JPH04500912A

JPH04500912A - 乏精子症男性における受精能の客観的生化学的測定法

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Publication number: JPH04500912A
Application number: JP1511042A
Authority: JP
Inventors: ハスザー，ガボー・ビー
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1988-10-11
Filing date: 1989-09-29
Publication date: 1992-02-20
Also published as: WO1990004039A1; DE68921763D1; EP0438493A4; US4945044A; AU4424189A; EP0438493A1; EP0438493B1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】乏精子症男性における受精能の客観的生化学的測定法見所□□□分野本発明は、乏精子症男性の精子における受精能を測定する為の生化学的方法に関するものであり、特に精子の細胞生理機能における、特定の酸素の分離および測定を利用した方法に関するものである。

従来Φ技術畢丸は、精子形成、精子生産及び精子成熟の為の部位としての役割を担っている。精子形成に関して考えうる問題点の診断は、通常１回射精液中の精子濃度を測定することによって行なわれる。すべての男性は精子数が変動するがその精子数が正常精子（ＮＳ）患者の通常量２０Ｘ１０’精子／ｄ未満の乏精子症（Ｏ３）患者においては、時折精子が欠乏することから変動がより顕著である。精子濃度の低下は、下垂体の問題、ホルモン量の不足、畢丸の疾患、加齢、環境的要因、発熱或いは過熱、仕事場における有機溶媒の被曝等がその原因となりうる。

不妊の夫婦における男性の因子或いは原因の発生する率は約４０％であることがわかってきた。これら不妊及び低受精率の男性の圧倒的大多数は、乏精子症及び／或いは精子無力症（精子の運動性が４０％未満）である、乏精子症の患者に関しては、その受精能力を予測する或いは確める方法が無い為、又は受精能力が欠乏している為、これらの男性が何年間かかっても子供の父親になろうとする場合には処置上の問題が存在する。精子を子宮内に入れること、或いは対外受精に関し、男性が不妊因子を持っている夫婦が妊娠する率はわずかに約２０％である。

これは好性乏精子症の夫と不妊性乏精子症の夫との間で、精子の濃度及び運動性に違いがなくてもそうである。男性の不妊症を処置する為には、乏精子症の検体における精子の質を、客観的な生化学的パラメーターを基に評価することが本質的に必要であることが徐々に明らかになってきた。

古典的な精液の分析パラメーター、すなわち精子の濃度、運動性及び速度以外に、選定の精子の機能を評価する現在の方法には、遁走或いは“スウイムアノプ” を伴なう運動性精子生産の評価、頚部粘液の侵入試験、アクロンン活性の測定、すなわち精子の侵入を促進する酵素、精子の膜に損傷がないかどうかを調べる低浸透性精子の腫脹法、及び精子の運動パターンの解析がある。これらの試験番よし）ずれも精子の生理学調査を総合的に処理するものではなし１し、受精能力との相互関係を強く示すものではない。より生物学的方法に関連の深い、人間の精子とフリーなハムスターの卵母細胞との浸透試験でさえも、好性の測定とむ）うよ引よ、どちらかと言うとより否定的な側（例えば、浸透速度が１５−２０％未満及び体外受精を行なった人の成功率低下）にある。

従来技術の問題点を心に留め、従って本発明の目的は、乏精子症男性の受精能力を予測することのできる客観的生化学的測定法を提供することにある。

本発明のもう一つの目的は、受精し易い時期を比較的高い正確性を持って予測することができる精子の試験法を提供することにある。

さらに本発明のもう一つの目的は、１回の射精液を用いて行なう精子の受精能力試験法を提供することである。

本発明のもう一つの目的は、精子の細胞成熟期を決定する方法を提供することである。

発哩曵開丞技術熟練者にとっては明白であろうと思われる上記及び他の目的番よ、精子の質の試験法を提供する本発明において達成される。その試験法には、精子検体を採取すること、その精子検体からＧＫ酵素を検出すること、そのＣＫ酵素のＣＫＸ異性体（アイソフオーム）から第一のＣに酵素の濃度を測定すること、及びその第一のＣＫ酵素の濃度を基に精子の質的パラメーターを決定することが含まれて（する、第二のＣＫ酵素濃度は、ＣＫ酵素のＣＫＢ異性体に関して測定するのが望ましく、こ泊よ又、精子の質的パラメーターを決定する際の基盤としても用し）られる、電気泳動及び螢光法によるＣＫＸ及びＣＫＢ異性体の量の測定は、第 −及び第二ＣＫ酵素濃度の決定に用いられる。精子の質的パラメーターは、ＣＫＸ及びＣＩＩＢ異性体の総しベＩしに対するＣ）ｆＸ異性体レベルの比に比例する。予しめ見積っておいた精子の質的レベルの最低限を満たす精子は、受精の見込みが高いものとして分類され、卵子への生体内或いは生体外受精への試みに用いる様選択される。

区血曵固単秘説皿第１図は、異なる精子濃度での検体の精子ＣＫ酵素活性をグラフに表わしたちのである。

第２図は、典型的な乏精子症及び正常精子患者の精子検体における、ＣＫＸ及びＣＫＢ異性体螢光測定の違いをグラフに示したものである。

第３図は、９４検体の精液における、精子ＣＫ活性とＣＫＸ異性体濃度との相互関係をプロットしたものである。

第４図は、本発明に間する精子検体の調製法を複合的に図示したものである。

本発朋少実施法本発明は、精子の細胞生理学において重要な生化学的マーカーを明らかにし、そして、これらマーカーのレベルを測定し、精子の質及び受精能力のレベルに関連する方法を提供するものである。そのマーカーは、ウニの精子で明らかにされている“クレアチンリン酸シャトル”の構成要素として、エネルギーの合成及び運搬において鍵をにぎる酵素であるクレアチン−Ｎ−ホスホトランスフェラーゼ（ＣＫ）酵素の異性体の両分を固定してきた。この酵素及びその異性体が重要であることがわかってきた。何故ならば、精子の最も本質的でエネルギーの高い機能は、それらのアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を燃料とする運動性だからである（人の場合、精子の遊走速度は１分間にその長さの４０倍、或いは約毎時３マイルに保たれる）。

乏精子症及び正常精子の男性において精子ＣＫ活性を測定したところ、精子あたりのＣＫ活性と精子濃度との間には、第１図中のプロットに示される様な反比例の関係があることがわかってきた。最初の精液検体、及び自己遊走選定法によってその運動性と直線速度とを高めた精液検体中の精子ＣＫ活性の測定は、改良した検体のＣＫ値の方が低いことを示している。何人かの乏精子症男性において、その遊走した精子部分のＣＫ活性は正常精子の男性のそれと同じである。最初の精子検体中の＋Ｊ活性、及び遊走した部分の改良度は、受精し昌い性質を持つ一部分の精子の相対濃度が好性の正常精子男性のそれと同しであることを反映している。その際のＣに活性は、乏精子症男性の精子の質及び受精能力を予測するのに用いることが可能で、精液分析及び男性の不妊症患者の処置において新しい技術を提供する。

Ｃに酵素は、異なる遺伝子によって生しるアミノ酸配列の違いを除き、他の点では同じ酵素活性を有する一種以上の異性体から構成されていると言える０人体組織における三種のＣＫ異性体はすでに筋型（Ｍ）、扇型（Ｂ）及びミドコンドＩＪア型（Ｍｉ）と命名されている。それらのＧＫ異性体は、聞、　ＭＢ、　ＢＢ或ｔＡはＭｉＭｉ二量体として存在している。　ＣＫは多くの器官に含有されているが、その異性体の分布番よその器官ごとに異なっているａ　１ｍ、胃、腸、膀胱及び肝臓には、ＧＫ酵素のＢＢ異性体二量体が主に含まれている。成育した骨格筋にはその間二量体が非常に多く含まれているが、一方胎児の骨格筋にはＢ型のＣＫ酵素が主に含まれて０ること力くわかってきている０Ｍ型ＣＫ酵素の生成を指示する遺伝子は、筋肉の成育過程を終えた後活性化されることが見出されてきた。

本発明は、未成育な筋肉と成育した筋肉との間に相異が見られるのと同様に、精子においても未成育な精子細胞と成育した精子細胞とはそれぞれ特有のＣＫ異性体成分濃度を有しており、そこには相異が見られるという発見に一部基づし１て（する、意外なことに、乏精子症の検体から採取した、しかも高いＧＫ活性を有して０る精子は、高レベルのＢ型精子ＣＫ酵素異性体（又は’ＣＫＢ″とも呼ぶ）を含んで０ることか見出された。しかしながら、正常精子で好性の男性は、ＣＫＢに加え、ここではＸ型酵素異性体（又は”ＣＫＸ”とも呼ぶ）と呼ぶことにしようと考えてしする別な精子Ｃに酵素異性体も有している。このＣＫＸアイソザイムは、ＣＫ酵素のＭ型異性体に似ているが、アガロース電気泳動法において筋型のＭ異性体と比べると、遅延因子に約８％の違いがあり、明らかに別な位置を占めて＆Ｓる。又、精子ＣＫＸアイソザイムは、筋型Ｍとは対照的に、筋ＣＰＭと精子ＣＰＢヘテロニ量体とを混ぜるという実験条件下、生体内でも生体外でもＭ８ノ〜イブリッドを形成すること番よなし）。

又ＣＫＸ及びＣＫＭ異性体は、種々の酵素阻害剤に対する反応も相異してしする。

本発明の方法及びシステムを試験する為、様々な乏精子症及び正常精子検体において、精子ＣＫ活性と精子ＣＫＸｆＡ度との関係に関する実験を行なった。乏精子症患者ではＣＫＸ濃度が非常に低く、重症の乏精子症患者の何人かはＣＫＢ異性体し力１有しておらず、ＣＫＸは検出されなかった。第２図は、電気泳動によって分離した精子のＣＫＸ及びＣＫＢ異性体について、その走査螢光パターンの典型的比較をグラフしたものである。左側のグラフで、重症の乏精子症患者の検体にはＣＫＢ異性体した存在しない、右側の正常精子患者の検体には、ＣＫＢ異性体に加えてＣＫＸ異性体も存在している。第３図に示す樺に、９４の観察値に関して精子ＣＫ活性をＣＫＸ濃度の関数としてプロットしたものは、その二つが比例関係にあり、高い相関係数（ｒ−０，８７）と高い有意性（ｐ＝０．００１）とを示した。精子ＣＫＸｉｌｌ１度と受精能力との相関関係についても試験を行ない、男性の受精能力を予測する方法が見出された。

その方法的見地に加え、本発明は精子の質及び受精能力を一つのキットにまとめて測定することのできるシステムも徒供する。このテストシステムおよびキットは、男性病学研究所、及び泌尿器科医と受精専門家の専門医院で用いられることを意図している。又、既存のＣＫ電気泳動装置の幾つかには、多量の検体を取扱うことのできる性能がある為、その試験は、仕事での有害な環境危険物に対する人間の大量集団検診において、又は軍隊等においても用いられ得る。

精子ＣＰＫ異性体比率の検出法は、次の各段階から成っている。すなわち、ｌ）精液から精子検体を調製すること、２）精子Ｃに異性体を電気泳動することにより、検出及び測定が可能なＣに異性体を定置的に生成させること、３）ＮＡＤＨ螢光法によるＣＫ活性の発色、及び４）そのＣに活性を光度検出し、ＣＫχ及びＣにＢ異性体比率を積算して測定すること、これらは、精子の質の測定値であるＣＫＸ／　（ＣＫＢ＋ＣＫＸ）比を決定するのに用いられる。

第４図に示す様に、検体の調製には、（ａ）試験管或いはバイアル１１に精子検体１０を採取及び調製すること、（ｂ）遠心により、撹拌しながらその検体に精子洗浄溶液１２を加えること、及びｆｃｌ洗浄した検体を濃縮することによって精子ペレット１４を得ること、以上が含まれる。さらにそのペレットに均質溶液を加えて（ｄ）スターラー或いはプランジャー１５で均質化し、（ｅ）精子ホモジネート１６を調製する。さらにその精子ホモジネートを（ｆ）遠心し、それを透明にする。ピペット１８を用いて精子の上層抽出物のアリコートを取り、さらに（ｇ）それを電気泳動板２４の分離溝２２にのせる。

Ｃにアイソザイムの分析を正しく解析する為には、適切な検体を採集すること、及び精子を洗浄して精液の流体を取り除くことが重要である。採集後直ちに測定を行なわない場合には、その洗浄した精子ペレットを−ＳＨ基保護剤を含む緩衝液で覆い、冷蔵しておかねばならい、そしてそれは、４’Ｃで４８時間以内なら貯蔵が可能である。さもなければ、その精子ペレットは一２０°Ｃで数週間以内なら、その活性を失なうことなしに冷凍貯蔵することができる。冷凍及び解凍の繰返しは、ＣＫ活性を損なうので避けなければならない。

精子ＣＫ異性体の測定は、臨床実験室で心筋障害の診断の為、患者の血清中のＣＫ比を測定する除用いる型の装置及び組成物を用いて行なう、これらには、電気泳動用試薬、Ｃ）ｆ酵素を電気泳動分離する為のアガロース或いは酢酸セルロースゲル、及び活性検出用試薬が含まれる。活性ピークの積算と同様、螢光検出及び走査も通常各製造業者のプレートに適した自動測定機を用いて行ない、Ｃに異性体のレベルを測定する。

Ｃにアイソザイムの分離法は色々あるが、中でも電気泳動法が最も効率的で、比較約１ｉ１である。Ｃにアイソザイムは、電気泳動によりアガロース媒質中で分離される。アイソザイムを含む、明確に分離されたゾーンは、そのアガロースをタレアチンキナーゼ基質で覆うことによって検出される。Ｃに異性体の存在及び活性は、その酵素活性により検出する。　ＣＫは、クレアチンリン酸からアデノシンニリン酸（ＡＤＰ）へのリン酸の転移を触媒し、クレアチンとアデノシンニリン酸（ＡＴＰ）を生成させる。このＣＫ反応で生成されたＡＴＰは、グルコース６−リン酸の生成に利用される。この反応は、酵素へキソキナーゼにより促進される。グルコース６−リン酸が生成すると、ＡＤＰは濃度が一定量に保たれながら再生される。さらにグルコース６−リン酸は、酵素グルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼによって酸化され、それと同時にニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）は螢光誘導体ＮＡＤＨへと還元される。そのＣに基質には、これらの反応及びインキュベーション後に必要な試薬が全て含まれており、そのＣＫ異性体の活性と比例関係にあるＮＡＤＨ螢光は、走査螢光計によって電気泳動フィルム上で定量される。

実施側本発明の方法による好ましい精子試験法は次の通りである：本発明の精子試験法には、使用前に精製水を加えることによって再生可能な四種の濃縮試薬、均質化に用いるプランジャーに合う１５ａｆの目盛付コニカル試験管、及びＣに同位体を電気泳動する為の透明なアガロース或いは酢酸セルロースの電気泳動板とから成るキットを用いる。

試圭ｌ）精子洗浄液、（ホスフェート緩衝液−標準（０，１５Ｍ）食塩水、ｐＨ７７，０１）　。

２）揉り抱１化３踵、（ホスフェート緩衝液−標準食塩水、ｐＨ：　７．０　、２０ｍＭ　ＤＴＴ。

０．１％トリトン）。

３）電気床劾復衡戒：ＭＨ５（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）　ｐＨ６，２。

４）堕益１ｉ、（本熔液ｌｉｄは、ＣＫ基質の１バイアルを溶解するのに用いられる）。

潤性成分　拭果虫生辰柊濃度クレアチンリン酸　９０１１Ｍアデノシンニリン酸　１２ｍＭマグネシウム゛ｔ　６０ｄアデノシン−リン酸　１５ｍＭニコチンアミドアデニンジヌクレオチド　６−門グルコース　６０−ＭＮＡＣ６（１ｗＭヘキソキナーゼ　９Ｘ１０３１υル（３０°Ｃ）グルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼ　７．５Ｘ　１０’ｌＵ／Ｌ（３０°Ｃ）検体曵廻■二１）精子は採集後できるだけ速やかに精液流体から分離し、精子洗浄液中で洗浄しなければならない；２）ｆｉ！ｌｉｔ後、その精子ペレットを０．２ｉｄの均質化溶液中で均質化しなければならない（スターラー或いはプランジャーで１０回）；３）その精子ホモジネートを遠心により透明にする；さらに４）その精子抽出物のアリコート０．０ＯＩｄ、　０．００２ｄ及び０．００５ｄを電気泳動にかける。

もしも試験を採集後３時間以内に行なうことができない場合には、約０．２ｄの均質化溶液で覆わなければならない、そうすれば、冷蔵で３日間、冷凍（−２０ °Ｃ）なら二ケ月以内貯蔵することができる。冷凍及び解凍を繰返すと酵素が失活するであろう。

驚入床軌汰＝ｌ）再生したＭＥＳ１３１衝液を、電気泳動セルの各室に入れる。各室の緩衝液をならし、中央部分の水分をぬぐい取る；２）アガロース或いは酢酸セルロースの電気泳動板を、その硬いプラスチックカバーから静かにはがす。フィルムは、注意深くその端のみを手で触る；３）三つの検体溝（通常０．００１．０．００２．０．００５ｄ）に、検体の三つの異なるアリコートを様々なサンプルにおける活性の違いが見込めるように設定して加える。検体は定量的ミクロリットルディスペンサーと使い捨ての検体チップを用いなければならない、各検体毎に新しいチップを用いる。その小滴が液溜めに触れる様にする。ピペットが溝或いは板表面に触れてはならない。

検体はできるだけ素速く加える。検体を加えてからアガロースに拡散するのに１分間放置する；４）その装填済のアガロースフィルムを、それが下側になる様、そのアガロースフィルムの陽極（＋）側とセルの陽極（＋）側とが合う様にして電気泳動セルに入れる。さらに、５）電源を入れ、適切な電流が供給できる樺調整する０通常は９０Ｖを使用し、２０分間電気泳動させる。

郊　ハンドの口　：１）を気泳動後、余分な緩衝液をセルから排出し、アガロースフィルムの端をしっかりとつかんでそれを取り出す、そのフィルムを、アガロースの側が上になる欅に、しかも陰極（−）の端が作業者の方を向く様にして平らなカウンター甲板上に置り；２）ゲルに沿って一度折り返しふくことにより、アダロースの端から残りの緩衝液を吸取る；３）アガロースフィルムの陰極（−）の縁に沿って、５ＩＩｌの血清学用ピペットを縦長に置＜；４）陽極と向かい合せになっているその５Ｉｄの血清学用ピペットの縁に沿ってアガロースの表面上に基質１ｄを平らに分配する；５）その基質を広げる為、そのピペットをアガロースフィルムと交差して、陽極の縁のしみ込んだ領域に差し掛かる所までゆっくりと押す；６）そのアガロースフィルムをそれが上になる様にして、湿らせた吸取紙の上の予熱した定温ｎｍに差し込み、そのプレートを３７°Ｃで２０分間温１する；７）温室後、そのアガロースフィルムを乾燥定温器／オーブン内に置＜、　１５−２０分間或いは乾くまで乾燥する−８）その乾燥したアガロースフィルムを紫外光（３６５ｎｍで）下で検定する。ＣＫアイソザイム活性のある部分は青白い螢光ハンドとして現れる；９）そのアガロースフィルムを、３６５ｎｓの励起波長を有し、４６０ｎ−の発光波長を探知する光度走査針を用いて走査する。

体外受精への試みを行なった４７検体の精液について目かくし試験を実施したところ、精液の質的パラメーター（ＣＫＸ／ｆＪＸ　＋ＣＫＢ）と、結果として得られた妊娠との間には十分な相関関係が認められた。ＣＫＸ／ＣＸＸ＋ＣＫＢの比を基に、我々は検体を受精の見込みが極めて低い群（１０検体）、受精の見込みが中程度の群（８検体）及び受精の見込みが高い群（２９検体）の各群にクラス分けした。４７検体の精液から５６の胚及び９件の妊娠という結果が得られた。受精が成功する見込みの低いものとして分類されたｌＯ検体の精液では、胚はわずかに５件、妊娠は１件もなかった。受精能力が中程度であるとされた８検体の精液では、胚が９件、妊娠は２件であった。受精の見込みが高いとされた２７検体の精液では、４２件の胚、７件の妊娠が認められた。受精に必要な精子の質的パラメーターのレベルは、最低的０，１０であると判断される。様々な製造業者による電気泳動フィルム及び螢光検出システムを用いる為、検出レベルには若干のばらつき（±５％）がある、しかしながら、その値は同じシステムを用いることによって一定になる。

この様に本発明は、−回射精液中のＣＫＸ型及びＣＫＢ型異性体全体に対するＣＫＸ型異型体性体性比の様に、精子の一つのパラメーターのみを基にして、精子の成熟度及び受精能力を定量的に評価できる有用で待望の方法を提供している。

精子ＣＫＸ酵素の濃度は、検体中の成熟精子の一部分の存在と比例関係にある。

精子の質的パラメーターを測定した後、予め定めた最低レベル（例えば比が最低０．１０）を有する精子は、体内或いは体外法によって人の卵子を受精させる為に選択することができる。これには場合により、受精への試みを行う以前に精子を強化する方法による精子選択を含んでも良い。

さらに、これらの生化学的パラメーターによる精子の質の定量的評価は、スイムアップ選択法、精子の自己遊走法、或いは様々なカラム分離及び成分遠心法の様な任意の精子強化法における改良の目安としての役割も担っている。　ＣＫＸ濃度は一回射精液中、及び欅々な精子強化法により調製した精子画分中に、様々な種類の精子集団が存在することを反映している。

本発明によるＣＫ異性体比を用いる生化学的方法は、精液の細胞成熟度の目安を提供しており、将来は、進歩した生殖法、すなわち卵母細胞への精子の注入に用いる為に、−回の妊性精液を選択することが可能になると言える。

又本発明は、精子欠損の体外治療につながるであろう診断手段をも提供している。ＣＫＸの様な生化学的マーカーにより、精子の質の変化を評価することが可能になり、男性労働者が有害条件下に身をさらしている様な工業環境における有効な集団検診法として用いることもできる。さらにそのＣＫＸ比により、種々の薬剤で治療を行なっている、或いは老齢化しつつある男性患者における精液のモニターができる欅になるであろう、又、ホルモン或いはペプチド誘導体で精子形成を一時的に減退させたり、それに変化をもたらしたりすることによる男性の避妊法の効果をモニターすることもできる。この様な処置が終了した後、ＣＫＸ濃度を調べれば、正常な精子形成の回復がわかるであろうし、各人においてその精子の質が処置以前のレベルに達していることがモニターされるであろう。

又本発明によるＣＫＸ濃度の測定は、種馬及び雄牛の様な動物の精子の質について述べる際にも、さらに受精能力及び繁殖の熟達を予測する際にも用いることができる。

本発明は、特定の具体例に関して記載してきたが、本発明の理念及び領域から離れることなく多様化することは可能であり、しかもそれが、発明の理念及び領域を出ることなく例解することを目的としてここに記載した本発明の変化及び改良、その全てを網羅するものであることは、技術熟練者には理解頂けるであろう。

精７膚皮（１０’／ｍ１） −，１０１，７０３，５１５，３１ＣＫＸ濃Ｌ（％）ＦＩＧ、４（ａ）　ＦＩＧ、４（ｂ）　ＦＩＧ、４（ｃ）補正帯の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成　３年　４月１１日１、特許出願の表示ＰＣＴ／ＵＳ８９１０４３０１、発明の名称乏精子症男性における受精能の客観的生化学的測定法３、特許出願人住　所　アメリカ合衆国コネチカット州０６５２５．　ウッドブリッジ。

チェストナッヒ・レーン　１６氏　名　ハスザー、ガボー・ビー４、代理人住　所　東京都千代田区大手町二丁目２番］−号新大手町ビル　２０６区電話　３２７０−６６４１〜６６４６５、補正帯の提出日（請求の範囲全頁の差替）請求少範西１、ａ）精子検体を手に入れること；ｂ）前記精子検体から精子Ｃに酵素を検出すること；Ｃ）前記Ｃに酵素の（ＪＸ異性体に関し、Ｃに酵素濃度を測定すること；及びｄ）そのＣＫ酵素濃度を基に精子の質的パラメーターを決定すること（その際、前記ＣＸＸ異性体の濃度の増加は前記精子検体の受精の可能性がより高いことを表わす。）；の各ステップから成る精子の質の試験法。

２、前記ＣＫ酵素のＣ）ｉＢ異性体に関し、第二のＣＫ酵素濃度を測定するステ、プを含み、さらに前記ステップ（ｄ）において、第二〇〇に酵素濃度も基にして精子の質的パラメーターを決定する請求項１記載の方法。

３、前記の第−及び第二ＣＫ酵素濃度をＣＫＸ及び（ＪＢ異性体の活性パラメーターから測定し、前記精子の質的パラメーターが、ｆＪＸ異性体濃度のＣＫＸ及びＣＫＢ異性体の総濃度に対する比率と比例関係にあり、高い比率はど前記精子検体の受精の可能性が高いことを表わす請求項２記載の方法。

４、前記精子検体を電気泳動にかけ、前記ＣＫ酵素異性体の検出及び測定を行なう請求項３記載の方法。

５、電気泳動に続いて、前記（Ｊ酵素を反応させて誘導体生成物とし、しかもその前記誘導体生成物が前記ＣＸＸ及び（ＪＢ異性体の酵素活性に比例して螢光を発する請求項４記載の方法。

６　ステップ（ａ）と（ｂ）との間に、検出及び測定が可能なＣに異性体を定量的に生成させるステップをさらに含んでいる請求項１記載の方法。

７、（ｅ）体内或いは体外受精への試みに用いる為、前記精子の質的パラメーターに関する予め定めた最低レベルに達している精子を選定すること、をさらに含んでいる請求項１記載の方法。

８、ｔｅ１体内体内或体外受精への試みに用いる為、前記精子の質的パラメーターに関する予め定めた最低レベルに達している精子を選定すること、をさらに含んでいる請求項３記載の方法。

９、前記精子の質的パラメーターの最低レベルが、ＣＸＸ異性体濃度のＣＫＸ及びＣＫＢ異性体濃度の総計に対する比率によって決定される時、それが約０．１０である請求項８記載の方法。

１０、選定した精子の質的パラメーターの試験が、受精を試みる以前、精子強化法後に行なわれる請求項７記載の方法。

１１、精？−ｆｃ浄液；精ｒ均質化液；電気泳動緩衝液；精子検体中のＣに酵素を検出する為の電気泳動フィルム；及び電気泳動により分離されたＣＫＸ及びＣＫＢ異性体の活性と比例関係にある螢光誘導体を形成する為のＣＫ基ｆ＆１１成物；を含み、ＣＸＸ異性体の精子ＣＫ酵素濃度を測定することにより精子の質と受精能力とを決定する（但し２、ＣＸＸ異性体の濃度の増加は前記精子検体の受精の可能性が高いことを表わす、）ためのマルチバートシステム。

１２、キット中で、前記溶液及び前記組成物が使用前に水で稀釈するようにｆｉＦＡされた形で存在している請求項１０記載のシステム。

１３、前記精子洗浄液と均質化液とを用いる為の容器及び均質化手段をさらに含んでいる請求項１２記載のシステム。

国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．ａ）精子検体を手に入れること；ｂ）前記精子検体から精子ＣＫ酵素を検出すること；ｃ）前記ＣＫ酵素のＣＫＸ異性体に関し、第一のＣＫ酵素濃度を測定すること；及びｄ）その第一のＣＫ酵素濃度を基に精子の質的パラメーターを決定すること；の各ステップから成る精子の質の試験法。
２．前記ＣＫ酵素のＣＫＢ異性体に関し、第二のＣＫ酵素濃度を測定するステップを含み、さらに前記ステップ（ｄ）において、第二のＣＫ酵素濃度も基にして精子の質的パラメーターを決定する請求項１記載の方法。
３．前記の第一及び第二ＣＫ酵素濃度をそれぞれＣＫＸ及びＣＫＢ異性体の活性パラメーターから測定し、しかもそこで、前記精子の質的パラメーターが、ＣＫＸ異性体レベルのＣＫＸ及びＣＫＢ異性体の総レベルに対する比率と比例関係にある請求項２記載の方法。
４．前記精子検体を電気泳動にかけ、前記ＣＫ酵素異性体の検出及び測定を行なう請求項３記載の方法。
５．電気泳動に続いて、前記ＣＫ酵素を反応させて誘導体生成物とし、しかもその前記誘導体生成物が前記ＣＫＸ及びＣＫＢ異性体の酵素活性に比例して螢光を発する請求項４記載の方法。
６．ステップ（ａ）と（ｂ）との間に、検出及び測定が可能なＣＫ異性体を定量的に生成させるステップをさらに含んでいる請求項１記載の方法。
７．（ｅ）体内或いは体外受精への試みに用いる為、前記精子の質的パラメーターに関する予め定めた最低レベルに達している精子を選定すること、をさらに含んでいる請求項１記載の方法。
８．（ｅ）体内或いは体外受精への試みに用いる為、前記精子の質的パラメーターに関する予め定めた最低レベルに達している精子を選定すること、をさらに含んでいる請求項３記載の方法。
９．前記精子の質的パラメーターの最低レベルが、ＣＫＸ異性体のＣＫＸ及びＣＫＢ異性体総計に対する比率によって決定される時、それが約０．１０である請求項８記載の方法。
１０．選定した精子の質的パラメーターの試験が、受精を試みる以前、精子強化法後に行なわれる請求項７記載の方法。
１１．精子洗浄液；精子均質化液；電気泳動緩衝液；精子検体中のＣＫ酵素を検出する為の電気泳動フィルム；及び電気泳動により分離されたＣＫＸＸ及びＣＫＢ異性体の活性と比例関係にある螢光誘導体を形成する為のＣｋ基質組成物：を含み、精子の質と受精能力とを測定するための請求項６記載の方法で用いられるマルチパートシステム。
１２．キット中で、前記溶液及び前記組成物が使用前に水で稀釈するように濃縮された形で存在している請求項１０記載のシステム。
１３．前記精子洗浄法と均質化液とを用いる為の容器及び均質化手段をさらに含んでいる請求項１２記載のシステム。