JPH04501060A - Ｌ―フェニルアセチルカルビノール（ｐａｃ）の製造方法、その方法に使用するための微生物及びその微生物を調製するための方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｌ〜フェニルアセチルカルビノール その　法に　るための　びその　を ｉｏ′Ｉ　るための １１坏と１量 本発明は、１−エフェドリン及びｄ−プソイドエフェドリンの製造において中間 体として有用であるフェニルアセチルカルビノール（ＰＡＣ）の製造方法に関す る。本発明はまた、フェニルアセチルカルビノールの製造に使用するために特に 適合された微生物及びその微生物を供給するだめの方法にも関する。

プソイドエフェドリン及びエフェドリンは２種の主な医薬である。プソイドエフ ェドリンは鼻のうっ血除去薬として有用であり、そしてせき及びくしゃみ用カプ セル、算用薬物、重用スプレー、算用ドロップ及びアレルギー及び枯草熱用医薬 における成分として見出される。エフェドリンは局部的な算用うっ血除去薬、シ ョックの温和な形のための処置（ＣＮＳ刺激剤）及び気管支拡張剤として有用で ある。

Ｌ−エフェドリンは、多くの植物種に見出される天然の生成物である。Ｌ−エフ ェドリンは、アルカリによる初期処理、続く有機溶媒による抽出により乾燥せし められた植物材料から得られる。ｄ−プソイドエフェドリンもまた天然に見出さ れるが、それは、Ｗｅｌｓｈ転位より１−エフェドリンから高収率で容品に得ら れる。

Ｌ−フェニルアセチルカルビノール（ＰＡＣ）は、１−エフェドリンの合成にお けるキー中間体である。Ｂｒｅｗｅｒの酵素によるＬ−（−）フェニルアセチル カルビノールへのベンズアルデヒドの転換は、Ｎｅｗｂｅｒｇ　ａｎｄ　Ｈｉｒ ｓｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅ＋＋、Ｚ、、１１５：２８２〜３１０（１９２１）により 初めに記載されている。より詳しくは、ベンズアルデヒドは、次のようにして、 発酵性酵母によりＬ−（−）フェニルアセチルカルビノールに転換され得る二Ｐ ＡＣを製造するためにベンズアルデヒドの酵母転ｍ及び１−エフェドリンを製造 するためにＰＡＣの化学的転換の組合せは、アメリカ特許第１．９５６，９５０ 号に記載される。ＰＡＣは次のようにして光学的に純粋なし一エフェドリンにメ チルアミンによる化学的還元アミノ化により転換され得る：次に、１−エフェド リンは、次のようにして高収率でｄ−プソイドエフェドリンに転換され得る：高 収率及び高純度でＬ−（−）フェニルアセチルカルビノールを形成するために酵 母によるベンズアルデヒドの微生物学的転換は合成路の商業的操作のために重要 なものであることがこの反応スケムから明らかである。

酵母からのＰＡＣの製造のための従来の方法は、糖蜜、ビール麦芽汁、Ｍｇ５Ｏ ａ及び他の塩を５．５〜６．０のｐｏで含む培地への酵母の添加を包含する。初 めの短期間の撹拌及び通気の後、アセトアルデヒド及びベンズアルデヒドの混合 物を一部添加する。約７．５ｇ／ＬのＰＡＣの最終濃度が、５〜１０時間の連続 した撹拌及び通気で得られる。　ｂｒｅｗｅｒ又はｂａｋｅｒの酵母により、ベ ンジルアルコールは常に共同生成物として観察される。ベンズアルデヒド基材の ＰＡＣの報告された最高の収率は約７３％である。残るベンズアルデヒドはアル コールに転換される。アセトアルデヒドはＰＡＣ製造のために必須ではないが、 しかしこの化合物の添加は、ＰＡＣの最高収率を達成するために必要とされる。

発酵性酵母によるＰＡＣの合成に関する文献のほとんどは収率の最適化を論じる 。高レベルの酵母が比較的低レベルのＰＡＣを得るために必要とされる一般的な 合意が存在する。

入手できる文献は、ＰＡＣへのベンズアルデヒドの現在の酵母転換法は不十分で あり、そして酵母生産性は低いことを示唆する。酵母は、ＰＡＣ産生が基質及び 最終生成物への高められた暴露により低下するので、多量では使用され得ない。

さらに、現在の酵母転換は発酵流体に低濃度のＰＡＣのみを供給する。これは、 多量の工程体積及び従って多量の抽出溶媒を必要として、そしてこれは労力及び 商業的操作における効用費用に対して逆に影響を及ぼす。

さらに、ベンズアルデヒドからのＰＡＣの収率は、所望しない副生成物である、 ベンジルアルコールを形成するためにアルコールデヒドロゲナーゼによるベンズ アルデヒドの触媒還元の結果として低められる。試験されたＰＡＣ産生株のすべ ては、ベンジルアルコールを生成する。

従って、ベンズアルデヒドの酵母転換によりＰＡＣを製造するための改良された 方法のための必要性が当業界において存在する。その方法は、これまでよりも発 酵流体にＰＡＣのより高い酵母生産性及びより高い最大濃度を付与する。さらに 、ベンジルアルコールへのベンズアルデヒドの触媒還元は最少にされるはずであ る。

１里■！ｎ 本発明は、ベンズアルデヒドの酵母転換によるＰＡＣの生成のための改良された 方法を提供することによって当業界におけるこれらの必要性を満たすことが目的 である。本発明の方法は、現在の方法におけるよりも発酵流体にＰＡＣのより高 い酵母生産性及びより高い濃度の獲得を可能にする。

より詳しくは、本発明はＬ−フェニルアセチルカルビノール（ＰＡＣ）の生成方 法を提供し、ここで前記方法は、同化しうる炭素を含む水性発酵培地における微 生物の含浸培養を提供することを含んで成る。微生物は、発酵培地に少なくとも 約１．０ｇ／Ｌの濃度でＰＡＣを形成するためにベンズアルデヒド及びピルベー トの存在下で嫌気性又は酸素制限条件下で培養される。その微生物は、サツカロ マイセス　セレビシアエ（錘ｚ畑μｍ匹腔ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の親株の突然 変異体又は互Ｚ乏ｆ　ｌ立上ユ（Ｃａｎｄｉｄａ　ｆｌａｒｅｒｉ）の親株の突 然変異体である。その突然変異体は、アルデヒド阻害により耐性であり、はとん どアセトアルデヒドを生成せず、そして同一の条件下で親株を用いての対応する 発酵よりも発酵培地にＰＡＣの高い濃度を提供する。ＰＡＣは発酵培地から分離 され得る。

本発明はまた、突然変異の微生物を生成するための方法も提供する。その方法は 、水性培地においてベンズアルデヒド及びピルベートと共に培養される場合、測 定可能な量のＬ−フェニルアセチルカルビノール（ＰＡＣ）を産生ずることがで きる微生物を供給することを含んで成り、ここで前記微生物は、サツカロマイセ ス　セレビシアエ又はカンジダ　−Ｚ旦土」−の種から選択される。微生物は、 化学的変異原物質又は照射により化学的に突然変異誘発される。得られた突然変 異誘発された微生物は、アセトアルデヒドに対する耐性を有するコロニーを形成 するための条件下でアセトアルデヒドの存在下で培養される。酵母細胞はコロニ ーから単離され、そしてベンズアルデヒド及びピルベートと共に発酵におけるし 一フェニルアセチルカルビノールの生成のために試験される。高レベルのＰＡＣ を産生ずるコロニーからの細胞が大規模な発酵に使用され得る。

本発明は類似する方法を提供し、ここで突然変異誘発された生物は、エフェドリ ン又はＰＡＣ−ジオンに対して耐性を有するコロニーを形成するための条件下で それらのいづれかの物質の存在下で培養される。酵母細胞は前記のように単離さ れ、そして試験される。

最後に、本発明は、水性培地においてベンズアルデヒド及びピルベートと共に培 養される場合、高レベルのＰＡＣを産生ずることができる突然変異体微生物の生 物学的に純粋な培養物を供給する。培養物はここで、サツカロマイセス　旦ビシ アエＰ２１８０　１Ａ−８ｐａ及び左工之久　フラレリｄｇｒとして同定される 。本発明は、前記条件下で高レベルのＰＡＣを産生ずることができるこれらの株 の突然変異体及び変異体を含む。

型皿■固皇星脱皿 本発明は次の図面により十分に理解されるであろう：第１図は、Ｓ、セレビシア エの親株及びそれらのいくつかの突然変異株を用いてのベンズアルデヒド／ピル ベート発酵における時間の関数としてのし一フェニルアセチルカルビノール（Ｐ ＡＣ）の濃度を示すグラフであり；第２図は、Ｓ、セレビシアエの親株及びそれ らのいくつかの突然変異株を用いてのベンズアルデヒド／ピルベート発酵ニおけ る時間の関数としてのアセトアルデヒド濃度を示すグラフであり； 第３図は、Ｃ。フラレリの株に関する時間の関数としてのＰＡＣの濃度を示すグ ラフであり； 第４図は、ｋヱ旦上悲の株を用いてのＰＡＣ発酵の速度及び程度に対するエフェ ドリンの効果を比較するグラフであり；そして 第５図は、ζユｉと史の野生型株及び３種の突然変異株を用いてのＰＡＣ発酵の 速度及び量を比較するグラフである。

ましい旨　の發 本発明の方法は、微生物学的転換により高収率でＬ−フェニルアセチルカルビノ ール（ＰＡＣ）を生成するために適合される。略語″ＰＡＣ″は、Ｌ−（−）フ ェニルアセチルカルビノールとして同定されるフェニルアセチルカルビノールの 立体特異的形を言及するために使用される。名称Ｌ−（−）フェニルアセチルカ ルビノールは、名称１−フェニルアセチルカルビノールと交換可能的に使用され 、そして両名称はＰＡＣ’として略される。

ＰＡＣはベンズアルデヒド及びピルベートの転換により調製される。′ピルベー ト”は、成分として言及される場合、その従来の感覚で使用される。

ベンズアルデヒド及びピルベートの転換は、微生物の突然変異株により本発明の 方法で行なわれる。本発明において使用される場合、用語“突然変異体”は、親 株とその子孫との間の遺伝子型に差異が存在する親機生物のすべての子孫を包含 することを意味する。その用語はまた、遺伝子型の差異を伴って又は伴わないで 親株から異なった表現型が存在する子孫を包含することも意味する。もちろん、 その用語はさらに、親株からの遺伝子型及び表現型の両者に差異を示す子孫を包 含する。

さらに詳しくは、本発明の方法は、ピルビン酸及びベンズアルデヒドを１−フェ ニルアセチルカルビノールに効果的にル酵母の種は、酵素ピルベートデカルボキ シラーゼを産生ずることができ、そして従って内因性ピルベートデカルボキシラ ーゼを含む。本発明に使用される場合、略語“ＰＤＣ，、、”とは、酵素ピルベ ートデカルボキシラーゼを意味する。

ピルベートデカルボキシラーゼはＰＡＣへのベンズアルデヒドの転換を触媒する 。この酵素はまた、ピルベートをアセトアルデヒドに転換することができる。ア セトアルデヒドの形成は、ベンズアルデヒドからのＰＡＣの収率の低下の明らか な原因である酵素を阻害すると思われる。本発明は、アルデヒド阻害に対して耐 性を有する突然変異株を供給する。これによれば、親株に比べて、発酵培地にお けるＰＡＣｏ）濃度により明らかなようにベンズアルデヒドの転換における突然 変異株の活性の阻害の低下が存在することを意味する。発酵培地におけるＰＡＣ の濃度は、同一の条件下で行なわれる２種の発酵が比較される場合、親株による 場合よりも突然変異株による場合により高い。本発明の好ましいＭ様において、 突然変異株は、親株よりもベンズアルデヒドからアセトアルデヒドを生成しない 。

突然変異は、土ヱｐ１１４≦　セレビシアエ又はカンジｌ　フラレリの種から選 択された微生物に誘発される。得られる突然変異体は、アセトアルデヒド阻害に 対して耐性を有するコロニーを形成する条件下でアセトアルデヒドの存在下で培 養される。そのコロニーからの細胞が単離され、そしてベンズアルデヒド及びピ ルベートによる発酵におけるＰＡＣの収率について試験される。細胞はまた、ア セトアルデヒドの収率についても試験される。従って、ＰＡＣを高レベルで生成 し、そして低レベルでアセトアルデヒドを生成するコロニーから酵母細胞を選択 し、そして親株に比べて改良された収率でＰＡＣを生成するためにこれらの微生 物を使用することが可能である。商業的な操業においてより高い収率でのＰＡＣ の生成は特に、生成の費用が減じられるであろうから、好都合である。

誘発された突然変異を有する酵母突然変異株を調製する方法が初めに記載される であろう。これは、高レベルのＰＡＣ生成のために突然変異体を培養し、そして 選択するための条件の説明を伴う。ＰＡＣへのベンズアルデヒドの転換において 突然変異体を用いるための条件の説明は次に提供される。

１、　憬　れた″′然・　る′　の富　′１野生型の酵母を、化学的突然変異誘 発物質、たとえばメチルニトロソグアニジン、亜硝酸又はエチルメタンスルホネ ートにより突然誘発することができる。好ましい化学的突然変異誘発物質はＮ− メチル−Ｎ′−二トローＮ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）である。野生型の酵 母はまた、紫外線又は電離線、たとえばガンマ線による照射により突然変異誘発 され得る。

２、″′炊・の アセトアルデヒド、ピルビン酸アルデヒド、プロピオンアルデヒド、ホルムアル デヒド、フルフラール、グリオキサール及びα−ケト酪酸に対して耐性である突 然変異株を調製することができる。より詳しくは、活性ＰＡＣ産生突然変異株が 次のようにして得られる。

上記のようにして調製された、誘発された突然変異を有する微生物を用いて、ア セトアルデヒドに対して耐性の突然変異体を、少量のアセトアルデヒドを含むジ ャー中に突然変異株を広げられたプレートを置くことによって培養することがで きる。アセトアルデヒドは揮発性であるので、ジャーが密封される場合、その大 気はアセトアルデヒドにより飽和される。耐性突然変異体がこれらの条件下で増 殖し、そしてコロニーを形成する（親株はそうではない）ことを確保するために 、アセトアルデヒドを約３５０４〜約１０００ｐ！の量で使用すべきである。た とえば約３５０４のアセトアルデヒドが３．７５Ｌのジャーに添加され得る。

この方法を用いて、突然変異がＳ、セレビシアエＰ　−２１８０−ＩＡ〔野生型 （ＷＴ）半数体株〕にＮ−メチル−Ｎ′−二トローＮ−二トロソグアニジンによ り誘発された。多くの突然変異体がピルビン酸アルデヒドに対して耐性のために 選択された。

突然変異体は下記第１表に同定される。

Ｐ−２１８０−ＩＡの処理により得られ、そして耐アセトアルデヒド　について 　された″然・ 豊 他の阻害剤に対して耐性な株を類似する方法を用いて培養することができる。た とえば、株は、類似する方法を用いて、２．３−ジヒドロキシベンズアルデヒド 、２．４−ジヒドロキシベンズアルデヒド、２，５−ジヒドロキシベンズアルデ ヒド、３．４−ジヒドロキシベンズアルデヒド、フルフラール（２−ホルムアル デヒド）、グリオキサール、ホルムアルデヒド及びプロピオンアルデヒドの存在 下で培養され得る。

使用されるアルデヒドが揮発性でない場合、アルデヒドが好ましくは、密封され たジャーに添加されるよりもむしろ培地中に導入される。

３、ＰＡＣの　のためにアルデヒド　７然　の゛びスクリーニング ＰＡＣを産生ずることにおける突然変異酵母株のそれぞれの有効性をアッセイす るために、バッチ発酵を次の通りに行なうことができる。固定された又は自由で ある既知量の細胞を、必要な基質を含む緩衝溶液に添加する。特に、バ・ンチ態 様でのＰＡＣの産生のために適切な標準反応混合物は実質的に次の成分から成る ： クエン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６，０１００ｍＭ塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ□ ）　１ｍＭポリエチレングリコール−１Ｏ００（ＰＥＧ−１０００）　２０％ピ ルビン酸ナトリウム　１１０ｍＭ ベンズアルデヒド（工業銘柄）　１１０ｎ＋Ｍ次に、細胞を含む標準反応混合物 を室温で数時間振盪する。

細胞サンプルを種々の間隔で取り、そして遠心分離する。得られた上清液をＰＡ Ｃの存在について定量分析する。ＰＡＣアッセイは、Ｅｇｇｌｅｔｏｎ星ｅ　、 　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、３７：５２６〜５２９（１９４３）から改良された。特 に、Ｅｇｇｌｅｔｏｎ広煮の方法は、５２５ｎ−での吸光度によるジアセチル化 合物の定量のためである。ＰＡＣ読みは５２５ｎｗでの吸光種のいづれかの寄与 により修正される。

第１表に同定される株のそれぞれを、上記のような条件下でベンズアルデヒド及 びピルベートと共に発酵した後、培養培地におけるＰＡＣの濃度により明らかに されるようにＰＡＣを産生ずるその能力について試験した。５時間後、発酵培地 におけるＰＡＣ（ｍＭ）の濃度が個々の微生物について第２表にＳ、セレビシア エＰ−２１８０−ＩＡ及び第２表に報告される結果は、突然変異株Ｓ、セレビシ アエＰ−２１８０−１４−８□は、野生型（−丁）株Ｐ−２１８０−ＩＡよりも 言及された条件下でＰＡＣの産生において実質的により効果的であることを示す 。この突然変異体の改良された性能は、アルデヒドによるＰＤＣ，、、の阻害の 低下の結果であると思われる。

親株Ｓ、セレビシアエＰ−２１８０−ＩＡ及びいくつかのその突然変異体を用い てのベンズアルデヒド／ピルベート発酵を行ない、そしてその発酵培地を、発酵 時間の３時間及び５時間後、個々の場合においてサンプル採取した。

第１図に関しては、すべての株は、ＰＡＣの形成の速度が初期にひじょうに早い 限り、類似する発酵運動学パターンを示した。続いて、ＰＡＣ形成の遅い速度が 存在し、そして最終的に、発酵培地におけるＰＡＣの不安定性によりＰＡＣ濃度 のわずかな低下が存在した。突然変異株Ｐ　−２１８０−ＩＡ　−８，。

は、測定が行なわれるそれぞれの発酵時間でＰＡＣの最高の収率を与えることが 第１図から明らかである。この突然変異体は、ＰＡＣの収率においてその親株Ｐ −２１８０−ＩＡよりも実質的に卓越する。突然変異株Ｐ　−２１８０−ＬＡ− ２３ｐ、及びＰ−２１８０−１６□はまた、ＰＡＣの収率において親株Ｐ−２１ ８０−ＬＡよりも卓越した。

さらに、突然変異体Ｓ、セレビシアエＰ　−２１８０−ＩＡ−８Ｐ、は、ベンズ アルデヒド／ピルベート発酵においてその親株よりも有意に低いアセトアルデヒ ドを生成する。特に、第２図は、発酵培地におけるアセトアルデヒドの濃度（ｍ Ｍ）を示す。アセトアルデヒドの濃度は、培地がサンプル採取される個々の反応 時間で突然変異体Ｐ−２１８０−ＩＡ−８□についてよりも親株Ｐ　−２１８０ −ＩＡについてか高かった。アセトアルデヒド濃度の低下は、突然変異株Ｐ　− ２１８０−ＩＡ　−８，、によるＰＡＣ産生の観察される上昇における原因因子 である。突然変異体Ｓ、（−レビシアエＰ　−２１８０−ＩＡ　−２５，、はま た、第２図から明らかなように親株よりも一層低いアセトアルデヒドを産生した 。

突然変異株Ｐ　−２１８０−ＩＡ　−Ｌ、は、それとその親株とを区別するもう １つの特徴を有する。ピルベートはＳ、セレビシア舌についての増殖のために良 好でない基質であることは良く知られている。突然変異体は、親株よりも炭素源 としてのピルベートにより良好に増殖する。突然変異体Ｐ−２１８０−ＩＡ−８ □はピルベート上で良く増殖し、そして親株は、アセトアルデヒドへのピルベー トの転換が増殖阻害を担当することを示唆しない。突然変異体は、それがそのア ルデヒド耐性について選択されるので、アセトアルデヒドの阻害効果を明らかに のがれる。

細胞代謝に対する２、３−ジヒドロキシベンズアルデヒドの阻害効果への耐性を 示すために、Ｓ、セレビシ７盃Ｐ−２１８０−ＩＡ及び突然変異体Ｐ−２１８０ −ＩＡ−８，、を、培養血中の増殖培地上にそれぞれ置いた。その培養物を等量 のアルデヒドにより含浸した。得られる細胞コロニーを試験し、そして突然変異 体は親株よりも一層小さな阻害領域（透明な領域）を示すことが見出された。こ れは、Ｓ、セレビシアエＰ−２１８０−ＩＡ−８□がその親株よりもこのアルデ ヒドの阻害効果に対してより耐性であることを示した。ホルムアルデヒド、グリ オキサール及び２−フルアルデヒド阻害に対する突然変異体Ｐ−２１８０−ＩＡ −８□の耐性についても類似する結果が得られた。

株Ｐ−２１８０−ＩＡ−８□の他に、ホルムアルデヒド、２，３−ジヒドロキシ ベンズアルデヒド及びフルフラールに対する耐性のＳ、セレビシアエの突然変異 株が得られた。ＰＡＣ産生では、親株Ｐ−２１８０−ＬＡよりも良好なものはな かった。

アセトアルデヒドに対して耐性のＣ，フラレリｃ１ｇｒの突然変異体もまた上記 のようにして調製された。ピルビン酸及びベンズアルデヒドからＰＡＣを形成す ることで、これらのいづれも親株より卓越していなかった。

アルデヒドに対して耐性の突然変異体を選択する他に、他の２種のアプローチは 、細胞におけるピルベートデカルボキシラーゼの量を高め又は酵素の特徴を変え るために使用された。培養及び選択方法は、アルデヒド耐性のために使用された 方法と同じであるが、但し、寒天プレートがジャーの代わりに使用された。

初めのアプローチは、ピルベート及びベンズアルデヒド反応の生成物の類似体に 対して耐性の突然変異体を選択することであった。エフェドリンに対して耐性の 突然変異体が選択すした。二、九扛匹ｄｇｒ　（ζヱ旦上工のデオキシグルコー ス耐性誘導体）のエフェドリン耐性株を選択するように企画された実験から、突 然変異体Ｃ，フラレリｄｇｒ　Ｅ　、　Ｄ及びＧを得た。個々の株は、上記方法 を用いてＰＡＣ産生についてアッセイされた。第３図は、野生型株（ＷＴ）及び ２種の突然変異体により得られるＰＡＣの濃度（ｍＭ）を示す。突然変異体ζ− ２シしｋＪ〜ｄｇｒ　Ｈ（ＤＧＲＥ）は、ＰＡＣ産生においてＷＴ株よりも実質 的に卓越していることが見出された。発酵培地におけるＰＡＣの最終濃度及びＰ ＡＣ形成の速度の両者は、突然変異体ＤＧＲ−Ｈに関して卓越していた。他方、 突然変異体ζｌ立上ユｄｇｒ　Ｆ（ＤＧＲＦ）は、ＷＴ株よりも低い好ましい結 果を与えた。第３図における結果は、適切な突然変異株を選択に注意の必要性を 示す。

突然変異体ＤＧＲ−Ｅが、発酵培地におけるエフェドリンがＰＡＣ産生に影響を 及ぼすかいづれかを決定するためにさらに試験された。ＰＡＣ産生の速度及び程 度は、突然変異体ＤＧＲ−εがＷＴ株と比較される場合、卓越していることが見 出された。その結果は第４図に示される。発酵培地におけるエフェドリン（＋　 ｅｐｈ）の存在は、突然変異体ＤＧＲ−Ｅ及びＷＴ株の両者によるＰＡＣ形成を 阻害するが、しかし突然変異株は親株よりも低い効果を与えた。第４図における 結果はまた、第３図における結果を確証し、すなわち突然変異体ＤＧＲ−Ｅは、 発酵培地におけるエフェドリンの不在下で（−ｅｐｈ）、ＰＡＣ産生においてＷ Ｔ株よりも卓越する。

第５図は、２種の他の単離体、すなわちｄｇｒ　Ｄ及びｄｇｒ　Ｇは、エフェド リンの不在下で親株よりも有意に卓越することを示す。

エフェドリンに対して耐性のＳ、セレビシアエの突然変異体は、卓越したＰＡＣ 産生体を付与しなかった。

第２のアプローチは、ＰＡＣ−ジオン、すなわちもう１つのＰＡＣ類似体に対す る耐性のためのラシシΣに」−ｄｉｒの突然変異体を選択することであった。Ｐ ＡＣ−ジオンは、下記一般式を存する： ＰＡＣ−ジオン耐性単離体は、ジオンの存在下で親株よりもＰＡＣを産生ずるが 、ジオンの不在下では卓越していなかった。

ＰＡＣ−ジオンに対して耐性のＳ、セレビシアエの突然変異体をまた選択し、そ してこれらは、ピルベート及びベンズアルデヒドからのＰＡＣの合成で親株より も良好でなかった。

４、　ベンズアル−゛ヒト　びピルベートの　・−によ圭且へ旦皮生 上記のようにして調製された突然変異株を用いて、水性発酵培地にＰＡＣを調製 することができる０本発明の方法は、従来のバイオリアクターにおいて実施され 得る０発酵は好ましくは撹拌タンク反応器において行なわれる。混合が、実質的 に均質の形で容器含有物を維持するために羽根車、撹拌器又は容器内の内容物を 維持するための他の適切な手段により供給され得る。

本発明の方法は、突然変異株の含浸培養により及び実質的に酸素欠乏又は嫌気性 条件下で行なわれ得る。自由に移動する細胞又は固定された細胞が使用され得る 。

基質は、酵母細胞を増殖し、そして発酵器におけるバイオマス濃度を高めるため に発酵器に添加され得る。従来の有機発酵性炭素基質、たとえば炭水化物がこの 目的のために使用さ得る。グルコースは好ましい基質である。有機基質は、単独 で又は他の有機基質と一緒に使用され得る。

炭素基質は、水溶液で発酵器に供給され得る。発酵培地中の基質の濃度は培養条 件に依存するであろう。いづれにせよ、炭素基質は、細胞増殖及び細胞維持のた めに十分な量で使用される。約５０ｇ／Ｌ〜約１００ｇ／Ｌのグルコースを含む 水溶液１が・炭素源として適切であることが見出された。

接２１／ａのための酵母細胞は、反応容器、たとえば振盪フラスコ又は発酵器に おける、同化可能な炭素の源を含む栄養培地上で増殖せしめられ得る０種々の培 養培地が使用され得る。

発酵に使用するために適切であることが見出された複合培地が下記第３表に記載 される。

グルコース　１００　ｇ／Ｌ 酵母抽出物　６　ｇ／Ｌ （ＮＨ＊）ｚｓＯａ　４　ｇ　／　Ｌ ＭｇＳＯ，・ＩＨｔｏ　０．６ｇ　／　ＬＫＨｚＰＯａ　１　ｇ　／　Ｌ 細胞増殖は３０″Ｃ及び５．５のｐ）ｌで典型的に行なわれる。反応容器におけ る増殖相の間のバイオマス濃度は、容器の内容物をサンプリングすることにより 、及びそのサンプルの光学密度（ＯＤ）を測定することによりモニターされ得る 。光学密度が、６６０ｎ−での吸光度により測定される場合、約５〜約３５であ る場合、細胞は酸素制限又は嫌気性又は両者にされるべきである。細胞は、グル コースが消耗される前に収穫されるべきである。細胞収穫は、４〜１０°Ｃでの 遠心分離により行なわれ得る。

突然変異微生物を特徴づける間、ＰＡＣ産生における明確な程度の変動性が認め られる。ＰＡＣ形成の速度はその生成方法に使用される培養物の増殖相と相互関 係することが見出された。特に、ＰＡＣ産生のために使用される細胞培養物にお ける溶解された酸素のレベルがＰＡＣ生産性の主な決定因子であることが見出さ れた。さらに、培養物が酸素以外のある栄養物の消耗により定常期に入る場合、 ＰＡＣ合成は存意に制限されることが見出された。しかしながら、培養物の実際 の密度は、発酵反応に対して主要な挙動を有するようには思われない。増殖曲線 （初期、中期又は後期の対数増殖期〜定常期）にそっての培養物のサンプリング は、細胞がＰＡＣ反応に使用される前、ある期間、嫌気性増殖されるかぎり、類 似する結果をもたらす。たとえば、これは、グルコース（５０ｇ　／　Ｌ　）を 含む複合培地上での発酵器中で微生物を増殖せしめることによって達成され得る 。バイオマスが約３０の光学密度に達する場合、好気性反応が止められ、そして 培地は酸素の消耗を可能にされる。その細胞は、グルコースを消耗しないで６〜 １６時間、嫌気性的に増殖せしめられる。収穫するためには、培養物を氷に含浸 された冷却コイルを通してポンプで送り、そして細胞を遠心分離により除去する ことができる。

本発明の実施に使用されるベンズアルデヒドは一般的に、市販物質の技術的又は 医薬的品種である。ピルベートは通常、ピルビン酸又はその非毒性水溶性塩の技 術的又は医薬的品種に由来する。非毒性アルカリ金属塩、たとえばピルビン酸ナ トリウムが好ましい。

ピルベート及びベンズアルデヒドは、反応培地がバイオマスを通して均等な分散 を確保するために十分に撹拌される場合、その反応に個々に添加され得る。本発 明の好ましい態様において、ピルベート及びベンズアルデヒドは水性培地に一緒 に混合され、そしてその得られる組成物は反応に添加される。

発酵反応の開始で、発酵培地中のベンズアルデヒドの濃度は一般的に約５　ｇ　 ／　Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ、好ましくは約１２ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌである。同様に 、発酵培地中のピルベートの濃度は、発酵の開始で、約ｌ：１〜約２０ｇ／Ｌ、 好ましくは約１２ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌである。

発酵の開始での発酵培地中のベンズアルデヒド：ピルベートの重量比は、一般的 に約０．５：１〜約２：１、好ましくは約ｌ：１〜約１．２：１であろう。

栄養培地中の化学物質成分の業主及び個々の成分の量は、細胞マス生成のために 元素必要条件を満たすために十分であるべきであり、そしてＰＡＣ生成の間、合 成及び維持のために適切なエネルギーを供給すべきである。

発酵工程は、中ぐらいの温度範囲にわたって行なわれる。

発酵温度は一般的に約１５゛Ｃ〜約３０°Ｃ１好ましくは約り０℃〜約２２°Ｃ である。最適発酵温度は、使用される微生物に依存し、そして最適温度は最少の 実験により決定され得る。

本発明の工程はまた、培養培地において中ぐらいのｐＨ値の範囲にわたって行な われ得る。そのｐＨは一般的に約５〜約８、好ましくは約６〜約６．５であろう 。培養培地中のｐＨは、発酵の間、低下し又は上昇することができる。非毒性ｐ Ｈｍ整剤又は緩衝剤が必要に応じて発酵培地に添加され得る。

本発明の方法は、細胞の生存性及び代謝を確保するために十分な滅菌条件下で行 なわれる。これは、微生物の注意した選択、発酵のために使用される装置の滅菌 及び試薬の可能な滅菌を要する。

発酵器は広範囲のバイオマス濃度にわたって作動され、そして最適濃度は過度の 実験を伴わないで決定され得る。前で記載したようム、＝、バイオマス濃度は、 発酵反応に対して主要な挙動を有するように思われない。その値の実際の範囲は 一般的にその方法の経済性に依存するであろう。

発酵培地中のＰＡＣの濃度は、生成物の回収の費用を減じるために最大にされる べきである。本発明の方法は、発酵培地において少なくとも約１ｇ／ＬのＰＡＣ 濃度で、及び好ましくは少なくとも約１０ｇ／ＬのＰＡＣＩ度で、及び特に約１ ５゛Ｃ〜約１５ｇ／Ｌの濃度で行なわれ得る。

本発明の方法は、バッチ（回分）又は連続基調で行なわれ得る。連続発酵による ＰＡＣの生成のためには、微生物がカラムに置かれ、そして標準反応混合物がそ のカラム上に送られる。酵素ＰＤＣ□、のための補因子であるチアミンピロホス フェート（ＴＰＰ）が、たとえば０．１　ｗＭの濃度で標準反応混合物に含まれ 得る。カラム流出液の両分を集め、そしてＰＡＣの存在について定量サンプリン グする。

ＰＡＣは、従来の技法を用いて発酵培地から回収され得る。

たとえば、バイオマスは、濾過、遠心分離又は沈降により発酵培地における液相 から回収され得る。その得られる液相はさらに、ＰＡｆＪ液をａ縮するために処 理され得る。ＰＡＣは、溶媒抽出によりその溶液から除去され得る。

ＰＡＣは、Ｎｅｕｂｅｒｇ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｚ、１２８：６１０（１９２２） の方法に従って精製され得る。その精製された生成物のＧＣ／ＭＳプロフィール は、１５０の分子量を有する親ピークを示す。反応の生成物はまた、正しい光学 的異性体、すなわちＬ−フェニルアセチルカルビノールであることが旋光針によ り測定される。メチルアミンとの反応によるエフェドリンへの転換が行なわれ、 そしてその結果は実証された。

本発明の突然変異株を用いてＰＡＣを生成するために使用され得る方法のより詳 しい説明は、Ｒｏｂｅｒｔ　Ｊ、５ｅｅｉｙ、口ｏｎａ１ｄＬ、Ｈｅｅｆｎｅｒ 、　Ｒｏｂｅｒｔν、Ｈａｇｅａ＋ａｎ、Ｍｉｃｈａｅｌ　Ｊ、Ｙａｒｕｓ及び ５ａｌｌｙ八、５ｕｌｌｉｖａｎにより　−（Ａｔｔｏｒｎｅｙ　Ｄｏｃｋｅｔ 　Ｎｏ、５ＹＮＥ−０３７）に出願され、そして°゛ＬＬ−フエニルアセチルカ ルビノールＡＣ）の製造方法、その方法に使用するための固定された細胞マス及 びその細胞マスを調製するための方法パの標題を有するアメリカ特許第　−号に 包含される。この出願の全開示は、本明細書における引例に依存し、そして引例 により組込まれる。

要約すれば、本発明は、ＰＡＣへのベンズアルデヒドの微生物学的転換のための 効果的な方法及びその方法に使用するための微生物を提供する。ＰＡＣについて の微生物の生産性は高い。さらに、その転換の間、アセトアルデヒドの形成を滅 しながら、発酵流体に比較的畜濃度のＰＡＣを得るごとが可能である。

ＦＩＧ、　／ 時間（時） ト ヤ 特表千４−５０１０６０　（９） 時間（時） ＦＩＧ、　４ 時間（時） 国際調査報告 １　Ｍ”〒／ｎ１ｌｌ＃１句／ｎムムフ１

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．Ｌ−フェニルアセチルカルビノール（ＰＡＣ）の製造方法であって、 微生物及び同化可能な炭素の源の含浸培養物を含む水性発酵培地を供給し； 前記発酵培地に少なくとも約１ｇ／しの濃度でのＰＡＣを形成するためにべンズ アルデヒド及びピルベートの存在下で嫌気性又は酸素制限条件下で前記微生物を 培養することを含んで成り；そして 前記微生物がサッカロマイセス　セレビシアエの親株の突然変異体又はカンジダ 　フラレリの親株の突然変異体であり、そして前記突然変異体がアルデヒド阻害 に対してより耐性であり、そして同一の条件下で親株を用いての対応する発酵よ りも発酵培地により低いアセトアルデヒド及びより高い濃度のＰＡＣを生成する ことを特徴とする方法。 ２．前記親株がＳ．セレビシアエ　Ｐ−２１８０−ＩＡであり、そして前記突然 変異体がＳ．セレビシアエ突然変異株Ｐ−２１８０−ＩＡ−２ｐａ，Ｐ−２１８ ０−１Ａ−３ｐａ，Ｐ−２１８０−ＩＡ−４ｐａ，Ｐ−２１８０−ＩＡ−６ｐａ ，Ｐ−２１８０−ＩＡ−７ｐａ，Ｐ−２１８０−ＩＡ−８ｐａ，Ｐ−２１８０− ＩＡ−９ｐａ，Ｐ−２１８０−ＩＡ−１０ｐａ，Ｐ−２１８０−ＩＡ−１１ｐａ ，Ｐ−２１８０−ＩＡ−１２ｐａ，Ｐ−２１８０−ＩＡ−１３ｐａ，Ｐ−２１８ ０−ＩＡ−１４ｐａ及び　Ｐ−２１８０−ＩＡ−１６ｐａから成る群から選択さ れる請求の範囲第１項記載の方法。 ３．前記親株がＳ．セレビシアエ　Ｐ−２１８０−ＩＡであり、そして前記突然 変異体がＳ．セレビシアエ株　Ｐ−２１８０−ＩＡ−８ｐａである請求の範囲第 １記載の方法。 ４．前記発酵が、約５〜約８のｐＨを有する発酵培地中で約１５℃〜約３０℃の 温度で行なわれる請求の範囲第３項記載の方法。 ５．前記発酵が発酵培地の連続撹拌により行なわれる請求の範囲第４項記載の方 法。 ６．発酵の開始で、前記発酵培地が約５ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／しのベンズアルデヒ ド、約５９／Ｌ〜約２０ｇ／しのピルベートを含み、そして前記ベンズアルデヒ ド：ビルベートが約０．５：１〜約２：１の重量比で存在する請求の範囲第５項 記載の方法。 ７．前記発酵培地中のＰＡＣの濃度が約１２ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／しである請求の 範囲第６項記載の方法。 ８．水性培地においてベンズアルデヒド及びピルベートと共に培養される場合、 高レベルの１−フェニルアセチルカルビノール（ＰＡＣ）を産生することができ る酵母微生物を産生するための方法であって、 （Ａ）水性培地においてベンズアルデヒド及びビルベートと共に培養される場合 、測定できる量のＰＡＣを産生することができる酵母微生物を供給し、ここで前 記微生物はサッカロマイセス　セレビシアエの種又はカンジダ　フラレリの種か ら選択され； （Ｂ）前記微生物を化学的突然変異誘発物質又は照射により突然変異誘発し； （Ｃ）その得られた突然変異誘発された微生物を、減じられたアセトアルデヒド 阻害を有する細胞コロニーを形成するための条件下でアセトアルデヒドの存在下 で培養せしめ；（Ｄ）アセトアルデヒド阻害に対する耐性を有するコロニーから 酵母細胞を単離し；そして （Ｅ）ベンズアルデヒド及びビルベートを含む発酵においてＰＡＣの収率のため に前記コロニーから単離された酵母細胞を試験することを含んで成る方法。 ９．ベンズアルデヒド及びピルベートを含む発酵においてアセトアルデヒドの収 率のために前記コロニーから単離された酵母細胞を試験することをさらに含んで 成る請求の範囲第８項記載の方法。 １０．水性培地においてベンズアルデヒド及びピルベートと共に培養される場合 、高レベルの１−フェニルアセチルカルビノール（ＰＡＣ）を産生することがで きる酵母微生物を産生するための方法であって、 （Ａ）水性培地においてベンズアルデヒド及びピルベートと共に培養される場合 、測定できる量のＰＡＣを産生することができる微生物を供給し、ここで前記微 生物はカンジタフラレリ型の株から選択され； （Ｂ）前記微生物を化学的突然変異誘発物質又は照射により突然変異誘発し； （Ｃ）その得られた突然変異誘発された微生物を、エフェドリン阻害に対して耐 性を有するコロニーを形成するための条件下でエフェドリンの存在下で培養せし め；（Ｄ）エフェドリン阻害に対する耐性を有するコロニーから細胞を単離し； そして （Ｅ）ベンズアルデヒド及びビルベートを含む発酵においてＰＡＣの収率のため に前記コロニーから単離された細胞を試験することを含んで成る方法。 １１．ベンズアルデヒド及びピルベートを含む発酵においてアセトアルデヒドの 収率のために前記コロニーから単離された細胞を試験することをさらに含んで成 る請求の範囲第１０項記載の方法。 １２．水性培地においてベンズアルデヒド及びピルベートと共に培養される場合 、高レベルの１−フェニルアセチルカルビノール（ＰＡＣ）を産生することがで きる微生物を産生するための方法であって、 （Ａ）水性培地においてベンズアルデヒド及びピルベートと共に培養される場合 、測定できる量のＰＡＣを産生することができる微生物を供給し、ここで前記微 生物はカンジダフラレリの株から選択され； （Ｂ）前記微生物をＮ−メチ ルーＮ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（Ｎ７６）により突然変異誘発し； （Ｃ）その得られた突然変異誘発された微生物を、ＰＡＣ−ジオン阻害に対して 耐性を有するコロニーを形成するための条件下でＰＡＣ−ジオンの存在下で培養 せしめ；（Ｄ）ＰＡＣ−ジオン障害に対する耐性を有するコロニーから細胞を単 離し；そして （Ｅ）ベンズアルデヒド及びピルベートを含む発酵においてＰＡＣの収率のため に前記コロニーから単離された細胞を試験することを含んで成る方法。 １３．ベンズアルデヒド及びピルベートを含む発酵においてアセトアルデヒドの 収率のために前記コロニーから単離された細胞を試験することをさらに含んで成 る請求の範囲第１２項記載の方法。 １４サッカロマイセス　セレビシアエ　Ｐ−２１８０−ＩＡ−８ｐａの生物学的 に純粋な培養物。 １５．カンジダ　　フラレリ　ｄｇｒの生物学的に純粋な培養物。