JPH04501508A - ハイブリッド凝固促進蛋白 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ハイブリッド凝固促進蛋白 人間の凝固補因子である因子ＶＩ　Ｉ　Ｉ　：Ｃ（ＦＶＩ　Ｉ　Ｉ）をコードし ているＤＮＡ配列は文献上で知られており　［例えばトウール等、１９８４年、 ネイチャー３１２巻３１２−３１７頁：ウッド等、１９８４年、ネイチャー３１ ２巻３３０−３３７頁；ベーア等、１９８４年、ネイチャー３１２巻３３７−３ ４２頁参照］、これらを発現させて組み替え体ＦＶＩＩＩを産生させる方法もま た知られている［例えばＷＯ３７１０４１８７、ＷＯ３８１０８０３５およびＷ Ｏ３８１０３５５８参照］。凝固促進活性ＦＶＩ　Ｉ　Ｉ類似体及びこれらをコ ードしているＤＮＡ配列もまた報告されている［例えばＷＯ３６１０６１０１お よびＷＯ３７１０７１４４参照］。一般ニコのような類似体は、Ｂドメインの一 部または全てを欠いており、モして／または特定のアミノ酸の位置が、例えば通 常プロテアーゼに対し不安定な部位が例えばトロンビンまたは活性化蛋白Ｃによ る蛋白分解に対して抵抗性となるように修飾されている。他の類似体は■または それ以上のリジン及び／またはチロシン残基における修飾を含んでいる。

その理由はいまなお確定していないが、組み替え体ＦＶＩＩＩの発現は比較的低 いレベルで進行する。例えば燐脂質もしくは７オン・ウィルブランド因子（ｖ　 Ｗ　Ｆ　）またはこれらの類似体の存在下での発現［例えばＷＯ８７１０４１８ ７オよびＷＯ８８１０８０３５参照］、ＢｉＰとして知られる内生小胞体蛋白を 低レベルで発現する細胞中で１７）ＦＶｌｌｌの発現［例えばＷＯ８８１０３５ ５８参照］ならびにＦＶＩＩＩおよびその類似体のＢドメイン内部での削除［例 えばＷＯ３５１０６１０１参照］、ノように、ＦＶＩ　Ｉ　Ｉ及びソノ類似体の 低い発現レベルの向上の御坊となる様々な方法が開発されてきた。

因子Ｖ（ＦＶ）は、凝固カスケード中に含まれるもう一つの高分子糖蛋白補因子 である。人間のＦＶ遺伝子はクローニングされ配列決定されている［例えばジェ ニー等、１９８７年、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オ ブ・サイエンシズ・ＵＳＡ１８４巻４８４６−４８５０頁参照１゜その順序は互 いに異なっているものの、ＦＶＩＩＩおよびＦＶは、共に３個の「Ａ」　ドメイ ン、１個のｒＢＪ　ドメイン及び２個の「Ｃ」ドメインをコードしているＤＮＡ によって発現される、ある共通の構成上の特性を持っており、これを下に模式的 に示す：１Ａ＝ｌＬ−ＩＡ＝ｌＬ　ＩＡ＝ｌＬ−ＩＱ＝ｌｆ−二基］さらにＦＶ ＩＩＩにおいては、高度酸性ペプチド領域がＡ−２及びＡ−３に先行する。

また驚くべきことに、ＢドメインはＦＶＩＩＩの凝固促進活性にとって重要では ない事、また活性な凝固促進蛋白は、Ｂドメインの一部または全てをコードして いるヌクレオチド領域を欠＜ＦＶＩＩＩ暗号化ＤＮＡの発現によって発現され分 泌される事も発見されていた。活性蛋白は産生され分泌されるだけではなく、こ れは完全な長さのＤＮＡにより発現される場合よりも高いレベルで媒質中に蓄積 される。

媒質中の活性凝固促進物質ＦＶＩＩＩ蛋白のレベルが低下するのは、少なくとも 部分的には幾つかの因子に起因する［例えばＷＯ３７１０４１８７、ＷＯ８７１ ０８０３ｓｓよびＷＯ８８１０３５５８参照］。

本発明は、組み替え技術によって、より高収量で、モして／またはヒトＦＶＩ　 Ｉ　Ｉの組み替え体よりもより均質な形で生産され得るハイブリッド凝固促進蛋 白をコードする新規ハイブリッドＤＮＡを提供するものである。さらに本発明の 蛋白は、より安定な凝固促進物質であり得、またはより安定な活性種を生じさせ ることができ、そして天然ＦＶＩＩＩに対する抗体によって阻害されず、従って このような抗体を用いた患者における出血疾患の処置に好ましい。

本発明のハイブリッド蛋白は、ｌまたはそれ以上のＦＶＩＩＩドメインの一部ま ｔ；は全ての代わりに、ＦＶの対応ポリペプチド部分を含む凝固促進活性または 凝固活性ＦＶＩＩＩ蛋白を含む。これらのハイブリッド蛋白をコードするＤＮＡ は、緊縮条件下でＦＶｌｌｌ、好ましくは人間の）”ＶＩ　Ｉ　Ｉをコードする ｃＤＮＡ、及びＦＶ。

好ましくは人間のＦＶをコードするｃＤＮＡとハイブリダイズすることのできる 、凝固促進または凝固活性（後に記載するような常套的検定により測定される） を有する蛋白をコードするＤＮＡを含む。

さらに、同義コドンが含まれなければこのようにハイブリダイズするであろうＤ ＮＡも勿論包含される。このＤＮＡはさらにＷＯ３７１０７１４４に開示される ように、例えば蛋白分解的開裂部位、硫酸化部位などをコードするｌまＩ；はそ れ以上の部位に於て、そして／またはＢドメインをコードする領域の内部での削 除により、修飾することができる。このＤＮＡはＷＯ３７１０７１４４に記載さ れるように、対応するＦＶサイト以外でさらに修飾することができる。

対応するＦＶＩＩＩ領域の代わりにＦＶ　Ｂドメインの一部または全てを含んで いるこれらのキメラ遺伝子によりコードされるハイブリッドＦＶＩＩＩ−ＦＶ蛋 白は、野生型ＦＶＩＩＩをもって典型的に得られるよりも高いレベルの発現を行 なうことができると考えられる。実際この事は、これまでに評価された事例に於 て真実であると思われる（例えば表ＩＩ参照）。さらに、生成する蛋白は一本鎖 を（例えば特定の蛋白分解的開裂部位がさらに修飾されている場合）または二本 鎖蛋白として取得し得るということが考えられる。

後者の場合、この蛋白は、ＦｖまたはＦＶＩ　Ｉ　ＩのＢドメインの蛋白分解的 切断時におけるおよそ９０ｋＤおよび８０ｋＤのサブユニットの複合体として、 または、〜９０ｋＤから約２００ｋＤまでの範囲の重鎖を伴う〜８０ｋＤの軽鎖 サブユニットの複合体として得られると考えられる。全ての場合に於て、得られ た蛋白は以下に詳細を記載するように、常套的凝固検定に於て凝固促進活性を保 持する本発明のＤＮＡ配列 本発明の一側面は、人間のＦＶＩＩＩと実質的に等しいポリペプチド配列または その変異体（ＦＶＩＩＩドメインの一部または全部をコードする１またはそれ以 上の部分を除いては、現在当分野で知られるまたは種々の特許出願に開示されて いるように修飾されている）をコードするＤＮＡ配列を提供するものである。こ のようなドメインの一つは、例えば、成熟Ｎ末端、Ａｌａ−１より始めた番号付 けでアミノ酸位置７４０から１６４９に至るＢドメインをコードしている。修飾 された領域内に於てこのＤＮＡ配列は、人間のＦＶペプチド配列、好ましくはＦ ＶＩＩＩに於て修飾されているものに対応する配列に等しいまたは実質的に等し いペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含んでいる。このＤＮＡ配列の 残りは天然のヒトＦＶＩＩＩをコードすることができ、または例えばＷＯ３６１ ０６１０１もしくはＷＯ８７１０７１４４に開示されるように、ポリペプチド配 列の一部を除去するためのさらなる修飾、および／または、例えば例示的オリゴ ヌクレオチド及び係る追加の修飾をもたらすための方法をも開示しているｗｏ８ ７１０７１４４に開示されるようなｌまたはそれ以上の特定部位に於ける修飾を 含むことができるということが理解されるべきである。

本発明に係る変異体ＤＮＡは、対立遺伝子変異、即ち個体から個体への自然変異 性に基づく配列の変異、または因子ＶｊＩＩｘｃ型凝固促進活性を保持する他の コドン置換もしくは削除を伴う変異をも含む。

従って本発明は、凝固促進蛋白をコードするＤＮＡ配列であって、そのＤＮＡ配 列が本明細書中に記載されるＢドメインをコードする領域内で修飾されている限 り、緊縮条件下でｐＳＰ６４−ＶＩ　Ｉ　Ｉに於ける野生型ヒ１−ＦＶＩＩＩ暗 号化ｃＤＮＡ挿入物（後に記載）とハイブリダイズすることのできる配列を包含 するものである。本発明のＤＮＡ配列は、緊縮条件下でヒトのＦＶｃＤＮＡ、例 えばｐＭＴ２−Ｖ（ＡＴＣＣＮｏ、４０５１５）におけるＦＶ　ｃＤＮＡ挿入物 とハイブリダイズすることもできる。

本発明のＤＮＡ配列の生成 本発明の全ての変異体ＤＮＡは、ヒトＦＶＩＩＩをコードするＤＮＡ配列を修飾 することにより製造することができる。この変異体ＤＮＡ配列は、ヒトの因子Ｖ ｌｌｌ：ｃまたはその類似体をコードするＤＮＡ配列の常套的部位指向性突然変 異生成により、および／または所望のＤＮＡ配列をライゲーションする事により 、生成できる。

ヒトの因子ＶＩＩＩ：ｃをコードするＤＮＡ配列がクローニングされた。この完 全な長さのヒトの蛋白をコードするｃＤＮＡおよび欠失類似体ｐＤＧＲ−２をコ ードするｃＤＮＡは、それぞれ受理番号ＡＴＣＣ３９８１２および５３１００の もとでＡＴＣＣに寄託されている。完全な長さのヒト因子ＶＩＩＩ／ｃ　ｃＤＮ Ａの製造および／またはヌクレオチド配列は、米国特許出願第５４６６５０号（ １９８３年ｌＯ月２８日出願）および６４４０８６号（１９８４年８月２４日出 願）並びに１９８５年５月９日に公開（公開番号Ｗ○８５１０１９６１号）され た国際特許出１［ＰｃＴ／ＵＳ８４１０１６４１号に詳細が開示されている。完 全な長さのヒトＦＶＩＩＩヌクレオチド配列を含む、ｐＳＰ６４−ＶＩ　Ｉ　Ｉ と称される９５２６４組み替えクローンは、受理番号ＡＴＣＣ３９８１２のもと でＡＴＣＣに寄託されている。

完全な長さのヒトＦＶ　ｃＤＮＡの製造及びヌクレオチド配列は、ジェニー等の 前記文献に開示されている。ジェニー等の上記文献に記載されているヒトＦＶ暗 号化ヌクレオチド配列を含む哺乳類の発現ベクターはｐＭＴ２−Ｖと称され、受 理番号ＡＴＣＣ４０５１５のもとてＡＴＣＣに寄託されている。

遺伝学的操作を単純化するために、部位指向性突然変異生成により独自の制限サ イトをＦＶＩＩＩおよびＦＶ　ｃＤＮＡ中に作り出した。このような技術は１ま たはそれ以上の塩基を置換または除去することにより特定の部位でｃＤＮＡを修 飾するためにも使用されている。このような突然変異生成法は、−末鎖ＤＮＡを 使用する、ヌクレイツク・アシズ・リサーチ１０巻６４８７−６５００頁（１９ ８２年）；メソッズ・イン・エンゲイモロジ−１００巻４６８−５００頁（１９ ８３年）；及びＤＮＡ３巻４７９−４８８頁（１９８４年）に記載のシラー及び スミスのＭ１３系、並びにヘテロ二本鎖ＤＮＡを使用するモリナガ等、バイオ／ テクノロジー６３６−６３９頁（１９８４年７月）の方法を含んでいる。このよ うな方法に従って使用される例としてのオリゴヌクレオチドを表Ｉに示す。本発 明に係る全ての変異体ＤＮＡは、組み立て例のために本明細書中に記載される方 法により当業者によって同様に生成できることが勿論理解されねばならない。

各々の因子をコードするｃＤＮＡ中にＭ　１　ｕ　Ｉサイトを導入することによ り、ＦＶＩＩＩ及びＦＶ間のドメインの簡便な交換が達成された。Ｍ　１　ｕ　 ＩはこれらｃＤＮＡのいずれの内部をも切断せず、またベクターの基幹をも切断 しないため、導入された独自のＭ　１　ｕＩサイトはＦＶＩＩＩおよびＦＶのｃ ＤＮＡ間のドメインを意図した通りに交換することを助ける。当然このようなサ イトが別のｃＤＮＡまたはベクターに存在する場合は、所望により係るサイトを 部位指向性突然変異生成によって移動させることができる。Ｍ　Ｉ　ｕ　１の代 わりに他の独自の制限サイトも同様にして導入することができ、または天然に存 在する制限サイトを簡匣性のためになくすことができることは理解されるべきで ある。加えてＭ　Ｉ　ｕ　ＩはＤＮＡ配列［５］　’−ＡＣＧＣＧＴ−［３’］ を認識するので、これはｔｈｒ−ａｒｇをコードするであろう。したがってＭ　 Ｉ　ｕ　Ｉサイトを特定の開裂サイト、例えばＮ末端残基がａｒｇであるトロン ビン開裂サイトに導入することが可能となる。この事は、その部位における甚だ しい配座の変化を避け、且つ生物学的活性に対する有意な妨害を避けるという希 望をもたらす。これまでの結果はこの目標に合致する。因子ＶおよびＶ［Ｉの間 のＢドメインの交換を媒介するために導入された特定のＭ　ｌ　ｕ　Ｉサイトは 、本発明のＦＶＩＩＩ　ｃＤＮＡにおいてはペプチド位置７３９−７４０　（コ ードされている配列−ＰＲ−を−ＴＲ−に変える）及び１６４７−１６４８　（ −ＱＲ−を−τＲ−に変える）に対応するヌクレオチド位置であり、本発明のＦ Ｖ、ｃＤＮＡにおいては７０８−７０９　（−１Ｒ−を−ＴＲ−に変える）及び １５４４−１５４５　（−ＬＲ−を−ＴＲ−に変える）の位置である。部分的制 限地図はここに示すとおりである：ＸｈｏＩ　Ｍｌｕｘ　Ｓａｌｘ Ｓａｌ工　Ｍｌｕｌ　ＢｓｔＥＩＺ　５ａｌ工Ｓａｌ工　ＢｓｔＥＩＩ　−Ｍｌ ｕｌ　、　Ｓａｌ工したがって、ＦＶ　Ｂドメインを伴うＦＶＩＩＩをコードス ル例示的ＤＮＡを組み立てるために、本発明者等は以下の図式を使用した。まず 、ＦＶＩＩＩ　Ｍ］ｕ１９０に発現ベクターをＭ　ｌ　ｕ　Ｉおよび５ａｉｌで 消化してＦＶＩＩＩ　Ｂドメイン及び軽鎖暗号化領域を切り取った。ＦＶＩＩＩ 　ＭｌｕＩ８０に発現ベクターを同様にして消化し、軽鎖をコードしているＭｌ ｕｌ−３ａ１１７ラグメントを単離した。このＦＶ発現ベクターＭＩｕ１７４に およｆ／Ｍｌｕ　Ｉ　９４ＫをＭ　ｌ　ｕ　ＴおよびＢｓｔＥＩＩで消化してＦ Ｖ　Ｂドメイン暗号化ＤＮＡを２つに切断した。次いで、得られたＤＮＡを下記 のようにライゲーションした： ０ＩＣ Ｘｈｏ工　Ｍｌｕｘ　Ｓａｌ工 ＦＶ　７３ドメイン暗号化領域をＦＶＩＩＩ暗号化配列の内部に正しり方向で含 んでいる、得られたベクターを同定し、ｐＭＴ２−ＶＩ　Ｉ　ＩＢ５と命名した 。所望により、５′及び３’Ｂドメイン連結部の−Ｔ　（Ｒ）−コドンは、常套 的位置指向性突然変異生成によって、それぞれ−Ｐ　（Ｒ）−及び−Ｌ　（Ｒ） −コドンに戻し得、または他の任意の所望コドンにできることに留意すべきであ る。

この工程はＢドメイン暗号化領域以外の領域まＩ；はＩ領域の一部を交換するた めに使用でき、また多数の交換を行なうｌ；めに反復することができ、そして所 望ならばもはや不要となったＭ　ｌ　ｕ　Ｉサイトの介入的破壊（突然変異生成 による）を伴うことができる。別法として、多数（例えば４．６．８、等）のＭ 　Ｉ　ｕ　Ｉサイトを例えば出発ベクター中に作り出して、交換すべき多数の領 域を規定することができる。この場合、得られたベクターを綿密に分析して、全 ての交換がいかなる所望のドメインの喪失または方向変化もなく適正に起こった ことを確認せねばならない。

Ｂドメイン交換の例は、本発明の一側面、即ち、Ｍ］　ｕ　Ｉサイトのごとき簡 便な制限サイトを因子ＶＩＩＩおよびＶをコードするＤＮＡの内部の異なったド メイン間の連結部に導入すること、及び、このようなりＮＡをＦＶＩ　Ｉ　Ｉ− ＦＶ融合蛋白をコードするハイブリッドＤＮＡの組み立てに使用することを説明 するものである。ドメインの境界の定義には幾らかの融通性があるということを 理解すべきである。例えば、ＦＶＩＩＩのＡｌドメインはアミノ酸残基３２９及 び３３６の間にその３′境界を有する。ＦＶＩＩＩのＡ２ドメインの５′境界は 残基３３７及び３７２の間にあると定義される。

ＦＶＩ　Ｉ　ＩＡ２ドメインの３′境界は残基６９８及び７４０の間にあると定 義される。ＦＶＩＩＩＡ３ドメインの５′境界は残基１６８９及び１７２１の間 であると定義される。ドメインの境界の定義における融通性は既に論じられてい る。例えばベーア等、上記；ケイン及びディビー、１９８８、ブラッド７１巻５ ３９頁；ジェニー等、上記、を参照されたい。＊ｇ！のため、ドメインの境界は トロンビン、活性化蛋白Ｃまたは因子Ｘａにより媒介される開裂のサイトとして 頻繁に採用する。勿論本発明は１またはそれ以上のドメインの一部の交換をも包 含する。

本発明のある特別の態様の実施においては、ＦＶＩＩＩおよびＦＶ暗号化ＤＮＡ 中にＭ　Ｉ　ｕ　Ｉサイトを１またはそれ以上の以下のドメインの境界にまたは その内部に作り出すことができる：ＦＶＩＩＩ： Ａ１　１　ココ９−３３６ 人２　コア２−３７７　７１１−７４０Ｂ　７４０　１６４８ λ３　１６Ｂ９　２０１９ Ｃ１２？ｙ２ｏ　２１７２ ｃ２　２１フ３　２３コ２ ｔ９酸↑生ドメイシ　３３６　コツ２ 畢そ鎖酉賢・ｒニドメイン　１６４９　１６８９Ｆｖ： Ａｌ　ｌ　３０３−３１７ Ａ２　３０３−３１７　６５６−６６３Ｂ　７ｏｓ　１５４５ Ａコ　１５４５　１８７７−１８８３ Ｃ１１日７７−１８８コ　２ｏコロ ＊　アミノ酸番号は完全なＦＶＩＩＩまたはＦＶポリヌクレオチドについて表示 する。

したがって別のドメイン交換の一例として、ＦＶ　Ａ２ドメインを、同様に生成 されたハイブリッドＤＮＡの発現により、ＦＶＩＩＩ　Ａ２ドメインの代わりに 挿入することができる。例えばＭ　Ｉ　ｕ！サイトはＦＶＩＩＩおよびＦＶ発現 ベクター中、Ａ２ドメインの５′及び３′境界に作り出すことができる。次いで Ｍ　１　ｕ　！フラグメントをこのベクターから切取り、ＦＶ　Ａ２暗号化領域 をＦＶＩＩ■発現ベクターにライゲーションすることができるが、このベクター からは、ＦＶＩＩＩ　ｃＤＮＡ中に導入されたＭ］　ｕ　Ｉサイトの位置により ＦＶＩＩＩ重鎖酸性領域を保存しつつまたは保存せずに、対応するＡ２暗号化領 域が切り取られである。

ＤＮＡ交換の他の例は、ｌまたはそれ以上のＦＶ　ＤＮＡ領域を、非対応領域の 代わりにＦＶＩＩＩ　ＤＮＡ中に挿入、例えばＦＶＩＩＩ　ＡｌドメインをＦＶ 　Ａ２ドメインと置換することを含む。

Ｂドメインの全体まｊ；は一部の交換の外に特に興味深いのは、ＦＶｌｌ１重鎖 の中及び軽鎖Ｃ２ドメインの中の特定の面領域に対する修飾である。Ｃ２ドメイ ン中、最もＣ末端のｔｏｏ−２００のアミノ酸残基内における修飾がとりわけ興 味深い。重鎮に対する修飾は、天然の配列ＦＶＩＩＩに比較して、より高い収量 で生産されるＦＶＩＩＩ変異体を提供し、一方、重鎮及び軽鎖の両領域における 修飾は、ある「阻害」患者においてはＦＶＩＩＩに対する抗体との交叉反応を受 けにくいＦＶＩＩＩ変異体を提供する。

より詳細なＦＶＩＩＩ重鎖及び軽鎖の図式的表示を下に示すが、ここで、特定の ドメインに名称を付け、酸性領域を斜線で示し、連結部のＣ末端アミノ酸位置を 特記した：１銀　・ ドーーーーーーーー人１−−−−−−−）　Ｖ／／／ドー−−一一一λ２−−− −−−−−＞Ｉ＼＼＼＼＼１軽頷 １　／／／／　ｌ　＜−−−−−−−一人３−−−−−−−＞ｌ＜−−−Ｃ１− −＞ｌ＜−−Ｃ２−−−＞１したがって、本発明に係るＤＮＡおよび蛋白種は、 Ａ１１Ａ２、Ａ３．ＣＩおよびＣ２ドメインの１またはそれ以上が全体または部 分的にＦＶ由来の対応配列に置換されている態様を含む。ＦＶＩＩＩおよびＦＶ のドメインの対応は当分野で良く知られており、例えばケインおよびディビー、 １９８８、ブラッド７１巻（３）：５３９−５５５頁にかなり詳細に示されてい る。

例えばＦＶＩＩＩの重鎮ドメインの一部が対応するＦＶ配列に置換されている態 様において、この置換はＦＶＩＩＩ領域の１−２２５．２２６−３７２．３３６ −５６２および／または５６２−７４０の位置であり得る。ＦＶＩ　Ｉ　Ｉ軽鎖 における部分的ドメイン置換を含む態様においては、この置換はＦＶＩＩＩの１ ６４８−１７２１１１６８９−２０２０．２０２０−２１７３８よび／または２ １７３−２３３２の位置由来の領域内であり得る。本発明のある態様は、重鎮及 び軽鎖の両領域でこのように修飾される。天然のＦＶＩＩＩ配列の置換に用いら れるＦＶ配列の領域は、対応するＦＶＩＩ■領域より長いことも短いこともあり 得るということは認識されるべきである。この事は、例えばケインおよびディビ ー、１９８８、上記、の第４図から明らかである。所望の変異体をコードするＤ ＮＡ配列をＭｌｕｌ（例えば）制限フラグメントのライゲーションにより生成す るか、部位指向性突然変異生成によるか、またはその両者の組合せによるかは、 通常、簡便性により決定する。

このドメイン交換工程が所望の発現ベクター以外のベクターにおいて行なわれる 場合は、本発明の変異体をコードする新しいＤＮＡ配列を、突然変異生成ベクタ ーから切取り、好ましくは哺乳類の細胞において発現のｔ；めの適当なベクター 中に導入することができる。

一時的にトランスフェクトされた、または永続的に形質転換された宿主細胞によ りもたらされた凝固促進活性は、血漿試料に対する標準検定によって測定できる 。

表１：　オリコ”スフレ２チド。ｌＩ＞’Ｊ名季生　ψ　西乙シ・」　・象　罠 ５ｃｒａａｎ　７４０　２．　５噌（ＴＴＧ　ＡＡＡ　ＣＴＣＧＴＡ　ｃｃｒ） ３　Ｉ　会（１）Ｓｃｒａａｎ　１６４８　４．　５’（ＧＣＣＡＴＡ　ＣＧＣ ＧＴＧ　入入入）］’　＊（３）６、　５１（入ＧＡ　ＧＣｋ　ＣＧＣＧＴＡ　 ＧＣＴ）３′　慟（５）Ｓｃｒｅｅｎ：３７２　８．５’（ＣＣＡＡＡＣＧＣＧ ＴＴＣＡＧＴ）３’　＊（７）Ｓｃｒ＠ｅｎ　２２６　１０．５’（入ＴＣＴＡ ＣＧＣＧ　ＴＧＣＣＴＧ）３’　会（９）Ｓｃｒｅｅｎ　３３６　１２．５’（ ＣＣＡ　ＡＡＣＧＣＧ　ＴＡＴ　ＧＡＡ）３１　会（１１）Ｓｃｒａａｎ　５６ ２　１４．５’　（ＧＴＡ　ＧＡＴ　ＡＣＧ　ＣＧＴ　ＧＣＡ）コ書　會（ｌコ ）Ｓｃｒｅｅｎ６９８　１６．５’（ＴＣＡＧＡＣＡＣＧＣＧＴＡＡＣ）３’　 ”（１５）Ｓｃｒｅｅｎ　１３１３　２０．５’（ＣＧＴ　ＡＧＴ　ＡＣＧ　Ｃ ＧＴ　ＧＣＴ）３”　慟（１９）Ｓｃｒｅｅｎ　１７２１　２２．５’（ＴＡＡ 　ＧＡＡ　ＣＧＣＧＴＧ　ＣＴＣ）コ轡　會（２１）Ｓｃｒａａｎ　２０２０　 ２４．５’（ＡＣＡ　ＧＣＡ　ＣＧＣＧＴＴ　ＧＴＣ）コツ　會（２コ）Ｓｃｒ ｅｅｎ　２１７：ｌ　２６．５’（ＧＡＴ　ＴｒＡ　ＡＣＧ　ＣＧＴ　ＴＧＣ） ３’　會（２５）［第Ｖ内シ］ 鶴　見刈　・勘策 Ｓｅｎ　７０９　２Ｌ　５’　（ｋＧＧ　ＡＡＣＧＣＧ　ＴＴＣＡＴＴ）：ｌ’ 　☆（２７）Ｓ（：ｎ１５４５３０．５＋（ＴＡＣＡＣＧＣＧＴＡＧＣＡＡ）］ ’　＊（２９）ｓｅｎ　コ４８　コ２．　入Ａ　ＡＡＡ　ＡＣＧ　ＣＧＴ　’ｒ ＣＴ　ＣＡＧ　＊（３１）Ｓｃｎ　５０６　コ４．　ＧＧＡ　ＣＡＣＧＣＧ　Ｔ ＧＧ　ＡＡＴ　倫（３コ）Ｓｃｎ　５０５　３６．　ＣＣＴ　ＧＡＣＧＣＧ　Ｔ ＣＧ　ＡＧ　＊（コ５）Ｓｅｎ　１０１８　３Ｂ、ＴＡＴ　ＣＴＡ　ＣＧＣＧＴ Ａ　ＣＣＴ　☆（３））ＳｃＮ　１７６５　４０．　Ｔ　ＴＣＴ　ＡＣＧ　ＣＧ τ　ＣＴＣＡＣ＊（コ９）Ｓｅｎ　コＤ　４２．　Ｇ　ＡＡＡ　ＡＴＴＡＣＧ　 ＣＧＴ　ＧＡＧＣ会（４１）Ｓｅｎ　６４］　４４＋　ＣＴＡＧＴＡＣＧＣＧＴ ＡＧＣＡ　会（４コ）Ｓｃｎ　１８７Ｂ　４６．　ＧＧＡＣＡＣＧＣＧＴＴＧＴ ＡＧ　＊（４５）Ｓｃｎ　２０３フ　４Ｂ、ＧＧＴＡＡＣＧＣＧＴｌ”ＧＴＴＣ 會（４））＊　括弧内に示されたオリゴヌクレオチドにつし１て起こった突然変 異生成のスクリーニングに使用。置換アミノ酸番二対するコドンに下線を付しで ある。当業者には認識できるであろう力（、オリゴヌクレオチドにおいて各々１ まｊ；はそれ以上のコドンを除去すること（こより、まｔ；は、所望アミノ酸に 対するコドンを置換することにより、ｌまたはそれ以上のアミノ酸の除去におけ る使用のため、まブこｉ１異なる（置換）アミノ酸を所望の部位に挿入するｔこ めに、第１ノゴヌクレオチドを容易に組み立てることができる。変更したし１元 のコドンの置換まｔ；は除去によって、他の突然変異生成オリゴヌクレオチドが 、所望のサイトに至るおよそ２０−５０ヌクレオチド配列を基礎として設計でき る。

本明細書中に記載する真核細胞の発現ベクターは当業者に良く知られる技術によ って製造できる。微生物のレプリコン、選択遺伝子、くエンハンサ−、プロモー ター等のようなベクターの構成要素は天然の供給源から取得、または既知の方法 により合成できる。カウフマン等、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロ ジー１５９巻６０１−６２１頁（１９８２年）：カウフマン、グロシーディング ズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシダ８２巻６８９−６９３ 頁（１９８５年）を参照されたい。本発明の変異体の製造に有用な真核生物の発 現ベクターは、さらに当分野で知られる誘導可能なプロモーターを含み、または 誘導可能な発現系を含み得る。

形質転換されｔ；セルラインを含む確立したセルラインは宿主として好適である 。正常な二倍体細胞、−次組織のインビトロ培養から誘導される細胞株、そして −次外植片（造血幹細胞のような比較的未分化の細胞を含む）もまた適当である 。選択遺伝子が優位に働いている限り、候補となる細胞は遺伝子型のうえで選択 遺伝子を欠失している必要はない。

宿主細胞は好ましくは哺乳類のセルラインで確立する。ベクターＤＮＡを染色体 ＤＮＡ中に安定に統合するため、そしてその統合されたベクターＤＮＡを引続き 増幅するためには、共に常法により、ＣＨＯ（チャイニーズ・ハムスターの卵巣 ）細胞が現在では好ましい。別法としてベクターＤＮＡはウシ乳頭腫ウィルスゲ ノムの全体または一部を含むことができ（ラスキー等、セル、３６巻３９１−４ ０１頁（１９８４年）、安定なエピソームの要素としての０１２７マウスの細胞 のようなセルラインに導入することができる。その他の使用可能な哺乳類のセル ラインは、Ｈｅ　Ｌ　ａ　ｓサルのＣＯ５−１細胞、ポウニス（Ｂｏｗｅｓ）細 胞のような黒色腫セルライン、マウスＬ−９２９細胞、スイス、Ｂａ１ｂ−ｃま たはＮＩＨマウス由来の３Ｔ３ライン、ＢＨＫまたはＨａＫハムスターセルライ ン等を含む。

いずれの型の発現ベクターを使用する場合でも、変異体ＦＶＩＩＩ　ＤＮＡをｖ ＷＦまたはその類似体をコードするＤＮＡ配列と共に、または燐脂質の存在下で 、例えばＷＯ３７１０６１０１およびｗｏ８８１０８０３５に記載のように同時 発現させるのが好ましい。

サラニ、アプロチニンのようなプロテアーゼ阻害剤を例えば約〜０゜Ｏｌ−〜５ ％、好ましくは０．５−１．０％（容量／容量）（アプロチニン、１５−３０） リプシン阻害剤単位（ＴＩＵ）／ｍｌ、シグマ）の量で、または、他のプロテア ーゼ阻害剤の対応する活性単位量を含有する培地中で、蛋白を発現させるのが好 ましい。

標準的免疫学的または活性検定により、安定な形質転換体を凝固促進産物の発現 についてスクリーニングする。凝固促進蛋白をコードしているＤＮＡの存在は、 サザン・プロッティングのような標準的手法により検出できる。サルＣＯ３−１ 細胞のような適当な宿主細胞中への発現ベクターＤＮＡの導入後数日間における 一時的な凝固促進遺伝子の発現を、選択せずに培地中の蛋白の活性または免疫学 的検定により測定する。

常套的手段により変異体ＤＮＡを発現させた後、こうして産生された蛋白を、全 て既知の方法により、回収し、精製し、そして／または物理化学的、生化学的、 及び／または臨床的特質について特性決定することができる。

本発明の蛋白は、ヒトの因子ＶＩ　Ｉ　Ｉ　：ＣまたはＦＶに対する適当なモノ クローナル抗体と結合するはずであり（即ち、認識されるエピトープが所望の蛋 白に存在する場合）、よってこのような抗体を用いる免疫親和クロマトグラフィ ーによって、及び／または常套的なＦＶＩＩＩ精製法によって回収及び／または 精製することができる。そのうえこれらの化合物は凝固促進活性を有するはずで ある。

本発明にしたがって生産された蛋白は、薬学上許容し得る、例えば非経口的に許 容し得る媒質、及び／または１またはそれ以上の賦形剤と共に、当分野で知られ る方法を用いて、薬学上許容し得る製剤に製剤化することができる。

非経口投与に好適な、このような薬剤は、簡便性のために該蛋白の滅菌凍結乾燥 調製物を含有させることができ、これは滅菌溶液の添加により再構成されて好ま しくは被投与者の血液と等張な溶液を生成することができる。製剤は、単位また は複数用量容器、例えば封入されたアンプルまたはバイアルで与えられ得る。こ れらの使用はヒト因子ＶＩＩＩ（またはｌもしくはそれ以上のＦＶ　Ａおよび／ またはＣドメインが存在する場合はＦＶ）と同様であるが、力価を考慮して適当 に調整する。

本発明は以下の説明的実験例および手法を参考に、より良く理解できるであろう が、これらは純然たる例であり、本発明の真の範囲を限定するものと解してはな らない。

プラスミドの由来 Ａ、ＦＶＩ工Ｉ 異なったベクターの間で配列が混ざってしまう不都合を最小限にするため、因子 ＶＩＩＩ　ｃＤＮＡの突然変異生成を、発現プラスミド中で直接実施した。一般 に突然変異生成のＩ；めに取られる研究方法は、修飾を施したモリナガの方法か ら導かれたものであった。

この研究法は、因子ＶＩＩＩ発現プラスミドにおいて都合のよい独自の制限サイ トを有するプラスミドの組み立てによって容易となる。

以下に、独自のＥｃｏＲＶ、ＨｐａＩ、ＣＩａＩおよびＸｂａＩ制限サイトを有 する因子ＶＩＩＩ発現プラスミドの組み立てを説明する。プラスミドｐＭＴ２は 、受理番号ＡＴＣＣ６７１２２の下でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレク シコンに寄託されているｐＭＴ２−ＶＷＦのＥｃｏＲＩ消化によって得られる。

ＥｃｏＲＩ消化はｐＭＴ２−ＶＷＦに存在するｃＤＮＡ挿入物を切り取り、線状 のｐＭＴ２を生成し、これをライゲーションして、大腸菌ＨＢＩＯ１またはＤＨ −５をアンピシリン耐性に形質転換するのに使用することができる。プラスミド Ｉ）ＭＴ２のＤＮＡは常法により製造できる。次に、ｐＭＴ２をＥｃｏＲＶおよ びＸｂａＩで消化し、この消化されたＤＮＡをＤＮＡポリメラーゼＩのタレナラ フラグメントで処理し、そしてＣｌａリンカ−（ＮＥバイオラブズ、ＣＡＴＣＧ ＡＴＧ）をライゲーションすることによって、ｐＭＴ２ＶＩＩＩを組み立てた。

この事により、ＳＶ４０複製起点付近のＨｉｎｄＩＩＩサイトから始まる塩基２ １７１−２４２１及びｐＭＴ２のエンハンサ−配列（ｐＭＴ２のＣ］ａＩ誘導体 ）が除かれる。因子ＶＩＩＩｃＤＮＡを５ａｌＴでｐｓＰ６４ＶＩ　Ｉ　Ｉから 切取り、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑化し、そしてＥｃｏＲ１アダプターを付 加した（ＡＡＴＴＣＣＴＣＧＡＧＡＧＣＴ）、次いでＥｃｏＲ１適合化因子Ｖｌ ｌｌ　ｃＤＮＡを、ｐＭＴ２のＣＩａＩ誘導体のＥｃｏＲエサイトにライゲーシ ョンした。得られたプラスミドをｐＭＴ２−ＶＩＩＩと称する。

Ｂ、ＦＶ ＦＶ　ｃＤＮＡの突然変異生成を、発現ベクター及びクローニング往復ベクター の両方で実施した。この突然変異生成方法は、モリナガ、上記より修飾を施して 導いた。

ＦＶの発現に使用する発現ベクターはｐ　Ｍ　Ｔ　２誘導体でもあっｔ；。

プラスミドｐＭＴ２　ＤＮＡはｐＭＴ２−ＶＷＦ　（ＡＴＣＣ６７１２２）から 、既に記載しＩ；ように線形で取得した。次にＥｃｏＲＩサイトを、５ａｌＩサ イトを含むアダプターへのライゲーションにより修飾した（下記参照）。次いで ＥｃｏＲＶおよびＸｂａＩにより消化し、この消化されｆ：　Ｄ　Ｎ　Ａ　ｔ− Ｄ　Ｎ　Ａポリメラーゼエのタレナラフラグメントで処理し、モしてＣ１ａｌリ ンカ−をライゲーションすることにより、ｐ　Ｍ　Ｔ　２のＣ１ａｌ誘導体を組 み立てた（Ｎ。

Ｅ、バイオラブズ、ＣＡＴＣＧＡＴＧ）。このことにより、ｐＭＴ２　ＳＶ４０ 複製起点の初期サイドにおけるＨ４ｎｄＩＩＩサイトから右回りに番号を付けて ２２６７−２４２１の塩基、及びエンハンサ−配列が除かれる。

ＦＶ　ｃＤＮＡは、オリゴｄＴをプライマーとして付けたヒトの胎児肝ｃＤＮＡ ライブラリーから誘導されたＦＶ　ｃＤＮＡの一部をそれぞれ含む２個の重複す るカロン２１Ａλ組み替え体から組み立てた（ジェニー等、上記参照）。

以下の手法を用いて完全な長さのｃＤＮＡを組み立て、並列するＤＮＡ配列を除 去した。λＶ４０１クローンを５ａｃＩＩで消化してＦＶ　ｃＤＮＡを除き、こ れを５ａｃ１１線状化ブルースクリプ１−ＫＳ　（＋）クローニングベクター（ ストラタジーン）にライゲーションし、プラスミド４０１Ｂ５−６を得た。Ｈｈ ａｌで消化（ＦＶ　ｃＤＮＡにおけるヌクレオチド４１）Ｌ、ＤＮＡポリメラー ゼＩのタレナラフラグメントで処理し、そして次にＢｇｌＩＩで消化（ＦＶ　ｃ ＤＮＡにおけるヌクレオチド４２７５）することにより、４０１Ｂ５−６からλ ＤＮＡ配列を除去した。これにより、並列するλ配列を持たない４２３４ｂｐ平 滑Ｂｇｌｌ１７ラグメントが得られた。この４２３４ｂｐフラグメントをライゲ ーションによってブルースクリプトＫＳ　（＋）のＥｃｏＲＶおよびＢａｍＨＩ クローニングサイトの中に挿入して、プラスミドＢｌｕ４０１を生成させた。

＾ｖｌの５ａｃＩＩ消化により、λｖ１クローン中のＦＶ　ｃＤＮＡを除去した 。次いでこのＳａｃ　１１７ラグメントを線状化５ａｃｌｌブルースクリプトＫ Ｓ　（＋）クローニングベクターにライゲーションしてプラスミドＶＩＢＳＩＯ を得た。次にＶＩＢＳＩＯをＨｐａｌで消化（ＦＶ　ｃＤＮＡにおけるヌクレオ チド６８５４）し、以下のＥｃｏＲＩ修飾アダプター：にライゲーションして、 プラスミドＢｌｕＶｌ−Ｒ１を得た。

完全な長さのＦＶ　ｃＤＮＡを含む発現ベクターの組み立てには、３個の制限サ イトが重要であった。ブルースクリプトＫＳ（＋）のポリリンカークローニング 領域中の５ａｌｌサイトは、Ｆｖ　ＣＤＮＡ配列の５″にある独自の５ａｌＩサ イトを提供する。さらに、Ｂｌｕ４０１及びＢｌｕＶｌ−Ｒ１の両プラスミドに 存在するＦＶｃＤＮＡには独自のＢｓｔＥＩＩサイト（ヌクレオチド３６６６） もある。独自の５ａｌｌサイトは、ＢｌｕＶｌ−Ｒ１の３′末端に導入されたＥ ｃｏＲＩ修飾アダプターの添加から得られる。

組み替え体Ｂｌｕ４０１はＦＶ　ｅＤＮＡの５′末末端列に貢献し、一方ＢＩｕ Ｖ１−Ｒ１は無傷のｃＤＮＡの３′末端を含んでいる。ｐＭＴ２誘導体、Ｂ］ｕ ４０１及びＢＩｕＶｌ−Ｒ１由来の３個の制限７ラグメントを、トリス酢酸塩中 １％の低融解温度アガロースゲル上の電気泳動で精製した。３６２５ｂｐＳａ　 ］　ｌ−Ｂｓ　ｔＥｌｆフラグメントの単離は、汚染し同時拡散した７ラグメン トを際くためのＸＭＮＩによる消化によってもまた促進された。ｐＮＴ２発現ベ クターは５ａｌｌ消化により線状化し、付いて子牛の腸のホスファターゼで処理 した。３個の７ラグメント：　（ｉ）３６２５ｂｐ　５ａｌＩ／ＢｓｔＥＩＩ　 Ｂ］ｕ４０１フラグメント、（ｉｉ）３１８８ｂｐ　５ａｉｌ／ＢｓｔＥＩＩ　 Ｂｌｕ　Ｖｌ−Ｒ１フラグメント、及び（ｉｉｉ）ＳａｌＩ消化ｐＭＴ２、をラ イゲーションして発現プラスミドｐＭＴ　２−Ｖを生成し、これを受理番号４０ ５１５の下でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託した。

完全な長さのＦＶ　ｃＤＮＡを含む第二のプラスミドをブルースクリ、ブトＫＳ 　（＋）において組み立てた。Ｂ１ｕ４０１を５ａｃＩＩ　（ブルースクリプト クローニングポリリンカーの３′サイト）およびＢｓｔＥＩＩ（ＦＶ　ｃＤＮＡ におけるヌクレオチド３６６６）で消化した。ブルースクリプトベクター配列お よびＦＶ　ｃＤＮＡの５′末端から始まりＢｓｔＥＩＩサイトに至るＦＶ配列の ３６２５ｂｐフラグメントを含むこのフラグメントを単離した。ＢｌｕＶｌ−Ｒ Ｉ　ＤＮＡをＢｓｔＥＩＩ（ヌクレオチド３６６６）およびＳａ　ｌ　Ｉ　（Ｅ ｃｏＲＩ修飾アダプターの３′）で消化して、ＦＶｃＤＮＡ配列の３′末端を含 むおよそ３９００ｂｐの７ラグメントを解放した。このフラグメントはλＤＮＡ 配列を尚含んでいるため、正確な大きさは明らかでない。ＢｓｔＥＩＩ／５ａｃ ｌＩ　Ｂｌｕ４０１およびＢｓｔＥＩＩ／５ａｃｌＩ　Ｂｔｕ　Ｖｌ−Ｒ１をラ イゲーションしてプラスミドＢｌｕＶを生成した。

ＢｌｕＶの５ａｌＩ消化によりλＤＮＡ配列を除去し、５ａｌ１７ラグメント上 に含まれる無傷の完全な長さのＦＶ　ｃＤＮＡ　（６８１３ｂｐ）を単離した。

ブルースクリプトＫＳ（＋）を５ａｌｌ消化により線状化し、子牛の腸のアルカ リホスファターゼで処理し、そして完全な長さのＦＶ　ｃＤＮＡを含む５ａｌ１ ７ラグメントにライゲーションした。Ｂ　ｌ　ｕＫＳＶ△λと命名された得られ たプラスミドは、λ配列の全く無い完全な長さのＦＶ　ｃＤＮＡを含む。

突然変異生成 （１）以下のＤＮＡ調整物を用いて突然変異生成を実施した。プラスミドｐＭＴ ２−ＶＩ　Ｉ　ＩをＣＩａＩで線状化し、子牛の腸のホスファターゼで処理し、 そして低融解温度トリス酢酸塩アガロースゲル上で分離した。次いで線状化ＤＮ Ａのバンドを、シリカジオキサイドへの吸着により抽出し、トリスＥＤＴＡで溶 出するか、またはフェノール抽出及びエタノール沈澱により抽出した。ｐＭＴ２ −ＶＩＩＩの第二のロットをＫｐｎｌ−ＸｈｏＩ、Ｋｐｎｌ−Ｅｃ。

ＲＶまたはＥｃｏＲＶ−ＸｂａＩで消化し、このＤＮＡフラグメントを低融解温 度アガロースゲル上での電気泳動により分離し、上記のように抽出した。プラス ミドｐＭＴ２−ＶをＮｈｅＩで線状化し、子牛の腸のホスファターゼで処理し、 低融解温度トリス酢酸塩アガロースゲル上の電気泳動により分離した。この線状 化したＤＮＡバンドをフェノールで抽出しエタノール中で沈澱させた。このＤＮ ＡペレットをトリスＥＤＴＡ中に再懸濁した。ｐＭＴ２−Ｖの第二のロフトをＡ ｐａＩおよびＤｒａ　Ｉ　Ｉで消化し、このＤＮＡフラグメントを低融解温度ア ガロースゲル上で分離し、上記のように抽出した。プラスミドＢ　］　ｕＫＳＶ をＳａｃ　Ｉ　Ｉで線状化し、子牛の腸のホスファターゼで処理し、このＤＮＡ を低融解温度アガロースゲル上の電気泳動により分離した。Ｂ　Ｉ　ｕＫＳＶの 第二のロフトをＥｃｏＲＶおよびｓｐｈ　Ｉで消化し同じ方法で分離した。ＤＮ Ａ７ラグメントは記載したようにフェノールで抽出した。

（２）適当なプラスミド各ｊｕｇを混合し、容量を１８ｕｌに調節し、２ＮＮａ ＯＨ２，Ｏｕ　ｌを加えた。

（３）この混合物を室温で１０分間変性し、次いで０．０２ＮＨＣ１、およびＯ ，ＩＭトリスＨＣＩ　（ｐＨ８，０）の溶液１８０ｕ　１で中和した。

（４）燐酸化した突然変異誘発性オリゴヌクレオチド２０ピコモルをヘテロ二本 鎖混合物４０ｕ１に加えた。

（５）この混合物を６８℃のヒートブロックに９０分間装いた。

インキュベージコン後、混合物を室温で徐々に冷却させた。

（６）各々の突然変異誘発反応に対し、ヘテロ二本鎖オリゴヌクレオチド混合物 ４０ｕ１を使用した。この反応は、２ｍＭＭｇＣＩ８．１ｍＭβ−メルカプトエ タノール、４００ｕＭ　ＡＴＰ、１１００ｕデオキシヌクレオチド三燐酸、大腸 菌ＤＮＡポリメラーゼＩのフレナラフラグメント３−４単位／ｕｌ及びＴ４ＤＮ Ａリガーゼ４００単位／ｕｌで行なった。

（７）反応物を室温で１０分間インキュベートし、１６℃に変えて一夜インキユ ベートした。

（８）７ｚノール−クロロホルム抽出及びエタノール沈澱により反応を停止させ 、得られたベレットを７０％エタノールで洗浄し、滅菌水１０ｕ】中に再懸濁し た。

（９）次いでＤＮＡをコンピテントな細菌ＨＢＩＯＩまたはＤＨ−５の形質転換 に使用した。５ｘＳＳＣ，０，１％ＳＤＳ、５ｘデンハート試薬、及び１１００ ｕ／ｍ＋の変性鮭精子ＤＮＡ中の１ｘ１０’ｃｐｍ／ｍｌのｓ！Ｐ標識化スクリ ーニングオリゴヌクレオチドを用いて、アンピシリン耐性コロニーをスクリーニ ングした。

（１０）算出されたオリゴヌクレオチドプローブの融解温度より５度低い温度で 、フィルターを５ｘＳＳＣ，Ｑ、１％ＳＤＳで洗浄した。

（１１）確実にハイブリダイズしているクローンからＤＮＡを調製し、まず異な った制限酵素による消化及びアガロースゲル電気泳動によって分析した。ＤＮＡ をニトロセルロースに移しフィルターを調製し、突然変異生成オリゴヌクレオチ ドが正しいフラグメントに導入されたことを確認するためにスクリーニングプロ ーブとハイブリダイズさせた。

（１２）次いでＤＮＡを大腸菌に再導入し、アンピシリン耐性コロニーをスクリ ーニングオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションについてスクリーニン グした。

（１３）ＤＮＡ配列決定により最終的な突然変異を確認した（例えばサンガー等 、１９７７、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイ エンシズＵＳＡ、７４巻５４６３−５４６７頁）。

実験手法及び検定方法 本発明のハイブリッドＤＮＡでトランスフェクトさせたＣＯ５−１サル腎臓細胞 による一時的な該蛋白の発現によって、ＦＶＩＩＩ−ＦＶハイブリッド蛋白の活 性を分析した。ＣｓＣｌ中でＤＮＡをバンド化することによりプラスミドＤＮＡ を調製し、記載したようにＣＯ３−１をトランスフェクトさせるのに使用した（ カウフマン、１９８５、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・ オブ・サイエンシズＵＳＡ、６８９頁）。トランスフェクトの６０時間後に、条 件設定した培地をＦＶＩＩＩまｔ；はＦＶ活性検定用に取った。ＦＶＩＩＩは、 カビ・コーチスト（ｃｏａｔｅｓｔ）色素産生検定法（カビ）により、または、 トロンビン活性化の前及び後のＦＶＩＩＩ欠損血漿の凝塊形成能（活性化部分的 トロンボプラスチン時間、ＡＰＴＴ）により検定する。ＦＶはトロンビン活性化 の前及び後のＦＶ欠損血漿の凝塊形成能（ＡＰＴＴ）によって検定する。変異体 分子の合成及び分泌を分析するために、そしてＭ　ｌ　ｕ　１制限サイト（Ｔｈ 　ｒ−Ａｒ　ｇ）の導入がいかなる突然変異した開裂サイトにおける開裂をも変 えていないことを確認するために、トランスフェクトされた細胞をトランスフェ クトの６０時間後に６時間３＄３−メチオニンで標識し、条件設定した培地及び 細胞抽出物を調製して、抗ＦＶＩＩＩまたはＦＶ特異性抗体を用いる免疫沈降及 び５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上における沈降物の電気泳動によって分析し た。

実施例 実施例１：９０ｋＤａ　ＦＶＩＩＩ開裂サイトの変更因子ＶＩＩＩの９０ｋＤａ 開裂サイトの突然変異生成を、ｐＭＴ２−Ｖｌｌｌ由来のＫｐｎ−ＥｃｏＲＶｌ ｏ、ｌｋｂフラグメント及びＣ１ａｌ線状化ｐＭＴ２−ＶＩＩＩ　ＤＮＡを間隙 へテロ二本鎖の生成に用いた、記載（モリナガ等、バイオテクノロジー８４巻６ ３６−６３９頁）されるような間隙へテロ二本鎖法により実施した。突然変異生 成オリゴヌクレオチドは表工のＮｏ、ｌであり、スクリーニングオリゴヌクレオ チドは表Ｉの１５量体　Ｎｏ、　２である。得られた変異体が正しいことをＤＮ Ａ配列決定（サンガーら、１９７７、ＰＮＡＳ７４巻５４６３頁）により立証し た。得られるＤＮＡ　（Ｍｌｕ　Ｉ　９０Ｋ）は、ＣｓＣｌ中での平衡に対して バンド化することにより調製し、上記のこと＜ＣＯ５−１細胞中にトランスフェ クトした。３５５−メチオニン標識化細胞抽出物及び条件設定しＩ；培地の免疫 沈降及びゲル電気泳動による分析は、合成された因子ＶＩＩＩが野生型因子ＶＩ ＩＩと大きさ及び量の上で似かよっており、そしてトロンビンによって適正に開 裂することを示した。カビ−コーチスト活性検定によって測定されるように（表 ＩＩ）、この突然変異生成は因子ＶＩＩＩの活性に影響を及ぼさなかった。

実施例Ｉ　Ｔ　：　８０ｋＤａの因子ＶＩＩＩ開裂サイトの変更Ｃ１ａｌ線状化 ｐＭＴ２−ＶＩＩＩ　ＤＮＡおよびｐＭＴ２−ＶＩＩＩのＥｃｏＲＶ−Ｘｂａｌ 　９．２ｋｂフラグメントを用いて間隙へテロ二本鎖を製造することにより、８ ０ｋＤａ開裂サイトの突然変異生成を実施した。突然変異生成オリゴヌクレオチ ドは表ＩのＮＯ３３であり、スクリーニングオリゴヌクレオチドは表ＩのＮｏ、 ４である。得られた変異体が正しいものであることを上記のＤＮＡ配列決定によ り立証した。得られるＤＮＡ（Ｍｌｕ１８０Ｋ）を調製し、上記のごと＜ＣＯ３ −１細胞中にトランスフェクトした。

カビ−コーチスト法による分泌されたＦＶＩＩＩ活性の分析ならびに５１５−メ チオニン標識細胞抽出物及び条件設定した培地の免疫沈降及びゲル電気泳動によ る分析は、この因子ＶＩＩＩが適切に分泌され、トロンビンにより開裂され、且 つその補因子活性の点で変わっていないことを証明した（表ＩＩ）。

実施例Ｉ１１：ＦＶＩＩＩにおける７３ｋＤａ開裂サイトの突然変異生成 表Ｉの４４量体オリゴヌクレオチドＮｏ、５及び表Ｉのスクリーニングオリゴヌ クレオチドＮｏ、６を利用して、実施例ＩＩに記載のように突然変異生成を実施 した。得られｆ：ＤＮＡ　（Ｍ　Ｉ　ｕ　１７３ｋ）が正しいものであることを ＤＮＡ配列決定により立証した。この得られたＤＮＡを前記のようにＣ０３Ｉ細 胞にトランスフェクトした。合成された蛋白は、因子Ｖｌｌｌ活性及び発現レベ ルの両方の点て野生型ＦＶＩ　Ｉ　Ｉと類似していた（表ＩＩ）。

実施例ＩＶ：９４ｋＤａ因子Ｖ開裂サイトの突然変異生成ｐ　Ｍ　Ｔ　２　Ｖの Ｎｈｅ　Ｉ／Ａｐａ　Ｉ　Ｉ　０．２ｋｂフラグメント及びＤｒａＩｌｌｌ、８ ｋｂ線状化ｐＭＴ２Ｖをもって調製した間隙へテロ二本鎖を使用して、因子Ｖの ９４ｋＤＡ開裂サイトの突然変異生成を実施した。突然変異生成オリゴヌクレオ チドは表■の４３量体ＮＯ，２７及び表■の１５量体スクリーニングオリゴヌク レオチドＮｏ、２８であった。得られたＤＮＡ　（Ｍｌ　ｕ　Ｉ　９４Ｋ）が正 しいことをＤＮＡ配列決定により確認し、前記のようにＣＯ３−１細胞にトラン スフェクトした。得られた分泌された蛋白は、トロンビン活性化前及び後の因子 Ｖ凝塊形成検定により、そして細胞の５ｓｓ−メチオニン標識による因子Ｖの合 成及び分泌の分析により、そして免疫沈降させた因子Ｖの５ＤＳ−ポリアクリル アミドゲル電気泳動による細胞抽出物及び条件設定された培地の分析により測定 されるように、野生型因子Ｖと量が似かよっていた。

実施例Ｖニア４ｋＤａ因子Ｖ開裂サイトの突然変異生成り　］　ｕＫＳＶ△λの ＥｃｏＲＶ−３ｐｈ１９．Ｏｋｂフラグメント及び５ａｃ１９．８ｋｂ線状化Ｂ １ｕＫＳＶ△λをもって間隙へテロ二本鎖を調製することにより、そして突然変 異生成オリゴヌクレオチド（Ｎｏ、２９、表Ｉ）及び１５量体スクリーニングオ リゴヌクレオチド（Ｎｏ、３０、表工）を使用して、前記のように突然変異生成 を実施した。得られたＤＮＡ　（Ｍｌ　ｕ　Ｉ　７４Ｋ）が正しいものであるこ とをＤＮＡ配列決定により確認した。

実施例ＶＩ：ＦＶ　Ｂドメインを有するＦＶＩ　Ｉ　ＩをコードしているＤＮＡ の調製 以下の手法を用いて因子ＶＩＩＩ／因子Ｖのハイブリッドを組み立てた。因子Ｖ ＩＩＩ発現プラスミドＭｌｕＩ９０Ｋを５ａｌｌおよびＭ　Ｉ　ｕ　Ｉで消化し 、大きな７．２ｋｂ７ラグメントを低融解温度アガロースゲル上の電気泳動によ り単離した。因子ＶＩＩＩ発現プラスミドＭＩｕ１８０ＫをＭ　ｌ　ｕ　Ｉおよ び５ａ１１で消化し、小さな２．３ｋｂフラグメントを低融解温度ゲル上の電気 泳動により単離した。因子ＶＢドメインは２個の７ラグメント：ｌ）プラスミド Ｍ１ｕ１７４ＫをＭ　ｌ　ｕ　ＩおよびＢｓｔＥＩＩで消化して因子ＶＢドメイ ンの１．１ｋｂ３′末端を得る、モして２）プラスミドＭＩｕＩ９４ＫをＭｌ　 ｕ　ＩおよびＢｓｔＥＩＩで消化して因子ＶＢドメインの１．４ｋｂ５’末端を 得る、から組み立てた。これらのフラグメントは低融解温度アガロースゲル上の 電気泳動後に単離した。

′　ハイブリッドを低融解アガロース中で上記７ラグメントの４方向ライゲーシ ヨンにより組み立てた。大量の制限エンドヌクレアーゼ消化及びゲル電気泳動分 析により、そして因子Ｖ−因子ＶＩＩＩ連結部前後の配列決定により、このハイ ブリッドが正しく組み立てられたことが立証された。得られたＤＮＡ、ｐＭＴ２ −ＶＩ　Ｉ　ｌＢ５ｔ−ＣＯ３−１細胞にトランスフェクトし、下記のごとく分 析した。

因子ＶＩＩＩの活性をカビ−コーチスト検定法により測定した（表ＩＩ）。対照 実験において野生型因子ＶＩＩＩを二本鎖分子として発現させ分泌させる。因子 Ｖは一重鎖ポリペプチドとして分泌され、ＦＶＩ　Ｉ　ｌｌ７）１０−４０倍高 いレベルで発現される。このハイブリッドは、恐らくは細胞からより効率的に分 泌される結果としてであろうが、野生型ＦＶＩ　Ｉ　１蛋白の２−４倍高い活性 を示した。３＠ｓ−メチオニン標識した条件設定した培地の分析は、ハイブリッ ド蛋白が因子Ｖよりわずかに小さな見かけの分子量（およそ３’００ｋＤａ）を 有して拡散する一末鎖ポリペプチドとして分泌されることを示した。適当な開裂 産物が、電気泳動に先立つトロンビン消化によって得られた。さらに、このハイ ブリッドは因子Ｖｌｌｌの重鎮に特異的なモノクローナル抗体によって、そして 因子ＶのＢドメインに特異的なモノクローナル抗体によって免疫沈降し、この事 は、この蛋白が正確に折り畳まれていることを示唆した。

実施例ＶＩＩ：ＦＶ軽鎖にょるＦＶＩＩＩ軽鎖の置換プラスミドＭ　ｌ　ｕ　Ｉ 　９０　Ｋを５ａｌＩおよびＥｃｏＲＶで消化し、８．９ｋｂ因千Ｖｌｌ１重鎮 をコードする７ラグメントを単離する。

因子Ｖｌｌｌ　ＢドメインをＭｌ　ｕ　１８よびＥｃｏＲＶによる消化によりＭ 　ｌ　ｕ　Ｉ　８０　ＫまたはＭｌｕ１７３Ｋから単離し、各々１１７８及び１ ０５４ｂｐの７ラグメントを単離する。２．ＯｋｂＭ］ａＩ−５ａ１１因子Ｖ軽 鎖をコードするフラグメントをＭ　１　ｕ　１７４Ｋから単離する。標準的技術 によりこのフラグメントを３方向ライゲージ履ンで組み立てる。これによって、 もし１１７８ｂｐフラグメントを使用すれば因子ＶＩＩＩの軽鎖の酸性領域を含 むハイブリッドが得られ、また１０５４ｂｐフラグメントの使用によっては該酸 性領域を欠くハイブリッドが得られるであろう。

実施例ＶＩＩＩ：ＦＶ重鎖によるＦＶＩＩＩの重鎖の置換ＦＶｌｌｌのＢドメイ ン及び軽鎖をコードする〜９．９ｋｂＸｈｏｌ−ＭＩｕ１７ラグメントをＭ１ｕ Ｉ９０Ｋから単離し、〜２゜３ｋｂ　Ｓａｌｌ−Ｍｌｕｌ　ＦＶ重鎮暗号化フラ グメントをＭ１ｕ１９４Ｋから単離する。これらをライゲーションしてプラスミ ドＶＩＩＩＨＣＶを生成し、これをＣＯ３−１細胞にトランスフェクトし、３ｓ Ｓ−メチオニン標識した条件設定した培地の免疫沈降によって分析した。このハ イブリッドは、ＣＯ５細胞により同様に産生される野生型ＦＶＩＩＩの〜２０− ５０倍高いレベルで、−末鎖ポリペプチド及び二本鎖ポリペプチド種の両者とし て分泌される。

酊・う程闇、粧 第Ｖエエエロ５化狂； 二　１．Ｘｌ２ＪＬ　−ム剋 ｐ町２−Ｖ　＋　＋　＋　− ｐＭＴ２−Ｖエエエ　５２　４０　２１８　１６６ｐＭＴ２−Ｖ工ｌｌＢ５　ｉ ｌｌ　７９　４２Ｂ　２８４Ｍ１ｕ工９０Ｘ　ＮＤ　３０　ＮＯ１３０，１４６ Ｍ１ｕ工ＥＩＯＸ　ＮＤ　３０　ＮＤ　１６０．１７６Ｍ１ｕ工７コＸ　ＮＤ　 ３５　ＮＤ　９５．　１２０箪Ｖ（ト）５滉性： 旦ΩＪ１ ｐＭＴ２−Ｖ　１０５１ ０５Ｏ工９４１Ｋ　Ｂ７５．　８５０ Ｍ１ｕエフ４Ｋ　９００．６５０ 実施例ＩＸ：ＦＶ軽鎖によるＦＶＩＩＩ軽鎖の置換プラスミドＭ　］　ｕ　Ｉ　 ７３　ＫをＭ　Ｉ　ｕ　Ｉおよび５ａｉ１で消化して〜１０．１ｋｂ　ＦＶＩＩ Ｉ軽鎖をコードするフラグメントを切り取る。プラスミドＭ　ｌ　ｕ　１７４　 ＫをＭ　Ｉ　ｕ　Ｉおよび５ａｌＩで消化して〜２０４５ｂｐ　ＦＶ軽鎖を切取 り、次いでこれを単離し、ＭｌｕＩ／５ａｌｌ消化Ｍ　ｌ　ｕ　１７３　Ｋプラ スミドＤＮＡとライゲーションする。得られたプラスミドは、ＦＶＩ　Ｉ　Ｉ重 鎖、ＦＶＩＩＩＢドメイン、ＦＶＩＩＩ軽鎖酸性領域及びＦＶ軽鎖を含むハイブ リッド蛋白をコードしている。もしＭ　１　ｕ　Ｉ　８０　Ｋの代わりにＭｌｕ １８０Ｋを使用すると、酸性領域を伴うＦＶＩＩＩ軽鎖をコードする〜９．９５ ｋｂフラグメントが切り取られる。したがってハイブリッド蛋白はその酸性領域 を欠くであろう。

実施例Ｘ：ＦＶの対応する要素によるＦＶＩＩＩ軽鎖及びＢドメインの置換 一組の重複する合成オリゴヌクレオチドを製造し、燐酸化し、ライゲーションし て以下の合成りＮＡを生成する：コ（’）　合ＲＤ　Ｎ　Ａ　ハ、ＦＶＩＩＴの ８０及び７３ｋＤ開裂ザイトの間に存在する酸性領域をフードするＭ　Ｉ　ｕ　 １カセツトを表わす。別法として、実施例ＩＩおよびＩＩＩに個別に記載したよ うに、Ｍｌｕｌサイトは表Ｉのオリゴヌクレオチド＃３および＃５を用いてＦＶ ＩＩＩ発現ベクターの８０及び７３ｋＤサイトに導入することもできる。次いで 、対応するカセットをＭ　ｌ　ｕ　Ｉによって単にベクターから切り取ればよい 。次にこのカセットを、実施例ＶＩでＭ　Ｉ　ｕＩ７４Ｋから単離したＭ　Ｉ　 ｕ　Ｉ　／　Ｂ　ｓ　ｔ　Ｅ　Ｉ　Ｉフラグメントにライゲーションし、そして 、部分的ＦＶ　Ｂドメイン暗号化７ラグメントに対し正しい方向にライゲーショ ンされたＦＶＩ　Ｉ　Ｉ酸性領域暗号化７ラグメントを含む得られたＭ　Ｉ　ｕ 　Ｉフラグメントを単離する。

次いで実施例Ｖｌの方法により、このフラグメントを、Ｍ１ｕＩ９０にのＳａ　 ］　Ｉ／Ｍｌ　ｕ　Ｉフラグメント、Ｍ　ｌ　ｕ　Ｉ　９４　ＫのＭ　Ｉ　ｕ１ ／ＢｓｔＥＩｌｙラグメント（共に実施例ＶＩにおいて取得）、及びＦＶ軽鎖を コードするＭ　ｌ　ｕ　１７４　ＫのＭＩｕＩ／５ａ１１フラグメントにライゲ ーションする。このハイブリッドが正しく組み立てられていることを実施例Ｖｌ のようにして立証する。得られるＤＮＡ、ｐＭＴ２−ＶＩ　Ｉ　ＩＢ５／ＬＣ５ は、Ｎ末端からＣ末端の順に、酸性領域を伴うＦＶＩＩＩ重鎖、ＦＶ　Ｂドメイ ン、ＦＶＩＩＩ軽鎖由来の酸性領域、及びＦＶ軽鎖を含むハイブリッド蛋白をコ ードしている。

実施例ＸＩ：ＦＶＩＩＩ　Ｂドメインの除去及びその軽鎖のＦＶ軽鎖による置換 実施例Ｘを以下の修飾を施して反復する。ＦＶＩＩＩ軽鎖酸性領域をコードして いるＭ　Ｉ　ｕ　Ｉカセットを、ＭＩｕＩ／５ａｌＩ消化ＭＬｕＩ９０Ｋ　ＦＶ ＩＩＩプラスミド、及びＦＶ軽鎖をコードしているＭ　ｌ　ｕ　Ｉ　７４　Ｋの ＭｌｕＩ／５ａｌＩフラグメントに直接ライゲーションする。正しく組み立てら れたハイブリッドｃＤＮＡは、ＦＶＩＩＩ軽鎖から誘導された酸性領域によりＦ Ｖ軽鎖と連結したＦＶＩＩＩ重鎖を含む蛋白をコードしている。

実施例ＸＩＩ：Ａ２、Ｂ、Ａ３、ＣＩおよびＣ２ＦＶＩＩＩドメインの置換 Ａ、ＦＶＩＩＩ軽鎖酸性領域をコードするＭ　Ｉ　ｕ　Ｉカセットを、ＦＶ　Ｂ ドメインのＣ末端部分をコードするＢｓｔＥＩＩ／ＭｌｕＩ　ＦＶフラグメント にライゲーションする。このようにして得られた、ＦＶＩＩＩ軽鎖酸性領域に結 合したＦＶ　ＢドメインのＣ末端部分をコードする、正しい方向のＢｓｔＥＩｔ ／ＭｌｕＩ反応産物を、ＦＶ軽鎖をコードするＭ　Ｉ　ｕ　Ｉ　７４由来のＭ　 Ｉ　ｕ　Ｉ　／　Ｓ　ａ　１１７ラグメントにライゲーションする。正しい方向 を有するＢｓｔＥＩＩ／５ａｌｌフラグメント（フラグメント「Ａ」）を同定し 、ゲル精製する。

Ｂ、　ペプチド位置３１２−３１３のＡ２ドメインをコードしている領域のちょ うど５°に導入されたＭ　Ｉ　ｕ　Ｉサイトを有するＦＶベクターを、オリゴヌ クレオチド＃４１を用いて製造する。ＦＶＡ２及び部分的ＦＶ　Ｂドメインをコ ードするＭ　Ｉ　ｕ　Ｉ　／　Ｂ　ｓ　ｔ　ＥＩＩフラグメントをここから切取 り、ゲル精製する（フラグメント「Ｂ」）。

Ｃ０ペプチド位置３７２のＦＶＩＩＩ　Ａ２領域に対しちょうど５゛に導入され たＭ　ｌ　ｕ　Ｉサイトを有するＦＶＩ　Ｉ　Ｉベクターを、オリゴヌクレオチ ド＃７を用いて製造する。次いでこのベクターをＭ　１　ｕ　Ｉおよび５ａｉｌ で消化して、ＡＩ及び重鎮酸性領域のみを残し殆どのＦＶＩＩＩ暗号化領域を切 り取る。次に、より大きなＭＩｕＩ／５ａｉｌフラグメントをゲル精製し、７ラ グメントＡおよびＢにライゲーションする。正しい向きの得られたベクターは以 下の暗号化領域を有する： ＦＶエエ工 国際調査報告

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．標準的凝塊形成検定により測定される凝固促進活性を有する蛋白をコードす るＤＮＡであって、緊縮条件下でヒトのＦＶＩＩＩをコードするｃＤＮＡ配列お よびヒトのＦＶをコードするｃＤＮＡ配列とそれぞれバイブリダイズすることの できるＤＮＡ。
2. ２．ＦＶＩＩＩ　Ｂドメインの代わりにヒトＦＶのＢドメインを含んでいる、ヒ トＦＶＩＩＩのポリペプチド配列をコードする請求項１に記載のＤＮＡ。
3. ３．請求項１に記載のＤＮＡを含む発現ベクター。
4. ４．請求項２に記載のＤＮＡを含む発現ベクター。
5. ５．請求項１のＤＮＡを含み、且つこれを発現できる宿主細胞。
6. ６．請求項２のＤＮＡを含み、且つこれを発現できる宿主細胞。
7. ７．請求項１または２に記載のＤＮＡを含み、且つこれを発現できるよう遺伝学 的に操作された宿主細胞を、該ＤＮＡを発現させ、且つその結果生産される蛋白 の生産をさせる適当な条件の下で培養することからなる、凝固促進蛋白の生産方 法。
8. ８．請求項１または２に記載のＤＮＡによりコードされる凝固促進蛋白。
9. ９．薬学上許容し得る媒質と混合された請求項８の蛋白を含有する薬学的組成物 。
10. １０．請求項７の方法により生産された蛋白を含有する薬学的組成物。