JPH04501209A - 生物学的に活性のある第ｉｘ因子を発現する細胞系統 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 ４、ヒト第Ｘ因子をコードする領域を含む外因性のＤＮＡ断片をゲノム中に組み 込んだ細胞株であって、該コーディング領域が、第■因子遺伝子プロモーター、 α−アンチトリプシン遺伝子プロモーター及び該コーディング領域の発現を誘導 するのに十分なこれらプロモーターの部分から選択されるプロモーター領域の支 配下に置かれている、請求項１乃至３のいずれかに記載の細胞株。

５、ヒト第Ｘ因子をコードする領域を含む外因性のＤＮＡ断片をゲノム中に組み 込んでおり、該コーディング領域が、第■因子遺伝子プロモーター又は該コーデ ィング領域の発現を誘導するのに十分な該プロモーターの部分の支配下に置かれ ている、請求項１乃至４のいずれかに記載の細胞株。

６−　ＴＭｈｅｐＴＧ３９及びＴＭｈｅｐＴＧ４８から選択される請求項２に記 載の細胞株。

７、ヒト血漿中に存在する第Ｘ因子と同様な活性を持つヒト起源の第Ｘ因子を血 漿中に含み、ヒト起源の第Ｘ因子をコードする領域を含む外因性のＤＮＡ断片を ゲノム中組み込んだ遺伝子導入動物（ｔｒａｎｇｅｎｉｃ　ａｎｉｍａｌ）であ って、該コーディング領域が、肝特異的なプロモーター領域の支配下におかれた 遺伝子導入動物。

８、ヒト第Ｘ因子をコードする領域を含む外因性のＤＮＡ断片をゲノム中に組み 込んだ、請求項７に記載の遺伝子導入動物。

９、ヒト第Ｘ因子をコードする領域を含む外因性のＤＮＡ断片をゲノム中に組み 込んでおり、該コーディング領域が、ゲノム型（ｇｅｎｏｍｉｃ　ｔ７ｐｓ）の ものである請求項８に記載の遺伝子導入動物。

１０、ヒト第Ｘ因子をコードする領域を含む外因性のＤＮＡ断片をゲノム中に組 み込んでおり、該コーディング領域が、第■因子遺伝子プロモーター、α−アン チトリプシン遺伝子プロモーター及び該コーディング領域の発現を誘導するのに 十分なこれらプロモーターの部分から選択されるプロモーター領域の支配下に置 かれている、請求項７乃至９のいずれかに記載の遺伝子導入動物。

１１、ヒト第Ｘ因子をコードする領域を含む外因性のＤＮＡ断片をゲノム中に組 み込んでおり、該コーディング領域が、第■因子遺伝子プロモーター又は該コー ディング領域の発現を誘導するのに十分な該プロモーターの部分の支配下に置か れている、請求項７乃至１０のいずれかに記載の遺伝子導入動物。

１２、肝腫瘍を発生することが可能であり、適当なプロモーター領域の支配下に 置かれたオンコジーンをコードする領域を含む外因性のＤＮＡ断片をそのゲノム 中に組み込んだ請求項７乃至１１のいずれかに記載の遺伝子導入動物。

１３、請求項１乃至５のいずれかに記載の細胞株を調製する方法であって、 一請求項１２に記載の遺伝子導入動物の腫瘍性肝、又は請求項１２に記載の遺伝 子導入動物由来の腫瘍性肝細胞が増殖した腫瘍性肝を取り除き、 −上記細胞株が該肝の細胞を培養することによって選択される、 上記細胞株を調製する方法。

１４、ヒト血漿中に存在する第Ｘ因子と同様な活性を持つヒト起源の第Ｘ因子を 調製する方法であ？て、請求項１乃至６のいずれかに記載の細胞株を培養し、続 いて培養培地中の該第Ｘ因子を得ることを特徴とする方法。

１５、請求項１４に記載の方法によって得られる第Ｘ因子。

明　細　書 生物学的に活性のある第Ｘ因子を発現する細胞系統本発明は、遺伝子導入（ｊｒ ａｏｓｇｅｎｉｅ）動物から得られ、生物学的に活性のある第Ｘ因子を発現する 、新規な不死化された（ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ）細胞株（ｃｅｌｌ　！１ｎ ｅｔ）及び本発明の細胞株から第Ｘ因子を生産する新規な方法に関する。

ヒト第Ｘ因子は、４１５アミノ酸の蛋白質（成熟型）であり、本来血中に存在し 、血液凝固を導く反応のカスケードに関与する。第Ｘ因子は、主として最初は前 駆体の形で肝で合成され、その前駆体は、少なくとも４種の翻訳後修飾即ち、（ ｉ）１２個のグルタミン酸残基を伴うγ−カルボキシル化、（ｉｉ）糖鎖形成、 （ｉｉｉ）　６４位のアスパラギン酸残基のβ−水酸化及び（ｉＶ）プロペプチ ドの蛋白質分解切断に続きシグナルペプチドの蛋白質分解切断による放棄を受け る。この様に加工された（ｐｔｏｃｅｓｓｅｄ　）第Ｘ因子は、血中に分泌され る。血液凝固の事態が起こると、−末鎖の循環型の第Ｘ因子（チモーゲン型）は 、活性化された第ＸＩ因子の存在下で切断を受け、二本鎖の第Ｘ因子の活性化型 （第１Ｘａ因子）になり、次いで第■ａ因子、血小板の膜由来のリン脂質及びカ ルシウムからなる複合体に関与する。

ヒト第Ｘ因子の遺伝性欠損は、重大な疾患、即ち３万人に一人の男性を冒す血友 病Ｂ型の原因である。現在では、患者は、ヒト血漿から得られた濃縮第■因子製 剤の輸液によって治療されている。患者はこの様に、提供者の血液中に検出不可 能な病原性の因子が存在している可能性があることから、感染の重大な危険にぎ らされている。この重要な欠点に打ち勝つために、長い間、組換えＤＮＡ技術に より第Ｘ因子を生産する研究が行われてきた。種々の発現系、特に、哺乳類の宿 主細胞を伴う系が提案されてきた。それにもかかわらず、この方法で生産された 第Ｘ因子は、正確に加工されておらず、またその活性は血漿由来の第Ｘ因子に比 べ、かなり低いことがすぐ判明した。

また同時に、遺伝子導入動物におけるヒト第Ｘ因子の発現も得られてきた。チョ ーら（Ｃｈｏｏ　ｅｊ　ａｔ、、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、　（１９８７） 　１５：８７１）は、ヒツジのメタロチオネインＩａ遺伝子の誘導性プロモータ ーの支配下に置かれた第Ｘ因子をコードする相補的ＤＮＡ　（ｃＤＮＡ）が事前 に導入された、遺伝子導入マウスにおけるこの蛋白質の発現を報告している。亜 鉛の存在下のみ、このプロモーターから有意なレベルの転写が誘導される。この 様に、生産された第Ｘ因子は、生物学的に活性があるが、チョーらの実験は、科 学的に興味のある実験ではあるが、能率面での明らかな理由のためと明らかな倫 理的な根拠にたって、これゆえに、産業上の適用を持つことができない。

今般、ヒト第Ｘ因子をコードする配列を含む一つまたは複数のＤＮＡ断片がゲノ ムの中に組み込まれた遺伝子導入動物の肝由来の不死化された細胞株を、培養す ると、ヒト血漿に存在する第Ｘ因子と同様な活性を持つ第Ｘ因子を産生ずること が判明した。

よって、本発明は、肝起源のトランス−インモータライズされた（ｔｒａｎｓ− ｉｍｍｏｒｔａｌｉｘｅｄ）細胞株であって、ヒト血漿中に存在する第Ｘ因子と 同様な活性を持つヒト起源の第Ｘ因子を発現でき、且つそのゲノムの中に、ヒト 第Ｘ因子をコードしている領域を含む外因性のＤＮＡ断片を組み込んでおり、該 配列が肝に特異的なプロモーター領域の支配下に置かれている細胞株を提案する ものである。

“ヒト起源の第■因子″とは、以下の二つの特性を持ついかなる蛋白質をも意味 すると理解されるニーその蛋白質は、アミノ酸配列がアンソン（Ａｎｓｏｎ）ら （ＥＭＢＯＪ、　（１９８４）　３　：１０５３　’）によって与えられたヒト 第Ｘ因子及びそのアミノ酸配列が修飾されているすべてのアナログ（ａｎａｌｏ ｇ）から選ばれる。これらの修飾は、欠失、挿入又は他のアミノ酸によるアミノ 酸の置換である。“ヒト第■因子アナログとは、ヒト第Ｘ因子と同じアミノ酸配 列を有するが、異なる翻訳後修飾を有するいかなる蛋白質をも意味すると理解さ れる。

−その蛋白質は、オーステン　アンド　リュイメスのアラポラトリー　マニュア ル　オブ　ブラッド　コアギュレーション（Ａｕｓｔｅｎ　＆　Ｒｈ７ｍｅｓ　 （１９７５）、Ａ　Ｉａｂｏｒａｊｏｒ７ｍｘｎｕ１１　ｏｆ　ｂｌｏｏｄ　ｃ ｏａｇｕｌａｔｉｏｎ、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　５ｃｉｅｎｔｉｌｉｃＥｄ、）に 記載のカオリン凝固テスト（ｋａｏｌｉｏ　ｃｏａｇｕｌａ目０ｎｔｅｓｊ）（ 一段階アッセイ）によって示される血液凝固活性を有し、この活性は、以下の記 載において、“第Ｘ因子”活性という。指針として、このテストにおける当該の 手順の詳細な説明を以下に示した。

テストするサンプルのアリコート１００μｇに、次のものを加える： 第■因子欠損血漿（スタガ（Ｓｔａｇｏ）　）　１００μｇ及びセファリン（ｃ ｅｐｈａｌｉｎ）　／カオリン溶液［軽量１０ｍ１のオウレン　アンド　コラ− バッファ　−（Ｏｗｒｅｎ　＆　ｌ：ｏｌｌｅｒｂｕｆｆｅｒ）　（５，５ｇ　 ／ρの５，５−ジエチルバルビッル酸、３．６９ｇ／Ｉの酢酸ナトリウム、０． ６３％の塩化ナトリウム、ｐＨ７，３）に対して、カオリン（メルク、Ｍｅｒｅ ｋ；リファレンス１９０６）２５ｍｇ　；セフ７リン（スタガ）１００μｇ０必 要ならば、このサンプルを事前にイミダゾール緩衝液（１，７５ｇ／ｆｌ　；ｐ Ｈ７，４）で希釈してもよい。この調製物を３７℃で１８０秒インキュベートし 、０．０２５Ｍ　ＣａＣ１２１００，ｃｚＮを添加する。

クロット形成までの潜在時間（凝固時間）を自動的に測定する（ベーリング　フ ィブリンタイマー　１０．　ＢｅｈｒｉｎｇＦｉｂｒｉｎｔｉｍｅｒ　１０）。

゛第Ｘ因子”活性は、それ以後以下の・様に調製された検量系に基づき；確立さ れる。即ち、第Ｘ因子を含んでいる対照血漿（スタガ　コントロール　プラズマ 　Ｎ　ＦＶＩＩＩ−ＦＩＸ、供給者によって示された活性；ＩＵ＝第■因子５μ ｇ）を、イミダゾール緩衝液で、１０．２０．４０．８０及び１６０倍に希釈す る。凝固時間を夫々の希釈された溶液で測定し、検量線を描く（対数目盛り上で 凝固時間の関数としての“第Ｘ因子”単位）。上述のように手順が行われた場合 、測定した活性が、２５０ｎｇ／ｍΩ未満のときは、試験サンプルは“第Ｘ因子 ”活性を有していないと考えられる。

この試験が、ヒト第Ｘ因子を発現する遺伝子導入動物の血漿を用いて行われると きは、２つの系のサンプルを使用すべきである、即ち、採取された血漿からなる 第一の系及び抗ヒト第■因子抗体が、当該動物の第Ｘ因子と交叉反応を起こさな いかぎりにおいて、中和抗ヒト第■因子抗体で処理した血漿からなる第二の系で ある。平行して得られる結果間の差を評価することによって、ヒト第Ｘ因子に特 異的に基づく第■因子活性を明らかにすることができる。最後にもし必要ならば 、遺伝子導入動物の血漿を、イミダゾール緩衝液で、更に希釈する。

“ヒト血漿中に存在する第Ｘ因子と同様な活性を持つヒト起源の第Ｘ因子”とは 、上述したオーステン　アンドリュイメスのテストを用いてμ“ｇ／ｍρで測定 した第■因子活性が、ＥＬＩＳＡテストによってμｇ／ｍｆｆで測定された当該 サンプル中の総第■因子量の、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％ 、より好ましくは少なくとも９０％に相当するようなサンプルによって表される ヒト起源の第Ｘ因子を意味すると理解される。第Ｘ因子に特異的なＥＬ　Ｉ　Ｓ Ａキットは、ダイアグノスチヵ（Ｄｉａｇｎｏｇｊｉｃａ　）スタガ１アスニエ ール（Ａｓｎｉｅｒｅｓ）　、フランスから、商業的に入手できる。本段落の定 義を基本とすると、ヒト血漿に存在する第Ｘ因子は、はぼ１００％の第■因子活 性を有する。一般的にいえば、上述のような活性の基準を満たす第Ｘ因子は、“ 生物学的に活性のある第Ｘ因子”という用語で表される。

“肝に特異的なプロモーター領域”とは、限られた哺乳動物細胞の型（すべての 型ではない）、特に肝細胞又は肝起源の細胞の転写を開始させることができる、 哺乳動物のプロモーター又はその一部分を意味すると理解される。好ましくは、 肝に特異的なプロモーターは主に肝細胞又は肝゛　起源の細胞中で、コードして いる配列（ｃｏｄｉｎｇ　５ｅｑｕｓｎｃｅ　）の転写を開始できるプロモータ ー、例えば、α−アンチトリプシン又は第■因子遺伝子プロモーターである。本 発明の目的には、今まで、第■因子遺伝子プロモーターに支配；　される発現が 、α−アンチトリプシン遺伝子プロモーターに支配される発現よりも弱いと考え られてきたにも拘らず、後者のプロモーターが特に最も好ましい。

（ｊｔａｎｓ−ｉｍｍｏｒｊａｌｉｘａ目ｏｎ　ｐｒｏｃｅｓｓ　）によって得 られる。

それは、遺伝子導入動物から又は遺伝子導入動物由来の肝腫瘍が増殖した動物か ら得られる、肝腫瘍細胞の培養物より選択される。

本発明の文脈において、“遺伝子導入動物（ｔｒａｎｇｇｅｎｉｃａｎｉａ＋ａ ｌ　）”とは、それ自身のゲノム内に組み込まれた状態で、ヒト起源の第Ｘ因子 をコードする領域又はオンコジーンをコードする領域を含む外因性のＤＮＡ断片 を有し、対応する蛋白質を発現できる動物を意味すると理解される。

この遺伝子導入動物は、完全なトランスジェニック（細胞すべてが外因性のＤＮ Ａ断片を保持している）であってもよ（、又は、モザイク（外因性のＤＮＡ断片 が、すべての細胞にではなく、ある割合の細胞中に存在する）であってもよい。

好ましくは、この遺伝子導入動物は、ヒト以外の哺乳類、より好ましくはネズミ （ｍｕｒｉｎｅ）　、最も好ましくは、マウス（ｍｏｕｓｅ　）が良い。

上記を考慮すれば、細胞株を得ることがで、きる遺伝子導入動物は、二重に（ｄ ｏｕｂｌｙ）　、”！！ＩＩち、第Ｘ因子について及びオンコジーンについてト ランスジェニックでなければならない。

第一の態様によると、その様な動物は、（ｉ）第■因子領域の支配下に置かれた 第一の外因性ＤＮＡ断片及び、（ｉｉ）適当なプロモーター、例えば、肝特異的 なプロモーター領域の支配下に置かれたオンコジーン（オンコジーン配列）をコ ードしている領域を含む第二のＤＮＡ断片、を共に注入された卵の発育によって 得られる。上記第−及び第二のＤＮＡ断片は、二つの異なる分子として、又は、 代わりに１つのＤＮＡ体として注入されても良い。

第二の別の態様によると、本発明の細胞株が確立される肝腫瘍を発育することが 可能な、第Ｘ因子の遺伝子導入を受けた動物は、以下のようにして得られる：オ ンコジーンの遺伝子導入を受ける最初の動物を得るために、オンコジーンを含む ＤＮＡ断片を、卵に注入する。

また、第二の遺伝子導入動物を得るために、同時に、第Ｘ因子をコードする領域 を含むＤＮＡ断片を注入する。その後、第−及び第二の遺伝子導入動物を、オン コジーンと第Ｘ因子を二重に遺伝子導入した子（ｏｆｆｓｐｒｉｎｇ　）を得る ために、交配させる。

したがって、本発明は、以下のものに関するものでもある。即ち、（ｉ）単独に 遺伝子導入された動物（ｓｉｎｇ１７ｊｒａｏｓｇｅｎｉｃ　ａｎｔｍａｌ　） であって、その血漿が、ヒト血漿中に存在する第Ｘ因子の活性と同様な活性を持 つヒト起源の第Ｘ因子を含んでおり、それ自身のゲノム中に、ヒト起源の第Ｘ因 子をコードする領域を含む外因性のＤＮＡ断片を組み込んでおり、該領域が肝特 異的なプロモーター領域の支配下に置かれている単独に遺伝子導入された動物、 及び（ｉｉ）　（ｉ）に記載の遺伝子導入動物であって、加えて、肝腫瘍を発達 させることができる動物［というのは、それはゲノム中に、適当なプロモーター 領域、例えば、真核生物プロモーター領域又はウィルス起源のもの（好ましくは 、それは肝特異的なプロモーター領域である。）、の支配下に置かれたオンコジ ーンをコードする領域を含む外因性のＤＮＡ断片を組み込んでいるからである］ 。

一般的にいえば、上記オンコジーンは検討中の動物において、肝腫瘍を誘導する ことができるどのようななオンコジーンでも良い。例えば、ＳＶ４０ウィルスの Ｔ抗原（ａｎｊｉｇｅｎ　）又は、マウスｃ−ｍｙｃ遺伝子によってコードされ る抗原である。

本発明の目的には、ヒト第Ｘ因子をコードする領域を含むＤＮＡ断片は、発現ブ ロック（ｅｘｐｅｔｓｓｉｏｎ　ｂｌｏｃｋ）の形で構築することができる。よ り具体的には、該領域を、コーディング領域（ｃｏｄｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ　） の５−末端でプロモーター領域の支配下に置くことによって構築され、それは、 肝特異的なプロモーター又は少なくとも肝細胞中で第Ｘ因子を発現させるのに十 分なプロモータ一部分である。プロモーター領域およびコーディング領域とは別 に、発現ブロックは、また、転写終了の中止の要素（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏ ｎｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　５ｔｏｐ　ｅｌｅｍｅｎｔ）を含んでいてもよい。

第Ｘ因子をコードする領域の配列は、以下のようなものであり得るニ ーゲノム型のもの：例えば、ヒト第Ｘ因子の場合、それは、特にアンソンら（上 述）によって記載された配列で、８個のエクソン（エクソンＡからＨ）と７個の イントロン（イントロン１から７）を含むもの、又は、上記配列中、少なくとも １個のイントロンの大きさが、欠失を導入することによって減じられたものに対 応する配列である。

−相補的ＤＮＡ型のもの；例えば、ヒト第Ｘ因子の場合、それは、アンソンら（ 上述）によって記載された配列で、７個のイントロンが無いもの。

一混合型のもの（又ミニジーン（ｍｉｎｉｇｅｎｅ）として知られている）；例 えば、ヒト第Ｘ因子の場合、それは、アンソンら（上述）によって記載された配 列で、７個のイントロンのうち、少なくとも１個が除去され、又７個のイントロ ンのうち少なくとも１個が保持されているものである。好ましくは、第一イント ロン又は、第一イントロンの一部のみが保持されているのが良い。

本発明のより好ましい態様としては、ゲノム型の配列を用いることが選択される 。

加えて、外因性のＤＮＡ配列は、増幅領域、例えば、アデノシンデアミナーゼ（ Ａ　Ｄ　Ａ）をコードする領域を含有することができ、それは、いくつかの抗生 物質に対する進行性耐性を与える。この増幅領域と第Ｘ因子をコードする領域は 、共通のプロモーター領域（ｃｏｍｍｏｎ　ｐｒｏｍｏｔｅｒｒｅｇｉｏｎ）の 支配下におかれなければならない。高い投与量の抗生物質に対する耐性に基づき 選択することによって、第Ｘ因子を過剰に産生ずる（ｂ７ｐｅｒｐｒｏｄｕｃｔ ｉｖｅ　）細胞株が得られる。

この外因性のＤＮＡ断片は、最初に発現ベクター、例えば、プラスミド、に挿入 された断片として構築される。にもかかわらず、本発明で用いるには、それは、 直線型にされ、他のプラスミド要素からは、分離されなければならない。

さらに、本発明は、本発明による細胞株を製造する方法をも提案する。即ち、該 方法においては、一本発明による遺伝子導入動物め腫瘍の肝（又は、腫瘍化が進 行している肝）又は、本発明の遺伝子導入動物由来の腫瘍肝細胞が増殖した動物 の肝を取り除き、−該細胞株が、該肝細胞を培養することにより選択される。

最後に、本発明は、又、ヒト血漿中に存在する第Ｘ因子と同様な活性を持つヒト 起源の第Ｘ因子を調製する方法にも関する。即ち、それは、本発明の細胞株を培 養して、続いて培養培地中の第Ｘ因子を集める方法である。

本発明は以下に例示され、以下の図に関する。

図１は、ヒト第Ｘ因子をコードする遺伝子の構造を、図式的に示したものであり 、以下のように、エクソンの位置（ＡからＨ）、ゲノムライブラリーのスクリー ニングに用いたオリゴヌクレオチドによって認識された配列の位置（［１］から ［６］）及び、３種のラムダ（ｌｓｍｂｄ＊）ベクター、　λＴＧ１９５１、λ ＴＧ１９５８およびλＴＧＩ９５２にクローン化された断片を表す。

図２は、プラスミドｐＴＧ３９６０の構造を図式的に示すものであり、その断片 がどのプラスミドに源を発するのか、そしてその断片が、どのラムダベクターか ら構築されたのかを記載している。第Ｘ因子のエクソンは、文字ＡからＨで示す 。

図３は、プラスミドｐＴＧ３９５４の構造を図式的に示すものであり、その種々 の断片がどのベクターに源を発するのかを記載している。第Ｘ因子のエクソンは 、文字ＡからＨで示す。

図４は、種々の断片がどのプラスミドに源を発するのかを記載したプラスミドｐ ＴＧ３９６２の構造を図式的に示す。第Ｘ因子のエクソンは、文字ＡからＨ（中 抜きの長方形）により、α−アンチトリプシン遺伝子の第一ノンコーす。

図５は、ヒト第Ｘ因子を発現する遺伝子導入マウス系（ｍｏｕｓｅ　１ｉｎｅ） の異なる組織から調製したＲＮＡの電気泳動分析を示す（“Ｃ′は対照マウス、 “Ｔ”はテスト）。

図６は、ヒト第Ｘ因子を発現する遺伝子導入マウスの肝由来のメツセンジャーＲ ＮＡの分析を示す；　（１）及び（２）は、ＴＭＴＧ３９６０−１ラインマウス 、“Ｃ”は対照マウス、（３）は、ＴＭＴＧ３９６２−１８ラインマウス、（４ ）は、ＴＭＴＧ３９５４−９ラインマウス及び（５）及び（６）は、ＴＭＴＧ３ ９５４−５８ラインマウスである。

図７は、遺伝子導入マウスの血漿から単離された遺伝子組換えヒト第Ｘ因子のウ ェスタンプロット分析を示す；（１）及び（２）は、ＴＭＴＧ：Ｅ（９５４−５ ８ラインマウス、（Ｃ）は対照マウス、（３）、（４）、（５）及び（６）は、 ＴＭＴＧ３９６０−１ラインマウス、“Ｓ”は、スタガ　第Ｘ因子及び（７）及 び（８）は、ＴＭＴＧ３９５４−９ラインマウスである。

図８ａ及び図８ｂは、プラスミドｐＴＧ４９１２の構築を図式的に示すものであ る。

実施例１ ヒト第Ｘ因子をコードする領域を含むＤＮＡ断片を保持するベクターの調製 Ａ　ヒト第Ｘ因子をコードする領域のクローニングヒトリンパ芽球腫細胞株（１ ７ｍｐｈｏｂｌｘｓｊｏｉｄ）　ＧＭ　１２０２Ａ　（４ＸＹ）由来のゲノムＤ ＮＡのライブラリーを、バクテリオファージλＥＭＢＬ３　（バビラニらＰａｖ ｉｒａｎｉ　Ａｅｊ　ａｌ、、　、バイオテクノロジー　Ｂｉｏ＼ｔｅｃｈｎｏ ｌｏｇＴ　（１９８７）５：３８９）中で生産し以下の合成オリゴヌクレオチド プローブ　（２１−１２２−及び２５−マー（ｍｅｔ）　）を用いて、スクリー ニングする。

５’ＡＡＧＴＡＣＡＡＧＣＴＧＡＧＣＴＧＴＡＴＴ３°　［１１５°ＴＧＣＣＡ ＴＧＡＴＣＡＴＧＴｒＣＡＣＧＣＧ　３°　［２］５°ＣｒＣＡＧＴＡＣＡＧＧ ＡＧＣＡＡＡＣＣＡＣＣｒＴＧ３’　［３１５°ＴＡＧＡＡｍＡＣＡＴＡＧＴＣ ＣＡＣＡＴＣＡＧＧ３°　［４１５’　ＧＴＣＴＣＴ’ＡＣＴＡＧＣＴＧＴＡＧ ＡＴｒＧＣ３°　［５１５°ＧＡＴｒＡＴＡＧＧＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＴＧ　３ ’　［６］これらは、図１に示すように、ヒト第Ｘ因子の異なる領域に対応する 。

３種の独立したλクローンを、プローブを用いてサザンブロツティング法で同定 する：即ち、λＴＧ１９５１、λＴＧ１９５８およびλＴＧ１９５２　（図１） 。λＴＧ１９５１インサート（ｉｎｓｅｒｔ）は、５ｋｂのプロモーター領域と 遺伝子の最初の４個のエクソンをカバーする領域を含む。

λＴＧ１９５２インサートは、イントロン６の２．３ｋｂ。

イントロン７、エクソンＧ及びＨと、１０ｋｂのポリアゾニレ−ジョンシグナル （ｐｏｌｙａｄｅｎ７１ａｔｉｏｏ　ｓｉｇｎａｌ）の下流に隣接した配列を含 有する。λＴＧ１９５８インサートは、エクソンＢからエクソンＦの下流０．４ ７ｋｂまで広がっている（それはλＴＧ１９５１インサートと７ｋｂ重複してい る）。結果として、上述した３個のインサートは、総合すると遺伝子の大部分、 特に、８個のエクソン及び隣接した５−（５ｋｂ）と３−　（１０ｋｂ）の領域 を含んでいる。即ち、この中には、イントロン６の領域（６，７ｋｂ）のみ存在 していない。

Ｂ　ヒト第■因子遺伝子プロモーターの支配下におかれたヒト第Ｘ因子をコード するゲノム型のＤＮＡ配列を含有するプラスミドの構築（ｐＴＧ３９６０　図２ ）１５−ｋｂのクローンλＴＧ１９５８の５ａｌＩ断片を、ラッセら（Ｌａｊｂ ｓ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｇｅｎｅ（１９８７）５７：１９３）により記載されたベ クターｐｐｏｌｙＩＩＩ−Ｉ★の５ａｌＩ制限部位にサブクローニングし、プラ スミドｐＴＧ３９１１を得る。

単制限部位（ｓｉｎｇｌｅ　ｔｅｓｊｒｉｃｊｉｏｎ　５ｉｔｓｓ）　（Ｓ　ｆ 　ｉ　Ｉ、ＥｃｏＲＩ、Ｋｐｎ　Ｉ、ＢａｍＨＩ、Ｘｈｏ　Ｉ及びＮｏｔＩ）を 含有する合成リンカ−を、コスミッドｐＣＶ００１　（チョーら、Ｃｈｏｏ　ｅ ｊ　ａｌ、、Ｇｅｎｅ（１９８６）４６：　２７７　）の２つのＥｃｏＲＩ部位 の間に導入し、そのコスミッドは、挿入の間で破壊され、プラスミドｐＴＧ３９ ０９を生成する。クローンλＴＧ１９５２から単離されるＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲ Ｉ　（４，３ｋｂ）及びＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ（１，８ｋｂ）断片を、ｐＴＧ ３９０９のＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ部位の間にクローニングし、ｐＴＧ３９１４ を得る。ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片の方向付け（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ　） を、酵素消化によって調べる。第■因子遺伝子の３一部分（エクソンＧとＨに対 応）を含む６．２ｋｂ断片（ＥｃｏＲＩ−ＡａｔＩＩベクター断片を加えた上述 の２つの断片）を、ＢａｍＨＩ及びＡａｔＩＩの消化によってコスミッドから再 抽出する。この断片は、ｐＴＧ３９１１の同じ部位間にクローニングされ、プラ スミドｐＴＧ３９２１を得る。

λＴＧ１９５１の５ａｌＩ−８ａｌＩインサートをプラスミドｐＡＴ１５３　（ ）ライラグ　ニー　ジエ−（ＴｗｉｇｇＡ、ｌ）とシュラット　ディー　（Ｓｈ ｅｒｒａｊ　Ｄ、）、Ｎａｔｕｒｅ（１９８０）２８３：２１６）の５ａｌＩ部 位にサブクローニングし、プラスミドｐＴＧ３９２７を得る。イントロン１の中 央部分をライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）に続（ＰｖｕＩ［消化によって除 去し、プラスミドｐＴＧ３９５２を得る。このプラスミドは、もはや、イントロ ン１の内部の２つのＰｖｕＩＩ断片（３，６５ｋｂと１．１３ｋｂ）を保持して いないが、エクソンＢとＣを含むＰｖｕｎ断片（４，３８ｋｂ）を保持している 。ｐＴＧ３９５２の５ａｌＩ−８ａｌＩインサートをベクターｐｐｏ　１　ｙ　 Ｉ　Ｉ　Ｉ−Ｉ”に移し、プラスミドｐＴＧ３９５６を得る。それは、５′末端 に単部位（ｓｉｎｇｌｅ　５ｕｅｓ）を持つ。ｐＴＧ３９５６のＸｈｏＩ−３ｎ ａＢＩ断片を、ｐＴＧ３９２１のＸｈｏＩ−８ｎａＢＩ部位間に導入して、プラ スミドｐＴＧ３９６０　（図２）を得る。そしてそれは以下のものを含んでいる 。

−５ｋｂの第■因子遺伝子プロモーター配列−２２ｋｂの第Ｘ因子をコードする 断片（イントロン１は、これら２つのＰｖｕＩＩ断片に関して、トランケートさ れ、イントロン６は、該イントロンの最も下流のＢａｍＨＩ部５　位を使用する ことにより、０．４６ｋｂの断片が更に欠失される結果７．１ｋｂの範囲でトラ ンケートされる。

−ポリアゾニレ−ジョンシグナルの下流の３゛ゲノム配の数百塩基対 Ｃヒト第■因子遺伝子プロモーターの支配下におかれたヒト第Ｘ因子をコードす る“混合（ｍｉｘｅｄ　）“型の配列を含むプラスミドの構築（ｐＴＧ３９５４ 　図３）１　第■因子遺伝子の３′末端を含む６．２ｋｂ断片を、Ｃ１ａＩ及び ＡａｔＩＩ消化によって、コスミッドｐＴＧ３９１４から再抽出する。その後、 ベクターｐＡＴ１５３のＣ１ａＩ及びＡａｔＩＩ部位の間にクローニングし、プ ラスミドｐＴＧ３９２４を生成する。この構築を、Ｅ、ｃｏｌｉＧＭ３３　（ｄ ａｍ　）株に移入する。ＢｃｌＩとＢｇｌＩ［の間に含まれるゲノム配列を除去 し、ファージλＴＧ１９５１由来であって、エクソンＢの５−末端とイントロン １の３′部分を含んでいるＢｃ　Ｉ　Ｉ−Ｂｇ　Ｉ　ＩＩ断片（２，３４ｋｂ） に置き換え、プラスミドｐＴＧ３９２６を得る。このクローニングは、Ｅ−ｃｏ ｌｔ　５に株で行われる。最後のクローニング工程中に取り除かれるＢａｍＨＩ とＢｇ１■部位間のインドロン６由来の０．６ｋｂのゲノム配列バ特許出願（Ｅ ｕｒｏｐｉａｎ　Ｐａｔｅｎｔ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　）　ＥＰ−Ａ　−１ ６２，７８２に記載されているプラスミドｐＴＧ３９７（このプラスミドはヒト 第Ｘ因子相補的ＤＮＡを含む）から単離されたＢｃｌＩ断片（１，４ｋｂ）を組 み込むことによって、エクソンＢとＨ間の相補的ＤＮＡの部分を再形成すること ができ、プラスミドｐＴＧ３９５１を得る。

プロモータ一部分、エクソンＡ及びイントロン１の残りの部分は、Ｘｈｏ　Ｉ− Ｂｇ　Ｉ　Ｉｆ断片の形でプラスミドｐＴＧ３９１０　（ｐＴＧ３９１０は、λ ＴＧ１９５１の５ａｌＩ断片を、ベクターｐｐｏｌｙＩＩＩ−Ｉ”にクローニン グして得られる）から単離される。この断片をｐＴＧ３９５１のこれら同一の部 位間に組み込み、プラスミドｐＴＧ３９５４　（図３）を得る。これは、従って 、プロモーターの５ｋｂ部分、エクソンＡ１完全な第一イントロン、相補的ＤＮ Ａの形態のエクソンＢからＨ及び数百塩基対のポリアゾニレ−ジョンシグナルの 下流の隣接した３′部分を含有している。

Ｄ　α−アンチトリプシン遺伝子プロモーターの支配下に置かれたヒト第Ｘ因子 をコードするゲノム型のＤＮＡ配有するα−アンチトリプシン遺伝子のイントロ ン１の５′部分、プロモーター領域及び最初のノンコーディングエクソンを含む ＫｐｎＩ−ＫｐｎＩ断片を、ベクターｐｔｙｃ１８（ヤニッシューペロン　シー ら、Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｏ　Ｃ，ｅｔａｔ、　、　Ｇｅｎｅ　（１９８ ５）　３３：１０３）に挿入する。特に、イントロン１の５′部分は、スプライ シング　ドナー（ｄｏｎｏｒ　）部位を含んでいる。

次いで、雑種の機能的なイントロン（ｈ７ｂｒｉｄ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｎ ｊｒｏｎ）を、アダプターの配列がマウスのｃ−ｍｙｃ遺伝子の第一イントロン の３−末端を基礎としているｐＵｃ１８のポリリンカーのＸｂａＩ部位に導入す ることにより形成する。この合成断片は、以下の配列である。

この合成断片は、５′から３′にかけて、ＸｂａＩ部位、転写の正確なスプライ シングを可能とするスプライシングアクセプター（ａｃｃｅｐｔｏｒ）部位（” ）（切断はＧとＣの間で起こる）、エクソン領域で第Ｘ因子をコードするＤＮＡ 断片を融合することができる平滑末端でのクローニング部位（ＨｐａＩ）及び最 後にＸｂａＩ部位を含んでいる。この断片の方向付けをシーフェンシングによっ て確かめる。

構築の最後に、プラスミドｐＴＧ３９２５を得る。

又、同時に、第Ｘ因子遺伝子のプロモーター領域の５′部分、エクソンＡ及びイ ントロン１のほぼ６００ｂｐを含むλＴＧ１９５１のＨｔｎｄＩＩ［断片（４ｋ ｂ）を、ベクターＭ１３ＴＧ１３０　（キエニー　エム　ビーら、Ｋｉｅｎ７　 Ｍ。

Ｐ、ｅｔ　ａｌ、、Ｇｅｎｅ（１９８３）２６：　９１）中にサブクローニング する。

ＳｍａＩ部位（平滑末端）をオリゴヌクレオチド５’　ＧＣＡＴＡＡＣＣＣＧＧ ＧＣＴＡＧＣＡＧ　３’を用いて定方向突然変異（ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａ ｇｅｎｅｓｉｓ）で作成する。この部位は、転写開始ＡＴＧの２ヌクレオチド上 流に作られる。こうして修飾されたＨｉｎｄＩ［Ｉインサートは、ベクターｐｐ ｏｌｙＩＩＩ−Ｉ”に再度組み込まれ、プラスミド１）ＴＧ３９１３を得る。

α−アンチトリプシン遺伝子のプロモータ一部分とコーディング領域の初めの部 分（該領域はスプライシングアクセプタ一部位を持っている。）は、ＥｃｏＲＩ −ＨｐａＩ断片の形態で、ベクターｐＴＧ３９２５から単離される。

この断片をプラスミドｐＴＧ３９１３のＥｃｏＲＩとＳｍａＩ部位間に組み込み 、プラスミドｐＴＧ３９５３を生成する。この挿入は、ＨｐａＩとＳｍａ　Ｉの クローニング部位を破壊し、エクソン領域中で行われる。開始ＡＴＧは、第Ｘ因 子をコードしている領域（エクソンＡ）によって得られる。融合領域（マウスｃ −ｍｙｃに対応する合成配列とエクソンＡとの間）をシーフェンシングすること で、ヌクレオチドが、そのクローニング中に失われているのが分かる。

第Ｘ因子をコードする領域の５′部分は、第Ｘ因子遺伝子のトランケートされた イントロン１を含有しており、完全なコーディング領域の組み立てのため、上述 と同様な手順（ｓｊｒａｊｅｇ７）を適用できるよう、再形成する。この目的に は、プラスミドｐＴＧ３９５２から単離されるＥｃｏＲＶ−３ａｌＩ断片をｐＴ Ｇ３９５３の同じ部位間にクローニングし、プラスミドｐＴＧ３９５７を得る。

最後にｐＴＧ３９５７のＸｈｏＩ−８ｎａＢＩ断片（９，９ｋｂ）を、ｐＴＧ３ ９２１の同じ部位間に移し、プラスミドｐＴＧ３９６２を得る（図４）。この最 終的なりローニング段階は、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＢＪ株に移入して行ｉ　う。一方こ れ以前の工程は、Ｅ、ｃｏｌＬ　５に株に移入して行う。

ｐＴＧ３９６２　（図４）において、α−アンチトリプシン遺伝子のノンコーデ ィング　エクソンは保持されている。

実施例２ １　ヒト第Ｘ因子を発現する単独の遺伝子導入マウス（ｓｉｎｇｌｙ　ｊｒａｎ ｓｇｅｎｉｃ　ｍ１ｃｅ）Ａ　遺伝子導入マウスの生産 ｐＴＧ３９５４を５ａｌＩと５ｆｉＩで消化し、ｐＴＧ３９６０及びｐＴＧ３９ ６２を５ｆｉＩのみで消化すると、それぞれの場合で、ｐＢＲ３２２から得られ るプラスミドＤＮＡ断片から分離した、第Ｘ因子発現のためのブロックを含むＤ ＮＡ断片が得られる。こうして放出された各断片をショ糖勾配で精製し、当業者 に知られている手法を用いて、雌Ｃ５７／Ｂ　１６マウスと雄ＳＪＬを交配させ てできた第一世代ハイブリッドマウス（ｆｉｒ＠ｔ−ｇｅｎｅｔａｔｉｏｎｈＹ ｂｒｉｄΦｉｃｅ　）の雄の受精卵の前核に注入する。その後、各卵を、マウス の子宮中に、再着床（ｒｅｉｍｐｌａｎｔｅｄ　）させ、妊娠を維持する。

アイソトープ３２ｐでラベルした適当なプローブ（ヨーロッパ特許公報ＥＰ−Ａ −１６２，７８２中に記載のプラスミドｐＴＧ３９７のＢ　ａｍＨＩ−Ｂ　ａｍ ＨＩ断片）を用いて、ドツトプロット（Ｄｏｔ−ｂｌｏｔ）“分析により、上記 動物のゲノム中に外因性のＤＮＡ断片が組み込まれていることを確かめるため、 新生児の尾の組織のＤＮＡを同定する。ハイブリダイゼーション　テスト陽性の マウスから血液を抜き、第Ｘ因子の発現レベルを、血清中、ダイアグノスチカス タゴ　アッセイ　キット（アスセラクロム（Ａｓｇｅｔａｃｈｒｏｍ）　ＩＸ　 ：　Ａ　ｇ　；　Ｒｅｆ、　０４１０）を用いたＥＬ　Ｉ　ＳＡ法により、決定 する。このテストは、ヒト第Ｘ因子に特異的で、マウス第Ｘ因子と、はとんどま たはまったく、交叉反応を示さない。結果を以下に示す。

表１に示すように、最も高い発現は、ｐＴＧ３９５４及びｐＴＧ３９６０由来の ＤＮＡを用いた場合に得られる。

それらは、ヒト第Ｘ因子遺伝子プロモーターを含んでいる。

加えて、良い発現レベルを得るために、イントロンすべてを保有することは（ｐ ＴＧ３９５４）　、必要ではない。

Ｂ　遺伝子導入マウス由来のヒト第■因子に対応するｍＲＮＡ分析 ＴＭＴＧ３９６０−１ライン遺伝子導入マウス（第Ｘ因子プロモーター及びゲノ ムのコードしている配列）から、１　種々の組織（腎臓、牌臓、腸、肝臓）の総 ＲＮＡを調製する。これらＲＮＡを、１％アガロースゲル／ホルムアルデヒドの 電気泳動で分離し、ナイロンメンブレン（ｎ７１ｏｎ　ｍｅｍｂｒａｎｅ）に、 トランスファー後、アイソトープ３２ｐでラベルした放射性ヒトプローブ（ｐｐ ｏ　ｌｙ　ｒ　Ｉ　Ｉ−Ｉ★中へクローニングされているヒト第Ｘ因子遺伝子の 、翻訳されていない３−配列の９００ｂｐ）で、ハイブリダイズする。

図５に示すように、ヒト第Ｘ因子メツセンジャーＲＮＡ（はぼ３ｋｂ）が、ＴＭ ＴＧ３９６０−１ライン遺伝子導入マウスの肝組織中にのみ検出されるが、肝臓 以外の組織から単離されたＲＮＡについても、対照動物の肝臓中にも、放射性の シグナルは検出されない。特異的に、肝臓中にヒト第Ｘ因子を発現する遺伝子導 入マウスをこうして得た。

さらに、すべての遺伝子導入マウス系の、肝由来のメツセンジャーＲＮＡを、同 じプローブで分析すると、シグナルの強さは、総体的に、発現のレベルに匹敵し ている（図６）。

Ｃウェスタンブロッティングによるヒト第Ｘ因子の分析ラインＴＭＴＧ３９６０ −１、ＴＭＴＧ３９５４−９及びＴＭＴＧ３９５４−５８由来の遺伝子導入マウ スから、血漿を採る。バリウムにて、分画を沈殿させ、再溶解後、ウェスタンブ ロッティングにて分析する。図７に示すように、遺伝子導入マウス由来のヒト第 Ｘ因子は、ヒト血漿の第Ｘ因子と同様な分子量（ａ＋ｏｌｅｃｕｌｉｒ　ｍ１ｓ ｓ）であり、得られた産物が、グリコシリル化されていることが明らかであない 第Ｘ因子は、より低い分子量を有すると考えられる）。

Ｄ　遺伝子導入マウス血漿中に存在するヒト第Ｘ因子の凝固活性 各種ラインのマウスの血漿中のヒト第Ｘ因子の濃度を、ＥＬ　Ｉ　ＳＡテストで 測定した。結果を表２に示す。各種のマウスを、ラインの番号（例えば、ＴＭＴ Ｇ３９６０−１）、続いて世代（例えば、２１世代はＩ）、続いて特定の番号で 表す。第一世代ＴＭＴＧ３９６０−１ラインマウス中で定量されるヒト第Ｘ因子 の濃度は、先祖マウス（ｐｒｏｇｓｎｉｊｔｉｚ　ｍｏｕｓｅ　）中で、測定さ れたそれよりも大きいことが分かる（表１参照）。というのは、後者は、モザイ クだからである。これら同一サンプルにおいて、ヒト第■因子活性を、上述のオ ウステン　アンド　リュイメス（Ａｕｓｊｅｎ　ａｎｄ　Ｒｈｙｍｅｓ　）の一 段階アッセイ技術による凝固テストによって測定する。活性を、対照として用い たヒト血漿（スタガ　ＩＵ／ｍ１）のサンプルに対して、Ｕ　／　ｍｇで、測定 する。マウス血漿は、（ＩＵ／ｍρのオーダーの）無視できないバックグラウン ドを示す。遺伝子導入マウスの血漿サンプルを、抗ヒトｉ■因子特異的ポリクロ ーナル抗体と共に、ブレインキュベートし、このバックグラウンドを中和し、活 性のレベルを、マウス第Ｘ因子のそれまで下げる。抗体非存在下で得られる値と 、抗体存在下で得られる値との差が、ヒト第Ｘ因子のみによる活性に対応する。

この活性を、μｇ／ｍ１　（ＩＵ／ｍＮ−参考として取られた正常ヒト血漿中の 第Ｘ因子５μｇ／ｍｊ２）で表す。

結果を以下の表２に示す。

表２によると、遺伝子導入マウスの血漿中、ヒト第Ｘ因子は、生物学的に活性が あると考えられる。というのは、凝固活性（μｇ／ｍΩで測定）が、ＥＬＩＳＡ テストで測定した第Ｘ因子の量と同等だからであり、この事は、すべてのライン に当てはまるものである。

Ｅ　クエン酸バリウム沈殿テスト 又、遺伝子導入マウス血漿中に存在するヒト第Ｘ因子の量を、バリウム塩沈殿テ スト（バジャジ　ニス　ビーら、Ｂａｊａｊ　Ｓ、Ｐ、ｅｔ　ａｔ、、Ｊ、Ｂｉ ｏｌ、Ｃｈｅ＋ｎ、　（１９８１）　２５６：　２５３　）で確認する。γ−カ ルボキシル化された蛋白質を、クエン酸バリウム（不溶性塩）に吸着、共沈させ 、又一方、そのようにカルボキシル化をうけていない蛋白質は、溶液中に存在す る。遺伝子導入マウス血漿中のヒト第Ｘ因子の量（ｔｏ！、）を、処理前に測定 する。クエン酸バリウムで血漿を処理後、吸着された、従ってγ−カルボキシル 化された画分（ａｄｓ、）を再溶解し、ＥＬＩＳＡテストで、定量する。その量 をサンプルの容量に適用し、従ってｎｇで表す。Ａｄｓ／ｌｏｔ比をパーセント で表して、γ−カルボキシル化されているヒト第Ｘ因子の割合を定量化する。

表３に示すように、マウス血漿中に存在するヒト第Ｘ因子の大部分は、γ−カル ボキシル化をうけている。というのは、それが不溶性画分で検出されているから である。ヒト血漿中に存在する第Ｘ因子と比較すると、実験によって、８０から １００％の割合で沈殿が得られる。

Ｆ　ラインＴＭＴＧ３９６０−１及びＴＭＴＧ３９５４−９から得られる第Ｘ因 子の精製と特徴付けＴＭＴＧ３９６０−１及びＴＭＴＧ３９５４−９ライン由来 のマウスから得られるヒト第Ｘ因子を免疫アフィニティークロマトグラフィーで 精製する。溶出される画分を、逆相ＨＰＬＣに通し、産物を脱塩し、エドマン（ Ｅｄａｍｎ　）分解によって、Ｎ末端配列を決定する。それぞれの場合で、得ら れる結果から示されるように、遺伝子導入マウス血中に存在するヒト第Ｘ因子は 、成熟型によく一致する。ヒト第Ｘ因子前駆体は、検出されない。遺伝子導入マ ウスのヒト第Ｘ因子は、この様に、均一であり、正しく加工されている。

実施例３ ヒト第Ｘ因子を発現するトランス−インモータライズされた（ｔｒａｎｓ−ｉｍ ｍｏｒｔｉｒｉｚｅｄ）細胞株Ａ　オンコジーンを発現する単独遺伝子導入マウ スｃ−ｍｙｃオンコジーンを発現する遺伝子導入マウス系ＴＭＴＧ２９８４を、 特許出願ＥＰ−Ａ　Ｏ，２９８，８０７に記載されたプラスミドｐＴＧ２９８４ のＮｏｔＩ−ＮｏｔＩ断片を用いて作る。

ＳＶ４０のＴおよびｔ腫瘍抗原を発現する遺伝子導入マウス系ＴＭＴＧ４９１２ を、下記プラスミドｐＴＧ４９１２のＳａ　Ｉ　Ｉ−ＥｃｏＲＩ断片を用いて生 じさせる。

プラスミドｐＴＧ４９１２は、特許ＥＵ　０，１４０゜７６２記載のプラスミド ｐＴＧ１７１及びプラスミドｐＭＬ２から得られる。プラスミドｐ　Ｍ　Ｌ　２ は、ラスキー　エムら（Ｌｕｓｋｙ　Ｍ、　ｅｔ　ａｔ、Ｎａｊｕｔｅ　２９３ ．　（１９８１）　ｐｐ、７９−８１）の文献に記載の“ｐＪＹＭ一様（ｌｉｋ ｅ）”プラスミドから得られ、そこにおいては、欠失されたｐＢＲ３２２の青領 域（ｐｏｉｓｏｎ　ｒｅｇｉｏｎ　）は、ヌクレオチド１０８６と２４５７の間 のＤＮＡ断片である。加えて、ＳＶ４０のＢａｍＨＩインサートが欠失を受け、 こうしてプラスミドｐＭＬ２がＪ、　Ｅｄｓ、　ＤＮＡ　Ｔｕｍｏｒ　Ｖｉｒｕ ｓｅｓ−８ｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ　Ｒｅｖｉｓｅｄ、　ｐｐ。

７９９−８４１．　（１９８１）　のＢａｍＨＩ−Ｂｃ　Ｉ　Ｉ断片２５５３− ２７７０を、ＢａｍＨＩであらかじめ消化しておいたベクターｐ　Ｍ　Ｌ　２に 挿入し、図８に示すようなベクターｐＴＧＭＬ２Ａ　を得る。

Ｔとｔ抗原及び、狂犬病糖蛋白質をコードしている遺伝子を持つプラスミドｐＴ Ｇ１７１のＢ　ａｍＨＩ−Ｂ　ａｍＨ工断片を、ＢａｍＨＩであらかじめ消化し ておいたベクターｐＴＧＭＬ２Ａ　に挿入し、図８に示すような、プラスミドｐ ＴＧ１７３を生成する。ヘ プラスミドｐＴＧ１７３を、平滑切断をする酵素Ｓｔｕ工と、突出した５−付着 末端を残す５ａｌＩとを用いて、消化する。小さい５ｔｕＩ−３ｔｕＩ及び５ｔ ｕＩ−８ａｌＩ断片を取り除く。Ｔとｔ抗原をコードする領域、アンピシリン耐 性遺伝子及び複製開始点を含む大きな５ａｌＩ−３ｔｕＩ断片を単離し、４種の ヌクレオチド　トリポスフエイトＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ及びＴＴＰの存在下、 クレノーポリメラーゼ（アマジャム、Ａｍｅｒｓｈａｍ）を作用させる。該ポリ メラーゼは、ヌクレオチドで、５ａｌＩ部位を埋め、よって、２つの平滑末端を 持つ断片を得る。

上述のプラスミドｐＴＧ３９２５を、突出した５′付着末端を残すＥｃｏＲＩお よび平滑切断をする酵素ＨｐａＩを用いて、消化する。プロモーター、第一ノン コーディングエクソン、α−アンチトリプシン遺伝子のスプライシングドナ一部 位を持つ第一イントロンの部分及び合成スプライシングアクセプタ一部位を含む ＥｃｏＲＩ　−ＨｐａＩ断片を単離し、ＥｃｏＲＩ部位の付着末端を切断する“ ムング　ビーン　（Ｍｕｎｇ　Ｂｅａｎ）　’ヌクレアーゼ（バイオラブズ（Ｂ ｉｏｌａｂｓ）　）を作用させる。その結果、２つの平滑末端を持つ断片を得る 。この断片を、上述で調製したＳ　ｔ　ｕ　Ｉｓ８に示すようなプラスミドｐＴ Ｇ４９１２を得る。

Ｂ　ヒト第Ｘ因子及び少なくとも一種のオンコジーンを発現する多重に遺伝子導 入を受けたマウス（ｍｕＨｉ−ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｍ１ｃｅ　） ＴＭＴＧ３９６０−１ラインマウスとＴＭＴＧ２９８４ラインマウスを交配させ て、二重に遺伝子導入を受けたマウス（ｄｏｕｂｌｙ　ｊｒａｎｓｇｅｎｉｃ　 ｍ１ｃｅ）を作成する。適当なプローブを用いたドツト−プロット分析によって 、二重に遺伝子導入を受けた状態を、確認する。祖先の（ｐｒｏｇｅｎＨｒｉｘ 　）ＴＭＴＧ３９６０−Ｉ　Ｘ　ＴＭＴＧ２９８４ラインマウスは、ヒトα−ア ンチトリプシン及びヒト第Ｘ因子を共に発現する。これらの２種の発現形質は、 メンデルの法則（Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ　ｆａｓｈｉｏｎ　）に従って子（ｏｆｆ ｓｐｒｉｎｇ　）に伝えられる。これら二重に遺伝子導入を受けたマウスのうち ３匹に、１２か月齢の時、肝腫瘍が発生する。

より初期の年齢で腫瘍が発生するマウスを得るために、ＴＭＴＧ３９６０−Ｉ　 Ｘ　ＴＭＴＧ２９８４ラインの雄と、ＴＭＴＧ４９１２ラインの雌を交配させる 。この交配によって生まれる三重に遺伝子導入を受けた子（ｊｒｔｐ１７ｊｒｉ ｎ＠ｇｅｎｉｃ　ｏｆｆｓｐｒｉｎｇ）の−匹は、１ｍｇ／ｍＮのヒトα−アン チトリプシンと４０．３μｇ／ｍΩのヒト第Ｘ因子を発現する。この動物を６週 齢で犠牲にし、そのすでに過形成を示している肝臓（肝臓Ｎｏ、１）を取り除く 。

３ｍｇ／ｍＮのヒトα−アンチトリプシンと６０μｇ／ｍｇのヒト第Ｘ因子を発 現する別の三重に遺伝子導入を受けた子を、３か月齢で同様な運命の処理をする （肝臓Ｎｏ。

２）。

Ｃトランス−インモータライズされた（ｔｒａｎｓ−ｉｍｍｏｒ４ａｌｉｘｅｄ ）細胞株の選択各々の肝臓を以下のように処理する。即ち、腫瘍性の肝組織を、 潅流段階を除き、ホワード　アンド　ペラシュ（Ｂｏｗａｒｄ　＆　Ｐｅ５ｂ、 　］、　Ｂｉｏ、　Ｃｈｃｍ、　（１９６８）　１０５：３１０５）に記載のよ うにコラゲナーゼ処理によって分離する。細胞を、１０μｇ／ｍｇのインシュリ ン、３００ｒｘｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン、１０μｇ　／　ｍΩのトランスフ ェリン、２５μｇ／ｍ、Ｑの表皮細胞成長因子（ＥＧＦ）　、２ｍＭのグルタミ ン、５０Ｕ／ｍｊ２のストレプトマイシン、２５０Ｕ／ｍ＃のペニシリン及び５ ％の透析した牛胎児血清（ＦＣＳ）を加えたウィリアムス培地Ｅ　（Ｗｉｌｌｉ ｘｍｇ’　ｍｅｄｉｕｍ　Ｅ）　（ギブコＧｉｂｃｏ　）中で株化する。これら 種々の成分の添加は、成長と肝細胞形態の維持に必須と考えられる。プライマリ ア培養フラスＤ　（ｐｔｉｍａｒｔａ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｆｌａｓｋｓ、フアシ ヨンＦａｌｃｏｎ）を、この第一の培養として用いる。培養は、１０％のＣＯ２ を含む加湿した雰囲気中で維持する。

この第一培養中、細胞をバルブの形態で（ｂｕｌｋ　ｆｏｒ＋ｎ　）で培養する 。その後、・細胞が、８０％のコンフリューエンス（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）の 状態になると、０．０５％のトリプシンの存在下、分離させ、上述した補足培地 中、連続した継代によって、数回継代培養を行う。最初の継代培養中、細胞を、 培養時（はぼ１０分間）に、プラスティックフラスコに移し、その壁面にはマク ロファージが即座に付着するので取り除くことができる。５回の継代後、ＦＣＳ を１ｍｇ／ｍｌ）の牛血清アルブミン（ＢＳＡ）に置き換える。さらに５回の継 代の後、純粋な肝細胞の培養物を得、肝臓Ｎｏ、１及び肝臓Ｎｏ、２より選択さ れたそれぞれを、ＴＭｈｅｐ３９及びＴＭｈｅｐ４８と名付ける。

これら細胞株から産生される第Ｘ因子の量を、ＥＬＩＳＡテストを用いて、培養 上清で直接測定する。ＴＭｈｅｐ３９では、産生能は、はぼ０．１５μｇ／１０ ６細胞／２４時間であり、ＴＭｈｅｐ４８では、０．２９〜０．５５μｇ／１０ ６細胞／２４時間である。培養が高い細胞密度のときは、産生能は、夫々、０． ３−０．４μｇ　／　ｍΩ／２４時間及びほぼ０．７μｇ　／　ｍΩ／２４時間 になる。

細胞株ＴＭｈｅｐ３９及びＴＭｈｅｐ４８によって産生される第Ｘ因子の“第Ｘ 因子”活性を上述のオウステン＆リュイメスのテストによって測定する。両場合 とも、活性、はほぼ１００％である。

２種の細胞株の培養上清に存在する第Ｘ因子を免疫アフィニティーカラムで精製 する。Ｎ末端の配列決定により、このように産生された第Ｘ因子が、成熟型のも のと良く一致することを確認する。ウェスタンブロッティングでも、同様に電気 泳動の移動度がヒト血漿由来の第Ｘ因子のそれと一致することを確認する。

Ｄ　細胞株ＴＭｈｅｐ３９及びＴＭｈｅｐ４８の特徴付は肝臓から特異的に分泌 される蛋白質であるアルブミンの産生を、培養液中、第一抗体としてウサギ抗マ ウスアルブミン抗血清、第二抗体としてペルオキシダーゼ標識ウサギ抗マウスア ルブミン抗体をもちいたＥＬＩ　ＳＡテストによって、検出する。両細胞株とも 、分泌されたアルブミンの量は、３〜１１μｇ／ｍＲ／２４ｈの間で変動する。

ＴＭｈ　ｅ　ｐ　３９細胞株中、肝細胞に特異的なメツセンジャーＲＮＡの存在 を、チルブラインら（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｊｒ７（１９７９）　１８ニア０１−７１０　）に記載のグ アニジウム塩酸塩法によって調製した総ＲＮＡを用いて、コスタンジアンド　ギ ルエスピー（１９８７）　（Ｂｅｒｇｅｒ　Ｓ、Ｌ、、Ｋ１ｍｍ“スポット−プ ロット″　（ｓｐｏｔ−ｂｌｏｔ　）技術によって検出する。マウストランスフ ェリン（１）、マウスα−アンチトリプシン（２）、マウスアルブミン（３）、 マウスβ−アクチン（４）、ヒトα−アンチトリプシン（５）、ハムスタービメ ンチン（ｖｉｍｅｎｊｉｎ）　（６）　、ヒト第Ｘ因子（７）、マウスｃ−ｍｙ ｃ　（８）　、５Ｖ４０Ｔ抗原（９）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ １０）及びマウスα−フェトプロティン（１１）をコードするｍ　ＲＮ　Ａの試 験を、配列が以下のように表されるプローブを用いて始める。

汎存する蛋白質であるβ−アクチンに対応するプローブを、ポジティブコントロ ール（ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ）として用いる。プローブ６（ネガテ ィブコントロール、ｎｅｇａ目マＣｃｏｎｔｒｏｌ）及びプローブ１１（もっば ら胎児、即ち未分化のレベルで発現する蛋白質に対応する）を用いるとき、ハイ ブリダイゼーションの不存在が正しく観察される。ポジティブの反応が、アルブ ミン、ヒト及びマウスα−アンチトリプシン、グルタチオントランスフェラーゼ 、ヒト第Ｘ因子、マウスｃ−ｍｙｃＳＳＶ４０Ｔ抗原およびトランスフェリンに ついて観察される。

上述の結果より、明らかに、連続した継代培養後に得られる細胞株は、安定で分 化したフェノタイプ（ｐｈｅｎｏｊ７ｐｅ　）を維持していることが分かる。

プラスミドｐＴＧ３９６０によって形質転換されたＥ、ｃｏｌｊ　ＢＪ株は、１ ９８９年７月１９日に、７５７２４　パリ　リュ　デュ　ドクトゥール　ルウ　 ２５（２５，ｒｕｅ、ｄｕ　Ｄｒ、ＲＯＵＸ　７５７２４　ＰＡＲＩＳ　）　Ｃ ，Ｎ、Ｃ，Ｍ、に、番号ｌ−８９３で寄託されている。

この細胞株ＴＭｈｅｐ４８は、１９９０年８月９日に、７５７２４　バリ　リュ 　デュ　ドクトゥール　ルウ　２５　Ｃ，Ｎ、Ｃ，Ｍ、に、番号ｌ９８９で寄託 されている。

腸腹吸腎籐　所蔵 ７・・ ＦＩＧ、６ ＦＩＧ、　７ ｋＤａ （１）　（２）　Ｃ（３）　（４）（５）　（６）　Ｓ　（７）（８）２００− ・　−２００ １１、ｍｍｍ＋　６．＾増電４−− ６９−・　−６９ ４６−中　−４６ ３０−・　−３０ ２１，５−・　−２１・５ １４．３−・　−１４，３ Ｆｉｇｕｒｅ　８ａ Ｆｉｇｕｒｅ　８ｂ 手続補正書（睦） １　事件の表示 ＰＣＴ／ＦＲ９０１００６０６ ２発明の名称 生物学的に活性のある第■因子を発現する事件との関係　特許出願人 トランスジーン　ソシエテ　アノニム ４代理人 大阪市中央区平野町２−１−２沢の鶴ビル６　補正の対象 「図面」の翻訳文 ７　補正の内容 図面の浄書 （内容に変更なし） 国際調査報告 一闇−−−＾帥−”””ｋ　ＰＣＴ／ＦＲ９０／１１ｎｇＭ国際調査報告 ＦＲ９０００６０６ ＳＡ　３９９７７

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. １．肝起源のトランス−インモータライズされた細胞株（ｔｒａｎｓ−ｉｍｍｏ ｒｔａｌｉｚｅｄ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ）であって、ヒト血漿中に存在する第Ｉ Ｘ因子と同様な活性を持つヒト起源の第ＩＸ因子を発現することができ、且つヒ ト起源の第ＩＸ因子をコードする領域を含む外因性のＤＮＡ断片を、そのゲノム 中に組み込んでおり、該コーディング領域が肝特異的なプロモーター領域の支配 下に置かれている細胞株。
2. ２．ヒト第ＩＸ因子をコードする領域を含む外因性のＤＮＡ断片をゲノム中に組 み込んだ、請求項１に記載の細胞株。
3. ３．ヒト第ＩＸ因子をコードする領域を含む外因性のＤＮＡ断片をゲノム中に組 み込んでおり、該コーディング領域が、ゲノム型（ｇｅｎｏｍｉｃ　ｔｙｐｅ） のものである請求項２に記載の細胞株。
4. ４．ヒト第ＩＸ因子をコードする領域を含む外因性のＤＮＡ断片をゲノム中に組 み込んだ細胞株であって、該コーディング領域が、第ＩＸ因子遺伝子プロモータ ー、α−アンチトリプシン遺伝子プロモーター及び該コーディング領域の発現を 誘導するのに十分なこれらプロモーターの部分から選択されるプロモーター領域 の支配下に置かれている、請求項１乃至３のいずれかに記載の細胞株。
5. ５．ヒト第ＩＸ因子をコードする領域を含む外因性のＤＮＡ断片をゲノム中に組 み込んでおり、該コーディング領域が、第ＩＸ因子遺伝子プロモーター又は該コ ーディング領域の発現を誘導するのに十分な該プロモーターの部分の支配下に置 かれている、請求項１乃至４のいずれかに記載の細胞株。
6. ６．ＴＭｈｅｐＴＧ３９及びＴＭｈｅｐＴＧ４８から選択される請求項２に記載 の細胞株。
7. ７．ヒト血漿中に存在する第ＩＸ因子と同様な活性を持つヒト起源の第ＩＸ因子 を血漿中に含み、ヒト起源の第ＩＸ因子をコードする領域を含む外因性のＤＮＡ 断片をゲノム中組み込んだ遺伝子導入動物（ｔｒａｎｇｅｎｉｃ　ａｎｉｍａｌ ）であって、該コーディング領域が、肝特異的なプロモーター領域の支配下にお かれた遺伝子導入動物。
8. ８．ヒト第ＩＸ因子をコードする領域を含む外因性のＤＮＡ断片をゲノム中に組 み込んだ、請求項７に記載の遺伝子導入動物。
9. ９．ヒト第ＩＸ因子をコードする領域を含む外因性のＤＮＡ断片をゲノム中に組 み込んでおり、該コーディング領域が、ゲノム型（ｇｅｎｏｍｉｃ　ｔｙｐｅ） のものである請求項８に記載の遺伝子導入動物。
10. １０．ヒト第ＩＸ因子をコードする領域を含む外因性のＤＮＡ断片をゲノム中に 組み込んでおり、該コーディング領域が、第ＩＸ因子遺伝子プロモーター、α− アンチトリプシン遺伝子プロモーター及び該コーディング領域の発現を誘導する のに十分なこれらプロモーターの部分から選択されるプロモーター領域の支配下 に置かれている、請求項７乃至９のいずれかに記載の遺伝子導入動物。
11. １１．ヒト第ＩＸ因子をコードする領域を含む外因性のＤＮＡ断片をゲノム中に 組み込んでおり、該コーディング領域が、第ＩＸ因子遺伝子プロモーター又は該 コーディング領域の発現を誘導するのに十分な該プロモーターの部分の支配下に 置かれている、請求項７乃至１０のいずれかに記載の遺伝子導入動物。
12. １２．肝腫瘍を発生することが可能であり、適当なプロモーター領域の支配下に 置かれたオンコジーンをコードする領域を含む外因性のＤＮＡ断片をそのゲノム 中に組み込んだ請求項７乃至１１のいずれかに記載の遺伝子導入動物。
13. １３．請求項１乃至５のいずれかに記載の細胞株を調製する方法であって、 一請求項１２に記載の遺伝子導入動物の腫瘍性肝、又は請求項１２に記載の遺伝 子導入動物由来の腫瘍性肝細胞が増殖した腫瘍性肝を取り除き、 一上記細胞株が該肝の細胞を培養することによって選択される、 上記細胞株を調製する方法。
14. １４．ヒト血漿中に存在する第ＩＸ因子と同様な活性を持つヒト起源の第ＩＸ因 子を調製する方法であって、請求項１乃至６のいずれかに記載の細胞株を培養し 、続いて培養培地中の該第ＩＸ因子を得ることを特徴とする方法。
15. １５．請求項１４に記載の方法によって得られる第ＩＸ因子。