JPH04501714A - 免疫調節活性を有するマトリックス - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 免疫調節活性を有するマトリックス 本発明は、少なくとも１種の脂質および少なくとも１種の免疫調節作用を有する サポニンからなるイスコム（ｉｓｃｏｍ　）マトリックス、そのマトリックスの 製造方法、それからなるワクチンおよびキットならびにそのマトリックス中に導 入する新規なサポニン類およびその新規なサポニンの製造方法に関する。

今日では、多くの微生物およびウィルス抗原か新しい技術によって製造できる。

しかしながら、ワクチンにおけるそれらの完全な保証は、抗体および／または細 胞仲介免疫応答を増大させる物質である有効なアジュバントとともに投与しない と実現しない。

現在、大部分の国でヒトへの使用が認められているアジュバントは、たとえばジ フテリアおよび破傷風トキソイドに対する抗体応答を増大させるために古くから 用いられてきた水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムのみである。これ らのアジュバントは多くのワクチンに対して有効ではあるが、研究の結果、他の アジュバントたとえばフロイントの完全アジュバント（ＦＣＡ）およびＱｕｉｌ 　Ａは、実験動物において抗体応答および細胞仲介免疫の誘発にさらに効果的で ある場合が多い。実際、これらは感染防郭にしばしば必要とされる。しかしなが ら、ＦＣＡは注射部位に肉芽腫を生じ、これがＦＣＡをヒトおよび動物用ワクチ ンに許容できないものとしている。実際、水酸化アルミニウムでも肉芽腫の形の 反応を注射部位に生じることがある。これらの理由から、ＦＣＡの有効性もち、 望ましくない副作用をもたないアジュバントの開発の多くの試みがなされている 。

ＭｏｒｅｉｎのＥＰＣ特許出願第８３８５０２７３．０号および第８５８５０３ ２６．１号には、疎水性領域をもつ抗原決定基とグリコシドの間の免疫原性複合 体、どくにトリテルペンサポニンととくにＱｕｉｌ　Ａの、いわゆるイスコム複 合体が記載されている。このようなイスコムでは、Ｑｕｉｌ　Ａの量は約１０〜 １００分の１でよく、それでＱｕｉｌ　Ａを遊離の形で抗原と混合した場合と同 じ抗原効果が得られる。

欧州特許出願第８７２０００３５．１号には、基本的なイスコム構造の形成には 抗原の存在は必要ではないことが示されている。すなわち、これは、ステロール たとえばコレステロール、リン脂質たとえばホスファチジルエタノールアミン、 およびグリコシドたとえばＱｕｉｌ　Ａから形成させることができる。

抗原を含まない基本的なイスコム構造の製造にはリン脂質も必要でないことが新 たに見出されたのである。典型的なケージ様のイスコム構造に類似の複合体、い わゆるマトリックスへ組立てられる必須の構成成分は、グリコシドたとえばＱｕ ｉｌ　Ａとともに、ステロールたとえばコレステロールであることが明らかにさ れた。また同時に、このマトリックスは、アジュバントのような免疫調節作用ま たは免疫抑制作用をもつことがわかったのである。

本発明は、少な（とも１種の脂質たとえばステロール、好ましくはコレステロー ル、および１種もしくは２種以上のサポニンたとえばトリテルペンサポニン、と くにＱｕｉｌ　Ａまたは脂質小胞ではないその下位成分の間の複合体に関し、そ れは意図的な抗原または抗原決定基を含まず、免疫調節剤として使用される。す なわち、イスコムの場合に行われるような抗原成分は包含されていない。

このマトリックスはアジュバント作用を有し、１種または２種以上の、好ましく はマルチマー型の抗原と一緒に混合して使用できる。

このイスコムマトリックスには、疎水性領域をもつ他のアジュバントを組み込む こともできる。他のアジュバントの包含を容易にするためには、他の脂質の添加 が必要になる場合もある。すなわち、本発明はまた、コレステロールおよびサポ ニン以外の脂質およびアジュバントも含有する複合体に関する。このような複合 体は、コレステロールおよびサポニン、好ましくはＱｕｉｌ　Ａもしくはその下 位成分、１種もしくは２種以上の他のアジュバント、ならびに１種もしくは２種 以上のコレステロール以外の脂質からなるマトリックスを含有する。これらは、 脂質小胞やリポソームではないことが好ましく、電子顕微鏡的にきわめて特殊な 構造を有する。

リポソームは文献に記載されていて、それらの一般的な構造は生物学の研究者に はよく知られている。リポソームは、ｌまたは２以上の一連の脂質層からなる小 胞で、各層の間に水層が配置された玉ねぎ様の構造を形成している。

マトリックスは、マルチマー型の抗原との混合物として、動物またはヒトに注射 することができる。別法として、マトリックスと抗原は別個に注射することもで きる。

この場合、アジュバントマトリックスと抗原は、同じリンパ腺に排出される領域 に注射すると、最良の結果が得られる。アジュバントを、本発明のマトリックス 中にマルチマーの形で供給すると、アジュバントの用量は、アジュバントをモノ マー型または不定型で別個に注射する場合に比べて減量することができる。これ は、アジュバントを慣用的に、すなわちそのまま単独で注射した場合に生じる毒 性的副作用が低減もしくは回避できることを意味する。しかし一方、上述の特許 出願によるイスコム複合体では、アジュバントの用量は従来用いられていた量か ら減量することはできない。

アジュバントを本発明のマトリックス中で使用する場合には、上述のＥＰＣ特許 出願によるイスコム粒子において行われるように、抗原をアジュバントと同じ粒 子内に組み込む必要はない。これは、両親媒性のない抗原または疎水性領域を曝 露させることができない抗原も使用できることを意味している。たとえば、一部 のウィルスたとえばピコルナウィルス、アデノウィルスまたはパルボウイルスは 両親媒性蛋白質をもたず、数個のコピーすなわちマルチマーとして存在する抗原 による顕微鏡では見えない形態をもっている。このようなウィルスについては、 それらに疎水基をカップリングさせるかまたは他の手段（たとえば部分変性）で 疎水基を創成し、それらをイスコム粒子に組み込ませるよりも、新しいアジュバ ント複合体と一緒にそれらを注射する方がより実用的である。

通常、本発明のマトリックスは、ステロール好ましくはコレステロール、および １種または２種以上のサポニンを、モル比約ｌ＝１または重量比約１：５で含有 する。複合体は電子顕微鏡で見ると、輪状のサブユニットまたは球状構造の部分 からなる開いた球状構造を有する。

それらの沈降係数は約２Ｏ３である。

他のアジュバントを組み込む場合には、脂質−アシュバント−マトリックスは、 通常、ステロールとサポニンを約１：ｌのモル比で含有し、他のアジュバントと 脂質が合わせて約１モルになるようにする。このようなマトリックスでは、ステ ロール：サポニン：他のアジュバントおよび脂質のモル比は約１：１：ｌである 。すなわち、ステロール：サポニン：他のアジュバントおよび他の脂質のモル比 は１：１：０．１〜１：Ｏ，Ｉ〜１てあり、付加的な脂質またはアジュバントは 、そのモル比（またはそれらのモル比の合計）が存在するサポニンおよびステロ ールのモル比の半分になるまでマトリックス中に添加することができる。

電子顕微鏡で見た構造は、イスコムとマトリックスについて同一である（第１図 参照）。

マトリックス中に導入される物質の密度に依存するが、コレステロール、サポニ ン、他のアジュバントおよび脂質を含有するマトリックスの場合、約１２〜２２ である。

サポニンは、Ｒ，Ｔｓｃｈｅｓｃｈｅ　＆　Ｗｕｌｆ　：　Ｃｈｅｍｉｅ　ｕｎ ｄＢｉｏｌｏｇｉｅ　ｄｅｒ　５ａｐｏｎｉｎｅ　ｉｎ　Ｆｏｒｔｓｃｈｒｉｔ ｔｅ　ｄｅｒ　ＣｈｅｍｉｅＯｒｇａｎｉｓｃｈｅｒ　Ｎａｔｕｒｓｔｏｆｆ、 　Ｗ、　Ｈｅｒｚ、　Ｈ，Ｇｒｉｓｅｂａｃｈ、　Ｇ。

Ｗ、　Ｋｉｒｂｙ　刊、第３０巻（１９７３）に記載されているような疎水性領 域をもつ任意のサポニン、とくに極性の高いサポニン、主として極性トリテルペ ンサポニン、たとえばキラハ内皮（Ｑｕｉｌｌａｊａｂａｒｋ）からのサポニン エキス、アラーロシド（Ａｒａｌｏｓｉｄｅ　）　Ａ、チコセツサボニン（Ｃｈ ｉｋｏｓｅｔｓｕｓａｐｏｎｉｎ　）　Ｎ、キンセン力（Ｃａｌｅｎｄｕｌａ　 ）−グリコシドＣ、チコセツサボニン■、イノコズチ（Ａｃｈｙｒａｎｔｈｅｓ 　）−サポニンＢ、キンセンカーグリコシドＡ１アラーロシドＢ、アラーロシド Ｃ１ブトラジア（Ｐｕｔｒａ　ｊｉａ）−サポニン■、ベルサｖ　（Ｂｅｒｓａ ｍａ　）−サポニシド、プトラジアーサボニン■、トリコシド（Ｔｒｉ−ｃｈｏ ｓｉｄｅ　）　Ａ１トリコシドＢ１サポナシドＡ、）リコシドＣ１ジブソシド（ Ｇｙｐｓｏｓｉｄｅ　）　、ヌタノシド（Ｎｕｔａｎｏｓｉｄｅ）　、ジアント シド（Ｄｉａｎｔｈｏｓｉｄｅ　）　Ｃ，すボナシドＤ１好ましくはトチツキ（ Ａｅｓｃｕｌｕｓｈｉｐｐｏｃａｓｔａｎｕｍ　）からのニシン（ａｅｓｃｉｎ ｅ　）　（Ｔ、　Ｐａｔｔｌ　Ｗ、　Ｗｉｎｋｌｅｒ　：　Ｄａｓ　ｔｈｅｒａ ｐｅｕｔｉｓｃｈ　ｗｉｒｋｓａｍ　Ｐｒ１ｎｚｉｐｄｅｒ　Ｒｏｓｓｋａｓｔ ａｎｉｅ　（Ａｅｓｃｕｌｕｓ　ｈｉｐｐｏｃａｓｔａｎｕｍ　）　。

Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌｆｏｒｓｃｈｕｎｇ、　１０　（４）　、２７３〜２ ７５（１９６０））またはＧｙｐｏｓｏｐｈｉｌｌａ　ｓｔｒｕｔｈｉｕｍから のザボアルビン（５ａｐｏａｌｂｉｎ　）　（Ｒ，Ｖｏｃｈｔｅｎ、　Ｐ、　Ｊ ｏｃｓ　＆Ｒ，Ｒｕｙｓｓａｎ　：　Ｐｈｙｓｉｃｏ−ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｐｒ ｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆｓａｐｏａｌｂｉｎ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ｒｅｌａｔ ｉｏｎ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｆｏａｍ　５ｔａｂｉｌｉｔｙ。

Ｊ、　Ｐｈａｒｍ、　Ｂｅ１ｇ、４２．　２１３〜２２６　（１９６８））、と くにＱｕｉｌｌａｊａ　５ａｐｏｎａｒｉａ　Ｍｏ１ｉｎａからのサポニンエキ ス、主としてに、　Ｄａｌｓｇａａｒｄ　；　５ａｐｏｎｉｎ　Ａｄｊｕｖａｎ ｔｓ。

Ｂｕｌｌ　Ｏｆｆ　Ｉｎｔ　Ｅｐｉｚ、７７　（７−８）　、１２８９〜１２９ ５（１９７２）に従って製造されるＤＱ−エキス、およびに、　Ｄａｌｓｇａａ ｒｄ　：　５ａｐｏｎｉｎ　Ａｄｊｕｖａｎｔｓ　ＩＩｌ、　Ａｒｃｈｉｖｆｊ ｉｒｄｉｅ　Ｇｅｓａｍｔｅ　Ｖｉｒｕｓｆｏｒｓｃｈｕｎｇ、４４　、　２４ ３〜２５４（１９７４）に従って製造されるＱｕｉｌ　Ａを使用できる。Ｑｕｉ ｌ　Ａおよびそのサブフラグメント、とくに以下に記載のフラグメントＢ２、Ｂ ３およびＢ４Ｂが好ましい。

本発明はまたβ−アミリン（Ａｍｙｒｉｎ）型のＱｕｉｌｌａｊａＳａｐｏｎａ ｒｉａ　Ｍｏ１ｉｎａから誘導される、８〜１１個の炭水化物残基を有する新規 なグリコジル化トリテルペノイドサポニンに関する。これらは以下の特性を有す る。

ａ）物質Ｂ２は分子量１９８８で、ＩＣ核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルは図５ Ａおよび図６Ａに、プロトンＮＭＲスペクトルは図１１Ａおよび１２Ａに示すと おりである。

ｂ）物質Ｂ３は分子量２１５０で、”ＣＮＭＲスペクトルは図５Ｂおよび図６Ｂ に、プロトンＮＭＲスペクトルは図１１Ｂおよび図１２Ｂに示すとおりである。

Ｃ）物質８４Ｂは分子量１８６２で、”ＣＮＭＲスペクトルは図５０および６Ｃ に、プロトンＮＭＲ構造は図１１Ｃおよび１２Ｃに示すとおりである。

化合物Ｂ２およびＢ３はそれ自体、アジュバント活性を存する。したがって、本 発明はまた、これらの化合物のアジュバントとしての使用に関する。化合物８４ Ｂはイスコムマトリックスの製造に有用である。アジュバント活性を有するＢ２ およびＢ３はマトリックス中に包含させることができる。

マトリックスはステロールたとえばコレステロールおよびサポニン８４Ｂから製 造できる。このマトリックスは強力なアジュバント活性はもたないようである。

このマトリックスのアジュバント活性を強化するためには、サポニンＢ２および ／またはＢ３および／またはアジュバント作用を有し、疎水基をもつ任意の他の 物質を組み込むことが可能であり、好ましい。アジュバントが疎水基を含まない 場合には、このような基を既知の化学的方法を用いてアジュバントにカップリン グさせることもできる。Ｂ２またはＢ３以外の他のアジュバントを組み込む場合 には、１３頁の最終バラグラフおよび１４頁のバラグラフ１〜３に掲げたような 脂質をさらに導入することが好ましい。

ステロール−８４Ｂマトリツクスでは、疎水基を含有するかまたはこのような基 を予めカップリングさせた免疫抑制物質を組み込むことも可能である。

ステロール−８４Ｂマトリツクスは、アジュバント、免疫抑制物質もしくは抗原 またはそれらの混合物と混合して、免疫調節剤として使用することも可能である 。

免疫調節剤としては、免疫系を増強、抑制または変化させる物質、たとえばアジ ュバント、サプレッサー、インターロイキン、インターフェロンまたは他のサイ トカインが考慮される。

本発明は好ましくは、ステロール、とくにコレステロール、８４ＢならびにＢ２ およびＢ３の一方または両者を含有するマトリックスに関する。マトリックスが コレステロールとＱｕｉｌ　Ａから製造される場合、それはＢ２゜Ｂ３およびＢ ４Ｂからなる。

マトリックスは、少なくとも１種のステロールを溶媒中に溶解し、１種または２ 種以上のサポニンおよび場合によっては他のアジュバントと脂質を加えて製造で きる。

ついで、溶媒を除去し、マトリックスをその成分が溶けない溶液たとえば水溶液 に移す。これは、ゲル濾過、限外濾過、透析または電気泳動によって行うことか できる。

ついて、マトリックスは過剰のステロールおよびＱｕｉｌＡから、たとえば密度 勾配による遠心分離またはゲル濾過によって精製してもよい。溶媒としては、水 または以下に述べるような可溶化剤もしくは界面活性剤を使用できる。

マトリックスの形成に際して起こる唯一の限定因子は様々な物理−化学的環境に おけるその所要時間であり、主要な速度限定因子はステロールたとえばコレステ ロールの水への低い溶解性である。マトリックス形成サポニンは水に自由に溶解 する。

Ｑｕｉｌ　Ａとコレステロールでは、固相においても、比較的長時間たとえば約 １カ月を要するものの、マトリックス様の形成が起こることが明らかにされてい る。コレステロールをＱｕｉｌ　Ａまたはその精製成分と接触させなければなら ない。コレステロールを超音波処理およびウルトラタラックス処理によってコロ イド状水懸濁液にすると、Ｑｕｉｌ　Ａとのマトリックスは約１２時間で形成す る。

したがって、界面活性剤のような、水に加えてコレステロールの水性媒体中にお ける溶解度を増大させる任意の他の物質が、マトリックスの形成に要する時間を 短縮させる。すなわち、コレステロールをコロイド型にすれば、コレステロール 、水およびＱｕｉｌ　Ａまたはその下位成分からマトリックスを製造することが できる。しかしながら、界面活性剤または溶媒を添加する方が実用的である。好 ましくは、サポニンは、少なくともそのミセル形成臨界濃度（ＣＭＣ）以上の濃 度で使用される。

Ｑｕｉｌ　Ａの場合、これは少なくとも０．０３重量％の濃度である。

可溶化剤としては、非イオン性、イオン性すなわち陽イオン性もしくは陰イオン 性または両イオン性界面活性剤のような界面活性剤、たとえば　Ｚｗｉｔｔｅｒ ｇｅｎｔまたは胆汁酸に基づく界面活性剤（過剰に用いられる）が使用できる。

適当な非イオン界面活性剤の典型的な例には、Ｎ−アルカノイル−Ｎ−アルキル −グルカミン、脂肪族または芳香族脂肪族酸およびアルコールとのポリゲルコー ルエステルおよびポリグリコールエーテルがある。これらの例としては、一般式 ％式％ する）を有するアルキルポリオキシエチレンエーテル、アルキル基とポリオキシ エチレン鎖の間にフェニル環を含有するアルキルフェニルポリオキシエチレンエ ーテル、略号Ｃ１φＥ、たとえばＴｒｉｔｏｎ　Ｘ　−１００＝　ｔｅｒｔ　− Ｃ，Ｅ、、、（ポリエチレンオキシドのオクチルフェノールエーテル）、アシル ポリオキシエチレンエステル；アシルポリオキシエチレンソルビタンエステル、 略号Ｃ。

ソルビタンＥ８、たとえばＴｗｅｅｍ　２０、Ｔｗｅｅｍ　８０、β−Ｄ−アル キルグルコシドたとえばβ−Ｄ−才クチルりルコシドがある。適当なイオン性界 面活性剤の代表的な例には胆汁酸界面活性剤たとえばコール酸、デソキシコレー ト、コレートおよびＣＴＡＢ　（臭化セチルトリアンモニウム）がある。揺台型 界面活性剤たとえばタウロデオキシコレート、グリコデオキシコレートおよびグ リココレートも同様に使用できる。その他の使用可能な可溶化剤には、リゾレシ チンおよび合成リゾリン脂質がある。

上述の界面活性剤の混合物も使用できる。透析法を用いる場合には、界面活性剤 はあまり長時間を要せずに透析可能なものでなければならない。

ある種の界面活性剤はマトリックスの形成を著しく促進する。これらには、極性 頭部基と非極性脂肪族鎖をもつ内因性生体膜脂質、たとえばホスファチジルコリ ン（陰性に荷電）およびホスファチジルエタノールアミン（陽性に荷電）が包含 される。

可溶化は、アルコール、存機溶媒もしくは小さな両媒性分子たとえばヘプタン− １，２，３−）−リオール、ヘキサン−１，２，３−）リオール、またはカオト ロピック剤、酢酸たとえばトリフルオロ酢酸、トリクロロ酢酸、尿素もしくはグ アニジン塩酸塩によって行うこともできる。

使用が好ましいものは、エチルアルコール、ジオキサン、エーテル、クロロホル ム、アセトン、ベンゼン、酢酸、二硫化炭素、ＭＥＧＡ−１０（Ｎ−デカノイル −Ｎ−メチルグルカミン）、およびβ−オクチルグルコシドである。

これらの物質により様々な収率でマトリックスが得られ、全体的には、系内の界 面活性剤の濃度が高いほど、多量のマトリックスが形成する。

上述のいずれの系においても、マトリックスを製造し、精製し、滅菌することが 技術的に可能である。したがって、可溶化剤の化学的性質およびその濃度が最終 生成物たとえばワクチンの目的で許容されるものであるならば、マトリックスの アジュバント活性プレバレージョン中に可溶化剤が含まれていてもよい。しかし ながら、多くの場合、マトリックスから透析、限外濾過またはカラムクロマトグ ラフ法によって、可溶化剤を除去することが必要になる。プレバレージョンを希 釈して、用いられた可溶化剤または界面活性剤を許容濃度にすることも可能であ る。プレバレージョンは、水また生理的に許容される溶液で、好ましくは、その 系（プレバレージョン）に用いられた可溶化剤または界面活性剤がそのＣＭＣ以 下の濃度になるまで希釈する。

可溶化剤はマトリックス中に、ステロール：サポニン：他の脂質アジュバントま たは可溶化剤のモル比が１：１　：　１．すなわち脂質、アジュバントおよび可 溶化剤の合計のモル比がサポニンとステロールの合計のモル比の半分までとする 。

可溶化剤はまた、イスコムマトリックスと混合したままにしておいてもよい。

可溶化剤と他の免疫調節成分が統合されるためには、少なくとも１個の疎水性領 域をもたなければならない。

ない場合には、マトリックスの作成前に、成分にこのような疎水性領域を連結す ることができる。

イスコムマトリックスに導入できるアジュバントの例は、所望の免疫調節作用を もつ天然または合成の任意のアジュバントであり、たとえば、ムラミルジペプチ ド（ＭＤＰ）−誘導体たとえば脂肪酸置換ＭＤＰ、ＭＤＰのスレオニン類縁体； 両媒性共重合体、脂肪族アミンたとえばアブリジンまたはＤＤＡ、ポリアニオン たとえばデキストラン硫酸、リボ多糖たとえばサポニン（ＱｕｉｔＡ以外の）を 挙げることができる（“Ｆｕｔｕｒｅ　ｐｒｏｓｐｅｃｔｓｆｏｒ　ｖａｃｃｉ ｎｅ　ａｄｊｕｖａｎｔｓ　”　、　Ｗａｒｒｅｎ、　Ｈ，Ｓ、　：　ＣＲＣＣ ｒ１ｔ。

Ｒｅｖ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、８　：　２．　８３〜１０１．　１９８８　；“Ｃｈ ａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｎｏｎｔｏｘｉｃ　ｍｏｎｏｐｈｏ ｓｐｈｏｒｙｌｌｉｐｉｄ　Ａ　”　Ｊｏｈｎｓｏｎ、　Ａ、　Ｇ、ら：　Ｒｅ ｖ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、　９　：５、　５５１２〜５５１６．　１９８ ７　；’Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｓｔａｔｕｓ　ｏｆ　５ｙｎｔｈｅｔｉｃ 　ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ’　、　Ｂｅｒｅｎｄｔ。

Ｍ、　Ｊ、ら：　Ｙｅａｒ　［ｍｍｕｎｏｌ、１９３〜２０１．１９８５　；’ 　［ｍｍｕｎｏｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｎｇ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ“、　Ｓｔｅ ｗａｒｔ−Ｔｕｌｌ。

Ｄ、　Ｅ、　、　Ｖａｃｃｉｎｅ、３　：　１．　４０〜４４．　１９８５　； これらの４件の文献は参考として本明細書に導入する）。

以下の両イオン性、中性、陽性および陰性界面活性剤は、免疫調節活性とくにア ジュバント活性を有する界面活性剤の例である。

親水性ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）と疎水性ポリオキシプロピレン（ＰＯＰ） を様々なＰＯＥのモル重量百分率およびＰＯＰとＰＯＥの結合様式で含有する非 イオンブロックボリｖ　−（ＢＡＳＦ　Ｗｙａｎｄｏｔｔｅ　Ｃｏｒｐ、　）、 たとえばＬ７２．Ｌａ１．Ｌ９２．プルロニックＬＩＯ１、Ｌ１２１．２５３１ および３１Ｒ１，オクタブロックスＴ１５０１；β−Ｄ−才クチルグルコシド； 陽イオン界面活性剤たとえば臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡ ）　、オクタデシルアミン（ＯＣＴ）、および臭化セチルトリメチルアンモニウ ム（ＣＴＡＢ）；マルトスト−ステトラパルミテート、トレハロースモノマイコ レート、トレハロースジベへニルベヘネート；両性界面活性剤（Ｎ−アルキル− Ｎ、　Ｎ−ジメチルアンモニオ−３−プロパンスルホネート）Ｚ３−８．Ｚ３− １０、　２３−１２．　Ｚ３−１４．　２３−１６　（Ｃａｌｂｉｏ−ｃｈｅｍ 、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　ＣＡ、　ＵＳＡから入手される）；Ｚ３−１８　（Ｓ ｅｒｖａ、　Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、　Ｆ　ＲＧから入手される）。

Ｍｙｒｊ４５．　Ｂｒ１ｊ５２．　Ｂｒ１ｊ５８　（同じ＜　５ｅｒｖａから） 、ならびにジオクチルスルホスクシネートおよびＴｗｅｅｎ　２０、　Ｔｗｅｅ ｍ　８０．　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ　−１００およびデオキシコール酸ナトリウム。

これらの界面活性剤は、界面活性剤およびアジュバントの両者として使用するこ とができ、イスコムマトリックスに導入できる。

以下は、ステロール（好ましくはコレステロール）８４Ｂマトリツクスに導入で きる免疫抑制剤の例である。

シクロスポリンＡ１臭化ジオクチルジメチルアンモニウム、１０個を越える炭素 原子、好ましくは１５個以上の炭素原子を有する陽イオン性単一鎖両親和剤、１ ４個まで好ましくは１２個までの炭素原子を有する二重鎖両親和剤。

所望のアジュバントまたは免疫抑制剤が適当な疎水性をもたない場合には、マト リックス中に導入するための疎水性ドメインを含むように修飾しなければならな い。

非疎水性アジュバントに連結できる疎水基は、１，２゜３．４，５．６，７．８ ，９．１０，１１．１２．１３゜１４．１５．１６．１７．１８，１９．２０． ２１，２２．２３．２４および２５個の炭素原子を存する直鎖状、分岐状、飽和 または不飽和脂肪族鎖、たとえば、好ましくは６，７および８個の炭素原子をも つ脂質、１．２゜３．４もしくは５個のアミノ酸、好ましくは２．　３．　４個 のＴｒｐ、ｌｉｅ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ。

Ｖａｒと（にＴｙｒから選ばれるアミノ酸をもつ小ペプチド；コール酸、ウルソ デオキシコール酸、またはコレステロール誘導体である。

これらの疎水基は、非疎水性蛋白質にカップリングできる基、たとえば、カルボ キシル、アミノ、ジスルフィド、ヒドロキシル、スルフヒドリルおよびカルボニ ル基たとえばアルデヒド基に結合しなければならない。

カップリングできる疎水基は、好ましくは、メタン、エタン、プロパン、ブタン 、ヘキサン、ヘプタン、オクタンのカルボキシル、アルデヒド、アミノ、ヒドロ キシルおよびジスルフィド誘導体、ならびにＣｙｓ、Ａｓｐ。

Ｇｌｕ、Ｌｙｓを含有するペプチド、好ましくはオクタナールおよびＴｙｒ　− Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ、Ａｓｐまたは−Ｇｌｕから選ばれる。カップリングで きる基をもつ疎水基は、たとえば上述の可溶化剤および界面活性剤、塩酸、酢酸 、６７容量％酢酸、ソーダ溶液、アンモニアを、溶解すべき物質に応じて補助的 に使用して溶解しなければならない。ついでｐＨを、その物質を沈殿させること なく中性方向に調整する。この場合、疎水基をカップリングさせる蛋白質が変性 しないようなｐＨ値にするように注意すべきである。

カップリング分子としてカルボキシル基をもつ疎水基は、水溶性のカルボジイミ ドまたは混成無水物によってアジュバントにカップリングさせることができる。

前者の場合は、カルボキシル基をｐＨ５においてカルボジイミドによって活性化 し、リン酸塩含量の高いｐＨ８の緩衝液中に溶解した蛋白質と混合する。後者の 場合は、カルボキシ化合物を、ジオキサンまたはアセトニトリル中、トリエチル アミンの存在下、イソブチルクロロホルメートと反応させ、得られた無水物をｐ Ｈ８〜９で蛋白質に加える。カルボキシル基をヒドラジンによりヒドラジドに変 換し、これを蛋白質中の過ヨード酸酸化糖単位におけるアルデヒドおよびケトン とヒドラゾン結合を形成させることができる。

アミノ基は亜硝酸により、低温でジアゾニウム塩に変換し、Ｔｙｒ、Ｈｉｓおよ びＬｙｓとアゾ結合を形成させることもできる。

ヒドロキシル基は無水コハク酸でヘミスクシネート誘導体に変換し、これをカル ボキシル基としてカップリングさせることもできる。

アルデヒド基は蛋白質中のアミノ基と反応させてシッフの塩基を形成させること ができる。

いくつかのカップリング基およびカップリング方法は、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　 Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ、５９　：　１２９〜１４３、　 ２８９〜２９９　（１９８３）、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ 、９３巻、２８０〜３３．およびＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ ｙ、　１１６　：　４０２〜４０７　（１９８１）に記載されている。これらは 参考として本明細書に導入する。

ステロール以外の脂質は、脂肪または脂肪類似物質、たとえば５０個までの炭素 原子を有する脂肪酸たとえば４．５，６，７，８，９，１０，１１，１２．１３ ．１４．１５，１６，１７，１８．１９．２０．２１，２２゜２３．２４．２５ ，２６，２７，２８．２９および３０個の炭素原子を存する飽和脂肪酸たとえば 酪酸、カップロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パ ルミチン酸、ステアリン酸、アラキト酸、ベヘン酸、リグノセリン酸または３０ 個までの炭素原子を有する不飽和脂肪酸たとえばヘキサデセン酸、オレイン酸、 リノール酸、リルン酸、アラキト酸を含有するトリグリセリドもしくは混合トリ グリセリド；ヒドロキシ脂肪酸たとえば９．１０−ジヒドロキシステアリン酸、 不飽和ヒドロキシ脂肪酸たとえばヒマシ油、分岐状脂肪酸、グリセロールエーテ ル、蝋すなわち高級脂肪酸と一部アルコールとの間のエーテル；リン脂質たとえ ばグリセロールホスフェートの誘導体たとえばホスファチジン酸の誘導体すなわ ちレシチン、セファリン、イノシトールホスファチド、１４，１５．１６．１７ ，１８．１９および２０個の炭素原子を有するスビンゴシン誘導体；グリコリピ ドイソプレノイド、スルホリピド、カロチノイド、ステロイド、ステロール、コ レスタノール、カブロスタノール、フィトステロールたとえばスチグマステロー ル、シトステロール、ミコステロール、たとえばエルゴステロール、胆汁酸たと えばコール酸、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、リトコール酸、ステ ロイドグリコシド、ビタミンへのエステル、またはそれらの混合物とすることか できる。

これらのまた他の有用な脂質は、Ｌｉｐｉｄ　ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄ 　１ｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、　Ｍ、　Ｉ、　Ｇｕｒｒ、　Ａ、　１．Ｊａｍｅ ｓ編、１９８０　、Ｃｈａｐｍａｎ　＆　Ｈａｌｌ、Ｌｏｎｄｏｎ、　Ｎｅｗ　 Ｙｏｒｋ、　ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅに記載され ている。これは参考として本明細書に導入する。

好ましくは、コレステロールホスファチジルコリン、リポソームまたは１ｎｔｒ ａｌｉｐｉｄ　ＴＭ　（、大豆油画分２００ｇ、卵黄レシチン画分１２ｇ、グリ セロール２２．５ｇ、および水で１１とする）が用いられる。

脂質は過程の任意の段階で、好ましくはサポニンの添加前に加えられるが、脂質 はサポニンの後で添加してもよい。

マトリックスは以下のように、透析法で製造するのが最善である。

２０％ＭＥＧＡ−１０または任意の他の適当な界面活性剤、好ましくは透析で除 去できる界面活性剤、たとえばβ−オクチルグルコシドに溶解し、（水または適 当な緩衝剤中）、５倍量のＱｕｉｌ　Ａ　（固体または水もしくは適当な緩衝液 たとえばＰＢＳに溶解して）と混合する。

混合物をＰＢＳに対してきわめて強力に、最初は゛−夜室温で（ＭＥＧＡ−１０ は＋４°Ｃで沈殿するから）、ついで＋４℃で透析する。マトリックスをたとえ ば３０９６（ｗ／ｗ）マクロースで（たとえばＴＳＴ４１．１３０−ター、１８ 時間、３９．０００　ｒｐｍ、１０℃）ペレット化して、過剰のＱｕｉｌ　Ａお よびコレステロールから精製する。ペレット化混合物をＰＢＳ　（または他の適 当な緩衝液）中に溶解し、濃度を１ｍｇ／ｍｌに調整する。

本マトリックスは免疫調節物質として使用することができる。免疫抑制物質また はアジュバントと混合し、またはマトリックス中に組合ませて、それらの増強剤 として使用できる。

ステロールたとえばコレステロール、サポニン、アジュバントおよび任意成分の 別の脂質を含有するマトリックスは、アジュバントとして使用できる。それは、 任意の病原生物からの任意の抗原もしくは抗原決定基、またはこれらの、もしく はこれらから誘導される任意のフラグメントもしくはサブユニットの抗原作用の 増強に使用できる。すなわち、それは、イスコム中に組み込まれる抗原のアジュ バントとして使用できる。このような抗原はＥＰＣ−特許出願８３８５０２７３ ．０および８５８５０３２６．１に記載されている。これらは参考として本明細 書に導入する。すなわち、マトリックスは、エンベロープを有するもしくは存し ないウィルス、細菌、原生動物、マイコプラズマ、寄生虫、軟体動物から誘導さ れる抗原もしくは抗原決定基、またはこれらの丸ごと生物とともに、アジュバン トとして使用できる。抗原または抗原決定基はさらに、ホルモン、酵素、炭水化 物および炭水化物含有構造体たとえばリボ多糖、ペプチドもしくは蛋白質または それらの組換え体であってもよい。

本発明はまた、少なくとも１種のマトリックスおよび１種または２種以上の抗原 性または免疫抑制性物質、ならびに医薬的に許容されるビヒクルを、混合してま たは別個コンパートメントに含有してなることを特徴とするヒトまたは動物用医 薬を包含する。

本発明はまた、マトリックス、１種または２種以上の抗原、および医薬的に許容 されるビヒクルからなるワクチンに関する。

さらに、本発明は、このような医薬またはワクチンからなるキットに関する。

一部の医薬またはワクチンにおいては、マトリックスの製造時に用いられる界面 活性剤が、その問題の製品について許容されるものであるならば、そのまま存在 していてもよい。

本発明の新規なアジュバント複合体の効果について、以下に、免疫刺激実験によ り説明する。

■、　イスコム、ミセルまたはミセル＋新規マトリックスとして提供される抗原 からの免疫原作用間の比較マウスを、イスコム複合体、ミセル、および本発明の 新規複合体（いわゆるマトリックス）とのミセルの形でのインフルエンザウィル スからのエンベロープ蛋白質によって免疫処置した。免疫応答は、注射後１５． ３０゜４４および５０日に、ＥＬＩＳＡ法で抗体を測定して評価した。以下の注 射を行った。

１、　５μｇのミセル＋０．１ｇｇマトリックスを混合し、左前肢に注射した。

２．５μｇのミセル＋０．１ｇｇマトリックスを別個に、右および左前肢に注射 した。

３．５μｇのミセル ４、ＥＰＣ８３８５０２７３，０に従って製造したスコム５μｇ 表　１ 局所反応の形での副作用は認められなかった。

この実験から、イスコムまたはミセル＋マトリックスの形でのインフルエンザか らのエンベロープ蛋白質が最高の抗体力価を与えると結論できる。マトリックス はきわめて低用量で提供することができ、なおアジュバント作用を存する。マウ スでアジュバント効果を得るためには、遊離型のＱｕｉｌ　Ａでは、マトリック スの用量の場合の１００倍の用量、すなわちＩＯμｇを要する。この用量ではＱ ｕｉｌ　Ａは局所的副反応を示し始める。マトリックスが明瞭アジュバント効果 を示すようになるためには、マルチマー型の抗原を同じ領域、たとえば四肢にマ トリックスとして注射しなければならない。すなわち、注射するアジュバントマ トリックス複合体と抗原は、同じリンパ腺に排出される領域に提供されなければ ならない。

２、　イスコムまたはミセルの形でのインフルエンザからのエンベロープ蛋白質 を、マトリックスまたはジフテリアトキソイド（ＤＴ）とともにまたはそれらを 加えないで用いた場合の免疫原作用間の比較 マウスにはエンベロープ蛋白質を次の形で注射した。

１．５μｇ　イスコム＋μｇＤＴ ２．５μｇ　イスコム ３．５μｇ　ミセル ４．５μｇ　ミセル＋０．１ｇマトリックスエンベロープ蛋白質における抗体応 答は、ＥＬＩＳＡ法により血清中で評価した。以下の結果が得られた。

３０　ｕ９．２０２　１５５．５５７　２２．ＬＯ７Ｂ７．０ＯＯ５ｏ　Ｌｌｏ 、６００　１１６．２００　３３．４００　９６．５００６５　１．６９１．Ｏ ＯＯ３，７Ｂ３．ＯＯｏ　２Ｂ３．３００　１．１４９．０ＯＯ８０５６２，８ ００２，５２９，ＯＯＯ５Ｌ２ｊＯ０９７６，５００１）最終希釈が４５０ｎｍ において有意な陽性値を与えるＥＬ　ＩＳＡ力価 局所反応の形での肉眼で認められる副作用はなかった。

インフルエンザウィルスからのエンベロープ蛋白質は、イスコムまたはミセル＋ 本発明のアジュバント複合体（マトリックス）の形で、最高の抗体力価を与える 。マトリックスの用量はきわめて低（、すなわち０．１μｇに維持することがで き、なお明瞭なアジュバント作用を有する。

３、　ジフテリアトキソイド（ＤＴ）モノマー型、モノマーＤＴ＋インフルエン ザウィルスからのエンベロープ蛋白質含有イスコム、Ｑｕｉｌ　Ａと混合したモ ノマーＤＴ。

およびコレステロールとモノマーＤＴ十本発明のアジュバント複合体（マトリッ クス）からの免疫原作用間の比較 この実験では、モデル抗原として、ジフテリアトキソイドをモノマー型で用いる 。

マウスにはジフテリアトキソイドを以下の形で注射した。

１、　５μｇＤＴ　（ジフテリアトキソイド）２．５μｇＤＴ＋５μｇ　イスコ ム ３、　５μｇＤＴ＋０．５μｇ　Ｑｕｉｌ　Ａ＋０．１μｇＣＬ（コレステロー ル〉 ４．５μｇＤＴ＋０．１μｇマトリックス１５　≦３０　≦３０　≦３０　≦３ ０３０　≦３０　≦３０　≦３０　≦３０５０　≦３０　≦３０　≦３０　≦３ ０６５　≦３０　９０　≦３０　１０．０００８０　≦３０　６０　９０　１． １００全群で、ＤＴに対する免疫原応答は低い。最良の結果は、ジフテリアトキ ソイド十本発明のマトリックスで免疫処置したマウスについて得られる。

上述の実験から、本発明のマトリックスをマルチマー型の抗原と一緒に使用する 場合に最良の結果が得られると結論できる。すなわち、本発明のマトリックスは 、たとえば遊離型Ｑｕｔｌ　Ａに比べ、アジュバントとしてきわめて良好な結果 を与えることが証明された。Ｑｕｉｌ　Ａの遊離型は、マウスでは１０μｇ、モ ルモットでは５０μｇ１ウシでは１ｍｇのような用量でアジュバントとして有効 であることを銘記すべきる。ワクチン注射に際しての実用的な用量は、小動物で １ｍｌ、大動物で２〜５または１０ｍ１である。Ｑｕｉｔ　ＡのＣＭＣ（臨界ミ セル濃度）は０．０３％であるから、１ｍｌを注射する場合、１ｍｌは約３００ μｇを意味する。しかしながら、注射後には、希釈効果により、濃度はＣＭＣよ り低くなり、ミセルは不安定になる。

本発明によれば、しかしながら、サポニンおよびと（にＱｕｉｔ　Ａ分子はコレ ステロール分子とともに結合され、したがってきわめて低濃度でも比較的安定な 複合体が形成される。この複合体は、ＱｕｉｌＡＯ，ｌμｇすなわち遊離型で存 在するＱｕｉｌ　Ａの場合の１００分の１に相当する低用量で、アジュバントと して有効である。

図面は次の通りである。

図１は典型的なマトリックスの電子顕微鏡像を示す。

図２は、Ｑｕｉｌ　ＡのサブフラクションのＵ、Ｖ、溶出像を示す。

図３は、Ｑｕｉｌ　ＡおよびそのサブフラクションのＨＰＴＬＣ−分離を示す。

図４は、本発明の新物質のＦＡＢ−マススペクトルを示す。

図５および６は、新物質のＩＣ−ＮＭＲスペクトル（Ｚ−領域）を示す。

図７．８および９は、それぞれ、Ｂ２．Ｂ３およびＢ４Ｂの完全ＩＣ−ＮＭＲス ペクトルを示す。

図１０は、β−アミリン−骨格を示す。

図１１および１２は新物質の’ＨＮＭＲスペクトルを示す。

図１３は、図７および８におけるスペクトルの一部を示す。

図１４は、物質Ｂ３の二次元ＮＭＲスペクトルを示す。

本発明を次に、以下の実施例によってさらに説明する。

例１ マトリックス（コレステロール−Ｑｕｉｌ　Ａ複合体）２０％ＭＥＧＡ−１０（ Ｈ２０中）に溶解したコレステロール１ｍｇを固体Ｑｕｉｔ　Ａ　５　ｍｇと混 合した。Ｑｕｉｌ　Ａを溶解させ、混合物をＰＢＳに対して強力に、最初は一夜 室温で、ついで＋４℃で透析した。イスコムマトリックスを３０％（ｗ／ｗ）ス クロースにより（ＴＳＴ４１．１３０一ター１８時間、３９．００Ｏｒｐｍ、１ ０”Ｃ）ペレット化して過剰のＱｕｉｌ　Ａおよびコレステロールから精製した 。ベレット化マトリックスをＰＢＳに溶解し、濃度を１ｍｇ／ｍｌに調整する（ 少量の３Ｈ−コレステロールで追跡）。

例２ ＭＤＰ（ムラミルジペプチド、Ｓｉｇｍａ　、アジュバントペプチド）を、Ｌｅ ｆｒａｎｃｉｅｒらによって記載されたようにして（Ｌｅｆｒａｎｃｉｅｒ、　 Ｐ、、　Ｃｈｏａｙ、Ｊ、、　Ｄｅｒｒｉｅｎ、　Ｍ、　＆Ｌｅｄｅｒｍａｎ、 　ｒ、、　Ｉｎｔ、Ｊ、Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅｓ、、　９　二 　２４９〜２５７．１９７７）、Ｎ−エチル−Ｎ′−（ジメチルアミノプロピル ）カルボジイミド塩酸塩を用い、ホスファチジルエタノールアミン（Ｐ　Ｅ　Ａ 、　）と接合した。

コレステロール１ｍｇ（２０％ＭＥＧＡ−１０，Ｈｚ　Ｏ中）に、等モル量（７ ）ＭＤＰ−ＰＥＡ　（ＭＥＧＡ−ｉ　ｏもしくはＤＭＳＯまたは他の任意の水混 和性溶媒中）、等モル量のホスファチジルコリン、およびＱｕｉｌＡ７ｍｇ（１ Ｍ形成に必要な５ｍｇに対してわずかに過剰）を加えた。室温で短時間（１５〜 ３０分）インキュベートしたのち、混合物をＰＢＳに対してきわめて強力に透析 した（室温４〜１２時間、ついで＋４℃）。

完全に透析したのち、付加的アジュバントが組み込まれたマトリックス複合体を １０％スクロースによってペレット化して、過剰のＱｕｉｔ　Ａから精製した。

例３ コレステロール１ｍｇ（２０％ＭＥＧＡ−１０，Ｈ，０中）に、等モル量のアブ リジン（Ｎ、Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ、Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエチル）プ ロペンジアミン）（ＭＥＧＡ−１０もしくはＤＭＳＯまたは他の任意の水混和性 溶媒中）、等モル量のホスファチジルコリンおよびＱｕｉｌ　Ａ　７ｍｇ　（Ｉ Ｍ−形成に必要な５ｍｇに対してわずかに過剰）を加えた。室温で短時間（１５ 〜３０分）インキュベートしたのち、混合物をＰＢＳに対してきわめて強力に透 析した（室温４〜１２時間、ついで＋４°Ｃ）。

完全に透析したのち、付加的アジュバントが組み込まれたマトリックス複合体を １０％スクロースによってペレット化しく１４頁の最終バラグラフに記載したと 同様にして）、過剰のＱｕｉｌ　Ａおよびアジュバントから精製した。

例４ コレステロールｌ　ｍｇ　（２０％ＭＥＧＡ−１０、Ｈ，０中）に等モル量のＤ ＤＡ　（臭化ジメチルジオクチルアンモニウム）（ＭＥＧＡ−１０もしくはＤＭ ＳＯまたは他の任意の水混和性溶媒中）、等モル量のホスファチジルコリン、お よび７ｍｇのＱｕｉｌＡ（ＩＭ−形成に必要な５ｍｇに対してわずかに過剰）を 加えた。室温で短時間（１５〜３０分）インキュベートしたのち、混合物をＰＢ Ｓに対してきわめて強力に透析した（室温４〜１２時間、ついで＋４℃）。

完全に透析したのち、付加的アジュバントが組み込まれたマトリックス複合体を １０９６スクロースによってペレット化しく１４頁の最終パラグラフに記載した と同様にして）、過剰のＱｕｉｌ　Ａおよびアジュバントから精製水１０ｍ１に Ｍｅｇａｌ　Ｏ（２ｇ）を加えたのち、コレステロール２００ｍｇを加え、コレ ステロールを超音波／ウルトラツラックスによって分散させる。この混合物１． 　６ｍｌを２％Ｑｕｉｔ　Ａ−溶液１０ｍ１に加える。反応混合物は１時間未満 で澄明化し、コレステロールがすべて反応したことを示す。電子顕微鏡により、 この場合の界面活性剤濃度は１０％であるにもかかわらず、マトリックスの濃度 はきわめて高いことが明らかである。透析または限外濾過による界面活性剤の除 去はマトリックス粒子の数に定量的な影響を与えることなく、マトリックス溶液 は完全に澄明のままである。

この実験は、反応混合物中に界面活性剤が存在すればマトリックスの形成か起こ ること、また完全なマトリックス形成はきわめて高い界面活性剤濃度で起こるこ とを本発明によるＱｕｉｌ　Ａ成分、Ｂ２．Ｂ３およびＢ４Ｂの製造 キラハ外皮（Ｎｏｒｄｉｓｋｅ　Ｄｒｏｇｅ　ｏｆ　Ｋｅｍｉｋａｌｉｅｆｏｒ ｒｅｔｎｉｎｇ。

Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、　Ｂａｔｃｈ　Ｎｏ、８３７２　）　５　ｇおよび蒸留 水５０ｍ１を電磁攪拌器により室温で３時間攪拌した。液相を濾紙によりブフナ ー漏斗を通して分離し、ＭｅｔｒｉｃｅｌＧｅ１ｍａｎ膜０．２２μを通して濾 過して精製した。このエキスは２．５％の乾燥物質を含有する。

粗エキスを、ビスキン−チューブ中ウェルド２０／　３２なしで、２００容量の 蒸留水に対して４８時間、２４時間後に水を換えて、透析した。このエキスはＤ Ｑと呼ぶ。

上記透析エキスをイオン交換グロマトグラフィーに付した。Ｏ，ＩＭ　Ｔｒｉｓ −ＨＣＩ！ｐＨ７，５で平衡化したＤＥＡＥ−セルロース（Ｗｈａｔｍａｎ　Ｄ 　Ｅ　５２　）のカラムをＫ　９／１５カラム（Ｐａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　 Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ　）中に調製した。ベッド材料をＯ，ＩＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ Ｉ　緩衝液、１）Ｈ７，５で平衡化した。カラムは、螺動式ポンプを用い、流速 ６０ｍ１／時で、段階的または直線的塩勾配によって溶出した。５０ｍ１のＤＱ をカラムに導入し、３００滴（約５ｍｌに相当）の分画を集めた。これらの条件 下では、ＤＱ中の一部の物質は、図２Ａ（ピークＡ）にみられるように、結合し ないでカラムを通過した。溶出はＵＶ吸収か認められなくなるまで続けた。流出 液の吸収はＵｖｉｃｏｒｄ　ＩＩシステム（Ｌ　Ｋ　Ｂ　−Ｐｒｏｄｕｋｔｅｒ 　）を用い２８０ｎｍで記録し、分画はＧｏｌｄｅｎ　Ｒｅｔｒｉｅｖｅｒ　（ Ｉ　Ｓ　ＣＯ）によって集めた。この時点で、開始緩衝液として作成した０、２ Ｍ　ＮａＣ１含有緩衝液を導入した。図２Ａから明らかなように、ピークＢが溶 出する。しかしながら一部の物質は依然としてベッド材料に付着し、濃厚なＮａ Ｃ１でも溶出は困難であった。これらの物質は、ＤＱの褐色の原因になる成分て あり、一方、ピークＡおよびＢはそれぞれわずかに着色または完全に無色の成分 であった。次の精製工程では、ピークＢをプールして、Ｋ１６／７０力ラム中Ｍ １５０リン酸緩衝液ｐＨ７，５で平衡化した５ｅｐｈａｄｅｘ５０　（微細）上 ゲル排除クロマトグラフィーに付し、１０ｍ１／時の流速で溶出した。脱塩はに １６／４０カラム中、５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ　２５メジウム上で実施した。

溶出は５０ｃｍの静水頭を用いて実施した。図２Ｂから明らかなように、ＵＶ像 は３つのピークを示した。ピークＣは空隙容量中に溶出しくＢｌｕｅ　Ｄｅｘｔ ｒａｎ　２０００゜Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、によ って決定）、ピークＥはカラムの全容量に溶出した（同じくクロム酸カリウムで 決定）。ピークＤは、ピークＣおよびＥとはよく分離されたか、図２Ｂにみられ るように、肩の存在はピークＤが少なくとも２種の物質からなることを示してい た。

したかって、ピークＤをプールし、ＤＥＡＥ−セルロー・ス上での新たな分離に 付した。出発条件は最初のイオン交換実験と同じとしたので、すべての物質がカ ラムに吸着された。この場合は、３００ｍ１の経過で０から１モルまで増大する 直線ＮａＣ１勾配（開始緩衝液中に作成）で継続した。この実験の結果は図２０ に示す。２個のピークＦおよびＧがＵＶ像に現れた。Ｆは明瞭に分離され、単一 の物質であったが（セクション３．３）、ピークＧはＦを夾雑していて単離でき なかった。ピークＦの均一性を検討するために、それをプールし、５ｅｐｈａｄ ｅｘＧ２５で脱塩し、同じ実験で再クロマトグラフィーを行った。図２Ｄから明 らかなようにピークＦの位置に唯一の対称的なピーク（Ｈ）が認められた。

任意の分画（同じ＜ＤＱ−エキス）が、さらに次のように精製できた。

分画Ｈを凍結乾燥し、クロロホルム／メタノール／Ｈ２０（６０：　４０　：　 ９．ｖ／ｖ／ｖ）に溶解した。２００ｍｇを次に、ケイ酸、Ｉａｔｒｏｂｅａｄ ｓ　ＲＳ　−８０６０（［ａｔｒｏｎ　Ｃａｂｓ、　Ｔｏｋｙｏ　Ｊａｐａｎ） で充填したＨＰＬＣカラム（４，５ｘ５０ｃｍ）に適用した。計２１！の溶媒の 供給に、ポンプ速度５　ｍ１７分を使用し、クロロホルム／メタノール／Ｈ２０ の勾配（６０：４０：９〜５０：４０：１０）の勾配で１０ｍ１の２００の分画 を集めた。分画は以下のようにして薄層クロマトグラフィーで分析した。

各第二の分画２μｌを薄層液体クロマトグラフィープレート（ＴＬＣ−プレート ）、（ＨＰ　Ｔ　Ｌ　Ｃ、Ｍｅｒｃｋ。

Ｂｏｄｍａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、　Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、　Ｎ、　Ｊ、）で クロロホルム／メタノール１０．２％ＣａＣｊ’ｚ　（５０：４０　：　１０Ｖ 　／　Ｖ　／　Ｖ　）中展開し、グリコシドをアニスアルデヒド試藁（酢酸／硫 酸／ｐ−アニスアルデヒド、９８：２：１）による緑色で決定した。Ｑｕｉｌ　 Ａ出発原料をＲｆ値の対照として使用した（ＨＰＴＬＣ分離を示す図３参照、レ ーンｌ、ＱｕｉｌＡ（分画Ｈ）；レーン２、Ｂ１゜レーン３、Ｂ２；レーン４、 Ｂ３；レーン５、Ｂ４Ａ　。

レーン６．８４Ｂ）。

同じＲｆ値を有しＢ２．Ｂ３およびＢ４Ｂと共移動する分画をプールし、ＴＬＣ で純度を分析した。これらの粗分画は通常、十分純粋にするためには２回クロマ トグラフィーを行わなければならない。分画ＢｌおよびＢ４Ａは不活性なので、 さらに分離することはしない。

このようにして濃縮した成分をさらに、５μ球状シリカ粒子（Ｚｏｒｂａｘ　Ｓ ｉ、　ＤｕＰｏｎｔ、　Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、　ＤＥ　）を充填したＨ　Ｐ　 Ｌ　Ｃカラム（２１，２ｘ２５０ｍｍ）上で精製した。濃縮分画Ｂ２．Ｂ３また はＢ４Ｂ　４０ｍｇを、クロロホルム／メタノール／Ｈ２０（６０：　４０　： 　９ｖ／ｖ／Ｖ）に溶解し、カラムに負荷した。計０．９１の溶媒を供給するた めのポンプ速度は３　ｍｌ／時を用い、クロロホルム／メタノール／Ｈ２０（６ ０：４０＋９〜５０：４０　：　ｌ　Ｏｖ／ｖ／ｖ）の勾配で３ｍｌの分画３０ ０を集めた。分画は上述のように、ガラス板上のＨＰＬＴＣ−プレート上で分析 した。精製分画をプールし、ロータリーエバポレーターによりく３０°Ｃて蒸発 乾固し、乾燥し、く−２０℃で保存した。この精製工程を約２０〜２５回繰返し た。すなわち、（２０〜２５）　Ｘ　２００ｍｇ＝４〜５ｇのＱｕｉｌ　Ａ出発 原料を用い、再クロマトグラフィーにより分画Ｂ３を製造し得た。Ｂ２および８ ４Ｂの収率はＢ３の収率の約４０９６であった。

このようにして製造されたＢ２．Ｂ３およびＢ４Ｂは次のようにして分析された 。

ａ）　マススペクトル 陰性ＦＡＢ−ＭＳ　（図４）および陽性ＦＡＢ−ＭＳ（データは示していない） を、精製Ｑｕｉｔ　Ａ成分Ｂ２゜Ｂ３．Ｂ４ＡおよびＢ４Ｂの分子量の決定のた めに実施した。図４に示したデータは予備的なものであり、図４に示したスペク トルの場合に用いたトリエタノールアミン中ではなくグリセロールのような中性 ｐＨマトリックス中での再実験が必要であろう。これは、これらの化合物のｐ） Ｉ＞８．５における著しいアルカリ不安定性が明らかにされたことから必要であ る。マトリックスエタノールアミンからのｍ／ｚ５９５，７４４および８９３ス テムからのピークは無視すべきである。アジュバント作用もイスコム粒子形成能 ももたない本発明者らの分画Ｂ４ＡはＫｏｍｏｒｉらによって記載された分画と 同一ではないかと思われる（構造については図１０参照）。したがって、最も興 味のあるグリコシドの分子量に相当するピークはｍ／ｚ１９８８．Ｂ２；　ｍ／ ｚ２１５０．Ｂ３；およびｍ／ｚ　１８６２．Ｂ４Ｂである。

ｂ）”Ｃ−ＮＭＲ 図５および６は、全サイズ分画：Ａ、Ｂ　（２０ｍｇ）　；Ｂ、　Ｂ　３　（８ ０ｍｇ）およびＣ，８４Ｂ　（４０ｍｇ）についての”Ｃ−ＮＭＲスペクトルそ れぞれの２領域、脂肪族炭素（８〜４５ｐｐｍ）およびアノマー炭素（９０〜１ １５ｐｐｍ）を示す。スペクトルはすべて、溶媒系、クロロホルム／メタノール ／水（３０：　６０　：　８．ｖ／ｖ／Ｖ）中で得られた。トリテルペノイド領 域はよく分解し、一部を表４のように帰属させた。

表　４ クロロホルム／メタノール／水（３０：　６０　：　８゜ｖ　／　ｖ　／　ｖ　 ）中で得られた分画Ｂ２．Ｂ３およびＢ４Ｂのβ−アミリン５環セグメントの部 分＋３０−ＮＭＲシグナル（図５参照）の帰属（ｐｐｍ）炭素番号　８２　Ｂ３ 　８４Ｂ　対照 Ｃ９”　−ｂ　−ｂ　−ｂ　４５．５ Ｃ１０３６，４３６，２３６，３３７，０ＣＩ２　１２２．５　１２２．２　１ ２２．５　１２３．１ＣＩ　３　１４４．１　１４６．６　１４３．６　１４４ ．８ＣＩ　４　４１．５　４１．８　４１．９　４１．６ＣＩ　５　３０．０　 ３０．５　３０．７　３０．７ＣＩ　８　４３．０　４２．８　４１．９　４２ ．７Ｃ２０３０，７３０，６３０，６３０，７Ｃ２５１６，０１６，１１６，０ １５，９Ｃ２６１７，７１７，３１７，６１７，６Ｃ２９３２，９３２，９３２ ，９３２，２ａ）図５と同様に番号を付す。

ｂ）溶媒のメタノールシグナルの下にがくされている（ＤＥＰＴ実験で確認） これらの帰属は、様々な溶媒中で得られた多数の参照スペクトルの研究から、ま た統計的比較による溶媒独立のシグナルの解析から行われたものである（データ は示していない）。図６には３種の化合物、Ａ、Ｂ２．Ｂ。

Ｂ３：およびＣ，Ｂ４Ｂのスペクトルにおける８０〜１４８ｐｐｍ領域、β−ア ミリン骨格（図１０）における、それぞれＣ−１２およびＣ−１３に相当する１ ２２および１４３　ｐｐｍにおける２重結合炭素シグナルの２つの特徴を示す。

９０〜１１５　ｐｐｍのアノマー炭素領域には、化合物中の同じ量の糖残基に相 当する約９〜１０のシグナルの存在が示されている。

級檜：Ａ、Ｂ２；Ｂ：Ｂ３；およびＣ：Ｂ４Ｂの分画の間には、分子の主にトリ テルペノイド領域およびオリゴ糖部分に相当する両スペクトル領域に、構造的な 差が確認できた。この時点では正確な糖の量は決定できない。

ｃ）　’ＨＮＭＲ 図１１には、分画：Ａ、Ｂ２　：Ｂ、Ｂ３　；およびＣ：Ｂ４Ｂについてそれぞ れ、完全プロトンスペクトル（０〜１０　ｐｐｍ　）を、また図１２には部分プ ロトンスペクトル（アノマー領域、４．０〜６．Ｏｐｐｍ）を示す。スペクトル は、ＤＭＳＯ−ｄａ　／Ｄｚ　Ｏ（９８：　２．　ｖ／ｖ）に溶解したサンプル （：”：Ｉ　Ｏｍｇ、　ｚ６００スキヤン）から得る。スペクトルの左端（図１ １）　、９．４ｐｐｍには、炭素−２４上のアルデヒドプロトンからのシグナル （図５参照）が見出される。このピークの二重化の性質は、これにカップリング する隣接プロトンがないことからこのピークは単一線と考えられ、分解の悪い異 常に複雑なアノマー領域（図１２の拡大図に見られるように）に対する説明を提 供するものである。

二重化は、２個の異なる化合物におけるアルデヒド部分または同じ分子の２個の 異なる集団の間の化学的交換の存在（この過程は、観察されるＮＭＲの時間スケ ールに対して十分遅い）によるものと考えられ、図１３および表５に示されるよ うな異なる温度における二重線中のピークの異なる積分を説明するものである。

３０１　９．４６　９．４４　０．０２　１．６１３５１　９．４７　９．４６ 　０．０１　１．９９３６１　９．４８　９．４７　０．０１　２．２３図１３ および上記表５は、ピークの積分比が温度で変動すること、また２個のピークは 温度が高くなると互いに接近するように移動することを示していて、両者ともそ れが２個の異なる分子によるものではなく、同じ分子の２個の異なる集団による ものであることを指示している。これは、分子内の多くのアノマープロトンが２ 個の集団における異なる化学的環境による二重共鳴をもっことを示唆して、複雑 なアノマー領域を説明するものかもしれない。しかしながら、現在の一連のデー タからは、化合物のグリコシレージョンの差が、スペクトル中のアノマープロト ンシグナルの量の差を生じることにより、それらの構造の差（図１２）の一部を 説明することを示している。分画Ｂ２．Ｂ３およびＢ４ＢのＦＡＢ−ＭＳデータ も、きわめて類似した物理−化学的性質をもち、同じ量の糖を有するが結合位置 および／または配列が異なる２個の類似サイズ分子の存在の形式的な可能性を否 定するものではない。

結論ニ一般的に、以前には未知の分子を含有する８〜ｌＯ糖からの一次元’ＨＮ ＭＲはプロトンの帰属および詳細な構造特性の帰属には十分でない。すべてのシ グナルを分離し、化合物全体を通しての適切な帰属を行うためには、２次元ＮＭ Ｒを使用し、また化合物を分析用に分解することか必要になる。同種核（’Ｈ− ’Ｈ）および異種核（’Ｈ−目Ｈ）ＣＯ３Ｙ、ＴＯＣＹおよびＮ０ＥＳＹの両者 である。二次元プロトン相感受性相関二重量子濾過ＮＭＲスペクトル（ＤＱＦＰ 　５ＣＯＰＹ）による分画Ｂ３の分析を図１４に示す。

ｄ）構造データの要約 現時点て得られているデータから結論すると、ＱｕｉｔＡ中のアジュバント活性 およびイスコム粒子形成能を有する活性分画は、それらのトリテルペノイドおよ びグルカン部の両者で互いに異なる独特のグリコジル化トリテルペノイド−サポ ニンを含有する。それらは図１Ｏに示した構造のような概略の構造を有し、β− アミリン型の５環ステロイド構造からなり、８〜１１個の糖残基を含有する。

例７ コレステロール０．１ｍｇを３Ｈ−コレステロール（Ｈ２０中２０％ＭＥＧＡ− １０に１０ｍｇ／ｍｌ溶解）、および０．５ｍｇの８２．Ｂ３もしくは８４Ｂま たはそれらの混合物と混合した。容量を０．５ｍｌに調整し、混合物を、モリブ デン酸アンモニウムで処理したプレバレージョンについて（着色防止法）ＰＢＳ 上で透析した。透析されたプレバレージョンについて、イスコム構造との複合体 の存在を、電子顕微鏡（ＥＭ）および分析的勾配遠心分離によって分析した。Ｅ Ｍでは、イスコム構造は、径１２ｎｍの輪状構造をもつサブユニットから構成さ れる径４０ｎｍのケージ様粒子によって特徴づけられる。沈降実験では、サンプ ルはサッカロース勾配（１０〜５０％）上に置かれ、ＴＳＴ４１．１４０−ター 中、４０゜０００ｒｐｍ、＋１０℃で１８時間遠心分離する。勾配を１８の分画 て捕集する（分画１は底部、分画１８は頂部）。３Ｈ−コレステロールの勾配中 での放射能の位置により、沈降定数および複合体が生成しているかを調べること ができる。

８４Ｂはコレステロールと典型的なイスコム構造を形成するが、強力なアジュバ ント活性ない。

Ｂ２はコレステロールとイスコム構造を形成しないが、コレステロールに結合す る。８４Ｂと一緒ではＢ２はコレステロールとイスコム様構造を形成する。Ｂ２ は弱いアジュバント活性を有する。

Ｂ３はコレステロールに結合するが、イスコム様構造にはならない。Ｂ２と同様 、Ｂ３は８４Ｂとともに、コレステロールとイスコム様構造を形成できる。Ｂ３ はアジュバンＩ・活性を有する。

ＦＩＧ、１ ２（ｉ？０ｒＬｚｔ：。

ＦＩＧ、２ 手続補正書 平成３年６月　７日てへ

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. １．少なくとも１種の脂質および少なくとも１種のサポニンからなり、脂質ビヒ クルではなく、また意図的な抗原または抗原決定基を含まない、免疫調節剤と使 用するためのマトリックス。
2. ２．少なくとも１種の脂質、少なくとも１種のサポン、および少なくとも１種の アジュバントからなる「請求項１」記載のマトリックス。
3. ３．ステロール好ましくはコレステロール、１種もしくは２種以上のサポニン、 １種もしくは２種以上のアジュバントおよび１種もしくは２種以上の他の脂質か らなる「請求項２」記載のマトリックス。
4. ４．サポニンはトリテルペンサポニン、とくにＱｕｉｌＡまたはその１種もしく は２種以上の成分である「請求項１〜３」のいずれかに記載のマトリックス。
5. ５．１種もしくは２種以上の免疫調節化合物からなる「請求項１〜４」記載のマ トリックス。
6. ６．電子顕微鏡下に環状のサブユニットまたは球形構造の部分からなるオープン の球形構造を有し、沈降定数は約１２〜２２Ｓであることを特徴とする「請求項 １〜５」のいずれかに記載のマトリックス。
7. ７．少なくとも１種の脂質および少なくとも１種のサポニンならびに所望により アジュバントからなり、脂質ビヒクルではなく、また意図的な抗原または抗原決 定基を含まない、免疫調節前またはワクチンとして使用するためのマトリックス を製造するにあたり、溶解中に溶解した少なくとも１種の脂質に、１種もしくは ２種以上のサポンを加え、他の所望によるアジュバントおよび脂質を加え、つい で溶媒をたとえば透析、ゲル濾過または電気泳動によって除去するかまたは希釈 することを特徴とする方法。
8. ８．脂質はステロール、とくにコレステロールであり、サポニンはトリテルペン サポニン、とくにＱｕｉｌＡまたはその１種もしくは２種以上の成分である「請 求項７」記載の方法。
9. ９．１種または２種以上の免疫調節化合物を添加する「請求項７または８」記載 の方法。
10. １０．ステロールおよびサポニンは脂質および／またはアジュバント中に可溶化 する「請求項７〜９」記載の方法。
11. １１．ＱｕｉｌｌａｊａＳａｐｏｎａｒｉａＭｏｌｉｎａから誘導され、８〜１ １個の炭水化物残基をもち、β−アミリン型のグリコシル化トリテルペノイドサ ポニンであって、以下の特性： ａ）物質Ｂ２は分子量１９８８、１２Ｃ−ＮＭＲスペクトルは図５Ａおよび図６ ＡにプロトンＮＭＲスペクトルは図１１Ａおよび図１２Ａに示す通りである。 ｂ）物質Ｂ３は分子量２１５０、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルは図５Ｂおよび図６ ＢにプロトンＮＭＲスペクトルは図１１Ｂおよび図１２Ｂに示す通りであり、ｃ ）物質Ｂ４Ｂは分子量１８６２、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルは図５Ｃおよび図６ Ｃ、プロトンＮＭＲ構造は図１１Ｃおよび図１２Ｃに示す通りである、を有する サポニン。
12. １２．ＱｕｉｌｌａｊａＳａｐｏｎａｒｉａＭｏｌｉａから誘導され、８〜１１ 個の炭水化物残基をもち、β−アミリン型のグリコシル化トリテルペノイドサポ ニンであって、以下の特性 ａ）物質Ｂ２は分子量１９８８で、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルは図５Ａおよび図 ６ＡにプロトンＮＭＲスペクトルは図１１Ａおよび図１２Ａに示す通りである。 ｂ）物質Ｂ３は分子量２１５０で、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルは図５Ｂおよび図 ６ＢにプロトンＮＭＲスペクトルは図１１Ｂおよび図１２Ｂに示す通りであり、 ｃ）物質Ｂ４Ｂは分子量１８６２、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルは図５Ｃおよび図 ６ＣにプロトンＮＭＲ構造は図１１Ｃおよび図１２Ｃに示す通りである、を有す るサポニンを製造を有するにあたり、ＱｕｉｌｌａｊａＳａｐｏｎａｒｉａＭｏ ｌｉｎａの表皮を水で抽出し、水抽出液を透析し、透析物を凍結乾燥し、凍結乾 燥物質をＳｅＰｈａｄｅｘＧ−５０上ゲル濾過およびついでＤＥＡＥ−セルロー ス上弱陰イオン性交換クロマトグラフィーに付し、生成物を中性（ｐＨ）条件下 に０．２Ｍ塩化ナトリウムで溶出し、それらをシリカゲル上反復クロマトグラフ ィーによって分離することを特徴とする方法。
13. １３．「請求項１〜６」に定義されたマトリックス、１種または２種以上の抗原 および医薬的に許容されるビヒクルからなるワクチン。
14. １４．「請求項１〜６」に記載の少なくとも１種のマトリックスおよび１種また は２種以上の免疫調節物質、ならびに医薬的に許容されるビヒクルを、混合して または別個のコンパートメントに含有してなるヒトまたは動物医薬用のキット。