ ００ｍｇ／ｍＡのＢＳＡ、３７℃）を制限酵素Ｎｃｏｌ（３０単位）及び５ｐｅ Ｉ（４５単位）で消化した。消化した増幅生産Ｔｈヲ、崩ｎ９旦り旦匹」」ユ硅 五旦匹しハ…虹、マニアチスら編集、コールド・スプリング・ハーバ−１ＮＹ、 （１，９８２年）に記載された通常の電気溶出技術を用いて１％のアガロースゲ ルで精製した。簡単に言えば、消化したＰＣＲ増幅住産物のゲル電気溶出の後に 、適当なサイズのｖＬ暗号ＤＮＡフラグメントを含むゲルの領域を切除し、透析 膜に電気溶出し、エタノールで沈殿させ、１０ｍＭのトリス−）ＨＣｆ、、ｐＨ ７，５及び／ａＭのＥＤＴＡを含む溶液中でＬｏｎｇ／ｍｊの最終濃度で再懸濁 したう複素の異なる■、暗号ＤＮＡ同族体に相当する等モル量のＤＮＡを、Ｎｃ ｏＴ及び５ｐｅｌで前もって切断されたｐブルースクリプトＳＫ−ファージミド ベクターにつないた。連鎖混合物の一部を、製造業者の指示を用いてエピクイア ン・コリ（Ｅｐｉｃｕｉａｎ　Ｃｏ１１）χＬ１−ブルーコンピテント細胞（ス トラタゲン・クローニング・シスラムダ、う・ジッラ、ＣＡ）に形質転換した。
形質転換体ライブラリーは３％未満の非組換えバンクグラウンドを含む１．２Ｘ １０３個のコロニー形成草位／μｓのｖＬ同族体からなることを測定した。
ラムダＺａｐＩＩファージクローンを分析するために、製造業者の指示（ストラ タゲン・クローニング・システム、う・ジョラ、ＣＡ）に従ってクローンをラム ダＺａｐからプラスミドに切除した。簡単に言えば、ファージプラークを寒天プ レートからコアを形成し、５０＋ｅＭのトリス−ＨＣｌ、ｐｔ１７．５、ｌｏｏ ＋ａＭのＮａＣ１、ｌｏｍＭのＭｇ５Ｏ，、及び０．０１％のゼラチンを含む緩 衝液５００μ！及びクロロホルム２０μＥを含む無習ミクロフユージ（ａ＋ｉｃ ｒｏｆｕｇｅ）　管に移した。
切除のため、ファージ原液２００μｌ、ＸＬＩ−ブルー細胞（Ａ６＠＠　−１， ００）　２００μ！及びＲ４０８へルバーファージ（Ｉ　Ｘ　１０　”ｐｆｕ／ ｖａ１）　１　、＋７　ｊを３７℃で１５分間保温した。切除したプラスミドを ＸＬｌ−ブルー細胞に感染させ、アンピシリンを含むＬＢプレートに塗布した。
二本ｔｆｉ　Ｄ　Ｎ　Ａを、ホルメス（）ｉｏｌｍｅｓ）らにより記載された方 法（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、１１４ｅ、　１９３頁（１９８１年）を参照 のこと）に従ってファージミドを含む細胞から調製した。まずクローンをＰνｕ ＩＩまたはＢｇｌｌのいずれかによる制限消化によりＤＮＡインサートに関して スクリーニングし、想像上のｖＮインサートを含むクローンをサンガー（Ｓａｎ ｇｅｒ）らにより記載された一般方法Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓ ｃｉ。
匹ムＪ５巻、５４６３〜５４６７頁、（１９７７年）を参照のこと）及びストラ タゲン・クローニング・シスラムダ、う・ジテラ、ＣＡからのＡＭＶ逆転写酵素 コ５Ｓ−ｄＡＴＰ配列決定キットに於ける製造業者の指示に於いて与えられたこ の方法の特別の改良に従って逆転写酵素を用いて配列を決定した。
８、　クローン　したＶ　レバート１−のＸｈｏｌ及びＥｃｏＲＩで消化されラ ムダＺＡＰにクローン化された増輻住産物は、９．Ｏｘ　１０’　ｐｆｕを育す るｄ　ＤＮＡライブラリーをもたらした。ライブラリーがＶＸ暗号ＤＮＡ同族体 の種々の集団からなることを確かめるために、ライブラリーから任意に選ばれた １日のクローンのＮ−末端１２０塩基を切除し配列を決定した（第５図を参照の こと）、クローンがｖＮ遺伝子源のものであるかどうかを決定するため、クロー ン化した配列を既知のＶＭ配列及びｖＬ配列と比較した。クローンは既知のＨ鎖 源の配列と８０〜９０％の相同性を示し、と士μμＬ蛙」二立乃工！二■駐匹− ｌｏ　１ｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、カボント（Ｋａｂｏｔ）　ら、第４編、Ｕ 、Ｓ、　Ｄｅｐｔ。
ｏｆ　）ｌ＠ａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　５ｃｉｅｒ＋ｃｅｓ、（１９１１ ７年）に於いて入手し得る配列と比較する時にＬ鎮源の配列と殆ど相同性を示さ なかった。これは、ライブラリーがＬｌ配列の如きその他の配列に優先して所望 のＶ。配列に関して富化されることを示した。
集団の多様性を、配列決定クローンを予め特定したサブグループ（第５図）に分 類することにより評価した。マウス■、Ｉ配列を１１のサブグループ（第５図） に分類した。マウスＶ。配列を、Ｓｅ　ｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ＰｒｏＬｅｉｎｓ　 ｏｆ　Ｉａ＋ｆｆ１ｕｎｏｌｏ　１ｃａｌ　ＩｎｔｅｒｅｓｔカポントらＮ第４ 編、Ｕ、Ｓ、　ＤｅｐＬ、　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　５ｃｉ ｅｎｃｅｓ　、（１９８７年）：ディルドロップ（Ｄｉｌｄｒｏｐ）著、ｌ５ｓ ｕｏｏｌｏ　Ｔｏｄａ、５Ｓ８４頁（１９８４年）；及びプロデユア−（Ｂｒｏ ｄｅｕｒ）　ら著、Ｅｕｒ、　Ｊ。
１ｍｆｆ１ｕｎｏ１．、　１４　ｔ’、９２２頁、（１９８４年）に記載された フレームワークアミノ酸配列に基く１１のサブグループＣＩ　（Ａ、Ｂ）、ＩＩ 　（Ａ、　Ｂ、　Ｃ）　、ｍ　（八、Ｂ、Ｃ，Ｄ）　、Ｖ　（Ａ、Ｂ）Ｅに分類 する。配列決定したクローンの分類は、ｃ　ＤＮＡライブラリーが少なくとも７ つの異なるサブグループのＶ９配列を含むことを示した。更に、配列決定したク ローン間の相同性の対状の（ｐａｉｒｗｉｓｅ）比較は、二つの配列が全ての部 分で同一ではないことを示し、配列分析により特性決定が可能である程度に集団 が異なることを示唆した。
りｏ−ン（Ｌ３６〜５０．第５図）のうちの６個はサブクラスＩ［［Ｂに属し、 非常に類領するヌクレオチド配列を有していた。これは刺激した膵臓中の一つま たは幾つかの関連する可変遺伝子から誘導されるｍＲＮＡの優勢を反映し得るが 、そのデータは増１法に於けるバイアスの可能性を除外することを許さない。
９、Ｖ　）　公　ベク　− ベクター系を選択するのに使用した主な基準は、直接スクリーニングし得る最大 数のＦａｂフラグメントを生じることの必要性であった９バクテリオフアージラ ムダを三つの理由で形質発現ベクターとして選択した。第一に、ファージＤＮＡ の試験管内パンケージングはＤＮＡを宿主細胞に再導入する最も有効な方法であ る。
第二に、タンパク質形賞発現を単一ファージプラークのレベルで検出することが 可能である０Ｍ後に、ファージライブラリーのスクリーニングは典型的に非特異 的な結合による４点を殆ど伴なわない、別のプラスミドクローニングベクターは 、それらが同定された後に、クローンの分析にのみ臂利である。この利点はラム ダＺａｐの使用のために本系に於いて失なわれず、それによりＨ鎖、Ｌｔｌａ、 またはＦａｂ形質発現インサートを含むプラスミドが切除されることを可能にす る。
大腸菌宿主ａｔ胞中で複数のＶ１１ｔ’Ｒ号ＤＮＡ同族体を形質発現するために 、ｖｓｌｆｉ号ＤＮＡ同族体を適当な読取り枠中に入れ、シャイン（Ｓｈｉｎｅ ）　らにより記載されたリポソーム結合部位（Ｎａｔｕｒｅ、２５４巻、３４頁 、１９７５年を参照のこと）を与え、形質発現タンパク質をペリプラズム間隙に 送るリーダー配列を与え、既知のエピトープ（エピトープｔａ、ｇ）に関して暗 号化するポリヌクレオチド配列を与え、且つまたＶ。′Ｒ号ＤＮＡ同族体とエピ トープｔａｇに関して暗号化するポリヌクレオチドとの間のスペーサータンパク 質に関して暗号化するポリヌクレオチドを与えるベクターをつくった。上記のポ リヌクレオチド及び特徴の全てを含む合成りＮＡ配列を、互いにハイブリッドを 形成し第６図に示された二本鎖合成りＮＡ配列を形成する２０〜４０の塩基の一 重鎖ポリヌクレオチドセグメントを設計することによりつくった０個々の一本嫂 ボリヌクレオチドＣＮ＋　〜Ｎ　ｌｘ　）を表３に示す。
ポリヌクレオチド２．３．９−４′、１１．１０−５’、６．７及び８を、夫々 のポリヌクレオチド（０，１μｇ／μり１μｌ及び２０車位のＴ４ポリヌクレオ チドキナーゼを７ｊｌ＋Ｍのトリス−ＭＣＩ、ｐＨ１，６，１０■ＭのＭｇＣＪ ！ｔ　、５ＩＩＩＭのＤＴＴ、１０ｍＭの２ＭＥ、５００μｇ　／　ｍ　Ｉｔの ＢＳＡを含む溶液に添加することによりキナーゼ処理した。そのｆＭ液を３７℃ で３０分間保ち、溶液を６５℃で１０分間保つことにより反応を停止した。二つ の末端ポリヌクレオチド、即ちポリヌクレオチドＮ１及びポリヌクレオチドＮＮ １２２０ｎを、２０．０ｍＭのトリス−ＨＣ１ｐｌ！７．４．２．０ｍＭのｈｇ ｃ＊ｚ及び５０．０ｍＭのＮａＣ１を含む１／１０容量の溶液と共に、上記のキ ナーゼ処理反応溶液に添加した。この溶液を７０℃で５分間加熱し、５００１！ の水のビーカー中で室温約２５℃に１．５時間にわたって冷却した。この期間中 に全ての１０のポリヌクレオチドはアニールして第６Ａ図に示された二本鎖合成 りＮＡゼインートを形成した６個々のポリヌクレオチドを友いに共有結合で連鎖 し、上記の反応液４０μｌを５０ｍＭのトリス−ＨＣｊ、ｐＨ７，５，７ｘＭの ＭｇＣ１ｘ　、ｌｓＭのＤＴＴ、１ｘＭのアデノシントリホスフェート（ＡＴＰ ）及び１０車位の７４　ＤＮＡリガーゼを含む溶液に添加することにより合成り ＮＡゼインートを安定化した。この溶液を３７℃で３０分間保ち、その後、溶液 を６５℃で１０分間保つことによりＴ４ＤＮＡリガーゼを失活した。末端ポリヌ クレオチドを、上記の反応液５２μ！、１０＋＋ＭのＡＴＰを含む溶液４μｌ及 び５単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを混合することによりキナーゼ処理し た。この溶液を３７℃で３０分間保ち、その後、溶液を６５℃で１０分間保つこ とによりＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを失活した。完全合成りＮ人インサート を、制限酵素Ｎａｔｒ及びＸｈｏＴで前もって消化したラムダＺａｐｌＩベクタ ーに直接つないだ、連鎖混合物を、ストラタゲン・クローニング・システムズ、 う・ジッラ、ＣＡから入手し得るギガバンク■ゴールドバンキング抽出物を用い て製造業者の指示に従って包装した。包装した連鎖混合物をｘＬ１ブルー細胞（ ストラタゲン・クローニング・システムズ、サンジエゴ、ＣＡ）に塗布した０個 々のラムダＺａｐＵプラークをコア形成し、インサートを製造業者、ストラタゲ ン・クローニング・システムズ、う・ジ；う、ＣＡにより与えられた生体内切除 プロトコルに従って切除した。この生体内切除プロトコルはクローン化したイン サートをラムダＺａｐ■ベクターからプラスミドベクターへと移動させ・容易な 操作及び配列の決定を可能にする。上記のクローニング工程の正確度を、サンガ ーら著、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ　ｌｌ５Ａ　−。
７４巻、５４６３〜５４６７頁、（１９７７年）に記載されたサンガージブオキ シド法を用い、ストラタゲン・クローニング・システムズ、う・ジ目う、ＣＡか らのＡＭＶ逆転写酵素”５−ＡＴＰ配列決定キットに於ける製造業者の指示を用 いてインサートを配列決定することによりＶｆ１認した。得られたｖ、Ｉ形質発 現ベクターの配列を第６Ａ図及び第７図に示す。
ｌ−主 Ｍｌ）　５’　ＧＧＣＣＧＣＡＡＡ丁τＣＴＩＴＴＴＣＡＡＧＧＡＧＡＣＡＧＴ ＣＡＴ　３　’Ｎ２）　５’　ＡＡＴＧＡＡＡ丁ＡＣＣＴＡＴＴＧＣＣＴＡＣ［ ；ＧＣＡＧＣＣＧＣ丁ＧＧＡＴＴ　３　’Ｎ５）５″　ＧＴＴＡＴＴＡＣＴＣＧ ＣＴＧＣＣＣＡＡＣＣＡＧＣＣＡＴＧＧＣＣＣ３’８４）　５’　ＡＧＧＴＧＡ ＡＡＣＴＧＣτＣＧＡＧＡＡＴＴＣＴＡＧＡＣＴＡＧＧＴτＡＡＴＡＧ　３　’ Ｎ５）　５’　丁ＣＧＡＣＴＡｔＴＡＡＣτＡＧＴＣ丁＾ＧＡＡｔＴＣＴＣＧＡ Ｉ、３　’Ｎ６）　５’　ＣＡＧＴＴＴＣＡＣＣ丁ＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＴＧＩ Ｉ；ＴＴＧＧＧ　３　’Ｎ７）　５　’　ＣＡＧＣＧＡＧＴＡＡＴＡＡＣＡＡＴ ＣＣＡＧＣＧＧＣＴＧＣＣＧＴＡＧＧＣＡＡＴＡＧ　３　’Ｎ８）　５’　ＧＴ Ａ丁丁ＴＣＡＴＴＡＴＧＡＣＴＧＴＣＴＣＣττＧＡＡＡＴＡＧＡＡＴＴＴＧＣ ３’Ｎ９−４）　５’　ＡＧＧＴＧＡＡＡＣＴＧＣＴＣＧＡＧＡＴＴＴＣＴＡＧ ＡＣＴＡＧＴＴＡＣＣＣＧ丁ＡＣ３’Ｎ１１）　５’　ＧＡＣＧＴＴＣＣＧＧＡ ＣＴＡＣＧＧＴＴＣＴＴＡＡ丁ＡＧＡＡＴＴＣＧ　３　’Ｎ１２）　５’　τＣ ＧＡＣ［；ＡＡＴＴＣＴＡＴＴＡＡＧＡＡＣＣＧτ＾ＩＩ；ＴＣ３’８１０−５ ）　５’　ＣＧＧＡＡＣＧτＣＣτＡＣＧＧＧＴＡＡＣＴＡＧ丁ＣＴＡＧＡＡＡ ＴＣＴＣＧＡＧ　３　’１０、ｖ　ノ　ベク　− 大ｌ！菌宿主細胞中で複数の■、暗号ポリヌクレオチドを形質発現するために、 ｖＬ暗号ポリヌクレオチドを適当な読取り枠に入れ、シャインらにより記載され たようなリポソーム結合部位（Ｎａｔｕｒｅ　、２５４　ｊｅ、３４頁（１９７ ５年）に参照のこと）を与え、形質発現タンパク質をペリプラズム間隙に送るリ ーダー配列を与え、且つまた■、ポリヌクレオチドとエピトープｔａｇに関して 暗号化するポリヌクレオチドとの間のスペーサータンパク質に関して暗号化する ポリヌクレオチドを与えるベクターをつくった。
上記のポリヌクレオチド及び特徴の全てを含む合成りＮＡ配列を、互いにハイブ リッドを形成し第６Ｂ図に示された二本鎮合成りＮＡ配列を形成する２０〜４０ の塩基の一本鎖ポリヌクレオチドセグメントを設計することによりつくった０個 々の一本鎖ポリヌクレオチド（Ｎ、〜Ｎｇ）を表３に示す。
ポリヌクレオチドＮ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ６、Ｎ７及びＮａを、夫々のポリヌクレ オチド１μｌ及び２０車位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを７０ｍＭのトリス −ＨＣｊ、ｐＥ７．６．１（１＋ＭのＭｇＣｊｚ　、　５ｍＭのＤＴＴ、Ｉ　Ｏ ａ＋Ｍの２ＭＥ、５００μｇ／＠ｌのＢＳＡを含む溶液に添加することによりキ ナーゼ処理した。その溶液を３７℃７３０分間保ち、溶液を６５℃で１０分間保 つことにより反応を停止した。二つの末端ポリヌクレオチド、即ちポリヌクレオ チドＮ１及びポリヌクレオチドＮ５　２０ｎｇを、２０．０ｍＭのトリス＝ＨＣ ！、ＰＨ７，４，２，０讃Ｍの？１１ＩＣｉ及び５０．０−ＭのＮａＣ１を含む １／１０容量の溶液と共に、上記のキナーゼ処理反応溶液に添加した。この溶液 を７０℃で５分間加熱し、５０〇−２の水のビーカー中で室温約２５℃に１．５ 時間にわたって冷却した。この期間中に全てのポリヌクレオチドはアニールして 二本鎖合成りＮＡベインートを形成した０個々のポリヌクレオチドを互いに共有 結合で連鎖し、上記の反応液４０μｌを５０ａＭのトリス−ＨｅｌｐＨ７，５， ７ｍＭ（ＤｒＩｇＣｊｚ　、１＋＋ＭのＤＴＴ、１ｍＭのＡＴＰ及び１０単位の Ｔ４ＤＮＡ！Ｊガーゼを含む溶液に添加することにより合成りＮＡベインートを 安定化した。この溶液を３７℃で３０分間保ち、その後、溶液を６５℃で１０分 間保つことによりＴ４ＤＮＡリガーゼを失活した。末端ポリヌクレオチドを、上 記の反応液５２μｌ、１０−ＭのＡＴＰを含む溶液４μｌ及び５単位のＴ４ポリ ヌクレオチドキナーゼを混合することによりキナーゼ処理した。この溶液を３７ ℃で３０分間保ち、その後、溶液を６５℃で１０分間保つことによりポリヌクレ オチドキナーゼを失活した。完全合成りＮＡベインートを、制限酵素Ｎｏｔｌ及 びＸｈｏＩで前もって消化したラムダＺａｐＵベクターに直接つないだ、連鎖混 合物を、ストラタゲン・クローニング・シスラムダ、う・ジョラ、ＣＡから入手 し得るギガバック■ゴールドバッキング抽出物を用いて製造業者の指示に従って 包装した。包装した連鎖混合物をＸＬＩブルー細胞（ストラタゲン・クローニン グ・シスラムダ、う・ジテラ、ＣＡ）に塗布した０個々のラムダＺａｐｎプラー クをコア形成し、インサートを製造業者、ストラタゲン・クローニング・シスラ ムダ、う・ジ！う、ＣＡにより与えられシッートら著Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ ｓ　Ｒｅｓ、　１６巻、７５８３〜’７６００頁１９８Ｂ年に記載された生体内 切除プロトコルに従って切除した。
この生体内切除プロトコルはクローン化したインサートをラムダＺａｐｎベクタ ーからプラスミドベクターへと移動させ、容易な操作及び配列の決定を可能にし 、またｖＬ形質発現ベクターのファージミド変種を生産する。上記のクローニン グ工程の正確度を、サンガーら著、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ ｉ　ＬＩＳＡ　、　７４巻、５４６３〜５４６７頁、（１９７７年）に記載され たサンガージ、デオキシド法を用い、ストラタゲン・クローニング・シスラムダ 、う・ジ！う、ＣＡからのＡＭＶ逆転写酵素”５−ｄＡＴＰ配列決定キットに於 ける製造業者の指示を用いてインサートを配列決定することにより確認した。得 られたＶ、形質発現ベクターの配列を第６図及び第８図に示す。
■Ｌライブラリーをつくるのに使用したｖＬ形質発現ベクターは、ｖＬ形賞発現 ベクターのＤＮＡが決定されることを可能にするために生産されたファージミド であった。上で詳述されたように、ファージミドをラムダＺａｐ　ＶＬ形質発現 ベクター（第８図）からの生体内切除法により生産した。このベクターのファー ジミド変種を使用した。何となれば、ＮｃｏＩ！ＩＪ限酵素部位はこの変壇中で 特異であり、こうしてｖＬＤＮＡ同族体を形質発現ベクターに操作上連鎖するの に使用し得たからである。
１１、ＶＩ［−）　ベク　− 大腸ｉｆ宿主細胞中で複数の■、暗号ＤＮＡ同族体を形質発現するために、■、 暗号ＤＮＡ同族体を過当な読取り枠中に入れ、シャインらにより記載されたよう なリポソーム結合部位（肱組匹、２５４巻、３４頁、１９７５年を参照のこと） を与え、ライ（Ｌｅｉ）ら（ム」匹、、１６９巻、４３７９頁（１９８７年）） 及びペター（Ｂｅｔｔｅｒ）ら（Ｓｃｉｅｎｃｅ　、　２４０！’、１０４１頁 （１９８８罠））により大腸菌中でＦａｂフラグメントをうまく分泌するのに従 来使用されていたＰａ１Ｂ遺伝子リーダー配列を与え、且つまたクローニングの ための制限エンドヌクレアーゼ部位を含むポリヌクレオチドを与えるベクターを つくった。上記のポリヌクレオチド及び特徴の全てを含む合成りＮＡ配列を、互 いにハイブリッドを形成し、第１０図に示された二本鎖合成りＮＡ配列を形成す る２０〜６０の塩基の一末鎖ボリヌクレオチドセグメントを設計することにより つくった。二本鎖合成りＮＡ配列内の夫々側々の一本鎖ポリヌクレオチド（０１ 〜０８）の配列を表４に示す。
ポリヌクレオチド０２．０３．０４．０５．０６及び０７を、夫々のポリヌクレ オチド（０，１μｇ／μｍ）１μｌ及び２０単位のＴ４ポリヌクレオチドキナー ゼを７０ｍＭのトリス−ＨＣｊ。
ａｌ１７．６．１０５Ｍの塩化マグネシウム（ＭｇＣｊｚ）、５ｓＭのジチオス レイトール（ＤＴＴ）　、１０＋ｍＭの２−メルカプトエタノール（２ＭＥ）　 、５００μｇ／ｗｒ１のウシ血清アルブミンを含む溶液に添加することによりキ ナーゼ処理した。その溶液を３７℃で３０分間保ち、溶液を６５℃で１０分間保 つことにより反応を停止した。二つの末端ポリヌクレオチド、ｏｌ及び０８の夫 々２０１１ｇを、２０．０μＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ１，４，２，０ｍＭの？ Ｉｇｌ、及び１５．０ｍＭの塩化ナトリウム（ＮａＣｊ！　）を含む１／１０容 量の溶液と共に、上記のキナーゼ処理反応溶液に添加した。この溶液を７０℃で ５分間加熱し、５０　ＩＪｓｌの水のビーカー中で室温約２５℃に１，５時間に わたって冷却した。この期間中に全ての８のポリヌクレオチドはアニールして第 ９図に示された二本鎖合成りＮＡベインートを形成した０個々のポリヌクレオチ ドを互いに共有結合で連鎖し、上記の反応８！４０μｌを５０１Ｍのトリス−Ｈ Ｃｌ、ｐ）１７．５．７ｍＭのｖｌｇＣｌｚ　、ＩＩＩＭのＤＴＴ、１ｍＭのＡ ＴＰ及び１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを含む溶液に添加することにより合成り 　Ｎ　Ａインサートを安定化した。この溶液を３７℃で３０分間保ち、その後、 溶液を６５℃で１０分間保つことによりＴ４ＤＮＡリガーゼを失活した。末端ポ リヌクレオチドを、上記の反応液５２μｌ、１０−ＭのＡＴＰを含むｆ４液４μ ｌ及び５ｊＩＬ位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを混合することによりキナー ゼ処理した。この溶液を３７℃で３０分間保ち、その後、溶液を６５℃で１０分 間保つことによりＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを失活した。完全合成りＮＡベ インートを、制限酵素Ｎｏｔｒ及びＸｈｏｌで前もって消化したラムダＺａｐＨ ベクターに直接つないだ、連ｔ！混合物を、ストラタゲン・クローニング・シス テムズ、う・ジッタ、ＣＡから入手し得るギガパ、り■ゴールドバッキング抽出 物を用いて製造業者の指示に従って包装した。包装した連鎖混合物をＸＬＩブル ー細胞（ストラタゲン・クローニング・システムズ、う・ジッタ、ＣＡ）に２ａ した０個々のラムダＺａｐｆ！プラークをコア形成し、インサートを製造業者、 ストラタゲン・クローニング・システムズ、う・ジッタ、ＣＡにより与えられた 生体内切除プロトコルに従って切除した。この生体内切除プロトコルはクローン 化したインサートをラムダＺａｐｎベクターからプラスミドベクターへと移動さ せ、容易な操作及び配列の決定を可能にする。上記のクローニング工程の正確度 を、ストラタゲンクローニング・システムズ、う・ジ曹う、ＣＡからのＡＭＶ逆 転写酵素”５−ｄＡＴＰ配列決定キットに於ける製造業者の指示を用いてインサ ートを配列決定することにより確認した。得られた■Ｌ■形質発現ベクターの配 列を第９図及び第１１図に示す。
ｌ−玉 ０１）　５　’　３４ＴＧＡＡＴＴＣＴＡＡＡＣＴＡＧＴＣＧＣＣＡＡＧＧＡＧ ＡＣＡＧＴＣＡ７　３　’０２）　５　’　ＡＡＴＧＡＡＡＴＡＣＣＴＡ丁ＴＧ ＣＣＴＡＣＧＧＣＡＧＣＣＧＣＴＧＧＡＴＴ　３　’０３）　５’　ＧＴＴＡＴ ＴＡＣＴＣＧＣＴＧＣＣＣＡＡＣＣＡＧＣＣＡ丁ＧＧＣＣ３’０４）　５’　Ｇ ＡＧＣ丁ＣＧＴＣＡＧＴＴＣＴＡＧＡＧＴＴＡＡＧＣＧＧＣＣＧ　３　’０５） 　５’　ＧＴＡＴＴＴＣＡＴＴＡＴＧＡＣＴＧＴＣＴＣＣＴＴＧＧＣＧＡＣ丁Ａ ＧＴ丁ＴＡＧＡＡ−ＴＴＣＡＡＧＣＴ　３　’ ０６）　５’　ＣＡＧＣＧＡＧＴＡＡＴＡＡＣＡＡ丁ＣＣＡＧＣＧＧＣＴＧＣＣ ＧＴＡＧＧＣＡＡＴＡＧ　３　’０７）　５’　ＴＧＡＣＧＡＧＣＴＣＧＧＣＣ ＡＴＧＧＣＴＧＧＴ丁ＧＧｒ、３’０８）　５　’　ＴＣＧＡＣＧｌ、ＣＣＧＣ ＴＴＡＡＣＴＣＴＡＧＡＡＣ３’１２、■　＋■　−イブーリー ｖ糎配列に冨む形質発現ライブラリーを調製するために、ｖ８配列に冨むＤ　Ｎ 　Ａ同族体を、５′プライマーの同じ組を使用するが３′プライマーとしてプラ イマー１２Ａ（表１）を用いて実施例６に従って調製した。その後、これらの同 族体を制限酵素Ｘｈｏｌ及び５ｐｅｌで消化し、血１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ］ｏｎｉ ＋王土当坦旺紅吐り匝匹虹、マニアチスらＪｊＬコールド・スプリング・ハーバ −１ＮＹ。
（１９８２年）に記載された通常の電気溶出技術を用いて１％の７ガロースゲル で精製した。その後、これらの調製したｖ、ｌＤＮＡ同族体を、Ｘｂａｌ及び５ ｐｅＴで前もって消化されたＶ、形質発現ベクターに直接挿入した。
ｖＸＤＮＡ同族体を含む連鎖混合物を、ギガバック・ゴールド■バッキング抽出 物（ストラタゲン・クローニング・システムズ、う・ジッタ、ＣＡ）を使用して 製造業者の仕様書に従って包装した。その後、形質発現ライブラリーをＸＬ−１ ブルー細胞に塗布されるように！１！傭した。
■Ｌ配列に冨むライブラリーを調製するために、■、配列に冨むＰＣＩ’ｌｌｉ 生産物を実施例６に従って調製した。これらのｖＬＤＮＡｌＤＮＡ同族体素Ｎｃ ｏｌ及び５ｐｅＩで消化した。消化したＶＬ　ＤＮＡ同族体を、Ｍｏ１ｅｃｕｌ ａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌｓマニアチスラ編 集、コールド・スプリング・ハーバ−１ＮＹ（１９８２年）に記載された通常の 電気溶出技術を用いて１％のアガロースゲルで精製した。ｔＩ製したｖＬＤＮＡ ｌＤＮＡ同族体酵素Ｎｃｏｌ及び５ｐｅＩで前もって消化されたＶｔ形形見発現 ベクター直接挿入した。ＶＬＤＮＡｌＤＮＡ同族体鎖混合物を、製造業者（スト ラタゲン・クローニング・システムズ、う・ジップ、ＣＡ）の指示を用いてＸＬ −１ブルーコンピテント細胞に形質転ｖＬ配列に冨むライブラリーをクローン化 するための調製に於いて、ＰＣＲ増幅生産物（２，５μｇ／３０μｌの１５０ｍ ＭのＮａＣｆ、８ｍＭのトリス−ＭＣＩ　（ｐＨ７，５）　、６＋＋ＭのＭｇ５ Ｏａ　、１−ＭのＤＴＴ、２００Ｍｇ／ａ＋ｊのＢＳＡ、３７℃を、制限酵素５ ａｃｌ（１２５単位）及びＸｂａＩ（１２５ｊ１位）で消化し、１５４のアガロ ースゲルで精製した。増幅反応の生産物の混合物をａ・要とするクローニング莫 験に於いて、等容量（５０μ！、１〜１０μｇ濃度）の夫々の１反ｔＪｆＡ金物 を増幅の後で制限消化の前に組合せた。７％ｉ化したＰＣＲ増輻牌臓膵臓ＮＡの ゲル電気泳動の後に、約３５０ｂｐのＤＮＡフラグメントを含むゲルの領域を切 除し、透析膜に電気溶出し、エタノールで沈殿させ、１０＋＋Ｍのトリス−ＨＣ ｌ、ｐＨ１，５及び１μＭのＥＤＴＡを含むＴＥ溶液中で５Ｏａｇ／μｌの最終 １度に再懸濁した。
■１形質発現ＤＮＡベクターを、このＤＮＡ１００μｇを夫々２５０単位の制限 エンドヌクレアーゼ５ａｃｌ及びＸｂａｌ（両方ともボーリンガ−・マンハイム （Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　ＭａｎＫｌｈｅｉｍ　）　、インジアナポリス、ＩＮ から入手した）並びに製造業者により推奨された緩衝液を含む溶液に添加するこ とによりクローン化のために調製した。この溶液を３７℃で１．５時間保った。
キの溶液を６５℃で１５分間保って制限エンドヌクレアーゼを失活した。溶液を ３０℃に冷却し、製造業者の仕様書に従って熱死滅性（ｈｅａｔ−マジソン、Ｗ ｌ）２５単位及びＣａＣｊｇをそれに添加した。この溶液を３０℃で１時間保っ た。その溶液をフェノールとクロロホルムの混合物で抽出し、続いてエタノール で沈殿させることにより精製した。今ここに、■、■形質発現ベクターが、上記 の実施例で調製したｖＬＤＮＡｌＤＮＡ同族体のために準備された。
■Ｌ配列に冨むＤＮＡ同族体を、表２に示された３　’　ＬｔＪｔライマー及び ５／Ｌ鎖プライマーを使用して実施例５に従って調製した０個々の増幅反応を、 ３　’　Ｌ、ｎプライマーと組合せて夫々の５’Ｌ鎖プライマーを使用して行な った。これらの別個のｖＬ同族体を含む反応混合物を混合し、実施例６に従って 制限エンドヌフレアーゼ５ａｃｌ及びＸｂａＴで消化した。ｖＬ同族体を、Ｍｏ １ｅ−組ｌａｒ汀並圏Ｌ［ｎ匝■旦■」鉦■し、マニアチスら、編集、コールド ・スプリング・ハーバ−１ＮＹ、（１９８２年）に記載された通常の電気溶出技 術を用いて１％のアガロースゲルで精製した。その後、これらの調製したｖＬＤ ＮＡ同族体を、３モルのＶＬＤＮＡ同族体インサートを各モルのｖＬ■形質発現 ベクターと５℃で一夜つなぐことにより、上で調製された５ａｃｌ　−Ｘｂａ開 裂ｖＬＩＩ形質発現ベクターに直接挿入した。ＤＮＡをギガパック…ボールド（ ストラタゲン・クローニング・システムズ、う・ジヨウ、ＣＡ）で包装した後、 ３Ｘ１０’のプラーク形成単位を得、石筆ム 実施例１３で調製した■、■形質発現ライブラリーを増幅し、ｖＬ■形質発現ラ イブラリーファージＤＮＡ５００ＭｇをＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　： Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　ＭａｎｕａＬ：ｓマニアチスらＳ編集コールド・スプ リング・ハーバ−１ＮＹ（１９８２年）に記載された操作を用いて増幅ファージ 原液から調製した。このＶＬ■形賞発現ファージＤＮＡ５０μｇを、エンドヌク レアーゼ製造業者により供給された緩衝液２００．ｕｊ！中に１００単位のＭＬ ｕ　Ｉ制限エンドヌクレアーゼ（ボーリンガ−・マンハイム、インジアナポリス 、ＩＮ＞を含む溶液中で３７℃で１．５時間保った。その後、溶液をフェノール とクロロホルムの混合物で抽出した。その後、ＤＮＡをエタノールで沈殿させ水 １００μｌ中で再懸濁した。こ量２００μｌ中の１００単位の制限エンドヌクレ アーゼＥｃｏＲＩ（ボーリンガ−・マンハイム、インジアナポリス、ＩＮ）と混 合した。この溶液を３７℃で１．５＃間保ち、その後、溶液をフェノールとクロ ロホルムの場合物で抽出した。ＤＮＡをエタノールで沈殿させ、ＤＮＡをＴＥ中 で再懸濁した。
実施例１２でｔｌｉｉ製したＶＮ形賞発現ライブラリーを増幅し、■買形質発現 ライブラリーファージＤＮＡ５００Ｍｇを上で詳述した方法を使用して調製した 。■８形形質現ライブラリーファージＤＮＡ５０μｇを、エンドヌクレアーゼ製 造業者により供給された緩衝液２００ｐｌ中に１００車位のＨｉｎｄ！［１制限 エンドヌクレアーゼ（ボーリンガ−・マンハイム、インジアナポリス、ｆＮ）を 含む溶液中で３７℃で１．５時間保った。その後、その溶液を、０．１Ｍのトリ ス−ＨＣｌ、ｐＨ７，５で飽和されたフェノールとクロロホルムの混合物で抽出 した。その後、ＤＮＡをエタノールで沈殿させ水１００μｌ中で再懸濁した。こ の溶液を、製造業者により規定された成分を含む緩衝液の最終容量２００μ！中 の１００単位の制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ（ボーリンガ−・マンハイム 、インジアナポリス、ＩＮ）と混合した。この溶液を３７℃で１．５時間保ち、 その後、溶液をフェノールとクロロホルムの混合物で抽出した。ＤＮＡをエタノ ールで沈殿させ、ＤＮＡをＴＥ中で再懸濁した。
制限消化したＶＭ形質発現ライブラリー及び■Ｌ■形賞発現ライブラリーを一緒 につないだ、連鎖反応は、ストラタゲン・クローニング・システムズ（う・ジヨ ウ、カリフォルニア）から購入した連鎖キット中に供給された試薬を使用する１ 　０ｐｌの反応液中にＶＸｌｌＪｇ及び■、■ファージライブラリー１μｇから なっていた。４℃で１６時間の連鎖後に、つながれたファージＤＮＡ１μｌをギ ガバック・ゴールド■包装抽出物で包装し、製造業者の指示に従って調製された ＸＬＩ−ブルー細胞に塗布した。得られた３Ｘ１０”のクローンの一部を使用し て組合せの有効性を測定した。得られたＶＩｌ及びｖＬ形質発項ベクターを第１ １図に示す。
Ｖ、及びＶＬの両方を含むクローンを、シッートら著、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ 　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　、１６巻、７５８３〜７６００頁（１９８８年）に記載さ れた試験管内切除プロトコルを用いてファージからｐブルースクリプトに切除し た。切除のために選ばれたクローンはデカペプチドｔａｇを形質発現し、２＋＋ ＋ＭのＩ　ＰＴＧの存在下にＸ−ｇａｌを開裂せず、こうして白色のままであっ た。これらの特徴を備えたクローンはライブラリーの３０％に相当した。切除の ために選ばれたクローンの５０％は制限分析により測定されるようにＶつ及びＶ 、を含んでいた＊ＶＩＩライブラリー中のクローンの約３０％はデカペプチドｔ ａｇを形質発現しｖＬ■ライブラリーのクローンの５０％はＶ、配列を含んでい たので、組合せライブラリー中のクローンの１５％以下はｖＮクローン及びｖＬ クローンの両方を含むことが予想された。得られた実際の数はライブラリーの１ ５％であり、組合せの方法が非常に有効であることを示した。
１５、　ＶＭ　ム　７パ　のた　（ＤＤＮＡ　（７）Ｖ、抗原結合タンパク質に 関して暗号化するＤＮＡ同族体を含む個々のクローンを分離するために、実施例 １１に従ってｉＩ製したｖＩ＋形質発現ライブラリーの力価を測定した＝このラ イブラリー滴定を、当業者に公知の方法を用いて行なった。簡単に言えば、ライ ブラリーの連１％釈液を１００■ＭのＮａＣｊ、５０■Ｍのトリス−ＨＣｌ、ｐ Ｈ１，５及びｌＯ＋ＭのＭｇ５Ｏａを含む緩衝液中でつくった。夫々の希釈液１ ０μＥを指数的に増殖する大腸Ｍ細胞２００ｐｉに添加し、３７℃で１５分間保 ってファージを細菌細胞に吸収された。上部の寒天３ｗｈ１は５ｇ／ｊのＮａＣ Ｊ、２ｇ／１１のＭｇ５Ｏ，，５ｇ／ｊノ酵母エキス、１０　ｇ／１（ＤＮＺ７ ミン（カゼイン加水分解産物）及び０．７％の融解した５０℃のアガロースから なっていた。ファージ、細菌及び上部の寒天を混合し、その後、予め温めた細菌 寒天プレート（５ｇ／ｊ！のＮａＣ１，２ｇ／ｌのＦＩｇＳＯ，，５ｇ／Ｉ−の 酵母エキス、１０　ｇ／ｊのＮＺチアミンカゼイン加水分解産物）及び１５ｇ／ ｊ！のジフコ寒天）の表面に均等に分布させた。プレートを３７℃で１２〜２４ 時間保ち、その期間中にラムダプラークが細・菌ローン上で発生した。ラムダプ ラークを計数してもとのライブラリー中の１ｍ１当りのプラーク形成単位の合計 数を測定した。
その後、滴定した形質発現ライブラリーを、複製フィルターがライブラリーから つくれるようにプレートアウト（ｐｌａｔｅ　ｏｕｔ）　した、複製フィルター は、関係する抗原結合タンパク質を形質発現しているライブラリー中の個々のク ローンをその後に分離するのに使用される。Ｎ単に言えば、１５０ｍｍのプレー ト当り２０．０００のプラークを生じる容量の滴定したライブラリーを、指数的 に増殖する大腸菌細胞６００μｌに添加し、３７℃で１５分間保ってファージを 細ｍｍ胞に吸収させた。その後、上部の寒天７．５ｍｌを、細菌細胞及び吸収フ ァージを含む溶液に添加し、全混合物を予め温めた細菌寒天プレートの表面に均 等に分布させた。この方法を、ライブラリーサイズに少なくとも等しい合計数の プラークをプレートアウトするのに充分な数のプレートに関して繰返した。その 後、これらのプレートを３７℃で５時間保った。その後、プレートを、１０ｍＭ のイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含む溶液で前 処理されたニトロセルロースフィルターでオーバーレイし、３７℃で４時間保っ た。プレートに対するニトロセルロースフィルターの配向を、フィルターを遣っ て数ケ所で細菌プレートに至る防水インク中に浸漬されたニードルで穴をあける ことによりマークした。ニトロセルロースフィルターをピンセントで取り出し、 ２０謬Ｍのトリス−ＨＣｌ、Ｉ）Ｈ７，５，１５０纏ＭのＮａＣ１及び０．０５ ％モノラウレート（トゥイージー２０）を含むＴＢＳ’ｌ液中テ１　回ｔ５１［ Ｌｆ、　ｔり、１０ｍＭのＩＰＴＯを含む溶液中で浸軟された第二ニトロセルロ ースフィルターを細菌プレートに再度通用して二重フィルターをつくった。
フィルターをＴＢＳＴの新しい溶液中で１５分間更に洗浄した。
その後、フィルターを、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、、ｐ）＋７．５．１５０ｍ ＭのＮａＣｌ及び１％のＢＳＡからなるブロッキング溶液中に入れ・室温でＩＦ ＃間攪拌した。ニトロセルロースフィルターを、−次抗体のｌ：５００希釈液を 含む新しいブロフキング？８液に移し、室温で少なくとも１時間にわたって穏か に攪拌した。フィルターを一次抗体を含む溶液中で攪拌した後、フィルターを７ ８３丁中で毎回５分間で３〜５回洗浄して残留の未結合−次抗体を除去した。フ ィルターを新しいプロフキング溶液及びアルカリホスファターゼ接合二次抗体の １：５００〜１：１０００希釈液を含む溶液に移した。フィルターを、その溶液 中で室温で少なくとも１時間にわたって穏かに攬捗した。フィルターをＴＢＳＴ の溶液中で毎回少なくとも５分間で３〜５回洗浄して残留の未結合二次抗体を除 去した。フィルターを、２０ｍＭのトリス−ＭＣＩ、ｐＨ７，５及び１’５０５ ＭのＮａＣｌを含む溶液中で１回洗浄した。フィルターをこのｆＪ液から取り出 し、過剰の水分を濾紙でそれらから吸い取った。フィルターを、１００５Ｍのト °ノスーＨＣ１、ｐＨ９，５，１００ｍＭのＮａＣ１，５ｍＭの門ＫＣ１ｔ　、 ０．３ｗ５ｇ／ｍＡのニトロフ゛ル−テトラゾリウム（Ｎ　Ｂ　Ｔ）及びＯ，１ ５ａｘ／ｗｒ　ｌの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ホスフェート（ ＢＣＩ　Ｆ）　をｔむ溶液中に室温で少なくとも３０分間入れることにより発色 させた。
残留発色溶液を、２０５Ｍのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ１，５及び１５０ｍＭｆＺ） Ｍａｉｌを含む溶液でフィルターからすすいだ、その後、フィルターを２０ａＭ のトリス−ＭＣＩ、ｐＨ２，９及び１−Ｎ１のＥＤＴＡからなるス）７プ溶液中 に入れた０強い紫色の発色が陽性の結果を示す、フィルターを使用して所望のタ ンパク質を生産したファージプラークを配置する。そのファージプラークを分離 し、その後、更に分析するために１殖させる。
−次抗体及び二次抗体の幾つかの興なる組合せを使用した。第一の組合せは、Ｖ ＋１抗原結合タンパク質が翻訳の解読を■□抗原タンパク賃に共有結合で付着さ れるデカペプチドエビトープを含むようにさせるのに適当な読取り枠で形質発現 される場合にのみ形質発現されるデカペプチドに対して免疫特異的な一次抗体を 使用した。このデカペプチドエビトープ及びこのデカペプチドエビトープに対し 免疫特異的な抗体は、グリーン（Ｇｒｅｅｎ）　ら著、皿２ＢＳ、４７７頁（１ ９８２年）及びニーマン（Ｎｉｅｍａｎｎ）ら著、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃ ａｄ、　Ｓｃｉ　υＳ、Ａ、８０１！、４９４９頁（１９８３年）に記載されて いた。認識されたデカペプチドの配列を第１１図に示す、デカペプチドに対し免 疫特異的であるモノクローナル抗体のｍ能上の均等物はグリーンらの方法及びニ ーマンらの方法に従って調製し得る。この−次抗体と共に使用した二次抗体は、 ヤギ抗マウスＩｇＧ　（フィッシャ−・サイエンティフック（ＦｉｓｈｅｒＳｃ ｉｅｎｔｉｆｉｃ）であった、この抗体はマウスＩｇＧの一定の領域に対して免 疫特異的であり、Ｈｌの可変領域の部分を認識しなかった。−次抗体及び二次抗 体のこの特別な組合せは、上記のプロトコルに従って使用された場合に、クロー ンの２５％〜３０９Ａがデカペプチドを形質発現していることを測定し、それ故 これらのクローンはまたｖＭ抗抗原結合タンパクモ形質発現していることが推定 された。
別の＆ｌせに於いて、抗デカペプチドマウスモノクローナル抗体を一次抗体とし て使用し、ストラタゲン・クローニング・シスラムズ、う・ジッラ、ＣＡからピ コブルー免疫スクリーニングキットの部分として市販されるアフィニティー精製 ヤギ抗マウス１５を二次抗体として使用した。この組合せは多数の偽陽性クロー ンを生じた。何となれば、二次抗体がまたＨ（［の■８と免疫反応したからであ る。それ故、この抗体はｖ、ｌタンパク質を形質発現する全てのクローンと反応 し、−次抗体と二次抗体のこの組合せは適当な読取り枠中の■９ポリヌクレオチ ドを含むクローンを特異的に検出せず、こうしてデカペプチドの形質発現を可能 にする。
−次抗体が螢光性イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、に接合される場合に、−次 抗体と二次抗体の幾つかの組合せが使用され、こうして抗体の免疫特異性は重要 ではなかった。何となれば、抗体が予め選択された抗原（Ｆ　ｊＴＣ）に接合さ れ、形質発現ライブラリー中のクローンにより生産されるｖｊＩ抗原結合タンパ ク質により結合されるべきものはその抗原であるからである。この−次抗体が有 効に結合された後、それはＦＩＴＣ接合マウスモノクローナル抗体ｐ　２　５７ ６４　（ＡＴＣＣ＃ＨＢ−９５０５）である。
この−次抗体と使用される二次抗体は、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　Ａ　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒハ匹虹、バーロウ（Ｈａｒｌｏｗ）及びロウ（Ｌｏ＠ｅ）、編集、コー ルド・スプリング・ハーバ−２ＮＹ、（１９８８年）に記載された方法を用いて アルカリホスファターゼに接合されたヤギ抗マウス１ｇｋ（フィッシャー・サイ エンティフィック、ピッツバーグ、ＰＡ）である、■に形質発現ライブラリー中 の特別なりローンが一次抗体に共有結合でカンブリングされたＦｒＦＣを結合す るｖ、Ｉ結合タンパク賀を形質発現する場合、二次抗体が特異的に結合し、発色 される場合アルカリホスファターゼは明瞭な紫色を生じさせる。
その型の抗体の第二の組合せは、ＦＴＴＣ接合ウサギつヒトＩｇＧ（フィッシャ ー・サイエンティフィック、ピンッパーグ、ＰＡ）である−次抗体を使用する。
この−次抗体と共に使用される二次抗体は、ｈ匹劫旦戯二り土山ｌ副二１虹Ｌ」 シー１１、バーロウ及びレーン、編集、コールド・スプリング・ハーバ−、ＮＹ 、　（１９８８年）に記載された方法を用いてアルカリホスファターゼに接合さ れたヤギ抗ウサギＩｇＧであるｓＶＭ形賞発現ライうラリー中の特別なりローン が一次抗体に接合されたＦＩＴＣを結合するｖ、Ｉ結合タンパク質を形質発現す る場合、二次抗体は特異的に結合し、発色される場合アルカリホスファターゼは 明瞭な紫色を生じさせる。
その他の一次抗体は、ＦＩＴＣと１！５Ｉの両方に接合されたマウスモノクロー ナル抗体ｐ　２　５７６４　（ＡＴＣＣ＃ＨＢ−９５０５）であった、その抗体 は形質発現されたいずれかのｖＮ抗原結合タンパク質により結合される。その場 合、抗体はまた１０Ｉでラベルされるので飄アルカリホスフッターゼに接合され る二次抗体を使用する代わりにフィルターのオートラジオグラムがつくられる。
オートラジオグラムのこの直接の生産が関係のあるＶＭ抗抗原結合タンパクモ形 質発現するライブラリー中のクローンの分離を可能にする。
１６、　ムＦマ　る■　びＶ　のためのＤＮＡａ坐立里 抗原結合Ｆマを形成するＶお及びｖＬに関して暗号化するＤＮＡ同族体を含む個 々のクローンを分離するため、ｖＨ及びｖＬ形質発現ライブラリーを実施例１５ に従って滴定した。その後、滴定した形賀発現うイプラ、リーを、実施例１５に 記載された方法を用いてｖ真で形質発現されたデカペプチドｔａｇの存在に関し てスクリーニングした。その後、ＤＮＡをデカペプチドｔａｇを形質発現するク ローンから調製した。このＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＰｖｕＩＩで消化し て、これらのクローンがまたＶＬ　ＤＮＡ同族体を含むか否かを測定した。Ｐｖ ｕｎ制限エンドヌクレアーゼフラグメントの一層遅い移行は、特別なりローンが ｖｘＤＮＡ同族体及びＶＬＤＮＡ同族体の両方を含むことを示した。
Ｖ、ＤＮＡ同族体及びｖＬＤＮＡ同族体の両方を含むクローンを分析して、これ らのクローンがＶＩＩＤＮＡ同族体及びＶｔＤＮＡ同族体から組立てＦ！タンパ ク質分子を生産するか否かを測定した。
ｖＩｌ及びｖＬの両方を含むクローン中に生産されたＦマタンパク質フラグメン トを、クローン中に形質発現された放射能でラベルしたタンパク質の免疫沈殿に より視覚化した。１００μｇ／μｌのアンピシリンを含むＬＢブロース（５ｇ／ ｊの酵母エキス、Ｌｏｇ／ｆｆｉのトリプトン及び１０ｇ／ｌのＮａＣ１、ｐＨ ７，０）の培養液に、Ｖ、及び■、を含むプラスミドを含む大腸菌を接壇した。
培養液を、５５０ｎ（至）で測定される光学密度が０．５になるまで振とうしな がら３７℃に保ち、その後、培養液を３．　ＯＯＯｇで１０分間遠心分離し、メ チオニンまたはシスティンを含まずアミノ酸で補給されたＭ９培地５０ｍｊ（６ ｇ／ｌのＮａｇ）ＩＰＯｅ　、３　ｇ　／　１０ＫＨ，ＰＯ，，０，５ｇ／ｊの ＮａＣ１，１ｇ／ｌのＮＩｌ、ＣＩ、２　ｇ／ｌのグルコース、２＋ａＭのＭｇ ＳＯ４及び０．１ｍＭのＣａＣ１ｆ）中に再懸濁した。この溶液を３７℃で５分 間保ち、その１Ｈｓｏ、−とじての３Ｓ３（−−ニー・イングランド・ヌクレフ 　−（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ）、ボストン、ＭＡ）０．５ｍ Ｃ１を添加し、その溶液を３７℃で更に２時間保った。その後、溶液を３０００ Ｘｇで遠心分離し、上澄液を廃棄した。得られた細Ｎ細胞ベレントを凍結し、融 解し、その後４０箇Ｍのトリス、ｐＨ８，０，１００１Ｍの匣垢及び１−ＭのＥ ［ｌＴＡを含む溶液中で再！ＩＩ！濁した。その溶液を１１００００Ｘで１０分 間遠心分離し、得られたベレットを廃棄した。上澄液を抗デカペプチドモノクロ ーナル抗体１０μ！と混合し、氷上で３０〜９０分間保った。セファローズビー ズ（ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ビス力タウエイ（Ｐｆｃａｔａｗａ ｙ）、ＮＪ）に結合されたプロティンＧ４０μｌをその溶液に添加し、添加溶液 を氷上で３０分間保って免疫沈殿物を生成させた。溶液を１０．ＯＯＯＸｇで１ ０分間遠心分離し、得られたベレットを１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７， ５を含む溶液１ｍｊｉ中に再＠濁し、１０，０００Ｘｇで１０分間遠心分離した 。この操作を２回繰返した。得られた免疫沈殿ペレフトを、製造業者の指示に従 ってファストゲル・ホモシナウス（Ｐｈａｓｔ　Ｇｅｌ　Ｉｌｏｓｏｇｅｎｏｔ ＋ｓ）　２０ゲル（）７−マシ７、ビス力タウェイ、ＮＪ）に装填した。ゲルを 乾燥し、Ｘ線フィルムを露出するのに使用した。
得られたオートラジオダラムを第１２図に示す０組立てＦ、分子の存在は、免疫 沈殿させられた■１の存在によりわかる。何となれば、それは沈殿する抗体によ り１１％される■。−デカペプチドｔａｇに付着されたからである。
バクテリアファージラムダＳ遺伝子は、リーダー（Ｒｅａｄｅｒ）ら著、亘匹旦 ■、４３巻、６０７〜６２２頁（１９７１年）に記載されるように溶菌に直接関 与されると示されていた。Ｓ遺伝子は、ガレ７ト（Ｇａｒｒｅｔｔ）　ら著、４ ．４４巻、８８６〜８９２頁（１９８２年）に記載されているようにそれがペプ チドグリカンを分解する場合に細胞の周辺賞中へのＲ遺伝子生産物の放出を１０ ７アミノ酸ポリペプチドを暗号化する。８１性Ｓ遺伝子変異体（Ｓ＋。、ＳＡＭ ５）は、正常なＳタンパク質膜チャンネルの形成を妨害し、こうして細胞溶解を 防止すると示された突然変異である。
ラアブ（Ｒａａｂ）ら著、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、１９９％、９５〜１０５ 頁（１９８８年）を参照のこと、この変異体Ｓ遺伝子は優性である。
何となれば、それが形質発現される場合に、野生型Ｓタンパク質の存在下であっ ても、それは細菌細胞の溶解を防止するからである。また、Ｓ、。。ＳＡＭ５優 性突然変異はアンバー変異を含み、それ故、変異体Ｓタンパク質が生産されるた めに細菌細胞中のサプレッサーｔＲＮＡの形質発現を必要とする。更に、このア ンバー変異は溶解しないで変異体Ｓ遺伝子構成物を含む細菌の増殖を可能にする 。何となれば、このアンバー抑制ｔＲＮＡなしでは、ｌｌ能脆性遺伝子タンパク 質が生産されないからである。
ラムダＺａｐ　５ａ−５からの優性Ｓ遺伝子を、ポリメラーゼ鎖反応を使用して 分離した。簡単に言えば、ラムダＺａｐ　Ｓａｍ５ＤＮＡを、Ｍｏ１ｅｃｕｌａ ｒ　Ｃ１ｏｎｉ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ、マニアチスら島 編集、コールド・スプリング・ハーバ−２ＮＹ（１９８２年）に記載された方法 を用いて分離した。ラムダＺａｐ　Ｓａｍ５ＤＮＡＯ，１ｐ　ｇを、プライマー ＲＧ１５（表５）１５０ｎ（及びプライマー　ＲＧＩ　６　（！！５）　１５０ ａｇ、夫々０．２５＋＊ＭのｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＡＴＰ　（ ｄＮＴＰｓ）　、５０ｍＭのＫＣｊ、１０ａ＋Ｍのトリス−ＨＣｌ、　ｐＨ８， ３，１，５ｗＭのＭｇＣｊ　’、及び０．１５％の無菌ゼラチンを含む緩衝液と 混合した。得られた溶液を９１℃に５分間加熱し、その後５４℃の水浴中に５分 間入ＦＬり、０．５μｌのＴａｑポリメラーゼ（パーキン・エルマー−セタス（ Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｓｅｒ−Ｃｅｔｕｓ）、ノーウオーク、ＣＴ）を添加し、そ の溶液を鉱油の層でオーバーレイした。
その後、その溶液をＤＮＴサーマル・サイクラ−（ＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒ ）　（パーキン・エルマー−セタス、ノーウオーク、ＣＴ）に入れ、下記の温度 及び時間条件に暴露した。（１）プライマー延長を可能にするために７２℃で２ 分間、（２）二重らせんＤＮＡを熱変性するために９１℃で１分間、及び（３） −末鎖の核はをハブリッド形成させるために５４℃で２分間、同溶液を、製造業 者の指示に従って合計３０のサイクルのために工程（１）、（２）及び（３）の 更なるサイクルに暴露した。その後、サイクルした溶液を７２℃で１０分間保ち 、その後使用するまで４℃で貯蔵した。
上記のポリメラーゼ鎖反応により生産された変異体Ｓ遺伝子ＤＮＡを制限エンド ヌクレアーゼＨｉｎｄ！Ｉ［及びＢｇｌＩＩで消化した。
簡単に言えば、上で生産されたポリメラーゼ額反応生成物の半分をフェノール抽 出、その後のエタノールによる沈殿により精製した。その後、ＤＮＡを、１００ ＋ＭのＮａＣ１，１０ｍＭのトリス−ＨＣ１ＰＨ７，７，１９−Ｍの？ＩｇＣ１ ｘ　、ｌｓＭのＤＴＴ、１１００ｐ／１ａｌｌのＢＳＡ、２０単位のＨｆｎｄｆ ｆｌ及び１０単位のＢｇｌｌＩを含む溶液と混合した。この溶液を３７℃で１時 間保った。この制限エンドヌクレアーゼ消化の効率を、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏ ｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ？Ｉｏｌａｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏ　、アウスベルら、編集 、シラン・ウィリイ・アンド・サッズ（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　５ｏｎ ｓ）　、ＮＹ　（１９８７年）に記載された方法に従ってゲル電気泳動により測 定した。
ポリメラーゼ鎖反応生成物の半分を制限エンドヌクレアーゼ５ａｕ３Ａ及びＢｇ ｌＩＩで消化した。簡単に言えば、ＤＮＡを、１００ｍＭのＮａＣｊ！、１０ｍ Ｍのトリス−ＨＣ１ｐＨ７，７，１０ｍＭのＭｇＣｆ　２　、ｌ　ｍＭのＤＴＴ 　、Ｉ　ＯＱ　ｔｔ　ｇ／ｒｎ１２のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）　、１０１ １位の５ａｕａＡ、及び１０単位のＢｇｌＩ［（ストラタゲン、う・ジッラ、Ｃ Ａ）を含む緩衝液と混合した。この溶液を３７℃で１時間保った。この制限エン ドヌクレシス消化の効率をゲル電気泳動により測定した。
スプリング・ハーバ−１ＮＹ　（，１９８２年）に記載された操作にスプリング ・ハーバ−１ＮＹ（１９８２年）に記載された方法に従って電気溶出によりアガ ロース薄片から精製した。電気溶出したＤＮＡをフェノール抽出、その後のエタ ノールによる沈殿により精製した。
変異体Ｓ遺伝子を、制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩ［［及びＢａｍＨＩで前 もって消化されたｐブルースクリプトＫＳ＋　（ストラタゲン）に挿入した。簡 単に言えば、ｐブルースクリプトＫＳ＋を、１００ｍＭのＮａＣ１！、１００Ｍ のトリス−ＨＣｌ！、ｐＨ７，７，１０ｍＭのＭｇＣｆ　ｔ　、Ｉ　ｍ？−１の ＤＴＴ、１００　ｕ　ｇ／ｒｎｌ！のＢ　Ｓ　Ａ、４０単位のＢａｍＨＩ及び４ ０単位のＨｉｎｄ［［（ストラタゲン）を含む緩衝液と混合した。この溶液を３ ７℃で１時間保った。ｐブルースクリプトＫＳ＋を含む溶液を、その後、トリス −ＨＣｌ、ｐＨ８，０を０．１Ｍの最終ｆＡＩまで添加することによりｐ）１８ ．０に調節した。子ウシの腸アルカリホスファターゼ（ストラタゲン）５単位を 、この溶液に添加し、その溶液を３７℃で３０分間保った。その後、子ランの腸 アルカリホスファターゼを、その溶液を６５℃で１０分間保つことにより失活し た。その後、ｐブルースクリプトＫｓ＋を、フェノール抽出、その後のエタノー ルによる沈殿により精製した。その後、制限エンドヌクレアーゼで清浄したｐブ ルースクＩＪ　フ）　Ｋ　Ｓ＋を、１０＋ｉＭ（７））リス−ＨＣ１、ｐＨ８， ０及び１ｍＭ（１）ＥＤＴＡを含む溶液中で再懸濁した。
変異体Ｓ遺伝子を、Ｈｉｎｄｌｎ及びＢａａ＋ＨＩＦＪＪ限エンドヌクレアーゼ による消化により上で調製されたｐブルースクリプトベクターに挿入（連鎖）し た。簡単に言えば、Ｈ４ｎｄｌ［［及びＢａｍＨＩで前もって切断されたｐブル ースクリプトベクター１μｌを、上で調製された変異体Ｓ遺伝子インサートｌｐ １．０．６６Ｍのトリス−ＨＣｊ！、ｐＨ７，６，５０ｍＭ　（７）ＭｇＣ１ｔ 　、５０　ｍＭ　（Ｄジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む緩衝液１μｋ並びに １０＋ｗＭのＡＴＰ及び０．５μｍ　（４単位）のＴ４ＤＮＡリガーゼ（ストラ タゲン）を含む溶液１μｌと混合した。この溶液を３７℃で１時間保った。
その連鎖混合物を、製造業者の指示に従ってＸＬＩブルー細胞（ストラタゲン） 中で形質転換した。
上記のクローニング工程の正確度をＤＮＡ配列決定により確かめた。
Ｂ／　■　ノ　ベタ　− ｖＨ暗号ＤＮＡ同族体を含まない形質発現ベクターに対して選択する能力を付加 するために、サプレッサーｔ　ＲＮＡ遺伝子を実施例９で調製されたｖつ形質発 現ベクターに挿入した１選択性■ｏ形質発現ベクターを、サブレンサーｔＲＮＡ 遺伝子及びデカペプチドｔａｇに関して暗号化するＤＮＡ配列を含む合成りＮＡ 配列を、制限エンドヌクレアーゼＸｈｏｌ及びＥｃｏＲＩで前もって開裂された 実施例９で調製したＶｘ形賞発現ベクターに挿入することにより調製した。
サプレッサー遺伝子及びデカペプチドｔａｇに関して暗号化するポリヌクレオチ ド配列を含む合成りＮＡ配列を、互いにハイブリッドを形成し第１８Ａ図に示さ れた二本饋合成りＮＡ配列を形成する２０〜４０の塩基の一末鎖ポリヌクレオチ ドセグメントを設計することによりつくった６個々の一末鎖ポリヌクレオチドを 表５に示す。
ポリヌクレオチド９２６．９２７．９２８．９２９．９３０．９３】、ＡＢ２３ 及び９７１＋、７０ｍＭ）’ＪスーＨＣ１（ｐＨ７，６＞　、１０ｍＭ　ＦＩｇ Ｃｌｔ　、５ｗＭ　ＤＴＴ、１０ｍＭ２ＭＥ、及び１ｍ！あたり５００μｇ１７ ）ＢＳＡを含有する溶液に各ポリヌクレオチド＜０．１μｇ／μｆ）１．Ｏｕｌ 及びＴ、ｔｌＪＦ、クレｆ＋ドキナーゼ２０ｊｔ位を加えることによりキナーゼ 化した（ｈｅｒｅｋｉｎａｓｅｄ）、　ｆＪＷｌ、を３７℃で３０分保持し、つ いで６５℃で１０分保つことにより反応を停止させた。
得られた（ｔｈｓ　ｒｅｑｕｉｒｅｄ）ポリヌクレオチドを７二−ル化して図１ ８Ａに示す合成りＮＡｇ列を形成させた０手短かに述べると（Ｂｒｉｅｆｌｙ） 、以下のポリヌクレオチドの溶液を１／ｌＯ容量の２０．０ｍＭ）’ＪスーＨＣ ｊ　（ｐＨ７，４）　、２．０ＩＩ＋Ｍ　ＭｇＣ１，及び５０．ＯｍＭＮａｃｌ を含有する溶液と混合した：ポリヌクレオチド９２６．９２７．９２８．９２９ ．９３０及び９３１を２．５μｇ／劇ｌ含有する別個の溶液５μｌ；キナーゼ化 されていないポリヌクレオチドＡＢ２４及びキナーゼ化されたポリヌクレオチド ＡＢ２３を２．０μｇ／ｓｌ含有する別個の溶液４μｌ；キナーゼ化されたポリ ヌクレオチド９７１及びキナーゼ化されていないポリヌクレオチド９７０を１． ０μｇ／ｌｅｌ含有する別個の溶液２μ！。
この溶液を７０℃に５分７ＪＯ熱し、水の入った５　００ａ＋ｊ！ビーカー中で １．５時間保持して４０℃に冷却した。この時間中に１０のポリヌクレオチドは すべてアニール化し図１８Ａに示す二本鎖合成りＮＡ挿入物を形成した。上記反 応物（４６，６μｇ）のすべてを、５０ａＭトリスーＭＣＩ　（ｐＨ７，５）　 、７ｍＭ　ＭＲＣｊ！ｔ　、１＋ａＭＤＤＴ、１論Ｍアデノシン三リン酸（ＡＴ Ｐ）及び１０紙位のＴ４ＤＮＡリガーゼを含有するン容液とポ合して連結反応混 合物を形成させることによって個々のポリヌクレオチドをお互いにヨπ時合させ て合成りＮＡ挿入物を安定化させた。この混合物を３７℃で１時間保ち、ついで 溶液を６５℃で１５分保持することにより丁４Ｄ　Ｎ　Ａ　リガーゼを失活させ た。上記連結反応混合物反応物のすべてと１０ｍＭ　ＡＴＰ及び５単位のＴ４ポ リヌクレオチドキナーゼを含有する溶液６μｌとを混合して目的ポリヌクレオチ ドをキナーゼ化した。この溶液を３７℃で３０分保持し、ついで溶液を６５℃で １０分保持してＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを失活させた。かくして、予め制 限エンドヌクレアーゼＸｈｏｌ及びＥｃｏｉｌｌで消化したＶＭ−発現ベクター （図７）に連結するための完全合成りＮＡ挿入物（図１８Ａ）が調製された。
Ｖ、−発現ベクター（図７）は製造者のすすめに従って制限エイドヌクレアーゼ Ｘｈｏｌ及びＥｃｏＲＩで消化した９手短に述べると、５０μｇのＶ、ｌ−発現 ベクター（３８，５μ！り、２２５単位のＸｈｏ　Ｉ　（Ｓｔｒａｔａｇａｎｅ ）及び１５０単位のＥｃｏＲＩ　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を、５０ｓＭ）リス −塩ａ　ＣｐＨ１，７＞　、１０ｍＭ　ＭｇＣｊ！ｔ　、５’ＯｓＭＮａＣ１及 び１００μｇ／５ＩＢｓＡよりなる一般的な制限エンドヌクレアーゼＶ＆衝液と 混合して消化混合物を形成した。消化混合物を３７℃で２時間維持した。
ついで１．ｏｍＭ）リスーＭＣＩ溶液（ｐ）１８．０）の添加によって消化混合 物をｐＨ８，Ｑに調製し、最終濃度０．１　Ｍとした。この溶液に２．５単位の 子牛腸アルカリ性ホスファターゼ（Ｓ　Ｌｒａ　ｔａｇｅｎｅ）を加え、得られ た？８戒を３７℃で３０分維持した。この溶液を６５℃で１０分維持して子牛腸 アルカリ性フォスファターゼを失活させた。ついで■、−発現ベクターＤＮＡを フェノール抽出によって精製し、ついでエタノール沈殿させた。ついで制限エン ドヌクレアーゼで切断したＶ８−発現ベクターＤＮＡを１０ｍＭトリス−ＨＣｌ 　（ｐＨ８，０）及び１ｓ＋Ｍ　ＥＤＴＡを含有する溶液５０μｌに再懸濁した 。
上記で調製した合成りＮＡ挿入物をＩＩＩ限エンドヌクレアーゼで切断した■ｘ −発現べ、フタ−に挿入した０手短に述べると、Ｘｈｏｌ及びＥｃｏＲＩで切断 したＶ、−発現ベクターｌμｇ、合成りＮＡ挿入物（０，５μｇ）２μｌ及びＴ ４ＤＮＡリガーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）　０．５　μｍ　（４ｊｔ位）を６ ６ｍＭ）リス−ＨＣＩＣｐＨ７，６）　、５．０ｍＭ　’ｔＩｇｃ１ｚ　、５． ＯｍＭ　ＤＴＴ及び］、０簡Ｍ　ＡＴＰを含有する溶液と混合して連結混合物を 性成させた。連結混合物を３７℃で２時間維持した。ついで連結混合物を製造者 の指示に従って５ｔｒａｔａｚｅｎｅから人手し得るギカパック■ゴールドバッ キングエキストラクト（Ｇｉｘａｐａｃｋ　ＩＩ　Ｇｏｌｄ　ｐａｃｋｔｎ＠　 ｅｘｔｒａｃｔ）を州いてパッケージした（ｗａｓ　ｐａｃｋａｇｅｄ）、つい でパッケージした連結混合物をＸＬＩブルーセル（Ｘ　Ｌ　ｆ　ｂｌｕｅ　ｃｅ ｌｌｓ）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）上に置いた。
個々のラムダファージプラークを、合成りＮＡ挿入物中に含まれたポリヌクレオ チド（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）とハイブリッドした個々のプラーク（ ｐｌａｑｕｅｓ）をＣｕｒｒｅｕｔ　Ｐ　ｏｔｏｅｏ　ｉｎ　Ｍｏ　ｅｃｕｌａ ｒｈ虱昼Ｌ（分子生物学における最近のプロトコル）　、Ａｕ５ｕｂｏｌ　ら縄 、ジッンウィリーアンドサッズ、ニューヨーク（１９８７）に記述された方法に 従って選択することによって、ＤＮＡ＆！列決定のために、選択した０選択し得 る■。−発現ベクターを図１９ＡＶ、をコード化するＤＮＡを含有しない発現ベ クターに相同体を選択する能力を付加するために、実施例１１で調製したＶ、− 発現ベクター中にサプレッサーｔＲＮＡ遺伝子を挿入した。制限エンドヌクレア ーゼ５ａｃｌ及びＸｂａｌで予め切断した、算施例１１で調製したｖＬ−発現ベ クター中にサブレンサーｔＲＮＡ遺伝子を含有する合成りＮＡ配列を挿入するこ とにより選択し得るｖＬ−発現ベクターを調製した。
サプレッサーｔＲＮＡ遺伝子を含有する合成り　Ｎ　Ａ配列は、互いにバイブリ フトして図１８Ｂに示す二本鎖合成りＮＡ配列を形成する、２０−４０塩基の一 本鎮ボリヌクレオチド断片を設計することによって構築した０個々の一本鎖ポリ ヌクレオチドを表５に示す。
ポリヌクレオチド９２６．９２７．９２８．９２９．９３０．９７２及び９７５ を、各ポリヌクレオチド（０，１μｇ／μｌ）１、０μＥ及び２０単位のＴ４ポ リヌクレオチドキナーゼを７０ｍＭトリス−ＨＣＡ　（ｐ）１７．６）　、１０ ｍＭ　ＭｇＣｊｚ　、５＋ａＭ　ＤＴＴ。
１０畠Ｍ２ＭＢ、１００μｇ／ｍ１ＢｓＡを含有する溶液に加えることによって キナーゼ化した。この溶液を３７℃で３０分維持し、ついで溶液を６５℃で１０ 分維持することにより反応を停止させた。
得られたポリヌクレオチドをアニール化して図１８Ｂに示す合成りＮＡ配列を形 成させた０手短かに述べると、以下のポリヌクレオチド溶液を２０．０ｍＭ）リ ス−ＨＣｊ　（ｐＨ７，４）　、２．０＋ＭＭｇＣｊ！、及び５０．　ＯｍＭ　 ＮａＣｊ！を含有する１／１０容積の溶液と混合した：キナーゼ化したポリヌク レオチド９２６．２２７．９２８．９２９．９３０及び９３１を２．５μｇ　／ 　ｍ　ｊ含有する別個の溶液５μｌ；キナーゼ化されていないポリヌクレオチド ９７４及び９７３を２．０μｇ／１ａｌｌ含有する別個の溶液２μｉ；キナ−含 有する別個の溶液２μｌ。
この溶液を７０℃で５分加熱し、ついで水の入つた５　００＠ｌ！ビーカー中で １．５時間、保持して４０℃に冷却した。この時間内に１０のポリヌクレオチド はすべて７二−ル化して図１８Ｂに示す二本値合成りＮＡ挿入物を形成した。上 記反応物（４２，２μｊ）のすべてを、５０＋ｏＭトリスーＨＣｌ　（ｐＨ７， ５）　％’　７ｍＭ門ｇＣｊ！、、１＊Ｍ　ＤＤＴ、１鯵Ｍアデノシン三リンｉ ！！２　（ＡＴＰ）及び１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを含有する溶液と混合し て連結反応混合物を形成させることによって個々のポリヌクレオチドをお互いに 共有結合させて合成りＮＡ挿入物を安定化させた。この混合物を３７℃で１時間 保ち、ついで溶液で６５℃で１５分維持してＴ４ＤＮＡリガーゼを失活させた。
上記連結反応混合物反応物のすべてと１０ａＭ　ＡＴＰ及び５単位のＴ４ポリヌ クレオチドキナーゼを含有する溶液６μｌとを混合して目的ポリヌクレオチドを キナーゼ化した。この溶液を３７℃で３０分保持し、ついで溶液を６５℃で１０ 分保持してＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを失活させた。かくして予め制限エン ドヌクレアーゼ５ａｃｌ及びＸｂａｌで消化したＶ、−発現ベクター（図９）に 連結するための完全合成りＮＡ挿入物（図１８Ｂ）が用意された。
ｖＬ−発現ベクター（図９）は製造者のすすめに従って制限エンドヌクレアーゼ ５ａｃｌ及びＸｂａｌで消化した０手短かに述べると５．０μｇのＶ、−発現ベ クター（３０，５μｍ）、５０ＪＩＬ位のＳ　ａｃ　Ｉ　（ＳｔｒａＬａｇｅｎ ｅ）及び５０１位のＸ　ｂａ　Ｉ　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を、１０＋ｇＭ） 　リ　スー　ＨＣＩ　（ｐ）１７．７）　、１　０ｍＭ　ＭｇＣ１ｔ　、　１　 ０　０＋＊ＭＮａＣ１及び１００μｇ／＋ｗｊＢＳＡよりなる一般的な制限エン ドヌクレアーゼ緩衝液と混合して消化混合物を形成した。消化混合物を３７℃で ２時間維持した。
ついで１．ｏｍＭ）リス−ＨＣり溶液（ｐＨ８，０）の添加によって消化混合物 をｐＨ８，０に調整し、最終濃度０．１　Ｍとした。この溶液に２．５ｊ１位の 子牛腸アルカリ性ホスファターゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎａ）を加え、得られた溶 液を３７℃で３０分維持した。この溶液を６５℃で１０分維持して子牛腸アルカ リ性フｔスファターゼを失活させた。ついで■Ｌ−発現ベクターＤＮＡをフェノ ール抽出によって精製し、ついでエタノール沈殿させた。ついで制限エンドヌク レアーゼで切断したｖＬ−発現ベクターＤＮＡを１（１＋Ｍ）リス−ＨＣｊ！　 （ｐｌ（８，０）及び１偽Ｍ　ＥＤＴＡを含有する溶液５０μｌに再懸濁した。
上記で調製した合成りＮＡ挿入物を制限エンドヌクレアーゼで切断した■１−発 現ベクターに挿入した０手短かに述べると、５ａｃｌ及Ｘｂａｌで切断した■。
−発現ベクター１μｇ１合成りＮＡ挿入物（０，５μｇ）２μＪ及びＴ４ＤＮＡ リガーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）０．５μｌ　（４単位）を６６−Ｍトリス− ＨＣｌ　（ｐＨ７，６）　、５．０−Ｍ−Ｃ１，、ｓ、ｏｍＭ　ＤＴＴ及び１． ＯＬＩＭ　ＡＴＰを含有する溶液と混合して連結混合物を生成させたた、連結混 合物を３７℃で２時間維持した。ついで連結混合物を製造者の指示に従ってＳｔ ｒａｔａｇｅｎｅから入手し得るギガバフクコゴールドバッキングエキストラク トを用いてパンケージした。ついでパッケージした連結混合物をＸＬＩブルーセ ル（’；ｔｒａｔｊｇｅｎｅ）上に１いた。
個々のラムダファージプラークを、合成りＮＡ挿入物中に含まれたポリヌクレオ チド（ｐｏｌｙｒ＋ｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）とハイブリッドしたプラーク（ｐｌ ａｑｕｅｉ）をＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒ　Ｍａｎｕａｌ（分子クローニング：実験室指針）　、Ｍａｎｉａｔｉｓら編 、Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、ニューヨーク　（１９８９）に記述さ れた方法に従ってスクリーニングすることによって、ＤＮＡ配列決定のために、 選択した６選択し得る■、−発現ベクターを図１９Ｂに示す。
Ｄ、ｊ！ＬｌｊるＶ−び■−ベタ　−の実施例１７Ｂで調製したｖＮ−発現ベク ターをそれがＸｈｏｌまたは５ｐｅｌ制限工ンドヌクレアーゼ部位を含まないよ うに修飾する。このベクターの修飾は１セントのポリヌクレオチド及び実施例１ ７Ｂに記述した方法と同様な方法を用いて達成する。
実施例１７Ｃで！ＦＩ製したＶＬ−発現ベクターをそれが５ａｃｌまたはＸｂａ Ｔ制限エンドヌクレアーゼ部位を含有しなくなるように修飾する、このｖＬ−発 現ベクターの修飾ば】セットのポリヌクレオチド及び実施例１７Ｃに記述した方 法と同様な当業界で周知の方法を用いて達成する。修飾したＶ、−発現ベクター と修飾したｖ８−発現ベクターを組み合わせて選択し得るｖＬ及び■９−発現ベ クターを生成させる０手短かに述べると、修飾した■ヮー発現ベクターを制限エ ンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄｌｌＩで酵素製造業者によって推奨さ れた条件を用いて消化し、他方修飾したＶ、−発現ベクターを制限エンドヌクレ アーゼＥｃｏＲＩ及びＭｌｕｌで消化する。制限エンドヌクレアーゼで切断した Ｖに及びｖし一発現ベクターを標準的技術を用いて連結して図２０に示す選択し 得るｖ８−及びｖＬ−発現ベクターを形成させた。
ｖ、Ｉ−及びＶ、−発現ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）は２つのサプレッサーｔＲＮ Ａ遺伝子を含有しており、１つはＶ。ＤＮＡ相同体で代替されており、他はＶ、 ＤＮＡ相同体で代替されている。従って、ベクターがｖＮとＶＬ　ＤＮＡ相同体 の両方を含有する場合には、そのベクターはｖＮ及びＶ、含有ベクター（ｖｅｃ ｔｏｒ）が適当な選択条件下にファージプラークを生じさせることを可能にする サプレッサーｔＲＮＡ遺伝子を含有していない。
Ｅ、ｕ　の゛　し′るＤ　Ｎ　Ａ　ベタ　−への実施例５で調製したｖｌｌ及び ／またはｖＬをコードするＤＮＡ相同体を提供された側頭エンドヌクレアーゼ部 位を用いてｖＭ及び■Ｌ発現ベクター、ｖＮ発現ベクターまたは■４発現ベクタ ーに挿入する。■、！−コードＤＮＡ相同体は代表的には提供されたＸｈｏｌ及 び５ｐｅｌ制限工ンドヌクレアーゼ部位（図２０）中に標準的手法を用いて挿入 する。■、−コードＤＮＡ相同体は代表的には提供された制限エンドヌクレアー ゼ部位（図２０）に挿入する。従って、遺ばれた特定の発現ベクターによって、 ここに記述した方法は■８−コードＤＮＡ相同体単独、ｖＬ−コードＤＮＡ相同 体単独、またはｖ９及びｖＬＤＮＡ相同体を含有する発現ベクターを生成させる 。
Ｖ）Ｉ−コードＤＮＡ相同体をまず発現ベクターに挿入し、ついでＶＬＤＮＡ相 同体を挿入することができる。別法として、ＶＬ−コード相同体をまず挿入し、 ついでＶ、Ｉ−コード相同体を挿入できる。いずれの挿入原序もｖ８−コードＤ ＮＡ相同体のライブラリーとＶＬ−コードＤＮＡ相同体のライブラリーのランダ ム組換えを可能にする。ｖＭ相同体をｖ、ｌ＋ｖＬ発現ベクターに挿入した後、 この発現ベクターを増殖させてより多くのＶ）１含有発現ベクターを生成させる ことができる。ついでＶＬ　−コードＤＮＡ相同体をｖｌ及び■Ｌ発現ベクター に押入できる。これらの手順のいずれも大きな組合せライブラリーの生産を可能 にする。
Ｆ、Ｖ蝕　び／唸たはＶ　ＤＮＡ　人　フ　−ジの゛最終ライブラリー中に存在 する、ｖＭ及び／またはＶＬ　ＤＮＡ相同体を含有しない発現ベクターの数を減 するために強力な選択系を用いる。この選択系は優性ラムダＳ遺伝子突然変異を Ｖ、及び／または■１発現ベクター中に存在するサプレッサーｔ　ＲＮＡと組み 合わせる０発現ベクター中にサプレッサーｔＲＮＡが存在すると、突然変異ラム ダＳタンパク質が生産されて感染菌体（量ｎｆｅｃｔｅ４　ｃａｌｌ）の’１４ Ｍ　（ｌｙｓｉｓ）を防止し、それによってファージプラークの生成を防止する 。ＤＮＡ相同体がサプレッサーｔＲＮＡに代替すると、発現ベクターはファージ プラークを生成させ得名。
ｖＭ及び／またはｖｔを検出するには、ｖｏ及び／またはＶＬ発現ベクターはフ ァージプラークを生産しなければならない、なぜなら、プラークの生産がない場 合には、免疫学的または結合アッセイを用いて検出するに十分な発現されたｖつ 及び■１がないからである。従って、Ｖ工及び／またはｖＬを含有しないファー ジは検出されない、この選択を達成するのに、実施例１７Ａで生産した変異体Ｓ 遺伝子プラスミドを含有する適当な宿主細菌菌体を目的とする発現ベクターライ ブラリーで感染させる。サプレッサーｔＲＮＡ遺伝子を育しない発現ベクター、 すなわちＤＮＡ相同体を含有する発現ベクターがファージプラークを生産する。
せの−イブ−１−の　７ Ｖｍ　、ＶＬ　、Ｆｖ及びＦａｂ配列の発現に遺したベクターを図７及び９に図 示する。前述の如く、これらのベクターはラムダＺａｐを、多重クローニング部 位に合成オリゴヌクレオチドを挿入することにより修飾することによって構築し た。ベクターはクローニング部位及び発現部位の側面に位置するＮｏｔｌ及びＥ ｃｏＲＩ制限部位に関し反対称となるように設計した。下記に示すごとく、バク テリオファージのような線状ベクター中の制限部位の配置における反対称はＬ鎖 を発現するライブラリーをＬＳＩを発現するライブラリーと結合して組合せのＦ ａｂ発現ライブラリーを構築するのを可能にする系の木賃的特徴である。ラムダ ＺａｐＵ　ＶＬ　ＩＩ　（図９）はＬｆｌ断片のためのクローニングベクターと して役立つよう設計されており、ラムダＺａｐＩ［Ｖｘ　（図７）はライブラリ ー構築の初期工程におけるＨ鎖配列のためのクローニングベクターとして役立つ よう設計されている。これらのベクターは、各末端に移入された特定の制限部位 を有する、ＰＣＲ増幅の生産物を効率的にクローン化するよう設計されている。
Ａ、抗体断片のＰＣＲ増幅 増幅された生産物の末端に制限部位を移入するオリゴヌクレオチドを有する膵臓 細胞から単離されたｍＲＮＡのＰＣＲ増幅をＦｄ及びカッパ鎖配列を含むＨａ配 列をクローン化し、発現するのに用いることができる。これらの増幅に用いられ るオリゴヌクレオチドブライマーを表１及び２に示す。これらのプライマーはＶ 、配列の増幅のために実施例５で成功裏に用いられたプライマーと類似である（ ａｎａｌｏｇｏｕｓ）。Ｈ鎖増幅のための５′プライマーのセットは■８を増幅 するのに以前に用いたものと同じであり、Ｌ鎮増幅のための５′−プライマーは 同様な原則に基づいて選ばＧ：３８３３　（＋９８９）。Ｈ（ＩｇＧ１）及びＬ 　（ｋ）　Ａｌｌ配列の独特の３′プライマーはＨ−Ｌｍジスルフィド結合の生 成に関与するシスティンを含むように選んだ。この段階ではラムダし鎮を増幅す るプライマーは構築されていなかった。なぜならラムダＬｆｆｌはネズミの抗体 の小さな分画しか構成しないからである。さらに、Ｊ（結合（ｊｏｉｎｉｎｇ） ）領域（アミノ酸１２８）におけるｍＲＮＡに相補的な３′プライマーと加工さ れたタンパク質の保存されたＮ−末端領域にある１次鎖ｃＤＮＡ　（ｆｉｒｓｔ 　５ｔｒａｎｄｃＤＮＡ）に相補的な独特な５′プライマー（５’　ｐｒｉｍｅ ｒｓ）の１セツトを用いてＦ７断片を構築した。制限エンドヌクレアーゼ認識配 列をプライマーに入れて、発現のために設定された読取り枠において増幅された 断片をラムダファージベクター中にクローニングするための準備をする（ａｌｌ ｏｗ　ｆｏｒ”）　ｅＢ、−イブ−！−の 組合せライブラリーの構築は２工程で行った。最初の工程では、別々のＨ及びＬ ＳＩライブラリーをそれぞれラムダＺａｐＩＩＶい及びラムダＺａｐｎＶＬ■中 に構築した。第２の工程で、これら２つのライブラリーを各ベクター中に存在す る反対称ＥｃｏＲＴ部位で結合させた（ｗｅｒｅ　ｃｏｍｂｉｎｅｄ）　＊　こ れによりＨ及びＬ鎖を共に発現し得るクローンのライブラリーが得られる。現実 の組合せはランダムであり、親動物中のＢ細胞集団中に存在する組合せを反侠す る必要はない、キーホールリンブレットへモジアニン（ＫＬＨ）、！：複合化さ せた式ｌ　（図１３）のｐ−ニトロフェニルホスホンアミデート（ＮＰＮ）抗原 １で予め免疫化した１　２９　Ｇｉｘ＋マウスの膵臓から単離したｍＲＮＡのＰ ＣＲ増幅によって得られたＤＮＡから、ラムダＺａｐｌＩＶ、発現ベクターを用 いてＨｆｆ配列のライブラリーを作出した。ＮＰＮ−ＫＬＨ複合体はジメチルホ ルムアミド中式１　（図１３）のＮＰＮ２．５ｍｇを含有する２５０μｌの溶液 とＯ，０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，２）中にＫＬＨ２ａｇを含有す る７５０μｌの溶液とを混合してｔｍ製した。すなわち２つの溶液を、回転する 撹拌棒による攪拌下のＫＬＨ溶液にＮＰＮ溶液を徐々に添加することによって混 合した。ついで混合物を同じ攪拌下に４℃で１時間維持して複合化を進行させた 。複合化ＮＰＮ−ＫＬＨを非複合化ＮＰＮ及びＫＬＨからセファデツクスＧ−２ ５を用いるゲル濾過によって単離した。単離したＮＰＮ−ＫＬＨ複合体を実施例 ２に記述した如きマウスの免疫化に用いた。
上述の免疫化で得られた膵臓ｍＲＮ−Ａを単離し、ラムダＺａｐＩ［ｖＩ＋発現 ベクターを用いてＶ、の遺伝子配列の１次ライブラリー（ｐｒｉｍａｒｙ　１ｉ ｂｒａｒｙ）を作出するのに用いた。１次ライブラリーは１．３Ｘ１０’のｐｆ ｕを含んでおり、Ｆｄ配列を発現するクローンのパーセンテージを決定するデカ ペプチド標識の発現についてスクリーニングした。このペプチドの配列はＦｄ　 （またはＶｘ）断片のベクターへのクローニングに続く発現のためのフレーム中 にのみ存在する。ライブラリー中のクローンの少なくとも８０％がデカペプチド ｍｓの免疫検出に基づ＜Ｆｄ断片を発現する。
Ｈ１！と同様にしてＬ鎖うイブラリーを構築した。このＬ鎖うイブラリーは２． ５Ｘ’ｌＯ”のメンバーを含有することが判明した。
抗カッパ鎖抗体を用いるプラーク配列決定はライブラリーの６０％が発現される Ｌ鎖挿入物を含むことを示した。この比較的小さな、挿入物のパーセンテージは ５ａｃｌ及びＸｂａｌでの切断後のベクターの不完全な脱リン酸化に由来すると 考えられる。
一旦得た後、この２個のライブラリーはＥｃｏＲＩ部位でそれらを交叉させるこ とにより組合わせライブラリーを構築するのに用いられた。この交叉を達成する ため、ＤＮＡははじめに各々のライブラリーから精製された。Ｌ−１ｊライブラ リーはＭｌｕｌ制限エンドヌクレアーゼにより切断され、得られる５′末端は脱 リン酸され、生成物はＥｃｏＲＩで消化された。この工程はベクターの左アーム （ａｒｌＩ）を数個の断片に切断したが、Ｌ−鎖配列を含む右アームはそのまま 残存した。
同様に、重い鎖ライブラリーのＤＮＡはＨ１ｎｔ３　ｍで切断され、脱リン酸化 され、及びＥｃｏＲＩにより切断され、右アームを破壊したがＨ−饋配列を含む 左アームはそのまま残存した。このようにしてｍ製されたＤＮＡは次いで結合さ れ、（Ｃｏｓ＋ｂｉｎｅｄ）、連結（ｌｉｇａｔｅ）された、連結後、！、−［ を含むクローンの右アームとＨ−鎖を含むクローンの左アームとの組合わせから 得られたクローンのみが生存可能なファージを再構築した。連結及びバフケージ ングの後、２．５Ｘ１０’のクローンが得られた。これはＮＰＮに対するアフィ ニティーを有するクローンを同定するためにスクリーンされた、組合せＦａｂ発 現ライブラリーである。
Ｌ−及びＨ−鎖断片を共に発現（ｅｏ−ｅｘｐｒｅｓｓ）するファージクローン の頻度を決定するために、Ｌ−ｔＡの重複リフト（ｌｉｆｔ）、Ｈ−鎖及び組合 せライブラリーは、Ｌ−及びＨ−鎖発現のために上述のようにスクリーンされた 。約５００の組換えファージのこの研究において、約６０９ＡがＬ−及び）（− １１蛋白質を共に発現した。
Ｃ１且厭且豆 すべての３種のライブラリー、Ｌ−鎖、Ｈ−Ｉ及びＦａｂは、それらが、ＮＰＮ ｆｖ３合する抗体断片を発現する組換えファージを含むかどうか決定するために スクリーンされた９代表的な工程においては、３０．０００フアージがプレート され（ｐｌａｔｅａ）、ニトロセルロースとの重複リフトがＩＺＳＩ標ｆｆ１Ｂ ＳＡに連結された（ｃｏｕｐｌｅｄ）　Ｎ　Ｐ　Ｎへ結合するためにスクリーン された（第１５図）。
Ｌ−鎖ライブラリーからの８０．ＯＯ１換えファージ及びＨ−１１ライブラリー からの同数の重複スクリーンは、抗原に結合するいずれのクローンも同定しなか った。これと対照的に、Ｆａｂ発現ライブラリーからの同様の数のクローンのス クリーンは、ＮＰＮに結合した多くのファージプラークを同定した（第１５図） 、この観測は、多くのＨ−１’ＡがＬ−１１と組み合わされて抗原に結合する条 件下では同しＨ−鎖又はＬ−１のみが得られないことを示唆する。したがって、 ＮＰＮの場合、多くのＨ−及びＬ−４３が特別なし−及びＨ−鎖に各々結合され たとき、多くのＨ−及びＬ−鎖は抗原に草に結合するものと信じられている。
数多くのクローンをスクリーンする能力を測定するために、及び組合せライブラ リーにおける抗原結合クローンの頻度についてより定量的な予測を得るために、 百方のファージプラークがスクリーンされ及び抗原に結合した約１００のクロー ンが同定された。
ＮＰＮに結合すると信じられている６クローンについて、正の及び約２０サラン デイング（ｓｕｒｒｏｕｎｄｉｎｇ）バクテリオファージプラークを含むプレー トの１域が「コア」され、リブレートされ（ｒｅ−ｐｌａｔｅｄ）−及び重複リ フトともにスクリーンされた（第１５図）。
予測されたとおり、２０個のファージのうち約１個が特異的に抗原に結合した。
負と信じられていた、プレートされたファージの領域の「コア」はリブレートの 際に正を与えなかった。
抗原−抗体相互作用の特異性を決定するために、第１６図に示されるように、抗 原結合は遊離の標緻しない抗原との競合に付された。競合研究は個々のクローン が抗原アフィニティーに基づいて識別できたことを示した。結合の抑制を競合さ せるために要求される遊離の抗原の濃度は１Ｏ−１００ｘｌＯ″Ｍの間で変動し 、このことは発現Ｆａｂ断片がナノ（ｎａｎｏ）モル範囲内で結合定数を有する ことを示唆している。
Ｄ、　ローンの　びそれ゛の　成 実施例１８Ｃで述べたようなＮＰＮを結合することができる蓋口生成物の特性化 （ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ）の調製において、Ｈ−及びＬ−鎖遺伝子 を含むプラスミドがＭ１３ｓｐ８ヘルパーファージを用いておおよそ「コアされ たＪ　（Ｃａｒｅａ）バクテリオファージプラークから削り取られた。削り取ら れたプラスミドの７７ピングはＨ−及びＬ−ｌｉｆｔ配列の挿入と一致する制限 パターンを立証した。
スタンブロッティングにより分析され、ＮＰＩ−Ｊ結合蕾白譬の組成を確立した ＊　Ｌ　Ｐ　Ｔ　Ｇ誘ｆｆ１（ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）に引きｍ＜ａｍの上清は濃 縮され、ゲル口過に付された０分子を範囲４０〜６０ｋＤの分画がプールされ（ ｐｏｏｌｅｄ）、濃縮され及び更にゲル口過分離に付された。第１７図に示され るように、溶離分画のエライザ分析は、ＮＰＮ結合が分子量５０ｋＤの螢白質と 結合しており、それはＨ−及びＬ−１を含むことが免疫検出により示されること を立証した。非還元性条件下濃縮細菌の上澄調製物のウェスタンプロット（図示 されない）はアンチ−デカペプチド抗体とともに展開された。これは、５０ｋＤ の分子量の蛋白質バンドを示した。これらの結果は、■−及びＬ−鎖が共有結合 しているＦａｂ断片のファンクシテン（ｆｕｎｃｔｉｏｎ）であるＮＰＮ結合と 一致している。
Ｅ、　のレバート１−の　・フ　−ジ　ムせ一イブー１−企並１座止較 この実施例においては、わずかに限定された数のプライマーがＥｄ配列のＰＣＲ 増幅のために用いられるので、比較的制限されたライブラリーが調製された。こ のライブラリーはカッパ／ガンマ１配列を発現するクローンのみを含むことが予 測されている。
しかし、抗体クラスはサブクラスを増幅するために追加的プライマーを加えるこ とができるので、これは本質的な方法の制限とはならない、この制限にもかかわ らず、我々は数多くの抗原結合クローンを単離することができる。
この研究から生じる中心的な問題は、上記のように調製されたファージライブラ リーを生体内の抗体レパートリ−と、大きさ、多様性の特徴及びアクセスのし易 さの諸点においていかにして比較するかということである。
哺乳類の抗体のレパートリ−の大きさを判断することは困難であるが、抗原特異 性とは異なる１０″〜１０１程度の数値がしばしば引用される。幾分が控えめに 後述されるように、この大きさかまたはこれより大きいファージライブラリーを 現行の方法の改良によって容易に構築することができる。事実、初期の組合せラ イブラリーが一旦構築された後、Ｈ−及びＬ−１に’は組み換えられ、例外的に 大きい数のライブラリーを得ることができる。
原理上、ナイーブな（ｎａｉｖｅ）　（非免疫の）生体内のレパートリ−及びこ れに対応するファージライブラリーはＨ−及びＬ−鎖のランダムな組合せを含む という点で同様であると予測される。しかし、異なるファクターが生体内レパー トリ−及びファージライブラリーにより発現される多様性を制限する役割を果た すであろう０例えば、耐性（ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）のような生理的な変化（ｍｏ ｄｉｆｉｃａ−ｔｉｏｎ）が生体内レパートリ−からのある壇の抗原特異性の発 現を制限するであろうがこれらの特異性はまだファージライブラリーにおいて現 われるかもしれない、一方、クローニング工程におけるバイアス（ｂｉａｓ）が 制限をファージライブラリーの多様化に導くかもしれない０例えば、刺激された Ｂ−細胞により発現される配列のためのｍＲＮＡの表現（ｒｅｐｒａｓｅｎｔａ ｔｉｏｎ）は、高レベルの発現のために、刺激されない細胞のそれらに優先する ものと予測し得る。異なるソース（ｓｏｕｒｃｅ）組織（例えば、末梢血液、骨 髄又は局所のリンパ節）及びＰＣＲプライマー（例えば、異なる抗原クラスを増 幅すると予測されるもの）は、異なる多様性特性を有するライブラリーをもたら すかもしれない。
生体内のレパートリ−とファージライブラリー間の別の相違は、前者がＨ−及び Ｌ−鎖の結合後の体腔（ｓｏｍａｔｉｃ）変異によるアフィニティー成熟を利用 できるのに対して、後者は成熟したＨ−及びＬ−９をランダムに結合することで ある。特定の生体内レパートリ−に由来する十分に大きいファージライブラリー であれば、元の成熟したＨ−及びＬ−ｆｆが組み換えられるであろう、この新し い技術の潜在的な利溢の一つば卓−の高度に多様な属に通有な（ｇｅｎｅｒｉｃ ）ファージライブラリーがＪｉしることにより免疫の必要性を回避することであ るため、体腔（ｓｏ＋５ａｔｉｃ）変異及びクローン選択の欠慣を補填するため の配列を至適化する方法を有することは有用であろう１本発明の方法においては ３種の方法が容易に通用し得る。第１に、飽和突然変異生成（ｓａｔｕｒａｔｉ ｏｎ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）がＣＤＲ’ｓ上で行なわれるかもしれず、及び 得られたＦ　ａｂｓは増加した機能のために分析され得る。第２に、抗原を結合 するクローンのＨ−又はＬ−［が、組合せライブラリーを構築するのに用いたの と同様の操作により、全体のし−又はＨ−［ライブラリーと組み換えられ得る。
第３に、上述の２種の手順の反復サイクルは、イムノグロブリンのアフィニティ ー又は触媒特性をさらに至通化するために行い得る。後の２種の操作がＢ−細胞 クローン選択において許容されないことは、ここに述べられる方法が実際に主通 な配列を同定する能力を増加するかもしれないことを示唆していることは留意さ れるべきである。
アクセスは、生体内抗原レパートリ−とファージライブラリーとを比較するのが 興味深い第３の領域である。実際上、ファージライブラリーはかなりアクセスし 易い、スクリーニング方法は、人間がプレート１個当たり少なくとも５０，００ ０のクローンを調べ１日当たり１０６の抗体を容易に検査し得ることを可能にす る。
このファクターのみで、ハイブリドーマ技術をここに記載される方法に代えるこ とは勇気づけられるべきである。最も強力なスクリーニング方法は、選択可能な マーカーを、栄養要求性細菌株の複製に必要とされる脱離基や触媒によって不活 性化され品い毒性′ｙｌ換基のような抗原へ導入することによって達成されるか もしれない、選択を利用する。生体内抗原レパートリ−は結合アフィニティーに 基づく選択である免疫を通してのみアクセスされるという事実に関連する、更な る有利性も存在する。このファージライブラリーは同様に制限されない３例えば 、触媒特性とともに抗体を同定する唯一の一般的な方法は抗体の遷移状態類似体 へのアフィニティーに基づく前選択（ｐｒｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）による、こ のような制限は、触媒反応が原理上直接的に分析し得る塗体外ライブラリーに通 用されない、数多くの抗体を機能のために直接的に分析する能力は機構がよく解 明されていないかまたは遷移状態類（以体の合成が困難である、触媒の選択を可 能にするかもしれない、触媒反応の分析は、合成類似体に悪化さセる（ｐｅｊｏ ｒａｔｉｖｅ　ｔｏ）反応機構のためのスクリーニング操作のバイアス（ｂｌａ ａ）を直接除去する。
ルたがつて、一定の化学変換の多重反応経路を同時に解明することが可能となる 。
ここに開始された方法は、多くの重要な点にお°いてそのままの（全体の）抗体 と明らかに異なるＦａｂ断片の生成を記載している。
疑いなく、−価のＦａｂ抗原バインダー（ｂｉｎｄｅｒ）を有することにおいて 、アフィニティーの損失があるが、これは適切なきつい（ｔｉｇｈｔ）バインダ ー（ｂｉｎｄｅｒ）の選択によって′４填できる。診断法やバイオセンサー等の 多くの里途においては、−価のＦａｂ断片を有することが好ましいかもしれない 、Ｆｃ効果Ｈ（ｅｆｆｅｃｔｏｒ）ａｌｉｉが要求される用途においては、Ｈ− 鎖遺伝子を拡張し及び＠乳細胞内でグリコジル化された（に１ｙｃｏｓｙｌａｔ ｅｄ）抗体全体を発現する技術は既に存在する。
ここに徒示された考えは、抗体の同定及び評価におけるＭ要を点（ｂｏｔｔｌｅ 　ｎｅｃｋ）である０ＭＬ−の特異性（＋ｎｏｎｏ−ｓｏｅｃｉｆ　ｉｃｉ　ｔ ｙ）を臂しつつ、従来可能であったより、少なくとも３倍多いクローンをｉ築し スクリーンすることが可能になった。この方法の潜在的な用途は基礎研究及び応 用科学に及ぶ。
上記の記述は本発明の例として倉口されたものであり、本発明を制限するもので はない０本発明の真の精神及び範囲から逸脱せずに多くの変更及び改良ができる 。
＝ 浄吉（内容に変更なし） ＦＩＧＬＪＲＥ　４ 浄書（内容に変更なし） ／ＬＯ３ 浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、５−３ サブクラス　エエ　（Ｃ） サブクラス　エエエ　（Ｂ） ／Ｌ３１ ＧＴＣＣＧＧＣＡＧＣＴＣＣＡ Ｌ３４ ＧＴＣＣＧＧＣＡＧＣＴＣＣＡ Ｌ５０ 浄書（内容に変更なし） ＣＴＣＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＡＧＴｎＣＡＧＣＣＴＧＧＡＧＧＧ ＴＣＣＣＧＧＡＡＡＣＴＣＬＯ８ 雑 浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、　６Ａ−１ 式　発現ベクター シャイン・ダルガルノ　ＭＥＴ リーダー２列 ＡＡＡＴＡＣＣＴＡＴＴＧＣＣＴＡＣＧＧＣＡＧＣＣＧＣＴＴＴＴＡＴＧＧＡＴ ＡＡＣＧＧＡＴＧＣＣＧＴＣＧＧＣＧＡリーダー配列 ＧＧＡＴＴＧＴＴＡＴＴＡＣＴＣＧＣＴＧＣＣＣＡＡＣＣＡＧＣＣＴＡＡＣＡＡ ＴＡＡＴＧＡＧＣＧＡＣＧＧＧＴＴＧＧＴＣＦＩＧ、　６Ａ−２ 浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、　６Ｂ−１ ＶＬ　旦叱シ望二二 シャイン・ダルガルノ ＭＥＴ　リーダー配列 リーダー配列 ＦＩＧ、　６Ｂ−２ ＧＧＴＡＣＣＧＧＧＴＣＣＡＣＴＴＩ’ＧＡＣＦＩＧＬＪＲＥ　１２ ＦＩＧＵＲＥ　ｉ３ ＦＩＧＬＪＲＥ　１４ ＦＩＧＵＲＥ　１５ 浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、　１６ ［インヒビタ刊 ・　・　０ ・　・　６．７×１０°１２ ・　・　６．７×１０°１０ ６．７×１０°７ ６．７×１０°６ ６．７×１０°５ 吸収（４０５ｎｍ） 吸収（４０５ｎｍｌ ｕｐＦ Ｂ ｕｐＦ ＦＩＧＵＲＥ　１８ 平成　年　月　日

Claims (85)

    【特許請求の範囲】
  1. １．（ａ）（ｉ）保存された受容体をコードする遺伝子のレパートリーであって 、相補鎖とアニール化させた受容体コード鎖を各々含有する二本鎖核酸よりなる レパートリーの鎖を分離し、（ｉｉ）その各々が受容体コード鎖中の保存された 配列にハイブリッドできるヌクレオチド配列を有する第１のポリヌクレオチド合 成プライマー、及びその各々が相補鎖中の保存された配列にハイブリッドできる ヌクレオチド配列を有する第２のポリヌクレオチド合成プライマーであって、い ずれも該受容体コード遺伝子レパートリーからの複数の異なる受容体コードＤＮ Ａ相同体の増幅をプライムする（ｐｒｉｍｅ）ことができる該合成プライマーで 、上記分離された鎖を、ポリメラーゼ連鎖反応に適した条件下、処理して保存さ れた受容体コード遺伝子ライブラリーを生産することによって、複数の異なる受 容体コードＤＮＡ相同体を含有する保存された受容体コード遺伝子ライブラリー を合成することを特徴とする、保存された受容体をコードする核酸を生産する方 法。
  2. ２．保存された受容体コード核酸がＶＨをコードし、保存された受容体コード遺 伝子がＶＨコード遺伝子（ＶＨをコードする遺伝子）であり、受容体コードＤＮ Ａ相同体がＶＨコードＤＮＡ相同体である請求の範囲１の方法。
  3. ３．第１のポリヌクレオチド合成プライマーが免疫グロブリンＪＨまたはフレー ムワーク（ｆｒａｎｅｗｏｒｋ）領域のヌクレオチド配列にハイブリッドする請 求の範囲２の方法。
  4. ４．第２のポリヌクレオチド合成プライマーがＶＨ免疫グロブリン遺伝子のフレ ームワーク、リーダーまたはプロモーター領域にハイブリッドする請求の範囲２ の方法。
  5. ５．ＶＨコードライブラリーから、予め決めた特異性を有する受容体をコードす るＶＨコードＤＮＡ相同体をさらに分離する請求の範囲２の方法。
  6. ６．該分離が （ａ）複数の異なるＶＨコードＤＮＡ相同体の各々を発現ベクターに発現のため に作動し得るように結合し、それによって複数の異なるＶＨ発現ベクターを形成 し、（ｂ）該発現ベクターと和合性のある宿主細胞の集団を複数の該異なるＶＨ 発現ベクターで形質転換してそのメンバーがＶＨ発現ベクターを含有する形質転 換された宿主細胞集団を生産し、 （ｃ）形質転換された集団をＶＨコードＤＮＡ相同体によってコードされた受容 体を発現する条件下で培養し、（ｄ）形質転換された集団のメンバーを該予め選 択した配位子を結合することがてきる受容体の発現についてアッセイし、それに よってＶＨコードＤＮＡ相同体を含有する形質転換体を同定し、 （ｅ）工程（ｄ）の同定された形質転換体を集団から分離し、それによって保存 されたＶＨコード核酸を生産することよりなる請求の範囲５の方法。
  7. ７．単離された遺伝子が触媒作用性受容体をコードする請求の範囲５の方法。
  8. ８．宿主細胞がＶＬ分子を発現し、同定された形質転換体が予め選択された配位 子を結合するＦＶを発現する請求の範囲６の方法。
  9. ９．宿主細胞集団のすべてのメンバーが同じ予め選択されたＶＬを発現し、同定 された形質転換体が予め選択された配位子を結合するＦＶを発現する請求の範囲 ５の方法。
  10. １０．プライマーまたは発現ベクターによってコードされた予め選択されたエピ トープを受容体が含有する請求の範囲５の方法。
  11. １１．発現ベクターが選択し得るマーカー遺伝子から構成された、エピソーム、 ファージもしくはプラスミドである請求の範囲５の方法。
  12. １２．保存された受容体コード核酸がＶＬをコードし、保存された受容体コード 遺伝子がＶＬコード遺伝子であり、受容体コードＤＮＡ相同体がＶＬコードＤＮ Ａ相同体である請求の範囲１の方法。
  13. １３．ＶＬコードライブラリーから、予め選択したＶＨの結合親和性を調節でき るＶＬをコードするＶＬコードＤＮＡ相同体を分離することをさらに含む請求の 範囲１２の方法。
  14. １４．該分離が （ａ）生産されたＶＬコードＤＮＡ相同体の部分をベクターに発現のために作動 し得るように結合してＶＬ発現ベクターを生成させ、 （ｂ）予め選択した受容体を発現できる和合性のある宿主細胞の集団を複数のＶ Ｌ発現ベクターで形質転換し、（ｃ）ＶＬコードＤＮＡ相同体によってコードさ れたポリペプチドと予め選択したＦＶ生産性受容体の両方を発現する条件下で形 質転換集団を培養し、及び （ｄ）培養物から、ポリペプチドのみを結合する予め選択された配位子の受容体 とは異なる予め選択された受容体によって結合した配位子に対する結合親和性を 有するＦＶ生産する形質転換体を分離し、それによって保存されたＶＨコード核 酸を単離する ことよりなる請求の範囲１３の方法。
  15. １５．第１のポリヌクレオチド合成プライマーが免疫グロブリンＪＬもしくはフ レームワーク領域のヌクレオチド配列にハイブリッドする請求の範囲１２の方法 。
  16. １６．第２のポリペプチド合成プライマーがＶＬ免疫グロブリン遺伝子のフレー ムワーク、リーダーもしくはプロモーター領域にハイブリッドする請求の範囲１ ２の方法。
  17. １７．ＦＶが触媒作用を有する（ｃａｔａｌｙｔｉｃ）請求の範囲１２の方法。
  18. １８．合成が複数の異なる第１のプライマーを用いて行われる請求の範囲１の方 法。
  19. １９．合成が複数の異なる第２のプライマーを用いて行われる請求の範囲１の方 法。
  20. ２０．合成が複数の異なる第１のポリヌクレオチド合成プライマーと複数の異な る第２のポリヌクレオチド合成プライマーを用いて行われる請求の範囲１の方法 。
  21. ２１．工程（ａ）を複数回、各回保存された受容体をコードする遺伝子の異なる レパートリーを用いて行い、ついで各回生産された１以上の保存された受容体を コードする遺伝子ライブラリーを混合する請求の範囲１の方法。
  22. ２２．発現ベクター分子が線状ＤＮＡ発現ベクター分子である請求の範囲６の方 法。
  23. ２３．線状ＤＮＡ発現ベクター分子がファージベクター分子である請求の範囲２ ２の方法。
  24. ２４．ラムダファージベクター分子がラムダＺａｐＩＩＶＨ分子である請求の範 囲２３の方法。
  25. ２５．ＶＬをコードする遺伝子（ＶＬコード遺伝子）をファージベクター分子に 作動できるように結合することをさらに含む請求の範囲２３の方法。
  26. ２６．ＶＨコードＤＮＡ相同体及びＶＬコード遺伝子を２つのシストロンの（ｄ ｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）発現のための方向（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）において ファージベクター分子に作動できるように結合する請求の範囲２５の方法。
  27. ２７．触媒作用性受容体を生産する方法であって、（ａ）請求の範囲７に従って 単難した遺伝子を適当な発現ベクターに発現のために作動し得るように結合して ＶＨ発現ベクターを生成させ、 （ｂ）和合性ある宿主細胞を該発現ベクターで形質転換して形質転換体を生成さ せ、 （ｃ）ＶＨコードＤＮＡ相同体によってコードされた触媒作用性受容体を発現す るための条件下で形質転換体を培養して、培養物中に触媒作用性受容体を生成さ せ、及び（ｄ）培養物から触媒作用性受容体を回収することを特徴とする方法。
  28. ２８．生産された触媒作用性受容体の触媒活性を調節することができるＶＬを発 現するＶＬコード遺伝子であって、そこにおいては生産された触媒作用性受容体 が該受容体とＶＬより構成されるＦＶの部分として存在するＶＬコード遺伝子を 、宿主細胞が含有する請求の範囲２７の方法。
  29. ２９．単離された遺伝子とＶＬコード遺伝子を同じ発現ベクターに、発現のため に作動し得るように、結合する請求の範囲２８の方法。
  30. ３０．それぞれ第１及び第２の遺伝子からの第１及び第２のポリペプチドであっ て、予め決められた特異性のヘテロ二量体受容体を生成させることができる第１ 及び第２のポリペプチドを発現することができる単離された共発現ベクターを生 産する方法であって、 （ａ）複数の異なる第１のポリペプチドコードＤＮＡ相同体を含有する第１のポ リペプチドコード遺伝子ライブラリーを（ｉ）第１のポリペプチドコード遺伝子 のレパートリーであって、相補鎖とアニール化した第１のポリペプチドコード鎖 を各々含有する二本鎖核酸よりなるレパートリーの鎖を分離し、（ｉｉ）分離し た鎖を、ポリメラーゼ連鎖反応増幅に適した条件下に、第１の及び第２のポリヌ クレオチド合成プライマーで処理し、ここで第１のプライマーの各々は第１のポ リペプチドコード鎖中に保存された配列とハイブリッドできるヌクレオチド配列 を有し、第２のプライマーの各々は相補鎖中に保存された配列とハイブリッドで きるヌクレオチド配列を有し、これらのプライマーは第１のポリペプチドコード 遺伝子レパートリーから複数の異なる第１のポリパプチドコードＤＮＡ相同体の 増幅をプライムする（ｐｒｉｍｅ）ことができ、該処理は第１のポリペプチドコ ード遺伝子ライブラリーを生成する、ことによって合成し、 （ｂ）複数の異なる第２のポリペプチドコードＤＮＡ相同体を含有する第２のポ リペプチドコード遺伝子ライブラリーを（ｉ）第２のポリペプチドコード遺伝子 のレパートリーの鎖を分離し、ここで該レパートリーは第２の相補鎖にアニール 化した第２のポリペプチドコード鎖を各々含有する二本鎖核酸よりなり、 （ｉｉ）分離した鎖を、ポリメラーゼ連鎖反応増幅に適した条件下で、第３及び 第４のポリヌクレオチド合成プライマーで処理し、ここで第３のプライマーの各 々は第２のポリペプチドコード鎖中に保存された配列とハイブリッドできるヌク レオチド配列を有し、第４のプライマーの各々は第２の相補鎖中に保存された配 列に対応するヌクレオチド配列を有し、これらのプライマーは第２のポリペプチ ドコード遺伝子レパートリーからの複数の異なる第２のポリペプチドコードＤＮ Ａ相同体の増幅をプライムすることができ、該処理は第２のポリペプチドコード 遺伝子ライブラリーを生産する、ことによって合成し、 （ｃ）工程（ａ）（ｉｉ）及び（ｂ）（ｉｉ）の第１のポリペプチドー及び第２ のポリペプチドーコードＤＮＡ相同体に連結するために適合化させた発現ベクタ ー分子を、別異の複数の第１のポリペプチドコードＤＮＡ相同体及び別異の複数 の第２のポリペプチドコードＤＮＡ相同体と、ＤＮＡ連結に適した条件下で処理 して複数の異なる共発現ベクターを生産することによって別異の共発現ベクター のライブラリーを生成させ、ここで異なる共発現ベクターの各々は第１及び第２ のポリペプチドの組合せであって、地のいずれかの該異なる共発現ベクターによ って発現されるヘテロ二量体受容体分子を生放する第１及び第２のポリペプチド の組合せとは異なる組合せよりなるヘテロ二量体受容体分子を発現することがで き、及び（ｄ）別異の共発現ベクターライブラリーから予め決められた特異性の 抗体を発現できる共発現ベクターを分離することよりなる方法。
  31. ３１．該発現ベクター分子が線状ＤＮＡ発現ベクター分子である請求の範囲３０ の方法。
  32. ３２．線状ＤＮＡ発現ベクター分子がファージベクター分子である請求の範囲３ １の方法。
  33. ３３．第１のポリペプチドがＶＨである請求の範囲３０の方法。
  34. ３４．第２のポリペプチドがＶＬである請求の範囲３３の方法。
  35. ３５．予め決められた特異性のモノクローナル抗体を生産する方法であって、 （ａ）複数の異なるＶＨコードＤＮＡ相同体を含有するＶＨコード遺伝子ライブ ラリーを （ｉ）ＶＨ−コード遺伝子のレパートリーの鎖を分離し、ここで該レパートリー は相補鎖にアニール化したＶＨコード鎖を各々含有する二本鎖核酸よりなり、 （ｉｉ）分離した鎖を、ポリメラーゼ連鎖反応増幅に適した条件下に、第１及び 第２のポリヌクレオチド合成プライマーで処理し、ここで該第１のプライマーの 各々はＶＨコード鎖中に保存された配列とハイブリッドすることかできるヌクレ オチド配列を有し、第２のプライマーの各々は相補鎖中に保存された配列とハイ ブリッドすることができるヌクレオチド配列を有し、これらのプライマーはＶＨ コード遺伝子レパートリーからの複数の異なるＶＨ−コードＤＮＡ相同体の増幅 をプライムすることができ、該処理はＶＨ−コード遺伝子ライブラリーを生産す る、 ことによって合成し、 （ｂ）複数の異なるＶＬ−コードＤＮＡ相同体を含有するＶＬ−コード遺伝子ラ イブラリーを （ｉ）ＶＬ−コード遺伝子のレパートリーの鎖を分離し、ここで該レパートリー は相補鎖にアニール化したＶＬ−コード鎖を各々含有する二本鎖核酸よりなり、 （ｉｉ）分離した鎖を、ポリメラーゼ連鎖反応増幅に適した条件下、第３及び第 ４のポリヌクレオチド合成プライマーで処理し、ここで第３のプライマーの各々 はＶＬ−コード鎖中に保存された配列とハイブリッドできるヌクレオチド配列を 有し、第４のプライマーの各々は相補鎖中に保存された配列に対応するヌクレオ チド配列を有し、これらのプライマーはＶＬ−コード遺伝子レパートリーからの 複数の異なるＶＬ−コードＤＮＡ相同体の増幅をプライムでき、該処理はＶＬ− コード遺伝子ライブラリーを生産する、 ことによって合成し、 （ｃ）工程（ａ）（ｉｉ）及び（ｂ）（ｉｉ）のＶＨ−及びＶＬ−コードＢＮＡ 相同体に連結するために適合化させた発現ベクター分子を、ＤＮＡ連結に適した 条件下、異なる複数のＶＨ−コードＤＮＡ相同体及び異なる複数のＶＬ−コード ＤＮＡ相同体でそれぞれ処理して複数の異なる共発現ベクター（ｃｏ−ｅｘｐｒ ｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｓ）を生産することによって共発現ベクターの異なる ライブラリーを生成さセ、ここにおいて、異なる共発現ベクターの各々はＶＨ及 びＶＬポリペプチドの組合せであって、他のいずれかの該異なる共発現ベクター によって発現される抗体分子を生成させるＶＨ及びＶＬポリペプチドの組合せと は異なる組合せよりなる抗体分子を発現することができ、（ｄ）共発現ベクター と和合する宿主細胞の集団を複数の異なる共発現ベクターで形質転換して形質転 換された集団を生成させ、 （ｅ）形質転換された集団をＶＨ−及びＶＬ−コードＤＮＡ相同体によってコー ドされた抗体分子を発現するための条件下で培養し、 （ｆ）形質転換された集団のメンバーを予め定めた配位子を結合することができ る抗体分子の発現についてアッセイし、それによって該モノクローナル抗体を生 産できる形質転換体を同定し、及び （ｇ）工程（ｆ）の同定された形質転換体のモノクローナル培養物から培養によ って生産された抗体分子を回収し、それによってモノクローナル抗体を生産する 、 ことよりなる方法。
  36. ３６．モノクローナル抗体が触媒作用性である請求の範囲３５の方法。
  37. ３７．保存された受容体をコードする遺伝子ライブラリー（保存された受容体コ ード遺伝子ライブラリー）を生産する方法であって、 （ａ）複数の異なる保存された受容体コードＤＮＡ相同体を（ｉ）保存された受 容体コード遺伝子レパートリーを、該レパートリー内に保存されたヌクレオチド 配列とハイブリッドすることによって第１の反応を開始することができる第１の ポリヌクレオチド合成プライマーを用いて、第１のプライマー延長反応に付し、 それによって複数の異なる受容体コードＤＮＡ相同体相補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅ ｎｔｓ）を生産し、ついで該相補体を、該相補体中に保存されたヌクレオチド配 列とハイブリッドさせることによって第２の反応を開始させることができる第２ のポリヌクレオチド合成プライマーを用いて、第２のプライマー延長反応に付し 、それによって複数の異なる受容体コードＤＮＡ相同体を生産するカ、または （ｉｉ）保存された受容体コード遺伝子レパートリーの相補体を、相補体中に保 存されたヌクレオチド配列とハイブリッドさせることによって第３のプライマー 延長反応を開始させることができる第３のポリヌクレオチド合成プライマーを用 いて、第３のプライマー延長反応に付し、及び （ｂ）生産された複数の異なる受容体コードＤＮＡ相同体をベクターに、発現の ために作動し得るように、結合して複数の異なる受容体発現ベクターを生成させ る ことよりなる方法。
  38. ３８．第１、第２及び第３のポリヌクレオチド合成プライマーが予め決めた制限 エンドヌクレアーゼ認識部位をコードする請求の範囲３７の方法。
  39. ３９．受容体コード遺伝子がＶＨをコードする請求の範囲３７の法法。
  40. ４０．受容体コード遺伝子がＶＬをコードする請求の範囲３７の方法。
  41. ４１．請求の範囲３９の方法によって生産されたライブラリー。
  42. ４２．請求の範囲４０の方法によって生産されたライブラリー。
  43. ４３．第１のポリヌクレオチド合成プライマーがフレームワーク領域のヌクレオ チド配列とハイブリッドする請求の範囲３９または４０の方法。
  44. ４４．第１のポリヌクレオチド合成プライマーがフレームワーク３領域のヌクレ オチド配列とハイブリッドする請求の範囲３９の方法。
  45. ４５．第１のポリヌクレオチド合成プライマーがＪＨ領域のヌクレオチド配列と ハイブリッドする請求の範囲３９または４０の方法。
  46. ４６．第１のポリヌクレオチド合成プライマーがヒンジ領域のヌクレオチド配列 とハイブリッドする請求の範囲３９の方法。
  47. ４７．第１のポリヌクレオチド合成プライマーが不変部のヌクレオチド配列とハ イブリッドする請求の範囲３９または４０の方法。
  48. ４８．宿主細胞が複数の異なるＶＨ分子を発現し、同定された形質転換体が予め 選択された配位子を結合するＦａｂを発現する請求の範囲６の方法。
  49. ４９．少なくとも１０５の異なる保存された受容体コードＤＮＡ相同体であって その複数が保存されたヌクレオチド配列を共有する該ＤＮＡ相同体の単離された （ｉｓｏ１ａｔｅｄ）混合物よりなる遺伝子ライブラリー。
  50. ５０．該相同体を発現ベクターにそれぞれ作動し得るように結合させた請求の範 囲４９の遺伝子ライブラリー。
  51. ５１．該相同体がそれで形質転換した和合性宿主中に個々的に存在する請求の範 囲５０の遺伝子ライブラリー。
  52. ５２．少なくとも１０５の異なる共発現ベクターであって、その各々が、他のい ずれかの該異なる共発現ベクターによって発現されるヘテロ二量体受容体分子を 生成する第１及び第２のポリペプチドの組合せとは異なる、第１及び第２のポリ ペプチドの組合せよりなるヘテロ二量体受容体分子を発現することができる該共 発現ベクターよりなる遺伝子ライブラリー。
  53. ５３．共発現ベクターの各々が、線状ＤＮＡ発現ベクターに２つのシストロンの 発現（ｄｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）のために作動し得るよう に結合させた第１のポリペプチドー及び第２のポリペプチドーコードＤＮＡ相同 体よりなる請求の範囲５２の遺伝子ライブラリー。
  54. ５４．発現ベクターがラムタファージまたはその誘導体である請求の範囲５３の 遺伝子ライブラリー。
  55. ５５．第１及び第２のポリペプチドがそれぞれＶＨ及びＶＬポリペプチドである 請求の範囲５２の遺伝子ライブラリー。
  56. ５６．請求の範囲１の方法によって生産される受容体コード遺伝子ライブラリー 。
  57. ５７．請求の範囲２の方法によって生産される遺伝子ライブラリー。
  58. ５８．少なくとも１０５の異なる受容体コードＤＮＡ相同体であって、その各々 が、第１の長さの鎖の数の第１の長さ以外の長さを有する鎖の数に対する比が少 なくとも４：１であるＤＮＡ鎖の集団として存在する該相同体よりなる遺伝子ラ イブラリー。
  59. ５９．請求の範囲３７の方法によって生産される遺伝子ライブラリー。
  60. ６０．請求の範囲３８の方法によって生産される遺伝子ライブラリー。
  61. ６１．発現ベクター分子が線状ＤＮＡ発現ベクター分子である請求の範囲３７の 方法。
  62. ６２．線状ＤＮＡ発現ベクター分子がファージベクター分子である請求の範囲６ １の方法。
  63. ６３．細菌性発現ベクターラムダＺａｐＩＩＶＨ。
  64. ６４．細菌性発現ベクターラムダＺａｐＩＩＶＬ。
  65. ６５．請求の範囲３０の方法によって生産される新規共発現ベクター。
  66. ６６．請求の範囲３０の方法によって生産される複数の異なる共発現ベクターを 有する遺伝子ライブラリー。
  67. ６７．請求の範囲３５の方法によって生産される予め決めた特異性を有する新規 モノクローナル抗体。
  68. ６８．請求の範囲８のプロセスによって生産され、予め選択された配位子を結合 することができ、そこにおいてＶＨ及びＶＬコードＤＮＡ配列が異なる細胞から 起源する新規に単離されたＦＶ分子。
  69. ６９．請求の範囲１のプロセスによって生産され、予め選択された配位子を結合 することができる新規受容体。
  70. ７０．請求の範囲６のプロセスによって生産され、予め選択された配位子を結合 することができる新規受容体。
  71. ７１．請求の範囲３５のプロセスによって生産され、予め選択された配位子を結 合することができる新規ＦＶ分子。
  72. ７２．請求の範囲２７によって生産される形質転換された宿主細胞。
  73. ７３．請求の範囲１４の方法によって生産され、予め選択された受容体の結合親 和性を調節することができる新規ポリペプチド遺伝子。
  74. ７４．請求の範囲１４の方法によって生産され、予め選択された配位子を結合す ることができる新規ＦＶ分子。
  75. ７５．請求の範囲１４によって生産される形質転換された宿主細胞。
  76. ７６．請求の範囲２７の方法によって生産される新規触媒作用性受容体。
  77. ７７．線状二本鎖ＤＮＡベクターのＶＨ−及びＶＬ−コードＤＮＡ配列をランダ ムに結び付ける（ｂｒｉｎｇｔｏｇｅｔｈｅｒ）ための使用であって、そこにお いて該ベクターはプロモーターに作動し得るように結合したＶＨ−コードＤＮＡ 配列を有しまた該ベクターがＶＬ−コードＤＮＡ配列を有する線状２本鎖ＤＮＡ 配列に作動し得るように結合し得るように適合化させた部位を有する。
  78. ７８．線状二本鎖ＤＮＡベクターのＶＨ−及びＶＬ−コードＤＮＡ配列をランダ ムに結びつけるための使用であって、そこにおいて結ベクターはプロモーターに 作動し得るように結合したＶＬ−コードＤＮＡ配列を有しまた該ベクターがＶＨ −コードＤＮＡ配列を有する線状二本鎖ＤＮＡ配列に作動し得るように結合し得 るように適合化させた部位を有する。
  79. ７９．該部位がＶＨ−コードＤＮＡ配列を有するベクター中及びＶＬ−コードＤ ＮＡ配列を有する線状二本鎖ＤＮＡ配列中の両方に見い出され、また該ベクター 及び該線状二本鎖ＤＮＡ配列中に該ベクターがＶＬ−コードＤＮＡ配列及びＶＨ −コードＤＮＡ配列の共発現のために作動し得るように結合し得るように位置し ている請求の範囲７７の使用。
  80. ８０．該部位がＶＬ−コードＤＮＡ配列を有するベクター中及びＶＨ−コードＤ ＮＡ配列を有する線状二本鎖ＤＮＡ配列中の両方に見い出され、また該ベクター 及び線状二本鎖ＤＮＡ配列中に該ベクターがＶＬ−コードＤＮＡ配列及びＶＨ− コードＤＮＡ配列の共発現のために作動し得るように結合し得るように該ベクタ ー及び該線状二本鎖ＤＮＡ配列中に位置している請求の範囲７８の使用。
  81. ８１．ＶＨ−コードＤＮＡ配列ライブラリーから選択されるＶＨ−ＤＮＡコード 配列を含有する切断された線状二本鎖ＤＮＡ配列ベクターであって、そこにおい て該ベクターはＶＬ−コードＤＮＡ配列によりなる第２のＤＮＡ配列がそれに作 動し得るように結合し得るように切断されている。
  82. ８２．ＶＨ及びＶＬ遺伝子から、共にヘテロ二量体受容体を生成することができ るＶＨ及びＶＬポリペプチドをそれぞれ発現することができる共発現ベクターラ イブラリーを生産する方法であって、 （ａ）複数の異なるＶＨ−コードＤＮＡ相同体を含有するＶＨコード遺伝子ライ ブラリーを （ｉ）ＶＨコード遺伝子のレパートリーの鎖を分離し、ここにおいて該レパート リーは相補鎖にアニール化させたＶＨコード鎖をそれぞれ含有する二本鎖核酸よ りなり、（ｉｉ）分離した鎖を、ポリメラーゼ連鎖反応増幅に適した条件下、第 １及び第２のポリヌクレオチド合成プライマーで処理し、ここにおいて第１のプ ライマーの各々はＶＨ−コード鎖中に保存された配列とハイブリッドすることが できるヌクレオチド配列を有し、第２のプライマーの各々は相補鎖中に保存され た配列とハイブリッドすることができるヌクレオチド配列を有し、これらのプラ イマーはＶＨ−コード遺伝子レパートリーからの複数の異なるＶＨ−コードＤＮ Ａ相同体の増幅をプライムすることができ、該処理がＶＨ−コード遺伝子ライブ ラリーを生産する、 ことによって合成し、 （ｂ）複数の異なるＶＬ−コードＤＮＡ相同体を含有する第２のポリペプチドコ ード遺伝子ライブラリーを（ｉ）ＶＬ−コード遺伝子のレパートリーの鎖を分離 し、ここにおいて該レパートリーは第２の相補鎖にアニール化させたＶＬ−コー ド鎖を各々含有する二本鎖核酸よりなり、（ｉｉ）分離した鎖を、ポリメラーゼ 連鎖反応増幅に適した条件下、第３及び第４のポリヌクレオチド合成プライマー で処理し、第３のプライマーの各々はＶＬ−コード鎖中に保存された配列とハイ ブリッドすることができるヌクレオチド配列を有し、第４のプライマーの各々は 第２の相補鎖中に保存された配列に対応するヌクレオチド配列を有し、これらの プライマーは第２のＶＬ−コード遺伝子レパートリーからの複数の異なるＶＬ− コードＤＮＡ相同体の増幅をプライムすることができ、該処理は第２のポリペプ チドコード遺伝子ライブラリーを生産する、 ことによって合成し、 （ｃ）工程（ａ）（ｉｉ）及び（ｂ）（ｉｉ）のＶＨ−及びＶＬ−コードＤＮＡ 相同体への連結のために適合させた発現ベクター分子を、複数の異なる共発現ベ クターを生産するＤＮＡ連結に適した条件下、別個の複数のＶＨ−コードＤＮＡ 相同体及び別個の複数のＶＬポリペプチドコードＤＮＡ相同体でそれぞれ処理し て共発現ベクターの別個のライブラリーを生成させる、ことよりなる方法。
  83. ８３．異なる共発現ベクターの各々が、他のいずれかの異なる共発現ベクターに よって発現されるヘテロ二量体受容体分子を生成する第１及び第２のポリペプチ ドの組合せとは異なる、第１及び第２のポリペプチドの組合せよりなるヘテロ二 量体受容体分子を発現することができる請求の範囲８２の方法。
  84. ８４．請求の範囲８３の方法によって生産される共発現ベクターライブラリー。
  85. ８５．該発現ベクター分子がラムダファージから導かれ、ＶＨ−及びＶＬ−コー ドＤＮＡ相同体が該発現ベクター分子に、２つのシストロンの発現のために作動 し得るように結合している請求の範囲８４の共発現ライブラリー。
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