JPH04500759A - 核酸配列増幅法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 核酸配列増幅法 本出願は１９８９年７月１１日出願の出願番号第３７９５０１号の継続出願であ る。

発明の分野 本発明は、単独でまたは核酸のホモジーニアスまたはヘテロジーニアスな混合物 の大きなまたは小さな成分として存在し得る「標的配列」または特定の核酸配列 のコピー数を増加させる方法に関するものである。この核酸の混合物は、診断用 の検査、環境検査、学術研究、クローニングのような別の操作のための試薬また は材料の調製、またはその他の目的のために採取される試料中に見いだされるも のであり得る。

特定の核酸配列の選択的増幅は、特異性を維持し、様々な研究方法の感受性、簡 便性、正確さおよび信頼性を増し、かつ種々の目的のための特定のオリゴヌクレ オチドの十分な供給を可能にしつつ、診断上のおよび環境に関わる検定の感受性 を増すという点で貴重である。

本発明は、その実施の際の簡便性の故に、とりわけ環境および診断用検査におけ る使用に好適である。

発明の背景 特定の核酸配列の検出および／または定量は、微生物の同定および分類、感染症 の診断、遺伝的異常の発見および性格決定、癌に伴う遺伝子の変化の同定、遺伝 的易罹患性の研究、および種々の型の処置に対する応答の測定のためにますます 重要になりつつある技術である。さらにこのような方法は、食物、環境からの試 料、種、および特定の微生物の存在が監視される必要のあるその他の型の物質中 で微生物を検出および定量する際の使用へと用途が広がることがわかった。その 他、犯罪の容疑者の同定、父親捜しの論争の解決、家系図および系統発生樹の作 成、および様々な生命形態の分類を助けるために核酸配列の関連性の測定が用い られる、法医学、人類学、考古学および生物学における適用性が見いだされてい る。

特定の核酸配列の検出および定量のための一般的方法は核酸のハイブリダイゼー ションである。この方法は、相補的または本質的に相補的な配列を含む二本の核 酸鎖が適当な条件の下で特異的に結合して二本鎖構造を形成する能力に基づ（も のである。特定の核酸配列（「標的配列」として知られる）を検出および／また は定量するために、その標的配列に対し相補的な配列を含む標識オリゴヌクレオ チド（「プローブ」として知られる）を調製する。このプローブを、標的配列の 含有が疑われる試料と混合し、ハイブリッド形成のために適当な条件を作りだす 。試料中に標的配列が存在すれば、プローブは標的配列とハイブリダイズする。

次いでこのブローブー標的ハイブリッドを様々な手段のうちの一つを用いて一重 鎖ブローブから分離する。このハイブリッドに付随した標識の量を測定する。

核酸ハイブリダイゼーション検定の感度は、主としてプローブの特異活性、ハイ ブリダイゼーション反応の割合および程度、ハイブリッド形成および非ハイブリ ッド形成プローブの分離方法の挙動、および標識の検出される感度によって制限 を受ける。最良の条件下において上記のような直接ハイブリダイゼーション法は 約１ｘｌＯ５ないし１ｘｌＯ’の標的分子を検出することができる。最も鋭敏な 方法は、日常の臨床および環境検査に必要とされる速さ、簡便性、および経済性 というような多くの特徴を欠（場合がある。そのうえ、その感度は多くの望まし い適用に対して十分でないことがある。感染症は、血液または他の試料１０ｍ１ につきわずか１個の病原性微生物に伴って起こり得る。法医艦識官は犯罪現場か ら微量の組織しか得られないということもある。研究者は、生体の遺伝子材料中 または一群の細胞のメツセンジャーＲＮＡ群中に存在する全配列の中にごく小さ な断片として存在する特定の遺伝子配列を検出および／または定量する必要があ るかも知れない。

この型の検定の様々な構成因子および操作工程間の相互作用の結果として、感度 および特異性の間には殆ど常に逆の関係が存在する。

即ち、その検定の感度を高めるための工程（例えばプローブの特異活性を高める ）を取り入れた結果、偽陽性の試験結果の比率がより高くなり得る。感度および 特異性のつながりは、ハイブリダイゼーション検定の感度を高める上での重大な 障壁であった。この問題に対する一つの解決は、増幅方法を用いて標的配列の存 在量を特異的に増加させることである。試料の残りの配列にコードされている情 報のかなりの部分の増幅を必要とすることなくただ一個の標的配列部分を増幅す ることにより、感度が向上し、一方向時に特異性は低下しない。例えば長さ２５ 塩基の核酸配列は、この配列中の２５の位置の各々が４種の異なるヌクレオチド のうちの１個によって占められているため、４２５分の１または１０１５分の１ の確率で存在する可能性がある。

「ポリメラーゼ連鎖反応」またはｒＰＣＲＪと呼ばれる核酸配列の特異的増幅法 はミュリス等によって記載されている（米国特許第４６８３１９５号、４６８３ ２０２号および４８００１５９号ならびに欧州特許出願第８６３０２２９８．４ 号、８６３０２２９９２号および８７３００２０３．４号ならびにメソッズ・イ ン・エンザイモロジー第１５５巻、１９８７．３３５−３５０頁参照）。この方 法は、鋳型として相補的配列の各鎖を用いる、同時に起こるプライマー依存核酸 合成の反復サイクルを使用している。増幅される配列は、合成を開始させるプラ イマー分子の位置によって規定される。プライマーは標的配列またはその相補体 の３′末端部分に対して相補的であり、かつ核酸合成を開始させるためにはこの 部位と結合せねばならない。伸長産物の合成後、次の合成工程の前にこの鎖を通 常熱変性により分離する。ＰＣＲ法の場合、相補的配列の両方の鎖が合成される 。

ＰＣＲにおいてＰＣＲ反応の各サイクルの終わりに新たに合成される鎖を分離す るのに用いられる鎖の分離工程は、しばしば熱変性である。その結果、熱安定性 酵素が必要となるか、または熱変性工程とＤＮＡ合成の次のサイクルの開始の間 に新たな酵素が添加されねばならないかのいずれかとなる。幾つかの異なる且つ 極端な反応温度のサイクルを反復する必要があるということは、ＰＣＲ法の不利 な点である。ＰＣＲを簡便にするためには高価なプログラム可能な温度サイクル 機器が必要である。

ＰＣＲ反応に使用されるプライマーの１個にプロモーター配列を組み込み、次い で数サイクルのＰＣＲ法により増幅した後、この二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＲＮＡの 転写のための鋳型として使用することにより、ＰＣＲ法がＲＮＡ転写と組み合わ せられた（例えばムラカワ等、ＤＮＡ第７巻２８７−２９５頁（１９８８）参照 ）。

特定の核酸配列を増幅するその他の方法は、プライマーの使用によりプロモータ ー配列を含む中間体二本鎖ＤＮＡ分子を供給するための一連のブライマーハイブ リダイゼーション、伸長および変性工程を含む。この二本鎖ＤＮＡを標的配列の ＲＮＡコピーを多数生成させるのに使用する。得られたＲＮＡコピーをさらにコ ピーを生成させるための標的配列として使用し、多数のサイクルを実施すること ができる（例えばバーブ等、ＷＯ３９／１０５０およびジンジエラス等、ＷＯ３ ８／１０３１５参照）。

特定の配列の比較的大量のＤＮＡをインビトロで化学的に合成する方法は当業者 に良く知られており、この方法によるＤＮＡの生成は今や常套である。しかしな がらこれらの方法は時間がかかり、また長さ約１００塩基よりずっと大きなオリ ゴヌクレオチドの合成には容易に用いることができない。さらに、合成すべきＤ ＮＡの全塩基配列がわかっていなければならない。これらの方法は、一度にただ １種の配列しか合成できない高価な機器を必要とする。この機器の操作にはかな りの訓練と専門知識が必要である。ＲＮＡの化学合成法は開発がより困難であっ た。

核酸は、微生物の遺伝子材料中に特定の核酸配列をクローニングまたは挿入し、 その結果この微生物が複製を行なう時に挿入された配列が複製されることを含む 技術によって合成することができる。

適当なプロモーター配列の下流に隣接してこの配列が挿入されれば、この配列の ＲＮＡコピーまたはこの配列によりコードされる蛋白生成物が生成し得る。クロ ーニングは事実上無制限の量の特定の核酸配列を産み出せるが、含まれる操作の 数のため、これは診断用、環境、または法医学用の検査における使用には適して いない。クローニング技術の使用にはかなりの訓練と専門知識を要する。１個の 配列のクローニングには数人月またはそれ以上の労力が費やされ得る。

ＲＮＡ指向ポリメラーゼ、好ましくはＱβレプリカーゼの結合のための認識配列 を有する組み替え一本鎖ＲＮＡ分子を用いて、比較的大量の特定のＲＮＡを作る ことができる（例えばクレーマー等の米国特許第４７８６６００号参照）。特定 の配列を異なった分子のＤＮＡコピー中に挿入し、これを発現ベクターにクロー ニングし、それをＲＮＡに転写し、次いでＱβレプリカーゼをもって複製するた めに、多くの工程が必要である。

発明の要約 本発明は標的（ターゲット）核酸配列の多数のコピーを合成する新規な自勉（自 動触媒）的（即ち、温度、ｐＨ，またはイオン強度のような反応条件を修飾する 必要なしに、１つのサイクルの生成物を次のサイクルに使用して自動的に循環す ることができる）方法を目的とするものである。

本方法は、（ａ）オリゴヌクレオチド／標的配列複合体が作られＤＮＡ合成が開 始し得る条件下で、ＲＮＡ標的配列を、標的の３゛末端分に対してこれと複合体 を作るに十分相補的な複合体形成配列を有し、且つ所望によりＲＮＡポリメラー ゼのためのプロモーターを含むブライミング配列の５゛側配を有する、第一プラ イマーを含む第一のオリゴヌクレオチドで処理し、（ｂ）ＲＮＡ標的に対し相補 的な第一のＤＮＡプライマー伸長産物を与える鋳型として該標的を使用する伸長 反応において第一プライマーを伸長し、（Ｃ）ＲＮＡ標的を選択的に減成（分解 ）する酵素を用いてＤＮＡ伸長産物をＲＮＡ標的から分離し、（ｄ）ＤＮＡプラ イマー伸長産物を、プライマーまたはスプライスの鋳型を含み、そしてオリゴヌ クレオチド／標的配列複合体が作られＤＮＡ合成が開始し得る条件下でＤＮＡプ ライマー伸長産物の３°末端部分に対しこれと複合体を作るに十分相補的な複合 体形成配列を有する第二のオリゴヌクレオチドで処理しくただし、もし第一のオ リゴヌクレオチドがプロモーターを持たなければ、第二のオリゴヌクレオチドが ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターを含む複合体形成配列の５“側配列を 有するスプライスの鋳型である）、（ｅ）ＤＮＡ伸長反応において、第二のオリ ゴヌクレオチドまたは第一プライマー伸長産物のいずれかの３°末端を伸長して ＲＮＡポリメラーゼのための鋳型を生成し、そして（ｆ）この鋳型を用い、プロ モーター配列を認識するＲ　Ｎ　Ａポリメラーゼを使用して標的配列のＲＮＡコ ピーを多数生成させる、ことを含む。オリゴヌクレオチドおよびＲＮＡコピーは 、標的配列のコピーを多数口触的に合成するために使用できる。

本発明の一側面において、概括的方法は、（ａ）オリゴヌクレオチド／標的複合 体が作られＤＮＡ合成が開始し得る条件下で、ＲＮＡ標的配列を、標的の３°末 端部分に対してこれと複合体を作るに十分相補的な複合体形成配列を有し、且つ ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターを含む５°から複合体形成配列に至る 配列を有する、第一プライマーを含む第一のオリゴヌクレオチドで処理し、（ｂ ）鋳型として該標的を使用する伸長反応において第一プライマーを伸長して、Ｒ ＮＡ標的に対し相補的な第一のＤＮＡプライマー伸長産物を得、（ｃ）ＲＮＡ標 的を選択的に減成（分解）する酵素を用いて第一のＤＮＡプライマー伸長産物を ＲＮＡ標的から分離し、（ｄ）ＤＮＡプライマー伸長産物を、オリゴヌクレオチ ド／標的複合体が作られＤＮＡ合成が開始し得る条件下でＤＮＡプライマー伸長 産物の３°末端部分に対しこれと複合体を作るに十分相補的な複合体形成配列を 有する第ニプライマーで処理し、（ｅ）第二のＤＮＡプライマー伸長産物を与え るＤＮＡ伸長反応において第ニプライマーの３°末端を伸長し、これによりＲＮ Ａポリメラーゼのための鋳型を生成し、そして（ｆ）この鋳型を用いて、プロモ ーター配列を認識するＲＮＡポリメラーゼを使用して標的配列のＲＮＡコピーを 多数生成させる、ことを含む。オリゴヌクレオチドおよびＲＮＡコピーは標的配 列のコピーを多数口触的に合成するために使用することができる。この側面は、 さらに、（ｇ）工程（ｆ）からのＲＮＡコピーを、オリゴヌクレオチド／標的配 列複合体が生成しＤＮＡ合成が開始し得る条件下で、第ニプライマーによって処 理し、（ｈ）　ＲＮＡコピーを鋳型として用いるＤＮＡ伸長反応において第ニプ ライマーの３°末端を伸長して第二のＤＮＡプライマー伸長産物を得、（ｉ）Ｒ ＮＡコピーを選択的に減成する酵素を用いて第二のＤＮＡプライマー伸長産物を ＲＮＡコピーから分離し、（ｊ）第二のＤＮＡプライマー伸長産物を、オリゴヌ クレオチド／標的配列複合体が生成しＤＮＡ合成が開始し得る条件下で、第一プ ライマーによって処理し、（ｋ）ＤＮＡ伸長反応において第ニプライマー伸長産 物の３°末端を伸長してＲＮＡポリメラーゼのための鋳型を生成し、そして、（ １）工程（ｋ）の鋳型を用い、プロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼを使 用して標的配列のコピーを多数生成させる、ことを含む。工程（１）、工程（ｇ ）ないしくｋ）のＲＮＡコピーの使用は口触的に反復されて標的配列のコピーを 多数合成する。工程（ｋ）においてスプライスの鋳型として挙動する第一プライ マーもまた工程（ｋ）のＤＮＡ伸長反応において伸長され得る。

本発明に係る概括的方法のもう１つの側面は、（ａ）オリゴヌクレオチド／標的 配列複合体が作られＤＮＡ合成が開始し得る条件下で、ＲＮＡ標的配列を、標的 配列の３°末端部分に対してこれと複合体を作るに十分相補的な複合体形成配列 を有する第一プライマーで処理し、（ｂ）鋳型として該標的を使用する伸長反応 においてプライマーの３′末端を伸長して、ＲＮＡ標的に対し相補的なりＮＡプ ライマー伸長産物を得、（ｃ）ＲＮＡ標的を選択的に減成する酵素を用いてＤＮ Ａ伸長産物をＲＮＡ標的から分離し、（ｄ）オリゴヌクレオチド／標的配列複合 体が作られＤＮＡ合成が開始し得る条件下で、ＤＮＡプライマー伸長産物を、プ ライマー伸長産物の３゜末端に対しこれと複合体を作るに十分相補的な複合体形 成配列、およびＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターを含む５′から複合体 形成配列に至る配列、を有するスプライスの鋳型を含む第二のオリゴヌクレオチ ドで処理し、（ｅ）ＤＮＡプライマー伸長産物の３°末端を伸長してこれにプロ モーターに対し相補的な配列を加え、それによりＲＮＡポリメラーゼのための鋳 型を生成し、（ｆ）この鋳型を用い、プロモーター配列を認識するＲＮＡポリメ ラーゼを使用して標的配列のＲＮＡコピーを多数生成させ、そして、（ｇ）工程 （ｆ）のＲＮＡコピーを用いて工程（ａ）ないしくｆ）を口触的に反復させて標 的配列を増幅する、ことからなる方法を提供する。

所望により、工程（ｄ）のスプライスの鋳型をプライマーとしても機能させ、こ れを工程（ｅ）において第一のプライマー伸長産物を鋳型として使用して伸長し 、第ニプライマー伸長産物を得ることもできる。

さらに、本発明の別の側面において、増幅させたい配列がＤＮＡとして存在する 場合、適当な「予備操作」を使用するとＲＮＡコピーが生成し、次いでこれを本 発明の「概括的方法」に従って増幅することができる。

したがって別の側面においては本発明は、増幅すべき存在するコピーの数を増加 させるばかりでなく、増幅のためのＤ　Ｎ　Ａ配列のＲＮＡコピーを提供し得る 、本発明の増幅方法に関連して使用するための「予備操作」を目的とするもので ある。

本発明は、試料中の特定の標的核酸配列のコピー数を増加させる方法を目的とす るものである。１つの側面において本発明は、それ自身追加の生成物の生成に使 用されることができ、その結果、例えば温度循環のような反応条件の操作を必要 とせずに自勉的反応を引き起こす生成物を産生ずる酵素的ハイブリッド−分離工 程を伴う、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば逆転写酵素）およびＤＮＡ依存ＲＮＡポ リメラーゼ（転写酵素）の共同作用を含む。「予備操作」を含む本発明方法の幾 つかの態様においては、「予備操作」の最初の工程を除く全ての工程を１種類の 温度で実施する。

本発明方法は、臨床上の、環境の、法医学用の、および類似の試料における特定 の核酸標的配列を検出および／または定量する検定の構成因子として、または、 様々な使用のための特定の標的配列のＤＮＡおよび／またはＲＮＡのコピーを多 数生成させるために使用できる。さらにこれらの方法は、クローニングのための ＤＮＡ標的配列のＤＮＡコピーを多数生成させるため、またはプローブを産み出 すため、または配列決定のためのＲＮＡおよびＤＮＡコピーを生成させるために も使用できる。

典型的な検定の一例の場合、増幅すべき試料を、緩衝液、塩、マグネシウム、ヌ クレオチド三燐酸、プライマーおよび／またはスプライスの鋳型、ジチオトレイ トール、およびスペルミジンを含有する緩衝液濃縮物と混合する。次いで所望に よりこの反応物を１００℃付近で２分間インキュベートして二次構造を変性させ る。室温まで冷却した後、もし標的が、確定した３′末端の無いＤＮＡ標的なら ば、逆転写酵素を加え反応混合物を４２℃で１２分間インキュベートする。反応 物を、今回はプライマー伸長産物をＤＮＡ鋳型から分離するために、再度１００ ℃付近で変性させる。冷却後、逆転写酵素、ＲＮＡポリメラーゼ、およびＲＮア ーゼＨを加え、反応物を３７℃で２ないし４時間インキュベートする。次いで、 生成物を変性させ、プローブ溶液を加え、６０℃で２０分間インキュベートし、 ハイブリダイズしていないプローブを選択的に加水分解する溶液を加え、反応物 を６０℃で６分間インキュベートし、そして残留する化学ルミネセンスをルミノ メータ−で測定することにより、この反応物を検定することができる（例えばア ーノルド等、ＰＣＴ　ＵＳ８８１０２７４６号（１９８８年９月２１日出願、１ ９８９年３月２９日公告）参照。この内容は引用して本明細書の一部とし、［Ｈ ＰＡＪと呼称する）。本発明方法の生成物は当業者に知られる他の多（の検定系 で使用することができる。

もし標的が確定した３゛末端を有する、または標的がＲＮＡであるならば、典型 的な検定は、標的を前記の緩衝液濃縮物と混合し、二次構造を変性させることを 含む。冷却後、逆転写酵素、ＲＮＡポリメラーゼ、およびＲＮアーゼＨを加え、 この混合物を３７℃で２ないし４時間インキュベートする。次いで反応物を前記 のごとく検定し得る。

本発明方法およびこの中で用いられる材料は、診断操作における使用のための診 断キットの一部として組み入れることができる。

定義 本明細書中使用される以下の語は、特に別途記載のない限り以下の意義を有する 。

１、鋳型 「鋳型」は、核酸ポリメラーゼにより複製される核酸分子である。

鋳型はそのポリメラーゼにより、−重鎖、二本鎖または部分的二本鎖であり得る 。合成されたコピーは鋳型に対し、または二本鎖もしくは部分的二本鎖の鋳型の 少なくとも一本の鎖に対し相補的である。

ＲＮＡおよびＤＮＡの両者は常に５゛から３°の方向へと合成され、二本鎖核酸 の二本の鎮は常に二本の鎖の５°末端がその二本鎖の反対の端にあるように並ん でいる（そしてその場合必然的に３゛末端もまた同様である）。

２、プライマー、スプライスの鋳型 「プライマー」は、鋳型と複合体を形成（水素結合またはハイブリダイゼーショ ンによる）してＤＮＡポリメラーゼによる合成の開始のためのプライマー／鋳型 複合体を与える、鋳型に対し相補的なオリゴヌクレオチドであって、これはＤＮ Ａ合成の過程で、鋳型に対し相補的な３゛末端に連なった共有結合により結合し た塩基の添加により、伸長する。この結果がプライマー伸長産物である。事実上 、既知の全てのＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素を含む）はＤＮＡ合成の開始の ためにオリゴヌクレオチドの一本鎖鋳型への結合（ブライミング）を必要とする が、これに対してＲＮＡの複製および転写（ＤＮＡからＲＮＡの複製）は一般に プライマーを必要としない。

適当な状況下ではプライマーがスプライスの鋳型としても働き得る（以下の「ス プライスの鋳型」の定義を参照されたい）。

「スプライスの鋳型」は−末鎖の核酸と複合体を作るオリゴヌクレオチドであっ て、特定の配列を付加するために標的核酸の３°末端を伸長する鋳型として使用 される。スプライスの鋳型は標的核酸分子の３°末端に対し十分相補的であり、 この３゛末端はスプライスの鋳型と複合体を作らせるために伸長させる。次いで ＤＮＡ−またはＲＮＡ−依存ＤＮＡポリメラーゼを使用して、スプライスの鋳型 の５°から相補領域に至る配列を鋳型として用いて標的核酸分子を伸長する。伸 長した分子の伸長産物は、スプライスの鋳型の５°末端の配列に相補的な特異的 配列を３゛末端に有する。

もしスプライスの鋳型の３°末端がブロックされておらず、且つ標的核酸に対し 相補的であれば、これはプライマーとしても働き、鋳型として標的核酸分子を用 いてＤＮＡポリメラーゼにより伸長される。スプライスの鋳型の３゛末端は、３ ′末端のジデオキシヌクレオチドの存在または標的に対し非相補的３′末端配列 の存在を含む種々の形で、または当業者に知られるその他の形でブロックできる 。

プライマーまたはスプライスの鋳型のいずれかが一本鎖の核酸と複合体を形成し 、ＤＮＡポリメラーゼのためのブライミング機能を果たすことができる。

３、標的核酸、標的配列 「標的核酸」は増幅されるべき「標的配列」を有し、−末鎖または二本鎖のいず れかであることができ、標的配列の外に増幅されるべきでない他の配列を含むこ とがある。

「標的配列」という語は増幅されるべき標的核酸の特定のヌクレオチド配列を意 味する。「標的配列」は、本発明の工程の最中にオリゴヌクレオチド（プライマ ーおよび／またはスプライスの鋳型）が複合体を形成する複合体形成配列を含む 。標的核酸が本来−末鎖である場合、「標的配列」という語は標的核酸中に存在 する「標的配列」に相補的な配列をも意味することになろう。「標的核酸」が本 来二本鎖である場合、「標的配列」という語は（＋）および（−）鎖の両者を意 味する。

４、プロモーター／プロモーター配列 「プロモーター配列」は、その核酸に結合し、特定の位置でＲＮＡの転写を開始 させる信号としてＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ（転写酵素）により認識される 特定の核酸配列である。結合のためには、このような転写酵素は一般にプロモー ター配列およびその相補体を含む部分において二本鎖であるＤＮＡが必要であり 、鋳型部分（転写されるべき配列）は二本鎖である必要がない。個々のＤＮＡ依 存ＲＮＡポリメラーゼは、転写を進める効率の点で著しく異なる様々な異なった プロモーター配列を認識する。ＲＮＡポリメラーゼが転写を開始するためにプロ モーター配列に結合するとき、そのプロモーター配列は転写される配列の一部で はない。したがってこれにより生成するＲＮＡ転写物は、その配列を含まないで あろう。

５、ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ ｒＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ」は、ＤＮＡ鋳型から相補的ＤＮＡコピーを合 成する酵素である。例として大腸菌由来のＤＮＡポリメラーゼ■およびバクテリ オファージＴ７　ＤＮＡポリメラーゼがある。既知のＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラ ーゼはすべて合成の開始に相補的プライマーを必要とする。適当な条件下ではＤ ＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼがＲＮＡ鋳型から相補的ＤＮＡコピーを合成できる ことが知られている。

５、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ（転写酵素）ｒＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラー ゼ」または「転写酵素」は、プロモーター配列（通常二本鎖）を有する二本鎖ま たは部分的二本鎖のＤＮＡ分子から多数のＲＮＡコピーを合成する酵素である。

このＲＮＡ分子（「転写物」）はプロモーターのすぐ下流の特定の位置から始ま って５゛→３°の方向へ合成される。転写酵素の例には大腸菌およびバクテリオ ファージＴ７、Ｔ３、およびＳＰ６由来のＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼがある 。

７、ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）ｒＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラ ーゼ」または「逆転写酵素」はＲＮＡ鋳型から相補的ＤＮＡコピーを合成する酵 素である。知られている全ての逆転写酵素はＤＮＡ鋳型から相補的ＤＮＡコピー を作り出す能力をも有する。したがってこれらはＲＮＡ−およびＤＮＡ−依存性 のＤＮＡポリメラーゼである。合成を開始するためにはＲＮＡおよびＤＮＡ鋳型 の両者にプライマーが必要である。

８、ＲＮアーゼＨ ｒＲＮアーゼＨ」はＲＮＡ　：　ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ部分を減成させる酵素で ある。ＲＮアーゼＨはエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼであり得る 。殆どの逆転写酵素は普通それらのポリメラーゼ活性に加えてＲＮアーゼＨ活性 を有する。しかし、付随するポリメラーゼ活性のないＲＮアーゼＨの他の供給源 も利用できる。

減成の結果ＲＮＡ：　ＤＮＡ複合体からＲＮＡが分離し得る。これとは別にＲＮ アーゼＨはＲＮＡ部分が融解または酵素にＲＮＡ部分の巻戻しをさせるように、 様々な位置で単にＲＮＡを切断することもできる。

９、プラス／マイナス鎖 核酸合成の議論は、核酸二本鎖の二本の相補的鎖を命名する語を採用することに より著しく単純化且つ明確化する。伝統的に、蛋白または構造的ＲＮＡを生成す るために使用される配列をコードする鎖は「プラス」鎖、そしてその相補体は「 マイナス」鎖と称した。

現在では、多くの場合両方の鎖が機能的であり、よって一方を「プラス」とし他 方を「マイナス」とする命名の割り振りは任意であることがわかっている。にも かかわらずこの語は核酸の配列の方向を指定するのに非常に有用であるので、本 明細書においてこの目的のためにこれを用いる。

１０、ハイブリダイズ、／％イブリダイゼーション「ハイブリダイズ」および「 ハイブリダイゼーション」という語は、ワトソン・クリックの塩基対形成により 複合体を形成するに十分相補的なヌクレオチド配列間の複合体形成を意味する。

プライマー（またはスプライスの鋳型）が標的（鋳型）と「ハイブリダイズ」す る時、このような複合体（または）１イブ１ルソド）はＤＮＡポリメラーゼがＤ ＮＡ合成を開始するのに要するブライミング機能を果たすのに十分安定である。

１１、プライマー配列 本明細書中で言及するプライマーの配列を以下に開示する。

ＨＢＶ領域２プライマー （＋）：５°ＣＡＣＣＡＡＡＴＧＣＣＣＣＴ＾丁ＣＴＴＡＴＣＡＡＣＡＣＴＴＣ ＣＧＧ３’（−）：５°ＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡ ＧＡＣＣＣＧＡＧＡＴＴＧＡＧＡＴＣＴＴＣＴＧＣＧＡＣ３’ プローブ （す：　５’ＧＧＴＣＣＣＣＴＡＧ＾＾ＧＡＡＧＡＡＣＴＣＣＣＴＣＧ３’ＨＩ Ｖ領域１プライマー （す：　５°ＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣＡＡ ＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＣＴＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣ３゜ （−）：５°ＧＴＣＴＡＡＣＣＡＧＡＧＡＧＡＣＣＣＡＧＴＡＣＡＧＧＣ３’プ ロ一ブ配列： ５’　ＧＣＡＧＣＴＧＣＴＴＡＴＡＴＧＣＡＧＧＡＴＣＴＧＡＧＧＧ３′ＨＩＶ 領域２プライマー （＋）　：　５’　ＡＡＴＴＴ＾＾ＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡ ＣＡＡＡＴＧＧＣＡＧＴＡＴＴＣＡＴＣＣＡＣＡ３’ （−）：　５’ＣＣＣＴ丁ＣＡＣＣＴＴＴＣＣＡＧＡＧ３’プローブ配列： （−）：　５”ＣＴＡＣＴＡＴＴＣＴＴＴＣＣＣＣＴＧＣＡＣＴＧＴＡＣＣＣＣ ３’ＨＩＶ領域３プライマー （＋）＋　５’ＣＴＣＧＡＣＧＣＡＧＧＡＣＴＣＧＧＣＴＴＧＣＴＧ３゜（−） ：５°ＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣＴＣＣＣＣ ＣＧＣＴＴＡＡＴＡＣＴＧＡＣＧＣＴ３’ プローブ： （＋）：　５’ＧＡＣＴＡＧＣＧＧＡＧＧＣＴＡＧＡＡＧＧＡＧＡＧＡＧＡＴＧ ＧＧ３゜ＨＩＶ領域４プライマー （＋）：５“＾ＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＧＡＣ ＣＡＴＣＡＡＴＧＡＧＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＴＧ３“ （−）　：　５’ＣＣＡＴＣＣＴＡＴＴＴＧＴＴＣＣＴＧＡＡＧＧＧＴＡＣ３’ プローブ： （−）　：　５’　ＣＴＴＣＣＣＣＴＴＧＧＴＴＣＴＣＴＣＡＴＣＴＧＧＣＣ３ ゜ＨＩＶ領域５プライマー （す：　５’ＧＧＣＡＡＡＴＧＧＴＡＣＡＴＣＡＧＧＣＣＡＴＡＴＣＡＣＣＴＡ Ｇ３′（−）：５°＾ＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡ ＧＧＧＧＴＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＧＡＴＡＡＴＧＣＴＧ３゜ プローブ： ５’　ＧＡＡＧＧＣＴＴＴＣＡＧＣＣＣＡＧＡＡＧＴＡＡＴＡＣＣＣＡＴＧ３゜ ＢＣＬ−２染色体転移主要ブレイクポイントｔ（１４；１８）プライマー （−）：５°ＧＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣＣＴ ＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣ３゜（＋）＋５°ＴＡＴＧＧＴＧＧＴＴＴＧＡ ＣＣＴＴＴＡＧ３’ＣＭＬ　染色体転移ｔ　（９：　２２）プライマー（−）： 　５’ＧＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣＴＣＡＧＡ ＣＣＣＴＧＡＧＧＣＴＣＡＡＡＧＴＣ３゜（＋）：５°ＧＧＡＧＣＴＧＣＡＧＡ ＴＧＣＴＧＡＣＣＡＡＣ３’プローブ： ５°ＧＣＡＧＡＧＴＴＣＡＡＡＡＧＣＣＣＴＴＣＡＧＣＧＧ３’１２、特異性 核酸配列の特性であって、これは配列および検定条件により標的および非標的配 列を識別する能力を意味する。

図面の簡単な説明 ど 第１Ａないし１０図は本発明の概括的方法を表わす。

第２Ａないし２Ｅ図は、予備操作Ｉと称される本発明の態様を表わす。

第３図は、予備操作ＩＩと称される本発明の態様を表わす。

第４Ａないし４Ｄ図は改良増幅法を表わす。

第５図は、ＡＭＶおよびＭＭＬＶおよび大腸菌由来のＲＮアーゼＨが特異的ＲＮ Ａ開裂サイトを有するという仮説を確認する実験の結果を示す。

第６図は、増幅中の５ａｐ−標識プライマーの取り込みの結果を示す。

発明の詳細な説明 本発明によれば、特定の核酸標的配列の検出および／または定量用の検定におけ る使用のため、または様々な用途の特定の標的配列のＤＮＡおよび／またはＲＮ Ａの多数のコピーを生成するための、特定の核酸標的配列の増幅のための新規な 方法および組成物が提供される。

■、概括的方法 好ましい側面において、本発明はＲＮＡ標的配列のＤＮＡおよびＲＮＡコピーを 多数合成する自勉的増幅方法を提供する。標的核酸は、増幅されるべき標的配列 を含む。標的配列は、どちらかの端がプライマー、スプライスの鋳型、および／ または天然の標的核酸の末端によって規定される標的核酸の領域であって、（＋ ）および（−）の両鏡を含む。

ある側面においてこの方法は、オリゴヌクレオチド／標的配列複合体が作られＤ ＮＡ合成が開始し得る条件下で、ＲＮＡ標的配列を含む標的核酸を、標的配列の ３°末端部分に対してこれと複合体を作るに十分相補的な複合体形成配列を有し 、且つ所望によりＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーター配列を含む５°から 複合体形成配列に至る配列を有する、第一プライマーを含む第一のオリゴヌクレ オチドで処理する事からなる。第一のオリゴヌクレオチドブライマーは、５°か らブライミング配列に至る他の配列を有することもある。第一プライマーの３° 末端は適当なりＮＡポリメラーゼによリ、ＲＮＡを鋳型として用いる伸長反応に おいて伸長され、ＲＮＡ鋳型に対し相補的な第一のＤＮＡプライマー伸長産物が 得られる。

この第一プライマー伸長産物を、ＲＮＡ鋳型を選択的に減成させる酵素を用いて ＲＮＡ鋳型から分離（少な（とも部分的に）する。好適な酵素はＲＮＡ−ＤＮＡ 複合体のＲＮＡ鏑に選択的に働く酵素であって、ＲＮＮアーゼを含む酵素を包含 する。幾つかの逆転写酵素はＲＮＮアーゼ活性を含むが、大腸菌ＲＮアーゼＨの ような外性のＲＮＮアーゼを添加するのが好ましい。

オリゴヌクレオチド／標的配列複合体が作られＤＮＡ合成が開始し得る条件下で 、−重鎖の第一プライマー伸長産物を、第一プライマー伸長産物中に含まれる標 的配列の３゛末端部分に対しこれと複合体を作るに十分相補的な複合体形成配列 を有する第ニプライマーまたはスプライスの鋳型を含む第二のオリゴヌクレオチ ドで処理する。第一プライマーがプロモーターを持たないときは、第二のオリゴ ヌクレオチドが、ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターを含む５°から複合 体形成領域の配列を有するスプライスの鋳型である。

所望によりこのスプライスの鋳型はその３゛末端においてブロックされ得る。第 二のオリゴヌクレオチドおよび／またはプライマー伸長産物の３“末端はＤ　Ｎ 　、Ａ伸長反応において伸長してＲＮＡポリメラーゼのための鋳型を生成する。

作られたＲＮＡコピーまたは転写物は、さらに操作をすることなく自動的に増幅 できる。

オリゴヌクレオチドがスプライスの鋳型として機能する場合、そのプライマー機 能は必要ない。したがって、このスプライスの鋳型の３′末端はブロックされて いてもいなくてもよい。得られる反応混合物の構成因子（即ち、確定した３°末 端を有する第一プライマー伸長産物を生成させるＲＮＡ標的、第一プライマー、 およびブロックされたまたはブロックされていないスプライスの鋳型）は大量の ＲＮＡおよびＤＮＡを自動的に合成するよう機能する。

本発明の一側面において、第一および第二のオリゴマーは共にプライマーである 。第一プライマーはＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターを含む５゛から複 合体形成配列に至る配列を有し、また他の配列をも含み得る。第ニプライマーも またＲＮＡポリメラーゼのだめのプロモーターを含み得る５°から複合体形成配 列に至る配列を含み、所望により他の配列を含む。両方のプライマーがプロモー ター配列を有する場合、クローニングのような他の目的のための第二のプロモー ターを導入する意図でない限り、両方の配列が同じＲＮＡポリメラーゼにより認 識されるのが好ましい。第ニプライマーの３゛端は、適当なりＮＡポリメラーゼ により伸長反応において伸長され、第一プライマー伸長産物に対し相補的な第二 のＤＮＡプライマー伸長産物を生成する。第一プライマーが標的配列の一方の端 を規定し、第ニプライマーはここで多端を規定することに留意されたい。第二の 伸長反応の二本鎖生成物は、ＲＮ　ＡポリメラーゼによるＲＮＡの生成のための 好適な鋳型である。もし第ニプライマーもまたプロモーター配列を有するときは 、二本鎖鋳型の両方の鎖に相補的な転写物が口触反応中に生成するであろう。こ の時点でＲＮＡ転写物は標的核酸とは異なる末端を持ち、しかしながら第一プラ イマーと第ニプライマーの間の配列は損なわれずに残っている。こうして生成し たＲＮＡ転写物は、さらに操作を行なうことなく上の系を自動的に再循環させる ことができる。したがってこの反応は自動的である。

もし第ニプライマーの複合体形成配列が第一プライマー伸長産物の３゛末端と複 合体を作るならば、第ニプライマーはスプライスの鋳型として働き、第一プライ マー伸長産物は伸長して５゛がらブライミング配列に至る第ニプライマーの任意 の配列を第一プライマー伸長産物に付加することができる。（例えば第１Ｅおよ び１６図参照）もし第ニプライマーがスプライスの鋳型として働き、且っ５゛か ら複合体形成配列に至るプロモーター配列を含むならば、プロモーター配列を付 加する第一プライマー伸長産物の伸長はＲＮＡポリメラーゼのためのさらなる鋳 型を産み、これが転写されていずれかの鎖のＲＮＡコピーを生成することができ る。（第１Ｅおよび１６図参照）両方のプライマーにプロモーターが含まれてい ることにより、合成される標的配列のコピー数が増加する。

本発明の概括的方法のもう一つの側面は、プライマーを含む第一のオリゴヌクレ オチド、およびスプライスの鋳型を含みそれ自身プライマーとして働くことので きるまたはできない（プライマー伸長反応においてそれ自体が伸長しないという 点において）第二のオリゴヌクレオチドの使用を含む。この概括的方法の側面は 、オリゴヌクレオチド／標的配列複合体が作られＤＮＡ合成が開始し得る条件下 で、ＲＮＡ標的配列を含む標的核酸を、標的配列の３゛末端部分に対してこれと 複合体を形成するに十分相補的な複合体形成配列を有する第一のオリゴヌクレオ チドブライマーで処理することからなる。この第一プライマーは、プロモーター を含む５°から複合体形成配列に至る他の配列を有していてもよい。第一プライ マーの３゛端を、適当なりＮＡポリメラーゼにより、ＲＮＡを鋳型とする伸長反 応で伸長して、このＲＮＡ鋳型に対し相補的な第一プライマー伸長産物を得る。

第一プライマー伸長産物を、ＲＮＡ鋳型を選択的に減成させる酵素を用いてＲＮ Ａ鋳型から分離する。好適な酵素はＲＮＡ−ＤＮＡ複合体のＲＮＡ鎖に選択的に 働くものであって、ＲＮＮアーゼ活性を含む酵素を包含する。幾つかの逆転写酵 素はＲＮＮアーゼ活性を含むが、大腸菌ＲＮアーゼＨのような外性のＲＮＮアー ゼを添加するのが好ましい。オリゴヌクレオチド／標的配列複合体が作られＤＮ Ａ合成が開始し得る条件下で、−重鎖の第一プライマー伸長産物を、プライマー 伸長産物の３゛末端部分に対しこれと複合体を作るに十分相補的な複合体形成配 列、およびＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターを含む５゛から複合体形成 配列に至る配列、を有するスプライスの鋳型で処理する。スプライスの鋳型の３ ′末端は、ブロックされている（例えばジデオキシヌクレオチドの添加により） か、または標的核酸に対し非相補的である（その結果これはプライマーとして機 能しない）か、または別法によりブロックされていないか、のいずれかである。

第一プライマー伸長産物の３′末端は適当なりＮＡポリメラーゼを用いてＤＮＡ 伸長反応において伸長され、第一プライマー伸長産物の３′末端にプロモーター を含む５°から複合体形成配列に至るスプライスの鋳型の配列に対し相補的な配 列が付加される。もし３゛末端がブロックされていなければ、スプライスの鋳型 が伸長して第一プライマー伸長産物に対して相補的な第ニプライマー伸長産物が 得られる。スプライスの鋳型を伴う伸長反応の生成物（ブロックされていようと なかろうと）は、プロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼを用いるＲＮＡ合 成のための鋳型として機能することができる。上に述べたように、このように生 成したＲＮＡ転写物はさらに操作を行なうことなく自動的に前記の系を再循環さ せることができる。即ちこの反応は口触的である。

幾つかの態様においては、増幅すべき標的配列は、使用するプライマー（または スプライスの鋳型）に対して相補的な特定の配列の位置によって両端が規定され る。他の態様においては、標的配列は、使用するプライマー分子に対し相補的な 特定の配列の位置が一個、そして特異的制限エンドヌクレアーゼにより、または 他の適当な手段により切断される、天然３°末端を含み得る特定の配列の位置に より、反対の端が規定される。他の態様においては、標的配列は、１またはそれ 以上の特異的制限エンドヌクレアーゼにより切断される特定の配列の位置により 、両端が規定される。

本発明の好ましい態様においては、ＲＮＡ標的配列を決定し、次いでＲＮＮアー ゼの減成がどこで二本鎖からＲＮＡ部分の切断または除去を起こすのかを決定す る。ＡＭＶ逆転写酵素およびＭＭＬＶ逆転写酵素中に存在するＲＮＮアーゼ１大 腸菌ＲＮアーゼＨまたは他の供給源およびこれらの組合せによって分析を行ない 、標的配列のＲＮアーゼ減成の効果を決定する。

プライマーの組を選択するにあたり、プライマーのうち１個を、反応混合物中に 存在するＲＮＮアーゼにより実質上減成されないＲＮＡの部分とハイブリダイズ するように選択するのが好ましい。もし実質的な減成が起こると、プライマーの 領域におけるＲＮＡ鎖の切断により、ＤＮＡ合成の開始が阻害されプライマーの 伸長が妨げられ得る。したがって、ＲＮＡがＲＮＮアーゼの作用を受ける場合、 プライマー伸長産物の生成を妨げる実質的減成の無いように配置されたＲＮＡ標 的の配列とハイブリダイズするプライマーを選択することが好ましい。

プロモーター−プライマーのハイブリダイゼーションの部位は、プロモーター− プライマーがハイブリダイズするＤＮＡ鎖の部分にハイブリダイズしたＲＮＡ８ 部分を除去するに十分なＲＮＡＭの減成が起こるように選択する。典型的には、 ＲＮアーゼＨ減成によりＲＮＡの一部分のみがＲＮＡ：　ＤＮＡ二本鎖から除去 され、このＲＮＡ鎖の実質的部分は二本鎖に残る。

ＲＮＡ合成のためのプロモーター含有二本鎖生成物の形成を第４図に示す。第４ 図に示すように、標的ＲＮＡ鎖は、反応混合物中に存在するＲＮアーゼＨにより 実質上減成されないＲＮＡ鎖の領域とハイブリダイズするよう選択されたプライ マーとハイブリダイズする。次いでこのプライマーを伸長してＲＮＡ鎖に対し相 補的なりＮＡ鎖を生成する。この後、反応混合物中に存在するＲＮアーゼＨによ りＲＮＡ鎖を様々な位置で切断または減成する。この切断または減成は、この時 点でまたは反応工程中の他の時点で起こり得ることを理解されたい。次いで重要 な切断または減成が起こる領域でこのＲＮＡフラグメントをＤＮＡ鎖から分離す る。次にこのプロモーター−プライマーを、ＲＮＡ鎖が実質的に減成されＤＮＡ 鎖から分離されたその３°末端でＤＮＡ鎖にハイブリダイズする。次いでこのＤ ＮＡ鎖を伸長して二本鎖ＤＮＡプロモーター配列を作り、これによりＲＮＡ合成 用の鋳型を生成する。この鋳型は二本鎖ＤＮＡプロモーター配列を含むことがわ かる。この鋳型をＲＮＡポリメラーゼで処理するとＲＮＡの多重鎖ができる。

ＲＮアーゼＨで引き起こされるＲＮＡの減成の正確な性質はわかっていないが、 ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡＮ玉鎖上ＮアーゼＨ減成の結果、ハイブリ ッドからＲＮＡの小片が分離する事がわかった。さらに、ＲＮアーゼＨ減成の後 に、小フラグメントの除去された領域でＤＮＡと結合するであろうプロモーター −プライマーを選択できるという事もわかった。

描かれた第１図および第２図にはＲＮアーゼＨ減成の後に残り得るＲＮＡは示し ていない。これらの図は一般にＤＮＡ　：ＲＮＡ二本鎖からのＲＮＡの完全な除 去を示しているが、好ましい条件下では第３図に示すように部分的脱離のみが起 こることが理解されるべきである。第１Ａ図を参照することにより、第１図のＲ ＮＡ鎖の実体部分が減成されずに残り、その結果第ニプライマーのハイブリダイ ゼーシヨンまたはプロモーター配列に対し相補的なりＮＡ鎖を作るためのハイブ リダイズされた第ニプライマーの伸長が妨げられると、提唱される機構は起こら ないであろう事が理解できる。しかしながら本出願において発見され開示される 合成の原理に基づいて、当業者は本発明の教示に従い、常套的改良を施してＲＮ Ａの増幅のための効果的且つ効率的な方法を提供することができる。

本明細書中の記載および第１Ａないし１０図かられかるように、本発明は選択可 能な変法を包含している。

第１Ａ図は、標的核酸が３′から標的配列に至る余分の配列を有する場合の本発 明に係る方法を描いている。第一のオリゴヌクレオチドは、３゛から標的配列の 末端に至る余分の配列を有する標的核酸（ＲＮＡ）の標的配列の３゛末端部分と 複合体を作る、５゛からその複合体形成配列に至るプロモーターを有する第一プ ライマーを含む。第二のオリゴヌクレオチドは第ニプライマーを含み、これは、 第一プライマー伸長産物の３゛末端と位置を同じくして第一プライマー伸長産物 の３゛末端部分と複合体を作る。工程（１）において第一プライマーは３°から 標的配列に至る余分の配列のためにスプライスの鋳型としては働かない。しかし ながら工程（１０）においては、第ニプライマー伸長産物が３゛から標的配列に 至る余分の配列を持たないため、第一プライマーはスプライスの鋳型として働く ことができる。

第１Ｂ図は、標的核酸（ＲＮＡ）が５“および３′の両方から標的配列に至る余 分の配列を有する場合の本発明に係る方法を描いている。第一のオリゴヌクレオ チドは第１Ａ図に示す通りである。第二のオリゴヌクレオチドは、３′から標的 配列に至る余分の配列を有する第一プライマー伸長産物の標的配列の３゛末端部 分と複合体を作るプライマーを含む。

第１Ｃ図は、確定した５“および３゛末端を持ち、したがって５゜または３゛の いずれから標的配列に至る余分の配列も持たない標的核酸（ＲＮＡ）を描いてい る。第一のオリゴヌクレオチドは第１Ａ図および第１Ｂ図に示す通りであるが、 これは標的核酸の３゛末端と複合体を作るため、工程１においてプライマーおよ びスプライスの鋳型の両者として働く。第二のオリゴヌクレオチドは第１Ａ図に 示す通りである。

第１Ｄ図は、確定した３°端を持ち、したがって３°から標的配列に至る余分の 配列は持たないが、５゛から標的配列に至る余分の配列を有する標的核酸（ＲＮ Ａ）を描いている。第一のオリゴヌクレオチドは第１Ｃ図に示す通りであり、プ ライマーおよびスプライスの鋳型の両者として機能する。第二のオリゴヌクレオ チドは第１Ｂ図に示す通りである。

第１Ｅ図は、確定した５゛端を持つが３°から標的配列に至る余分の配列を有す る標的核酸（ＲＮＡ）を描いている。第一のオリゴヌクレオチドは第１Ａ図に示 す通りである。第二のオリゴヌクレオチドは第ニプライマーを含み、これは第一 プライマー伸長産物の３゜末端と複合体を作るので、スプライスの鋳型をも含む 。第二のオリゴヌクレオチドはさらに５゛からその複合体形成配列に至るプロモ ーターをも有する。

第１Ｆ図は５°および３°の両者から標的配列に至る余分の配列を有する標的核 酸（ＲＮＡ）を描いている。第一のオリゴヌクレオチドは第１Ａ図に示す通りで ある。第二のオリゴヌクレオチドは、第一プライマー伸長産物が３°から標的配 列に至る余分の配列を有するため工程（４）でスプライスの鋳型として働けない 外は、第１Ｅ図に示す通りである。

第１Ｇ図は、確定した５゛および３′端の両者を持ち、標的配列以外に配列を持 たない標的核＃　（ＲＮＡ）を描いている。第一のオリゴヌクレオチドは第１Ｃ 図に示す通りであり、第二のオリゴヌクレオチドは第１Ｅ図に示す通りである。

この標的は余分の配列を持たないので、両方のオリゴヌクレオチドがスプライス の鋳型としても働く。

第１Ｈ図は、３′から標的配列に至る配列の無い確定した３゛端を持ち、５°か ら標的配列に至る余分の配列を持つ標的核酸（ＲＮＡ）を描いている。第一のオ リゴヌクレオチドは第１Ｃ図および第１Ｇ図に示す通りであり、プライマーおよ びスプライスの鋳型の両者として働く。第二のオリゴヌクレオチドは第１Ｆ図に 示す通りである。

第１Ｉ図は、確定した５“末端を持ち５°から標的配列に至る余分の配列を持た ないが、３゛から標的配列に至る余分の配列を有する標的核酸（ＲＮＡ）を描い ている。第一のオリゴヌクレオチドはプロモーターなしのプライマーを含んでい る。第二のオリゴヌクレオチドは、５°から複合体形成配列に至るプロモーター を有する、ブロックされていないスプライスの鋳型を含む。

第１Ｊ図は、確定した５′および３°端の両者を持ち、標的配列以外に配列を持 たない標的核酸（ＲＮＡ）を描いている。第一のオリゴヌクレオチドはプロモー ターなしのプライマーを含んでいる。第二のオリゴヌクレオチドは第１Ｉ図に示 す通りである。

第１Ｋ図は、５゛から標的配列に至る余分の配列を持たない確定した５°末端を 持ち、３′から標的配列に至る余分の配列を有する標的核酸（ＲＮＡ）を描いて いる。第二のオリゴヌクレオチドは５゜からその複合体形成配列に至るプロモー ターを有するスプライスの鋳型を含むが、これはその３′末端がブロックされて いる。第二のオリゴヌクレオチドはプライマーとして働くことはできない。

第１Ｌ図は、確定した５°および３°端を持ち、標的配列以外に余分の配列を持 たない標的核酸（ＲＮＡ）を描いている。第一のオリゴヌクレオチドはプライマ ーおよびスプライスの鋳型の両者として働く。第二のオリゴヌクレオチドはブロ ックされたスプライスの鋳型であり、第１Ｋ図に示す通りである。

第１Ｍ図は、確定した５゛末端を持ち、したがって５°から標的配列に至る余分 の配列を持たないが、３゛から標的配列に至る余分の配列を有する標的核酸（Ｒ ＮＡ）を描いている。第一のオリゴヌクレオチドは第１Ｉ図に示すプライマーで ある。第二のオリゴヌクレオチドは、第１Ｋ図および第１Ｌ図に示す、プロモー ターを有するブロックされたスプライスの鋳型である。

第１Ｎ図は、標的配列以外に余分の配列を持たない確定した５゛および３゛配列 の両者を持つ標的核酸（ＲＮＡ）を描いている。第一のオリゴヌクレオチドは、 第１Ｊ図に示すように、プロモーターなしのプライマーを含む。第二のオリゴヌ クレオチドは、第１Ｋ図、第１Ｌ図および第１Ｍ図に示すように、プロモーター を有するブロックされたスプライスの鋳型を含む。

第１０図は、５°から標的配列に至る余分の配列を持たない確定した５°末端を 持ち、３゛から標的配列に至る余分の配列を有する標的核酸（ＲＮＡ）を描いて いる。１個のオリゴヌクレオチドが第一のおよび第二のオリゴヌクレオチドの両 方に使用される。このオリゴヌクレオチドは、工程（１）に示すように標的配列 の３“末端部分と複合体を作る３′プライマー配列、および、工程（４）に示す ようにプライマー伸長産物の３′末端と複合体を作るプロモーターを持つ５゛ス プライスの鋳型の配列を有する。

要約すると本発明方法は、温度、イオン強度およびｐＨのような反応条件の反復 操作をすることなく標的核酸配列の多数のコピーを自勉的に合成するための方法 を提供するものであって、この方法は、（ａ）反応混合物中に、ＲＮＡ標的配列 を含む標的核酸：２個のオリゴヌクレオチドプライマー、即ちＲＮＡ標的配列（ 例えば（＋）鎖）の３′末端部分に対しこれと複合体を形成するに十分相補的な 複合体形成配列を有する第一のオリゴヌクレオチド、および相補体（例えば（− ）鎖）の標的配列の３“末端部分に対しこれと複合体を形成するに十分相補的な 複合体形成配列を有する第二のオリゴヌクレオチド（ここで、第一のオリゴヌク レオチドは、所望によりプロモーターを含む５′から複合体形成配列に至る配列 を有する第一プライマーを含み、第二のオリゴヌクレオチドはプライマーまたは スプライスの鋳型を有する。但し、もし第一のオリゴヌクレオチドがプロモータ ーを持たない場合は、第二のオリゴヌクレオチドはＲＮＡポリメラーゼのための プロモーターを含む５゛からプライミング配列に至る配列を有するスプライスの 鋳型である。）；ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ−ＤＮＡ複合体のＲＮＡ鎖を選択 的に減成する酵素活性（例えばＲＮアーゼＨ）；およびプロモーターを認識する ＲＮＡポリメラーゼ、を混合することからなる。反応混合物の構成因子は順次ま たは一度に合することができる。反応混合物をオリゴヌクレオチド／標的配列が 形成される条件下で、そしてＤ　Ｎ　Ａプライミングおよび核酸合成条件（リボ ヌクレオチド三燐酸およびデオキシリボヌクレオチド三燐酸を含む）のもとで標 的配列の多数のコピーが作られるに十分な一定時間インキユベートする。この反 応は、構成因子である酵素のような反応因子の安定性を維持するのに好適な条件 の下で、そして増幅反応過程の間反応条件の修飾または操作を要することなく、 有利に起こる。したがってこの反応は、実質的に等温の条件下で起こり得、実質 的に一定のイオン強度およびｐＨを含む。

この反応は、第一のＤＮＡ伸長反応により生成するＲＮＡ−ＤＮＡ複合体を分離 する変性工程を必要としない。こうした工程は、反応混合物の温度の実質的上昇 （一般に周囲温度ないし約８０℃から約１０５℃まで）、そのイオン強度の減少 （一般にＩＯＸまたはこれ以上）、またはｐＨの変化（通常ｐＨを１０またはこ れ以上に上げる）によるような反応条件の操作を必要とする。このような反応条 件の操作はしばしば酵素活性に有害に作用して余分の酵素の添加を要し、また、 これをさらなる核酸合成に好適な条件に戻すためさらに反応混合物の操作が必要 にもなる。

好適なりＮＡポリメラーゼは逆転写酵素を包含する。特に好適なりＮＡポリメラ ーゼはＡＭＶ逆転写酵素およびＭＭＬＶ逆転写酵素を包含する。

本発明方法に使用されるプライマーおよび／またはスプライスの鋳型への組み込 みに好適なプロモーターまたはプロモーター配列は、その配列を認識し且つこれ に結合するＲＮＡポリメラーゼによって特異的に認識され、転写の工程を開始さ せ、これによりＲＮＡ転写物を生成させる核酸配列（天然に存在するか、合成に より作られるか、または制限消化の産物のいずれか）である。この配列は所望に よりＲＮＡポリメラーゼのための実際の認識部位を越えて伸長しているヌクレオ チド塩基を含んでよく、これが安定性または減成工程に対する感受性の増加また は転写効率の向上を与え得る。開始配列を認識できる既知の且つ利用可能なポリ メラーゼのあるプロモーター配列は、使用にとりわけ好適である。典型的な既知 の且つ有用なプロモーターは、バクテリオファージＴ３、Ｔ７またはＳＰ６由来 のもののように、ある種のバクテリオファージポリメラーゼにより認識されるも の、または大腸菌由来のプロモーターを包含する。

本発明方法での使用に好適ないくつかの逆転写酵素は、例えばＡＭＶ逆転写酵素 のようにＲＮＮアーゼ活性を有するが、大腸菌ＲＮアーゼＨのような外性ＲＮア ーゼＨを添加するのが好ましい。実施例に示すように、外性ＲＮアーゼＨの添加 が必要でなくとも、ある条件下ではＡＭＶ逆転写酵素中に存在するＲＮＮアーゼ 活性が、反応混合物中に存在する因子によって阻害されることがある。このよう な状況においては外性ＲＮアーゼの添加が望ましい。比較的大量の異種ＤＮＡが 反応混合物中に存在する場合、ＡＭＶ逆転写酵素の本来のＲＮＮアーゼ活性は多 少阻害され（例えば実施例８参照）、したがって、生成する標的配列のコピー数 はその結果減少する。標的配列が、存在するＤＮＡのうちわずかな部分しか含ま ない場合（例えば試料が有意な量の異種ＤＮＡを含有するとき）、外性ＲＮアー ゼＨを添加するのが特に好ましい。このような好ましいＲＮＮアーゼの１つは大 腸菌ＲＮアーゼＨである。このような外性ＲＮアーゼＨの添加が大量のＤＮＡに より引き起こされる阻害を克服することが示された（例えば実施例８参照）。

これらの方法により生成したＲＮＡ転写物は、前記の機作により標的配列のさら なるコピーを生成する鋳型として働くことができる。

この系は口触的であり、本発明方法による増幅は、温度、ｐＨ１イ要なしに口触 的に起こる。この方法は高価な温度循環装置を要せず、増幅反応工程の最中に酵 素または他の試薬を何回も添加する必要もない。

本発明方法は、臨床上、環境の、法医学、および類似の試料中の特定の核酸標的 配列を検出および／または定量するため、または種々の用途のために特定の標的 配列のＤＮＡおよび／またはＲＮＡの多数のコピーを生成させるための検定の一 因子として使用できる。

典型的な検定においては、増幅すべき試料を、緩衝液、塩、マグネシウム、三燐 酸、プライマーおよび／またはスプライスの鋳型、ジチオトレイトール、および スペルミジンを含有する緩衝液濃縮物と混合する。この反応物を所望により１０ ０℃付近で２分間インキュベートして核酸中の二次構造を変性させる。冷却後、 もし標的が確定した３゛末端を持たないＤＮＡ標的ならば、逆転写酵素を加え、 反応混合物を約４２℃で１２分間インキュベートする。今回はＤＮＡ鋳型からプ ライマー伸長産物を分離するために反応物を１００℃付近で再度変性させる。冷 却後、逆転写酵素、ＲＮＡポリメラーゼ、およびＲＮＮアーゼを加え、反応物を ３７℃で２ないし４時間インキュベートする。次いで生成物を変性させ、プロー ブ溶液を加え、６０℃で２０分間インキュベートし、ハイブリダイズしていない プローブの標識を選択的に加水分解する溶液を加え、反応物を６０℃で６分間イ ンキユベートシ、モしてルミノメータ−で残っている化学ルミネセンスの標識を 測定することにより、反応物を検定することができる。上記に引用したＨＰＡ適 用の方法をここに記載しである。溶液内プローブハイブリダイゼーションの代わ りに、生成物を測定する幾つかの他の方法を用いることができる。

標的が確定した３′末端を持ち、且つ一方のオリゴヌクレオチドが、３′末端に 対しこれと複合体を作るに十分相補的な複合体形成配列、および５゛から複合体 配列に至るプロモーター配列を有するスプライスの鋳型である場合、または標的 がＲＮＡである場合、典型的な検定は、標的を前記の緩衝液濃縮物と混合し二次 構造を変性させることを含む。冷却後、逆転写酵素、ＲＮＡポリメラーゼ、およ び所望ならばＲＮＮアーゼを加え、混合物を３７℃で２ないし４時間インキュベ ートする。次いで反応物を前記のように検定することができる。

Ｉｌ、予備操作 以下の記載は、所望により本発明の好ましい方法と共に使用できる予備操作の幾 つかの態様である。幾つかの標的核酸は口触的増幅に先立ち修飾を要するため、 これらの操作を用いて修飾を行なう。

標的核酸（および標的配列）が本来ＤＮＡである場合、これらの操作を用いて概 括的方法で使用するための標的配列のＲＮＡコピーを作ることができる。これら の予備操作は自身反復でき、故にそれ自身増幅方法として使用できることが理解 されるべきである。

予備操作Ｉ この方法は、確定した３°末端を有する１本（−重鎖）のＤＮＡからなる標的核 酸の標的配列のＲＮＡコピーを与えるものである。

予備操作Ｉは２個の核酸構成因子、即ち標的核酸分子およびオリゴヌクレオチド スプライスの鋳型を使用する。この操作は確定した３°端を有するＤＮＡ標的核 酸を要する。もし本来の３°末端が未知または何らかの理由で不十分な場合は、 制限ヌクレアーゼの使用、別の配列へのライゲーション、または他の何らかの手 段によって新たな確定３°末端を作り出すことができる。

以下の記述において、（第２八図ないし第２Ｃ図参照）標的核酸は自由裁量によ り「マイナス」の意義を有するものとする。したがってスプライスの鋳型は標的 に対しこれと複合体を作るに十分相補的であるような「プラス」の意義を有する ことになる。このスプライスの鋳型は標的の３゛末端に対しこれと複合体を作る に十分相補的な複合体形成配列を有する。さらにスプライスの鋳型は、ＲＮＡポ リメラーゼのためのプロモーター配列を含む５′から複合体形成配列に至る配列 を有する。スプライスの鋳型は所望により、５′からプロモーターに至る、プロ モーターおよび複合体形成配列の間、および／または３′から複合体形成配列に 至る、他の配列を有していてよい。スプライスの鋳型はさらに３′末端でブロッ クされるよう修飾されていてもよく、その結果これは伸長反応において余分のヌ クレオチドを添加しても伸長できず、またスプライスの鋳型とじて働くのに加え てプライマーとして働くことができなくなる。

予備操作Ｉは２種の酵素活性、即ちＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡ 依存ＲＮＡポリメラーゼを使用する。

標的核酸を、オリゴヌクレオチド／標的配列複合体が作られＤＮＡ合成が開始し 得る条件下でスプライスの鋳型で処理する。適当なりＮＡポリメラーゼを使用す るＤＮＡ伸長反応においては、５゛から複合体形成配列に至るスプライスの鋳型 の配列に対し相補的な配列を標的ＤＮＡの３′末端に付加する。スプライスの鋳 型は、もし３′末端でブロックされていなければＤＮＡポリメラーゼのためのプ ライマーとしても働き、伸長してプライマー伸長産物を与える。

この伸長反応の産物、即ち二本鎖または部分的二本鎖のいずれかである標的／ス プライスの鋳型複合体は、プロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼを用いる ＲＮＡ転写物の合成のための鋳型として働く。次いでＲＮＡ転写物を、概括的方 法用に使用、または以下のごと＜ＲＮＡのＤＮＡコピーの生成に使用することが できる二標的配列を含むＲＮＡ転写物（「プラス」意義を有する）を、オリゴヌ クレオチド／標的配列複合体が形成されＤＮＡ合成が開始し得る条件下で、ＲＮ Ａ転写物の標的配列の３゛端に対しこれと複合体を作るに十分相補的な複合体形 成配列を有するプライマー（名目上「マイナス」意義を有する）で処理する。次 いでこのプライマーを、標的配列を有するＤＮＡプライマー伸長産物を作り出す 鋳型としてＲＮＡ転写物を用いるＤＮＡ伸長反応で伸長させる。ＤＮＡ標的配列 を、ＲＮＡの変性または減成のいずれかによりＲＮＡ転写物から分離し、スプラ イスの鋳型で始まるサイクルを反復させる。所望によりプライマーは５゛からブ ライミング配列に至る余分の配列をも有していてよい。さらにスプライスの鋳型 もまた３′から複合体形成配列に至る余分の配列を有していてよい。

ある態様において、上の方法を、３°からスプライスの鋳型を含む配列に至るプ ライマーを含む配列を有するオリゴヌクレオチドを使用することにより、１個の オリゴヌクレオチドを用いて実施することができる（例えば第２Ｃ図参照）。

予備操作Ｉをさらに第２Ａ図ないし第２Ｅ図を参考にして説明する。第２Ａ図は 、確定した３°末端を持ち、３°から標的配列に至る余分の配列を持たない標的 核酸（ＤＮＡ）を示している。第一のオリゴヌクレオチドはプライマーおよびス プライスの鋳型の両者を含み、５°から複合体形成配列に至るプロモーターを有 する。

第２Ｂ図は第２Ａ図に示されるような標的核酸（ＤＮＡ）を示している。第一の オリゴヌクレオチドは、３′端でブロックされ、したがってプライマーとして働 くことのできないスプライスの鋳型を含んでいる。

第２Ｃ図は第２Ａ図および第２Ｂ図に示されるような標的ＤＮＡを示している。

第２Ｃ図は、５゛からその３゛端のプライマー配列に至るスプライスの鋳型（プ ロモーターを有する）の配列を有する一個のオリゴヌクレオチドの使用を示して いる。即ちこのオリゴヌクレオチドは、工程（１）および（７）ではブロックさ れたスプライスの鋳型として、そして工程（４）ではプライマー（およびスプラ イスの鋳型）として働（。

第２Ｄ図は、確定した５°端、ならびに、前述の複合体形成、プライマー伸長お よび分離工程（工程１および２）を受けて確定した３′末端を有する相補的ＤＮ Ａ標的を作り出す、３°から標的配列に至る余分の配列を有する標的核酸（ＤＮ Ａ）を示している。工程（１）および（７）のオリゴヌクレオチドは、最初の標 的ＤＮＡの標的配列（ここでは名目上（十））の３°末端部分と複合体を作るプ ライマーを含む。他のオリゴヌクレオチド（工程（４）および（１０））は、最 初の標的に対する相補体の３゛端と複合体を作る、ブロックされていないスプラ イスの鋳型を含む。

第２Ｅ図は、確定した５°端、ならびに、前述の複合体形成、伸長および分離工 程（工程（１）および（２））を受けて確定した３′末端を有する相補的ＤＮＡ 標的を作り出す、３°から標的配列に至る余分の配列を有する標的核酸（ＤＮＡ ）を示している。工程（１）および（７）のオリゴヌクレオチドは、最初の標的 ＤＮＡの標的配列（ここでは名目上（＋））の３°末端部分と複合体を作るプラ イマーを含む。工程（４）および（１０）のオリゴヌクレオチドは、最初の標的 に対する相補体の標的配列の３°末端部分と複合体を作るブロックされたスプラ イスの鋳型を含む。

スプライスの鋳型は、標的／スプライスの鋳型複合体が形成されＤＮＡ合成が開 始し得るような複合体形成条件下で、標的核酸の３′末端と複合体を作る。（工 程１）適当なりＮＡポリメラーゼを用いて標的核酸の３′末端を伸長し、５°か ら複合体形成配列に至るスプライスの鋳型の配列に対し相補的な配列を付加する 。もしスプライスの鋳型の３′末端がブロックされておらず、標的核酸に対し十 分相補的であるならば、このスプライスの鋳型はプライマーとして働き、その結 果スプライスの鋳型の３°末端もまた伸長され得る。

（第２Ａ図）得られた標的／スプライスの鋳型複合体は部分的または完全に二本 鎖である。（第２Ａ図対第２Ｂおよび２０図参照）最小限この二本鎖領域は標的 核酸と複合体を形成したプロモーター配列およびブライミング配列を含む。

工程２の鋳型は適当なＲＮＡポリメラーゼにより転写される。このＲＮＡポリメ ラーゼは各鋳型につき約５−１０００のＲＮＡコピーを生成する。第２八図ない し２０図において、生成したＲＮＡは名目上「プラス」意義であり、プロモータ ーの３°端から標的核酸の５′端に至る配列を含む。

工程３のＲＮＡ産物は概括的方法にしたがって標的配列を口触的に増幅させるた めに使用でき、または、別法として、このＲＮＡ中の標的配列の３°末端部分に 対しこれと複合体を形成するに十分相補的な複合体形成配列を３′末端に持ち、 且つ所望により５°から複合体形成配列に至る他の配列を含むプライマーと複合 体を形成且つブライミングする条件下で処理することができる。このプライマー を、プライマー伸長反応において、ＲＮＡを鋳型として使用してＲＮＡ依存ＤＮ Ａポリメラーゼにより、伸長する。これにより少なくとも部分的に二本鎖の生成 物が作られ、そしてこれは例えばＲＮアーゼＨによる（工程５）ＲＮＡ部分の減 成または変性のような他のなんらかの方法によって、さらなる合成のために少な （とも部分的に一本鎖としなければならない。

工程６で生成したＤＮＡは工程１のための標的分子として使用でき、前記のごと くスプライスの鋳型で処理して、より多くのＲＮＡおよびＤＮＡを生産させる。

これらの工程を、所望の増幅レベルが生成するまで循環させることができる。ス プライスの鋳型およびプライマーの適当な選択により、この新たな標的分子（工 程６）が最初の分子とは異なる末端を持つことができることにも留意されたい。

さらに、もしＲＮＡ由来のプライマー伸長産物が５′から複合体形成配列に至る プロモーター配列を有するならば、「プラス」意義の複合体形成配列を持ち、所 望により５°から複合体形成配列に至る他の配列をも有する第ニプライマーを、 伸長したプライマー産物の複製に使用してＲＮＡポリメラーゼのための二本鎖鋳 型を生成することができる。このように作られた鋳型はＲＮＡポリメラーゼが「 マイナス」意義のＲＮＡを作ることを可能にし、このＲＮＡを、概括的方法を用 いて増幅、または本明細書中の操作を用いてさらに増幅することができる。

予備操作ＩＩ 予備操作ＩＩは、口触的反応種を生み出す方法の点で予備操作Ｉと異なる。ＤＮ Ａ標的核酸は確定した３°末端を持つ必要が無い。

ある側面においては、スプライスの鋳型の代わりに５゛から複合体形成配列に至 るプロモーター配列を含んでいるプライマーを使用して、このプロモーター配列 をＲＮＡポリメラーゼのための鋳型へと導入する。このプライマーは、標的配列 の３゛末端部分に対しこれと複合体を作るに十分相補的な複合体形成配列、およ び、５゛から複合体形成配列に至るＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターを 含む配列を有する。このプライマーをＤＮＡポリメラーゼで伸長させてプライマ ー伸長産物を得る。

通常熱変性により鎖を分離した後、標的分子と同じ意義の第二のオリゴヌクレオ チドをプライマーとして用いて、第一プライマー伸長産物に対するＤＮＡ相補物 を合成する。第ニプライマーは、プロモーターを含み得る５゛から複合体形成領 域に至る余分の配列を持ち得る。第ニプライマー中にプロモーター配列が含まれ ることにより増幅が促進される。第ニプライマーはスプライスの鋳型でもあり得 る。

予備操作ＩＩを第３図を参考にしてさらに説明する。第３図は、５°および３゛ の両方から標的配列に至る余分の配列を有する標的ＤＮＡを示している。第一プ ライマーはその３゛末端に複合体形成配列、そしてプロモーター配列を含む５゛ から複合体形成配列に至る配列を持ち、標的と十分複合体を形成してプライミン グ機能を発揮しＤＮＡ合成を開始させる。適当なりＮＡポリメラーゼがこのプラ イマーを伸長してプライマー伸長産物を与える。この鎖を変性または他の手段に より分離して、プライマー伸長産物を含む一本鎖のプロモーターを生成する。

第一プライマー伸長産物の標的配列の３゛末端部分に対し十分相補的な複合体形 成配列をその３′末端に持ち、そして所望により、プロモーター配列を含み得る ５′から複合体形成配列に至る他の配列を持つ、第ニプライマーを使用する。第 ニプライマーは工程３からのプライマー伸長産物と十分複合体形成してブライミ ング機能を発揮しＤＮＡ合成を開始させる。ＤＮＡポリメラーゼは第ニプライマ ーを伸長させて第ニプライマー伸長産物を与える。得られた二本鎖ＤＮＡ分子は この時点でＲＮＡポリメラーゼのための鋳型とじて働き、概括的方法のためのＲ ＮＡ転写物を産むことができる。第３図に示すように、生成されたＲＮＡ分子は 名目上「プラス」意義であり、本発明に係る概括的方法を用いて増幅することが できる。

第ニプライマーの複合体形成配列が工程３からの第一プライマー伸長産物の３′ 末端に対し相補的であり、第ニプライマーが５゛から複合体形成配列に至るプロ モーター配列を含んでいる場合、第ニプライマーはスプライスの鋳型として働き 、その結果工程３からの第一プライマー伸長産物の３゛末端がさらに伸長してプ ロモーター配列を付加し、両意義のＲＮＡ転写物を生成するＲＮＡポリメラーゼ のための鋳型ができる。このようにして作られたＲＮＡ分子は概括的方法を用い て増幅することができる。

本発明の他の側面においては、第ニプライマーがスプライスの鋳型として働き、 且つ５′から複合体形成配列に至るプロモーターを有し、その結果第一プライマ ーはプロモーターを有する必要が無い。

この場合、工程２からの第一プライマー伸長産物はさらに伸長してプロモーター 配列に対する相補体を生成し、こうして「マイナス」意義のＲＮＡを生産するた めの鋳型がＲＮＡポリメラーゼによって作られる。

上記の工程を反復することにより、さらなる標的配列のＲＮＡおよびＤＮＡコピ ーを生産することができる。

実施例 序文 前述の方法に対する以下の実施例は本発明方法の機作および用途を説明するもの である。これらは本発明を限定するものではな（、そのように解してはならない 。

１またはそれ以上の実施例において用いられる多くの物質は類似している。実施 例の記載を単純にするために幾つかの物質を略記し、ここに説明する。

ｒｆｒａｇｌＪと称する鋳型は、Ｂ型肝炎ゲノム由来のＤＮＡの一部分と相同性 の二本鎖ＤＮＡセグメントである。これは制限ヌクレアーゼ消化によりプラスミ ドから切り取られ、クロマトグラフィー法によって残りの核酸から精製された。

精製に続いてこのフラグメントは制限エンドヌクレアーゼで切断し、フェノール 抽出を経て精製し、エタノール沈澱により所望の標的を得た。

ｒＭ１３Ｌ　（−）Ｊと称する鋳型は、全配列のうちの小断片としてマイナス鎖 標的配列を含む精製された一本鎖ＤＮＡ標的である。

本明細書に記載される実施例においては幾つかの異なるプライマーおよびスプラ イスの鋳型を使用した。Ｔ７１）ｒｏ（＋）と称するオリゴヌクレオチドは、５ °末端付近にＴ７ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター、そして３°末端付近には 、上記２種の鋳型に対するマイナス鎖標的配列の３′末端に対して相補的な配列 を含む。さらにＴ７ｐｒｏ（＋）はその働きを促進するための他の配列情報をも 含んでいる。Ｔ７ｐｒｏ　（＋）の配列は、５’　−ＡＡＴＴＴ　ＡＡＴＡＣＧ ＡＣＴＣＡＣＴＡＴ　ＡＧＧＧＡ　ＧＡＧＧＴ　ＴＡＴＣＧ　ＣＴＧＧＡ　ＴＧ ＴＧＴ　ＣＴＧＣＧ　ＧＣＧＴ３’である。

Ｔ７ｐｒｏに類似のもう一つのオリゴヌクレオチドはｄｄＴ７ｐｒｏ（＋）であ る。これは、３°末端が末端デオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼを用い てジデオキシヌクレオチドで伸長されている点で７７ｐｒｏ（＋）と異なる。Ｔ ７ｐｒｏ（＋）と異なりｄｄＴ７ｐｒｏ　（＋）は、逆転写酵素によるＤＮＡ合 成のためのプライマーとして働くことはできないが、スプライスの鋳型として働 くことができる。

ＨＢＶ（−）Ｐｒは、ｆ　ｒａｇｌ鋳型のプラス鎖とハイブリダイズしＭ１３Ｌ （−）の内部の配列と相同的なプライマーである。［ＨＢＶ（−）Ｐｒは３°か らＴ７ｐｒｏ（＋）に対し相同的なプラス鎖配列に至る配列に対して相補的であ る。］ＨＢＶ（−）Ｐｒに相当する配列は、５’−ＧＡＧＧＡ　ＣＡＡＡＣＧＧ ＧＣＡ　ＡＣＡＴＡ　ＣＣＴＴＧ−３°である。

プロモーター領域を含むもう一つのオリゴヌクレオチドはＴ７ｐｒｏ（−）であ る。このプロモーター−プライマーはＴ７ｐｒｏ（＋）と同一の配列を含むが、 マイナス標的に対して相補的な配列がプラス標的に対して相補的な配列で置き変 わっている。Ｔ７ｐｒｏ（−）の３°末端はｆｒａｇｌのプラス鎖の３′末端に 対して相補的である。Ｔ７ｐｒｏ（−）に相当する配列は、５°−ＡＡＴＴＴ　 ＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴ　ＡＧＧＧＡ　ＧＡＴＣＣＴＧＧＡＡ　ＴＴＡ ＧＡ　ＧＧＡＣＡ　ＡＡＣＧＧ　ＧＣ−３°である。

ｄｄＴ７ｐｒｏ　（＋）と同様に、ｄｄＴ７ｐｒｏ　（−）は、末端デオキシヌ クレオチジルトランスフェラーゼを用いて３°末端をジデオキシヌクレオチドで 伸長することによって作られた３°がブロックされたオリゴヌクレオチドである 。ｄｄＴ７ｐｒｏ　（−）はプライマーとして働くことはできないが、他の点で はＴ７ｐｒｏ（−）と類似している。

これらの実施例で用いられる鋳型は、プライマーに対して相同的または相補的な 領域および前記のスプライスの鋳型の間の実質的な配列を含む。オリゴヌクレオ チド間の配列が本発明の結果として増幅されるのであるから、この配列の定量化 は増幅を測定する特異的手段を提供する。この生成物は、オリゴヌクレオチドブ ライマーとスプライスの鋳型の間にコードされた配列に特異的なりＮＡプローブ を用いるハイブリダイゼーション技術によって検定するのが簡便である。以下に 示す実施例では２個のプローブ、即ちプローブ（＋）およびプローブ（−）を使 用する。プローブ（＋）はマイナス意義の生成物に対して相補的であり、プロー ブ（−）はプラス意義の生成物に対して相補的である。プローブ（＋）に相当す る配列は５゛−ＣＣＴＣＴ　ＴＣＡＴＣＣＴＧＣＴ　ＧＣＴＡＴ　ＧＣＣＴＣ− ３′であり、プローブ（−）に相当する配列は５°−ＧＡＧＣＡＴＡＧＣＡＧＣ ＡＧ　ＧＡＴＧＡ　ＡＧＡＧ、Ｇ−３°　である。本明細書中で使用されるプロ ーブは化学ルミネセンスの標識で標識した。検定において、ハイブリダイズした プローブ上の標識はルミノメータ−で測定される光を放出する。

以下の実施例において、相対的増幅を以下のように測定した。増幅反応混合物の 試料（通常１０μｍ）をｌＱｍＭ）リス−ＨＣＩ（ｐＨ８，３）で５０μｍに希 釈し、９５℃で２分間変性させた。氷上で冷却した後、およそ７５ｆｍｏｌのプ ローブ（＋）またはプローブ（−）　、０．２Ｍ琥珀酸リチウム（ｐＨ５，２） 、２１％（ｗ／Ｖ）ラウリル硫酸リチウム、２ｍＭＥＤＴＡ、および２ｍＭＥＧ ＴＡを含有するプローブ溶液５０μｍを試料に加え、混合した。次いで反応物を ６０℃で２０分間インキュベートし冷却した。各ハイブリダイゼーション反応物 に、飽和はう酸ナトリウム溶液を塩酸でｐＨ８，５に調節し、次いでこのほう酸 の最終濃度が０．８Ｍとなるよう希釈し、トリトンＸ−１００を最終濃度５％（ ｖ／ｖ）まで加えることにより調製した溶液５００μｍを添加した。次にこの反 応物を混合し、６０℃で６分間インキュベートして、ハイブリダイズしていない プローブの化学ルミネセンスｅｇｇを破壊した。このハイブリダイズしていない プローブの化学ルミネセンス標識の破壊方法は非常に特異的であって、ハイブリ ダイズしていないプローブのうちほんのわずかな部分のみに化学ルミネセンスが 残るだけである。

反応物を冷却し、残留する化学ルミネセンスを、１，５Ｍ水酸化ナトリウム２０ ０μｍ、０．１％（Ｖ／Ｖ）過酸化水素を加えてルミノメータ−で定量した。こ の検定において、ハイブリダイズしたプローブはルミノメータ−で測定される光 を放出する。ハイブリダイズしていないプローブの化学ルミネセンス標識を破壊 する反応は１００％有効ではないため、一般に約３００ないし１３００相対光単 位（ＲＬ　Ｕ）の範囲で存在する信号のバックグラウンドがある。

同位体で標識したプローブとのハイブリダイゼーション、プロッティング技術お よび電気泳動を使用する検定を含む他の多くの検定法もまた利用可能である。

以下の実施例において使用される酵素は、セイカガク・アメリカ、Ｉｎｃ、の鳥 の骨髄芽球症ウィルス逆転写酵素、二ニー・イングランド・バイオラブズまたは エビセンターのＴ７　ＲＮＡポリメラーゼ、ならびにベセスダ・リサーチ・ラボ ラトリーズのモロニー・ネズミ白血病ウィルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素および大 腸菌ＲＮアーゼＨである。類似の活性を持つ他の酵素および他の供給源からの酵 素もまた使用でき、また、異なったプロモーター特異性を有する他のＲＮＡポリ メラーゼもまた使用に適している。

別途記載のない限り以下の実施例において使用する反応条件は、容量１００μｌ 中、４０ｍＭトリス−ＭＣＩ、２５ｍＭＮａ０３８　ｍＭＭ　ｇ　ＣＩ　＊、５ ｍＭジチオトレイトール、２ｍＭスペルミジン三塩酸塩酸塩ｍＭｒＡＴＰ、１ｍ ＭｒＣＴＰ、１ｍＭｒＧＴＰ。

１ｍＭｒＵＴＰ、０．２ｍＭｄＡＴＰ、０．２ｍＭｄＣＴＰ、０゜２ｍＭｄＧＴ Ｐ、０．２ｍＭｄＴＴＰ、０．１５μＭの各プライマーまたはスプライスの鋳型 、および特記した量の鋳型および酵素である。

これらの反応条件は必ずしも最適のものではなく、い（つかの系では記したよう に変更されている。これらのおよび他の標的配列のために他の配列が使用されて おり、使われているオリゴヌクレオチド配列は一例であってこれを限定する意図 ではない。

実施例１ 本システムが機能することを説明するために、上記の４つのプロモーター含有オ リゴヌクレオチドを各々別々に４ｆモルのターゲット（フラッグ１）を含有ある いは非含有の反応液に加えた。反応液を９５℃で２分間インキュベートしてター ゲットを変性させ、ついで冷却して該オリゴヌクレオチドをターゲットにアニー リングさせた。逆転写酵素１３単位とＴ７　ＲＮＡポリメラーゼ１００単位を加 え、反応液を３７℃で３０分間インキュベートした。反応液の１０分の１をハイ ブリディゼーション法で検定した。表１に示した結果（相対光単位ＣＲｅ１ａｔ ｉｖｅ　Ｌｉｇｈｔ　ＵｎｉｔあるいはＲＬＵ　（ｓ）とｆモルで表示している ）はブロックしたあるいはブロックしていないオリゴヌクレオチドがスプライス 鋳型として作用し、生成物を生成することを示している。ターゲット非存在下の 反応液で測定した信号はこのタイプのアッセイに於ける信号の典型的なバックグ ラウンドを示している。

表１ 予備工程Ｉにおけるスプライス鋳型の比較増幅システムをｄｄＴ７ｐｒｏ　（＋ ）と７７ｐｒｏ　（＋）　でサイクルした。この実験で、標準反応液では４８モ ルのフラッグＩ、ＨＢＶ（−）ＰｒおよびｄｄＴ７ｐｒｏ　（＋）あるいはＴ７ ｐｒｏ（＋）を混合し９５℃でインキュベートした。冷却後、逆転写酵素１３単 位とＴ７ＲＮＡポリメラーゼ１００単位を加え、混合物を３７℃で３０分間イン キュベートした。反応物の１０分の１を測定のため除き、残りでサイクルを繰り 返した。３回サイクルを繰り返した後、その１０μリットル部をハイブリデイゼ ーション法にてプローブ（−）により測定した。表２に示した結果は生成物がブ ロックしたスプライス鋳型あるいは非ブロックしたスプライス鋳型いずれともサ イクリングすることにより増幅することを示している。

表２ 予備工程Ｉとのサイクリング 予備工程Ｉの感度 この実施例では非ブロツクスプライス鋳型、Ｔ７ｐｒｏ（＋）とプライマー、Ｈ ＢＶ（−）Ｐｒを用い増幅法の感度を調べた。予備工程１の６サイクルを実施例 ２と同様にフラッグ１の量を減少しながら行った。増幅後、生成物を発明の詳細 な説明の欄で述べたハイブリディゼーション法を用いて測定した。この方法を用 いて４Ｘ１０−２１モルのフラッグ１が検知され得た（表３参照）。

表３ 予備工程Ｉの６サイクルを用いた感度 ターゲット（モル）　検体（μｌ）　生成物（ＲＬＵ’　５）４Ｘ１０”　５　 ３２８３９０ ４Ｘ１０−”　２０　１０５３６４ ４Ｘ１０−”°　２０　３１６６ ４Ｘ１０−”　２０　１９２７ 予備工程Ｉを含む増幅 下記実施例では、増幅されるターゲットはフラッグ１であった。

反応液の最初のセットでは、ターゲットとスプライス鋳型の種々の組み合わせを ９５℃で２分間インキュベートし、ついで冷却し逆転写酵素１３単位とＴ７ＲＮ Ａポリメラーゼ１００単位を加えた。反応混合物を３７℃で３０分間インキュベ ートしついで５μｍ部の反応混合物を両プローブと測定して生成物を定量した。

この測定の後、反応液を５μｍの反応液１および２、およびＴ（−）スプライス 鋳型を用いて調製した。混合物を９５℃で２時間インキュベートし、冷却しつい で逆転写酵素１３単位Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ１００単位を加えた。新しい反応 物を混合し３７℃で２時間インキュベートした。その１０μｍ部を下記表４に示 した時間で水浴に除いた。生成物を前記のハイブリディゼーション方法を用い測 定した。データは両スプライス鋳型がいずれもフラッグ１からＲＮＡを生成せし めたことを示している。データはまたＲＮＡとそのＲＮＡに相補のスプライス鋳 型を含有した反応液中でより多くのマイナスおよびプラスセンス生成物が生成さ れたことを有意に示している。最後に、反応液ＩＢの反応速度論は生成物の幾何 学的増加を示し、一方反応液２Ｂの速度論はもっと直線である。この違いはＩＢ 反応液での生成物はさらに生成物を生成する為の基質として作用していることを 示し、つまりこの反応は口触反応である。

表４ 予備工程Ｉ 反応液１　＋　１　−　−１ □ 予備工程Ｉを含む増幅の反応速度論 下記の実施例は本発明方法のこの態様の可能性を示す。フラッグ１の少量（１０ ａモル）を７７ｐｒｏ　（＋）　、Ｔ７ｐｒｏ　（−）およびＨＢＶ　（−）ｐ ｒの種々の組み合わせと反応に用いた。反応混合物を９５℃で２分間インキュベ ートしてＤＮＡターゲツトを変性し、冷却しついで逆転写酵素とＴ７ＲＮＡポリ メラーゼを加えた。

混合後、反応液を３７℃で３０分間インキュベートした。その１５μｍ部を種々 の時間で除き、０℃で測定まで保存した。反応生成物を定量するためにハイブリ デイゼーションア・ソセイを用いた。表５に示したデータは本発明が１つのスプ ライス鋳型と１つのプライマーを必要とすることを示している。しかしながら第 ２のスプライス。

鋳型は有利である。１つのみのプライマーあるいはスプライス鋳型で得た結果は 本アッセイの測定限界以下であった。先の実施例のように、反応速度論は幾何学 的であり口触反応を示唆してしする。

表５ ０時間以上にわたる生成物合成の継続を示した。我々はさらに感度の向上をも示 した。

この実施例ではプライマーの種々の組み合わせを用いて決定した末端のないＤＮ Ａターゲットの５００ａモルを増幅する。ターゲットは先に引用したＭ１３Ｌ（ −）であった。反応物調製にあたって、サンプルを９５℃で２分間インキュベー トし、冷却しついで逆転専業１３単位を加えた。反応物をついで４２℃で１２分 間インキユベートシた。次に、反応物を再び９５℃で２分間インキュベートし冷 却した。逆転写酵素とＴ７ＲＮＡポリメラーゼを加え、３７℃で２分間インキュ ベートした。反応物の１０μｍ部をプローブ（＋）およびプローブ（−）と測定 した。表６に示した結果は大量の核酸の合成が２つのプライマーを用いた時のみ 起こることを示している。

また２つのプロモータープライマーが１つのプロモーターブライマーと１つのプ ライマーに比べて有利なことを示している。反応液４および５における低レベル 合成は元の鋳型から約１コピーのＤＮＡの合成に符合する。本システムを初期９ ５℃変性工程を要し、この工程は二重鎖ターゲットあるいは一本鎖ターゲットの 二重鎖領域を変性し同時にまた不活性の望まれないヌクレアーゼやプロテアーゼ 活性をも変性する。

表６ 予備工程■システム プローブ　相対光単位（ＲＬＵ’　Ｓ）プローブ（＋）　８６２　７４４　７６ ２　１０８９　２５７７　９６２２１　３０５０１プローブ（−）　４７３　４ ２０　４８３　３０３８　１０８０　１５１７１　１４８６３外因性ＲＮＡ５ｅ Ｈの添加が本発明の口触反応システムでの増幅を向上し得ることを示すために、 い（つかの反応物を種々の量のターゲット、Ｍ１３Ｌ（−）および外因性ＲＮＡ ５ｅＨをＯあるいは２単位用いて調製した。用いた外因性ＲＮＡ５ｅＨはＥ、ｃ ｏｌユニ由来であった。すべての反応物はＴ７ｐｒｏ（＋）とＴ７ｐｒ０（−） と調製した。反応物を９５℃変性処理に処し、冷却し逆転写酵素を加えた。４２ ℃で１２分間インキュベート後、反応物を再び９５℃で変性した。冷却後、逆転 写酵素、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼおよび必要な場合は（表７参照）ＲＮＡｓｅＨ を加え、３７℃で３時間インキュベートした。その１０μｍ部を各反応混合物か らハイブリディゼーション法によるアッセイのために１時間毎に除いた。表７の データは外因性ＲＮＡ５ｅＨが有意に反応速度を促進し本発明の感度を上昇させ ることを示している。６００ＲＬＵ’　ｓ以下の信号は典型的なバックグラウン ドレベルとみなした。

表７ 予備工程■を含む増幅の感度に対する外因性ＲＮＡ５ｅＨの作用１ｏ　０　１４ ５５　３７６　５７９　２０７５１１１ＸＩＯ”　２　□４１９２０７１１５０ ３８９６４０７３　ｉ外因性ＤＮＡの添加が有意に本自勉増幅システムを阻害し 得ることを示した。外因性ＲＮＡ５ｅＨの添加の有利性をさらに示すために、増 幅反応液を２μｇの子牛胸腺ＤＮＡの添加あるいは不添加で調製しこの阻害を示 した。子牛胸腺ＤＮＡ添加の反応液では、逆転写酵素を２濃度で用い、さらにＡ ＭＶ　ＲＮＡ５ｅ　Ｈがこの阻害ｓｅＨを同様の理由によりいくつかの反応液に 加えた。反応液は標準反応液とは各リボヌクレオチドの濃度が２．５ｍＭまで上 昇し、塩化マグネシウムの濃度が１２．８ｍＭまで上昇している点において異な る。反応液をターゲットとして１００ａモルのＭ１３Ｌ（−）を、およびＴ７ｐ ｒｏ（＋）と７７ｐｒｏ（−）を用いて調製した。

９５℃で２分間変性後、反応液を冷却し逆転写酵素を１３単位あるいは３９単位 加え、さらに反応物を３７℃で１２分間インキュベートした。反応液を再び９５ ℃で変性し冷却しついで逆転写酵素１３単位あるいは３９単位、Ｔ７ＲＮＡポリ メラーゼ１００単位あるいは３００単位およびＥ、ｃｏｌ　ｉ、ＲＮＡ５ｅ　Ｈ を０単位あるいは２単位加えた。３７℃で１時間インキュベート後、各反応液の １０μｍ部をハイブリデイゼーションアツセイを用いて測定した。表８に示した 結果は子牛胸腺ＤＮＡが外因性ＤＮＡの無い反応システムに比べ反応を９０％阻 害し、逆転写酵素の追加（ＲＮＡｓｅＨを伴う）は生成物増幅を有意に影響しな いことを示した。さらにＴ７ＲＮＡポリメラーゼの追加は生成物収量に有意な影 響を示すが、それは外因性ＲＮＡ５ｅＨの追加による増加にほとんど関係しなか った。阻害が除去されるだけではなくまた増幅も子牛胸腺ＤＮＡとＥ、ｃｏｌ　 ｉ、ＲＮＡ５ｅ　Ｈの無い反応に関係して５倍以上も増加した。高濃度のＥ、ｃ ｏｌ　ｉ、ＲＮＡ５ｅ　Ｈとの反応でみられた信号はハイブリデイゼーションア ソセイで用いたプローブ量を飽和していた。これらのサンプルを正確に定量する ために、増幅生成物は測定の前に希釈する必要があった。

表８ 外因性ＤＮＡによる増幅阻害に対するＲＮＡ５ｅＨの効果逆転写酵素　Ｔ７　Ｒ ＮＡ　Ｅ、ｃｏｌｉ、９−ゲ７）　外因性　相対酵素　ポリメラーゼ　ＲＮＡ５ ｅ　ＨＤＮＡ　ＤＮＡ　光（単位）　（単位）　（単位）（８モル）　（８ｇ） 　単位１３　ｉｏｏ　４　］、００　２　２７８６６６このシステムは初期転写 と変性を要しない。つまりタープ・ソトのＤＮＡ補体が作られ元のターゲットは ＲＮＡ５ｅＨで除かれる。

ＤＮＡは次に第２プライマーあるいはプロモータープライマーにアニーリングし ＤＮＡ合成を通してＲＮＡポリメラーゼのための鋳型を作る。ＲＮＡ５ｅＨが活 性でない場合は、始め４二生成したＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドはＲＮＡポリメ ラーゼのための鋳型を生成することなく反応を終結させるであろう。本発明方法 を説明する試みの中で、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターとターゲット核酸を含 有したプラスミドを用い他の配列の中にターゲット配列を含有した大量の一本鎖 ＲＮＡ転写体を生成した。２つの同様な反応液もまた調製した。つまりＲＮＡポ リメラーゼ不含のプラスミド含有を１つ、他方はプラスミド不含でＲＮＡポリメ ラーゼ含有の反応液である。

これらの反応液の希釈物を生成物定量のため測定した。３反応液すべての等希釈 物を２つのプロモーターブライマー、Ｔ７ｐｒｏ（＋）およびＴ７ｐｒｏ（−） 含有の増幅反応物を調製するために用いた。

表９の反応液１は６０ａモルのＲＮＡと０．６ａモルの原料プラスミドを含有し ていた。反応液２は０．６ａモルの原料プラスミドを含有していたがＲＮＡは含 有していなかった。反応液３はターゲットを全く含有しなかった。各反応液は９ ５℃で変性せず、かわりに逆転写酵素とＴ７ＲＮＡポリメラーゼを加え３７℃で ４時間インキュベートした。ハイブリディゼーション法による後のアッセイのた めに１時間毎に反応液の１部を除いた。表９に示したように、プラスミドとプラ スミドから調製したＲＮＡを含有した反応液は大きなハイブリディゼーション信 号を示した。つまりプラスミドのみを含有した反応液はＴ７ＲＮＡポリメラーゼ がプラスミドからＲＮＡをつくることができるので重要な生成物を生成し、これ は総括方法により両センスの核酸をさらに生成すめために利用できた。最後にタ ーゲットを含有しない対照（反応液３）は何も生成しなかった。

表９ 予備工程■反応速度論 時間　反応液　１２３１２３ （時間）　１０−ブ（＋）のＲＬＵ’　ｓ　プローブ（−）のＲＬＵ’　ｓ反応 液１ニブラスミド＋ＲＮＡ 反応液２ニブラスミド 反応液３：ターゲット無し 総括方法による増幅 下記の実験は他の初期化方法が本発明において第１プライマーの伸展と決定した 末端の無いＤＮＡターゲットの変性工程の必要性を緩和しうることが可能かどう かを決定するために行った。この実験では既知量のターゲットを表１０に示した ように第１逆転写酵素の存在下あるいは非存在下で増幅した。一度にすべての酵 素を加える増幅時間は４時間であった。使用したターゲットは正常生理食塩水に 希釈したＭ２Ｓ（＋）であった。Ｔ７ｐｒｏ（＋）とＴ７ｐｒ。

（−）を使用した。２５μｌの各希釈液に２５μｌの０．ＩＮＫＯＨを加えた。

サンプルを９８℃で１０分間インキュベートしついで冷却した。各サンプルを１ ００μｍにして、最終濃度を５０ｍＭトリズ？　（Ｔｒ　ｉ　ｚｍａ）塩基、４ ０ｍＭグルタミン酸、２５ｍＭ水酸化カリウム、１２．８ｍＭ塩化マグネシウム 、５ｍＭジチオスレイトール、２ｒｎＭスペルミジン三塩酸塩、２．５ｍＭ各リ ボヌクレオチドトリホスフェート、０．２ｍＭ各デオキシリボヌクレオチドトリ ホスフェート、および０．１５μＭ各プライマーとした。標準プロトコール管に １３単位の逆転写酵素を入れ４２℃で１２分間、ついに９５℃で２分間インキュ ベートし冷却した。ついですべての試験管に１３単位の逆転写酵素、１００単位 のＴ７ＲＮＡポリメラーゼおよび０．　５単位のＲＮＡ５ｅＨを加えた。反応液 を３７℃で４時間インキュベートしその１０μｍ部をケミルミネッセンスプロー ブアッセイにて測定した。表１０の結果は短縮プロトコールを用いた場合にいく らかの増幅は明らかであることを示している。観察された増幅のレベルは有意に 標準プロトコールを用いた場合よりも低度であるが、これは同程度に有効になる ように開発され得るし、あるいは有意なレベルのターゲット核酸が存在する場合 には有用になり得る。

表１０ Ｍ２Ｓ（＋）　３．８Ｅ−１７標準　２２９５４５１１／　３．８Ｅ−１９ｌｔ 　２３７４４４３／／　３．８Ｅ−２１／／　２３０２２７無　０　３０３７ Ｍ１３（＋）　３．８Ｅ−１７短縮　２４７５５７４＝、　３．８Ｅ−１９／ｌ 　２７２０９／／　３．８Ｅ−２１１７１４４ 無　０　１６７９ これらのデータのもっとも予想される説明はＴ７ＲＮＡポリメラーゼが完全には 特異的ではないということである。ターゲット領域の少数のＲＮＡコピーを生じ る低レベルのでたらめなＲＮＡ合成が存在する。これらのコピーは標準方法によ り増幅される。

我々の初期の研究はある種のプライマーセットとターゲットで外因性ＲＮＡ５ｅ Ｈなしで優れた増幅を示した。反応のメカニズムを明らかにする我々の次の研究 で、広範囲のターゲットに本方法を有効的に適用することが可能になった。我々 はここに増幅に外因性ＲＮＡ５ｅＨを用い、また逆転写酵素を伴うＲＮＡ５ｅＨ 活性に呼応する方法を開示しその権利を主張する。

我々はＥ、ｃｏｌｉ、ＲＮＡ５ｅは常に増幅を改良するわけではないので日常的 に添加されるべきではないことを発見した。我々はＲＮＡ５ｅＨのい（つかの形 態はＲＮＡ　：　ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡのどこを切断するかについての特 異的な配列であることを確定した。増幅反応において、我々は完全な長さの生成 物ＤＮＡ中のプロモーター含有プライマーを検出しなかった。２つのプロモータ ーブライマーを用いた態様ではプロモーターブライマーのうちただひとつのみが 完全な長さの生成物ＤＮＡに測定可能な限りにおいてとり込まれている。本分野 の技術者により自明なすべての他のメカニズムは両プライマーを含有する完全な 長さの生成りＮＡを示唆している。これらの発見はＲＮＡ５ｅＨが増幅の間に合 成された主要ＲＮ　Ａ種を十分には分解していないという可能性に因ると思われ る。これらの発見に基づいて、ＲＮＡ５ｅＨ配列特異性に関する我々の発見を組 み入れた新しい増幅メカニズムがここに提示される。

新規で有用なプロモータープライマー設計標準を開示する。さらには、ターゲッ ト核酸配列の複数コピーを合成する新規な方法をここに主張し、これは １）選択されたＲＮＡ５ｅ　Ｈによる分解にさらされた後にプライマー伸展生成 物を形成する能力を残すように位置しているＲ　Ｎ　Ａターゲットの部分と複合 化するＲＮＡターゲット配列の部分に相補であるプライマーを選択し； ２）すべてのメツセンジャーＲＮＡが実質的にＲＮＡ５ｅ　Ｈの分解を通して二 重鎖から除かれる領域においてＤＮＡと複合化するプライマーの伸展により得ら れるＩ）ＮＡの部分に相関であるプロモーターブライマーを選択し； ３）ＲＮＡターゲットとプライマー、プロモーターブライマー、ＲＮＡ５ｅＨ， 逆転写酵素をコンバインし、ＲＮＡの複数コピーとそのＲＮＡに相補のＤＮＡの 複数コピーを形成することを特徴とする。ここで開示の新規な方法はＲＮＡター ゲット配列と同じ極性（あるいはセンス）のＤＮＡの実質的に等数のコピーを作 らない。

この工程は新規なターゲットサイトのための優れたプロモーターブライマーとプ ライマーの設計を可能にする方法を提供する。我々はプロモーターブライマーと プライマーのそのような組み合わせおよびそのための設計標準をここに開示し主 張する。ここで開示のメカニズムはＲＮＡ鎖の転写のための新規な反応中間体を 包含する。

この中間体は二重鎖ＤＮＡプロモーター領域を含むＲＮＡとＤＮＡの二重鎖複合 体である。我々の知る限りこのようにものはかつて文献に記載された事はない。

実にどの先行技術システムも、特にグアテリ、Ｊ、Ｃ，らの８７　ＰＮＡＳ　１ ８７４〜１８７８　（１９９０）もまたジンゲラス、ＴＲ０らのＰＣＴ出願番号 ８８／１０３１５号のいずれもＲＮＡ５ｅＨ分解サイトの位置に基づいてプライ マーとプロモーターブライマー配列を適切に選択していない。このように、本方 法は新規でありどの先行開示に対しても自明なものではない。

ＲＮＡ５ｅＨ配列特異性の重要さと反応メカニズムの理解の認識は本ターゲット 増幅法を広範囲のターゲット配列に有効的に適用ための鍵である。さらに、従来 同業者はＲＮＡ５ｅＨは十分にまた組繊的にＲＮＡ：ＤＮＡ複合体のＲＮＡ鎖を 分解しているとしていた。

Ｉ：増幅法のメカニズム 増幅効率を画先行方法と調べると使用したプライマーセットでのわずかな変動を 伴う増幅効率に大きな変異が明らかとなった。先行技術が一般に受け入れている 反応方法は我々の見るところでは、なぜ１つのプライマーセットが他よりずっと 優れて作用するのか合理的な説明をしていない。

先行技術方法を用いて増幅法を改良する試みでは満足出来る結果が得られなかっ た。ＤＮＡ鎮を初期化する能力での差がプライマーセット効率でみられた差の原 因かどうか知るためにブライミングの有効性を調べた。プライミング効率と総体 的増幅の間に相関性はみられなかった。プライマーセットの自己相補構造と交差 相補構造を形成する能力の分析によりプライマー効率に於ける差はこれらのファ クターに単に原因があるのではないと判明した。

我々はまたＥ、ｃｏｌｉ、ＲＮＡ５ｅ　Ｈの添加が均一に増幅を改良するのでは ないことを発見した。ここで提示するたデータが示すように、得られた結果はタ ーゲットからターゲットで、またブラ保たなければならない。与えられたターゲ ットとプライマーセットと共に、Ｅ、ｃｏｌ　ｉ、ＲＮＡ５ｅ　Ｈの添加は逆転 写酵素がトリ骨髄芽球細胞症ウィルス（ＡＭＶ）由来のものでありモロニーマウ ス白血病ウィルス（ＭＭＬＶ）でない場合には有利である。これらの結論を示す データを下記に記す。

初期の研究ではＡＭＶ逆転写酵素はウィルス複製の間に形成されたＲＮＡ：ＤＮ ＡハイブリッドからＲＮＡを消化する時に比較的大きなフラグメントを残すこと が示唆された。これらのフラグメントはプライマーとして第２ＤＮＡ鎖の合成を 初期化する。我々はＡＭＶとＭＭＬＶ　ＲＮＡ５ｅ　Ｈ活性の配列特異性の証拠 があるという発見をここに報告するものである。

反応メカニズムを明確にするために、個々のプライマーの末端を３２Ｐで標識し 、各プライマーのＤＮＡ生成物へのとり込むをポリアクリルアミドゲル電気泳動 により調べた。一般的に受け入れられている先行技術メカニズムによれば、両プ ライマーは完全な長さのＤＮＡ生成物にとり込まれていることになる。しかしな がら我々の実験では増幅の間に合成された主要ＲＮＡ種に相補するプライマーの みが完全な長さの生成物にとり込まれていた。主要ＲＮＡ鎖と同じ極性を持つプ ライマーは決して完全な長さのＤＮＡ生成物にとり込まれなかった。事実、それ は全く小さいままで残った。これらの結果は多数の異なるターゲットとプライマ ーセットで確認された。

プライマーの一つの伸展を検出出来なかったことから、完全な二重鎖ＤＮＡ中間 体は増幅の間に蓄積しないこと、また口触増幅には要しないことが示唆された。

これらの観察はＲＮＡ５ｅＨの可能な配列特異性を考慮した本発明の増幅システ ムのメカニズムを示唆する。本メカニズムを大まかに図４に示す。

実験により酵素がＲＮＡ　：ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡを特殊な切片に切断す ることが判明した。さらに、切断サイトの位置は特異な領域にあることが判明し た。メカニズムを確認するために、我々のＴ７ｐｒｏ“／Ｔ７ｐｒｏ−ターゲッ トとプライマーセットの組み合わせから生じたプラス鎖ＲＮＡを含有したＲＮＡ 　：ＤＮＡハイブリッドを調製した。３２ｐＨｌｌ識ＲＮＡをメツセンジャーＤ ＮＡにハイブリッドし、ＡＭＶ逆転写酵素（付随するＲＮＡ５ｅＨ活性を含有し ている）とインキュベートし反応生成物をポリアクリルアミドゲル電気泳動で分 析した（図５）。フラグメントの大きさから数個の小さな切片が生成しこれらは １つあるいは両方の末端の近くを切断して生成したことが判明した。分子の内部 部分は切断されなかつた。この実験は酵素が使用した反応条件下で配列あるいは 構造特異性を持つことを示している。結果は図４の反応メカニズムと完全に一致 する。

切断サイトがどこで起こるかを決定するためにさらに実験を行った。複数切断サ イトはプロモーター含有プライマーと一致する領域にあり他のプライマーを結合 する領域には無いことが望ましい。ＲＮＡ末端を個々に標識し消化生成物を分析 することにより、使用した条件下で切断はＲＮＡの５′末端のみに検出されるこ とが判明した。これは図４のメカニズムと一致する。

ＡＭＶおよびＭＭＬＶ逆転写酵素のＲＮＡ５ｅＨ活性が切断する配列を調べるた めに配列決定実験を行った。特異的に各々の酵素で切断されることにより配列は 識別される。予測通り、２つの酵素の配列特異性は異なりこれはあるプライマー セットは一つの酵素とまた別のプライマーはもう一つの酵素とより機能すること を説明すると思われる。我々の反応条件下でＭＭＬＶ酵素で得た配列特異性は文 献に記載の別の反応条件下でのものと一致しない。これは特異性は反応条件によ り影響され得ることを示唆している。

増幅メカニズムに於けるＲＮＡ５ｅＨの役割の詳細に調べるとｃＤＮＡコピーか らの転写を指示するプロモーターの完全な除去は必要でなく、あるいは新規の転 写活性鋳型の形成に望ましいという我々の発見に達した。つまりいくつかの適用 に於いては、もしＲＮＡ５ｅＨがプロモーターブライマーが第１鎖ｃＤＮＡ生成 物にアニーリングする上でさらにサイトに選択的であれば、またもし他のプライ マーが転写物にアニーリングするのにもっと阻害しなければ、逆転写酵素固有の ＲＮＡ５ｅＨ由来の非常に低レベルのＲＮＡ５ｅＨ活性でさえ効果的な増幅に十 分であろう。

Ｅ、ｃｏｌ　ｉ、ＲＮＡ５ｅ　Ｈはレトロウィルス酵素よりも伝えられるように 特異的でないので、特にもしこのプライマー、ターゲット、Ｅ、ｃｏｌｉ、ＲＮ Ａ５ｅ　Ｈ，および酵素活性に影響を及ぼす成分の濃度が慎重に釣り合っていな い場合には、非プロモーター含有プライマーが結合している領域に割って入るか もしれない。我々の見るところ、これらの結果はＥ、ｃａｌ　ｉ、ＲＮＡ５ｅ　 Ｈの使用を商業的な分野での適用に適しなくしている。逆転写酵素ＲＮＡ５ｅＨ が所望の領域で切断しない場合や適した条件下で切断しない場合には、異なる特 異性を持つ他のＲＮＡ５ｅＨ活性の添加は有効である。例えば、ＭＭＬＶ逆転写 酵素での研究により、この酵素はＡＭＶ酵素よりもサンプルＤＮＡによる阻害に 敏感でないことが判明した。多くのシステムに於いてこれは最良の様式である。

新しいプライマーセットが設計され、模型と我々が今までに得たＲＮＡ５ｅＨ配 列特異性情報に基づいて開示される。メカニズムや配列特異性の知識がない以前 に設計されたもので得たものよりも、有意に優れた合成がこれらのプライマーセ ットから得られた。ここに記載の本発明は特異的なターゲット領域の為の機能的 なプライマーセットの設計を可能にする。

我々が開示する新しいメカニズムはＲＮＡ鎖の転写の為の新規な反応中間体を包 含する。この中間体はＲＮＡとＤＮＡの二重鎖複合体であり、これはまた二重鎖 ＤＮＡプロモーター領域を包含する。

我々の知識ではこの反応は述べた通りどの先行技術とも異なる。

反応メカニズムを理解することはこれらのターゲット増幅工程を使用する上で重 要である。ＲＮＡ５ｅＨ配列特異性の重要性を認識することは本ターゲット増幅 法を広範囲のターゲット配列に有効的に適用する上での鍵である。一方、プロモ ーターブライマー設計の実験的研究は困難で経費がかかり、また成功の頻度も低 （て本発明をこの分野での貴重な進歩とする。

べたように大量の合成が特殊なターゲットとプライマーセットで得られるために 当初は好ましい態様とみなされていた。またＥ、ｃ。

］　ｉ、ＲＮＡ５ｅ　ＨはサンプルＤＮＡによる阻害を克服するのを助長する上 で有用であると発見された。しかしながら、反応の分析によりＥ、ｃｏｌ　ｉ、 ＲＮＡ５ｅ　Ｈの添加は多（の場合に増幅に不利益であることが判明した。さら に過剰量あるいは過小量の旦工ｅｏｌ　ｉ、ＲＮＡ５ｅ　Ｈの存在は有害なので その添加量は狭い範囲内だ注意深く調整されなければならない。本方法を実用的 に商業上適用するにあたっては、特に酵素が保存にあたって完全に安定でないか も知れないためにこれは重大な障害である。さらにＥ、ｃ。

±１．ＲＮＡ５ｅ　Ｈの使用によりこのシステムに過大な経費と煩雑さが加わる 。経費は多くの商業的適用にとっては禁制である。Ｅ。

ｃｏｌｉ、ＲＮＡ５ｅ　Ｈの使用はアッセイをさらに複雑にし、その代わりに研 究開発経費を上昇せしめこのアッセイを広範囲の商業的適用にとって繊細すぎる ものとしてしまう。このようにアッセイメカニズムに対する我々の説明は技術的 に実行可能（ターゲットサイトへの適用性）でまたより安価でより丈夫な工程で ある点において広範囲の使用に適した方法に帰着した。初期の実験でＥ、ｃｏｌ ｉ、ＲＮＡ５ｅ　Ｈの添加が増幅上昇を起こすことが判明したので、血清やヒト ＤＮＡを含有したサンプルでの増幅システムの実行に及ぼすＥ、ｃｏｌｉ、ＲＮ Ａ５ｅ　Ｈの効果をいくつかの実験で調べた。

実施例１１ Ｅ、ｃｏｉｉ、ＲＮＡ５ｅ　Ｈ濃度の最適化血清での最適増幅に必要なＥ、ｃｏ ｌ　ｉ、ＲＮＡ５ｅ　Ｈ量を決定するために実験を行った。下記の実験はＴ７ｐ ｒｏ”／Ｔ７ｐｒ０−プライマ一対テｃ７）０，０．　２５．０．５および１１ １位（７）ＲＮＡｓｅＨ存在下で増幅を比べた。ＨＢＶ−ヒト血清のレベルまで 希釈したＨＢＶ十血漿あるいはＨＢＶ−血清を単独で調べた。

１０μｍの血清を当量の０．　ＩＮ　ＫＯＨに加え蒸発を防ぐために油層で覆っ た。サンプルを混合し９５℃で加熱し室温まで放冷した。サンプルを９０μｍの 反応容積にして最終濃度を５０ｍＭトリス酢１１ｐＨ７，６，２０，８ｍＭＭｇ Ｃ］２．５ｍＭジチオスレトール、２ｍＭスペルミジン塩酸塩、０．１５μＭ各 プライマー、６゜２５ｍＭ　ＧＴＰ、６．２５ｍＭ　ＡＴＰ、２．５ｍＭ　ＵＴ Ｐ、２゜５ｍＭ　ＣＴＰ、０．２ｍＭの各ｄＴＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ。

ｄＣＴＰ、および１３単位のＡＭＶ逆転写酵素とした。サンプルを混合し３７℃ で１２分間加熱しついで９５℃まで加熱してさらに室温まで冷却した。１３単位 のＲＴと１００単位のＴ７ＲＮＡポリメラーゼを加え反応混合物を３７℃で３時 間インキュベートする。２５μｍの各反応混合物を測定した。

の各反応毎に０．２５単位のＥ、ｃｏｌ　ｉ、ＲＮ、Ａｓｅ　Ｈ付近を中心とし た狭い最適範囲にあることが判明した。Ｅ、ｃｏｌｉ、　ＲＮＡ５ｅＨは使用が 困難ではあるけれどもい（らかのＲＮＡ５ｅＨ活性の添加はこの実験で有用であ る。

表１１ ターゲット（モル）　ＲＮＡ５ｅＨ（単位）　実測ＲＬＵ５Ｘ１０−２０　０　 ５６７８０９ ５Ｘ１０−”　１８０４１ ５Ｘ１０−”　２９３８ ５Ｘ１０−２０　０．２５　１１５３３６６５Ｘ１０−２２　７３２１０９ ５Ｘ１０−”　５５６６ ５Ｘ１０−２０　０．５　１００１９０４５Ｘ１０−２２　２９５９６ ５Ｘ１０−”　１．０　６１０４８５ ５Ｘ１０−”　１３０２６ ５Ｘ１０−”　４０６２ ＮＡｓｅＨの量を８μｇのヒトＤＮＡを含有した溶解産物の存在下または非存在 下で測定した。２Ｘ１０−”モルのウィルスターゲットが各反応混合物に存在し た。ＤＮＡターゲットは５０μモルの各プライマーと４０ｍＭ）リス塩酸ｐＨ８ ，３，２５ｍＭＮａＣ］、２０．８ｍＭ　ＭｇＣｌ、、５ｍＭジチオスレイトー ル、２ｍＭスペルミジン塩酸塩および表１１に示したヌクレオチドトリホスフェ ートの存在下混合し、９５℃まで加熱し室温まで冷却した。１３単位の逆転写酵 素を加え反応混合物を４２℃まで１２分間加熱し、９５℃まで加熱し再び室温ま で冷却した。１３単位のＡＭＶ逆転写酵素と１００単位のＴ７ＲＮＡポリメラー ゼを加え３７℃で３．５時間加熱した後測定した。

表１２ −　〇　単位　８，４００ −　０．５　２３９．０００ −　１．０　４６８．０００ 〜　１．５　４９８．０００ −　２．０　４３９，０００ −　３．０　２０，１００ −　４．　０　５，８０６ ＋　１．　０　６，６３５ ＋　１．　５　５７９ ＋　２．０　１３．４００ ＋　３．０　１７，８００ ＋　４．０　９，１５２ これらの結果はＥ、ｃｏｌｉ、ＲＮＡ５ｅ　Ｈレベルは過剰量のＥ、ｃｏｌｉ、 ＲＮＡ５ｅ　Ｈが増幅に有害なので注意深く調整されなければならないことを示 している。さらに最適濃度は非特異ヒトＤＮＡの存在により変化し、ヒトＤＮＡ による阻害はすべてのＲＮＡ５ｅＨレベルで重大であった。

実施例１３ 大腸菌ＲＮＡ５ｅＨの、ＨＩＶ領域２と称する第２領域の増幅への効果を調べた 。以下のデータは大腸菌ＲＮＡ５ｅＨが狭い濃度範囲で増幅を促進することを証 明している。ＨＩＶ領域２プライマーは表１２に関して述べたように、種々の濃 度の大腸菌ＲＮＡ５ｅＨの存在下で増幅された。各反応混合物１０μｌを分析し 、必要に応じて希釈した。生成した標的（ターゲット）を定量するために、シグ ナルを標準曲線と比較した。

ＲＮＡ５ｅＨ標的（ｐＩｇｏｌ）　生成物（ｐｍｏｌ）　増幅の観測値１．６７ 　Ｘ　１０弓’　２，１４　１．３　Ｘ　１０”０．２　Ｕ　１．６７　Ｘ　１ ０−１’　０．１７　１．ＯＸ　１０’０．４　Ｕ　１．６７　Ｘ　１０−”　 ０．１８　１．Ｉ　Ｘ　１０”１．２　Ｕ　１．６７　Ｘ　１Ｏ−ＩＱ　Ｏ，０ １２７，６Ｘ　１０’１．６７　Ｘ　１０−”　１６．０　９．６　Ｘ　１０” ０．２　Ｕ　１．６７　Ｘ　１０−”　２０．６　１．２　Ｘ　１０’０．４　 ｔｉ　１．６７　Ｘ　１０−’　０．１４　８．５　Ｘ　１０’１．２　Ｕ　１ ．６７　Ｘ　１０−’　０．１５　９．０　Ｘ　１０’これらのデータは、ガテ リら（Ｇｕａｔｅｌｌｉ、８７　ＰＮＡＳ　１８７４−１８７８）の説とは逆に 、大腸菌ＲＮＡ５ｅＨを加えなくとも増幅が達成され得ることを示している。

本発明者らは幾つかの標的領域で大腸菌ＲＮＡ５ｅＨとＭＭＬ〜ｒ逆転写酵素と を用いて調べた。実施例１２に記載の条件下、ヒトＤＮＡ８μｇの存在下または 非存在下、３時間の自己触媒工程の反応を行った。Ｈ１ｖ領域１．３および４か らのプライマーセットを試験した。使用するウィルス性鋳型は、ハイブリダイゼ ーションアッセイでＲＬＵが直線領域にあるよう選択した。ＭＭＬＶ逆転写酵素 を、開始時４０００．増幅期８００Ｕで用いた。Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼも含 有させ、大腸菌ＲＮＡ　ＩＵを指示の通り加えた。最上欄の＋ＲＮＡ５ｅＨ，− ＲＮＡｓｅＨの項の下の値はアッセイ反応液１０μｍに関して得たＲＬＵ値であ る。

表１５ 標的領域　標的（ｍｏｌ）　ヒトＤＮＡ　↓ＲＮＡ５ｅＨ−ＲＮＡｓｅＨＨＩＶ 領域１　２　Ｘ　１０−２＋５４．９００　１３７，０００ＨＩＶ領域１　２Ｘ １０””　８ａｇ　１５，１００　１３，８００１１１Ｖ領域３　２　Ｘ　１０ ”　−９６，１００３９１，０００ＨＩＶ領域３　２　Ｘ　１０−”　８　ＩＩ ｇ　１２４．０００　２４６．０００ＨＩＶ領域４　２Ｘ１０−”　２０．４０ ０　１０７．０００ＲＩＶ領域４　２　Ｘ　１０−”　８　＃ｇ　５６，０００ 　８，８００Ｄ　Ｎ　、Ａ、の存在下、大腸菌ＲＮ　Ａ　ｓｅ　Ｈは明らかにＨ ＩＶ領域４プライマーによる増幅を刺激した。試験した大多数の場合、ＭＭＬＶ 逆転写酵素単独使用の場合の増幅は、少なくとも、ＭＭＬＶ逆転写酵素と大腸菌 ＲＮＡ５ｅＨの併用時と同様に良好であった。ガテリら（Ｇｕａｔｅｌｌｉ、８ ７　ＰＮＡＳ　１８７４−１８７８）の説とは逆に、効率的な増幅は大腸菌ＲＮ Ａ５ｅＨを必要としなかった。

逆転写酵素の配列特異性 本発明者らは、あるプライマーセットは、ＡＭＶ逆転写酵素と併用するとその作 用が最良となるのに対し、他はＭＭＬＶ逆転写酵素との併用、またはいずれか１ つの逆転写酵素に大腸菌ＲＮＡ５ｅＨを添加した時その作用が最良となることを も見いだした。ブロモータ−プライマーおよびプライマーまたは大腸菌ＲＮＡ５ ｅＨの起源を少し変化した場合の、増幅効率の変動の観測値は本発明機構を支持 している。これらの発見を支持する詳細なデータを以下に記載する。

ＭＭＬＶ逆転写酵素はクローン化されており、３００単位／μ１以上の高濃度で Ｂ　ＲＬ　（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｓ）やＵ、Ｓ、　Ｂ ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓから購入することができる。注意すべき点は、ＭＭＬＶ 逆転写酵素の天然の核酸鋳型に対するＤＮＡ合成活性は、ＡＭＶ逆転写酵素との 比較で、約１０倍高い単位濃度で得られることである。

単位活性における類似性の欠如は、ホモポリマー鋳型（単位活性アッセイに使用 ）を用いた場合と、ヘテロ重合核酸鋳型を用いた場合に酵素が異なる相対活性を 示すことによる。本発明における増幅反応において、種々の濃度のＭＭＬＶ逆転 写酵素を用いて試験した。これらの結果の例を以下の表に示した。ＡＭＶ逆転写 酵素試料の場合、開始段階で逆転写酵素を１４Ｕ用い、増幅段階で５６Ｕ用いた 。開始段階および増幅段階におけるＭＭＬＶ逆転写酵素量を測定した。

ＨＩＶ領域２プライマー各１５ｐｍｏｌを用い、ＮａＣ１の代わりに２５ｍＭ　 ＫＣＩを用いる外は、実施例１２記載のインキュベーション条件を用いた。Ｔ７ ボリメラーゼ４００Ｕを増幅期間中に用いた。ヒトＤＮＡ８μｇの存在下または 非存在下に行った結果を以下の表に示す。ＡＭＶまたはＭＭＬＶで示した欄は、 それぞれＡＭＶ逆転写酵素またはＭＭＬＶ逆転写酵素による増幅作用の結果を示 す。数字は開始、および自己触媒期間のそれぞれにおいて用いた値（単位）を示 している。表中の値はＲＬＵである。増幅生成物は希釈されておらず、用いた条 件下で約２５０，０ＯＯＲＬＵを与えるに十分な濃度のハイブリダイゼーション 標的でシグナルが飽和するので、〉２００．０ＯＯＲＬＵの値では増幅程度が有 意に低く見積もられているかもしれない。

表１６ ヒト　ＡＭＶ　ＭＭＬＶ　ＭＩＩＬＶ　ＭＭＬｖ標的（ｍｏｌ）　ＤＮＡ　１４ １５６　４００／４００　４００／６００　４００／８０００　４９５　４７０ 　３．８００ １、６　Ｘ　１０−”　−２７８，０００７７、０００５，６２１１，６Ｘ１０ −”Ｏ−２９２，０００２７８，０００−２６９，００００＋　４７４　５４７ 　４８８　１．３５２１．６ｘｌＯ−２０＋　１０．２００　６２．７００　２ ０５，０００　１４９，０００ヒ１−ＤＮＡの非存在下におけるＭＭＬＶ逆転写 酵素の指令による増幅の感度はＡＭＶ指令による増幅よりも有意に低いが、外因 性ＤＮＡの存在下ではＭＭＬＶは非常に有効であった。

ＨＩＶ領域２の高レベル増幅を観察した後、本発明者らはＡＭＶ逆転写酵素を用 いてヒトＤＮＡの存在下、他の標的領域を試験した結果、これらの領域の最良の 増幅には大腸菌ＲＮＡ５ｅＨがなお必要であることを見いだした。次いで、大腸 菌ＲＮＡ５ｅＨの非存在下、ＭＭＬＶ逆転写酵素を用いて各領域の増幅を試験し 、ＡＭＶ逆転写酵素十大腸菌ＲＮＡ５ｅＨを含有する反応での増幅と比較した。

これらの結果の幾つかを以下の表に示した。実施例１２の記載に従ってＨＩＶ領 域３および４プライマーを用いた（５０　ｐｍｏｌ／反応）。ＡＭＶ逆転写酵素 を用いる反応では開始に際して１４Ｕ用い、増幅に際して逆転写酵素５６Ｕ十大 腸菌ＲＮＡ５ｅＨＩＵを用いた。ＭＭＬＶ逆転写酵素を用いる反応では開始に際 して４００Ｕ加え、増幅に際して８００Ｕを加えた。４時間の増幅インキュベー ション期間中、全反応混合物中にＴ７ポリメラーゼ４００Ｕを存在させた。表中 の値は増幅反応混合物１０μｌを用いて行った、ホモジーニアスブロテクション アッセイで得たＲＬＵ値である。アッセイ前に反応混合物を希釈した場合もある 。

表１７ ！ニド　ＨＩＶ領域３　ＨＩＶＱ域４ 標約４標的ｌ）　ＤＮＡ　ＡＭｖＭｉｌＬＶ　Ａ）ＩＶ　ＭＭＬＶＯ−２，０４ ９７５１１，１８４７７７１，６Ｘ１０−”！　−７０，８００６８９２，ｌＸ １０’　３０５，０００１．６　Ｘ　１０−”　−５１０，０００１，８６９０ ＋　５５１　４００　１．０５８　１．１ｇ２１、６　Ｘ　１０−”ｌ　＋　− １３，９００１６，２００１，６Ｘ１０−”　＋　７０６　１．８６２　１４１ ，０００　１５４．０００１．６Ｘ１０−１’　＋　−−６８３，０００７２３ ，０００１，６ｘ　１０”　＋　１０．８００　１１５．０００ＨＩＶ領域２で 観察されたように、ヒトＤＮＡの非存在下ではＭＭＬＶによる増幅はＡＭＶ逆転 写酵素十大腸菌ＲＮＡ５ｅＨによる増幅よりも有意に低いが、ＤＮＡの存在下で はＭＭＬＶによる増幅は少なくともＡＭＶ逆転写酵素＋ＲＮＡ５ｅＨ，４２によ って達成される増幅と同じく良好であった。

実施例１４　８ＢＶゲノムの第２領域のためのプライマー以下の実験はＨＢＶゲ ノムの２つの領域に向けたプライマーセットを用いて行われた。データはプライ マーセットがＡＭＶ　ＲＴと同程度には増幅しないことを示している。実験はＨ ＢＶ陰性血清で希釈した陽性血漿を用い、実施例１１記載のごとくに行った。増 幅反応混合物１０μｍをハイブリダイゼーションアッセイに付した。

表１８ ＲＬＵ観測値 標的（ｍｏｌ）　ＨＩ　Ｖ領域Ｉ　ＨＩＶ領域２４．８　Ｘ　１０”　６９０， ６７４ ４、８　ｘ　１０”　４７５．８４９　７３．１１４４、８　Ｘ　１０−２３２ ４２．４５２　４．１９３０　１、４１７　１．９４０ これらの結果を標準的なプロトコールを用いる追加実験で確認した。領域１プラ イマーはこれらの実験でも高いＲＬＵであり一致した結果を示した。

対照的に、同じ２つのプライマー対の増幅にＭＭＬＶ酵素８００Ｕを用いると、 下記表に示すように反対の効果が認められた。

表１９ ＲＬＵ観測値 標的（ｍｏｌ）　領域１　領域２ ９、６　Ｘ　１０−”　３７．２７８　１．０６７、９５１９、６　Ｘ　１０− ２”　１．８５８　４０．８２６０　１、０１０　１．６４に の実験では、各反応混合物中に血清５μｌが含有されていた。

このように、各プライマー対の増幅能力は増幅期間中存在する逆転写酵素の影響 を受けた。鋳型配列の利用可能性等のファクター、プライマーの特異的ハイブリ ダイゼーション能力、およびＲＮＡ合成の効率に対する逆転写酵素の影響は有意 でない。ＲＮ　Ａ　ｓｅＨの特異性や活性、およびＤ　Ｎ　Ａのポリマー化活性 にも影響しないであろう。

下記のデータは、適当な条件下でプロモーター−プライマーを組合せて用いると 増幅が増大することを例示している。

この実験は、全増幅反応をハイブリダイゼーション法で分析したことを除き、表 １１の項で述べたと同様に行った。

表２１ １２００　２　Ｘ　１０−”　１．０９４．１７７１２０　２　Ｘ　１０−”　 ４４２．１３７１２　２　ｘ　１０−”　２４，０５３１．２　２　Ｘ　１０− ２４　８．６５４０　０　１、８２８ 実施例１５　Ａ、ＭＶ逆転写酵素とＭＭＬＶ逆転写酵素の比較以下の実験はＭＭ ＬＶ（３００単位）またはＡＭＶ（３９単位）を用いてＣＭＬ患者の染色体に発 見されたＢＣＬ−２染色体転座主要ヒト染色体ブレイクポイントｔ（１４；１８ ）のためのプライマーの増幅に関する比較実験である。各酵素について、大腸菌 ＲＮＡ５ｅＨの作用を評価した。増幅は２４ｍＭ　ＭｇＣｌ２およびプライマー 各５Ｑｐｍｏｌを用いる外は実施例１２記載の方法に従って増幅を行った。溶解 液（リゼート）を含有する反応液には白血球由来のＤＮＡ４μｇが存在していた 。全反応混合物はＴ７ＲＮＡポリメラーゼ３００単位とインプット２本鎖ＤＮＡ 標的ＩＱａｍｏｌを含有していた。

匡主ｌ ＲＴ　溶解液　０単位　０．５単位　１．０単位　２．０単位ＲＮＡ５ｅＨＲＮ Ａ５ｅＨＲＮＡ５ｅＨＲＮＡｓｅＢＡＭＶ　−１０８，０１８２，０３５，３７ ７−＋　４４．４８５　２０４，８９４　１６５．９７２　１３６．６４７ＭＭ ＬＶ　−３，０１５，９４８２，２２４，６６６−＋　３，０７０．１３６　２ ．７１４，２５７　７６７．２１８　１０５，８４５結果はＭＭＬＶおよびＡＭ Ｖ　ＲＴが、特に大腸菌ＲＮＡ５ｅＨの非存在下では、同程度にこのプライマー セットを増幅しないことを示すものである。ＡＭＶ逆転写酵素を含有する反応混 合物に大腸菌ＲＮＡ５ｅＨを加えると増幅が顕著に増大する。このことはこれら の反応ではＲＮＡ５ｅ活性が制限されていることを示唆するものである。

逆に、ＭＭＬＶ　ＲＴを含有する反応混合物に大腸菌ＲＮＡ５ｅＨを加えても増 幅は促進されなかった。これらのデータによっても、以前に、ＭＭＬＶ　ＲＴに は、大量の非特異的ヒトＤＮＡの存在下での有意な増幅を維持する能力があると いう指摘が確認された。

０、　１つのプライマーは完全長さの生成物には取り込まれない本発明者らの最 も重要な発見の１つは、主ＲＮＡ種と同じ極性を持つプライマーが検出可能な程 度には完全長さの生成物に取り込まれないということであった。このことを証明 するために、個々のプライマーを３！Ｐで末端ラベルし、各プライマーのＤＮＡ 生成物への導入をポリアクリルアミドゲル電気泳動で調べた。本発明者らは、当 初、両プライマーが共に完全長さのＤＮＡ生成物に取り込まれると予測していた 。しかしながら、プロモーターを含有するプライマーは完全長さのＤＮＡ生成物 中に見い出すことができなかった。実際、それは非常に小さいままであった。こ れらの結果は多くの異なる標的およびプライマーセットによって確認された。本 発明者らの方法を以下に説明する。

自己触媒期間に蓄積されたｃＤＮＡの種を同定するためにプライマーの５°末端 をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで１１２ｐラベルし、増幅反応混合物に打ち込 んだ（スパイクした）。以下の実施例は、１つの極性のプライマーが増幅の間に 優先的に蓄積され、その蓄積される鎖は常に、自己触媒中に合成された優勢なＲ ＮＡ種と相補的な鏑であることを示している。図５は増幅期間中に３２ｐラベル ＨＩ■領域２が取り込まれたという結果を示す。このプライマーセットから、（ ＋）センスの２１４塩基からなるＲＮＡが得られた。ＲＮＡに相補的なプライマ ーは、標的配列の存在下、２３５および２１４塩基の主バンドに取り込まれた（ レーン３）。標的非存在下では完全長さの断片は見られなかった（レーン４）。

２１４塩基の断片はＲＮＡと同長のｃＤＮＡを表しているが、２３５塩基断片は ＲＮＡ十７７プロモーター配列（２１塩基）を表している。逆に、このプロモー タープライマーは標的存在下、または非存在下における完全長さＤＮＡ生成物に は観察されなかった（それぞれレーン１および２）。

図５のレーン５−８は増幅期間中の３２ｐラベルＨＢＶ領域１プライマーの導入 結果を示している。これらはＴ７ｐｒｏ”およびＴ７ｐｒｏ−として知られてい る。このプライマーセットは２極性を有する１３２塩基ＲＮＡを産生し得るが（ ＋）鎖ＲＮＡが優勢である。優勢なＲＮＡに相補的なＴ　７　ｐｒｏ−は本発明 で提供した機構の通り、１３２塩基および１５３塩基の断片に取り込まれた（レ ーン７、（＋）標的：レーン８、（−）標的）０１５３塩基断片はＴ　７　ｐｒ ｏ”のＲＮＡ十７７プロモーター配列（２１塩基）を表している。逆に、！２ｐ ラベルＴ　７　ｐｒｏ”プライマーはいずれの長さの断片にも取り込まれなかっ た（レーン５、（＋）標的；レーン６、（−）標的）。

ゲル電気泳動で分析した反応混合物をＨＰＡによって分析し、優勢なＲＮＡと同 じ極性のｃＤＮＡを別の方法でも検出できるかを調べた。作成された鎖の相対比 率を決定するためにプラスおよびマイナス鎖プローブを用い、各反応混合物の一 部をＲＮ　Ａ　ｓｅＡで処理してＲＮＡとＤＮＡの比率をめた。結果を以下に示 す。

表２３ プローブの極性　プライマーセット　ＲＬＵ　ＲＬＵ未処理　ＲＮＡ５ｅＡ （−）　＊ＨＩＶ領域２　６７９，１８２　１．０３７＊ＨＩＶ領域２　４５３ ，６７５　１．４６４（＋）　＊ＨＩＶ領域２　３２．９２２　１，０９４．２ ４９＊ＨＩＶ領域２　３９，４９４　６５５．５９５（−）　＊ＨＢＶ領域１　 ５６７．１１０　４，８５４ＨＢ　Ｖ領域１　６７１．６５６　４．２１０（＋ ）　＊　ＨＢ　Ｖ領域１　５６．５５０　３０３，１６０ＨＢＶ領域１　７７． ９８３　４５０．３３２＊　＝　３２　ｐラベル（＋）鎖プライマー、その他、 ３２ｐラベル（−）鎖。

これらの結果は完全長さの生成物がプロモーターブライマーで観察されない場合 でも増幅が十分に作動していたことを示すものである。これらの結果は従来の研 究において観察されたこと、即ち、１個のセンスプローブで観察されるシグナル の大多数はＲＮＡに由来していること、そして相補的な鎮シグナルは予測通りＤ ＮＡに由来する、ということに関連している。両極性のＲＮＡから作成されたＨ ＢＶ領域１プライマーセットについてさえ、このことは正しい。

Ｄ　酵素がＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドの特異的部位を切断するということを示 す機構の確認 上記の実験および観察結果に基づいて、ＲＮＡ５ｅＨ中にあり得る配列特異性を 考慮した増幅システムを図４に示した。この機構をサポートする上で重要な要素 はＲＮＡ５ｅＡ配列特異性であることから、酵素が実際にＲＮＡ：　ＤＮＡハイ ブリッドを特異的な部位で切断するということを示す必要がある。しかもこの切 断部位は、良好な増幅のためには、モデルにしたがって、特異領域内に存在して いなければならない。この疑問を解くために、既知の標的とプライマーセットの 組み合わせで生成されるＲＮＡ：　ＤＮＡバイブリドを調製した。

ＲＮＡを３２ｐでラベルしＡＭＶ逆転写酵素（その関連ＲＮＡ５ｅＨ活性を含有 する）と−緒にインキュベーションし、反応生成物をポリアクリルアミドゲル電 気泳動で分析した。結果は、新規な反応機構と完全に一致していた。即ち、断片 のサイズは、数個の小片が生成しこれらは１方または両方の端付近で切断されて 生成したものであることを示していた。分子の内部領域は切断されていなかった 。この実験で、用いた反応条件下で酵素が配列または構造特異性を有することを 確認した。

提供した機構においてはプロモーター含有プライマーが結合する領域で複数の切 断が起きることを必要とするので、切断の起きる位置を決定するためにさらに実 験を行った。個別にＲＮＡの末端ラベルし、消化生成物を分析することで、それ らの切断がＲＮＡの５′末端においてのみ起きることが示された。これはまた提 供した機構と一致することである。

実施例１６ 図６は特異的ＲＮＡ５ｅＨ開裂部位における、ＡＭＶ、ＭＭＬＶおよび大腸菌切 断由来のＲＮＡ５ｅＨ活性を示す。図中の矢印は完全長さＲＮＡの位置を示す。

図６は３２ｐで内部標識したＨＩＶ領域２を１重鎖配列とハイブリダイゼーショ ンしＡＭＶ由来ＲＮ　Ａ　ｓｅＨで４５分間（レーン２）、ＭＭＬＶ由来ＲＮＡ ５ｅＨで５．１５．４５または１２０分間（レーン３−６）　、または大腸菌由 来ＲＮＡ５ｅＨで５分間（レーン７）二・ツクトランスレーションしたものであ る。生成した断片のサイズは各酵素によって異なり、酵素開裂の特異性およびこ の鋳型についての特異性が酵素間で異なることを示している。最も急速な分解は 大腸菌ＲＮＡ５ｅＨの存在下で観察され、この酵素の切断が、特異性１；おいて より低いことあるいは活性がより高いことを示唆している。

図６ｂはＨＢＶ領域ｌＲＮＡを合成標的配列とハイブリダイゼーシヨンし、ＡＭ Ｖ逆転写酵素由来のＲＮ　Ａ　ｓｅＨで５．３０．６０または１２０分間（レー ン２−５）または大腸菌由来ＲＮＡ５ｅＨで１．３．１５または６０分間（レー ン６−９）　、ニックトランスレーションした結果を示す。２個の酵素により異 なるサイズの断片が生成し、開裂の特異性を示した。ＨＢＶ　ＲＮＡの３′末端 をラベルし、ＡＭＶ逆転写酵素でニックトランスレーションすると同じサイズの 断片が観察され、開裂部位がＲＮＡの５′末端に近いことを示した。

これらのデータは特異的な部位がＡＭＶ由来ＲＮＡ５ｅＨ％ＭＭＬＶ由来ＲＮＡ ５ｅＨおよび大腸菌由来ＲＮＡ５ｅＨで開裂されること、およびこれら３酵素に おける部位の幾つかは異なっていることを示している。増幅される領域内に特異 的な部位が存在することはＲＮＡ　：ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡを開裂させ、 能率的な自己触媒作用がもたらされる。切断部位情報を用いて設計されたプライ マーは増幅効率を改善する。このことは、あるプライマーセットの増幅程度がＲ ＮＡ５ｅＨの供給源に依存して様々な程度に変化するという本発明者らの観察と 一致している。

Ｅ、ＭＭＬＶ　ＲＮＡ５ｅＨおよびＡＭＶ　ＲＮＡ５ｅＨ切断部位の同定 実施例１７ ＡＭＶ　ＲＮＡ５ｅＨによる消化部位を同定するためにＲＮＡを相補的配列とハ イブリダイゼーションし、ＡＭＶ　ＲＮＡ５ｅＨでニックトランスレーションし た。変性後、配列決定すべき領域の３゛末端に相補的なプライマーとハイブリダ イゼーションし、サンガーの配列決定法に従い、ジデオキシヌクレオチドの存在 下で伸長した。

ｃＤＮＡ合成の終結、これはＲＮＡ開裂を示すが、はＨＢＶ　ＲＮＡの以下の部 位で観察された。

５°　ＧＧＧ　ＡＧＡ　ＧＧＵＵＡ　ＩＪＣＧＣ＊［Ｉ　ＧＧＡ＊ＩｊＧＵＧＵ ＣＬＩＧＣＧＧＣＧＬＩＩＩＵＬ］Ａ　ｔｌｃＡ＊ＵＡυＬＩＣＣＵＣＵＩＪＣ Ａ本υＣＣＵＧ・・・３°ＭＭＬＶ　ＲＮＡ５ｅＨによる消化部位を同定するた めにＲＮＡと相補配列とをハイブリダイゼーションし、ＭＭＬＶ　ＲＮＡ５ｅＨ でニックトランスレージコンした。変性後、配列決定すべき領域の３°末端に相 補的なプライマーとハイブリダイゼーションし、サンが−の配列決定法に従い、 ジデオキシヌクレオチドの存在下で伸長した。ｃＤＮＡ合成の終結はＨＢＶ　Ｒ ＮＡの以下の部位で観察された。

５’　ＧＧＧＡＧＡＧＧＵＵＡＵＣＧＣ＊ＵＧＧＡ＊ＬＩＧＵＧＵＣＬＩＧＣＧ ＧＣ＊ＧＵＵＵｔｌＡＵＣ＾本ＵＡＵＵＣＣＵＣＵＵＣＡＵＣＣＵＧＣ＊ＵＧＣ ＵＡＵＧＣＣＵＣＡ＊ＵＣＵＵＣ・・・−３゜以下の部位は第２のＨＢＶ　ＲＮ Ａ配列と同定された。

５°　ＧＧＧＡＧＡＣＣＣＧＡＧＡＬＩ＊ＵＧＡ＊ＧＡｔｌＣυＵＣＵＧＣＧＡ Ｃ以下の部位はＨＩＶ　ＲＮＡ配列と同定された。

５°ＧＧＧＡＧＡＣＡＡＡ零〇ＧＧＣＡＧＵＡ零ＵＬＩＣ＾υＣＣＡＣＡＡＵＬ ＩＵＵＡＡＡＡＧＡＡＡＡＧＧＧＧＧＧＡＵＬＩＧＧＧＧＧＧＵＡＣＡＧＩＪＧ ＣＡＧＧＧＧＡＡＡＧＡＡＵＡＧＬＩＡＧＡＣＡＵＡＡＵＡＧＣ＊ＡＡＣＡＧＡ Ｃ＾ＵＡＣ本ＡＡＡＣＵＡＡＡＧＡＡＵＵＡＣＡＡＡＡＡＣＡＡＡＵＵＡＣ＊Ａ ＡＡＡＡＵＵＣＡＡＡＡＵＵＵＵＣＧＧＧＵＵＵＡＬＩＵＡＣＡＧＧＧＡＣ零＾ ＧＣ本＾ＧＡＡＡ・・・３′大多数の開裂部位はＣＡまたはＵＧジヌクレオチド の近くに存在する。開裂部位の検出に用いた方法では開裂反応の間に蓄積された 部位が同定されたにすぎない。使用した方法で認識された部位以外の部位でも開 裂が起きると予測される。

Ｆ、増幅システムのためのプライマー 種々のＲＮ　Ａ　ｓｅＨ酵素が配列特異性を有するという知見に基づいて本発明 者らは様々なプライマー／標的の組み合わせを試験しそれらの増幅システムにお ける動向を適正化することを試みた。今日までに得られたデータは生成したＲＮ Ａ断片の各片のサイズが比較的大きく、断片はおそらく２本鎖から自然発生的に 解離したものではないことを示唆している。このことは、ＡＭＶ逆転写酵素を用 いて行ったＡＭＶ　ＲＮＡまたはポリオウィルスＲＮＡの複写実験において、最 初に合成されたｃＤＮＡ鎖からのｃＤＮＡの合成におけるプライムに、ＲＮＡ５ ｅＨによって産生されたＲＮＡ断片を酵素が用いることが分かったことから、予 想外なことではない。

ＲＮＡ５ｅＨ酵素が配列特異性を有するならば、増幅反応は以下のごとくに進行 するであろう（反応混合物中のＲＮＡ中間体から開始して）。

増幅中に生成した主プライマー種に相補的なプライマーがＲＮＡの３゛末端に結 合する。反応混合物中のプライマー濃度は高いので、過剰のプライマーにより生 成されたＲＮＡ：ＤＮＡ２本鎖は合成を開始し得る前にＲＮＡ５ｅＨ活性によっ て開裂されるであろう。従って、プライマー結合領域は、反応に用いるＲＮＡ５ ｅＨが認識する配列を多数含有しないことが好ましい。

切断部位が頻繁に存在するので、認識された切断部位を含まないＲＮＡ相補プラ イマーを実際に設計し得ない場合もあるかもしれない。そのような場合、プライ マーの３゛末端部位をＲＮＡとのアニーリングのために保持するために切断部位 はできるだけ５′末端に近（すべきである。

プライマーを適当なりＮＡポリメラーゼで伸長すると、ＲＮＡポリメラーゼプロ モーターを含有する第２プライマーの結合部位が現れるはずである。逆転写酵素 によって仲介されるプライマーの結合と合成の開始のためには、プライマーがＤ ＮＡにハイブリダイズする際にヌクレーション（ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ）とジッ パ−リング（ｚｉｐｐｅｒｉｎｇ）が可能なようＲＮＡの一部を除去する、ある いは単にＲＮＡをニックし生成したＲＮＡを排除するだけで十分である。本発明 者らのデータはかなり大きいＲＮＡ片が生成し、またプロモーター含有プライマ ーが完全長さのＤＮＡに取り込まれないことを示していることから、以下の事象 が起きていると考えられる。

１、　プロモーター−プライマー結合を可能ならしめるに十分なニックがＲＮＡ に含まれている。適当な部位の１つのニックによって、単に、消失させるに十分 な小さいＲＮＡ断片が生成しプライマー結合部位またはその一部が露出されるの か、または１つのニックが１またはそれ以上の酵素の巻戻し作用を促しＲＮＡ断 片が通い出されるのかは、現時点では不明である。

２、逆転写酵素でｃＤＮＡ３°末端が伸長されプロモーター領域の２本鎖ＤＮＡ が作られる。

３、このようにして生成した複合体からＲＮＡが合成される。この複合体はＲＮ 　、Ａに結合したｃ　Ｄ　Ｎ　Ａからなり、２本鎖ＤＮＡプロモーターを含有す る。

このように、反応物には、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含有するプライマ ーの結合部位の内部または近辺のどこかに、ＲＮＡ５ｅＨ活性が認識する配列が 存在する必要がある。

幾つかの適用例では、標的配列それ自身の内部にはＲＮＡ５ｅＨ認識部位のない ことも望ましい。標的内の部位は開裂され２重鎖ｃＤＮＡ領域の合成のためのＲ ＮＡプライマーの生産に用いられるであろう。この酵素作用の可能性を消滅する ことが好ましい。

本発明者らが得たモデルおよびＲＮＡ５ｅＨ配列特異性情報に基づいて新規なプ ライマーセットが企画された。本発明者らの企画は以下の通りである。

Ｔ７プロモーターーブライマー用 １）プライマー領域は１０塩基あたり１またはそれ以上の切断部位を有する。

２）プライマー領域はその５′末端の近くに切断部位を有する。

３）プライマー領域はその３゛末端の近く、および可能なら３°末端の一部に切 断部位を有する。

４）プライマーの長さは〉１８塩基である。

５）　Ｔ　＋ａｅＳｉは約５５−６５℃である。

他のプライマー用 １）プライマーはＲＮＡ５ｅＨ切断部位を殆ど持たないか、全く持たない。

２）プライマー内に存在する切断部位はすべて５°末端付近に存在する。

３）プライマーの長さは約１８−２８塩基である。

４）Ｔ、ｅｓｔは５５−６５℃である。

明らかに、これらの基準および機構、ならびに配列特異性に関する知識に従って 設計されたプライマーを用いて、より良好な合成が達成された。このことは本発 明によれば、特異的な標的領域のための機能的なプライマーセットの製造が可能 であることを示すものである。これらを以下により詳細に説明する。

実施例１８ ＲＮ　Ａ　ｓｅ　Ｈの特異性に関する発見を効率的なプロモーター−プライマー の組合せを設計するのに利用した。従来技術の方法はプロモーターを非選択的に プライマーに付加したものにすぎない。本発明者らは増幅産物の収率を高めるの に最適なプロモーター−プライマーの組み合わせを設計することができた。以下 に示す実験はプロモーター−プライマー配列を少し変化させることで増幅効率が 大きく変化することを示している。

以下の例では同一領域からのプライマーを、ＲＮＡ５ｅＨ開裂部位およびＧ　Ｐ −ＩＩＩ増幅効率に関して比較したものである。各試料について、被検プライマ ー以外は同一の試薬を用いて２回、増幅を行った。

１、非プロモーターブライマー 最初の例では、ＣＭＬ生要ｔ（１４：１８）ブレイクポイント増幅領域のための 非プロモータープライマー部位を１５塩基移動することにより、４塩基認識配列 と仮定して推定のＲＮＡ５ｅＨ切断部位内の数を４から１に、３塩基認識配列と 仮定して５から２に減少した。　２．５ｍｍ　ＡＴＰ、　１６．５ｍｍ　ＭｇＣ ｌ２、および５ＱｍＭ　ＫＣＩを用いるほかは実施例１５と同様に反応させた。

このプライマー配列における変化は増幅効率にとって極めて積極的な影響を及ぼ した。

第２の例では、４塩基認識部位と仮定される推定のＲＮ　Ａ　ｓｅＨ部位のみを 除去するためにＨＢＶ領域１の非プロモータープライマー内に意図的に不適合を 配した。３塩基切断部位の場合は、当業者ならば、不適合により３′末端に最も 近い切断部位が除去されたことが分かるであろう。この変化もまた、増幅効率に 極めて積極的な影響を及ぼした。データは、プライマーの位置を変化する方法ま たは不適合を導入する方法の２方法のいずれも増幅の促進に利用し得ることを示 している。おそらく非プロモーターブライマーからのＲＮＡ５ｅＨ切断部位の除 去の方が、より能率的に自己触媒期間のｃ　ＤＮＡ合成を開始させるであろう。

配列　ＲＬＵ 例Ｉ　ＧＧＡＧＣＴＧＣＡＧＡＴＧＣＴＧＡＣＣＡＡＣ７ｇ、８８０ＧＡＣＣＡ ＡＣＴＣＧＴＧＴＧＴＧＡＡＡＣＴＣＣＡ　２，５５２，３３３例２　ＴＣＣＴ ＧＧＡＡＴＴＡＧＡＧＧＡＣＡＡＡＣＧＧＧＣ５７，７１０ＴＣＣＴＧＧＡＡＴ ＴＡＧＡＧＧＡＴＡＡＡＣＧＧＧＣ５１８，６９５２、プロモーター−プライマ ー 以下の例は同じ領域を起源とするが推定のＲＮＡ５ｅＨ切断部位の数が異なるプ ロモーターブライマーを示す。最初の例ではＨＩＶ領域５のための２つのプロモ ーターブライマーが１０塩基移動して４塩基認識部位と仮定して推定のＲＮＡ５ ｅＨ切断部位を２から３に変化させるか、３塩基認識部位と仮定して３から５に 変化させた。これは増幅効率に正の影響を及ぼした。第２の例では推定のＲＮＡ ５ｅＨ切断部位を含有する配列を主要ブレイクポイントｔ　（１４；　１８）転 座のためのプロモーターブライマーの上流に挿入し、標的に対する１つの不適合 を含有させてプライマー領域内に切断部位を生成させた。これも増幅効率に正の 影響を及ぼした。これは増幅効率の上昇に、プロモータープライマーへのＲＮ　 Ａ　ｓｅ　Ｈ切断部位の挿入を利用することができることを示すものである。お そらく、ＲＮＡ５ｅＨ切断部位の挿入がＲＮＡ鎖の移動を助け、プロモーター領 域の複製効率を増大し、その結果、能率的な自己触媒が達成される。

プライマー名称　ＲＬＵ 例３　Ａ　４５，４６６ Ｂ　９０８，１４７ 例４　Ｃ６４，６０１ Ｄ　２．　９４６．　７０６ 上記プライマーの配列を以下に示す。

プライマーＡ： Ａ　ＡＴＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＡＡＴＣＴＴＧ ＴＧＧＧＧＴＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴ−３’プライマーＢ＝ ＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＧＧＧＧＴＧＧＣＴ ＣＣＴＴＣＴＧＡＴＡＡ　ＴＧＣＴＧ−３’プライマーＣ： ＡＴＴＴＡＡ　ＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＧ ＴＧＧＴＣＣＣＴＴＧ−３゜プライマーＤ： ＴＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＴＣＡＧＴＴＡＣ ＡＡＴＣＧＣＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＴＧＡＧＣＡＧＡＣＧＣＴＧＡＣＣＧＴ ＧＧＴＣＣＣＴＴＧ−３゜上記の例で、非プロモーターブライマーからのＲＮＡ ５ｅＨ切断部位の除去は、切断部位の除去が元の標的に不適合を導入するとして も、増幅効率を増大した。付加的なＲＮＡ５ｅＨ切断部位を含有させるためのプ ロモーター含有プライマーの設計もまた、それが切断部位の導入が元の標的に不 適合を導入するとしても、増幅を増大した。

推定のＲＮＡ５ｅＨ切断部位の数、分布、および位置が、一部では、特定のプラ イマーの有用性を決定する。

意図的な不適合の導入またはプロモーターおよびプライマー間への配列の挿入に よる増幅の増大は増幅法における自明の改善ではない。

本発明の好ましい実施態様では、ＲＮＡ標的配列を決定し、次いでＲＮＡ５ｅＨ 分解が２本鎖からのＲＮＡ切片の切断または除去を起こす場所を決定する。ＡＭ Ｖ逆転写酵素およびＭＭＬＶ逆転写酵素中に存在するＲＮＡ５ｅＨ，大腸菌ＲＮ 　Ａ　ｓｅＨまたはこれらの組み合わせによる、標的配列のＲＮＡ５ｅ分解の効 果を決定するために実験を行うことができる。

プライマーを選択するに際し、反応混合物中に存在するＲ　Ｎ　Ａ　ｓｅＨによ って実質上分解されないＲＮＡセクションとハイブリダイズするようにプライマ ーを選択することが好ましい。実質的な分解があるとプライマー領域内でのＲＮ Ａ鎖の切断によってＤＮＡ合成が停止または阻害されプライマーの伸長が阻止さ れる。このように、ＲＮＡ標的の配列とハイブリダイズするプライマーであって 、ＲＮＡがＲＮＡ５ｅＨに供されたとき、プライマー伸長生成物の形成を阻止す る実質的な分解がないような位置にあるプライマーを選択することが望ましい。

プロモーター−プライマーがハイブリダイズするであろうＤＮＡ部分にハイブリ ダイズしたＲＮＡ鎮部分を除去するに十分なＲＮＡ鎖の分解が起きるように　プ ロモーター−プライマーのハイブリダイゼーション部位を選択する。通常は、Ｒ ＮＡ５ｅＨ分解によってＲＮＡ・ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡの幾つかの部分だけが除 去され、ＲＮＡ鎖の実質的な部分は２本鎖に残存する。２本鎖ＤＮＡプロモータ ーを含有するＲＮＡ　：　ＤＮＡ２本鎖１つが得られる。

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Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（ａ）オリゴヌクレオチド／標的配列複合体が作られＤＮＡ合成が開始し得 る条件下で、ＲＮＡ標的配列を含む核酸を、標的の３′末端部分に対してこれと 複合体を作るに十分相補的な複合体形成配列を有し、且つ所望によりＲＮＡポリ メラーゼのためのプロモーターを含む複合体形成配列の５′側配列を有する、第 一プライマーを含む第一のオリゴヌクレオチドで処理し、；（ｂ）鋳型として該 標的を使用する伸長反応でプライマーを伸長して、ＲＮＡ標的に対して相補的な ＤＮＡプライマー伸長産物を得；（ｃ）ＲＮＡ標的を選択的に減成する酵素を用 いてＤＮＡプライマー伸長産物をＲＮＡ標的から分離し； （ｄ）ＤＮＡプライマー伸長産物を、プライマーまたはスプライスの鋳型を含み 、そしてオリゴヌクレオチド／標的配列複合体が作られＤＮＡ合成が開始し得る 条件下で、標的配列の３′末端部分に対してこれと複合体を作るに十分相補的な 複合体形成配列を有する第二のオリゴヌクレオチドで処理し（ただし、もし第一 のオリゴヌクレオチドがプロモーターを持たなければ、第二のオリゴヌクレオチ ドがＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターを含む複合体形成配列の５′側配 列を有するスプライスの鋳型である）；（ｅ）ＤＮＡ伸長反応において、第二の オリゴヌクレオチドまたは第一プライマー伸長産物のいずれかまたは両者の３′ 末端を伸長してＲＮＡポリメラーゼのための鋳型を生成し；そして、（ｆ）工程 （ｅ）の鋳型を用い、プロモーター配列を認識するＲＮＡポリメラーゼを使用し て標的配列のＲＮＡコピーを多数生成させることからなる、標的核酸配列の多数 のコピーを合成する方法。 ２．工程（ｃ）の酸素がＲＮアーゼＨを含む請求項１に記載の方法。 ３．さらに、該オリゴヌクレオチドおよびＲＮＡコピーを使用して標的配列の多 数のコピーを自触的に合成させることを含む、請求項１に記載の方法。 ４．工程（ｃ）の酵素がＲＮアーゼＨを含む請求項３に記載の方法。 ５．（ａ）オリゴヌクレオチド／標的配列複合体が作られＤＮＡ合成が開始し得 る条件下で、ＲＮＡ標的配列を含む標的核酸を、標的配列の３′末端部分に対し てこれと複合体を作るに十分相補的な複合体形成配列を有し、且つＲＮＡポリメ ラーゼのためのプロモーターを含む複合体形成配列の５′側配列を有する、第一 プライマーを含む第一のオリゴヌクレオチドで処理し；（ｂ）ＲＮＡ標的に対し て相補的な第一のＤＮＡプライマー伸長産物を与える鋳型として該標的を使用す る伸長反応で第一プライマーを伸長し； （ｃ）ＲＮＡ標的を選択的に減成する酵素を用いて第一ＤＮＡプライマー伸長産 物をＲＮＡ標的から分離し；（ｄ）第一ＤＮＡプライマー伸長産物を、オリゴヌ クレオチド／標的配列複合体が作られＤＮＡ合成が開始し得る条件下で、標的配 列の３′末端部分に対してこれと複合体を作るに十分相補的な複合体形成配列を 有する第二プライマーを含む第二のオリゴヌクレオチドで処理し； （ｅ）第二プライマーの３′末端をＤＮＡ伸長反応で伸長して第二のＤＮＡプラ イマー伸長産物を得、これによってＲＮＡポリメラーゼのための鋳型を生成し、 そして； （ｆ）工程（ｅ）の鋳型を用い、プロモーター配列を認識するＲＮＡポリメラー ゼを使用して標的配列のＲＮＡコピーを多数生成させることからなる、標的核酸 配列の多数のコピーを合成する方法。 ６．工程（ｃ）の酵素がＲＮアーゼＨを含む請求項５に記載の方法。 ７．第二プライマーがＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターを含んでいる複 合体形成配列の５′側配列を有する、請求項５に記載の方法。 ８．工程（ｃ）の酵素がＲＮアーゼＨである請求項７に記載の方法。 ９．さらに、該プライマーおよびＲＮＡコピーを使用して標的配列の多数のコピ ーを自触的に合成させることを含む、請求項５に記載の方法。 １０．第二プライマーがＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターを含んでいる 複合体形成配列の５′側配列を有する、請求項９に記載の方法。 １１．さらに、 （ｇ）工程（ｆ）からのＲＮＡコピーを、オリゴヌクレオチド／標的配列複合体 が生成しＤＮＡ合成が開始し得る条件下で、第二プライマーによって処理し； （ｈ）ＤＮＡ伸長反応で第二プライマーの３′末端を伸長してＲＮＡコピーに対 して相補的な第二のＤＮＡプライマー伸長産物を得；（ｉ）ＲＮＡコピーを選択 的に減成する酵素を用いて第二のＤＮＡプライマー伸長産物をＲＮＡコピーから 分離し；（ｊ）第二のＤＮＡプライマー伸長産物を、オリゴヌクレオチド／標的 配列複合体が生成しＤＮＡ合成が開始し得る条件下で、第一プライマーによって 処理し； （ｋ）ＤＮＡ伸長反応において第一プライマーの３′末端を伸長して第一のＤＮ Ａプライマー伸長産物および第二のＤＮＡプライマー伸長産物の３′末端を得、 それによりＲＮＡポリメラーゼのための鋳型を生成し；そして、 （ｌ）工程（ｋ）の鋳型を用い、プロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼを 使用して標的配列のコピーを多数生成させる、ことを含む請求項５に記載の方法 。 １２．第二プライマーがＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターを含んでいる 複合体形成配列の５′側配列を有する請求項１１に記載の方法。 １３．さらに、該プライマーおよびＲＮＡコピーを使用して標的配列の多数のコ ピーを自触的に合成することを含む、請求項１１に記載の方法。 １４．第二プライマーがＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターを含んでいる 複合体形成配列の５′側配列を有する、請求項１３に記載の方法。 １５．さらに、 （ｍ）工程（ｌ）のＲＮＡコピーを使用して、工程（ｇ）ないし（ｌ）を反復し 、標的配列の多数のコピーを自触的に合成する、ことを含む請求項１１に記載の 方法。 １６．工程（ｃ）および（ｉ）の酵素がＲＮアーゼＨを含んでいる請求項１５に 記載の方法。 １７．第二プライマーがＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターを含んでいる 複合体形成配列の５′側配列を有する、請求項１５に記載の方法。 １８．工程（ｃ）および（ｉ）の酸素がＲＮアーゼＨを含んでいる請求項１７に 記載の方法。 １９．さらに、 （ｇ）工程（ｆ）のＲＮＡコピーを複合体形成条件下で第一および第二プライマ ーで処理し； （ｈ）ＲＮＡコピーを鋳型として用いるＤＮＡ伸長反応でプライマーを伸長して ＤＮＡプライマー伸長産物を得；（ｉ）ＲＮＡコピーを選択的に減成する酵素を 用いてＤＮＡプライマー伸長産物をＲＮＡコピーから分離し；（ｊ）このＤＮＡ プライマー伸長産物を複合体形成条件下でプライマーで処理し； （ｋ）このプライマーをＤＮＡ伸長反応で伸長して相補的プライマー伸長産物を 得、それによりＲＮＡポリメラーゼのための鋳型を生成し；そして、 （ｌ）工程（ｋ）の鋳型を用い、プロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼを 使用して標的配列のコピーを多数生成させる、ことを含む請求項７に記載の方法 。 ２０．さらに、該プライマーおよびＲＮＡコピーを使用して標的配列の多数のコ ピーを自触的に合成することを含む、請求項１９に記載の方法。 ２１．さらに、 （ｍ）工程（ｌ）のＲＮＡコピーを使用して、工程（ｇ）ないし（ｌ）を反復し 、標的配列の多数のコピーを自触的に合成する、ことを含む請求項１９に記載の 方法。 ２２．工程（ｃ）および（ｉ）の酸素がＲＮアーゼＨを含んでいる請求項２１に 記載の方法。 ２３．（ａ）オリゴヌクレオチド／標的配列複合体が作られＤＮＡ合成が開始し 得る条件下で、ＲＮＡ標的配列を含む核酸を、標的配列の３′末端部分に対して これと複合体を作るに十分相補的な複合体形成配列を有する第一プライマーを含 む第一のオリゴヌクレオチドで処理し、； （ｂ）ＲＮＡ標的に対して相補的なＤＮＡプライマー伸長産物を与える鋳型とし て該標的を使用する伸長反応で第一プライマーの３′末端を伸長し； （ｃ）ＲＮＡ標的を選択的に減成する酵素を用いてＤＮＡプライマー伸長産物を ＲＮＡ標的から分離し； （ｄ）ＤＮＡプライマー伸長産物を、オリゴヌクレオチド／標的配列複合体が作 られＤＮＡ合成が開始し得る条件下で、プライマー伸長産物の３′末端に対して これと複合体を作るに十分相補的な複合体形成配列、およびＲＮＡポリメラーゼ のためのプロモーターを含む複合体形成配列の５′側配列、を有するスプライス の鋳型を含む第二のオリゴヌクレオチドで処理し； （ｅ）プライマー伸長産物の３′末端を伸長してプロモーターに対し相補的な配 列をこれに付加し、それによってＲＮＡポリメラーゼのための鋳型を生成し；そ して、 （ｆ）工程（ｅ）の鋳型を用い、プロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼを 使用して標的配列のＲＮＡコピーを多数生成させる、ことからなる、標的核酸配 列の多数のコピーを合成する方法。 ２４．さらに、該オリゴヌクレオチドおよび該ＲＮＡコピーを使用して標的配列 の多数のコピーを自触的に合成することを含む、請求項２３に記載の方法。 ２５．スプライスの鋳型の３′末端がブロックされている請求項２４に記載の方 法。 ２６．さらに、 （ｇ）工程（ｆ）のＲＮＡコピーを使用して、工程（ａ）ないし（ｆ）を反復し 、標的配列の多数のコピーを自触的に合成する、ことを含む請求項２３に記載の 方法。 ２７．工程（ｃ）の酵素がＲＮアーゼＨを含んでいる請求項２６に記載の方法。 ２８．スプライスの鋳型の３′末端がブロックされている請求項２６に記載の方 法。 ２９．工程（ｅ）において、スプライスの鋳型が第二プライマーとして働き、こ のスプライスの鋳型の３′末端がＤＮＡ伸長反応で伸長して第一プライマー伸長 産物に対し相補的な第二プライマー伸長産物を与える、請求項２６に記載の方法 。 ３０．第一プライマーがＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターを含んでいる 複合体形成配列の５′側配列を有する、請求項２９に記載の方法。 ３１．工程（ｃ）の酸素がＲＮアーゼＨを含んでいる請求項３０に記載の方法。 ３２．該プライマーおよび該スプライスの鋳型がプライマーを含む配列の５′側 にスプライスの鋳型を含む配列を有する単一のオリゴヌクレオチドを含んでいる 、請求項２８に記載の方法。 ３３．（ａ）オリゴヌクレオチド／標的配列複合体が作られＤＮＡ合成が開始し 得る条件下で、確定した３′末端を有するＤＮＡ標的配列を含む一本鎖標的核酸 を、標的配列の３′末端部分に対してこれと複合体を作るに十分相補的な複合体 形成配列を有し、且つＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターを含む複合体形 成配列の５′側配列を有する、スプライスの鋳型を含む第一のオリゴヌクレオチ ドで処理し、； （ｂ）標的の３′末端を伸長してプロモーターに対し相補的な配列を付加し、こ れによりＲＮＡポリメラーゼのための鋳型を生成し、そして； （ｃ）工程（ｂ）の鋳型を用い、プロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼを 使用して標的配列のＲＮＡコピーを多数生成させることからなる、標的配列の多 数のコピーを合成する方法。 ３４．スプライスの鋳型の３′末端がブロックされている請求項３３に記載の方 法。 ３５．さらに、 （ｄ）オリゴヌクレオチド／標的配列複合体が作られＤＮＡ合成が開始し得る条 件下で、工程（ｃ）のＲＮＡコピーを、ＲＮＡコピーの３′末端部分に対してこ れと複合体を作るに十分相補的な複合体形成配列を有するプライマーを含む第二 のオリゴヌクレオチドで処理し、； （ｅ）ＤＮＡ伸長反応でプライマーの３′末端を伸長してＲＮＡコピーに対して 相補的なＤＮＡプライマー伸長産物を得；（ｆ）ＤＮＡプライマー伸長産物をＲ ＮＡコピーから分離し；（ｇ）オリゴヌクレオチド／標的配列複合体が作られＤ ＮＡ合成が開始し得る条件下でＤＮＡプライマー伸長産物をスプライスの鋳型で 処理し； （ｈ）プライマー伸長産物の３′末端をＤＮＡ伸長反応で伸長してプロモーター に対し相補的な配列をこれに付加し、それによってＲＮＡポリメラーゼのための 鋳型を生成し；そして、（ｉ）工程（ｈ）の鋳型を用い、プロモーターを認識す るＲＮＡポリメラーゼを使用して標的配列のＲＮＡコピーを多数生成させる、こ とからなる、請求項３３に記載の方法。 ３６．工程（ｆ）がＲＮＡコピーを選択的に減成する酵素を使用する、請求項３ ５に記載の方法。 ３７．さらに、該オリゴヌクレオチドおよび工程（ｉ）のＲＮＡコピーを用いて 標的配列の多数のコピーを自触的に合成することを含む、請求項３６に記載の方 法。 ３８．スプライスの鋳型の３′末端がブロックされている請求項３７に記載の方 法。 ３９．さらに、 （ｊ）工程（ｉ）のＲＮＡコピーを使用して、工程（ｄ）ないし（ｉ）を反復し 、標的配列の多数のコピーを自触的に合成する、ことを含む請求項３６に記載の 方法。 ４０．（ａ）オリゴヌクレオチド／標的配列複合体が作られＤＮＡ合成が開始し 得る条件下で、ＤＮＡ標的配列を含む一本鎖標的核酸を、標的配列の３′末端部 分に対してこれと複合体を作るに十分相補的な複合体形成配列を有し、且つＲＮ Ａポリメラーゼのためのプロモーターを含む配列を有する、第一プライマーを含 む第一のオリゴヌクレオチドで処理し、； （ｂ）該標的を鋳型として使用するＤＮＡ伸長反応で該プライマーを伸長してＤ ＮＡ標的配列に対して相補的な第一ＤＮＡプライマー伸長産物を得； （ｃ）第一プライマー伸長産物を標的から分離し；（ｄ）第一プライマー伸長産 物を、オリゴヌクレオチド／標的配列複合体が作られＤＮＡ合成が開始し得る条 件下で、標的配列の３′末端に対してこれと複合体を作るに十分相補的な複合体 形成配列を有する第二プライマーを含む第二のオリゴヌクレオチドで処理し；（ ｅ）第二プライマーの３′末端をＤＮＡ伸長反応で伸長して第二ＤＮＡプライマ ー伸長産物を得、それによってＲＮＡポリメラーゼのための鋳型を生成し； （ｆ）工程（ｅ）の鋳型を用い、プロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼを 使用して標的配列のＲＮＡコピーを多数生成させ；（ｇ）工程（ｆ）からのＲＮ Ａコピーを、オリゴヌクレオチド／標的配列複合体が生成しＤＮＡ合成が開始し 得る条件下で、第二プライマーによって処理し； （ｈ）第二プライマーの３′末端をＤＮＡ伸長反応で伸長してＲＮＡコピーに対 して相補的な第二ＤＮＡプライマー伸長産物を得；（ｉ）ＲＮＡコピーを選択的 に減成する酸素を用いてこのＤＮＡプライマー伸長産物をＲＮＡコピーから分離 し；（ｊ）第二プライマー伸長産物を、オリゴヌクレオチド／標的複合体が生成 しＤＮＡ合成が開始し得る条件下で、第一プライマーによって処理し； （ｋ）ＤＮＡ伸長反応において第一プライマーの３′末端を伸長して第一ＤＮＡ プライマー伸長産物および第二プライマー伸長産物の３′末端を得、それにより ＲＮＡポリメラーゼのための鋳型を生成し；そして、 （ｌ）工程（ｋ）の鋳型を用い、プロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼを 使用して標的配列のコピーを多数生成させる、ことからなる、標的核酸配列の多 数のコピーを合成する方法。 ４１．工程（ｉ）の酸素がＲＮアーゼＨを含んでいる請求項４０に記載の方法。 ４２．第二プライマーがＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターを含む複合体 形成配列の５′側配列を有する、請求項４０に記載の方法。 ４３．工程（ｉ）の酵素がＲＮアーゼＨを含んでいる請求項４２に記載の方法。 ４４．さらに、該オリゴヌクレオチドおよびＲＮＡコピーを用いて標的配列の多 数のコピーを自触的に合成することを含む、請求項４２に記載の方法。 ４５．工程（ｉ）の酵素がＲＮアーゼＨを含んでいる請求項４４に記載の方法。 ４６．さらに、 （ｍ）工程（ｌ）のＲＮＡコピーを使用して、工程（ｇ）ないし（ｌ）を反復し 、標的配列の多数のコピーを自触的に合成する、ことを含む請求項４２に記載の 方法。 ４７．工程（ｉ）の酵素がＲＮアーゼＨを含んでいる請求項４６に記載の方法。 ４８．（ａ）オリゴヌクレオチド／標的配列複合体が作られＤＮＡ合成が開始し 得る条件下で、ＤＮＡ標的配列を含む一本鎖標的核酸を、標的配列の３′末端部 分に対してこれと複合体を作るに十分相補的な複合体形成配列を有するプライマ ーを含む第一のオリゴヌクレオチドで処理し； （ｂ）該標的を鋳型として使用する伸長反応で該プライマーの３′末端を伸長し て該標的に対して相補的なＤＮＡプライマー伸長産物を得； （ｃ）プライマー伸長産物を標的から分離し；（ｄ）プライマー伸長産物を、オ リゴヌクレオチド／標的配列複合体が作られＤＮＡ合成が開始し得る条件下で、 標的配列の３′末端に対してこれと複合体を作るに十分相補的な複合体形成配列 、およびＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターを含む複合体形成配列の５′ 側配列を有するスプライスの鋳型を含む第二のオリゴヌクレオチドで処理し； （ｅ）プライマー伸長産物の３′末端を伸長してプロモーターに対し相補的な配 列をこれに付加し、それによりＲＮＡポリメラーゼのための鋳型を生成し；そし て、 （ｆ）工程（ｅ）の鋳型を用い、プロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼを 使用して標的配列のＲＮＡコピーを多数生成させる、ことからなる、標的核酸配 列の多数のコピーを合成する方法。 ４９．（ｇ）工程（ｆ）のＲＮＡコピーを、オリゴヌクレオチド／標的配列複合 体が生成しＤＮＡ合成が開始し得る条件下で、プライマーによって処理し； （ｈ）プライマーの３′末端をＤＮＡ伸長反応で伸長してプライマー伸長産物を 得； （ｉ）ＲＮＡコピーを選択的に減成する酵素を用いてこのプライマー伸長産物を ＲＮＡコピーから分離し；（ｊ）プライマー伸長産物を、オリゴヌクレオチド／ 標的配列複合体が生成しＤＮＡ合成が開始し得る条件下で、スプライスの鋳型に よって処理し； （ｋ）プライマー伸長産物の３′末端を伸長してプロモーターに対し相補的な配 列をこれに付加し、それによりＲＮＡポリメラーゼのための鋳型を生成し； （ｌ）工程（ｋ）の鋳型を用い、プロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼを 使用して標的配列のＲＮＡコピーを生成させる、ことからなる、請求項４８に記 載の方法。 ５０．スプライスの鋳型の３′末端がブロックされている請求項４９に記載の方 法。 ５１．さらに、該オリゴヌクレオチドおよびＲＮＡコピーを用いて標的配列の多 数のコピーを自触的に合成することを含む、請求項４９に記載の方法。 ５２．工程（ｉ）の酵素がＲＮアーゼＨである請求項５１に記載の方法。 ５３．さらに、 （ｍ）工程（ｌ）のＲＮＡコピーを使用して、工程（ｇ）ないし（ｌ）を反覆し 、標的配列の多数のコピーを自触的に合成する、ことを含む請求項４９に記載の 方法。 ５４．工程（ｉ）の酵素がＲＮアーゼＨである請求項５３に記載の方法。 ５５．実質的に一定の温度、イオン強度およびｐＨの条件下で標的核酸配列の多 数のコピーを自触的に合成する方法であって、（ａ）（１）一本鎖ＲＮＡ標的配 列を含む標的核酸；（２）ＲＮＡ標的配列の３′末端部分に対してこれと複合体 を作るに十分相補的な複合体形成配列を有し、且つ所望によりＲＮＡポリメラー ゼのためのプロモーターを含む複合体形成を列の５′側配列を有する、プライマ ーを含む第一のオリゴヌクレオチド；（３）プライマーまたはスプライスの鋳型 を含み、且つＲＮＡ標的配列に対する相補体の３′末端部分に対してこれと複合 体を作るに十分相補的な複合体形成配列を有する、第二のオリゴヌクレオチド（ ただし、もし第一のオリゴヌクレオチドがプロモーターを持たないならば、第二 のオリゴヌクレオチドはＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターを含む複合体 形成配列の５′側配列を有するスプライスの傍型である）； （４）ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ；（５）ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ； （６）ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖を選択的に減成する酵素；および （７）プロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼ；を合し；そして、 （ｂ）実質的に一定の温度、イオン強度およびｐＨを含むＤＮＡプライミングお よび核酸合成条件下で、工程（ａ）の混合物をインキュベートすることからなる 方法。 ５６．工程（ａ） （６）の酵素がＲＮアーゼＨを含む請求項５５に記載の方法。 ５７．第一プライマーがプロモーターを有する請求項５５に記載の方法。 ５８．第二のオリゴヌクレオチドがＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターを 含む複合体形成配列の５′側配列を有する第二プライマーを含む、請求項５７に 記載の方法。 ５９．ＤＮＡポリメラーゼが逆転写酵素を含む請求項５８に記載の方法。 ６０．実質的に一定の温度、イオン強度およびｐＨの条件下で標的核酸配列の多 数のコピーを自触的に合成する方法であって、（ａ）（１）ＲＮＡ標的配列を含 む標的核酸；（２）一方がＲＮＡ標的の標的配列の３′末端部分に対してこれと 複合体を作るに十分相補的な複合体形成配列を有し、他方が標的配列の相補体の ３′末端部分に対しこれと複合体を作るに十分相補的な複合体形成配列を有し、 且つスプライスの鋳型がプロモーターを含む複合体形成配列の５′側配列を有す る、逆の意義を持ったプライマーおよびスプライスの鋳型；（３）ＤＮＡ依存Ｄ ＮＡポリメラーゼ；（４）ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ；（５）ＲＮＡ：ＤＮ Ａ二本鎖のＲＮＡ鎖を選択的に減成する酵素；および （６）スプライスの鋳型のプロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼ； を合し；そして、 （ｂ）実質的に一定の温度、イオン強度およびｐＨを含むＤＮＡプライミングお よび核酸合成条件下で、工程（ａ）の混合物をインキュベートすることからなる 方法。 ６１．標的核酸配列の多数のコピーを自触的に合成する方法であって、 （ａ）（１）一本領ＤＮＡ標的配列を含む核酸；（２）標的配列の３′末端部分 に対してこれと複合体を作るに十分相補的な複合体形成配列、およびＲＮＡポリ メラーゼのためのプロモーターを含む複合体形成配列の５′側配列を有する、第 一プライマー； （３）ＤＮＡポリメラーゼ； を合し； （ｂ）標的配列を鋳型として用いて標的配列に対し相補的なプライマー伸長産物 が合成されるＤＮＡプライミングおよび合成条件下で、工程（ａ）の混合物をイ ンキュベートし；（ｃ）工程（ｂ）の反応混合物を処理してＤＮＡ二本鎖を分離 させ； （ｄ）工程（ｃ）の反応混合物に、 （１）プライマー伸長産物の標的配列の３′末端部分に対しこれと複合体を作る に十分相補的な複合体形成配列を有する第二プライマー； （２）ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ；（３）ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ； （４）ＲＮＡ：ＤＮＡ複合体のＲＮＡ鎖を選択的に減成する酸素； （５）プロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼ；を加え；そして、 （ｅ）実質的に一定の温度、イオン強度およびｐＨを含むＤＮＡプライミングお よび核酸合成条件下で、工程（ｄ）の混合物をインキュベートすることからなる 方法。 ６２．実質的に一定の温度、イオン強度およびｐＨの条件下で標的核酸配列の多 数のコピーを自触的に合成する方法であって、（ａ）（１）標的配列を含む標的 核酸；（２）標的配列の３′末端部分に対してこれと複合体を作るに十分相補的 な複合体形成配列を有し、且つ所望によりＲＮＡポリメラーゼのためのプロモー ターを含む複合体形成配列の５′側配列を有する、第一プライマーを含む第一の オリゴヌクレオチド；（３）第二プライマーまたはスプライスの鋳型を含み、且 つ標的配列の３′末端部分に対してこれと複合体を作るに十分相補的な複合体形 成配列を有する、第二のオリゴヌクレオチド（ただし、もし第一のオリゴヌクレ オチドがプロモーターを持たないならば、第二のオリゴヌクレオチドはプロモー ターを含む複合体形成配列の５′側配列を有するスプライスの鋳型である）；（ ４）ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ；（５）ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ；（ ６）ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖を選択的に減成する酵素；および （７）ＲＮＡポリメラーゼ； を合し；そして、 （ｂ）実質的に一定の温度、イオン強度およびｐＨを含むＤＮＡプライミングお よびＤＮＡ合成条件下で、工程（ａ）の混合物をインキュベートすることからな る方法。 ６３．第一のオリゴヌクレオチドがプロモーター配列を有する請求項６２に記載 の方法。 ６４．工程（ａ）（６）の酵素がＲＮアーゼＨを含む請求項６３に記載の方法。 ６５．工程（ａ）（６）の酵素が逆転写酵素中に存在するＲＮアーゼＨ活性を含 む請求項６４に記載の方法。 ６６．工程（ａ）（５）の酵素が、添加された外性ＲＮアーゼＨを含む請求項６ ４に記載の方法。 ６７．第二のオリゴヌクレオチドがプロモーターを有する請求項６６に記載の方 法。 ６８．工程（ａ）（６）の酵素がＲＮアーゼＨを含む請求項６２に記載の方法。 ６９．工程（ａ）（６）の酵素が逆転写酵素中のＲＮアーゼＨ活性を含む請求項 ６８に記載の方法。 ７０．工程（ａ）（６）の酵素が、添加された外性ＲＮアーゼＨを含む請求項６ ８に記載の方法。 ７１．標的核酸配列の多数のコピーを合成する方法であって、（ａ）ＲＮＡ標的 配列の一部分に対し相補的であり、ＲＮＡ標的の該部分と複合体を形成するプラ イマーを選択し（ただし、ＲＮＡ標的の該部分はこれが実質上減成されずに残る ように位置している）；（ｂ）該プライマーの伸長により得られたＤＮＡの部分 に相補的であり、実質上全ての相補的ＲＮＡが該ＲＮＡの減成により二本鎖から 除去されている領域のＤＮＡと複合体を形成するプロモーター−プライマーを選 択し；そして、 （ｃ）該ＲＮＡ標的を、該プロモーター−プライマー、付随するＲＮアーゼＨ活 性を有する逆転写酵素および転写酵素と合し、標的核酸配列の多数のコピーを形 成させることからなる方法。 ７２．工程（ｃ）において外性ＲＮアーゼＨが添加される請求項７１に記載の方 法。 ７３．工程（ｃ）の逆転写酵素が付随するＲＮアーゼＨ活性を欠く、請求項７２ に記載の方法。 ７４．標的核酸配列の多数のコピーを合成する方法であって、（ａ）ＲＮＡ標的 配列の一部分に対し相補的であり、ＲＮＡ標的の該部分と複合体を形成するプラ イマーを選択し（ただし、ＲＮＡ標的の該部分は、選択されたＲＮアーゼＨによ る減成に暴露された後になおプライマー伸長産物を形成できるように位置してい る）；（ｂ）該プライマーの伸長により得られたＤＮＡの部分に相補的であり、 実質上全ての相補的ＲＮＡが該ＲＮＡの減成により二本鎖から除去されている領 域のＤＮＡと複合体を形成するプロモーター−プライマーを選択し；そして、 （ｃ）該ＲＮＡ標的を、該プロモーター−プライマー、付随するＲＮアーゼＨ活 性を有する逆転写酵素および転写酵素と合し、標的核酸配列の多数のコピーを形 成させることからなる方法。 ７５．工程（ｃ）において外性ＲＮアーゼＨが添加される請求項７４に記載の方 法。 ７６．工程（ｃ）の逆転写酵素が付随するＲＮアーゼＨ活性を欠く、請求項７５ に記載の方法。 ７７．標的核酸配列の多数のコピーを合成する方法であって、（ａ）ＲＮＡ標的 配列の一部分に対し相補的であり、ＲＮＡ標的の該部分と複合体を形成するプラ イマーを選択し（ただし、ＲＮＡ標的の該部分はこれが実質上減成されずに残る ように位置している）；（ｂ）該プライマーの伸長により得られたＤＮＡの部分 に相補的であり、実質上全ての相補的ＲＮＡが該ＲＮＡの減成により二本鎖から 除去されている領域のＤＮＡと複合体を形成するプロモーター−プライマーを選 択し；そして、 （ｃ）該ＲＮＡ標的を、該プロモーター−プライマー、付随するＲＮアーゼＨ活 性を有する逆転写酸素および転写酵素と合し、実質上同等の数の該ＲＮＡ標的配 列と同じ極性のＤＮＡコピーを作らずして、該ＲＮＡの多数のコピーおよび該Ｒ ＮＡに対して相補的なＤＮＡの多数のコピーを形成させることからなる方法。 ７８．工程（ｃ）において外性ＲＮアーゼＨが添加される請求項７７に記載の方 法。 ７９．工程（ｃ）の逆転写酵素が付随するＲＮアーゼＨ活性を欠く、請求項７８ に記載の方法。 ８０．標的核酸配列の多数のコピーを合成する方法であって、（ａ）ＲＮＡ標的 配列の一部分に対し相補的であり、ＲＮＡ標的の該部分と複合体を形成するプラ イマーを選択し（ただし、ＲＮＡ標的の該部分は、選択されたＲＮアーゼＨによ る減成に暴露された後になおプライマー伸長産物を形成できるように位置してい る）；（ｂ）該プライマーの伸長により得られたＤＮＡの部分に相補的であり、 実質上全ての相補的ＲＮＡが該ＲＮＡの減成により二本鎖から除去されている領 域のＤＮＡと複合体を形成するプロモーター−プライマーを選択し；そして、 （ｃ）該ＲＮＡ標的を、該プロモーター−プライマー、付随するＲＮアーゼＨ活 性を有する逆転写酸素および転写酵素と合し、実質上同等の数の該ＲＮＡ標的配 列と同じ極性のＤＮＡコピーを作らずして、該ＲＮＡの多数のコピーおよび該Ｒ ＮＡに対して相補的なＤＮＡの多数のコピーを形成させることからなる方法。 ８１．工程（ｃ）において外性ＲＮアーゼＨが添加される請求項８０に記載の方 法。 ８２．工程（ｃ）の逆転写酸素が付随するＲＮアーゼＨ活性を欠く、請求項８１ に記載の方法。 ８３．標的核酸配列の多数のコピーを合成する方法であって、（ａ）ＲＮＡ標的 配列の一部分に対し相補的であり、ＲＮＡ標的の該部分と複合体を形成するプラ イマーを選択し（ただし、ＲＮＡ標的の該部分は、選択されたＲＮアーゼＨによ る減成に暴露された後になおプライマー伸長産物を形成できるように位置してい る）；（ｂ）該プライマーの伸長により得られたＤＮＡの部分に相補的であり、 さらなるプライマー伸長産物ＤＮＡの伸長が該プロモーター−プライマーの相補 体を生成させるよう、該ＲＮＡの５′端の十分量が二本鎖から除去されている領 域のＤＮＡと複合体を形成する、プロモーター−プライマーを選択し；そして、 （ｃ）該ＲＮＡ標的を、該プロモーター−プライマー、付随するＲＮアーゼＨ活 性を有する逆転写酵素および転写酵素と合し、標的核酸配列の多数のコピーを形 成させることからなる方法。 ８４．工程（ｃ）において外性ＲＮアーゼＨが添加される請求項８３に記載の方 法。 ８５．工程（ｃ）の逆転写酵素が付随するＲＮアーゼＨ活性を欠く、請求項８４ に記載の方法。 ８６．標的核酸配列の多数のコピーを合成する方法であって、（ａ）ＲＮＡ標的 配列の一部分に対し相補的であり、ＲＮＡ標的の該部分と複合体を形成するプラ イマーを選択し（ただし、ＲＮＡ標的の該部分は、選択されたＲＮアーゼＨによ る減成に暴露された後になおプライマー伸長産物を形成できるように位置してい る）；（ｂ）該プライマーの伸長により得られたＤＮＡの部分に相補的であり、 該プロモーター−プライマーが該プライマーの伸長により得られる該ＤＮＡの３ ′端と複合体形成するよう、該ＲＮＡの５′端の十分量が除去されている領域の ＤＮＡと複合体を形成する、プロモーター−プライマーを選択し；そして、（ｃ ）該ＲＮＡ標的を、該プロモーター−プライマー、付随連するＲＮアーゼＨ活性 を有する逆転写酵素および転写酸素と合し、標的核酸配列の多数のコピーを形成 させることからなる方法。 ８７．工程（ｃ）において外性ＲＮアーゼＨが添加される請求項８６に記載の方 法。 ８８．工程（ｃ）の逆転写酵素が付随するＲＮアーゼＨ活性を欠く、請求項８７ に記載の方法。 ８９．（ａ）ＤＮＡ合成が開始し得る条件下で、ＲＮＡ標的配列を含む核酸を、 標的配列の３′末端部分に対してこれと複合体を作るに十分相補的な複合体形成 配列を有する第一プライマーを含む第一のオリゴヌクレオチドで処理し、； （ｂ）鋳型として該標的を使用する伸長反応でプライマーを伸長してＲＮＡ標的 に対し相補的なＤＮＡプライマー伸長産物を得；（ｃ）該ＲＮＡ標的の５′端を 選択的に消化し；（ｄ）ＤＮＡプライマー伸長産物を、ＤＮＡ合成が開始し得る 条件下で、プライマーまたはスプライスの鋳型を含み、且つ該ＤＮＡプライマー 伸長産物の３′末端部分に対し十分相補的な複合体形成配列を有する第二のオリ ゴヌクレオチドで処理し；（ｅ）第一プライマー伸長産物の３′末端をＤＮＡ伸 長反応で伸長してＲＮＡポリメラーゼのための鋳型を生成し、そして；（ｆ）工 程（ｅ）の鋳型を用い、プロモーター配列を認識するＲＮＡポリメラーゼを使用 して標的配列のＲＮＡコピーを多数生成させる、 ことからなる、標的核酸配列の多数のコピーを合成する方法。 ９０．工程（ｃ）の減成が酵素的である請求項８９に記載の方法。 ９１．酵素的減成にＲＮアーゼＨを使用する請求項９０に記載の方法。 ９２．標的配列の多数のコピーを自触的に合成するためにオリゴヌクレオチドお よびＲＮＡコピーを使用することをさらに含む、請求項８０に記載の方法。