JPH04501460A - 触媒活性セリンプロテアーゼに関する免疫検定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 背景 血栓症と血栓崩壊は一連の高度に調節される酵素反応によりデリケートなバタン スに保たれる。酵素の大部分を構成するものは、比較的高濃度で血液中を循環す る不活性酵素であるチモーゲンによって必要とされるのに応じて作り出されるセ リンプロテアーゼである。活性の有る凝血促進性酵素と抗凝血性酵素は、血栓症 に関係する異常に犯されている人或はその様な異常の危険性を持つ人を診断する 上で役立ち得る事がますます明らかになっている。

例えば、疫学研究によれば、高レベルのフィブリノゲンとファクターＶＩＩは冠 動脈の病気と発作の高い危険性と関係がある。幾らかの研究者は、活性化された ファクターＶＩＩと活性化されていないファクターＶＩＩとを区別し、活性化さ れたファクターＶＩＩのレベルが上記の危険性の指標である事に気付いている。

更にアテローム硬化にかかる人の中には血栓症体質の人がおり、血栓症体質は凝 血／フィブリン溶解性組織の活性の慢性的な増大にその兆候が有る場合がある。

発作や心筋梗塞の様なアテローム硬化症が血栓症状となって現れる事が、西洋産 業社会における人々の死亡の大きな原因である。

患者が血栓症にかかっているか或はその危険性があるかどうかを判定するには、 凝血／フィブリン溶解性組織の活性凝血促進性ファクターと抗凝血性のファクタ ーの血漿レベルを精確に測定する必要がある。この測定の必要性は今後ますます 増大するであろう。心臓病、発作その他多くの血栓症に関係する異常は大分部高 齢者に発生する。現代が急速に高齢化社会になりつつある状況にあって、凝血／ フィブリン溶解性組織の活性状態のモニターは臨床的宵月性をますます高めるで あろう。

光凪塁！約 本発明は生物学的流体中の触媒活性セリンプロテアーゼを検出、定量する検定法 に関する。本発明の方法は、凝血／フィブリン溶解性組織の活性酵素の測定並び に血栓症関連の障害が認められる上記組織或はその成分の評価、に有用である。

本発明の方法は、触媒活性セリンプロテアーゼに広範な特異性を持つハロメチル ケトンと特定の型のセリンプロテアーゼに特異である免疫学的試薬を組合せて使 用する。本発明のハロメチルケトンプローブは活性部位に特異である。つまり、 本発明のハロメチルケトンプローブは触媒活性セリンプロテアーゼにだけ取込ま れる。特定の型のセリンプロテアーゼに特異的に作用するのとしては抗体を使用 する。ハロメチルケトンプローブの活性部位特異性と抗体の型特異性を組み合わ せることにより特定のセリンプロテアーゼの触媒活性部を定量する。

本発明の検定方法では、ハロメチルケトンプローブを生物学的流体サンプルでイ ンキュベートして上記プローブを、概して、サンプル中の触媒活性セリンプロテ アーゼに取込む。ハロメチルケトンプローブは、検定のフォーマットに応じて、 検出可能の標識か、標識することの可能な基か、或は、固相に捉えられる２次的 認識部位を与える基か、に結合される。従ってハロメチルケトンが取込まれると 活性セリンプロテアーゼは検出或は分離の為に標識される。単一特異的な抗体は 生物学的流体でインキュベートされ測定されるべき型のセリンプロテアーゼを選 択的に定着させる。本発明において、ハロメチルケトンが検出の為の標識を与え る検出法では、測定すべきセリンプロテアーゼを型特異的に分離するために、抗 体を固相に結合することが出来る。他方、ハロメチルケトンが分離の為の２次的 な認識部位を与える検定法では抗体を使用してセリンプロテアーゼを、検出の為 に、型特異的に標識することができる。

本発明は、更に、触媒活性セリンプロテアーゼを生物学的流体から分離する方法 に関する。この分離方法では、ビオチニル化ハロメチルケトンをセリンプロテア ーゼの活性部位に取込み、セリンプロテアーゼをアビジン被覆固相に吸着する。

図面Ω皿里な脱阻 第１図は本発明の免疫検定法の２つの形態を示す。

第２図は７ｙクターＸａ−ＢＣＰＰＡＣＫとｔＢＣＰＰＡＣＫ（７）固相抗体検 定のための標準曲線を示す。

第３図はｔＰＡの比色による活性部位特異性免疫検定の為の標準曲線を示す。

発期座詳紅五説咀 本発明の検定法により血栓症と血栓崩壊に伴う触媒活性セリンプロテアーゼを検 出、定量できる。この触媒活性セリンプロテアーゼには、組織プラズミノーゲン アクチベーター、ウロキナーゼ、ファクターＶＩＩａｓファクターＩＩａｘファ クターＩ　Ｘ　ａ　ｓファクターＸａｓプラスミン、活性蛋白質Ｃがある。本発 明の検定法によれば、触媒活性酵素のレベルを精確に測定できる。本発明の検定 法は種々のやり方で不均質或は均質の検定法として実施できる。のちほど説明す る実施例は固相検定法である。下に説明する検出方法に加え、ハロメチルケトン プローブ・抗体通信方法（例えば、エネルギー転移螢光発光）を使用できる。

本発明の検定法の一つのやり方では標識されたハロメチルケトンを使用して生物 学的流体サンプル中の触媒活性セリンプロテアーゼ直接的に標識し、特定の型の セリンプロテアーゼに特異性を持つ抗体を使用してセリンプロテアーゼを選択的 に分離させる。検出可能の標識（例えば、あとで詳しく説明する酵素、発螢光団 、ラジオアイソトープ）に結合されたハロメチルケトンを、活性部位に特異の、 標識されたハロメチルケトンを生物学的流体中のセリンプロテアーゼに電子対共 有的に取込み事を許す条件下で、上記生物学的流体でインキュベートする。この 最初のインキュベートの後で、上記の生物学的流体を、測定すべき特定の型のセ リンプロテアーゼ（組織ブラズミノーゲンアクチベーター、ファクターＶＩＩａ 等）に特異な抗体を含む固相免疫吸着剤でインキュベートする。このインキュベ ートは、特定のセリンプロテアーゼが上記の免疫吸着剤に（同免疫吸着剤上の抗 体とのキレート化により）選択的に吸着されるのを許す条件下で、行う。このイ ンキュページ日ソを行ったら、上記の免疫吸着剤と生物学的流体を分離し、免疫 吸着剤に結び付けられている標識量を測定する。この標識量は生物学的流体中の セリンプロテアーゼの量に正比例する。

上記の検定法のバリエージ日ソとして、ハロメチルケトンがセリンプロテアーゼ 中に取込れた後で、検出可能の標識の付着の為の２次的な認識部位として役立つ 、ビオチンの様な成分にハロメチルケトンを結合することができる。このバリエ ージ日ソでは、セリンプロテアーゼが抗体で被覆された免疫吸着剤に選択的に吸 着された後、アビジン・ビオチン・標識複合体（例えば、酵素）をビオチニル化 ハロメチルケトンに付着させることができる。モして固相に結び付いた標識の量 を測定する。

本発明の検定法の別のやり方では、ハロメチルケトンによって２次的な認識部位 をセリンプロテアーゼ中に取込み、そして、セリンプロテアーゼによって、その 触媒活性部を固相へ多量に取込みことができる。このやり方では、セリンプロテ アーゼのアビジン被覆固相への付着の為の２次的な認識部位を与えるためにビオ チンを使用することも出来る。従って、ビオチニル化ハロメチルケトンは、セリ ンプロテアーゼの触媒活性部への取込みに充分な条件下で、生物学的流体により インキュベートされる。そしてその後で、生物学的流体を、アビジンで被覆され た固相によりインキュベートする。このインキュベートは、ビオチニル化ハロメ チルケトンを取込んだセリンプロテアーゼ（例えば、この時点では取込まれたハ ロメチルケトンにより既に不活性にされている触媒活性セリンプロテアーゼ）が アビジン被覆吸着剤に吸着されるのを許す条件下、で行う。そして、このインキ ュベートを行った後で箋上記の吸着剤と生物学的流体を分離し、そして吸着剤を 、検定されるべき特定の型のセリンプロテアーゼに対して特異の、標識された抗 体でインキュベートする。既述のやり方の場合と同様、吸着剤と結び付いている 標識の量を、生物学的流体中の触媒活性セリンプロテアーゼの量を表すものとし て、測定する。

上記の２種類の検定のやり方が第１図に示しである。この第１図に示した検定法 は酵素をベースとする比色検定法であるが、既述のように、放射定量検定法とす ることもできるし、或は、発螢検定法とすることもできる。第１図の左側のやり 方では生物学的流体サンプル中の凝血ファクター（セリンプロテアーゼ）がビオ チニル化クロロメチルケトン−ビオチニル−ε−アミノカプロイル−Ｄ−フェニ ルアラニル−Ｌ−プロリル−し−アルギニンクロロメチルケトン（ＢＣＰＰＡＣ Ｋ）と反応する。この凝血ファクター（ＢＣＰＰＡＣＫ複合体）は、抗凝血ファ クター（例えば抗体）により被覆された固相に固定される。固定されたこの凝血 ファクターは、凝血ファクター（ＢＣＰＰＡＣＫ複合体）にアビジンを介して結 合されたビオチニル化ペルオキシダーゼにより検出（定量）される。第１図の右 側のやり方では、凝血ファクター（ＢＣＰＰＡＣＫ複合体）は、抗凝血性ファク ターで被覆されたているのでなくアビジンで被覆された固相に固定される。こう して固定された凝血ファクターはペルオキシダーゼ共役抗体により検出（定量） される。

本発明の検定法は殆どどんな生物学的流体でも実施できる。典型的な場合にあっ ては、本発明の検定法は血液或は血漿や血清の様な血液成分に実施されるが、リ ンパ液、消化液、尿の様な他の流体も使用できる。本発明で使用する生物学的流 体としては、更に、動物や微生物の細胞が培養された液状媒体でもよい。生物学 的流体はハロメチルケトンを含んだ試験管に直接集める或はその中に直接追加す る。

本発明にとって望ましいハロメチルケトンはクロロメチルケトンであり、就中、 セリンプロテアーゼの活性部位の８１準部位に対して特異に作用するペプチドル クロロメチルケトンである。この本発明にとって望ましいクロロメチルケトンは 次式でおおむね表すことができる。

上の式においてＡｌ　、Ａ２　、Ａ３はアミノ酸かアミノ酸類似体である。Ａ１ は、セリンプロテアーゼの触媒部位の準部位Ｓ１に望ましい特異性を与えるアミ ノ酸かアミノ酸類似体である。Ａ１としては、適当な準部位特異性を付与するア ミノ酸であればどんなアミノ酸でもよい。トリプシン様の酵素の為には、Ａ１と してアルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、ホモアルギニン（ｈＲ）を使用出来る。

血液凝固酵素と血栓崩壊酵素の為には、Ａｌとしては、出来ればアルギニンを使 用するのがよい。

ＡＱ　、Ａ３としてはどんなアミノ酸、アミノ酸類似体でもよい。しかし、Ａ３ としては、出来ればチロシン（Ｙ）やフェニルアラニン（Ｆ）の様な芳香族アミ ノ酸を使用するのがよい。

Ｄは選択的に認識可能であり、従って、トリペプチジルクロロメチルケトンを取 入れたセリンプロテアーゼの検出或は分離を可能ならしめる化学基を表す。例え ば、Ｄとしては、トリペプチジルクロロメチルケトンに直接結合された（但しこ れは後で説明するようにスペーサーＳを介して結合でもよい）発螢光団、ラジオ アイソトープ或は酵素の様な標識であればよい。或は、Ｄとしては、クロロメチ ルケトンがセリンプロテアーゼの活性部位中に取込まれた後で検出可能の標識に 結合させ得る基でもよい。例えば、ビオチンがそれである。ビオチニル化クロロ メチルケトンは、例えば、アビジン−ビオチン−酵素複合体によって検出される ように、標識できる。或はまた、Ｄは、既述の２番目のやり方の場合のように固 相（例えば、アビジン被覆固相）に捉えられる２次的な認識部位を与える基であ ってもよい。

ＳはＤをトリペプチジルクロロメチルケトンに結合する為に必要とされ得るスペ ーサー基である。スペーサーは、セリンプロテアーゼに取込まれた時にアビジン を結合する為にビオチンを使用出来るようにする為に必要である。ビオチンをク ロロメチルケトンに結合する為の望ましいスペーサー基は次式で表される：上の 式においてｎは３〜８である。望ましいりンカーはε−アミノカプロン酸である （上の式においてｎ＝５）。本発明にとって特に望ましいビオチニル化クロロメ チルケトンは次の通りである： ビオチン−ＮＨ（ＣＨ２）５　ＣＦ−Ｐ−ＲＣＣＨ２Ｃｌ本発明の検定法では抗 体がセリンプロテアーゼに対する型特異性を付与する。

本発明の検定では抗体を使用して特定の型のセリンプロテアーゼを選択的に識別 してそれを標識したり、或は、セリンプロテアーゼを選択的に分離できる。セリ ンプロテアーゼに対して特異の抗体はポリクロナールでもモノクロナールでもよ く、この抗体は市販されているし、或は、標準的製法で作ることも出来る。

本発明の検定法において、セリンプロテアーゼを型特異的に標識する為に標識さ れた抗体が必要なやり方の場合は、酵素、発螢光団或はラジオアイソトープが標 識であってよい。酵素として望ましいのは、ペルオキシダーゼである（例えば、 セイヨウワサビペルオキシダーゼ）。ペルオキシダーゼの活性は、０−フェニレ ンジアミン−２ＨＣ１の様な発色基質を使用して比色的に測定できる。抗体を標 識する適当な発螢光団としては、ダンシル、フルオレセイニアルローダミニル基 或はユーロピウムがある。適当なラジオアイソトープはγ放出体１３１　Ｉと１ ２５Ｉである。これらの種類の標識は従来の方法で抗体に付着させることが出来 る。例えば、酵素は、標準的方法によるアビジン・ビオチン結合により抗体に結 合できる。発螢光団は抗体に化学的に結合できる。ラジオアイソトープは直接、 又は、アルキル化或はキレート化剤を介して結合できる。

セリンプロテアーゼの選択的分離のために抗体を固相に固定できる。これにより 、特定の型のセリンプロテアーゼに対して特異性を持つ免疫吸着剤をもたらすこ とができる。種々の固相を使用できる。良く知られている固相としては、ガラス 、ラテックス、ポリスチレン、ポリプロピレン、デキストランその他の材料で作 られたビード、或は、この様な材料で形成又は被覆されたチューブ、或はこの様 な材料で被覆されたミクロタイタープレートウェル等がある。また「固相」とし ては液状媒体中に懸濁された粒子でもよい。例えば脂質粒子（リポソーム）がそ れである。

当該技術分野の熟練者であれば、他の多くの適当な固相を知るであろうしまた抗 体を固相に固定させる他の多くの方法も知るであろう。また、単なる日常的な実 験により確かめることが出来るであろう。

抗体は、共有結合の様な方法により、アミド又はエステル結合或は吸着を介して 電子対共有的に或は非共有的に固相に結合できる。

本発明の一つのやり方ではアビジン被覆の免疫吸着剤を使用して、ビオチニル化 クロロメチルケトンを取込んだセリンプロテアーゼを捉える。アビジン被覆免疫 吸着剤は抗体免疫吸着剤と同じ方法で作ることが出来る。

本発明の各実施例において生物学的流体中の特定のセリンプロテアーゼの量は免 疫吸着剤に結び付いた標識の量を測定することにより測定する。固相に結び付い た標識の量は生物学的流体中のセリンプロテアーゼの量に正比例する。（検定の やり方によっては、固相に結び付いた標識でなく、可溶のままの標識の量を測定 出来る。この場合には可溶標識の量は生物学的流体中のセリンプロテアーゼの量 に反比例する。） 固相に結び付いた標識は標準的方法で測定する。もし標識が放射性γ放出体であ れば、この標識を例えばγ線計数器で直接測定する。或はもし標識が螢光化合物 であれば、その標識は螢光針で測定する。或は、標識が酵素であれば、その標識 の量はその酵素の為の発色基質を使用した比色法により測定する。

こうして測定した標識の量を、標識量とセリンプロテアーゼ量との予め設定され た量的関係と比較する。この量的関係は、スタンダード、つまり、予め量が分か っている特定のセリンプロテアーゼを含む液体サンプル、を使用して検定するに より把握できる。量の異なるセリンプロテアーゼを含む幾つかのサンプルの場合 であれば、検定を行い、そして、免疫吸着剤に付着された標識の量を測定する。

そして標識の量と特定のセリンプロテアーゼの量との関係を表す曲線を描く。こ の曲線をを参照することにより、（予め含有量の分かっていないサンプル中の） 特定のセリンプロテアーゼの量を、検出された標識に量によって測定できる。

本発明の検定を行う為の試薬は検定キットで作成出来る。キットは種々の検定の やり方に合わせることができる。最初に述べた検定法の為のキットは、触媒活性 セリンプロテアーゼに対して特異性を存する、標識されたハロ（クロロ）メチル ケトンと、測定すべき特定の型のセリンプロテアーゼに対して特異性を有する抗 体を含む免疫吸着剤とを、（別々の容器に）含んでいる。このやり方のバリエー ジせン、つまり、ビオチニル化クロロメチルケトンを使用するやり方の為はキッ トはビオチニル化ハロメチルケトンと、アビジン結合標識と、測定すべき特定の 型のセリンプロテアーゼに対して特異性を持つ抗体を含む免疫吸着剤とを含む。

２番目に述べたやり方の為のキットはビオチニル化ハロメチルケトンと、アビジ ン結合吸着剤と、測定すべき特定の型のセリンプロテアーゼに対して特異性を有 する、標識された抗体とを含む。キットの他の成分としては、セリンプロテアー ゼ標準液、ポジイティブコントロール（例えば、予め量の分かっているセリンプ ロテアーゼを含む生物学的流体）があり、酵素標識を使用の場合は、酵素（例え ば、セイヨウワサビペルオキシダーゼや基質０−フェニレンジアミン−２ＨＣ１ の様なペルオキシダーゼ）用の発色基質がある）。

本発明の検定法には多くの臨床的価値がある。例えば、（１）血栓症の危険性、 （２）血栓崩壊の治療、（３）止血組織の連続性、の評価である。血栓症の危険 性の評価では、本発明の検定法により患者の血液中の凝血組織の活性酵素の性質 と量を評価出来る。また血栓崩壊の治療ではかなりの量の血栓崩壊剤を静脈注射 する。例えば、組織ブラズミノーゲンアクチベーターによりプラズミノーゲンの 活性化と血塊の溶解を行う。溶解の範囲と速度は（とりわけ）循環する活性組織 ブラズミノーゲンアクチベーターのレベルと（潜在的に）プラスミンや凝血酵素 の様な他のエージェントのレベルにより直接左右される。蓄血組織にハロメチル ケトンを取込むことにより血液中で進行する反応をすばやく停止させ、酵素が組 織プラズミノーゲンアクチベーターを標識する範囲を評価できる。

止血危険性の評価では、トロンビン、最終的にはフィブリン塩を生成する為に凝 血経路中のチモーゲン・酵素変換における不連続性或は異常を識別又は解釈する 事を目的とする一連の検定を行う。クロッティングは例えば、接触経路又は凝血 の外在経路を通じて、血漿サンプルにおいて開始させる。そして、少し間隔をお いて）ハロメチルケトンを血漿反応組織に添加する。こうすると活性化プロセス 中にチモーゲンから作られた全ての酵素が標識される。続いて活性化された酵素 の性質のためにスクリーニングを行うと凝血組織中の不連続性或は異常の源をつ きとめることが出来る。

本発明のビオチニル化クロロメチルケトンはまた、生物学的流体から触媒活性セ リンプロテアーゼを分離する為にも使用できる。この為には、ビオチニル化クロ ロメチルケトンを生物学的流体でインキユベートする。このインキユベートは、 ビオチニル化クロロメチルケトンが部位に取込まれるに充分な条件下で行う。次 に、生物学的流体を、アビジンを含む固相吸着剤と接触させる。この接触は、ビ オチニル化クロロメチルケトンを取込んだセリンプロテアーゼが吸着剤に吸着さ れるのを許す条件下で、行わせる。そして、生物学的流体と吸着剤を分離する。

次に本発明の詳細な説明する。

実施例 実施組上　ビオチニル化クロロメチルケトンの調製星オ　ニル−−フ　ニルアラ ニル−−プロリレー　−アル′ニン　ロロメ　ル、ケー　ン　ビ　ニル−） ＰＰＡＣＫ、２ＨＣ１［Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ／Ｃａｌｂ１ｏｃｈｅｍ）］　（１ ６，２ミリグラム、３０．０ミクロンモル）とＫＨＣＯｓ　（８，０ミリグラム 、６０ミクロンモル）を水中で溶解させ、溶解後直ちに、ＤＭＦ　（０，５０ミ リリツトル）中でビオチンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｓｌｇｍａ ）　（１０，２ミリグラム、３０ミクロンモル）と反応させた。この状態を２２ ℃で１０分間維持した後、反応を１．０ＭＨＣＬ　（０，３０ミリリツトル）で 酸性化した。そして原生酸物を、溶離剤としてメタノールを使用して、セファデ ックスＬＨ−２０（２０ｘｌ　ｃｍ）において色層分析した。

溶離後にＡ２５４と板目染色剤を添加した。ベースラインより上の部分を個々に 乾燥させ、１．０ミリモルＨＣＩ（各１ミリリツトル）中で溶解させた。この溶 液を、ウシＸａによる８２２２２の加水分解防止能力と、フルオレセイン−アビ ジン（Ｓｌｇｍａ　）の螢光発光の高まりに就いて、テストした。これらのサン プルを凍結乾燥させた。薄層色層分析（クロロホルムとメタノール［３：　１］ で溶離させたベーカーフレックスシリカ）を行った結果、サンプルは同質であっ て同一である事が分かったＣＲｆ＝　０．３４）。総合歩留りは１８．６ミリグ ラム（８７％）であった。得られた固体を１０ミリモルＨＣＩ（２ミリリツトル ）中で溶解させ、−２０℃で凍結保存した。最終濃度は１３ミリモルであった。

ビオ　ニル−ε−アダツカプロ　ルー　−）ＰＰＡＣＫ、２ＨＣ１（１０，５ミ リグラム、２０ミリモル）とＫＨＣＯ３（３，０ミリグラム、３０ミクロンモル ）を水（０，４０ミリリツトル）中で溶解させた。溶解させた後直ちに、この溶 液を、ＤＭＦ　（０，４０ミリリツトル）中で、Ｎ−ヒドロキシスクシニルビオ チニル−ε−アミノカプロン酸塩（Ｓｌｇｍａ）　（９゜１ミリグラム、２０ミ クロンモル）に添加した。そしてビオチニル−ＰＰＡＣＫ　（上記）の場合と同 様に清浄化し、特徴化した。その結果、Ｒ，＝　０．４Ｌ歩留り　＝　９．２ミ リグラム（５６％）であった。最終濃度（１０ミリモルＨＣＩ中）は５．６ミリ モルであった。

−−−ベンジル　−−ロシニル−１シル−−アル０二ン一夕！」シリシ肚ｈＬＺ Ｎ−ｔＢＯｃ−（０−ベンジル）−Ｌ−チロシン（Ｓｌｇｍａ　）　（７，４３ グラム、２０ミリモル）を、０℃に冷却しジシクロヘキシカルボジイミド（ム１ ｄｒ１ｃｈ）　（４，５４グラム、２２ミリモル）で処理したジメチオキシエタ ール（ＤＭＦ）（２０ミリリツトル）中で溶解させた。０℃の温度で１時間そし て２２℃で２時間保持した後、固化した反応生成物に酢酸エチル（２５０ミリリ ツトル）を添加した。そして残留物を酢酸エチル（１００ミリリツトル）中で再 懸濁し、更に２回濾過した。

こうして化合させた濾過物を真空中で蒸発させて厚い油を形成し、この油をホッ トイソプロパツールから再結晶させた。その結果、ＢＯＣ−０−Ｂｚ−Ｔｙｒ− ＯＮＳｕの歩留りは７．６８グラム（８２％）であった。

ＢＯＣ−０−Ｂｚ−ＴＹｒ−ＯＮＳｕ　（４，６９グラム、１０ミリモル）をＤ ＭＦ（１０ミリリツトル）中で懸濁し、グリシン（０，７５グラム、１０ミリモ ル）とＫＨＣＯ３（１，００グラム、１０ミリモル９の溶液で処理した。これに よる反応物は最初は激しく泡立った。室温で１時間攪拌すると、混合物は澄み、 もう沸騰はしなかった。この反応物を、冷たいＬＭ　、Ｈ２ＳＳＯ４でＰＨ＝３ に慎重に酸性化し、そして、水（１００ミリリツトル）で希釈した。生成物を酢 酸エチル（２Ｘ　５０ミリリツトル）で抽出し、化合抽出物を水（３Ｘ　５０ミ リリツトル）で洗浄し、ＮａＣ１（５０ミリリツトル）を飽和させ、無水硫酸ナ トリウム上で乾燥し、蒸発させて固形物にした。この固形物をクロロホルム−ヘ キサンから再結晶させた。その結果、ＢＯＣ−（０−Ｂｚ）−ＴＹｒ−ＧＩＹの 歩留りは３．２０グラム（７５％）であった。

ＢＯＣ−（０−Ｂｚ）−ＴＹｒ−Ｇｌ　ｙ（２，１５グラム、５．０ミリモル） を−２０℃のＴＨＦ　（５ミリリツトル）中で溶解させ、４−メチルモリホリン （Ａｌｄｒｌｃｈ）　（０，５６４ミリリツトル、５．０ミリモル）とクロロギ 酸イソブチル（ム１ｄｒｌｃｈ）　（０，６８０ミリリツトル、５．０ミリモル ）で処理した。−２０℃で３０分維持した後、反応生成物を５．０ミリリツトル のＤＭＦ中でε−二トローＬ−アルギニンクロロメチルケトンＨＣＬ　（１，４ ４ミリグラム、５．０ミリモル）の冷たい（−２０℃）溶液で処理し、そしてそ の後で直ちに４−メチルモリホリン（０，５８４ミリリツトル、５．０ミリモル ９を添加した。反応を一２０℃で２時間行わせ、そして、更に２時間にわたって ２２℃までゆっくり暖めた。その後で酢酸エチル（５０ミリリツトル）を添加し 、ＩＭＨ，８０４（２５ミリリツトル）と水（３Ｘ）と塩水で溶液を抽出し、無 水硫酸ナトリウム上で乾燥し、そして、蒸発さセテ油にした。クロロホルム−エ ーテルから再結晶させた結果、均質の生成物が得られた。ＢＯＣ−（０−Ｂｚ） 　−Ｔ’Ｙｒ−Ｇｌｙ−（１ニーＮＯ２）−Ａｒｇ−Ｃｋの歩留りは０．９３グ ラム（２８％）であった。

ビオ　ニルーε−ア々ツカプロ　ルー　−ロシル　１シ止二り二１土土三Ｚ二文 ロロメ　ル　ン　−−） ＢＯＣ−（０−Ｂｚ）　−Ｔｙｒ　−Ｇ　Ｉ　Ｙ　−（ｇ　−ＮＯ２）　−Ａｒ 　ｇ−ＧＫ　（１３２ミリグラム、０．２０ミリモル）を飽和ＨＣＩ／メタノー ル（１０ミリリツトル）中で溶解させ、１０分攪拌した。溶剤を真空中で除去し 、ＨＣ１／メタノールの２番目のアリコート（１０ミリリツトル）と交換した。

２０分後、溶剤を除去し、エーテル（５０ミリリツトル）を添加した。そして沈 殿生成物中の溶剤を別の容器に移し、固形物を夜通し高真空でＫＯＨペレット上 にてボンピングした。

残留物をＤＭＦ　（１，０ミリリツトル）中で溶解させ、そして、Ｎ−ヒドロキ シスクシニルビオチニル−ε−アミノ−カプロン酸塩（９１ミリグラム、０．２ ０ミリモル）の溶液に添加した。そして更に、水中にて、これにＫＨＣＯ２（４ ０ミリグラム、０．４０ミリモル）を添加した。反応を２２℃で３０分行わせた 後、メタノールＨＣＩ（５ミリリツトル）とエーテル（５０ミリリツトル）で処 理した。

その結果、２つの相が形成された。エーテル相（上の相）を除去し、下の相をセ ファデックスＬＨ−２０カラム（Ｉ　Ｘ　２０　ｃｍ）に直接充填し、そして、 メタノールで溶離させた。ピークが一度Ａ２Ｂ。まで観察された。これは薄層色 層分析の（クロロホルム３に対しメタノール１の割合、Ｒｆ　＝　０．２１）の 結果、同質であった。生成物をエーテルで沈殿させ、濾過して回収した。歩留り は、ブロックされたビオチニル化ペプチド［ＢＣ−（０−Ｂｚ）−Ｔｙｒ−ＧＩ Ｙ−Ｃｅ　−Ｎ。

２　）−Ａｒｇ　ＣＫ］　８９ミリグラム（３５％）であった。

上記生成物（６５ミリグラム、６６ミクロンモル）をバイオサーチＨＦ開裂反応 器にて液状フッ化水素と反応させた。３０分後、真空中でＨＦを蒸発させ、来い 残留物を夜通しＫＯ）（上にて水ポンプ真空中で保持した。その後残留物を１． ０ミリモルＨＣＩで処理し、濾過した。濾過液を凍結乾燥した結果純白でない固 形物になり、この固形物をメタノール（０，５ミリリツトル）中に入れ、メタノ ール中にてセファデックスＬＨ−２０（Ｉ　Ｘ　２０ｃｍ）上で色層分析した。

溶離の結果、一度大きなピーク（Ａ２８゜）が現れた。このピークは扱口試薬で 陽性であり、ウシファクターＸａが８２２２２と反応するのを妨げた。プールさ れたピークを蒸発させて固形物とした。この固形物を１ミリモルＨＣＩ中に入れ 、凍結乾燥した。歩留りは５０゜２ミリグラム（８７％）であった。固形物を１ ０ミリモルのＨＣＩに溶解させ、凍結させた。最終濃度は１３ミリモルであった 。

ビ　ニル　の 清浄化した酵素をＨｅｐｅｓ（２０ミリモル）／ＮａＣ１（１５０ミリモル）ｐ Ｈ＝７．４中にて希釈した（ファクターＶＩＩ調合剤は０．　１ミリグラム／ミ リモルであった。ヒトファクターＶＩＩを、１時間かけてヒトＸａの０．２％ア リコー）　（Ｗ／Ｗ）でインキュベートしてＶＩＩａに変換した。）。ビオチニ ル化ペプチドクロロメチルケトンを０．５モル当量アリコートだけ添加し、５分 〜１０分３７℃で反応させた。直接的な発色基質を使用できる酵素の場合には、 反応混合物をを検定して反応の程度を確かめた。検定により生成された残留クロ ロメチルケトンの妨害のためにファクターＶＩＩａの結合検定を使用することが 出来た。検定された蛋白質は、すべて、各調合剤の１．５〜２．０当量により完 全に阻害された。クロロメチルケトン当量をひとつ追加して完了を確実ならしめ 、完了後も更に１時間反応を続行させた。典型的な反応性曲線を表１に示す：表 １ ヒトＸａのＢＣ−ＰＰＡＣＫとの反応 添加当量　比活性 ０　１、００ ０、４６　０．６２ ０、９２　０．　１３ １、３８　０．０１ １、８４　０．００ ２、７Ｅ３　０．００ フアクターＶＩＩａの為には５当量の阻害剤を使用した。残留阻害剤を除去する 為に蛋白質をＨｅｐｅｓ／塩類液中にてセファデックスＧ−２５（Ｉ　Ｘ　２０ ｃｍ）で色層分析し、その後Ａ２５ｏを添加した。

蛋貞質／ヱ　−　・のス　Ｅ三Ｚｌ 清浄化した酵素、チモーゲン或は酵素舎チモーゲン混合物のサンプルを、次のよ うに、ＢＣ−ＰＰＡＣＫで処理した：ＨｅＩ）ｅｓ　（２０ｍＭ）／ＮａＣ１（ １５０ｍＭ）ｐＨ＝　７．４中の蛋白質（０，５ｍｇ／ｍＬ）サンプル１０〜３ ０μｇを１０倍のモル過剰ＢＣ−ＰＰＡＣＫと３０分反応させ、その次の更に別 の１０倍アリコートと反応させ、夜通し室温でインキュベートした。そしてサン プルを２−メルカプト−エタノールで減少させ、１２Ｘ１２又はｐＨａＢｔＧｅ 　１システムでのＰＡＧＥゲル電気泳動の為に準備した。電気泳動後、トリス／ グリシンメタノール転移バッファーを使用してニトロセルロースにプロットした 。そしてニトロセルロースをトウイーンでブロック（阻害）シ、トリス／グリシ ン洗浄し、アビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼと反応させた。モして４−ク ロロナフタレンで展開させたところ、ビオチニル化蛋白質が可視化された。

蛋白質としては、トロンビン（ｈＩＩａ）、ファクターＸａ　（ｈＸａ）（１鎖 と２鎖）、及びプラスミン（ｈＰｍ）があった。ｈＩＬ　ｈＶＩ　１１ｈＸ１ｈ Ｐｇの場合、何の反応も観察されなかった。ＢＣ−ＹＧＫ−ＧＫでは、プラズミ ノーゲン／プラスミン組織をテストしなかった点を除いて、同一の結果を生じた 。カプロイルスペーサーのないビオチニル−ＰＰＡＣＫを使用した時はどの蛋白 質も陽性のプロットを示さなかった。

ヒ　の　−　：二Ｃｌヒ３り刀えｇ区 ３７℃の正常のヒト血漿（２００ｕＬ）をトロンボプラスチン（１０μＬ）とＣ ａ”（４ｍＭ）で活性化した。間隔をおきながら２０μＬのアリコートを除去し 、これを１３ｍＭのＢＣ−ＹＧＫ−ＧＫ　（最終ＣＫｍ度は１．２μＭであった ）の２μＬアリコートに添加した。１２２秒後にクロットが観察された。サンプ ルをに対しＰｈａｓｔＧｅｌ電気泳動を行った。プロットの展開（上記と同様） は濃度が時間の経過につれて変化する幾つかのビオチニル化蛋白質を表した。

実施但１　ファクターＸａ−ＢＣ−ＰＰＡＣＫのための固相抗体検定アンチファ クターＸａ抗体をミクロタイタープレートウェル（０，１Ｍ炭酸塩のコーティン グバッファーの中の濃度が１０μｇ／ｍＬ）に中に吸収した。種々の量のファク ターＸａ−ＢＣＰＰＡＣＫを添加した後、更に、アビジン−ビオチニル化ペルオ キシダーゼ試薬を添加し、そして最後に基質（然るべく洗浄したもの）を添加し た。

連続希釈によって測定した、約４ｍｇ／ｍｌのファクターＸａ−ＢＣＰＰＡＣＫ に対する感度により標準曲線（第２図）を作成した。この手順をｔＰＡ−ＢＣＰ ＰＡＣＫについて繰り返した（第２図）。

実Ｍ皿　螢光クロロメチルケトン誘導体の調製ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ ）をレムリよって記述されている２０Ｘ２０ｃｍゲル（Ｌａｅｍｍｌｌ、イギリ ス（１９７０）ｈ剋皿２２ヱ：　８８０−８８５）或はｐｈａｒｍａｃｌａ　Ｐ ｈａｓｔｇｅ１組織（ｈａｓｔｓ　ｓｔｅｍ　ハン　ブー　、Ｐｈａｒｍａｃｉ ａ）にて行った。ＳＬＭ８０００フォトン計量螢光発光分光光度計或はパーキン −エルマーモデルＭＰＦ’−４４Ａにより螢光発光スペクトルを得た。ケアソー ２１９ＵＶ／ビジプル分光光度計により運動測定を行った。

上記の場合を除き、全ての蛋白質を新鮮な凍結ヒト血漿から分離した。これらの 蛋白質は色層分析的並びに電気泳動的に純粋であった。ジェニーその他により記 述されているモノクロナール抗体組織（Ｊｅｎｎｙ、　Ｒ，、Ｃｈｕｒｃｈ、　 １１．、　Ｏｄｅｇａａｒｄ、　Ｂ、、　Ｌｌｔｖｌｌｌｅｒ、Ｒ，、Ｍａｎｎ 、に、（１９８６）　ｅ　Ｂｌｏｃｈｅｍ　：２２７−２４５）を使用して個々 の蛋白質を純化した。プロトロピンをランドブラッド、キングトン、マンの方法 （Ｌｕｎｄｂｌａｄ、’Ｒ，Ｌ、ｔ　Ｋｌｎｇｄｏｎ、　ｌ１１．ｓ、、Ｍａｎ ｎ　Ｋ、Ｇ、（１９７Ｃ３）　ｋ仙回ム」■ｄ　：１５　Ｂ−１７６）で活性化 した。ファクターＩＸをクローセフ、コニグスベルグ、ネマソンの方法（（１９ ７５）■胆ユｅｔｔ−丘豆：３８２−３８５）により活性化した。また、ファク ターＸを、ラッセルクサリヘビ毒液Ｘアクチベーターと反応させた後ペンスアミ ジンセファロースで純化することにより活性化した。更に、蛋白質Ｃをトロンビ ンと反応させて（Ｋ１ｓｉｅｌ＋　Ｗ−＋　ｎａＹｉｅ、　Ｅ−Ｗ、（１９８１ ）　ｋ比はＬ臘ｕｍ　ｒｔ　Ｃ，８０：　３２０−３３２）活性化した。ヒトフ ァクターＶＩＩを、一般的に、ファクターＶＩＩと活性種（ＶＩＩａ）の混合物 として分離させた。他のチモーゲン調合剤は活性フオームの痕跡のみ含んでいた 。

プラスミノーゲンを次のようにして分離させた。即ち、溶解させた、アプロチニ ンにより処理された血漿をリジン−セファロース上で通し、結合プラスミノーゲ ンをε−アミノカプロン酸（ＥＣＡＣ）で溶離させて、分離させた（ＣａＳｔｅ ｌ１１ｎＯ＋Ｆ、Ｊ、、Ｐｏｗｅｌｌ、Ｊ、Ｒ，（１９８０）ＭｅｔｈｏｄｓＥ ｎｚ　ｏｌ　８０：３Ｇ５−３７８）。そして、再度リジンセファロース上を通 した後セファデックスＧ−１００でアプロチニンから分離させた結果、電気泳動 で評価すると同質のプラスミノーゲンが得られた。プラスミノーゲンを、Ｈｅｐ ｅｓ／塩類液中において、ウロキナーゼで処理（プラスミノーゲン１に対しウロ キナーゼ２００の割合［重量割合］）することによりプラスミンを得た。組織プ ラズミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）は組み換えヒトｔＰＡ（Ｇｅｎｅｎｔ ｅｃｈ）であって、単一鎖フオームとと長鎖フオームの両方を含んでいた。ウロ キナーゼはディビットＯスタンプ博士の気前のよい贈り物であって、２鎖であっ た。

組織ファクターを伴う最初の反応研究ではウサギトロンボプラスチン（Ｓｉｇｍ ａ）を使用した。このトロンボプラスチンがかなりの蛋白質加水分解活性、純化 され、再構成された組織ファクターを示す事が分かった時、サム・ラバボールド 博士からの気前のよい贈り物を使用した。それに続く研究では、トムＱエツジン グトン博士からの気前の良い贈り物である純化された、脂質を含まないヒト組織 ファクターを使用した。再構成のために８０％アセトンで組織ファクターをＨｅ ｐｅｓ／）ウィーンから沈殿させた。デカントと吸引によってアセトンを除去し た後、蛋白質をＨｅｐｅｓ／塩類液の中に入れ、ヒギンズとマンの方法（１１１ ｇｇ１ｎｓ　Ｄ、Ｌ、　＆　Ｍａｎｎ、　Ｋ、Ｇ、（１９８３）　Ｊ、　Ｂｌｏ ｌ、　Ｃｈｅｌｌｌ、　２５８：１１ｉ５０３−１３５０８）により作られたリ ン脂質（ホスファチジルコリン７５％とホスファチジルセリン２５％）とＣａＣ １ｚにより処理して１０−１００１０−１Ｏ０と４ｍＭＣａ　（Ｉ　Ｉ）を調合 した。結合ファクターＶＩＩ検定に就いて下に説明した方法により両調合剤の組 織ファクター活性を検定した。

最初のＨｅｐｅｓ／）ウィーン溶液を、最終濃度１０ｍＭのＤＦＰと１時間反応 させた後上記のようにアセトンで沈殿させることにより組織ファクターをＤＦＰ でブロックした。そしてこの沈殿物を再構成又は更にブロックした。同様に、組 織ファクターを２４時間１．０ｍＭと反応させるか或は１００Ｍのｐ−クロロメ ルクリ安息香酸塩と２時間反応させてブロックした。サンプルひとつに３種類の 処理を全部行った。各ケースにおいて組織ファクターの比活性を処理により１０ 〜２０％減少させた。この３倍にブロックされたサンプルは当初の活性の約５５ ％を維持した。上記両調合剤からの組織ファクターのゲル分析は見掛は分子量が ４５０００の一つの蛋白質を示した。

−−−ベンゾ　ル　−−ロシル　ｉシル−ε−二　口　−一アル′ニン　ロロメ 　ル　ン Ｎ−ｔＢＯＣ−（０−ベンジル）−Ｌ−チロシン（Ｓｆｇｍａ　）　（７，３４ グラム、２０ミリモル）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド［ＨＯＮＳｕコ　（Ａ ｌｄｒｉＣｈ）　（２，５０グラム、２２ミリモル）をジメチオキシエタン［： ＤＭＥ］　（２０ｍＬ、０℃）中に溶解させ、ジシクロヘキシカルボジイミド（ ムＩｄｒ１ｃｈ　）　（４，５４グラム、２２ミリモル）で処理した。これを１ 時間Ｏ℃に保った後２時間２２℃に保ち、固形化した反応混合物に酢酸エチルを 添加し、スラリーを濾過した。そして残留物を酢酸エチル（１００ｍＬ）中で再 度懸濁し、そして更に２回濾過した。この様に化合した濾過物を真空中で蒸発さ せて厚い油を形成し、この油をホットイソプロパツールから再結晶させた。ｔＢ Ｏｃ　（−０−Ｂｚ）−ＴＹｒ−ＯＮＳｕの歩留りは７．６８グラム（８２％） であった。

ｔＢＯｃ−（０−Ｂｘ）−’ｒｙｒ−ＯＮＳｕ　（４，８９グラム、１０ミリモ ル）をＤＭＥ　（３０ｎｎＬ）中で懸濁し、グリシ７　（０，７５グラム、１０ ミリモル）とＫＨＣＯ３（１００グラム、１０ミリモル）の水溶液で処理した。

これによる反応液は最初は激しく泡立った。これを１時間攪拌するとこの混合物 は澄み、それ以上沸騰を起こさなかった。この反応生成物を、冷たいＬ　Ｍ　Ｈ ２ｓ　Ｓ　Ｏ４でＰＨ＝３に慎重に酸性化し、そして、水（１００ミリリツトル ）で希釈した。生成物を酢酸エチル（２Ｘ　５０ミリリツトル）で抽出し、化合 抽出物を水（３Ｘ　５０ミリリツトル）で洗浄し、ＮａＣ１（５０ミリリツトル ）を飽和させ、無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、蒸発させて固形物にした。この 固形物をクロロホルム−ヘキサンから再結晶させた。その結果、ｔＢＯｃ−（０ −Ｂｚ）−ＴＹｒ−ａｔｙの歩留りは３．２０グラム（７５％）であった。

ｔＢＯｃ−（０−Ｂｚ）−ＴＹｒ−Ｇｌｙ　（２，１５グラム、５．０ミリモル ）を−２０℃のテトラヒドロフラン［ＴＨＦコ　（５ミリリツトル）中で溶解さ せ、４−メチルモリホリン（ム１ｄｒ１ｃｈ）　（０，５６４ミリリットル、５ ．０ミリモル）とクロロギ酸イソブチル（Ａｌｄｒｌｃｈ　）　（０，８６０ミ リリツトル、５．０ミリモル）で処理した。−２０℃で３０分維持した後、反応 生成物を５．０ミリリツトルのジメチルホルムアミド［ＤＭＦ］中でε−ニトロ −Ｌ−アルギニンクロロメチルケトンＨＣＬ　（１，４４ミリグラム、５．０ミ リモル）の冷たい（−２０℃）溶液で処理し、そしてその後で直ちに４−メチル モリホリン（０，５８４ミリリツトル、５．０ミリモル９を添加した。反応を一 ２０℃で２時間行わせ、そして、更に２時間かけて２２℃までゆっくり暖めた。

その後で酢酸エチル（５０ミリリツトル）を添加し、ＩＭＨ２Ｓｏ、（２５ミリ リツトル）と水（３Ｘ）と飽和ＮａＣ１で溶液を抽出し、無水硫酸ナトリウム上 で乾燥し、そして、蒸発させて油にした。クロロホルム−エーテルから再結晶さ せた結果、薄層色層分析（ベーカーフレックスシリカでクロロホルム９に対しメ タノール１の割合、Ｒｔ　＝０．４４）で均質である事が判明した生成物が得ら れた。ｔＢＯｃ−（０−Ｂｚ）　−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｃｅ−Ｎ０２　）−Ａｒｇ −ｃｋの歩留りは０．９３グラム（２９％）であった。

−一−１＋―■■― ｔＢＯＣ−（０−Ｂｚ）−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｃｅ−ＮＯ２）−Ａｒｇ−ｃｋ　（ ６１０ミリグラム、１．０ｔリモル）を、３０分、室温にて、液状Ｈｆで処理し た。処理後、ＨＦを真空中で除去し、固形物を乾燥させ、この固形物を１．０ｍ ＭＨＣｌの中に入れ、凍結乾燥させた。これにより得られた生成物をメタノール （ＩＸ　３０ｃｍ）中のセフ１デックスＬＨ−２０で色層分析した。この結果溶 離した生成物を真空中で溶剤により蒸発させて回収し、メタン／エーテルから再 結晶させた。歩留りは３１９ｍｇ（５４％）であった。

ビオ　ニル−ε−アクツカプロ　ルー　−チロシル　１シル−−アルギニンーロ ロメ　ル　ン　−） ｔＢＯｃ−（０−Ｂｚ）−Ｔｙｒ−ＧＩＹ−Ｃｅ−ＮＯ２）−Ａｒｇ−ｃｋ　（ １３２ミリグラム、０．２０ミリモル）を飽和ＨＣＩ／メタノール（１０ミリリ ツトル）中で溶解させ、１０分攪拌した。溶剤を真空中で除去し、ＨＣ１／メタ ノールの２番目のアリコート（１０ミリリツトル）と交換した。２０分後、溶剤 を除去し、エーテル（５０ミリリツトル）を添加した。そして沈殿生成物中の溶 剤を別の容器に移し、固形物を夜通し真空中でＫＯＨペレット上にて乾燥した。

残留物をＤＭＦ　（１，０ミリリツトル）中で溶解させ、そして、Ｎ−ヒドロキ シスクシニルビオチニル−ε−アミノ−カプロン酸塩（９１ミリグラム、０．２ ０ミリモル）の溶液に添加した。そして更に、水中にて、これにＫＨＣＯ，（４ ０ミリグラム、０．４０ミリモル）を添加した。反応を２２℃で３０分行わせた 後、メタノールＨＣＩ（５ミリリツトル）とエーテル（５０ミリリツトル）で処 理した。

その結果、２つの相が形成された。エーテル相（上の相）を除去し、下の相をセ ファデックスＬＨ−２０カラム（Ｉ　Ｘ　２０　ｃｍ）に直接充填し、そして、 メタノールで溶離させた。ピークが一度Ａ２８Ｇまで観察された。これは薄層色 層分析の（クロロホルム３に対しメタノール１の割合、Ｒｒ　＝　０．２１）の 結果、同質であった。生成物をエーテルで沈殿させ、濾過して回収した。歩留り は、ブロックされたビオチニル化ペプチド［ＢｉｏＣａｌ）−（０−Ｂｚ）−Ｔ ｙｒ−Ｇｌｙ−（ｅ−ＮＯｚ　）　Ａｒｇ−ｃｋコロ９ミリグラム（３５％）で あった。

上記生成物（６５ミリグラム、８６ミクロンモル）をバイオサーチＨＦ　開裂反 応器にて液状フッ化水素と反応させた。３０分後、真空中でＨＦを蒸発させ、来 い残留物を夜通しＫＯＨ上にて真空中（アスピレータ−真空）で乾燥させた。そ の後、残留物を１．０ｔ！ＪモルＨＣＴで処理し、濾過した。濾過液を凍結乾燥 した結果純白でない固形物になり、この固形物をメタノール（０，５ミリリツト ル）中に入れ、メタノール中にてセファデックスＬＨ−２０（Ｉ　Ｘ　２０ｃｍ ）上で色層分析した。溶離の結果、一度大きなピーク（Ａ２８０　）が現れた。

このピークは板目試薬で陽性であり、ウシファクターＸａが８２２２２と反応す るのを妨げた。プールされたピークを蒸発させて固形物とした。この固形物を１ ミリモルＨＣＩ中に入れ、凍結乾燥した。歩留りは５０．２ミリグラム（８７％ ）であった。固形物を１０ミリモルのＨＣＩに溶解させ、凍結させた。最終濃度 は１３ミリモルであった。

ペブ　８　ロロメ　ル　ンへの　−・の　ＡＡ、塩化入火夫二上法 ６−シメチルアミノナフタレンー２−スルホニル−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ− プロリル−Ｌ−アルギニンクロロメチルケトン塩酸塩［２、ローダンシル−ＦＰ Ｒｃｋ、ＨＣＩコＦＰＲｃｋ、　２ＨＣｌ　（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）　（５， ０ｍｇ、　９．５モル）をメタノール（１，０ｍＬ）中で溶解させ、そして、２ ．ローダンシルクロリド（モリキュラープローブ）により処理した。これを２５ ℃に２９分維持した後、１．０ＭＨＣｌを加えて反応をとめ、この混合物をセフ ァデックスＬＨ−２０カラム（１×３Ｑ　Ｃｍｓ　メタノール中）に直接充填し た。溶離後、螢光発光、Ａ２ａｏ　％扱口染色剤、薄層色層分析を続けた。その 結果、生成物が単一の、螢光性の板目陽性スポットＲｒ　＝０．１４　（ベーカ ーフレックスシリカゲルでクロロホルム２に対しメタノール１の割合）として現 れた。プールされたサンプルを蒸発させて油を得、１．ＯｍＭ中に入れた。そう するとこの溶液はトロンビンの合成基質（８２２３８）との反応を急激に阻害し 、螢光蛋白質を生成した（下の標識方法を見られたい）。溶液を凍結乾燥して油 とし、この油を１０．０ｍＬＨ’Ｃ１（３，８ｍＬ）の中に入れて凍結させた。

最終濃度は１．０ｍＭであった（Ａ３６゜で測定）。

Ｂ、−ヒドロ　シス　シン　々５エステル５（と６）カルボキシルフルオレセイ ニルーＬ−グルタミングルシル−Ｌ−アルギニンクロロメチルケトン塩酸塩［Ｆ ｌ−ＥＧＲｃｋ］水（１５０μＬ）中のし一グルタミングルシルーし一アルギニ ンクロロメチルケトンニ酸塩化合物［１６コ　（１３，０ｍｇ、２８モル）をＤ ＭＦ　（３００μＬ）と１．００ＭＫＨＣＯ３（５０μＬ１５０ミクロンモル） 中の５（と６）カルボキシルフルオレセインＮ−ヒドロキシスクシンイミドエス テルにより急速に続は様に処理した。１０分後、０．ｌ０ＭＨＣｌ　（４００μ Ｌ）を添加し、混合物をＬＨ−２０セフ１デツクス力ラム（メタノール中のＩ　 Ｘ　３０ｃｍ）に直接充填した。

メタノールによる溶離が、均質であって板目の試薬で陽性のひとつの螢光帯をも たらしたにの螢光帯をプールし、真空中で溶剤を除去した。そして残留物を１． 。

ｍＭＨｃｌ中に入れ、乾燥凍結して油を得、この油を１０ｍＭＨＣｌ　（５，２ ｍＬ）中に入れ、凍結状態で保存した。濃度は１．９５ｍＭであった（Ａ４８゜ にょる）ウシファクターＸａの溶液０．５ｍｇ／ｍＬを作り、５２２２２により 検定した。この溶液を５０μＬ（０，５５ｎモル）含む一連のチューブを用意し た。フルオレセイ＝ルーＥＧＲｃｋをＨｃｌｅｓ／塩類液１）Ｈ＝７．４により ５５μＭに希釈し、希釈後直ちに、５０μＬフアクターＸａアリコートのうちの ひとつに添加した。２０℃で１分インキュベートした後、残りのファクターＸａ 活性を８２２２２により測定した。同様に、部分的に加水分解したクロロメチル ケトンのアリコートの４時間にわたる残りの阻害剤活性を検定し、そして更に２ ４時間にわたり検定した。同様の実験をヒトトロンビンと２、ローダンシル−Ｆ ＰＲｃｋを使用して行った。

フルオレセ　ニル−のウシフ　−　の　、２．０ｍＬＨｅｐｅｓ／塩類液ｐＨ＝ ７．４０中のウシファクターＸａ　（１゜０ｍｇ１２２．１ミクロンモル）を２ ２℃にインキュベートし、５２２２２との反応をテストした。Ｆ−ＥＧＲｃｋ　 （１０ｍＭＨＣｌ中の１．９５ｍＭ）をアリコートで添加し、１０分反応させた 。３２２２２検定により残留ファクターＸａ活性を測定した。

エヱーヨユｊム九九乱→シｊ１製 ヒトファクターＸ　（０，５ｍｇ、１．０ｍｇ／ｍｌ、Ｈｅｐｅｓ／ｅｐｅｓ／ ［２２μＭコ）を、室温にて、２．ローダンシル−ＥＧＲｃｋ　（最終濃度１０ μＭ）で２時間処理した。そしてもうひとつの阻害剤アリコートを添加し、夜通 し反応を行わせた０反応生成物をセファデックスＧ−２５カラム（Ｉ　Ｘ　２０ ｃｍ）に直接充填し、Ｈｅｐｅｓ／ｅｐｅｓ／離させた。ファクターＸの最終濃 度は３００ηｇ／ｍｌであった。

５〜１０％のファクターＶＶＩ（ゲル分析による）を含むヒトファクターＶＩＩ 　（０，２０ｍＬ　０．２５ｍｇ／ｍＬ１Ｈｅｌ）ｅｓ／塩類液中の５．０μＭ ）をＢｉｏＣａｐ−ＹＧＲｃｋ（最終濃度２００　μＭ）で２時間処理した。そ して、もう一つの同量のＢｉｏＣａｌ）−ＹＧＲｃｋのアリコートを添加し、夜 通し反応させた。その結果得られた反応生成物をセファデックスＧ−２５カラム （Ｉ　Ｘ　３０ｃｍ）に直接充填し、Ｈｅｐｅｓ／塩類液バッ塩類−バッファー た。溶出液を、２０分、０．２５グラム（８８ユニツト）のアビジン−アクリル 樹脂（Ｓｌｇｍａ　）で撹拌した。そして樹脂を遠心分離により除去し、上澄み をセントリコン１０の中で最終濃度１００μｇ／ｍＬに凝縮した。ゲル電気泳動 を行った結果、ファクターＶＩＩａは残っていなかった。

発色検定 ファクターＸａ：１ｍＬキュベツト中にてＨｅｐｅｓ／塩類液ｐＨ＝７．４中の ２２．５μＭＳ２２２２を１〜１０μＬのファクターＸａ調合剤で処理した。わ ずかの間混合物を攪拌し、ケアリー２１９ｔ）Ｖ／ビジプル分光光度計で吸光度 を４０５ｎｍとした。この割合を最初の線形和とした。同様の方法をトロンビン （Ｓ２２３８）、プラスミン（Ｓ２２５１）、ｔＰＡ　（８２２３８）について も行った。

ファクターＶＩＩ：ネマソンの共役活性測定を行った。ファクターＸ（５００ｎ ｇ／ｍＬ）、組織ファクター（１２ｎｇ／ｍＬ／脂質（ＰＳＰ８１１００μＭ） ）（或はトロンボプラスチン）、ＣａＣ１□　（２０ｍＭ）の各当量の原液を混 合し、３０秒３７℃でインキュベートシ、そして最初の３つの原液のアリコート で処理した０反応生成物を５分インキユベートシ、そして、既述のファクターＸ ａ／８２２２２法によりアリコートを検定した。

この検定のバリエージ目ンにより、組織ファクター活性度を測定し、完全な或は 不充分な複合体におけるファクターＸ活性化を測定した。ファクターＸ活性化が 低い事が予想される場合にはインキュベート時間をかなり長くとった。不充分な 複合体ではオミットされたファクターＶＩＩ或はファクターＸの代わりにＨｅｐ ｅＳ／塩類液を使用した。またオミットされた組織ファクターの代わりにリン脂 質（ｐｓｐｓｔｏｏμＭ）を使用した。

アビジン−ビオ　ニル クロロメチルケトンと反応させたプロテアーゼでビオチンを使用できるかどうか 判定する為に、処理した蛋白質をセファデックスＧ−２５に通して非付着プロー ブを取り外した。そして上記蛋白質をアビジン−フルオレセイン（Ｓｉｇ＋ｓａ 　）と反応させた。アビジンに対するビオチンの定着（発光と興奮の両方）にお いてフルオレセインの螢光発光を７５％高めた。！１度が分かっている遊離ビオ チンで作成した標準曲線を使用してサンプルのビオチン含有量を量的に把握でき た。或は、サンプルをゲル電気泳動により分離し、トリス／グリシン／メタノー ル転移バッフ１−中のニトロセルロースにプロットした。そして、トリス（２０ ｍＭ）／塩類液ｐＨ＝７．４　（ＴＢＳ）で洗浄しニトロセルロースをトウィー ン／ＴＢＳでブロックした後、アビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼでプロッ トを成長させ、４−クロロナフチルアミンで可視化した。

ヒトフ　−　の３−　の　ｌ ファクターＶＩＩａを１０％（ゲル分析による）含むヒトファクターＶＩＩ（１ ００μＬＨｅｐｅｓ／塩類液中で４９μｇ、１０ミクロンモル）を３　Ｈ−ＤＦ Ｐ（１０ｍＭ１０．４４Ｃｉ／ミクロンモル）と４時間かけて反応させた。そし てこのサンプルをＳＤＳ　ＰＡＧＥにより分離し、クーマシーブリリアントブル −で染色した。ファクターＶＩＬＶＩＩａに対応する帯を除去し、９０℃の３０ ％過酸化水素中に溶解させ、ＡｇｕａＳｏｌシンチレーション媒体中に分散させ 、べ・ツクマントＳ−３１３３Ｐカウンターにより計数した。

結果：ｖ！光性に関して標識されたクロロメチルケトンの化学的特性とスペクト ル特性は表■の通りである： 表■ 製品　方法／歩留り　Ｒｆ　吸光度　発光１、　５−ダンシル−ＥＧＲｃｋ　Ｓ Ｏ２ＣＬ１５２％　０．３９　３２０／４２００　５２０２．５−ダンシル−Ｅ ＧＲｃｋ　５Ｏ２−ＣＩ／３２％　０．４８　３７０／ｊｅｔ、　４７５２、　 ８−ダンシル−ＥＧＲｃｋ　Ｓｏ□−ＣＬ／４５％　０．４０　Ｊ、Ｆルをりσ ｏ　４３０２．５−ダンシル−ＥＧＲｃｋ　−０ＮＳｕ／３６％　０．３０　’ １７ｄ１７ＪＩρ　５２５フルオレセイン−ＥＧＲｃｋ　−０ＮＳｕ／２５％　 ０．ｄ−Ｎｏ／＃ｔｙａａ　５９０Ｌｌｓｓａｍｉｎｅ　−０−ダミ７　ＥＧＲ ｃｋ　ＳＯ２Ｃｌ／２４％　ρ、１ｇ　、Ｆ／ゲク／Ｉａａ　５９Ｑ６−ピレン −ＥＧＲｃｋ　−５Ｏ２−０１１５２％　ρ混　ＪｐＪ’ｔＬ　３９８１．５− ダンシル−ＦＰＲｃｋ　−８Ｏ２Ｃｌ’／６２％　ρ、フ／　ゴーＬｌ／鮭ノ” 　５１０２、ローダンシル−ＦＰＲｃｋ　−８０２−ＣＩ／４０％　０．ル　ｉ ｔａ／、ｆ−ｙａｔ）４３０フルオレセイン−ＦＰＲｃｋ　−０ＮＳｕ／３２％ 　ｔｌ、ｌｆ　＃？ｊ／７７ｕＯａ　５２５Ｌｉｓｓａｍｔｎｅ　−０−ダミン ーＦＰＲｃｋ−３Ｏｚ　Ｃ１１５０％　ρ、／ＬＪ−りｆ７１ｅｏｔ　５９Ｑ１ ．５−ダンシル−ＴＧＲｃｋ　−８Ｏ−−ＣＩ／４０％　ａ、ｉｎ　、Ｂｘｒ／ ｙＬｄＤ　５３０上の表のクロロメチルケトンはすべて、非標識ペプチドも発螢 光団も含まず、−２０℃で１０ｍＭ５長期にわたり保存されても安定していた。

少量のヒドロキシヒドロキシメチルケトンによる汚染を不可能ならしめることは できなかった。その理由は、使用分析方法が少量の加水分解をもたらす事が予想 され得たからである。

プロテアーゼに対する調合剤の反応性がおおむね高いのは、クロロメチルケトン 基がほとんど加水分解されないからである０強い塩基により処理されると加水分 解するクロロメチルケトンはプロテアーゼを阻害する能力を喪失してしまう０本 発明者は次の事に注目した。即ち、ダンシル誘導体は、たとえ光線があたらない ように保護されても、長期にわたり室温下におかれると螢光発光強度を失ってし まう傾向がある。しかしこれらの化合物はプロテアーゼを阻害する能力を喪失し ない、これらの阻害剤はすべて光線を浴びると白くなりやすいため、出来るだけ 光線があたらないよう保護した。

本発明の種々の発螢光団・ペプチドの組合せの活性範囲を把握する為にプロテア ーゼとその対応チモーゲンを甚しく過剰量の各試薬と反応させた。この全ての反 応において反応度合いをゲル電気泳動によりモニターした。螢光帯を写真にとり 、染色する前に標識した。あらゆる場合において、活性酵素のみが標識を取り入 れることができるので、活性部位ヒスチジンを含む事が分かっているポリペプチ ド鎖のみを標識した。テストした全てのプロテアーゼ（ファクターＩＩａＮＶＩ ＩａＮＩＸ　ａ　Ｎ　Ｘ　ａ　Ｎ　Ａ　Ｐ　ＣＮプラスミン、ｔＰＡ（Ｌ鎖と２ 鎖）、ウロキナーゼ）が［ＦコーＦＥＲｃｋ、［ＦコーＥＧＲｃｋ、［：Ｆコー ＹＧＲｃｋ　（［Ｆコニどんな螢光プローブでもよい）と反応した。ウロキナー ゼのＦＰＲｃｋ誘導体との反応速度は比較的遅かったが、テストした他の全ての 組合せは５：１以下のクロロメチルケトンのモル過剰で本質的に量的な標識取込 みをもたらした。しかしこれとは対照的に、チモーゲンフオームは、どれも、た とえモル比が５０＝１以上であっても標識を取込むよう誘導することができなか った。少量の標識がチモーゲン調合剤に取込まれた時に製品をゲル分析してみる と、チモーゲン調合剤を汚染する活性プロテアーゼの痕跡がこの取込みの原因で あることが判明した。

発色基質検定を行える場合には標識取込みを直接モニターできた。これらの反応 では、阻害剤の各アリコートを２次のアリコートが添加される前に取込みが非常 に遅くなる迄１反応させた。クロロメチルケトンの加水分解速度が遅いので、そ の前に添加された全ての阻害剤が消費されてしまうまで待つことは出来なかった 。只発色基質のベースライン加水分解のみが観察されるまで、添加を続けた。あ るプロテアーゼにおいて、所要の阻害剤の量はプロテアーゼの構造と添加速度の 両方に左右された。　［Ｆ］　−ＥＧＲｃｋ跣導体を使用してファクターＸミー ８２２２２反応を阻害した場合、活性阻害には２〜５のモル当量が必要であった 。［Ｆ］−ＦＰＲｃｋとＣＦ３−ＹＧＲｃｋ誘導体は、概して＊　ＩＩａとＸａ の両ファクターの阻害により効果的であり、典型的な場合では２又はそれ以下の モル当量で完全な阻害を行った。或は代わりに阻害速度に従う方法がある。この 方法では、阻害剤と発色基質の両方を含む溶液に酵素を添加した。加水分解速度 は急激に低下し得る。しかしこれらの結果の解釈は、クロロメチルケトンの加水 分解が競合的に反応すること。

それに、まだ活性の有る酵素によって基質が比較的急激に減損することによって 。

複雑になる。

検定のためには一番最初に生じる加水分解を次の発色段階に結び付けなければな らないファクターＶＩＩａの様な酵素の場合には、ファクターＶＩＩａ（又はＶ ＩＩ）のクロロメチルケトンとの反応をフォローする為に検定を直接使用する事 は不可能であった。何故なら、残留阻害剤が生成された酵素（ファクターＸａ） と急激に反応して検定を妨害するからである。実験として、完全に活性化された ヒトファクターＶＩＩａをフルオレセイニルーＦＰＲｃｋ　（１，０当量）と反 応させ、２０分後に検定した。その結果、酵素はファクターＸａ活性を発生させ る能力が３８％阻害されていた。他のケースでは１反応性を、酵素への標識の取 込みと電気泳動分離によってただ質的にのみ、測定した。

活性プロテアーゼとかなりの螢光発光を取込むことが出来なかったクロロメチル ケトンの唯一の組合せは、ＦＰＲｃｋ誘導体と反応させた２鎖ウロキナーゼであ った。この結果は、ウロキナーゼがｋｉｓｓａａ＋ｔｎｅ−ローダミン−ＦＰＲ ｃｋの存在下でプラズミノーゲンをプラスミンに変換出来る事で確認できた。

分離された。標識された蛋白質における発螢光団と蛋白質の割合を吸光度測定に よって直接的に定量したところ、　ｉｔ、、て、１：１に近い値が得られたが、 この測定は、蛋白質への定着が行われると螢光発光強度が変化してしまう事と幾 らかの組織の中の螢光発光エネルギー転移のかなりのレベルによって複雑になる 。下の表■は非定着阻害剤を含まずに分離された蛋白質の見掛けの発螢光団・蛋 白質比率を表す： 表■ 発螢光団の定量化：蛋白質クロロメチルケトンの吸光度による発螢光団と蛋白質 の比率 発螢光団・蛋白質 （モル１モル） ヒトＸａ　フルオレセイニルーＥＧＲｃｋ　１．０８ウシＸａ　フルオレセイニ ルーＥＧＲｃｋ　１．０２ヒトＸａ　フルオレセイニルーＹＰＲｃｋ　０．９８ ヒトＸａ　ｏ−ダミンーＸ−ＥＧＲｃｋ　Ｏ，’９２ヒトＸａ　２＊　６−ダ７ シに−ＥＧＲｃｋ　１．ＯＳヒトＸＩＩａ　フルオレセイニルーＹＰＲｃｋ　Ｏ ，９５ヒトＶＩＩａ　フルオレセイニルーＹＰＲｃｋ　０．９ｉ（発螢光団の吸 光度に合わせて修正したＡ２６０により蛋白質濃縮物を測定した。

発螢光団の濃度は特定プローブの最大吸光度において測定した。）加水分解速度 対応のヒドロキシメチル化合物に対するクロロメチルケトンの加水分解は９重要 ではあるが、生理学ｐＨでは、阻害作用を確実に排除するほど急速ではない、発 色基質に対する活性を阻害する能力で測定するとｙ　Ｈｅｐｅｓ／塩類液ｐＨ＝ ７゜４（２０℃）中でのクロロメチルケトンの見掛は半減期は２〜５時間であり 、阻害作用の多く（５〜２０％）が２４時間経過後も残った。３７℃では反応は 幾分速かったが、２〜５％の活性が６時間後も残った。加水分解速度はＦＰＲｃ ｋ誘導体の場合よりＥＧＲｃｋ誘導体の場合の方が幾分速かった。ｐＨを大きく 上げれば加水分解速度は速くなる。１１．０ｐＨｃｔ、ＯｍＭ　Ｎａ０Ｈ）で５ 分加水分解すると、阻害作用は完全に失われ、従って加水分解は完全である。

ロープ　プローブ・　・　の　１　ゝ プローブの螢光発光は、一般的に、ペプチドやペプチドが付着されているクロロ メチルケトンの性質によって大きく左右されない。しかし蛋白質取込みと共にト ラマツチツクな変化が生じる。取込まれたプローブでは（非付着阻害剤との関係 での）興奮と発光の最大限における波長移動は一般に小さい。つまり、典型的な 場合にあって、０〜５ｎＭである。一般に、２８０ｎＭで興奮が幾らか増大する 。これは、蛋白質とプローブの間でエネルギーが移動するためである。この興奮 の増大は、プローブの興奮帯が３２ＯＮ４００ｎＭである場合に特に、顕著であ る。他の点では、興奮と発光の強度変化は使用プローブと蛋白質の両方に左右さ れ、この強度変化は蛋白質分解複合体の他の成分に対するプロテアーゼの定着に おいて観察され得る。

活性酵素Ω除去 ビオチニル化クロロメチルケトン、ビオチニル化−ε−アミノカプロイル−ＹＧ Ｒｃｋは、サンプルから活性プロテアーゼの痕跡をスムーズに除去する事を可能 ならしめる。螢光プローブの場合と同様、活性プロテアーゼのみがビオチニル化 ペプチドを取込む。ビオチンをアビジンへの定着に使用できるが、これはビオチ ンが活性化された状態の時だけ可能である。これにより、固体マトリックスに結 合されたアビジンとの反応により阻害されたプローブを急速に除去できる。プロ テアーゼ活性の完全な阻害は種々の活性部位阻害試薬により行い得るが、チモー ゲン調合剤からプロテアーゼの痕跡を物理的に除去する事はしばしば困難である 。活性化に分子の大きさの変化が伴わない時には、特にそうである。この方法に よれば汚染物を容易に除去でき、この方法は、少量の活性化を検出する試薬の調 合その他プロテアーゼの痕跡が残っているのは望ましくない用途に特に有用であ る。

本発明の実験で、ヒトファクターＶＩＩとＶＩＩａ（５〜１５％ＶＩＩａ）の混 合物を、５倍の過剰量のクロロメチルケトン（蛋白質総量に基づく）を使用して 、ＢｔｏＣａｌ）−ＹＧＲｃｋと反応させた。この生成物をゲル濾過して過剰の 阻害剤を除去し、そして、同生成物を、ポリアクリル酸エステルマトリックスに 結合されたアビジンと反応させた。反応物の上澄みをゲル分析した結果、ファク ターｖＩＩａで汚染されていなかった。１０％（Ｗ／Ｗ）ファクターＸａをドー プしたウシファクターＸａの溶液を同じプロトコールで処理した時も同一の結果 を得た。

ε−アミノカプロイル基により与えられるスペースがこの反応にとって欠かせな い。ビオチンをペプチドクロロメチルケトンに直接結合すると、プロテアーゼ（ ファクターＩＩａとＸａ）との反応は９発色基質により検定されたように、正常 に進んだ。しかし、アビジン−アクリル、フルオレセイン−アビジン、或はアビ ジン−ペルオキシダーゼプロットを使用してアビジンの定着（結合）を検出する ことはできなかった。スペーサーを用いれば、上記のどの検出方法を行ってもア ビジンは容易に反応する。ゲル濾過段階はアビジン消費量を著しく減少させる。

回笠物 当該技術分野の熟練者であれば上記の本発明の実施例と同等の技術を認識するで あろう、或は、単なる日常的実験によりその様な同等の技術を確認し得るであろ う。この様な同等技術は次の請求範囲に含まれるものである。

終了 キ （酵素−ＢＣＰＰＡＣＫ）　ｎｑ／ｍ１ＦＩＧ。２ １／１２８　１／３２　＋／８ 国際調査報告 １＋１ｊｆｆｉｌｌｌ暢ＭＩＡｅｌｋｊｗＭＮ・ＰＣＴ／ＵＳ８９１０４１９２ 国際調査報告　ＰＣＴ／ＵＳ　８９１０４１９２

Claims (50)

【特許請求の範囲】
1. １．生物学的流体の触媒活性セリンプロテアーゼを検出あるいは定量する方法で 、 ａ．生物学的流体を、 ｉ．ハロメチルケトンがセリンプロテアーゼに共有結合するために十分な条件下 で、触媒活性セリンプロテアーゼに特異的なハロメチルケトンと、ｉｉ．抗体が セリンプロテアーゼに結合することができる条件下で、特定の型のセリンプロテ アーゼに特異的な抗体と、共に、インキュベートし、 ｂ．上記生物学的流体中の触媒活性セリンプロテアーゼの存在あるいは量を、上 記ハロメチルケトン及び上記抗体が結合したセリンプロテアーゼの量として、定 量する、 ことを特徴とする方法。
2. ２．上記定量されるセリンプロテアーゼが、繊維プラスミノーゲン活性体ファク ターＶＩＩａ、ファクターＩＩａ、ファクターＩＸａ、ファクターＸａ、プラス ミン、及び、活性タンパク質Ｃからなるグループから選択される、ことを特徴と する請求項１の方法。
3. ３．上記ハロメチルケトンが、選択的に認識可能な化学化合物で標識された、ペ プチジルクロロメチルケトンである、ことを特徴とする請求項１の方法。
4. ４．上記標識化合物が、酵素、発蛍光団、あるいは、放射性同位体である、こと を特徴とする請求項３の方法。
5. ５．上記ハロメチルケトンが、ビオチニール化されている、ことを特徴とする請 求項１の方法。
6. ６．生物学的流体中の触媒活性セリンプロテアーゼを定量する方法で、ａ．標識 されたクロロメチルケトンがセリンプロテアーゼに共有結合するために十分な条 件下で、生物学的流体と、触媒活性セリンプロテアーゼに特異的な標識されたク ロロメチルケトンと、をインキュベートし、ｂ．セリンプロテアーゼが選択的に 免疫吸着剤に吸着される条件下で、特定の型のセリンプロテアーゼに特異的な抗 体を含む固相免疫吸着剤と、生物学的流体とを接触させ、 ｃ．上記免疫吸着剤及び生物学的流体を分離し、ｄ．上記生物学的流体中の触媒 活性セリンプロテアーゼの量を、免疫吸着剤と結合する標識化合物の量として、 定量する、ことを特徴とする方法。
7. ７．上記定量されるセリンプロテアーゼが、繊維プラスミノーゲン活性体ウロキ ナーゼ、ファクターＶＩＩａ、ファクターＩＩａ、ファクターＩＸａ、ファクタ ーＸａ、プラスミン、及び、活性タンパク質Ｃからなるグループから選択される 、ことを特徴とする請求項６の方法。
8. ８．上記クロロメチルケトンが、標識されたトリペプチジルクロロメチルケトン である、ことを特徴とする請求項６の方法。
9. ９．上記標識化合物が、酵素、蛍光化合物、あるいは、放射性同位体である、こ とを特徴とする請求項６の方法。
10. １０．上記標識化合物が、ダンシル基フルオロエズシェル基ロダミニル基及び、 ユウロピウムからなるグループから選択される発蛍光団である、ことを特徴とす る請求項６の方法。
11. １１．上記標識化合物が、ホース・ラディッシュペルオキシダーゼ（過酸化酵素 ）である、ことを特徴とする請求項６の方法。
12. １２．生物学的流体中の触媒活性セリンプロテアーゼを定量する方法で、ａ．ビ オチニール化されたクロロメチルケトンがセリンプロテアーゼの触媒活性部位に 共有結合するために十分な条件下で、生物学的流体と、セリンプロテアーゼの触 媒活性部位に特異的なビオチニール化されたクロロメチルケトンとをインキュベ ートし、 ｂ．セリンプロテアーゼが免疫吸着剤に吸着される条件下で、特定の型のセリン プロテアーゼに特異的な抗体を含む免疫吸着剤と、生物学的流体とを接触させ、 ｃ．上記免疫吸着剤及び生物学的流体を分離し、ｄ．上記免疫吸着剤を、アビジ ン結合酵素と接触させ、ｅ．上記生物学的流体中の触媒活性セリンプロテアーゼ の量を、上記免疫吸着剤に結合する触媒活性の量として、定量する、ことを特徴 とする方法。
13. １３．上記定量されるセリンプロテアーゼが、繊維プラスミノーゲン活性体ウロ キナーゼ、ファクターＶＩＩａ、ファクターＩＩａ、ファクターＩＸａ、ファク ターＸａ、プラスミン、及び、活性タンパク質Ｃからなるグループから選択され る，ことを特徴とする請求項１２の方法。
14. １４．上記クロロメチルケトンが、ビオチニール化されたペプチジルクロロメチ ルケトンである、ことを特徴とする請求項１２の方法。
15. １５．上記クロロメチルケトンが、 ビオチン▲数式、化学式、表等があります▼但し、 ［Ｓ］：ビオチンとＡ３とを結合させる、任意のスペーサーＡ１：セリンプロテ アーゼの触媒活性部位のサブサイトＳ１に特異的なアミノ酸残基 Ａ２：アミノ酸残基 Ａ３：アミノ酸残基 の式で表されることを特徴とする請求項１４の方法。
16. １６．上記Ａ１が、Ｒ、Ｋ、あるいは、ｈＲである、ことを特徴とする請求項１ ５の方法。
17. １７．上記Ａ３が、芳香族アミノ酸残基である、ことを特徴とする請求項１５の 方法。
18. １８．上記Ａ３が、Ｆ、Ｗ、Ｙ、あるいは、Ｈである、ことを特徴とする請求項 １７の方法。
19. １９．上記Ｓが、 ▲数式、化学式、表等があります▼ 但し、 ｎ：３ないし８ の式で表されるリンカーである、ことを特徴とする請求項１５の方法。
20. ２０．上記クロロメチルケトンが、 ビオチン▲数式、化学式、表等があります▼の式で表されるビオチニール化され たクロロメチルケトンである、ことを特徴とする請求項１２の方法。
21. ２１．上記クロロメチルケトンが、 ビオチン▲数式、化学式、表等があります▼の式で表されるビオチニール化され たクロロメチルケトンである、ことを特徴とする請求項１２の方法。
22. ２２．上記酵素が、ホース・ラディッシュペルオキシダーゼ（過酸化酵素）であ る、ことを特徴とする請求項１７の方法。
23. ２３．生物学的流体中の触媒活性セリンプロテアーゼを定量する方法で、ａ．ビ オチニール化されたクロロメチルケトンがセリンプロテアーゼの活性部位に共有 結合するために十分な条件下で、生物学的流体と、セリンプロテアーゼの活性部 位に特異的なビオチニール化されたクロロメチルケトンとをインキュベートし、 ｂ．ビオチニール化されたクロロメチルケトンと結合したセリンプロテアーゼが 固相吸着剤に吸着される条件下で、アビジンを含む固相吸着剤と、生物学的流体 とを接触させ、 ｃ．上記吸着剤及び生物学的流体を分離し、ｄ．抗体がセリンプロテアーゼと結 合することが可能な条件下で、上記吸着剤を、定量対象である特定の型のセリン プロテアーゼに特異的な、標識された抗体と接触させ、 ｅ．上記生物学的流体中の触媒活性セリンプロテアーゼの量を、上記吸着剤に結 合する標識化合物の量として、定量する、ことを特徴とする方法。
24. ２４．上記定量されるセリンプロテアーゼが、繊維プラスミノーゲン活性体ファ クターＶＩＩａ、ファクターＩＩａ、ファクターＩＸａ、ファクターＸａ、プラ スミン、及び、活性タンパク質Ｃからなるグループから選択される、ことを特徴 とする請求項２３の方法。
25. ２５．上記クロロメチルケトンが、ビオチニール化されたペプチジルクロロメチ ルケトンである、ことを特徴とする請求項２３の方法。
26. ２６．上記クロロメチルケトンが、 ビオチン▲数式、化学式、表等があります▼但し、 ［Ｓ］：ビオチンとＡ３とを結合させる、任意のスペーサーＡ１：セリンプロテ アーゼの触媒活性部位のサプサイトＳ１に特異的なアミノ酸残基 Ａ２：アミノ酸残基 Ａ３：アミノ酸残基 の式で表されることを特徴とする請求項２５の方法。
27. ２７．上記Ａ１が、Ｒ、Ｋ、あるいは、ｈＲである、ことを特徴とする請求項２ ６の方法。
28. ２８．上記Ａ３が、芳香族アミノ酸残基である、ことを特徴とする請求項２６の 方法。
29. ２９．上記Ａ３が、Ｆ、Ｗ、Ｙ、あるいは、Ｈである、ことを特徴とする請求項 ２８の方法。
30. ３０．上記Ｓが、 ▲数式、化学式、表等があります▼ 但し、 ｎ：３ないし８ の式で表されるリンカーである、ことを特徴とする請求項２６の方法。
31. ３１．上記ビオチユール化されたクロロメチルケトンが、ビオチン▲数式、化学 式、表等があります▼の式で表される、ことを特徴とする請求項２６の方法。
32. ３２．上記ビオチニール化されたクロロメチルケトンが、ビオチン▲数式、化学 式、表等があります▼の式で表される、ことを特徴とする請求項２６の方法。
33. ３３．上記抗体が酵素で標識されている、ことを特徴とする請求項２３の方法。
34. ３４．触媒活性セリンプロテアーゼを検定するためのキットで、触媒活性セリン プロテアーゼに特異的な、標識されたクロロメチルケトンと、定量対象である、 特定の型のセリンプロテアーゼに特異的な抗体と、を備えることを特徴とするキ ット。
35. ３５．上記クロロメチルケトンが酵素、発蛍光団、あるいは、放射性同位体で標 識されている、ことを特徴とする請求項３４のキット。
36. ３６．触媒活性セリンプロテアーゼを検定するためのキットで、触媒活性セリン プロテアーゼに特異的な、ビオチニール化されたクロロメチルケトンと、 アビジンで被覆された固相吸着剤と、 定量対象である、特定の型のセリンプロテアーゼに特異的な、標識された抗体と 、 を備えることを特徴とするキット。
37. ３７．上記ビオチニール化されたクロロメチルケトンが、ビオチン▲数式、化学 式、表等があります▼但し、 ［Ｓ］：ビオチンとＡ３とを結合させる、任意のスペーサーＡｌ：セリンプロテ アーゼの触媒活性部位のサブサイトＳ１に特異的なアミノ酸残基 Ａ２：アミノ酸残基 Ａ３：アミノ酸残基 の式で表されることを特徴とする請求項３６のキット。
38. ３８．上記Ａ１が、Ｒ、Ｋ、あるいは、ｈＲで、上記Ａ３が、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ある いは、Ｈで、上記Ｓが、 ▲数式、化学式、表等があります▼ 但し、 ｎ：５ないし８ の式で表されるリンカーである、ことを特徴とする請求項３７のキット。
39. ３９．触媒活性セリンプロテアーゼを検定するためのキットで、触媒活性セリン プロテアーゼに特異的な、ビオチニール化されたクロロメチルケトンと、 アビジンが結合した標識化合物と、 定量対象である、特定の型のセリンプロテアーゼに特異的な抗体で、被覆された 免疫吸着剤と、 を備えることを特徴とするキット。
40. ４０．上記ビオチニール化されたクロロメチルケトンが、ビオチン▲数式、化学 式、表等があります▼但し、 ［Ｓ］：ビオチンとＡ３とを結合させる、任意のスペーサーＡ１：セリンプロテ アーゼの触媒活性部位のサブサイトＳ１に特異的なアミノ酸残基 Ａ２：アミノ酸残基 Ａ：：アミノ酸残基 の式で表されることを特徴とする請求項３９のキット。
41. ４１．上記Ａｌが、Ｒ、Ｋ、ｈＲ、Ｆ、あるいは、Ｔで、上記Ａ３が、Ｆ、Ｗ、 Ｙ、あるいは、Ｈで、上記Ｓが、 ▲数式、化学式、表等があります▼ 但し、 ｎ：３ないし８ の式で表されるリンカーである、ことを特徴とする請求項４０のキット。
42. ４２．上記標識化合物が酵素である、ことを特徴とする請求項３９のキット。
43. ４３．ビオチン▲数式、化学式、表等があります▼但し、 ［Ｓ］：ビオチンとＡ３とを結合させる、任意のスペーサーＡ１：セリンプロテ アーゼの触媒活性部位のサブサイトＳ１に特異的なアミノ酸残基 Ａ２：アミノ酸残基 Ａ３：アミノ酸残基 の式で表されることを特徴とするビオチニール化されたクロロメチルケトン。
44. ４４．上記Ａ１が、Ｒ、Ｋ、あるいは、ｈＲである、ことを特徴とする請求項４ ３のビオチニール化されたクロロメチルケトン。
45. ４５．上記Ａ３が、芳香族アミノ酸残基である、ことを特徴とする請求項４３の ビオチニール化されたクロロメチルケトン。
46. ４６．上記Ａ３が、Ｆ、Ｗ、Ｙ、あるいは、Ｈである、ことを特徴とする請求項 ４５のビオチニール化されたクロロメチルケトン。
47. ４７．上記Ｓが、 ▲数式、化学式、表等があります▼ 但し、 ｎ：３ないし８ の式で表されるリンカーである、ことを特徴とする請求項４３のビオチニール化 されたクロロメチルケトン。
48. ４８．ビオチン▲数式、化学式、表等があります▼の式で表される、ことを特徴 とするビオチニール化されたクロロメチルケトン。
49. ４９．ビオチン▲数式、化学式、表等があります▼の式で表される、ことを特徴 とするビオチニール化されたクロロメチルケトン。
50. ５０．生物学的流体中から触媒活性セリンプロテアーゼを取り除く方法で、ａ． ビオチニール化されたクロロメチルケトンがセリンプロテアーゼの活性部位に結 合するために十分な条件下で、生物学的流体と、セリンプロテアーゼの活性部位 に特異的なビオチニール化されたクロロメチルケトンとをインキュベートし、 ｂ．ビオチニール化されたクロロメチルケトンと結合したセリンプロテアーゼが 固相吸着剤に吸着される条件下で、アビジンを含む固相吸着剤と、生物学的流体 とを接触させ、 ｃ．上記吸着剤及び生物学的流体とを分離する、ことを特徴とする方法。