JPH04501662A - 混合給送組換え酵母発酵 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 混合給送組換え酵母発酵 本発明は、一般的に発酵技術のすぐれた改良と関連しており、特に組換え酵母の 生産の改良を目指した、組換え酵母宿主菌株での、制御された高生産するかたち で異種タンパク質をコードしている異種遺伝子の発現によって生産される、その タンパク質の増量された量での調製を可能にするものである。したがって、本発 明は、異種遺伝子産物の回収を最大限にするような、高い細胞濃度の発酵に於け る組換えタンパク質の生産を可能にする、所定の組換えで利用されている酵母宿 主の増殖及び培養技術のすぐれた改良を利用する。本発明は、特にピキア　パス トリス（Ｐｉｃｈｉａ（Ｐ、）ｐａｓｔｏｒｉｓ）酵母宿主との利用に適してい るが、同等な培養特性及び感受性を持って全ての酵母宿主、すなわち、例えばハ ンセヌラ　ポリモルファ（ｈａｎｓｅｎｕｌａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）も本発 明によればうまく利用できると推測される。

大量の生物学的に有用な異種遺伝子産物つまり異種ポリペプチドの生産のために 、（酵母宿主に対する）異種遺伝子の発現が大量の発酵に用いられている組換え 宿主システムでの使用に、酵母宿主菌株が特に適用できることが分かっていた。

これらの酵母宿主は、原核生物と真核生物双方の利点を結びつけているようであ り、また組換え発酵を設定する際の開発が最大限に調査可能であるような、容易 に操作できる性質を備えているため、特に組換えシステムに適している。例えば 、原核生物のように、酵母は比較的速い増殖速度を持つ単細胞生物でありかつ比 較的容易に、所定の異種遺伝子に制御要素を操作可能に配置しである異種ＤＮＡ カセットで形質転換される。その上、高等真核生物に特有と通常考えられている 利点を備えており、それは、グリコシレージョン構造を組込むための器官や、よ くみられる場合としては、異種遺伝子産物をより容易に宿主酵母組織の支持培養 培地から回収可能にするような分泌経路の利用のようなものである。

最近酵母宿主Ｐ、バストリスが大いに注目を集めている。このメチル栄養性酵母 は高レベル異種遺伝子発現用の顕著な酵母として示されていた。おちにピキア発 現システムの総合的成功は、その主要なアルコールオキシダーゼ（＾０Ｘ１）遺 伝子のプロモーターの強さと結びついており、前述の強さは、メタノール存在下 で増殖すると純粋なＰ、パストリス抽出物中のタンパク質の３０％までをアルコ ールオキシダーゼ酵素が占めるという観察により示されている。ＡＯＸ１遺伝子 のプロモーターは１９８５年という早い時期から単離、クローン化されＰ、バス トリスに形質転換されている。そのほかのこのメチル栄養性酵母宿主の重要な特 ｉは、単純なメタノール−栄養物−塩培地で高細胞濃度に経済的に達することが できるということである。このような条件下でとキアは肝炎Ｂウィルス表面抗原 、インヴエルターゼ、動物リゾチームＣそのほかを含む異種遺伝子産物の高レベ ルの生産が可能であることが示されている。これらの異種遺伝子産物には、産物 が宿主細胞を支持している培地中に分泌され、その培地がら単離できるようなピ キア分泌過程によって認識されるという利点をさらに持つものもある。

増殖にメタノールを利用できる酵母の報告は、１９６０年代後半に初めて現れた 。その後、はんの数種のメチル栄養性酵母しか同定されていない、それらは、カ ンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）　、ハンセヌラ、ビキ乙トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏ ｐｓｉｓ）という名の４属に属する。これらの属でのメタノール利用の生化学的 経路が明らかにされており頚似していることが示されている。“メチル栄養性” という言葉は、他の炭素源栄養分の中で、メタノールで増殖する酵母能力を示す 、研究者は、メタノールとグルコース混合物を同時に、あるいはほがの、ギ酸、 グリセロール、リボース、ソルビトール、キシロース栄養分との混合炭素源をこ れらの菌株は利用可能であることを発見した。グリーソンら（Ｃｌｅｅｓｏｎ） 　、　Ｙ　ｅ　ａ　ｓ　ｔ　４．１　（１９８８）参照。

研究は、ハンセヌラという特定の属の酵母、特にメチル栄養性種ハンセヌラポリ モルファについても行われている。この研究は増殖速度を促進するための支持培 地の機構の研究に焦点を当てており、炭素制限連続培養装置培養システムでの異 なる組成の培地からの種による炭素利用の研究を含んでいる。全ての混合物につ いて調査した結果、類似した利用パターンが展開されることが明らかになり、そ れは、低希釈率ではメタノールと高次炭素源は同時に利用されるが、より高希釈 率では高次炭素源（すなわち−炭素より多い炭素からなる化合物）を細胞は好ん で利用して、他方、たいてい、使用されなかったメタノールは培養培地中に集積 されたというパターンであった。イーグリら（Ｅｇｌ　ｉ）　、Ｂｉｏｔｅｃｈ ｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ２８．１７３５（１９８６ ）及び同様な研究についての報告としてそこに挙げられている多種の引用文献参 照。

同じ研究室の研究者らは、メタノールを高比率で含む炭素源（Ｃ１とｃ６）の混 合物を使用した場合、メタノールに対する一定の増殖産は、メタノールを唯ムの 炭素源として使用した場合のメタノールによってみられる増殖産に対応して記録 されていた。さらにこの研究者らは、例えばグルコースが培地中に高レベルで存 在すると、メタノール代謝経路を抑制することを発見した。グルコースが制限さ れた濃度で存在すると、メタノール経路の脱抑制が観察された。この後者のシス テムでメタノール濃度を増加すると、メタノールによるメタノール代謝経路の誘 導が観察された。誘導の程度は混合基質混合物でのメタノールの増加している比 率にともなって増加することが分かった。イーグリ＾ｒｃｈｉｖｅｓ　ｏｆ　Ｍ ｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ１３２、Ｈ１９８２）、参照イーグリら、Ｍｉｅｒｏｂ ｉａｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　ｏｎ　ｃｌ　Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ、クロフォードら（Ｃ ｒａｗｆｏｒｄ）ｅｄｓ、、Ａｍｅｒｉｃａｎ　５ｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　Ｍｉ ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ｄAｃ、（１９８ ４）；イーグリら、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ ｌｏｇｙ　１３２，１７７９（１９８６）；エーゲリングら（ＥＨｇｅ　ｌ　ｉ 　ｎｇ）＾ｒｃｈｉｖｅｓ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　１２７，１１９ （１９８０）；エーゲリングら、＾窒■ ｈｉｖｅｓ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　１３２，３６２（１９８１）； ハゼウら（Ｈａｚｅｕ）Ｂｉｏｔｅｃｈ　１ｅｔｔｅｒｓ　T，３９９ （１９８３）　；ミュウラーら（ｍｕｅｌｌｅｒ）＾ｐｐｌ　、Ｍｉｃｒｏｂ、 Ｂｉｏｔｅｃｈ、２５，２３８（１９８６）　；シュバルッら（ｓｗａｒｔｚ） ＾ｐｐ１．Ｅｎｖｉｒ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏ１．４１．１２０６（１９８１）。

といった様々な先だった仕事についても注目が向けられている。

これら先の研究者は皆、連続培養装置システムで仕事をしていたので、制御され た研究において全体の培養培地中の特定の栄養分の濃度の変化を引き起していた 。さらにこれらの研究者たちは、研究に組換えられていない生物の培養液、及び 比較的低濃度の培養液を使用した。したがって、これらの研究者たちは、宿主酵 母生物が変異を起こす、あるいはそうでなければ外来の遺伝子とその機能する産 物をとりのぞくという、遺伝的負担の影響を受けにくいシステム、そして、最大 限に細胞培養量を開発するように高培養密度を用いたときに生じることが知られ ている不整による問題がないシステムで、実験していた。

そのうえ、この研究者らは、高密度発酵と関わるほかの問題を避けていた。とく に、高密度発酵はしばしば、高基質供給材料濃度の供給および／あるいは供給材 料の高率の付加によって支持されている。このパラメーターは相方とも、多炭素 基質代謝の副産物であるエタノールを増殖培地中に集積し得るという点で、酵母 の生理機能に影響することが知られている。エタノールはアルコールオキシダ引 き起こし得る。

対照的に、組換え酵母システムについての研究は、バイオテクノロジー産業にお いて利用可能な量の単離および回収するために異種産物の生産レベルを最大限に するような、高密度、高度開発培養操作技術を必要とする。これらの宿主細胞は 、強化された培養改良によって起こる、増殖パターンの変動を受けやすくする培 養技術に、極度にさらされるだけでなく、それらの周りの環境に対しての新来者 である異種遺伝子産物の莫大な生産量に耐性がなければならない。この宿主の生 物学的な反応は、変異を誘発することで異種タンパク質の生産を除くあるいは外 来遺伝子とその産物そのものを取り除こうとすることであると予測される。

さらに、高密度培養は、さらに、アルコールオキシダーゼプロモーターからの転 写効率を抑えるエタノールの副産の増加という問題を生じる。

したがって、比較的広密度の、組替えられていない野生型酵母培養連続装置シス テムに間して先の研究者により得られるかも知れない結果は、別個のことなる組 換えシステムをもちいたとき研究成果とは関係がない。このことから、従来技術 は、例えば、組換え宿主システムでの高生産操作培養をしたときの結果を示唆す る基盤になりえない。

本発明は、 （１）栄養培地がメタノールをすこしあるいはまったく含まない高濃度多次炭素 源からなる、増殖培地中で成育可能な酵母細胞の密度が増加するのに十分な期間 、組換え遺伝子産物を全く発現させずに生産しない高増殖過程（２）該酵母宿主 のメタノール代謝経路を脱抑制するのに十分な期間、制限された量の多炭素炭素 源栄養を給供する事 （３）低多炭素炭素源栄養を維持してメタノール濃度を増加させている間、発酵 培養が組換え遺伝子産物を高生産する状態に維持することを可能にすることから なる培養の混合栄養給供、細胞増殖、遺伝子誘導法を用いた培養組換えメチル栄 養性酵母宿主からの、組換えタンパク質の連続増量獲得を可能にする予想できな い結果に基礎をおいている。

したがって、本発明は組換えメチル栄養性酵母宿主培養からの組換え遺伝子産物 生産を増量する方法に基づいており、その方法では、該遺伝子産物は、メタノー ル反応性発現制御要素と操作可能に関連している組換え遺伝子配列の発現によっ て作られていて、その方法は （ａ）栄養培地がメタノールをすこし、あるいはまったく含まない高濃度多炭素 炭素源からなる増殖培地中で成育可能な酵母細胞の密度が増加するのに十分な期 間、組換え遺伝子産物を全く発現させずに生産しない高増殖過程（ｂ）該酵母宿 主のメタノール代謝経路を脱抑制するのに十分な期間、制限された量の多炭素炭 素源栄養を給供する事 （ｃ）低多炭素炭素源栄養を維持してメタノール濃度を増加させている間、発酵 培養が組換え遺伝子産物を高生産する状態に維持することを可能にすることから なる培養の混合栄養給供、細胞増殖、遺伝子誘導法を用いた該培養組換えメチル 栄養性酵母宿主の培養からなる。

産生物を作るように設計された微生物の培養によって、組換え遺伝子産物を製造 する業界でよく理解されているように、発明に沿って製造された産物は、通常酵 母培養液から回収され精製されるが、組換え遺伝子産物を含む無細胞培養培地が 培地から産物を分離しなくても、使用できる場合や、組換え遺伝子産物を含む細 胞あるいは細胞の一部（例その膜画分）が、細胞あるいはその一部から産物を分 離しなくても使用できる場合、また細胞と培地両方を含み、組換え遺伝子産物を その片方あるいは両方に含んで直接利用できる様な場合がある。酵母培養からの 組換え遺伝子産物の回収と精製は、業者によく知られている多数の方法とれでも 行うことができる。組換えメチル栄養性酵母宿主では発明の方法が、組換え遺伝 子産物の生産を改良するために実践されていて、その宿主は業界で知られており 、組換え遺伝子産物をコードする遺伝子配列、および組換え遺伝子産物をコード する遺伝子配列と発現について操作可能に関連している、メタノール反応性発現 制御要素から成る組換えＤＮＡで、メチル栄養性酵母を形質転換し、形質転換さ れた酵母を選択することからなる既知の方法によって得られる。

第１図はメタノールのみ（白四角）、４：１グリセロール−メタノール混合物（ 黒四角）、２：１グリセロール−メタノール混合物（黒ひし形）あるいは、制限 グリセロール／非制限（ＮＬ）メタノール混合物（白ひし形）でＭｕｔ−（メタ ノール利用欠損）株を１リットル発酵したときの誘導状態にあるウシリゾチーム Ｃ２の濃度を時間でプロットしたものである。

第２図はメタノールのみ（白ひし形）、制限グリセロール／非制限（ＮＬ）メタ ノール混合物（白四角）でＭｕｔ−株を、あるいは制限したメタノール使用法下 で増殖しているＭｕｔ十株（黒四角）を１リットル発酵したときの誘導状態にあ るウシリゾチームＣ２の濃度を時間でプロットしたものである。

第３Ａ図はメタノールのみでＭｕｔ−株を１リットル発酵したとき（白四角）、 １０リットル発酵したときく黒四角）の誘導状態にあるウシリゾチームＣ２の濃 度を時間でプロットしたものである。

第３Ｂ図は混合グリセロール−メタノール供給材料でＭｕｔ−株を１リットル発 酵したとき（白四角）、１０リットル発酵したとき（黒四角）の誘導状態にある リゾチーム濃度を時間でプロットしたものである。

発明の詳細な説明 本発明を、組換えピキアパストリス酵母宿主での主要なアルコールオキシダーゼ （ＡＯＸ）遺伝子プロモーター制御下でのウシリゾチームＣ２の生産をモデルシ ステムとして描いてより具体的に記述する。自律的複製プラスミドやエピソーム あるいは染色体に、広いパライエティーの望ましい組換え産物（例、メチル栄養 性酵母宿主にとって異種のポリペプチド）のいずれかをコードするＤＮＡを持つ 、そのＤＮＡがメタノール反応性制御要素の制御下で発現しているほかのどのメ チル栄養性酵母宿主のひとつを用いても発明は同等に実施されることがわかって いる。これらの望ましい産物には、ヒトリゾチーム、ヒト過酸化還元酵素、ヒト 上皮性成長因子（ＥＧＦ）（１−５２）と（１−４８）がある。

その望ましいＷ３様では、混合給送法である本発明は、グリセロールを増殖用炭 素源、メタノールを増殖と異種遺伝子発現の誘導両方用の炭素源として使用する 。

２種の供給材料は、共同して働き、より効率的な細胞増殖と異種遺伝子発現を可 能にする。

発酵混合給送法はＭｕｔ＋、Ｍｕｔ−菌株両方の増殖の有利な方法であり、それ ぞれ完全、不完全なＡＯＸ１遺伝子をもつ。機能し得るＡＯＸ１遺伝子が欠損し ているため、Ｍ　ｕｔ−株は、Ｍｕｔ＋株にくらべてメタノールでは増殖がたい へん遅い。この性質は、組換えＭｕｔ−株の発酵処理を必要とするし、メタノー ルが炭素源の時Ｍｕｔ、十株に比べてかなり長い時間を必要とする。混合給送発 酵法により得られた利点１つは、Ｍｕｔ−株がより時間効果的に、すなわち大い に量的生産性において増殖し製品を合成することが可能になった点である。連続 発酵でも混合給送の使用によってＭｕｔ＋、Ｍｕｔ−株の量的生産性を増加でき る。

比較的高レベルの異種遺伝子発現を維持すると同時に発酵に必要な熱仕事量と酸 素を減少するので、発酵器き給送法はＭｕｔ＋、Ｍｕｔ−菌株両方にとって有利 である。はとんどの発酵体は熱と酸素の移動容量が制限されているため、そして 細胞密度と生産性は、発酵器の熱と酸素の移動容量と関連しているので、生物の 冷却と酸素要求の減少はみな、細胞性生産性の能力の上昇を起こすはずである。

発明された方法で増殖した菌株は、またメタノールのみより混合給送の方が迅速 に増殖する。

細胞増殖と遺伝子誘導の混合給送法は、連続的及び供給前発酵どちらにおいても 操作可能である。

混合給送発酵でのＭｕｔ＋、Ｍｕｔ−細胞増殖方法を、以下に簡単に記述する。

発酵は大きく３つにわけられる段階でおこなわれており、第一に、２％グリセロ ールをくわえたＹＮＢ（酵母ナイトロゲンベース）で増殖した細胞を、４％また はよりたかいグリセロールの培地を含む発酵器に接種する。この粂件ではＡＯＸ １プロモーターでは抑制されてるので、組換え産物は作られない。細胞のエネル ギーは、かわりに細胞密度の増加にむけられる。

細胞密度が、グリセロール枯渇において望ましいレベルにたつした後、細胞密度 は１−１０−容器巾約３５ｇ、／１（乾燥ｗｔ）、２Ｌ容器中２０ｇ／Ｉであり 、細胞は、発酵のグリセロール制限供給群形態を開始される。このグリセロール 供給は約・４から１２時間、たいていは約４から６時間持続し、ＡＯＸ１プロモ ーターが抑制から完全に脱抑制された状態に徐々に移行することを可能にする。

供給前発酵の混合給送過程は、通常３０時間目に開始し、望ましくは約４０時間 以上継続するが、メタノール供給の、例えば４：１あるいは２：１（グリセロー ル：ＭｅＯＨ）比での、開始によって始められる。供給されるグリセロールとメ タノールは両方、１２ｗ＋ｌ／ＬのＹＴＭとＴＭ微量金属を含む。

Ｍｕｔ−細胞にとって望ましい方法では、グリセロールとメタノールが２：１の 比で、移行状Ｒ後約８時間発酵器に供給されて、細胞が正常に増殖し、ＡＯＸ１ プロモーターが完全に脱抑制することを確実にする。その後、メタノール供給率 は、残余メタノール濃度が０．１から０．８％の間になるように増加され、一方 グリセロール供給は一定である。

供給前発酵の混き給送過程後、基本的な塩の供給の開始により、連続的発酵を始 めることが可能である。スープと細胞全体は、ＭｅＯＨ、グリセロール、基礎的 な塩の付加される割合で供給器から移されるので、供給器の容量は一定に保たれ る。（供給器容量により決定される流出速度は、希釈速度として知られている特 徴的な数値を与える。） メタノール過剰形態での増殖に比較して、混合給送過程では一貫してＭｕｔ−株 での生産性がより高くなることが可能である。Ｍｕｔ十株では、混合給送過程は 、他の増殖方法に比べて同等で、高くてもそれほど変わらない生産性を持つ。

実施泗 、　シ１ゝ　−ムＣ 菌株 ウシリゾチウームＣ２（ウシ第４胃の最も豊富にあるリゾチーム）をコードする ｃＤＮＡを、ウシ第４胃組職から単離したポリＡ＋ＲＮＡを用いて、ｇｔｌＯに 調製したｃＤＮＡライブラリーから単離した。ウシリゾチウームＣ２遺伝子のエ キソン２．３及びエキソン４の一部からなる部分ゲノムクローン、ｐＬｌでライ ブラリーをスクリーニングした。陽性クローンをエキソン２の５゛端に相補的な オリゴヌクレオチドでスクリーニングで確認した。クローンのひとつ、ＢＬ３の インサートの塩基配列を決定した結果、塩基配列は、ウシリゾチウームの完全長 をコードする塩基配列であるが、部分シグナル塩基配列のみを示しているイニシ エーターメチオニンが欠けていることがわかった。欠損しているシグナル塩基配 列を部位特異的変異導入法をインサートに付加し、欠損しているヌクレオチドの 配列は、前タンパク質に対する第４胃ｍ　ＲＮ　Ａの直接配列決定により得た。

変異導入法をまた用いて、ウシリゾチームＣ２の完全なシグナル配列と成熟タン パク質を今度はコードしているインサートの５°及び３′端にＥｃｏＲＩ部位を 付加した。ＥｃｏＲＩ断片をＥｃｏＲＩ切断ピキア発現プラスミドｐＡＯ８０４ に挿入した。（構造は後に記述した。） プラスミドｐＡ０８０４は、ＢｇｌＩＩ切断ベクターをＡＯＸ１部位に挿入しそ れを破壊する目的に使用されるＰ、バストリスＡＯＸ１遺伝子の５′と３°端か らの塩基配列から成る。プラスミドはまたＰ、パストリスＡＯＸ１転写プロモー ターとターミネータ−１Ｐ、バストリスＨＩＳ４遺伝子、細菌中での復製と選択 に必要な塩基配列も含む、唯一のＥｃｏＲＩ部位は、プロモーターと終結因子領 域を分離して、この部位に異種遺伝子が挿入できる。

プラスミドｐＡＯ８０４は、以下のように作成された：ｐＢＲ３２２をＥ　ｃ　 ｏ　ＲＩで切断し、突出した末端を大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウフラ グメントでうめて、そのＤＮＡをＴ４リガーゼを使用して再び環状にした。再環 状化したＤＮＡを使用して大腸菌ＭＣ１０６１をアンピシリン耐性に形質転換し 、ＥｃｏＲＩ部位のない約４．３７ｋｂｐの大きさのプラスミドを持つ形質転換 体をスクリーニングした。このような形質転換体を選択し、培養して、ｐＢＲ３ ２２ΔＲＩと示される、ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ部位を塩基配列： ５°−ＧＡＡＴＴＡＡＴＴＣ−３’ ３’　−ＣＴＴＡＡＴＴＡＡＧ−５゜ で置き換えているプラスミドを生産した。

ｐＢＲ３２２ΔＲＩをＰｖｕｌｌで切断し、生じた平滑端にＴ４リガーゼを用い て塩基配列 ５°−ＣＡＧＡＴＣＴＧ−３゜ ３’　−ＧＴＣＴＡＧＡＣ−５゜ のリンカ−を連結した。そのＤＮＡを、やはりＴ４リガーゼを使用して再び環状 にしそのｆ＆ＢｇｌＩ［で切断しＴ４リガーゼを使用して再び再環状化し、１つ 以上のリンカ−がＰｖｕｌｌ切断ｐＢＲ３２２ΔＲＩへ連結してしまうことによ ってできる多くのＢｇｌＩＩ部位を除去した。多くのＢｇｌ［部位金除去する処 理をされたＤＮＡを使用して大腸菌ＭＣ１０６１をアンピシリン耐性に形質転換 した。ＢｇｌＩ［部位のある約４．３８ｋｂｐのプラスミドを持つ形質転換体を スクリーニングした。このような形質転換体を選択し、培養して、今後の仕事で ｐＢＲ３２２ΔＲＩＢＧＬと示されるプラスミドを生産した。ｐＢＲ３２２ΔＲ ＩＢＧＬは、ｐＢＲ３２２ΔＲＩのＰｖｕｆ１部位のかわりに塩基配列５’　− ＣＡＧＣＡＧＡＴＣＴＧＣＴＧ−３’３’　−ＧＴＣＧＴＣＴＣＧＡＣＧＡＣ− ５’をもつ以外は、ｐ　ＢＨ３２２ΔＲＩＢＧＬはｐＢＲ３２２ΔＲＩに等しい 。

ｐＢＲ３２２ΔＲＩＢＧＬを５ａｌＩとＢｇｌ［で切断し、大きな断片（約２゜ ９７ｋｂＰ）を単離した。プラスミドｐＢＳＡＧＩ５Ｉはヨーロッパ特許出願発 行Ｎｏ、０２２６７５２に記載されており、ＢｇｌＩＩとＸｈｏＩでかんぜんに 切断しＰ、バストリスＡＯＸＩ下流領域ＡＯＸ１遺伝子ターミネータ−（ＡＯＸ Ｉプロモーターからの転写方向と比べて）から約８５０ｂｐの断片を単離した。

ｐＢＳＡＧＩ５ＩからのＢｇｌＵ−Ｘｈｏ！断片とｐＢＲ３２２ΔＲＩＢＧＬか らの約２．９７ｂｐのＳａｌＩ−ＢｇｌＩ［断片を結合し、Ｔ４リガーゼでライ ゲーションした。ライゲーションは混合物を使用して大腸菌ＭＣ１０６１をアン ピシリン耐性に形質転換し、ＢｇｌＩＩ部位のある予想される大きさの約（３， ８ｋｂｐ）のプラスミドを持つ形質転換体をスクリーニングした。このプラスミ ドをｐＡＯ８０１と示した。ｐＢＲ３２２ΔＲＩＢＧＬ断片からの５ａＩ１部位 の突出端を８５０ｂｐ　ｐＢＳＡＧＩ５Ｉ断片のＸｈｏＩ部位の突出端とライゲ ーションし、その過程で、ｐＡＯ８０１中の５ａｌＩ部位とＸｈｏＩ部位の両方 を除去した。

ｐＢＳＡＧＩ５ＩをそのｔＩｉＣｌａＩで切断し、約２．０ｋｂｐ断片を単離し た。

２、ｏｉｃｂｐ断片は、約１．０ｋｂｐのＰ、パストリスＡＯＸＩプロモーター 、転写開始部位からなる部分、約７００ｂｐの肝炎Ｂウィルス表面抗原（“ＨＢ ｓＡｇ”）をコードする部分、Ｐ、バストリスＡＯＸ遺伝子ポリアデンレーショ ンシグナルと部位コーディング部分とターミネータ−からなる約３００ｂｐの部 分をもつ。２．０ｋｂｐ断片のＨＢｓＡｇコード部分は、Ａ、ＯＸ１プロモータ ーのある１、０ｋｂｐ部位に隣接して末端で、ＥｃｏＲＩ部位で、ＡＯＸ１ター ミネータ−のある３００ｂｐ部位に末端で隣接して５ｔｕＩ部位で境をなしてお り、１．０ｋｂｐプロモ一ター含有部分、３００ｂｐターミネータ−含有部分か ら見れば、ＡＯＸＩプロモーターからの転写がＨＢｓＡｇの発現に操作可能であ るような、向きと位置で、ＨＢｓＡｇをコードしている小部分をもっている。プ ロモータ一部分をＨＢｓＡｇコード部分に結合しているＥｃｏＲＩ部位は（ＡＯ ＸＩプロモーターからの転写方向で考えれば）ＡＯＸＩプロモーターの転写開始 シグナルコードトリプレットのまさしく上流にある。

２．０ｋｂｐのプロモーター、ターミネータ一部分、ＣｌａＩ部位で境をなして いるｐＢＳＡＧＩ５Ｉ断片についての詳細はヨーロッパ特許出願刊行Ｎ０９０２ ２６８４６とエリスら（Ｅｌｌｉｓ）Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　５． １１１１　（１９８５）を参照、プラスミドｐＡＯ８０１をＣＩａＩで切断し、 Ｔ４リガーゼを使用したライゲーションによってｐＢＳＡＧＩ５Ｉからの約２． ０ｋｂｐ　ＣｌａＩ部位で境界をなす断片を結きした。ライゲーション混合物を 使用して大腸菌ＭＣ１０６１をアンピシリン耐性に形質転換し、形質転換体をス クリーニングして、Ｃ１ａＩとＢｇｌＵで切断すると２．３２ｋｂｐ　ｐＢＲ３ ２２の復製起点とアンピシリン耐性遺伝子がある）と約１．９ｋｂｐ、１．４８ ｋｂｐ及び１００ｂｐの断片ができる、予想される大きさく約５．８ｋｂｐ）の プラスミドを得た。Ｂｇｌ　Ｉ［５ＥｃｏＲＩで切断すると該プラスミドは、３ ００ｂｐ　ＡＯＸＩ遺伝子ターミネータ一部分とＨＢｓＡｇコード部分の約２． ４ｋｂｐの断片；ＡＯＸ１部位（Ｒ初に述べた９００ｂｐ　ＥｃｏＲＩ−Ｂｇｌ ｌＩ断片よりもＡＯＸＩコード断片からさらに上流）のＡＯＸ１遺伝子のＡＯＸ Ｉタンパク質コード部分の上流部分を含む約９００ｂＰの断片、およびｐＢＲ３ ２２由来の複製起点とアンピシリン耐性遺伝子とＡＯＸ１部位の約１００ｂｐ　 Ｃ１ａＩ−ＢｇｌＩ［部分とを含む約２．４２ｋｂｐの断片を生じた。このプラ スミドは、ｐＢＳＡＧＩ５ＩのＣ１ａＩ断片を望ましい方向にもち、反対の望ま しくない方向には、約３．３ｋｂｐ、２．３８ｋｂｐ、９００ｂｐのＥｃｏＲＩ −Ｂｇｌ　■断片がある。

ｐＡＯ８０２と示される望ましいプラスミドをもつ形質転換体の１つを以後の仕 事のために選択し、培養してそのプラスミドを生産した。ｐＡＯ８０２中のｐＢ ＳＡＧＩ５Ｉ由来の望ましい方向のＣＩａＩ断片は、ＡＯＸ１部位のＡＯＸＩ遺 伝子の下流由来の８００ｂｐ断片の末端にあるＢｇｌ［部位で切断されて作られ た線状化したプラスミドの、ＡＯＸ１部位に、Ｐ、バストリス染色体への挿入を 正しくおこすような方向に向いている、ＡＯＸ１部位中のＡＯＸＩ遺伝子をもつ 。

ｐＡＯ８０２は、その後、ＥｃｏＲＩ部位と５ｔｕＩ部位でしきられているＨＢ ｓＡｇコード部分をとりのぞく処理をした。プラスミドを５ｔｕＩで切断し、５ ’　−ＧＧＡＡＴＴＣＣ−３’ ３°−ＣＣＴＴＡＡＧＧ−５’ の塩基配列のリンカ−を、Ｔ４リガーゼを用いて平滑端を連結した。混合物はそ の後ＥｃｏＲＩで処理し、再び、Ｔ４リガーゼを用いたライゲーションを行った 。

ライゲーション温き物を使用して、大腸菌をアンピシリン耐性に形質転換し、形 質転換体を予想される大きさの（５，１ｋｂｐ）の約１．７８ｋｂｐ、９００ｂ ｐ、２．４２ｋｂｐのＥｃｏＲＩ−Ｂｇｌｌｌ断片、約ｔｏｏｂｐ、２．３２ｋ ｂｐ、１．４８ｋｂｐ及び１．２ｋｂｐのＢｇｌＩＩ−Ｃ１ａＩの断片をもつプ ラスミドを探してスクリーニングした。このプラスミドをｐＡ０８０３と示す、 望ましいプラスミドを持つ形質転換体を以後の操作のために選択し、培養してｐ Ａ。

８０３を生産した。

プラスミドｐＡ０８０４は、ｐＡ０８０３由来で、ｐＡＯ８０３のｐＢＲ３２２ 由来Ｂａｍ由来Ｂａｍ約１部位５ｋｂｐのＰ、パストリスＨＩＳ４遺伝子を持つ Ｐ、バストリスの染色体由来の断片を挿入して作られた。フレラグら、（Ｃｒｅ ｇｇ）Ｍｏ１．Ｃｅｌ　１．Ｂｉｏｌ、５．３３７６　（１９８５）及びヨーロ ッパ特許出願刊行Ｎｏ、０１８０８９９と０１８８６７を参照。ｐＡＯ８０３を ＢａｍＨＩで切断し、ＨｉＳ４遺伝子を含む。Ｂｇｌ［部位でしきられている断 片と結合し混合物においてＴ４リガーゼを用いたライゲーションを行った。ライ ゲーション混合物は大腸菌ＭＣ１０６１をアンピシリン耐性に形質転換するのに 使用され、形質転換体を予想される大きさく７．８５ｋｂｐ＞の５ｓｌＩで切断 されるプラスミドをめてスクリーニングした。この形質転換体の１つを以後の仕 事のために選択しそれがもつプラスミドをｐＡＯ８０４と示した。ｐＡＯ８０４ は約１．５ｋｂｐと、５．０ｋｂｐの５ａｌＩ−ＣＩａＩ断片、約１．３ｋｂｐ のＣ１ａＩ−Ｃ１ａＩ断片をもち、これによりプラスミド中のＨＩＳ４遺伝子の 転写方向はアンピシリン耐性遺伝子の転写方向と同方向で、ＡＯＸ１プロモータ ーからの転写方向とは反対であることが示されている。

ｐＡＯ８０４のＨＩＳ４遺伝子中の方向はプラスミドの機能あるいはＡＯＸ１プ ロモーターと終結因子部の闇のＥｃｏＲＩ部位に挿入されるｃＤＮＡコード部分 をもつ、その派生プラスミドの機能にとって重要ではない。

ピキアバストリス菌株ＧＳ　］、　１５　（ｈ　ｉ　５４）−フレラグらＭｏ１ ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　１５．３３７６（ １９８５）、ＡＴＣＣＮｏ’、２０８６４−はウシリゾチーム発現プラスミドｐ ｓＬ１２Ａの切断断片を宿主菌株として使用した。ディガンら（Ｄｉｇｅｍ）Ｄ ｅｖ、Ｉｎｄｕｓｔｒ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏ＋、２９．５９　（１９８８）参照。

ウシリゾチーム遺伝子を含む最終的な発現ベクターは、ｐｓＬ１２Ａベクターで あり、Ｍｕｔ’及びＭｕ七形質転換体両方の発展に使用された。“Ｍｕｔ”−メ タノール利用。Ｍｕｔ’株ではＡＯＸＩ遺伝子が機能し続けているのでメタノー ルでの増殖は野生株ど似ている。Ｍｕｔ”株ではメタノール上での増殖は、Ｐ。

バストリスの少ないアルコールオキシダーゼ遺伝子（ＡＯＸ２遺伝子）が機能し ているため、まだおこるが、増殖はメタノール上でＭｕｔ”株に比較して大変遅 い。

ｐｓｒ−ｉ２ＡｅＢｇ１１１で切断し、ＢｇｌＩ［断片を全細胞塩化リチウム形 質転換システムを用いてＧ５１１．５４胞に形質転換した。（フレラグら、Ｍｏ １ｅｃｕｉａｒ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、５．３３７９（ １９，８５））、Ｍｕｔ−細胞はこの形質転換から、回収される。代表的なＭｕ ｔ”株はＡ３７と呼ばれた。

Ｍｕ　ｔ”形質転換体は、ｐｓＬ１２Ａを、ＨＩＳ４道伝子中に１カ所プラスミ ドを切断する、５ａｌＩにより切断し、この全ｆＦＭ胞形質転換法にＳ　ａ　Ｉ 　Ｉで切断したプラスミドを用いることで、開発された。Ｍｕｔ″細胞はこの形 質転換から回復した。代表的なＭｕｔ株はＬｌと呼ばれた。

菌株はアミノ酸を含まない酵母ナイトロジェンベース（ＹＮＢ）（ディツユ（Ｄ ｉｆｃｏ）（株）（Ｌａｂｓ）デトロイト）＋２％グルコース寒天培地上で毎月 うえかえて保持されていた。接種物は３０℃２０Ｏｒｐｍでアミノ酸を含まない ２％グリセロール＋リン酸バッファー（ｐＨ６，０）ＹＮＢ中で増殖させた。

担胞蜜度状定 細胞密度は最小限の４０００ｇで１０分間発酵器中スープ全体を遠心し、湿った 細胞のリットルあたりのダラムを細胞沈殿の重要を測定して決定することから算 出される。乾燥細胞濃度の計算には、１／４の相間因子が使用される。

工叉Ｚ二止盪度訣笈 エタノール濃度は、標準的なガスクロマトグラフィー技術により決定される。

皇ン旦ゾチニに１ｊ−恒 リゾチーム濃度は、凍結乾燥したミクロコツカス　リソデクティカス（Ｍｉｃｒ ｏｃｏｃｃｕｓ　ｔｙｓｏｄｅｋｔｉｃｕｓ）細胞を使用する。１００ｍＭリン 酸ナトリウムバッファーｐｉ（５ｉ、　Ｏ中での濁度測定アッセイによって決定 された。−シュガー（Ｓｈｎｇａｒ）、Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ａｃ ｔａ。

８．３０２（１９５２）、（４５０ｎｍでの）吸光度の直線的減少を３０℃で３ 分間にわたり測定した１発酵器試料の減少速度を直接以前に生成した組換えウシ リゾチームＣ２−ドブソンら（Ｄｏｂｓｏｎ）、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５ ９．１１６０７　（１９８４）−に対応させて濃度を算出した。

ウシ１ゝ　−ム ウシリゾチームの濃度（ｍｇ／Ｌ）は無細胞スープから算出した。全リゾチーム （ｍｇ）量は、発酵器からの細胞を含む全スープに基づいて計算した。量的生産 性（ｍｇ／Ｌ−ｈ）は、発酵器中での液体量と誘導状態の時間によって、生産さ れる全リゾチームを割ることによって産出された。抑制および脱抑制下にある時 間は、これらの発酵では約２４−３０時間である。細胞あたりのリゾチーム産出 量（ｍｇ／ｇ）は全リゾチームを全細胞に対してプロットし、プロットの傾斜を 決定して直線回帰を利用して産出した。傾きは、細胞あたりのりゾチーム産出量 として考える。傾きの相関係数は０．９５以上である。

−ゝ　び゛　の　・ ２リツトル発酵器（Ｌ、、Ｈ，発酵１．ヘイワード（Ｈａｙｗａｖｄ）ＣＡ　； ビオラツイツチ（Ｂｉｏｌａｆ　１ｔｔｅ＞、ＬＳＬバイオラフィッイソプリン ストン。

Ｎ、Ｊ）を２２５ｍｌの１０×基礎的塩（４２ｍｌ／ｎ＋Ｉ８５％リン酸、１． ８８１１硫酸カルシウム　２Ｈ２０，２８，６ｇ／Ｉ硫酸カリウム、２３．４ｇ ／ｌ硫酸マグネシウム７水和物、６．５ｇ／ｌ水酸化カリウム）と３０ｇグリセ ロールを含む７００ＩＩｌｌ容量でオートクレーブした。滅菌後、３ｍｌのＹＴ Ｍ、微量塩溶液（５゜０ｍ１７’ｍｌの硫黄酸、６５．０ｇ、／Ｉの硫酸鉄７水 和物、６．０ｇ／勺の硫酸銅５水和物、２０．０ｇ／Ｉの硫酸亜鉛７水和物、３ ．０ｇ／ｌの硫酸マンガン１水和ｆＪＬ　０　、　１　ｇ／　ｌビオチン）を加 え、濃いアンモニア水を加えて、ｐＨを５゜０に調製して、そしてｐＨは発酵の 間０．１％シュトルクトル（Ｓｔｒｕｉｋｔｏｌ）Ｊ６７３消泡剤（Ｓｔｒｕｉ ｋｔｏｌ、Ｃｏ、スト（Ｓｔｏｗ）オハイオ。

米国）を含む２０％アンモニア水を加えて５．０に調整された。過度の泡立ちは 、泡プローブにより探知され、２％シュトルクトルＪ６７３消泡剤の付加により 調節された。その後発酵器は１０〜・５０＋ｓＩ量の接種物により接種された。

初期のグリセロールの消費のため、以下に記述するようなグリセロール供給をは じめた。

発酵の溶解酸素を３１／分までの空気流速度の上昇及び、発酵の間１５００ｒｐ 五ηまでのはやさで振とうすることにより空気飽和を２０％以上に維持した。

１０１発酵（１４Ｉバイオラフィッチ発酵器中での）は、Ｍｕｔ−混合供給群方 法には、１，９１の１０×基礎塩と３００ｇグリセロールを含む７．Ｏ１容量か ら開始し、Ｍ　１１　ｔ　’メタノール混合供給群方法では２．４１の１０×基 礎塩と３６０ｇグリセロールをよむ５．０リツトル量、あるいは、Ｍｕｔ−メタ ノール混合供給群方法では３．２リツトルの１０×基礎塩と４８０ｇグリセロー ルな含む８リンドル量から開始する。滅菌後、１２９ｍ１のＹＴＭ、微量塩を加 え、ｐＨを５．０に調製り７、ひきつづき、発酵中を通じてアンモニアガスを付 加して５゜０にｇ＝した。過度の泡立ちは１０％シュトルクトールＪ６７３消泡 剤を付加して制御した。発酵容器に２００−５００ｍ１量を接種した。初期グリ セロールの消費により以下に概説する供給を開始した。溶解しているＢ素は発酵 ・１０リットル／′分までの空気流速度の上昇、１１０００ｒｐまでの振どう、 及び／あるいは１゜５バールまで発酵容器への圧力による２０％以上に維持した 。

Ｍｕｔ−ＮＬ　ムΔ゛笑　ヘ グリセロール群状態が完了した後、１２ｍ１／ｌ　ＹＴＭ、微量塩を含む５０％ （重量で）グリセロールの給送を、２１発酵容器には５．４ｍｌ／ｈ、１０リッ トル発酵容器には５４ｍ１／ｈで開始した。グリセロール給送の６時間後、グリ セロール給送を、３．６ｎ＋Ｉ７’ｈ　（３６ｍｌ／ｈ、１０リツトル）に減少 し、１２ｍ１、、／ＩＹＴＭ、微量塩を含むメタノールの給送を、２リツトル発 酵容器には１．１ｍ１／ｈ、１０リットル発酵容器には１１ｍ１／ｈで開始した 。５時間後、メタノール給送を、残余メタノール濃度が約１％まで望ましくは０ ．２と０．８％の間になるように調節した。発酵は、メタノールとグリセロール 給送で４０−５０時間行われる。

Ｍｕｔ−２：　１　’　ｈ−”’ｆｔ　″　１竪２：１発酵はメタノール供給が 発酵の間１．１ｍｌ／ｈｏｕｒにおよぶほどは増加せず、グリセロール：メタノ ールの比（重量で）が２＝１比になるようにする以外は、ＮＬ発酵と同様に行わ れた。

ル匹」４：１　人へ笑　Δ ４：１方法は、ＮＬ発酵と同じように開始される。グリセロール／メタノールの 同時給送の間、４：１発酵では２：１方法で使用されているグリセロール給送速 度は２倍、すなわち、発酵中通じて、重量でグリセロール対メタノールが４＝１ 比になるようにＩＬに対して７．２ｍｌ／ｈｒ、１０Ｌに対し７２ｍ１／ｈｒこ の発酵は、ＩＬ及び１０Ｌ発酵両方について、Ｍｕｔ−採用４：１混合給送発酵 と同じ方法に従って行われた。

Ｍｕｔ−メタノール グリセロール群状態が完了した後、誘導供給前状態を、残余メタノール濃度を０ ．２から０．８％の間に維持するために発酵器にメタノールを付加することによ りはじめた。１０Ｌ行う場合、ＹＴＭ、微量塩は使用されない。かわりに、４０ ｗ＋ＩのＩＭ＋微量塩（５ｏ＋Ｉ／］硫黄酸、４．８ｇ／ｌ塩化鉄２水和物、２ ．０ｇ／ｌ硫酸亜鉛１水和物、ｏ、ｏ２ｇ／ｌホウ酸、０．２ｇ／ｌモリブデン 酸ナトリウム、０．３ｇ／ｌ［酸マンガンー１水和物、０．０８ｇ／ｌヨウ化カ リウム、０．０６ｇ／Ｉ硫酸銅−５水和物）と２ｍｇ／ｌビオチンを１日おきに 発酵器に注入した。

Ｍｕｔ”メ　ノール−Δ グリセロールを消費した後、１２ｍｇ／ｌ＋　ｙ’ｒＭ、微量塩を含む５０％グ リセロール給送を２リツトルに対して１２ｍ１／勺または１０リットル発酵器に 対して２００ｍ１／ｈで開始し、全部で７時間行った。グリセロール給送６時間 後、１２　ｍ　Ｉ　／　ｌ　ＹＴＭ４微量塩を含むメタノール給送を２リツトル 発酵器に対して１．１ｍｌ／ｈ及び１０リツトルに対して１１ｍ１／ｈ５分間に はじめた。溶解した酸素の上昇がメタノール給送がシャットオフした後に見られ たとき、メタノール給送を次の５分間間隔で再びはじめた。後者の過程を、メタ ノール給送中止に、溶解した酸素が即座に反応することが観察されるまで、何度 がくりかえし、一度そうなったらメタノール給送を３０分間隔で時間あたり２０ ％増加しつつ行った。メタノール給送は、給送速度が発酵器２リットルにつき７ ．６ｍｌ／ｈ、１０リツトルにつき１２６ｍ１／ｈに達するまで増加させた。そ して、発酵は、発酵器２リットルにつき４０−６０時間、°１０リットルにつき ２５−３５時間行われた。スープ　ヲ゛（や　い　゛　のｔ・めの　４００ｍ１ 　ＩＯＸ基礎塩、８０ｇグリセロールと脱イオン水（１リツトルにあわせる）を 含む２リツトルＬＨ発酵器を滅菌した。滅菌、冷却後、３ｍｌＹＴＭ４溶液を加 え、２０％ＮＨ，ＯＨを使用してｐＨを３，６に調製した６発酵器に６０ｍ１の Ｍｕｔ−細胞接種物を接種し、ｐＨ調節器を５．０に設定した。群増殖の間、振 どう速度を周期的に、２０％空気飽和以上に溶解した酸素分圧を維持するように 調整した。初期グリセロールを消費した後、１２ｍｇ／ｌのＹＴＭ。

念含む５０％グリセロール溶液な発酵器に２０　ｍ　ｇ　／　ｈでポンプで流入 した。４時間牛後グリセロール給送速度を１０ｍｇ／ｈｒに減少させ、１２　ｍ 　ｇ／　Ｉ　ＹＴＭ’を含むメタノールの給送を１．０ｍｌ／ｈで開始した。３ 時間後メタノール単独は倍になった。９０分後、２ｍｌ／ｈのメタノール給送速 度を３．８ｍｌ／ｈに調整し、最初にメタノール給送をはじめてから１３．５ｈ ｒ時間後まで一定に保った。

Ｍｕｔ−合給送達、培養 ３．２Ｌ　ＩＯＸ基礎塩、８００ｇグリセロール、３２ｍ１　ＹＴＭＪｉ量塩か らなる７、６ｋｇ滅菌培地を含む１４Ｌバイオラフィッチ発酵器に、ＹＮＢ＋２ ％グリセロール÷リン酸バッファーをＡ３７株の終夜培養液５００ｍ１を接種し た。発酵は、３０℃で、ＮＨ，の付加でｐＨ５に制御されて、行われ、過度の泡 立ちはシュドラクトールＪ−６７３消泡剤により制御されている。

グリセロールの初期群負荷が消費されたときに、１２ｍ１／ｌ　ＹＴＭ、と１２ 　ｍ　ｌ　／　Ｉ　Ｉ　Ｍ＋微量塩を含む５０％グリセロール給送を２００　ｍ 　１　／　ｈで開始した。６時間後、グリセロール給送を１２２ｍ１／ｈまで減 少させ、メタノール給送を１９ｍ１／ｈで開始した。メタノール給送を開始して から８時間後、４×基礎塩給送をはじめ、自動重量制御器で発酵器内量を８．４ Ｌに制御した。４時間後、すべての給送速度は、エタノールの集積に応じて下の 方に調整された。

調整された給送速度は、塩、メタノール、グリセロールそれぞれに対して６０ｍ １／ｈ、１４ｍ１／ｈ、３２ｍ１／ｈである。

上記の流速で２０次間発酵を行った後、量を７，４Ｌまでへらして速度を１５６ ｍ１／ｈ、４１　ｍ　１．　／　ｈ、８８ｍ１／ｈまで増加した。翌日給送を１ １９ｍ１／ｈ、３０ｍ１／ｈ、６５ｍ１／ｈまで減少させ、２日間一定にしてお いた。最終給送調整で流速を塩、メタノール、グリセロールについて８０ｍ１／ ｈ、３０ｍ１／ｈ、３６　ｍ　１　／　ｈにしてさらに２日間にしておいた。連 続状態にはいって４時間給送速度を初めて下方に調整するのに伴って発酵器内の りゾチーム濃度は、１１０ｍｇ／ｌから最終サンプリングで５２５ｍｇ／ｌまで 上昇しながら、連続過程で、１０ｍｇ／ｌｈの量的生産性を生じて、増加した。

Ｍ　ｕ　ｔ　’　へム゛笑゛　件 Ｍｕｔ”株での１４Ｌ発酵を行ったとき、給送組成の操作によってリゾチーム生 産性が促進することもわかった。グリセロール：メタノール比を４：１から２： １に減少させると、量的生産性１２５ｍｇ／ｌｈから９ｍｇ／ｌｈまで増加した 。量的生産性は細胞密度によって較正されているリゾチーム値によるものである ことに注意しなければならない。生産性は、無細胞スープリットルあたりむしろ 発酵器スープのリットルあたりのりゾチーム量に基づいている。この仕事であつ かっている細胞密度は、無細胞スープでの濃度は全スープ値より２５〜４０％高 いはずである。Ｍｕｔ−、Ｍｕｔ”（みかえ培養を用いた。

様々な発行形態の比較はＩＬスケールでの発酵実行として第１表に表わされてい る。

表１ １リツトル　−リゾ　−ム Ｃ１，ＯＨ供給　混合給送ＭＵＴ−ＣＨ，ＯＦＩ供給　混合給送ＨＵＴ〜　４： １　２：Ｉ　ＭＬ　ＭＵＴ−ＨＵＴ”″（４：１）最大リゾチーム濃度（ｍｇ／ Ｉ）２５０　１８０　２９０　３７５　４５０　１３０誘導時間（時間）　１７ ５　３９　４３　４５　３９　４９細胞密度（乾燥ｇ／ｌ）　６０　８２　８５ 　１０３　８４　７８体積生産性（Ｂ／１−ｈ）　１．２　３．４　４．８　５ ．６　７．７　３．０細胞あたりのりゾチーム 収量（論ｇ／ｇ）　５．２　２．３　３．７　４．０　５．６　２．４最大工タ ノール濃度（ｍｇ／ｌ）　１０　２１０　！００　１００　３０　Ｎ、Ｄ。

表１に見られる顕著な点を以下に挙げる。

１、本発明の混合給送法で培養したＭｕｔ−株の体積生産性は、メタノール単独 供給法で培養したＭｕｒ株の体積生産性を３〜６倍上回る。

２、混き給送法で培養したＭｕじ細胞によって分泌されたウシリゾチームの最大 濃度は、メタノール単独供給法で培養した同じ細胞に分泌された最大濃度（２５ ０ｎ＋ｇ／ｌ）に近づき（１８０ｍｇ／　Ｉ　）　、また上回る（２９０および ３７５ｍｇ／　Ｉ　）、明らかに、これらの混合給送法の濃度に、およそ４分の １の時間で到達する。

３、混合給送発酵法によりＭｕじ細胞を培養すると、メタノール単独供給法で同 じ細胞を培養した場きよりも高い細胞密度に達することが可能になる。さらに、 このより高い細胞密度に４分の１の時間で到達する。

４、　Ｎｕｔ−株には、非制限（ＮＬ）発酵法、混合給送発酵法が好ましかった 。

第１図は４種の異なる手法、すなわち、メタノール単独供給法、あるいは、グリ セロールとメタノールを４：１．２：１（グリセロールニメタノールの重量比） で混合給送する方法、あるいは、制限グリセロール供給法、非制限メタノール（ ＭＬ）供給法による、２リツトル発酵器中でのりゾチーム産生を示している。Ｎ Ｌ混合給送発酵法により、４８時間で３７５…ｇ／Ｉが得られ、元来のメタノー ル単独Ｍｕじ発酵法の体積生産性を６倍上回った。

第２図は、メタノール単独供給Ｈｕｔ−および混合給送ＮＬ　Ｍｕじ発酵を、メ タノール単独供給Ｈｕｔ”発酵と比較したものである。この図のデータは、遅く 増殖するＮｕｔ−細胞の生産性を、Ｎｕｔ−細胞を本発明の混合給送発酵法で培 養することにより、より早く増殖するＨｕｔ″細胞と同等にできることを示して いる。Ｎｕｔ’細胞は蓄積したエタノールに感受性であることが主要な原因とな って、Ｍｕｔ−細胞はＭｕｔ’細胞よりも発酵器中でより容易に維持できるため 、Ｎｕｔ”に匹敵する生産性を達成するような方法でＭｕｔ−株を培養できるこ とは有利である。

第３Ａ図は、１０リツトルと１リツトルの結果の比較を示している。より高い開 始グリセロール濃度（７％対４ｚ）を用いたので、１０リットル発酵の方が高い 産物レベルおよび生産性を示すことが期待された。この１０リットル発酵により 、１２５時間で３２５ｍｇ／ｌに達しく表２）、誘導段術で２．１ｍｇ／ｉｈの 体積生産性を与えた。５．２ｍｇ／ｇ細胞の収量は、１リツトル発酵で得られた ものと同じであった。

典型的な１０リットル発酵のリゾチーム濃度は第３Ｂ図に示されており、リゾチ ーム産生速度は２０時間後に遅くなる。体積生産性は、メタノール供給発酵より も高い（５，８ｍｇ／Ｉ−ｈ）。

表２ ウシ１ゾ　−ム　の１０リツトルまでのスケールアップＣＨ３０Ｈ供給ＭＩＩＴ −混合給送（ＮＬ）ＭＵＴ−最大リゾチーム濃度（ｍｇ／　ｌ　）　３２５　２ ２０誘導時間（時間）　１２０　３０ 細胞密度（乾燥ｇ／Ｉ）　７５　８０ 体積生産性（ｎｇ／Ｉ−ｈ）　２．１　５．８細胞あたりリゾチーム収量（鶴ｇ ／ｇ）　５．２　２．８最大工タノール濃度（ｍｇ／ｌ）　１０　２２０メタノ ール供給発酵に対して、混合給送（ＮＬ）発酵で、体積生産性が劇的に上昇した ． ２．見丘迭Ｙ±：ム ｐ｝ＩＬＺ１０３と呼ばれるブラスミドは、以下の配列をｐ＾０８０４のＥｃｏ Ｒ１部位に挿入することによって構築された： ５゛−＾八ＴＴＣＡＴ（；＾＾Ｇ（；ＣＴＣＴＣＡＴＴＣＴＴＣＴ［；ＣＧＧＣ Ｔ丁ＧＴＣＣＴＣＣＴＴＴＣＴＣＴＴＡＣＩ；ＧＴＣＣＡＣＧ（；Ｃ八八ＣＧＴ ＣＴＴＴＣ＾＾＾ＧＧＴＧＴ（；Ａ（：ＴＴＣ：（：ＣＣＡＧ＾八ＣＴＣＴＣ八 ＾＾＾（；ＡＴＴ（：（：ＣＡＡＴＧ（；ＡＴＣ（，ＣＴＡＣＡＧＧＧＧＡＡＴ ＣＡ（：ＣＣＴＡＧＣ＾＾ＡＣＴ（ｔｌ：ＡＴＧＴＧＴＴＴＣ（：ＣＶＡ八＾Ｔ ｆ；Ｇ（；ＡＧＡＧＴ１１ｆ；ＴＴＡＣ＾八ＣＡＣＡＣＧＡＧＣＴ八Ｃ＾＾＾Ｃ ＴＡＣ＾＾ＴＧＣＴＣｆ；ＡＣ：ＡＣＡＧ＾八ＧＣＡＣＴ（：ＡＴＴＡＴ（；Ｃ ＧＡＴ八ＴＴＴＣＡ（：ＡＴＣ＾八ＴＡＣ：ＣＣＧＣＴＡＣＴｆ；ＧＴ（：Ｔ＾ ＾ＴＧＡＴＩＩ；（；Ｃ＾＾八八ＣＣＣＣΔＣＧＡＧＣ八ＧＴＴ＾＾Ｔ（；ＣＣ ＴＧＴＣ八ＴＴＴＡＴＣＣＴＧＣ八ＧＴ（：ＣＴＴＴ（：ＣＴＩＩ；Ｃ＾八ＣＡ Ｔ八＾ＣＡＴＣＧＣＴＧＡＴＧＣＴ（；ＴＡＧＣＴＴＧＴ（；Ｃ八＾ΔＣＡＣＧ ＩＩ：ＴＴＧＴＣＣ（；ＴＧＡＴＣＣ＾Ｃ＾ΔＧＧＣＡＴＴＭ：ＡＧＣＡＴＧ（ ：（；ＴＧＧＣＡＴＧ（：ＡＣ八＾八ＴＣＣＴＴＧＴＣ＾八＾＾ＣＡＧ八ＧＡＴ ＧＴＣＣＧＴＣＡＣ：ＴＡＴＧＴＴＣ八八ＧＧＴＴＧＴＧＧ八ＣＴＧＴ＾＾Ｇ５ ゛末端の最初の５塩基（ＥｃｏＲＩ部位に対応する》と３′末端の差異母の塩基 （ＥｅｏＲ１部位に対応する）を除く上述の配列を持つＤＮＡは、ヒト胎盤由来 のプレリゾチームのシグナルベブチド（カスタノン（Ｃａｓｔａｎｏｎ）他、Ｇ ｅｎｅ　６６，　２２３−２３４　（１９８８））およびヒト組織球性リンパ腫 細胞系Ｕ−９３７のプレリゾチームのシグナルペプチド（サンドストロム（Ｓｕ ｎｄｓｔｒｏｍ＞とエルシン（Ｎｉ　Ｉｓｓｏｎ）、Ｉｎｔｌ．　Ｊ．　Ｃａｎ ｃｅｒ　１１７，　５６５−５７７　（１９７６j） と同一のアミノ酸配列であるシグナルペプチドを持ち、ヒト乳リゾチーム（ジョ レス（Ｊｏｌｌｅｓ）他、Ｍｏｌ．　ａｎｄ　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　 ６３，　１６５　（１９８４））、ヒト胎盤由来リゾチーム（カスタノン他、上 述）、およびヒト組織球性リンパ腫細胞系Ｕ−９３７（サンドストロンとエルシ ン、上述）のりゾチームと同じアミノ酸配列である成熟リゾチームペプチドを持 つプレリゾチームをコードしている。

ウシリゾチームｃ２との関連で上で述べたように、ブレリゾチームｐＨＬＺ１０ ３は−Ｐ．バストリス株［：Ｓ１１５，　Ｎｕｔ一、Ｍｕじ（単一コピー）、お よびＨｕｔ”″（マルチコピー）株からりゾチームを調製するために用いられ、 そのこれらの細胞内でヒトプレリゾチームが産生され、成熟ヒトリゾチームが培 地中に分泌される．ヒトリゾチームを分泌する株は、ウシリゾチームを分泌する 株に関連して述べたような多様な方法で培養され、それにより、ヒトリゾチーム が産土され、培地から回収される。メチル栄養性酵母のウシリゾチーム産生株の 混合給送発酵法に関して上で述べた利点は、ヒトリゾチーム産生株に関しても同 様に当てはまるものである． ３．上皮成長因ヱ ズプスミ上 以下の配列のＤＮＡを構築した： ５゜−＾＾ＴＴＣＡＴ（；ＡＣ＾＾ＴＴＣＣＴＴＣ＾＾ＴＴＴＴＴＡＣＴＣ：Ｃ Ｍ：ＴＴＴＴＡＴＴＣＧＣＡ（：ＣＡＴＣＣＴＣＣＣＣＡＴＴＡＣＣＴ（；ＣＴ ＣＣＡＧＴＣ八＾ＣＡＣＴＡＣ＾八ＣＡＣ八八（；ＡＴＣ＾八＾ＣＧＧＣＡＣ＾ 八＾ＴＴＣＣＣ（；ＣＴＣ＾＾ＣＣＴＧＴＣＡＴＣ（；（；ＴＴＡＣＴＣＭ：Ａ ＴＴＴＡＧ＾＾（；（Ｃ：ＧＡＴＴＴＣＧＡＴＧＴＴＣ：ＣＴＧＴＴＴＴ（；Ｃ ＣＡＴＴＴＴＣＣ＾＾ＣＡＣ：ＣＡＣ＾八＾Ｔ＾＾ＣＣ；Ｇ（；ＴＴＡＴＴＧＴ ＴＴＡＴ＾＾八ＴＡＣＴ＾ＣＴＡＴＴ（；ＣＣＡ１１；ＣＡＴＴ（：ＣＴＣＣＴ ＾八＾Ｇ八＾Ｇ八＾（：（：（：（；ＴＴＴＣＴＴＴＧ（；ＡＴ＾＾八八Ｇ＾＾ ＾ＴＴＣＣ（；ＡＴＡ（；Ｃ（；Ａ（；ＴＧＴＣＣＴＣＴＣ：ＡＧＴＣＡＣ［； ＡＴ（；ＣＴＴＡＣＴＧＴＣＴＡＣＡＴ（；ＡＣＧＣＣ（：ＴＣＴＧＴＡＴＧＴ ＡＴＡＴＴＣＡＧＣＣＴＣＴＡ（：八Ｃ八ΔＧＴＡＣ（；Ｇ（；ＴＧＴ＾八ＴＴ ＣＣＧＴＴＧＴＴＧ（：ＣＴ八ＣＡＴＣＧＧＴ（；ＡＧＣ（；ＴＴＧＴＣＡ１１ ；Ｔ八ＴＣＧＴＧＡＴＣＴ（：＾＾＾Ｔ（；（；ＴＧＧ（：＾＾ＣＴＴＣ（；Ｔ Ｔ＾八八ＣＣＴ（；Ｃ この配列の５′末端の最初の５塩基は、ＥｃｏＲＩ部位に対応する。この配列の ３′末端のＧもＥｃｏＲＩ部位に対応する。この配列の３′末端のＧのすぐ５′ 側の５′−＾ＧＣＴＣは、ＤＮ＾を構築する際に用いる方法の人工産物である。

５゛末端の近傍の５゛−＾ＴＧから始まり、３゛末端近くの５’−Ｔ＾＾の翻訳 終止シグナルをコードするトリプレットで終わる残りの４１７塩基は、サツ力ロ ミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｅｅｒｅｖｉＳｉａｅ）の ブレブローα接合因子のＮ末端８５アミノ酸（米国特許代４，５４６，０８２号 参照）および５３アミノ酸の成熟ヒト上皮成長因子の５３７ミノ！！！（すなわ ち、ＥＧＦ（１−５３＞）をコードする。このＤＮＡをブラスミドｐＡＯ８０４ のＥｃｏＲＩ部位に挿入し、ウシおよびヒトリゾチームに関して述べたように、 ｐ＾０８１７゜と名付けた得られたブラスミドをＰ．バストリス株（１；Ｓ１１ ．５と用いてＭｕじ、Ｎｕｔ”（単一コピー）、およびＨｕｔ”（マルチコビー ）株を調製し、これらの株から、上述の多様な方法で培養することにより、成熟 した５２アミノ酸のヒト上皮成長因子（すなわち，ＥＧＦ（１−５２））および 成熟４８アミノ酸ヒト上皮成長因子（すなわちＥＧＦ（１−４８＞）が培地中に 分泌される。分泌は、上述の配列を持つＤＮ八にコードされるポリベブチドのＮ 末端の８５アミノｉ！２（Ｓ．セレビジエのブレブロσ接合因子由来》によって 媒介される。このポリベブチドのカルボキシ末端のアミノ酸は、Ｐ．バストリス 株中、あるいは培地中で迅速にタンパク質分解によって切断され、成熟Ｅ（；Ｆ （１−５３＞は回収されたＥＧＦの主要成分ではない。しかしながら前述のよう に、成熟ＥＧ；Ｆ（１−５２）は培地からｆｉｌｌされ、培地中でゆっくりとタ ンパク質分解によって安定な成熟ＥＣ：Ｆ（１−４８）に転換される．（ＥＧＦ （１−５２）とＥＣＦ（１−４８）はＥＧＦ（１−５３）と同等な生物活性を持 ち、ＥＧＦ（１−５３）のように治療上有用である。）メチル栄養性酵母中でウ シおよびヒトリゾチームを産生する場自と同様に、混合給送法を用いる利点は、 ＥＧＦ（１−５２）およびＥＧＦ（１−４８）を産生ずる多様なＭｕｔ表現系の すべてでも同様に観察された。

Ｅ（；Ｆ（１−５２）とＥ（；Ｆ（１−４８＞は、スフエロブラスト法（クレッ グ（Ｃｒｅｇｇ）他、Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．　５．　３３７６　（１ ９８５））によってＢ８＋ＩＩで切断したプラスミドｐ＾０８１７で形質転換さ れた（ＥＧＦをコードするＤＮ八の挿入によってゲノムの八〇ＸＩ遺伝子が破壊 されたＮｕｔ−株を得るため）Ｐ．パストリスｃｓｉｉｓ株、あるいは、スフェ ロブラスト法によって元の形のｐ＾０８１７で形質転換された（Ｐ．パストリス ゲノム中の相同的な領域に添加されることによってＭｕｔ”株を得るため）Ｐ． パストリス（：Ｓ１１５株を培養することによっても産土される。ブラスミドｐ ΔＯ８１７中には、ヘッド・ツー・テイルに連結した同一の発現力セットが２つ 存在する。それぞれのカセットは、Ｐ．パストリス八ＯＸＩプロモーター、それ が転写に関して機能するように連結している焼＜　４３０ｂｐのブレブロａ接合 因子（１−．８５）、成熟ＥＧＦ（１−５３）をコードする上述のＤＮＡ、およ び、そのＤＮＡの下流のＰ．パストリス八ＯＸＩ遺伝子のポリアデニル化シグナ ルと転写ターミネーターを含んでいる。

上述の配列を持つ約４３０ｂｐの、ＥｃｏＲ１部位を末端に持つ、プレブロａ接 会因子、成熟ＥＣＦをコードするＤＮＡ断片は、１．５ｇアガロースグルから単 離された。１５μｇのプラスミドｐ＾０８１７（その構築は以下に述べる）をＥ ｃｏＲ　Ｉで消化し、標準的な連結反応で、該約４３０ｂｐ断片に連結した。該 ４３０ｂｐ断片が正しい向き（プレブロα接合因子（１−８５＞−ＥＧＦ（１− ５３）Ｍ合タンパク質をコードするｌＩＩＲＮ肋’＾ＯＸＩプロモーターから転 写される向き）であるブラスミドを含有する形質転換体を決定するために、ブラ スミドＤＮＡをＰｓｔｌで消化した．正しい構造のものは約１７４０ｂｐ断片を 生じた。正しいブラスミドをｐ＾０８１６と命名した。

完全な、八〇ＸＩプロモーターから発現される、ブレプロσ接合因子（１−８５ ＞　−Ｅ（；Ｆ（１−５３）融合タンパク質の発現力セツ１〜を、１５．ｇのｐ 八Ｏ８１６をＢｇＩＴＩとＢａＪＩで消化し、約１６７０ｂｐ断片をゲルから切 り出すことによってｐ八０８１６から取り出した。ゲル精製した断片をつぎに、 ＢａＩＩＩｌ’ｌｒで切断したｐ＾０８１６に連結した。連結反応液を大腸菌Ｍ Ｃ１０６１の形質転換に用い、ａＢ’のコロニーを選択した。二つのヘッド・ツ ー・テイルにつながった発現カセットを含むプラスミドを有するコロニーは、Ｐ ｓｔｌで消化して１８２フｂｐ、１４９７ｂｐ　、９５４７ｂｐの断片を生じる ものとして同定した，二のプラスミドをｐ＾０８１７と命名した。

ブラスミドｐ＾０８１５は、ブラスミドｐ＾０８０７　（後述）中の八〇ｘ１転 写ターミネーター（上述のｐ＾０８０４の構築を参照）の下流および近傍のＣｌ ａ１部位をＢａｍｔｌＩ部位に変化させるようにミュータゲナイズすることによ って構築した。ｐ＾０８０７のミュータゲナイズに用いたオリゴヌクレオチドは 次の配列を持つ：５’　−ＧＡＣ（：ＴＴＣＧＴＴＴＣＴＣＣＣＧＡＴＣＣＡＡ ＴＣＣ（：ＧＴＡＧＴＴＴＡＴ．ミュータゲナイズしたプラスミドを、ｐ八０８ ０７−Ｂａ請と名付けた。ブラスミドｐ八Ｏ８０４をＢｉ＋ＩＩＩで消化し、２ ５ｎｇの２４００ｂｐ断片を、ＢｇｌＩＴで消化したｐ＾０８０７−Ｂａｎ由来 の２５ＯｎＨの５４００ｂｐ　ＢｇＩＩＩ断片に連結した。正しい構造は、Ｐｓ ｔＩ／ＢａｍＨＩで消化して６１００ｂｐと２１００ｂｐのバンドが同定できる ことによって確認した。正しい構造をｐ＾０８１５と名付けた。

ブラスミドｐＡＯ８０７は以下のように構築した：復製開始点（ｏｒｉ）を含む 約４５８ｂｐのＲｓａＩ−Ｄｒａｌ　ＤＮ＾断片（“ｆｌ−ｏｒｉ断片”と呼ぶ ）またはバクテリオファージｆ１をファージから、通常の方法で得た。

ｐＢＲ３２２（２μｇ）を２ユニットのＤｒａＩで部分消化した。連結混合液を 大腸菌ＪＭ１０３株の形質転換に使用した。ａ＋ｎｐ’形質転換体を採取し、ヘ ルパーファージＲ４０８を重複怒染させた。培地から一本鎖ファージを単離し、 ＪＭ１０３の再恐染に用いた。ａｔｏｐ’形質転換体は、ｐＢＲ３２２のＤｒａ １部位（ヌクレオチド３２３２および３２５１）にクローン化されたｆｌ−ｏｒ ｉを含む、プラスミドｐＢＲｆｌ−ｏｒｉを含有する。

プラス辷ドｐＢＲｆ　１−ｏｒ　ｉ　（１０１１ｇ）をＰｓｔｌとＮｄｅ　Ｉで 消化し、ｆｌ−ｏｒｉを含む約０．８ｋｂｐ断片を１．２ｚアガロースゲルの電 気泳動によって分離した。このＤＮＡ約１１００ｎをＰｓｔｌとＮｄｅ■で消化 してホスファターゼ処理した１１００ｎのｐＡＯ８０４と混合した。この混合液 を塊結させ、大腸菌ＪＭ１０３の形質転換に使用し、ｐＡＯ８０７を得た。

苗株 ５［珪 ２０、ｇの発現ベクターｐ＾０８１７をＢｇｌｌｌで消化し、タンデムにつなが った発現カセットを切り離した。消化によって得られた直鎖状ＤＮＡ断片（５μ ｇ）を用いて、スフェロプラスト法［フレラグ他、Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉ ｏｌ、　５．３３７６　（１９８５）］によってＰ、パストリス株に５１１５（ ＾ＴＣＣ２０８６４）の形質転換を行った。旧Ｓ＋細胞を選択し、細胞の、メタ ノール下で増殖する表現型（Ｎｕｔ）を決定した。

約１５１の細胞がＨｉｓ”　Ｍｕｔ−であり、発現ベクターが正しくへｏｘ１座 位に挿入されてへ〇ＸＩ遺伝子を破壊していることが示唆された。プラスミドｐ ＡＯ８０３をプローブとして用いた、形質転換体のＥｃｏＲＩ消化物のサザン分 析により、へ〇ＸＩ遺伝子の破壊が確認され、挿入された発現ユニットの数が示 された。以後の研究のために選択された株は、表３に示すように命名した。

表３ 採土　担肛　見■進　工を１ Ｇ−Ｅ（：Ｆ８１７Ｓ１０　Ｎｕｔ−Ｈｉｓ”　八ＯＸＩ　ＩＧ−ＥにＦ８１７ Ｓ７　ＭｕじＨｉｓ”　八〇ＸＩ　１に−Ｅ［ｌ；Ｆ８１７Ｓ９　Ｈｕｔ−Ｈｉ ｓ”″　ΔＯＸＩ　複数式３において、“コピー数”とは、挿入されたＢｇＩＩ Ｉ断片の数を意味する。各ＢｇｌＩＩ断片はプレプロａ接合因子（１−８５）− ＥＧＦ（１−５３）融きタンパク質の発現カセットを２個含んでいる。

Ｈｕｔ”株 Ｐ、バストリス株Ｇ５１１５（＾ＴＣＣ２０８６４）を、スフェロプラスト法に よって、５１Ｊｇの切断していないベクターｐ＾０８１７で形質転換した。この 型の形質転換では、プラスミドはプラスミド上の断片との相同性のある部位でＰ 、パストリスのゲノムへ追加される形で挿入される。形質転換体をＨｉｓ″Ｍｕ ｔ”表現型で選択し、そのうちいくつかについてサザン分析を行った。ＥｃｏＲ Ｉ消化物に対して、プラスミドｐＹＭ４［ｐＹＭ４はｐＹＮ３０（ＮＲＲＬ　Ｂ −１５８９０）をＣ１ａｌで消化し、末端を再連結することによって得られた］ をプローブとして分析を行い、ハイブリダイゼーションのパターンから、６個の うち２個において適当な挿入が行われていることが示された。以後の研究のため に選択された株を表４に示す。

表４ 採土　人現工　色■准　刀とＩ Ｃ＋ＥＧＦ８１７ＳＩ　Ｍｕｔ”Ｈｉｓ”　ＨＩＳ４　１Ｇ＋ＥＧＦ８１７Ｓ６ 　Ｍｕｔ”Ｈｉｓ”　ＨＩＳ４　１匹ＬＬ目ｉハ光酵 ａ０発発酵器運転開始と一般的操作 ２リットル発酵器（Ｌ、Ｈ，ファーメンテ−ジョン社、ヘイワード、Ｃ＾；バイ オラフイツト、ＬＳＬバイオラフイツト、プリンストン、ＮＪ）を、２２５＋Ｉ ｌｌの１０Ｘ基本塩（５２随１／ｌ　８５［１ン酸、１．８Ｆｉ／Ｉ硫酸カルシ ウム−２ＨｚＯ）、２８．６ｇ／Ｉ　［酸カ！Ｊ　”ム、２３．４６／Ｉ硫酸マ グネシウム−７Ｈ２０）　、６．５ｇ／Ｉ水酸化カリウム）および３０ｇ０＄グ リセロールむ７００ｍ１体積で高圧滅菌した。滅菌後、３翔１のＹＴＭ４　）レ ース塩を加え、濃アンモニア水でｐＨを５．０に合わせた；次に、発酵の間中、 ０．１ｇストラクトールＪ６７３抗発泡剤を含む２゜２アンモニア水を添加する ことによりｐＨを５．０に調節した。過剰な泡は、泡が発酵器中の泡センサーに 接触した場合にストラクトールＪ６９３を添加することによって、発酵期間中調 節した。つぎに、発酵器に１０〜５０ｍ１のイノキュラム（リン酸緩衝化０．６ ５２酵母窒素ベース、ｐＨ６，２＄グリセロールを含む培地中で一晩振盪培養し た培養液）を添加した。最初に存在したグリセロールが消費され尽くされた時点 で、グリセロール供給を以下のように開始した。発酵の溶解酸素は、発酵期間中 の空気の流速を３リットル／分まで増加させ、振盪速度を１５００ｒｐａ＋ｔで 上昇させることにより、空気飽和の２０１以上に維持した。

１０リットル発酵（１５リツトルバイオラフイツＩ・発酵器中）は、Ｈｕｔ”メ タノール供給バッチ法の場合、４リツトルの１０Ｘ基本塩と５２０ｇのグリセロ ールを含む７．０リツトルの体積で開始した。滅菌後、ＹＴＭ、およびＩＭ訃レ しス塩をそれぞれ３０蹟１添加し、ｐＨを調節して、発酵期間中アンモニアガス を添加することにより連続的にｐＨ５に維持した。過剰の泡は５ｚのストラクト ールＪ６７３抗発泡剤を加えて調節した。発酵器に２００〜５００…１の培養液 を注入した。最初に添加したグリセロールが消費され尽くした時点で、以下に述 べるように供給を開始した。溶解酸素は、光酵期間中、空気流速を４０リットル ／分まで、振盪速度を１１０００ｒｐおよび／または発酵器の圧力を１．５６バ ールまで上昇させることによって空気飽和の２０％以上に維持した。

ｂ、１リツトル発酵器でのＭｕじ株の培養（１）　Ｈｕｔ−（ＮＬ）混き給送バ ッチ発酵グリセロールパッチ段階が完了したのち、１２ｍ１／Ｉ　ＹＴＭ−）レ ース塩を含む５０ｚ（重ｔ＞グリセロールの供給を、２リツトル発酵器で５．４ ｍｌ／ｈて開始した。グリセロール供給６時間後、グリセロール供給を３．６ｎ Ｌ’ｌ＋（１０リツトルの場合には３６ｍ１／ｈ）に減少させ、１２ｍ１／ｈ　 ＹＴＭ、　）レース塩を含むメタノール供給を、２リツトル発酵器の場合１゜１ ｍｌ／ｈて開始した。５時間後、残存するメタノール濃度が約１ｚまで、望まし くは０．２からＯ，Ｓ＄の間になるように、メタノール供給を調節する。発酵は 定期的に試ｆ＋採取し、メタノール供給を開始してから３６〜５０時間後に回収 した。

（２）　Ｍｕｔ−メタノール供給バッチグリセロールバッチ最暗が完了した後に 、残存メタノール濃度が０．２から０．８ｚの間に維持するために発酵器にメタ ノールを添加することによって、誘導供給バッチ最暗を開始した。発酵器から定 期的に試料を調製し、メタノールで培養後１６７時間後に回収した。

（３）　ＥＣＦ（１−５２）産生のための別法４００ｍ１１０・基本塩、８０８ グリセロール、および脱イオン水（１リツトルにする）を含む２リツトルＬ）Ｉ 発酵器を滅菌した。滅菌して冷却した後、３鋺１のＹＴＭ、溶液を添加し、２０ Ｘ　ＮＨ，ＯＲを用いてｐＨ３，６とした。６０ｍ　ｌのＭｕｔ−細胞培養液を 注入し、りＨ：ｌントローラーを５．０に設定した。バッチ培養の間、振盪速度 は定期的に上昇させ、溶解酸素分圧を空気飽和の２０％以上で維持した。最初に 添加したグリセロールが消費され尽くした時点で、１２ｍ１／ｌ　ＹＴＭ＜を含 む５ｏｚグリセロール溶液を、２０Ｉ自１／ｈｎｏ速度で発酵器に流入させた。

４時開牛後、グリセロール基本速度を１０ｍ１／ｈｒに減少させ、１２ｎｌ／Ｉ 　ＹＴＮ−を含むメタノールの供給を１．０ｍｌ／ｈで開始した。３時間後に、 メタノール供給速度を２倍にした。２ｍｌ／ｈで９０分培養後、メタノール供給 速度を３．８ｓｌ／Ｉｉに合わせて、メタノール供給を始めてから１３．５時間 後に回収するまで一定に維持した。

ｃ、２リツトル発酵器中でのＭｕじ株の増殖−Ｍｕｔ”メタノール供給バッチグ リセロールが消費され尽くした後、１２ｍ１／ｌ　ＹＴＭ＝）レース塩を含む５ ｏｚグリセロ・−ル供給を、２リツトル発酵器では１２ＩＩＩＬ７’ｈの速度で 開始し、全部で７暗闇培養した。

グリセロール供給して６時間後、１２＋＋＋Ｉ／ｈ　ＹＴＭ、　トレース塩を含 むメタノール供給をを開始し＝１．１ｍｌ／ｈで５分間行った。メタノール供給 を停止させた後に溶解酸素の上昇が見られたら、メタノール供給ををさらに５分 間行った。メタノール供給停止に対して溶解酸素の迅速な反応が見られるまで後 者の過程を繰り返しな；これが起こった際には、メタノール供給分を１時開あた り２０％、３０分間隔で増加させた。メタノール供給は、供給速度が７．６ｍｌ ／ｈに達するまで、増加させた。発酵はつづいて４０〜６０時間行った。

ｄ０発酵の結果 メタ、ノール供給バッチ法では、に−Ｅ（：Ｆ８１７Ｓ９とＧ−ＥＧＦ８１７Ｓ １０の双方の株の細胞増殖は同様であり、１６７時間後に約３００ｇ／Ｉの湿っ た細胞が得られた。しかしながら、マルチコピー株に−Ｅ（：Ｆ８１７Ｓ９は４ ００＋ｎｇ／ＩのＥＧＦを産生し、Ｅｌｌ：Ｆ発現カセットを２コピーしか持た ない他の株の２倍であった。ＥＧＦの最大濃度はメタノールで１２０時間増殖さ せた後に到達した。

混合給送法では、いずれの株も３００ｇ／１以上に増殖し、マルチコピー株に産 生された４００ｍｇ／　ＩのＥＧＦもまた、２コピ一株が産生するレベルよりも 高かった。これらの株は１、混合給送法でほぼ著に迅速に増殖した。

マルチコピー株では、メタノールのみを供給するのに比較して、混合給送を用い ると、ＥＣ：Ｆ産生に必要なメタノール培養時間が減少し、１２０時間に対して ３５時間であった。細胞量を作るための最初のグリセロールでのバッチ増殖によ り、全過程時間にさらに２４時間が加えられる。メタノール供給法および混き給 送法によるＥＧＦ生産性は、それぞれ３餉ｇｌ−’ｈ−雪および７ｍｇ　ｌ−首 １．−１であった。

２コピーのＥＧＦ遺伝子を持ツＭｕｔ”株、Ｇ、ＥＧＦ８１７Ｓ１は、２コピー のｈＥＧＦ遺伝子を持つＮ０１株と同様の濃度でｈＥ［；Ｆを産生した。

ｅ、ピキア・バストリス発酵培地中での分泌されたＥＧＦの安定性発酵実施期間 中の、培地中のＥＧＦのＨＰＬＣ分析から、１−４８ペプチドは、より長いもの よりもはるかに安定であることが示された。より長い形の物は発酵中の、誘導後 初期に見られた。メタノールで２４時間培養後、１−４８ペプチドが蓄積し、明 らかに他の形の分解産物であった。１−４８ペプチドは発酵条件下で非常に安定 であり、より長い発酵法においても６日間まで存在し、蓄積した。この予想しな かった高度な安定性により、この型のｈＥ（：Ｆは産生と精製がより長い型のも のよりもはるかに容易である。

ｆ、　Ｅ（：Ｆ（１−４８＞の生物活性１−４８Ｅ（：Ｆペプチドを、ｉｎ　ｖ ｉｔｒｏの細胞増殖原アッセイとｉｎ　ｖｉｖｏの胃潰瘍治癒刺激の双方で生物 活性の試験を行った。どちらの型の試験でもこのペプチドは高い生物活性を持っ て居ることが示された。

４、ヒトスーパー　シドジスム　−ゼ ブラスミド５ＯＤ１０４ プラスミドｐｓＯＤ１０４は、ｐ＾０８０４のＥｃｏＲ１部位に、約４７０ｂｐ の両端にＥｃｏＲＩ部位を持つＤＮＡを挿入することによって作成されたもので あり、該ＤＮＡはハレウエル（Ｈａｌｌｅｗｅｌｌ）他、Ｎｕｃｌ、＾ｃｉｄｓ 　Ｒｅｓ、　１３．２０１７−２０３４（１９８５）の第１図に示されて居る、 １５４アミノ酸と翻訳終止コドンをコードする４６５塩基対と、後述の２つの例 外を除いては同一の配列を持つ。２つの例外とは、ｐｓＯＤ１０４の挿入断片で は、終止コドンをコードするトリブレットの最後の塩基が、ハレウエルらの配列 では八であるのに対してＧであり、また、Ｔｈｒ−５４をコードするトリブレッ トの！＆後の塩基がハレウエルらの配列では八であるのに対してＧであることで ある。ｐｓＯＤ１０４では、ｐ＾０８０４のＥｃｏＲＩ部位中の挿入断片はヒト 赤血球Ｃｕ／Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼのサブユニット（ここでは以下 、“ヒトスーパーオキシドジスムターゼまたは“ヒトＳＯＤ”と呼ぶ）をコード する。

ｐｓＯＤ１０４またはその断片で形質転換することによって作成されたＰ、バス トリスの株は、ヒトスーパーオキシドジスムターゼを細胞内で産生ずる。これら の細胞から得られたヒトＳＯＤは元来のヒトＳＯＤの活性を持ち、治療上応用を 含む、ＳＯＤ、特にヒト’ｓＯＤが用いられるのと同じ応用分野で有用である。

雌 プラスミドｐｓＯＤ１０４は、Ｐ、パストリスのＮｕｔ”およびＮｕｔ−の双方 の株に対して用いら、れな。宿主となった株は、ヒスチジン要求性のＧ５１１５ （ＡＴＣＣＮｏ、２０８６４）である。形質転換は、フレラグ他、Ｍｏ１．　Ｃ ｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　５．３３７６（１９８５）で述べられているスフェロプ ラスト法で行った。Ｈｕｔ″″株を作成するために、消化していないｐｓＯＤ１ ０４を（：５１１５゛に・形質転換し、Ｈｉｓ“細胞を選択した。９個のＨｉｓ ”株についてサザンハイプリダイゼーションを行った。染色体ＤＮ＾をＥｃｏＲ Ｉで消化し、＾ＯＸＩ　５’および３’　ｒｙｏｕｉｋｉｗｏ含むｐ＾０８０３ 、または、ピキア）ＩＩＳ４遺伝子を含むｐＹＭ４をプローブとした。ＢｇｌＩ Ｉ消化も行い、ｈＳＯＤ遺伝子断片と相同な、５°−Δ＾ＣＴＣＡＴＩＩ；＾＾ ＣＡＴにＧ＾＾ＴＣＣＡＴにＣ八にＧＣＣＴノ配列を持つオリゴヌクレオチドを プローブとした。サザン分析の結果から、表５に示すような、３つのクラスのＮ ｕｔ’形質転換体が同定された：表５ 採土　ユ星二ゑ　慢入皇位 Ｃ−５ＯＤ１０４Ｃ１，４，５，７，８１八〇ＸＩに＋５ＯＤ１０４Ｃ２，９， １０１ＨＩＳ４（＋５ＯＤ１０４Ｃ３２１（ＩＮ４とへ０ＸＩＮｕｔ−株を作成 するために、プラスミドｐｓＯＤ１０４をＢｇＩＴＩで消化したものをに５１１ ５細胞に形質転換し、Ｈｉｓ”細胞を選択した。）Ｉｉｓ”株は、Ｍｕ　を表現 型についてさらに選択した。

およそ１２１の形質転換体が生育が遅く、へ〇Ｘ１座位が破壊されていることを 示唆した。これらのうち２２個を、メタノール上における増殖速度に関して、コ ントロール株Ｇ−ＰＡ０８０４ト比較しり、Ｇ−ＰＡＯ８Ｏ４株Ｇ、ｉ、ｐＡＯ ８０４ノＢｇｌ　ＩＩ消化物テ八へＸＩを破壊すルコとによって得られた株であ る。これは、期待されたＭｕじ表現型を示すが、組み替え遺伝子産物は発現しな い。ずべてのｈｓＯＤ　Ｍｕじ形質転換体はほぼＧ−Ｐへ０８０４と同程度の速 度で増殖することが示された。増殖が遅いことは、ヘテロな遺伝子産物が細胞に 有毒性を持つことを示唆するものである。

９個のＨｉｓ″Ｍｕじ細胞のサザン分析を上述のように行った。９個すべての株 はへＯＸＩ座位に１コピー挿入されており、この遺伝子を破壊していることが示 された。これらの株はに−５ＯＤ１０４Ｃ１からＧ−ＳＯＤ１０４Ｃ９と名〔寸 けられた。

！酵 振盪フラスコ実験の結果から、２つのＨｕｔ”株Ｇ＋５ＯＤ１０４Ｃ１０（１コ ピー）とＧ＋５ＯＤ１０４Ｃ５（２コピー）、および、１つのＭｕｔ−株、に− ５ＯＤ１０４Ｃ５について、ｈＳＯＤ産生のための１１発発酵器評価した。Ｍｕ ｔ”細胞は、メタノール制限バッチ法で生育し、Ｍｕｔ−、ＩＭ胞はメタノール 過剰供給パンチ法または混合給送バッチ法の双方で生育できる：１、メタノール 供給バッチ、メタノールを制置したもの、Ｍｕｔ”表現型発酵器を７００ｍ　ｌ の基本塩培地（Ｒ終基本塩濃度は３．３×）　（１０ｘ基本塩ニリン酸（８５＄ ）４２．０ｍｌ／Ｉ、硫酸ｈ　ルシウム４ＨｚＯ１，８ｇ／　Ｉ　、硫酸ｈ　’ Ｊ　’７ム２８．６ｇ／ｌ　、ｔＥＲマグネシウム・７Ｈ２０２３，４ｇ／Ｉ、 水酸化カリウム６．５８７Ｉ）および４ｚグリセロールとともに高圧加熱滅菌し た。滅菌後、各３ｍｌのＹＴＭ、とＩＭ、を添加しＪＮＩｌ、０）１でｐＨを５ に合わせた。その後に、０．１１ストルクト一ルＪ６７３抗発泡剤を含む希釈し たＮＨ，０ｆｌ（１：４）を添加することによってｐＨ５を維持した。注入用培 養液は、選択用プレートから調製し、２１グリセロールを含む、リン酸緩衝化０ ．６７ｇ酵母窒素ベース（ｐＨ５）中で、３０℃で一晩培養した。発酵器に培養 した細胞を注入し、バｉソチ増殖過程を１８から２４時間続けた。基質が枯渇し た時点で、５ｏｚグリセロール供給（ＹＴＭ、とＩＮ、をそれぞれ１２＋ａｌ／ ｌ含む）を１２ｍ１／ｈで開始し、７時闇続けた。基質が消費され尽くした時点 、通常グリセロール供給後６時間後で、メタノール供給（ＹＴＮ、とＩＮ、をそ れぞれ１２＋ａｌ／Ｉ含む）を１．５ｎｌ／ｈｒで開始し、さらに３ｎｌのＹＴ Ｍ、とＩＮ、を発酵器に加えた。３０分おきに、１０ｇの増加分の調製を、最終 供給速度が７．５ｍｌ／ｈとなるまで１０時間続ける。容器は、ＭｅＯＨ誘導ｆ ＆４８〜８０時間後に回収した。

２、制限したＭｅＯＦＩ、連続培養、Ｍｕｔ”表現型発酵器は、上述の制限Ｍｅ ０１’を供給バッチ法と同様に調製した。グリセロールを消費し尽くした時点で 、５＄　ＭｅＯＨ供給（１リツトルＭｅＯＨあたり、４×基本塩、１２ｍ１　Ｙ ＴＭ４およびＩＭ、を含む）を１０繭１／ｈで開始した。５％　ＭｅＯＨ供給は 、続く６時間で６０ｎｌ／ｈを越えるまで増加した。判の植木の体積が１リツト ルに達した場きく約３０時間）、発酵器中の体積な１リツトルに一定に保つよう にしながら、回収流を供給流と同じ速度で開始した。

ＭｅＯＨで培養して１４３時間目に、１ｍ１の銅および亜鉛溶液を反応液に加え た。ＨｅＯ■培養２培養２闇５ から１００％　ＭｅＯＨ供給（ＹＴＭ．およびＩＭ＋　１２ｍ１／ｌ添加）に切 り替え、回収流を終了させることによって、連続培養を供給バッチ法に切り替え た。供給バッチ法は上述のように、７２時間行い、全体としてはＭｅＯＨで５０ ３時間培養した３、メタノール供給バッチ、過剰ＭｅＯＦｌ、Ｍｕｔ−表現型発 酵器は上述のＭｕじメタノール供給バッチ法と同様に調製し、培養液を注入した 。基質が消費され尽くした時点でメタノール供給（ＹＴＭ．およびＩＮ，をそれ ぞれ１２ｍ＋１７１含む）を０．５ｍｌ／ｈで開始し、ＹＴＭ．とＩＮ，をそれ ぞれ３繭１、発酵器に添加した．供給速度は、残存ＭｅＯＨ濃度が約４ｇ／ｌで 維持されるように、発酵中に増加させた。容器はＭｅＯＨ誘導後６から１０日後 に回収した。

４、混合給送バッチ、Ｎｕｔ−表現型 発酵器は上述のＭｕｔ”メタノール供給バッチ法と同様に調製し、培養液を注入 した．基質が消費され尽くした時点で、５ｏｚグリセロール供給（ＹＴＭ．およ びＩＮ，をそれぞれ１２ｎｌ／１８ｉむ）を５．４ｍｌ／ｈで開始し、６時間行 った。つぎに、グリセロール供給速度をＬ５ｍｌ／ｈに落とし、各３嗣のＹＴＭ ．とｒ？Ｌを加え一ＭｅＯＦｔ供給（ＹＴＭ．およびＩＮ，をそれぞれｆ２ｍｌ ／Ｉ含む）を開始した。Ｎｅｏ■添加の初速度は約１ｍｌ／ｈ（ＭｅＯＨ：グリ セロール供給比は０．７：１）であった。３０分ごとのＩＢの増加旦の調整は、 最終供給速度が４．９ｍｌ／ｈ（ＭｅＯＨ：グリセロール供給比２：１）となる まで、つづく１０時間行った。ＭｅＯＨ供給速度は、残存メタノール濃度が４ｇ ／ｌを越えないように調節した。容器は、ＭｅＯＨ誘導後８０時間で回収した。

結果 Ｍｕｔ”株（２コピー、および１コピー）は、メタノール供給バッチ法を用いて 、高い細胞密度（３４０−３５０ｇ　Ｗ／Ｉ）にわずか５４時間で到達した（発 酵法１）。（′″四”は゛″湿潤重量”を意味する。）Ｈｕｔ−株に通常用いら れるメタノール供給バッチ法（発酵法３）は、はるかに長い発酵であって、典型 的に６日から１０日続く。例えば、このような方法で、２８０ｇＭＷ／Ｉ細胞密 度に達するまでに１５０時間かかった。混合給送法（発酵法３）を用いて、Ｈｕ ｔ−株がＨｕｔ”株と同等の細胞密度にをるのに短い培養時間しかかからないこ とがしめされた。３８０ｇ四／ｌ（９５ｇ乾燥重量／１）の細胞密度となるのに ８０時間かかった。

発酵法１．３、および４におけるｈｓＯＤ発現のタイムコースから、最も高いｈ ｓＯＤレベル（３５００ｋｌＪ／ｕｇ、あるいは３．ＳＵ／ｐｇの比活性を基に すると０．９２ｇ／Ｉ）は、２コピーのＮｕｔ”株によって産生された。この株 はまた、表６に示すように、最も高い死生産性のひとつである２４０Ｕ／ｇ　１ Ｉ１１１Ｉ−ｈを示した。

１コピーの株の中では、最も高い発現レベルおよび死生産性を示したのはＨｕｔ ’株ζ゛あり、その次が混合基質で培養したＭｕじ株であった。メタノール制限 供給バッチ法で培養したＭｕじ細胞は、他のものよりも生産性が低かった。

同様な収量及び死生産性から示唆されたように（表６）、発酵法１の初期の実行 は、その方法の後期の実行において再現性を示した。この発酵法の後半の２つの 実行は、メタノールで８０時間誘導したものである。ｈｓＯＤの収量は誘導条件 下で産生される細胞量に比例するため、高い発現レベル、それぞれ５１００ｋＵ ／ｌおよび１４００ｋＵ／Ｉはより長い実行によって得られた。ｈｓＯＤの比活 性のわれわれの決定法に基づくと、最大の発現レベルは後期の発酵法１の実行に よるものであった。このとき、発酵器体積１リットルあたり、１．３ｇのｈｓＯ Ｄが産生された。

上述のように、実行４７６は、まず連続培養法で行われ、続いて供給バッチ法で 行われた。連続培養では、ｈｓＯＤレベルは４３１時間維持され、反応液への銅 および亜鉛の添加には非感受性であった。表６に示すように、この発酵法によっ て培養された２コピ一株Ｇ＋５ＯＤ１０４Ｃ３は最高の死生産性を示した（３３ ０Ｕ／ｇ／ｈ）。

実行４４５と４４６について表６の結果を比較すると、混合給送発酵の利点が明 らかになる。

上述のｈｓＯＤ発現レベルは、後述の活性アッセイのデータを基にしている。活 性アッセイは機能的な分子のみを測定するので、変性した酵素あるいは活性のな い酵素は検出されないルたがって、示された発現レベルは下限である；実際のレ ベルはこの値と同じか、あるいはより高くなる。

ヒトＳＯＤ活性アッ七イ 硝酸アッセイ［Ｙ、オヤナギ、Δｎａ１．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１４２．２９０ 　（１９８４）］をｈｓＯＤ活性の測定に用いた。このアッセイはｈｓＯＤによ る、ヒドロキシルアミンの硝酸への酸化に基づくものであり、この硝酸は指示染 色剤によって検出される。

硝酸アッセイはピキア抽出物中のｈｓＯＤ濃度の測定に非常、に有用であること が知られている。表７は、発酵過程に集められた幾つかの試料は高い活性を示す のに体し、コントロール試料（Ｇ−ＰＡＯ８０４）ははるかに低い値を示し、し ばしば組み換え株の５ｚ程度の値しか示さなかったルたがって、このアッセイは 組み換えｈｓＯＤ活性を抽出物中の他のＳＯＤ様活性と区別でき、表７で示され るように、一般に偏差は１０％以下であった。

釣坦乙ム匁工 ４４１−２１　．７９１　１０．４４ ４４１−５４　１．７７９　４．００ ４４２−２１　．３８５　６．９４ ４４２−５４　．５６９　１１．４０ ４４５−３４　６．８９ ．３４０ １番号は４回のアッセイの値の平均値である。

２試料の平均値の標準偏差から算出した。

硝酸アッセイは、ヒト赤血球ＳＯＤ標準（シグマケミカル社）とＰ、バストリス から精製したヒト組み換えＳＯＤの双方についてチトクロームＣアッセイととも に行い、チトクロームＣアッセイに対して補正した。赤血球ＳＯＤは、発売元に よってチトクロームＣアッセイで比活性２．７ユニツト／μｇと報告されている 。我々は、このアッセイで比活性が３．８ユニット／ＩＩｇと測定し、本発明に よって調製したｈｓＯＤが同等の値を示すことを見いだした。すべてのタンパク 質濃度は定量的アミノ酸分析を用いて決定した。硝酸アッセイは、２つの調製物 に対しても同等の値を示した。したがって、未知試料から得られた値は常に既知 の比活性の精製酵素から得られた値と比較することにより、簡便で、より明確に 区別できる硝酸アッセイを用いることが可能となる。

Ｐ、パストリス中で産生されたｈｓＯＤの精製と安定性９０２以上の組み換えｈ ｓＯＤは、単純な緩衝液中でグラスビーズでＰ、パストリス細胞から抽出した。

典型的には、０．ｂＩＩＭ　ＥＤＴ＾を含む５０静リン酸ナトリウムまたはリン 酸カリウム緩衝液（ｐＨ７、ｓ）を使用し、ベレットを集めた後の回収率は、活 性アッセイまたはウェスタンプロットのいずれかで測定した場１ｓｓｓ以上であ った。（酵素が安定であれば、別の緩衝液も使用可能である。〉組み換えｈｓＯ Ｄは、マツコード（ＭｃＣｏｒｄ）他、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２４１ ．６０４９　（１９６９）が赤血球抽出液について示した方法を実質的に用いて 細胞抽出液から精製した。

ヘモグロビンは、エタノール−クロロホルム処理によって赤血球調製物から沈殿 させる。同様に、多くの酵母タンパク質は、Ｐ、パストリス抽出液から除去され る。抽出液体積の２５πのエタノールを１滴ずつ撹拌している抽出液懸濁液に加 え、塩水−氷バス中で４℃以下に保った。クロロホルムを同様に加えた（最初の 抽出液体積の１５ｚ）混入しているタンパク質を変性させ、氷バス中でさらに１ ５分撹拌することによって沈殿させ、沈殿物を遠心によって除去した。

スーパーオキシドジスムターゼを、相抽出過程によってさらに精製した。２５℃ に暖めな上清に２塩基性リン酸カリウムを添加した。３ｏｚのに２■ＰＯ１（重 量対体積）をエタノール−クロロホルム溶液に溶解したときに、ｈｓＯＤは、高 温の下層と分離して上層にくる。上層を４℃に冷却して、遠心してきれいにする 。

組み換えｈｓＯＤを冷たいアセトン（上清体積の７５ｚ）で沈殿させ、遠心し、 少ない体積に懸濁して濃縮した。溶液を２．５ｍＭリン酸カリウム、ｐＩ（７， ８に対して透析した。（リン酸カリウム緩衝液のかわりに、別の低イオン強度の 中性付近の緩衝液を用いてもよい。）この緩衝液は次の過程で用いるＤＥ−５２ または同様な陰イオン交換樹脂の平衡緩衝液でなければならない。ｈｓｏｎはＤ Ｅ−５２からリン酸カリウム、ｐＨ７，８の２．５ＩｅＭから１００−の勾配で ？写出する。

３〜５℃で抽出液を保存する場合、ｈｓＯＤ活性は少なくとも４週間は安定であ る。精製タンパク質としては、Ｐ、パストリス由来の組み換えｈｓＯＤは３〜５ ℃で少なくとも８週間安定である。

寄託 生育可能なＰ、バストリス株Ｇ５１１５の培養液は、特許目的の微生物寄託に関 するブタペスト条約、およびその下に公布された規定に基づいて、アメリカン・ タイプ・カルチャー・コレクション、米国メリーランド州ロックビル、（“′＾ ＴＣＣ”）に、１９８７年８月１５日に寄託され、＾ＴＣＣ受託番号２０８６４ を与えられている。

前述の説明は、本発明を実行する際に使用可能なより特異的な方法である。上述 の説明は詳細ではあるが、ここで全体の本質を制限するものとして述べられたも のではない；むしろ、本発明の境界は、請求の範囲の法的な説明によってのみ支 配されるものである。

浄書（内容に変更なし） Ｍｕｔ−宿主の混合供給 メタノール培養時間 １リツトル　ウシ　リゾチーム発酵 メタノール培養時間 メタノール培養時間 混合供給Ｍｕｔ−のスケールアップ メタノール培養時間 補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成　３年　３月２６日 特許庁長官　植　松　敏　殿　、磁 １、特許出願の表示 ＰＣＴ／ＵＳ８９１０４１６４ ２、発明の名称 混合給送組換え酵母発酵 ３、特許川原状 住　所　アメリカ合衆国カリフォルニア用９２０３７．　ラ・ホーラ。

ノース・トーレイ・バインズ・ロード　１　’０２８０名　称　ザ・サルク・イ ンスティチュート・バイオテクノロジー／インダストリアル・アソシエイツ・イ ンコーホレーテッド４、代理人 住　所　東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手町ビル　２０６区 （１）　補正書の翻訳文　１通 請求の範囲 （１）　組み換え体Ｐ、パストリス酵母宿主の培養物からの組み換え遺伝子産物 の産生方法であって、該産物がメタノール反応性プロモーターに機能的に連結し ている外来の遺伝子をコードしているＤＮＡから発現することによって産生され るものであって； （ａ）゛増殖培地中に生育可能な酵母細胞の密度が増加するのに十分な時間、該 酵母宿主細胞を高増殖過程とすることであって、栄養培地が次のものを含んでい ること： メタノール反応性プロモーターを抑制するのに十分な、非制限的な濃度の抑制炭 素源であって、それによって該外来遺伝子からの組み換え遺伝子産物の発現を抑 制するもの、および、 実質的にメタノールを含まないこと、 その後、 （ｂ）　該酵母宿主のメタノール代謝経路が脱抑制するのに十分な時間、制限さ れた量の抑制性炭素源を供給すること、およびその後に、（Ｃ）　該酵母宿主細 胞を高産生過程とすることであって、メタノール供給が開始され、それによって 培地がメタノールと抑制性炭素源栄養の混合液となり：そこにおいて培地中のメ タノール濃度が該外来遺伝子由来の組み換え遺伝子産物の発現を誘導するのに十 分であること、 の過程による該酵母宿主を培養することを含む方法。

（２）　該酵母宿主がｍｕｔ−であるところの請求の範囲第１項記載の方法。

（３）　該酵母宿主がｍｕｔ“であるところの請求の範囲第１項記載の方法。

（４）　該プロモーターがＡＯＸＩであるところの請求の範囲第１項記載の方法 。

（５）　該抑制性炭素源栄養がグリセロールまたはグルコースであるところの請 求の範囲第１項記載の方法。

（６）　該組み換え遺伝子産物がスーパーオキシドジスムターゼタンパク質であ るところの、請求の範囲第１項記載の方法。

（７）　該組み換え遺伝子産物が上皮成長因子タンパク質であるところの、請求 の範囲第１項記載の方法。

（８）　該組み換え遺伝子産物がリゾチームであるところの、請求の範囲第１項 記載の方法。

（９）　該過程（Ｃ）が約２：１のグリセロール：メタノール比を用いて行われ るものである、請求の範囲第１項記載の方法。

（１０）　該過程（Ｃ）が約４：１のグリセロール：メタノール比を用いて行わ れるものである、請求の範囲第１項記載の方法。

（１１）　該過程（Ｃ）が、メタノール濃度が培地中で約１％を越えないように メタノール供給速度を調節することによって行われるものである、請求の範囲第 １項記載の方法。

（１２）　該培養が約２７℃から３５℃で行われるものである、請求の範囲第１ 項記載の方法。

（１３）　該プロモーターがＡＯＸ１プロモーターであるところの請求の範囲第 ５項記載の方法。

（１４）　該プロモーターがＡＯＸ１プロモーターであって該酵母宿主がｍｕｔ −株であるところの、請求の範囲第５項記載の方法。

（１５）　該プロモーターがＡＯＸ１プロモーターであって該酵母宿主がｍｕｔ ′″株であるところの、請求の範囲第５項記載の方法。

手続補正書（方式） １、事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ８９１０４１６４ 平成１年特許願第５１０３８４号 ２、発明の名称 混合給送組換え酵母発酵 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所 名　称　ザ・サルク、・インスティチュート・バイオテクノロジー／インダスト リアル・アソシエイッΦインコーボレーテッド ４、代理人 住　所　東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手町ビル　２０６区 ６、補正の対象 （１）出願人の代表者名を記載した国内書面国際調査報告 −ａｈｋａ１ム　’ＰＣＴ／ＵＳ８９１０４１６４

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. （１）組み換えメチル栄養性酵母宿主の培養物からの組み換え遺伝子産物の産生 を増加させる方法であって、該産物がメタノール反応性の発現調節因子に支配さ れるように連結している組み換え遺伝子配列からの発現によって産生されるもの であって、該方法が混合栄養供給材料を用いて該メチル栄養性酵母宿主を培養す ることを含むものであって、細胞増殖−遺伝子誘導法が、（ａ）栄養培地が高濃 度の多炭素、炭素源栄養を含んでいるがほとんどまたはまったくメタノールを含 まない培地であって、該組み換え遺伝子産物を発現によって実質的な量を産生せ ずに、栄養増殖培地中で生育可能な酵母細胞密度を増加させるために十分な期間 である、高増殖過程、（ｂ）該酵母宿主のメタノール代謝経路を脱抑制するため に十分な期間、制限された量の多炭素、炭素源栄養を与えること、（ｃ）発酵培 養液を、低温度の多炭素、炭素源栄養に維持しながらメタノール濃度を上昇させ 、組み換え遺伝子産物の高発現段階に維持させること、からなる過程を含むもの である方法。
2. （２）該過程（ｃ）をグリセロール：メタノール比約２：１で行うものである、 請求の範囲第１項記載の方法。
3. （３）該過程（ｃ）をグリセロール：メタノール比約４：１で行うものである、 請求の範囲第１項記載の方法。
4. （４）該過程（ｃ）を、残存メタノール濃度を約１％までとするように、過程の 期間中メタノール濃度を調節することによって行うものである請求の範囲第１項 記載の方法。
5. （５）該培養が約２７℃から３５℃で行われるものである、請求の範囲第１項か ら第４項のいずれかに記載の方法。
6. （６）該メチル栄養性酵母宿主がピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔ ｏｒｉｓ）株であって、該メタノール反応性発現調節因子がＡＯＸ１プロモータ ーであるものである、請求の範囲第１項から第５項のいずれかに記載の方法。
7. （７）該メチル栄養性酵母宿主がＭｕｔ−株である、請求の範囲第１項から第６ 項のいずれかに記載の方法。
8. （８）該メチル栄養性酵母宿主がＭｕｔ＋株である、請求の範囲第１項から第６ 項のいずれかに記載の方法。
9. （９）組み換え発現産物が動物リゾチームｃであるところの、請求の範囲第７項 および第８項のいずれかに記載の方法。
10. （１０）組み換え発現産物がウシリゾチームｃ２であるところの、請求の範囲第 ９項記載の方法。
11. （１１）組み換え発現産物がヒトリゾチームであるところの、請求の範囲第９項 記載の方法。
12. （１２）組み換え発現産物がヒトＥＧＦ（１−５２）およびヒトＥＧＦ（１−４ ８）からなる群から選択されるものである、請求の範囲第７項および第８項のい ずれかに記載の方法。
13. （１３）組み換え発現産物がヒトＥＧＦ（１−４８）であるところの、請求の範 囲第１２項記載の方法。
14. （１４）組み換え発現産物はヒトスーパーオキシドジスムターゼであるところの 、請求の範囲第７項および第８項のいずれかに記載の方法。