JP2000514034A

JP2000514034A - 作用物質、ポリエーテル及び任意に身体に許容可能とみなされる天然性蛋白質からなるコンジュゲート

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Publication number: JP2000514034A
Application number: JP08530650A
Authority: JP
Inventors: シン，ハンスヨーク; シュレンク，ハンス−ヘルマン; マイエル−ボルスト，ヴォルフガンク; ステーレ，ゲルト
Original assignee: ドイチェスクレブスフォルシュンクスツェントルムスチフトゥングデスエッフェントリヒェンレヒツ
Priority date: 1995-04-13
Filing date: 1996-04-12
Publication date: 2000-10-24
Also published as: DK0821593T3; DE59609483D1; US6150327A; WO1996032134A2; WO1996032134A3; EP0821593B1; EP0821593A2; DE19514087A1; ATE220922T1; ES2180750T3

Abstract

(57)【要約】本発明は、作用物質成分、ポリエーテル成分及び任意に身体により許容可能とみなされる天然性蛋白質成分からなり、それらの該成分が、酸アミド結合及び／又は酸エステル結合を介して結合しているコンジュゲートに関する。また、本発明は、かかるコンジュゲートの製造方法及びその使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】作用物質、ポリエーテル及び任意に身体に許容可能とみなされる天然性蛋白質からなるコンジュゲート本発明は、作用物質成分、ポリエーテル成分及び任意に、外因性とはみなされない天然性蛋白質成分からなるコンジュゲート、かかるコンジュゲートの調製方法並びにその使用に関する。作用部位において十分計算された様式で、医薬製剤を濃縮するという要求が長い間存在している。特に、癌疾患、感染性疾患、皮膚疾患及び／又は免疫系疾患を治療するときに、これらの疾患に冒されている細胞及び組織において医薬製剤を濃縮することが望まれる。また、医薬製剤が作用部位に到達しない場合に、それらを排出することが意図される。このことは、医薬製剤によって生じる身体の負担を最小にするために役立つものである。従って、本発明の目的は、前記を達成させるために役立つ実現可能性を提供することにある。本発明によれば、このことは、作用物質成分、ポリエーテル成分および任意に、外因性とはみなされない天然性蛋白質成分からなり、酸アミド結合及び／又は酸エステル結合を介して該成分が結合していることを特徴とするコンジュゲートにより達成される。本発明のコンジュゲートの成分は、以下の遊離体として示される。本発明のコンジュゲート中に、それらは誘導体型で存在する。「作用物質」という用語は、癌疾患、感染性疾患、皮膚疾患及び／又は免疫系疾患等の疾患の治療及び／又は診断用に用いることが可能で、かつ、酸アミド結合及び／又は酸エステル結合を形成可能ないかなる種類でもよい化合物からなる。かかる化合物は、抗生物質、抗ウイルス剤、抗原生動物剤及び細胞増殖抑制剤等の化学療法剤であってもよい。抗生物質の例としては、スルホンアミド類、７ −クロロテトラサイクリン等のテトラサイクリン類、フシジン酸並びにキノロン類、アンホテリシン、イソニアジド、ピラジン−２−カルボン酸及びピラジンアミド等のジャイレース阻害剤が挙げられる。抗ウイルス剤の例としては、アマンタジン及びリマンタジン等が挙げられる。抗原生動物剤の例としては、メフロキン及びプリマキン等が挙げられる。細胞増殖抑制剤の例としては、ドキソルビシン等のアントラサイクリン類、トポイソメラーゼ阻害剤、マイトマイシンＡ及びＣ、ブレオマイシン酸、クロラムブシル、メルファラン並びにメトトレキサート等の葉酸拮抗剤が挙げられる。また、かかる化合物は、光活性化合物、特に水性媒質で光活性な光活性化合物であってもよい。その例としては、ｏ−、ｍ−及び／又はｐ−テトラヒドロキシフェニルポルフィン（ＴＨＰＰ）、ｏ−、ｍ−及び／又はｐ−テトラカルボキシフェニルポルフィン（ＴＣＰＰ）並びにｏ−、ｍ−及び／又はｐ−テトラスルホフェニルポルフィン等のポルフィリン類、ｏ−、ｍ−及び／又はｐ−テトラヒドロキシフェニルクロリン、ｏ−、ｍ−及び／又はｐ−テトラカルボキシフェニルクロリン並びにｏ−、ｍ−及び／又はｐ−テトラスルホフェニルクロリン等のクロリン類、ｏ−、ｍ−及び／又はｐ−テトラヒドロキシフェニルバクテリオクロリン、ｏ−、ｍ−及び／又はｐ−テトラカルボキシフェニルバクテリオクロリン並びにｏ−、ｍ−及び／又はｐ−テトラスルホフェニルバクテリオクロリン等のバクテリオクロリン類、並びにフタロシアニンテトラスルホン酸等のフタロシアニン類が挙げられる。前記光活性化合物は、光活性化に正の影響を有するＡｌ³⁺ 又はＺｎ²⁺等の金属イオンを含んでもよい。例えば、放射性ヨウ素、Ｉｎ³⁺及び／又はＧｄ³⁺等の金属イオン等の検出可能な標識を有する前記化合物を提供してもよい。その結果として、本発明のコンジュゲートは、疾病の診断用にも用いてもよい。前記化合物及びそれらの類似体又は誘導体それぞれの１以上が、本発明のコンジュゲートに存在してもよい。複数が存在するならば、それらは、同一または互いに異なってもよい。本発明のコンジュゲートは、酸アミド結合及び／又は酸エステル結合を形成可能なポリエーテルまたはその誘導体を含む。かかるポリエーテルの例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、特に、その末端のヒドロキシル基がＣ₁〜Ｃ₁₂のアルキル基、好ましくはメチル基によりエステル化又はエーテル化されているものが挙げられる。それらの代表例は、メトキシポリエチレングリコール、ジアミノメトキシポリエチレングリコール、メトキシポリエチレングリコール− ｐ−ニトロフェニルカルボネート、メトキシポリエチレングリコールスクシンイミジルスクシネート、メトキシポリエチレングリコールトレシレート、メトキシポリオキシエチレンアミン（アミノＰＥＧ）、メトキシポリオキシエチレンカルボン酸及びメトキシポリオキシエチレンイミダゾールカルボニルである。ポリエーテルは、１００〜２０，０００ダルトンの分子量を有することが好ましく、約５，０００ダルトンが特に好ましい。また、前記検出可能な標識を有するポリエーテルを提供してもよい。本発明のコンジュゲート中に、前記ポリエーテルが１以上存在する。複数が存在するならば、それらは同一又は互いに異なってもよい。本発明のコンジュゲートは、外因性とはみなされない、かつ、酸アミド結合及び／又は酸エステル結合を形成可能な天然性蛋白質を任意に含む。この蛋白質は、９０，０００ダルトンまでの分子量を有することが好ましい。該蛋白質は、アルブミン、具体的にはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）及びトランスフェリンが特に好ましい。本発明のコンジュゲートの成分は、コンジュゲートの分子量が、好ましくは約１０，０００ダルトンを越える、特に好ましくは約１５，０００ダルトンを越えるように選択される。本発明のコンジュゲートの個々の成分は、所望通りに互いに結合してもよい。作用物質は、ポリエーテル及び存在するならば蛋白質の両方に結合することが好ましい（図１〜３を参照）。本発明の好ましいコンジュゲートを、図１〜３に示す。前記コンジュゲートの調製方法も、本発明により提供される。かかる方法において、酸基の活性化及び活性化酸基とアミノ基又はヒドロキシル基との結合等の化学で起こる通常の反応を行なう。この目的のために、実施例１及び２並びに図１〜３におけるコンジュゲートの調製が参照される。本発明のコンジュゲートは、身体のある種の細胞、特に癌細胞、炎症組織及び病理学的皮膚の細胞において、十分計算された様式で濃縮するという点で顕著である。また、本発明のコンジュゲートは、作用部位に到達しないならば、急速に分解され得るという点で顕著である。その結果として、身体に対する副作用を最小に抑えることができる。従って、本発明のコンジュゲートは、癌疾患、感染性疾患、乾癬等の皮膚疾患及び／又は免疫系疾患等の疾患を治療するために最良の実現可能な方法に適する。さらに、本発明のコンジュゲートは、標識後、疾患、特に前記疾患を診断するために使用することができる。図面の簡単な説明図１は、ＴＣＰＰ、アミノＰＥＧ及びＨＳＡからなる本発明のコンジュゲートの調製を示し、図２は、ＴＨＰＰ及び４ＰＥＧｓからなる本発明のコンジュゲートの調製を示し、図３は、アルミニウム−フタロシアニンテトラスルホネート−アミノＰＥＧからなる本発明のコンジュゲートの調製を示し、及び図４は、心臓領域及び肝臓領域と比較した、Ｗａｌｋｅｒ癌肉腫によるＨＳＡ −ＴＣＰＰ−アミノＰＥＧコンジュゲート（図１を参照）の吸収のシンチグラフィによる検出を示す。以下の実施例により、本発明を説明する。実施例１：ＴＣＰＰ、ＨＳＡ及びアミノＰＥＧからなる本発明のコンジュゲートの調製このコンジュゲートの調製を、図１に示す。ａ）ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）及びヒドロキシスクシンイミド（ＨＳＩ）によるＴＣＰＰの活性化並びにその後のアミノＰＥＧとの反応ＴＣＰＰ（ＭＷ：７９１）を、１０ｍｇ／ｍｌの濃度でジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解する。４倍モル量のジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ、ＭＷ：２０６．３３）及び１０倍モル量のヒドロキシスクシンイミド（ＨＳＩ、ＭＷ：１１５．１）を、透明な暗赤色溶液に添加する。約２〜３時間の反応時間の後、ＴＣＰＰ−アミノＰＥＧを生成するように等モル量のアミノＰＥＧを添加できるような含有量まで、ＴＣＰＰ−スクシンイミジルエステル（ＴＣＰＰ −ＳＥ）への変換が進行した。さらに１２〜１４時間の反応時間の後、ＤＰＣユニットによりＴＣＰＰ−アミノＰＥＧ−ＨＳＩ₃の生成をチェックする。操作条件：ＨＰＬＣポンプ、レオダイン注入バルブ、ＵＶモニタープレカラム：３０ｘ８ｍｍ、ＥｕｒｏｇｅｌＳＥＣ１０００、カラム：２個の３００ｘ１０ｍｍ、ＥｕｒｏｇｅｌＳＥＣ１０００溶媒：１ｍＭＬｉＢｒ（０．１モル％ＬｉＢｒ）を有するＤＭＦ／ＬＤＭＦ流速：０．６ｍＬ／分保持時間：ポリスチレン標準：平均分子量：５ｋＤ２７．００分１０ｋＤ２４．６７分。ｂ）ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）へのＴＣＰＰ−アミノＰＥＧの結合：アミノＰＥＧ−ＴＣＰＰ−ＳＥ₃のＤＭＳＯ溶液を、４ｇのＨＳＡ（２０％、免疫）溶液（２０ｍｌの原液＋２０ｍｌの０．ｌ７ＭＮａＨＣＯ₃及び１５ｍｌのＥｔＯＨに溶解）に、定常攪拌しながら非常にゆっくり添加し、水溶液に不溶性の未反応ＤＣＣにより、最初の透明溶液が混濁する。アミノＰＥＧ−ＴＣＰＰ−ＳＥ_xの添加終了後、最大限の含有量まで反応を完了させるように、さらに室温で３０分間、反応混合物を攪拌し、次いで、１時間冷蔵庫に貯蔵する。その後、滅菌濾過ユニット（Millipore、Stericup-GV、０．２２μｍ Low Binding D uropore Membrane）により混濁物質を分離し、３０ｋＤの排除限界を有するメンブランによる限外濾過（Amicon YM 30）により、低分子水溶性成分（ＤＭＳＯ、ＨＳＩ及び未結合ＴＣＰＰ）を分離する。ＨＳＡ−ＴＣＰＰ−アミノＰＥＧが得られた（図１）。ＴＣＰＰ−アミノＰＥＧのＨＳＡへの結合収率は、平均８５〜９０％である。ＨＰＬＣにより分析の純度が制御される。ＨＰＬＣ条件：プレカラム：ＺｏｒｂａｘＤｉｏｌ（５０ｘ４ｍｍ）カラム１：ＺｏｒｂａｘＧＦ４５０、カラム２：ＺｏｒｂａｘＧＦ２５０溶離液：０．２Ｍクエン酸Ｎａ、ｐＨ７．５流速：１ｍｌ／分ＵＶ検出器１：２８０ｎｍ（蛋白質に対する）ＵＶ検出器２：４２０ｎｍ（ＴＣＰＰに対する）フィード体積：１００μｌ（＝最大１０ｍｇの蛋白質）保持時間：ダイマー画分１７．７分モノマー画分１９．７７分。実施例２：ＴＨＰＰ及び４ＰＥＧｓからなる本発明のコンジュゲートの調製このコンジュゲートの調製を、図２に示す。３０ｍｇの５，１０，１５，２０−テトラキス（４−ヒドロキシフェニル）２１Ｈ，２３Ｈ−ポルフィン（ＴＨＰＰ）を、３ｍｌのＤＭＦに溶解する。そこに、４倍モル過剰のメトキシポリエチレングリコール−ｐ−ニトロフェニルカルボネート（＝１ｇＮＰＣ−ＭＰＥＧ、１０ｍｌのＤＭＦに溶解）及び５ｍｌの重炭酸溶液（０．１７Ｍ、ｐＨ８．５）を添加する。用いたＴＨＰＰを完全に変換させるために、反応を室温で数日間行ない、ＨＰＬＣにより制御できる。ＴＨＰＰ−ＰＥＧ（図２を参照）が得られた。ＨＰＬＣ条件：ポンプ、レオダインバルブＵＶ／ＶＩＳ及びＲＩ検出器プレカラム：３０ｘ８ｍｍ、ＥｕｒｏｇｅｌＳＥＣ１０００（Knauer，Berl in）カラム：各３００ｘ１０ｍｍの２個のカラム、ＥｕｒｏｇｅｌＳＥＣ１０００（Knauer，Berlin）溶離液：ＤＭＦ＋８７ｍｇ（１ｍＭ）ＬｉＢｒ／ＬＤＭＦ流速：０．６ｍｌ／分保持時間：ポリスチレツ標準：２０ｋＤ２３．０分１０ｋＤ２４．６５分５ｋＤ２７．０５分分子量：ＴＨＰＰ−ＰＥＧ：２２分。放出されたｐ−ニトロフェニル基、未反応ｍＰＥＧ及びＤＭＦを分離するために、反応混合物を１Ｌの０．０５ＮＨＣｌに挿入し、付随する物質をＴＨＰＰ −ｍＰＥＧから限外濾過（ＹＭ１０、Amicon）により分離する。実施例３：心臓領域及び肝臓領域と比較したＷａｌｋｅｒ癌肉腫によるＨＳＡ− ＴＣＰＰ−アミノＰＥＧコンジュゲートの吸収のシンチグラフィによる検出Ｗａｌｋｅｒ癌肉腫を有するラットに、本発明のＨＳＡ−ＴＣＰＰ−アミノＰＥＧコンジュゲート（図１を参照）を与えた。癌による該コンジュゲートの吸収を、通常のシンチグラフィにより示し、心臓領域及び肝臓領域における減少と比較した。図４から示されるように、本発明のコンジュゲートは癌に濃縮する。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成９年１月２８日（１９９７．１．２８）【補正内容】請求の範囲１．作用物質成分、ポリエーテル成分および外因性とはみなされない天然性蛋白質成分からなり、それらの該成分が酸アミド結合及び／又は酸エステル結合を介して結合していることを特徴とするコンジュゲート。２．作用物質が、癌疾患、感染性疾患、皮膚疾患及び／又は免疫系疾患の治療に使用可能な化合物であることを特徴とする請求項１記載のコンジュゲート。３．作用物質が、化学療法剤又は光活性化合物であることを特徴とする請求項１又は２記載のコンジュゲート。４．複数の作用物質が存在することを特徴とする、請求項１〜３いずれか記載のコンジュゲート。５．ポリエーテルが、ポリエチレングリコール又はその誘導体であることを特徴とする請求項１〜４いずれか記載のコンジュゲート。６．複数のポリエーテルが存在することを特徴とする、請求項１〜５いずれか記載のコンジュゲート。７．蛋白質がアルブミンであることを特徴とする、請求項１〜６いずれか記載のコンジュゲート。８．作用物質、ポリエーテル及び任意に、外因性とはみなされない天然性蛋白質が、酸アミド結合及び／又は酸エステル結合を形成することにより互いに結合していることを特徴とする、請求項１〜７いずれか記載のコンジュゲートの調製方法。９．疾患を治療するための請求項１〜７いずれか記載のコンジュゲートの使用。１０．疾患が、癌疾患、感染性疾患、皮膚疾患及び／又は免疫系疾患である請求項９記載の使用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者マイエル−ボルスト，ヴォルフガンクドイツ連邦共和国ドッセンハイムデー −69221 シュリュッセルヴェーク９ (72)発明者ステーレ，ゲルトドイツ連邦共和国マンハイムデー− 68305 カッセレルシュトラーセ８

Claims

【特許請求の範囲】１．作用物質成分、ポリエーテル成分および任意に、外因性とはみなされない天然性蛋白質成分からなり、それらの該成分が酸アミド結合及び／又は酸エステル結合を介して結合していることを特徴とするコンジュゲート。２．作用物質が、癌疾患、感染性疾患、皮膚疾患及び／又は免疫系疾患の治療に使用可能な化合物であることを特徴とする請求項１記載のコンジュゲート。３．作用物質が、化学療法剤又は光活性化合物であることを特徴とする請求項１又は２記載のコンジュゲート。４．複数の作用物質が存在することを特徴とする、請求項１〜３いずれか記載のコンジュゲート。５．ポリエーテルが、ポリエチレングリコール又はその誘導体であることを特徴とする請求項１〜４いずれか記載のコンジュゲート。６．複数のポリエーテルが存在することを特徴とする、請求項１〜５いずれか記載のコンジュゲート。７．蛋白質がアルブミンであることを特徴とする、請求項１〜６いずれか記載のコンジュゲート。８．作用物質、ポリエーテル及び任意に、外因性とはみなされない天然性蛋白質が、酸アミド結合及び／又は酸エステル結合を形成することにより互いに結合していることを特徴とする、請求項１〜７いずれか記載のコンジュゲートの調製方法。９．疾患を治療するための請求項１〜７いずれか記載のコンジュゲートの使用。１０．疾患が、癌疾患、感染性疾患、皮膚疾患及び／又は免疫系疾患である請求項９記載の使用。