JPH04501715A - 細胞接着レセプターの結合を改変する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 レセプターのｒムを　・・する　′ 細胞接着は、細胞の固着、極性、移動および分化の維持および促進において重要 な役割を果たす。接着過程は、接着リガンドを特異的に認識して結合する細胞表 面レセプ多−によって仲介される。

既知の接着レセプターの多くは、インテグリンと呼ばれるレセプター群に属する 。インテグリン群にはフィブロネクチン、ビトロネクチンおよびフィブリノーゲ ンのレセプター並びにフォノ　ビルプラント因子、ラミニン、補体成分Ｃ３ｂ１ のレセプターおよびある種の細胞−細胞接着レセプターが含まれる。インテグリ ンは、大きな細胞外ドメインと細胞質内にある小さな尾部を有するヘテロニ量体 の膜タンパク質である。

リガンドが何であるかが既に知られているインテグリンのリガンドタンパク質は 、一つの共通の性質を有している。即ち、トリペプチドＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ （ＲＧＤ）は、このレセプターによって認識されるタンパク質構造の必須部分で ある。インテグリンを介して起こる接着過程は、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐを有す る、固定化されたまたは可溶性のペプチドを供給することによって操作できる。

このような過程の操作を可能にすることにより、非常に様々な応用の可能性があ る。Ａｒｇ−ＧＩｙ−ＡＳＩ）を有するペプチドの性質および使用は、例えば米 国特許第４５７８０７９号および第４６１４５１７号、Ｐｉ　ｅｒｓｃｈｂａｃ ｈｅｒおよびＲｕｏｓｌａｎｔｉ著、Ｎａｔｕｒｅ　３０９：３０（１９８４） 、並びにＰｉｅｒｓｃｈｂａｃｈｅｒおよびＲｕｏｓｌａｎｔｉ著、ＰＮＡＳ　 ８１：　５９８５　（１９８４）に記載されており、これらはすべて参考文献と してここに組み込まれている。

接着レセプターのリガンドとの結合には、Ｃａ”＊たはＭｇ２ゝのような二価カ チオンの存在が必要である。これらのレセプターのαサブユニットは、他の既知 のＣａ２“結合タンパク質のＣａ”結合部位に類似する幾つかの短いアミノ酸配 列を含み、二価カチオンはおそらく、これらの配列を介して作用するのであろう 。

細胞接着の過程に重要な役割を果たすことから、これらの系を更に操作可能とす ることが要求されている。本発明はこの要求を満たし、さらに関連する利点をも 提供するものである。

発明の要旨 本発明は、カチオンを供給することにより、インテグリン細胞表面レセプターの リガンドに対する結合活性（ｂｉｎｄｉｎｇ　ａｂｉｄｉｔｙ）を増大させる方 法を提供する。本方法で用いられるレセプターとしては、フィブロネクチン、ビ トロネクチン、ラミニンあるいはコラーゲンのレセプターが好ましいが、他のイ ンテグリンもまた使用され得る。結合活性を増大させるカチオンには、Ｍｎ”″ 、Ｃ０２＋、Ｃｄ２＋およびＮｉ”がある。Ｇｄ２”は、フィブロネクチンおよ びビトロネクチンレセプターのリガンドに対する結合活性を減少させる。本方法 は、精製されるレセプターの結合収量を増すために、リガンドマトリックスカラ ムに使用できる。本発明は、ＥＬＩＳＡ法やラジオレセプターアッセイに於いて 、レセプターの基質との結合を増大させるために、ならびに細胞の移動を増大さ せるためにも使用できる。

図面の簡単な説明 第１図は、フィブロネクチンレセプターリポソームのフィブロネクチンとの結合 に於ける、カチオンの効果を示す。カチオンの添加無しに調製したレセプターリ ポソームを指示濃度のＣａＣｌ２、ＭｇＣｈまたはＭｎＣｌ２と混合し、フィブ ロネクチンでコートされたプラスチックマイクロタイターウェルに対するそれら の付着能力をアッセイした。ｉ　ｎ＋Ｍ　ＭｇＣｌ２および１　ｍＭ　ＣａＣｌ ２存在下で測定したコントロール付着を１００％とし、３回実験した結果をコン トロール付着に対するパーセントとして表している。

第２図は、１１０　ｋＤａフィブロネクチン断片の存在下でのフィブロネクチン レセプターリポソームのフィブロネクチンとの結合を示す。レセプターリポソー ムは１　ｍＭ　ＣａＣｌ２および１ｍＭ　ＭｇＣｌ２の存在下で、あるいはｌ　 ｍＭ　ＭｎＣｌ２の存在下で調製した。３回の実験の平均値を、阻害剤なしに適 当なカチオンの存在下で測定したコントロール付着に対する割合として示した。

第３図は、可溶性阻害剤としてＧＲＧＤＳＰを用いた場合の、第２図での記載と 同様の付着を示す。

第４図は、ＥＬＩＳＡ法に於けるフィブロネクチンレセプターのフィブロネクチ ンとの結合および可溶性リガンドによる結合の阻害を示す。マイクロタイターウ ェルを１μｇ／ｍ　ｌのフィブロネクチンでコートし、種々の濃度のフィブロネ クチン、ＧＲＧＤＳＰ　５ＧＲＧＥＳＰまたは関連性のないペプチドの存在下で 、精製したレセプターを、コートしたウェルに結合させた。レセプターのウェル への結合は、酵素標識した・抗体を用いて検出した。

第５図は、種々の濃度のＭｎ”＊たはＣａ２＋存在下における、Ａ３７５細胞の メンブレンインバージョンカルチャーシステム（Ｍｅｍｂｒａｎｅ　Ｉｎｖａｓ ｉｏｎ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　５ｙｓｔｅ＋＊（ＭＩＣＳ））アッセイを示す。

１００　ｇＭ　ＭｎＣｌ２で３０％の侵入（ｔｎｖａｓｉｏｎ）の増大が見られ る。

第６図は、ＭＩＣＳアッセイを使用した、１００μＭ　ＣａＣｌ２または１００ 　ｕＭ　ＭｎＣｌ２の存在下における、Ａ３７５Ｍ侵入のＧＲＧＤＳＰによる阻 害を示す。

発明の詳細な説明 本発明は、インテグリンの、それらのりガントへの結合活性が、Ｍｎ２“の存在 により増加するという発見に関する。このようなインテグリンには、フィブロネ クチン、ラミニン、ビトロネクチンおよびコラーゲンレセプターが含まれる。現 在、他のカチオンもまた、インテグリンの、それらのりガントへの結合を改変す ることが知られている。アミノ酸配列が知られている全てのインテグリンのαサ ブユニットは、他のタンパクにおける既知のＣａ２″″結合部位に類似する配列 を含む。この説明によって限定しようとするものではないが、これらの配列の存 在により、レセプターが、Ｍｎ２“の存在に対して感受一般のインテグリンおよ びそれらのサブユニットについては、その詳細がＲｕｏｓｌａｈｔｉおよびＰｉ ｅｒｓｃｈｂａｃｈｅｒ％５ｃｉｅｎｃｅ　２３８：４９１　（１９８７）に記 載されている。これは参考文献としてここに組み込まれている。本願で使用され るすべての用語は、この参考文献によって与えられる定義および説明に従う。本 質的には、これらのインテグリンには、細胞接着の相互作用を仲介することに関 わる、一群の関連する細胞表面へテロニ量体糖タンパクが包含される。インテグ リンには、これに限定されないが、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラー ゲン、ラミニン、テネイシン（ｔｅｎａｓｃｉｎ）、および細胞表面タ′バク質 ［１ｂ／ｌ１ｌａに対するレセプターが含まれ、上記細胞表面タンパク質１１ｂ ／ｌ１ｌａは、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、フォノビルプラント因子 およびトロンポスポンジンを認識する。白血球接着レセプターである、ＬＦＡ− １，Ｍａｃ−１およびｇｐ　１５０／９５もまたレセプターのインテグリン群の うちの一つである。

本発明の目的のためには、用語”カチオン”は陽電荷、好ましくは２＋または３ ＋を有するイオンを包含すべきである。これらには、金属およびランタニド系の ような希土類金属が含まれる。

本願で使用されるように、レセプター結合の改変には、結合アビディティーの変 化と結合アフィニティーの変化の両方が含まれる。結合アフィニティーの増大は 、各々のレセプターとそのリガントとの結合の強度の増大を反映する。結合アビ ディティーの増大は、結合アフィニティーの増大、あるいはリガンドに結合する レセプター分子の総数の増加を反映し得る。

本発明は、Ｍｎ２＋の存在が、フィブロネクチンレセプターのフィブロネクチン との結合に対して示す、顕著な効果に関する。結合アフィニティーと結合アビデ ィティーは両者ともＭｎ２２の存在下で大きく増大する。さらに、Ｍｎ２“は、 少なくとも一つのリガンドについて調べたところ、他のインテグリンの結合アビ ディティーをも増大させることが示された。このことは下記実施例に記載の、１ あるいはそれ以上のアッセイで測定された。これらのインテグリンには、フィブ ロネクチン、ビトロネクチン、Ｉ型およびＩＶ型コラーゲン、並びにラミニンの レセプターが含まれる。

他のカチオンもまた、フィブロネクチンレセプターおよび他のインテグリンの結 合アビディティーに効果を示す。このような金属には、Ｃｏ２＋、Ｃｄ　”、Ｎ ｉ２°およびＧｄ”が含まれるが、これらに限定されない。最初の３種類は、結 合アビディティーを増大させる。Ｇｄ３”は結合アビディティーを減少させるの で、インテグリンの活性を一般に緩和するために使用できる。

結合アビディティーのこのような改変は、種々の濃度のカチオンの存在下または 非存在下での幾つかの異なるアッセイによって測定できる。これらの中には、イ ンテグリンを含むリポソームの特定リガンドに対する結合を検出するアッセイ、 インテグリンとリガンドとの結合を決定するための標識された抗体の使用、イン テグリンとリガンドの結合を決定するための標識されたインテグリンの使用、お よびリガンドを結合させたマトリックスに対するインテグリンの結合を決定する ためのアフィニティークロマトグラフィーがある。これらの各々のアッセイは、 結合アフィニティーまたは結合に用いられるレセプター数の増加のような、結合 アビディティーの種々の面を反映するので、様々なアッセイは全て同様の効果を 示すわけではない。インテグリンの結合活性に影響するカチオンは、インテグリ ンの結合を改変する活性を有すると考えられる。結合アビディティーがカチオン の存在下で増加することが、１あるいはそれ以上のアッセイで示された場合には 、そのカチオンはインテグリン結合の促進活性を有すると考えられる。結合アビ ディティーがカチオンの存在下で減少することが、１あるいはそれ以上のアッセ イで示された場合には、そのカチオンはインテグリン結合の阻害活性を有すると 考えられる。

インテグリン結合促進性のカチオンがインテグリンの結合アビディティーを改変 することを示すことから、多くの応用が考えられる。結合活性を改変するために 、インラグリン結合促進性カチオンは、単独で、あるいは生理的に優勢なＣａ” およびＭ　ｇ　２°のような他のカチオンと組み合せて与えられ得る。

例えば、リガンド結合性のマトリックスカラムを用いるインテグリンの精製を、 容易に行なうことができる。このようなカラムによる精製は、Ｐｙｔｅｌａらの ＰＮＡＳ　８２：５７６６−５７７０（１９８５）に記載されている。これは参 考文献としてここに組み込まれている。簡単に述べると、目的のインテグリンと 反応するリガンドを、セファロースＲのような適当な支持体マトリックスに結合 させる。セファデックスＲまたはアガロースのような他のマトリックス材料も使 用できる。このようなリガンドには、完全なインテグリンリガンドとともに、フ ィブロネクチンの１１０ｋｉ）断片およびＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐを含む合成ペ プチドのようなインテグリンリガンドの断片も含まれる。目的のインテグリンを 含む溶液をカラムに通し、これによりインテグリンをマトリックスに結合させる 。結合したインテグリンをマトリックスから離すことのできる溶液をカラムに通 し、結合したインテグリンを溶離する。結合溶液中に、適当なインラグリン結合 促進性カチオンの存在する場合には、インテグリンのカラムへの結合量は増加し 、その結果、精製インテグリンの収率が高められる。

さらに、インラグリン結合促進性カチオンの存在下におけるインテグリンの結合 アビディティーの増加は、インテグリンまたはそのリガンドの存在を決定するア ッセイを容易にする。例えば、様々の免疫測定法が、レセプター−リガンドの様 な結合対の存在を、該リガンドまたはレセプターと反応性を有する標識化抗体を 用いて検出するのに利用される。このような方法はその当業者によく知られてい る。例えばＨＡＮＤＢＯＯＸ　ＯＦ　ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴＡＬ　ＩＭＭＵＮＯ ＬＯＧＹ　（Ｄ、Ｍ、　Ｗｅｉｒｍ）、ＢｌａｃｋｖｅｌｌＳｃｉｅｎｔｉｆｉ ｃ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ　（３ｒｄ版１９７８）を参照、これはここに参 考文献として組み込まれている。適当な標識には、酵素および蛍光性、発光性ま たは化学発光性の系の構成成分、および放射性核種が含まれる。一方、同様の標 識されたレセプターまたは標識されたリガンドは、インテグリン結合促進性カチ オンの存在下で、それぞれリガンドまたはレセプターの存在の決定に使用できる 。

インテグリン結合促進性カチオンは、細胞の移動も促進する。このような結果は 、細胞の移動が細胞の接着と分離の両者を必要とすることを考慮すると、とくに 予測しがたい。細胞の付着を助ける因子が細胞の移動をも助けるということには 、必ずしもならない。とりわけＭｎ２＋は、侵入タイプの系と創傷治癒モデルと の両者において細胞移動を増大させることが示された。インテグリン結合促進性 カチオン、特にＭｎ”は、細胞移動の望まれる場所、例えば創傷やヤケドの場所 に、治癒を促進するために直接付与され得る。このカチオンは、様々な方法、例 えば溶液形態での付与および浸漬により、注射により、あるいは包帯または内部 レザーバー（ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）のような適当な包帯剤で カチオンを供給することにより投与できる。さらに、補綴物または移植片と共に 投与することにより、宿主細胞の移動および付着を促進できる。緩慢な放出また は長時間に及ぶ放出の方法による投与も使用できる。

本発明は、以下の実施例により説明されるが、これに限定されるものではない。

実施例ｌ Ｍｎ２°はフィブロネクチンレセプターリポソームのフィブロネクチンに・する 　Ａを　させるレセプターをリポソームに組み込み、様々なカチオンの存在下で 、フィブロネクチンでコートされた表面へのレセプターリポソームの付着を測定 することにより、フィブロネクチンレセプターのりガントへの結合に対するカチ オンの効果を調べた。

フィブロネクチンレセプターを、Ｐｙｔｅｌａら、Ｃｅ１ｌ　４０：１９１（１ ９８５）およびＰｙｔｅｌａ　ら、Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　ｉ４４：４ ７５−４８９（１９８７）に記載の方法に従い、ヒト胎盤から、フィブロネクチ ンの１１０　ｋＤａキモトリプシン断片を用いたアフィニティークロマトグラフ ィーによって精製した。これらの文献は以下の変更とともに参考文献としてここ に組み込まれている。１１０　ｋＤａ断片は、上記Ｐｙｔｅｌａら（１９８５） に記載されている１２０　ｋＤａ断片に相当する。もとの方法からの変更の一つ は、二価カチオンの溶解を確実にするため、ホスフェート緩衝液の代わりにトリ ス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ：　１５０ｕ＋Ｍ　ＮａＣ１，５０ｍＭ　）リス−Ｈ Ｃｌ、ｐＨ７，３）を使用したことである。簡単に述べれば、上記Ｐｙｔｅｌａ ら、（１９８５）の記載に準じて、ホモジナイズした胎盤組織を、１　ｍＭ　Ｃ ａＣｌ２．１　ｍＭ　ＭｇＣｈおよび３　ｎ＋Ｍフェニルメチルスルホニルフル オライド（ＰＭＳＦ）を含む２倍容積の冷ＴＢＳで１回洗浄して遠心した後、ペ レットを１００　ｍＭオクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（Ｃａｌｂｔｏｃｈ ｅｍ社製、Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）、およびカルシウム、マグネシウムおよび ＰＭＳＦを含む等容積の冷ＴＢＳで抽出した。透明な抽出物を、ゆっくりと４℃ で、まずリガンドのついていない（ｐｌａｉｎ）セファロースのカラムに通して 、次に１１０　ｋＤａフィブロネクチン断片セファロースカラムに通した。この アフィニティーカラムを室温で、２５　ｍＭオクチル−β−Ｄ−チオグルコピラ ノシド（Ｃａ　ｌ　ｂｉｏｃｈｅｍ社製）、および１　ｍＭ　ＣａＣｌ２および １ｍＭ　ＭｇＣｌ２を含む６倍容積のＴＢＳで洗浄した。結合したレセプターは 、カルシウムおよびマグネシウムの代わりに２０　ｍＭ　ＥＤＴＡを含む洗浄用 の緩衝液で溶離した。溶離したレセプターは、直ちにレセプターリポソームの調 製に使用するか、あるいは凍結して保存した。いくつかの実験では、単離工程を 通じてＣａＣｌ２およびＭｇＣｌ２を１　ｍＭ　ＭｎＣｌ２に置き換えた。

基本的には上記ｐｙｔｅｌａら、　（１９８５）の記載に従い、ホスファチジル コリンのリポソームを調製し、表面への付着をアッセイした。簡単に述べれば、 精製レセプターを含むリポソームは、カチオンを含まないＴＢＳに透析して調製 した。得られた調製リポソームの一部は、様々なタンパク質リガンドにコートさ れたプラスティックマイクロタイターウェルに対するリポソームの付着を試験す るアッセイの開始時に、適当なカチオンと混合した。このタンパク質は２５μｇ ／ｍｌの濃度でプラスチックをコートした。この濃度はリポソーム付着の最大値 を与えることが知られている。特異的付着は、フィブロネクチンおよび他のリガ ンドに対する付着から、ウシ血清アルブミンに対する付着を差し引いて算出した 。付着アッセイの阻害について試験するペプチドは、Ｐｉｅｒｓｃｈｂａｃｈｅ ｒおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ、　Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｔ　２６２：１７２９４（１９Ｂ？）に従い、高速液体り０ ７トグラフイーで精製した。この文献はここに参考文献として組み込まれている 。

Ｍｎ２＋の効果を、最も関連のある生理的カチオンであるＣａ”およびＭｇ２＋ の効果と比較するために、カチオンの滴定（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）を行った。第 １図に示すように、これらの実験から、Ｍｎ”は広い濃度範囲において、Ｍ　ｇ 　２“またはＣａ”よりも効果的にレセプターの結合を増大させること、更に、 Ｍｎ２＋は他の二つのカチオンよりも、はるかに低い濃度で効果を示すことが示 された。Ｍｎ２”は、リポソームの付着を、組織中のＭｎ２＋濃度に近いわずか ３μＭで促進した。リポソームの付着を、ＩＩＩＩＭＣａ”またはＭｇ　２４と 、様々な濃度のＭｎ”との存在下で測定した場合に、Ｍｎ２＋の濃度が、Ｃａ２ ＋またはＭｇ　２＊の濃度のわずか１／１０の時に、そのＭｎ２＋による増大が 明確になった（表１参照）。

（以下余白） 表１ Ｃａ”またはＭｇ２ゝの存在下におけるフィブロネクチンレセプターリポソーム のフィブロネクチンへの結合に対するＭｎ２＋の影響 添加したＭｎ”　１　ｍＭ　Ｃａ”　１　ｍＭ　Ｍｇ””なし　１．００＄　１ ．００１ １　ｍＭ　５．７８±０．４７　３．１２±０．１００、ｉ　ｍＭ　４．４１± ０．３３　２．０４±０．０８０．０１　ｍＭ　１．２３±０．６６　０．９７ ±ｏ、１７＊結果はＣａ”＊たはＭｇ　２４のみを加えて測定したときの結合に 対する倍数で示す。２回の実験の平均および標準誤差を示す。

実施例１１ のニ　カチオンのヅ 実施例Ｉと同様の方法で調製し測定したところ、表２かられかるように、Ｍｎ” 以外のカチオンも、フィブロネクチンに対するフィブロネクチンレセプターリポ ソームの結合活性に影響を与える。特にｃｏ２°およびＣｄ２＋は、付着する割 合（％）を、Ｃａ２＋およびＭｇ　２″′の存在下で得られた割合よりも増加さ せた。同様のアッセイにおいて、ｚｎ２＋はコントロール値の１２８％の付着を 生じた。Ｎｉ”は、Ｃａ”とｙ　ｇ　２°とを同時に用いた場合と同様の効果を 示した。Ｂａ”、Ｂｅ”％Ｆｅ”およびＦｅ３“の４種ツカチオンは、Ｃａ”よ りも少ない付着を生じたが、Ｃａ”　％　１ｇ２１存在しない場合よりも高いレ ベルでフィブロネクチンレセプター付着を維持した。多分一部には溶解度の問題 のためと思われるが、フィブロネクチンレセプター付着に対するＣｕ、Ｇｄ　、 　Ｌａ　およびＳｒ２＋の効果を決定することは困難であった。しかし、少なく とも１回の実験では、それぞれＣａ”　Ｇ）Ｍｇ　Ｑ　＊　６存在しない場合に 比べて、付着を増大させた。　Ｐｂ”Ｔも、おそらくまた溶解度の問題から、明 確な結果は得られなかった。

ムＬ フイ７’ｏキ７デ／Ｉ”ｎＶＳ　Ｈｉ８′Ｉ”−８’７る刀チオンつ影）Ｆカチ オン　イ丁Ｓ　ζ系ン Ｃａ”　ａｎｄ　Ｍｇ”　１００ Ｃａ”　７５±１Ｏ Ｎｉ”°　１００　＋　１２ Ｍｇ”　１１０±　５ Ｃｄ”　１３０　±３０ Ｃｏ”　１５０±１３ Ｋｎ”　２１０±２９ Ｎｏｎａ　Ｓ　±　９ レセプターリポソーム調製物の一部を、各々のカチオン（１ｍＭ）と混合し、フ ィブロネクチンでコートされたマイクロタイターウェルに対するリポソームの付 着を測定した。結果は、１　ｍＭ　ＣａＣｌ２および１　ｍＭ　ＭｇＣｌ２の存 在下で測定したコントロールの付着に対する割合（％）として示す。３回の実験 の平均および標準誤差を示す。

実施例ＩＩＩ ピ皿ヨ」と二３ａ≦韮 アフィニティーおよび、を・　させる レセプターの相対的なアフィニティーの変化を測定するために、レセプターリポ ソームの付着に対する可溶性リガンドによる阻害を用いた。第２図に示すように 、フィブロネクチンの１１０　ｋＤａの細胞結合性断片は、濃度依存的にレセプ ターリポソームのフィブロネクチンへの結合を阻害した。Ｍｎ２＋存在下では２ 　Ｘｌ０−”Ｍにおいて、Ｃａ”７Ｍｇ２”存在下では９Ｘ　１０−”Ｍにおい て結合は５０％減少した。これらの濃度を比較すると、Ｍｎ２“は、レセプター のその断片に対する相対的なアフィニティーを４．５倍増大させることが示唆さ れる。

Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐを含有するペプチドであるＧｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａ ｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ（ＧＲＧＤＳＰ　）もまた、レセプターリポソームのフィ ブロネクチンに対する付着を阻害した。ＧＲＧＤＳＰは、Ｍｎ２＋処理したレセ プターリポソームの結合を、　Ｃａ２”７Ｍｇ２”処理したリポソームを阻害す るのに必要な濃度よりもはるかに低濃度で阻害した。

５０％阻害を示すペプチド濃度はＭｎ”で１．３　Ｘ　１０−’Ｍ、　Ｃａ”７ Ｍｇ２＋で６．７Ｘ　１０−’Ｍであった。５０％阻害を示すペプチド濃度の比 較から、Ｍｎ２＋は、ペプチドに対するレセプターの相対的なアフィニティーを 、５０倍増大したことが示唆される。これらの結果は、Ｍｎ２＋はレセプターの リガンドに対する結合の阻害能力を増大することを示す。とりわけ、短い合成ペ プチドの阻害活性はＭｎ”の存在下で増大する。

実施例ＩＶ フィブロネクチンレセプターＥＬ［ＳＡレセプターの結合活性を測定するため、 Ｍｎ２＋を用いた酵素標識免疫吸着測定法を開発した。

プラスチックマイクロタイタープレートウェル（Ｌｉｎｂｒｏ、　Ｔｉｔｅｒｔ ｅｋ、　Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｌｒｉｅｓ社製）は、トリス緩衝生理食塩水 （ＴＢＳ）中の１μｇ／ｍ　１のフィブロネクチンまたは他のタンパク質で、室 温で一部コートした。結合アッセイの前にプレートを、０．０１％ツイーン２０ （ポリオキシエチレンソルビタンモノラウリエート）を含むＴＢＳ　（ＴＢＳ− ツイーン）で２回、および水で２回洗浄した。フィブロネクチンレセプターを２ ０　ｍＭオクチル−β−Ｄ−チオグルコピラノシドおよび１　ｍＭ　ＭｎＣｌ２ を含むＴＢＳで希釈した。レセプター希釈物をフィブロネクチンでコートされた ウェル中で、室温で９０分インキュベートした。非結合レセプターを、オクチル グルコシドおよびＭｎ２＋を含むＴＢＳで３回洗浄除去した。

結合レセプターを、精製されたウサギ抗フィブロネタチンレセプター抗体と共に 、室温で１２０分間インキュベートし、次にアルカリホスファターゼ（Ｓｉｇｍ ａ社製）の結合したヒツジ抗ウサギＩｇＧと共に、−晩インキユベートした。Ｔ ＢＳ−ツイーンで２回および水で２回洗浄して非結合抗体を除去した。アルカリ ホスファターゼの基質（１ｍＭ　ＭｇＣｌ２を含む１Ｍジェタノールアミン、ｐ Ｈ９，８、中の１　ｍｇ／ｍｌ　ｐ−二トロフェニルホスフェート（Ｓｉｇｍａ 社製））を加えた後、ウェル中の酵素活性を、マルチチャンネルフォトメーター （Ｔｉｔｅｒｔｅｋ、　Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ、　Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｉｅｓ社製）で測定した。各アッセイで２回ずつ測定を行った。コントロールに はＢＳＡでコートしたもの、およびコートしないウェルを用いた。

阻害実験においては、一定の濃度のフィブロネクチンレセプター（直接の結合ア ッセイで最大結合の約５０％を与える濃度）の存在下で、フィブロネクチン、フ ィブロネクチン断片、またはペプチドの希釈物を、フィブロネクチンでコートさ れたマイクロタイターウェル中でインキュベートした。結合レセプターを上記と 同様に１−て検出した。Ｃａ２＋およびＭｇ　２＋の影響を調べる場合には、Ｔ ＢＳ中で行うことも可能であるが、ＴＢＳの代わりにリン酸緩衝生理食塩水（Ｐ ＢＳ）を用いてアッセイを行った。

フィブロネクチンレセプターのフィブロネクチンに対する濃度依存的な結合がＥ ＬＩＳＡでみとめられた。Ｍｎ２＋の存在下では、検出可能なフィブロネクチン レセプターの最小値は約Ｌｏｎｇであった。最も高いレセプター濃度においても 、フィブロネクチンレセプターのラミニンに対する結合はわずかじが検出されず 、ビトロネクチン、ウシ血清アルブミンまたはコートしないマイクロタイターウ ェルに対する結合は検出されなかった。レセプター、第一抗体またはその両者を 加えないと、フィブロネクチン上のシグナルが存在しないということが、ネガテ ィブコントロールから示された。コーティングに使用したフィブロネクチンのタ イトレージョン（ｔｉ　ｔｒａｔ　１ｏｎ）から、フィブロネクチンの至適コー ティング濃度はｌμｇ／ｎ＋１であることが示された。このコーティング濃度と 、最大結合の約５０％を与えるレセプター量とは、次の阻害実験で用いた。

ＥＬＩＳＡにおいて、固相フィブロネクチンに対するフィブロネクチンレセプタ ーの結合を阻害する能力を、フィブロネクチン、１１０ｋＤａおよび１１．５ｋ Ｄａ　（Ｐｙｔｅｌａら（１９８７））の細胞結合性断片、並びにフィブロネク チンの細胞結合部位に由来するＧＲＧＤＳＰペプチドについて試験した。フィブ ロネクチンの１１０ｋＤａ断片は、最も高い阻害活性を示し、最大阻害の半分（ ＩＤｓａ）が約５ＸｌＯ−９Ｍで得られた。他のリガンドの阻害活性は、フィブ ロネクチン＞　ＧＲＧＤＳＰ＞１１．５ｋＤａ断片の順で減少しＩＤ５ａはそれ ぞれ８．６Ｘ　１０−９Ｍ、８．８ｘ　１０−”Ｍおよび？、　７Ｘ　１０−７ Ｍであった。フィブロネクチンおよびペプチドＧＲＧＤＳＰによる阻害を第４図 に示す。

第４図はまた、非常に関連の深いペプチドＧＲＧＥＳＰがＧＲＧＤＳＰに比べて 阻害性が２０００倍低いこと、さらに、非関連ペプチドは実質上活性がないこと も示す。

上記アッセイは、レセプターのフィブロネクチンに対する結合を促進するために 、Ｍｎ２°の存在下で行った。生理的な二価カチオンであるＣａ”およびＭｇ２ “の存在下では、アッセイは感受性が低かった。この観察から、レセプターのリ ガンドに対するアフィニティーは、Ｃａ２およびＭｇ２＋よりもＭｎ２＋の存在 下で増大することが確認された。

抗体の代わりに放射能標識したレセプターを用いたもう一つの検出方法を行った 。アッセイは除去し得る（ｒｅｍｏｖａｂｌｅ）マイクロタイターウェル（Ｉｍ ｍｕｎｏｌｏｎ　２．　Ｒｅｍｏｖａｖｅｌｌ、　ＤｙｎａｔｅｃｈＬａｂｏｒ ａｔｏｒｉｅｓ）中で行った。０．１、ｏ、ｓ、ｉ、ｓおよび１０μｇ／ｍｌの 濃度の＋２５■−フィブロネクチンをウェル中で一部インキユベートすることに よってコーティング効率を調べた。結合しないフィブロネクチンはＥＬＩＳＡと 同様にして洗浄除去し、ウェル中に残った放射能をカウントした。

レセプター結合のためのフィブロネクチンの至適コーティング濃度を見つけるた めに、上記と同様の様々な濃度の非標識のフィブロネクチンを、ウェルをコート するのに用いた後、一定濃度の　１２Ｊ標識されたフィブロネクチンレセプター （２５０ｎｇ／ｍｌ）を添加した。室温で９０分後、結合しないレセプターをＥ ＬＩＳＡと同様の方法で洗浄除去し、結合した放射能をカウントした。１２５工 標識されたフィブロネクチンレセプターのウェルに対する濃度依存的な結合がみ られた。

フィブロネクチンとフィブロネクチンレセプターとの間のアフィニティ一定数を 、置換実験で測定しまた。一定濃度の１２５１−フィブロネクチンレセプター（ ２５０ｎｇ／ｍｌ）を用い、その置換を、種々の濃度の非放射性レセプター（０ 〜２５μｇ／＋１）の関数として測定した。フィブロネクチンのコーティング濃 度は１ａｇ／ｍｌであり、非特異的結合は１ａｇ／＋ｌのＢＳＡでコートしたウ ェルに結合する放射能レセプターの量としてめた。見かけの解離定数は３Ｘ　１ ０−８Ｍであった。

実施例Ｖ Ｍｎ”はアフィニティークロマトグラフィーからのフィブロネクチンの収　を　 大するフィブロネクチンレセプターは、１１０ｋＤａフィブロネクチン断片（上 記Ｐｙｔｅｌａら、　（１９８５）、　（１９８７）を参照）を用いたアフィニ ティークロマトグラフィーで単離することができる。しかし、レセプターはアフ ィニティーマトリックスに緩く結合しており、洗浄用緩衝液で一部除去されるた め、収量は低い。

アフィニティークロマトグラフィーからのレセプターの収量は、クロマトグラフ ィー用緩衝液中のＣａ”７Ｍｇ２＋をＭｎ２”に置き換えることにより改善され た。５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析のバンドのデンシトメトリーから評価した収量は、表 ３に示すように、Ｃａ”およびＭｇ　２″を用いたよりもＭｎ”を用いた方が４ 倍高かった。

ゲルマンデンシトメトリーを用い、クーマシーブルーで染色したゲルをスキャン した。３回の同様の実験から、この収量の増大は再現性があることが示された。

さらに、界面活性剤としてオクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドの代わりに０． ５％Ｎ０ｎｉｄｅｔ　Ｐ−４０（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）を用いたときにも 、Ｍｎ”により１、匹敵し得る収量が示された。Ｍｎ２“またはＣａ２ゝ／Ｍｇ ”″で単離したレセプター調製物は、５ＤＳ−ＰＡＧＥで互いに類似していた。

Ｍｎ２４を用いて単離したレセプターをリポソーム付着アッセイで試験したとこ ろ、レセプターの結合は、Ｃａ”７Ｍｇ”中よりもＭｎ２９中の方が数倍高かっ た。このことからＭｎ”のレセプターに対する影響は可逆的であることが示唆さ れる。

太３ 〃す不ン　レジ７９ターｅ−７ｏｒ５ａＰ＠実施例ＶＩ Ｍｎ２“は　のインテグリンのリガンドに・　る鎧ｊ２１１六１０立 ビトロネクチンレセプターは、ペプチドＧｌｙ−Ａｒｇ−Ｇ１ｙ−Ａｓｐ−Ｐｒ ｏ−Ｌｙｓを含む点で異なるアフィニティーマトリックスを使用したこと以外は 実施例Ｉのフィブロネクチンレセプターの記載に従って、ヒト胎盤から精製した 。ペプチドはアブライドバイオシステムズモデル４３０Ａを用い、製造業者の仕 様書に従って合成した。ビトロネクチンレセプターは実施例Ｉの方法に従って、 １　ｍＭ　Ｃａ”および１　ｍＭ　Ｍｇ”の存在下で、あるいは１　ｍＭ　Ｃａ ２＋のみの存在下で単離した。いくつかのリポソーム付着アッセイにおいて、Ｍ ｎ２＋は、このインテグリンのビトロネクチンに対する結合を、Ｃａ”およびＭ ｇ　２“中で測定した結合よりも２０−５０％促進した。

■型コラーゲンレセプターもまた、胎盤から、実施何重に以下の変更を加えた方 法を用いて単離した。この方法では、Ｍｎ”ヲクロマトグラフィー用緩衝液に使 用し、アフィニティーマトリックスにはＩ型コラーゲンを含ませた。Ｃａ２＋お よびＭｇ　２４で処理したＩ型コラーゲンレセプターリポソームは、コラーゲン に対し測定可能な結合を示さなかった。しかし、Ｍｎ２＋の存在下では、コラー ゲンに対する明確で特異的な結合が測定された。

実施例ｖＩＩ 細胞　人アッセイにおける　の−筋 細胞移動に対するＭｎ”の影響は、示されたシステムに従って、腫瘍細胞を試験 することにより測定した。侵入はＨｅｎｄｒｉＸら、（１９８５）　Ｃｌ１ｎ、 　Ｅｘｐ、　Ｍｔａｓｔａｓｉｓ　３：２２１−２２３の記載に従って、メンブ レンインバージョンカルチャーシステム（ＭＩＣＳ）の改変方法を用いて測定し た。上記文献はここに参考文献として組み込まれている。使用した細胞系はＡ３ ７５Ｍと呼ばれるヒトメラノーマ細胞系であり、その起源はＸｏｚｌｏｗｓｋｉ ら、Ｊ、Ｎ、Ｃ，１，７２：９１３（１９８４）に記載されている。これは参考 文献としてここに組み込まれている。この細胞は、膜システムを通じて容易に測 定可能な数が移動することが知られているため、試験用に選択された。侵入しな いフィブロブラストをコントロール細胞として使用した。全ての細胞は、１０％ の熱不活性化ウシ胎児血清（Ｔｉｓｓｕｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃ ａｌｓ社製、　Ｔｕｌａｒｅ、　ＣＡ）および０゜１％のゲンタマイシン（Ｇｉ ｂｃｏ社製）を補った、ダルベツコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）　（Ｇ　ｊ ｂｃｏ社製、Ｃｈａｇｒｉｎ　Ｆａｌｌｓ、ＯＨ）中で培養した。細胞は、全て のアッセイにおいて、２　ｍＭ　ＥＤＴＡを含有し、Ｃａ２＋およびＭｇ２”を 含有しないＰＢＳを用いて、カルチャーディツシュから除去した。細胞は、２％ ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ中で４８時間、０．２５　ｕ　Ｃｉ／ｍｌの１４０ −チミジン（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ社製、　Ｂｏｓｔｏｎ、 　ＭＡ）を用いて放射標識した後、ＭｎＣｌ２の存在下あるいは非存在下で、以 下のように調製したＭＩＣＳチャンバーの上部区画部分に植え込んだ。

新鮮なヒト胎盤を出産時に得て、その際にへその尾の領域近くから羊膜を得た。

滅菌ＰＢＳ、ファンジャイーゾーン（Ｆｕｎｇｉ−ｚｏｎｅ）／ペニシリン／ス トレプトマイシン（［ｒｖｉｎｅ　５ｃｉｅｎｔｉｆ　ｉｃ、　Ｉｒｖｉｎｅ、 　ＣＡ）ですすぎ、そして再度ＰＢＳですすいだ後、Ｇｅｈｌ　ｓｅｎおよびＨ ｅｎｄｒｉｘ、（１９８７）　Ｐｉｇｍｅｎｔ　Ｃｅ１ｌ　１：１６−２１の図 １に表されている、特別に設計されたＭＩＣＳチャンバーに合うように、羊膜を 整えた。上記文献は参考文献としてここに組み込まれている。羊膜は、ＭＩＣＳ 装置の上部プレートと下部プレートとの間に、上皮表面が上部プレートに向き合 うように、無菌状態で載置した。締めネジを締め、膜外の物質をメスで取り去っ た。膜をチャンバーに取り付ける前に、１０％０％ウシ胎清を含む無菌ＤＭＥＭ （Ｇｔｂｃｏ）で下部のウェル（”標的ウェル”）を満たした。羊膜の上皮は、 新しく調製した０、２５Ｍ　水酸化アンモニウム（ＮＨ４０Ｈ）で５分間、室温 で処理して取り除いた後、ＰＢＳでさらに洗浄し、その下にあるコラーゲン性ス トロマとともに、露出した基底膜が残った。このようにして、ホスト細胞の干渉 なしに、細胞と細胞外マトリックスとの相互作用を調べることが可能となった。

標識した細胞を最終濃度１゜０ＸＩＯ５／ｍｌで、血清含有ＤＭＥＭ中の各々の 上部または”シーディングチャンバーに加え、３７℃、５％ＣＯ２および９５％ 空気の雰囲気の、加湿されたインキュベーター内に置いた。全ての膜は、細胞を 植え込む前に、漏れを注意深く調べた。

基底膜とその下のコラーゲン性ストロマにうま＜侵入できた細胞の数は、下部ウ ェル中の培地（１，１ｍｌ）を各２４時間ごとと７２時間の時点で、　ＭＩＣＳ チャンバーの横についている口から、進行中の実験を中断することなく取り出し て測定した。各下部ウェルからサンプルを取り出した後、新しい培地を下部ウェ ルに補充した。このようにして、細胞侵入は、同一の実験において種々の時間間 隔で、繰り返し測定できた。全ての下部ウェル中の試料について、１４Ｃ−チミ ジンで放射能標識した細胞はペレットとした後、シンチレーシコンバイアルに入 れた。次に、全ての実験について、集められた１４Ｃ標識細胞は、０．５＋ｍｌ のＩ　Ｎ　ＮａＯＨで溶解した。蛍光を防ぐため１００　μｌの氷酢酸を各バイ アルに加え、工０ＩＩｌｌのＡＣＳシンチレーションカクテル（Ａｍｅｒｓｈａ ｍ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＡｒｌｉＡｒｌｌｎ　Ｈｅｉｇｈｔｓ、　ＩＬ） を、シンチレーションカウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍａｎｔｓ、 Ｂｒｅａ、ＣＡ）を用いた放射能測定の前に加えた。

Ｍｎ”による羊膜移動の調節は、種々の濃度（１０−１００μＭ）のＭｎＣｌ２ が、ＭＩＣＳチャンバーの上部と下部の両ウェルに含まれるようにして、上記の 様にアッセイを行って調べた。Ｍｎ２＋またはＣａ２“の存在下でのＡ３７５Ｍ 細胞が羊膜を侵入する能力を、第５図に示す。　結果は、１００μＭの濃度にお いて、　Ｍｎ２＋が７２時間後のＡ３７５Ｍ細胞の移動を３０％増加したことを 示す。より高濃度のＭｎ”では、細胞の生存に影響するので、従って移動は減少 する。

実施例Ｖｌｌ＋ Ｍｎ２＋　下における　ペプチドによるの　の且　゛ ＲＧＤ配列を有するペプチドが、　ＭＩＣＳ系において、羊膜を通っての腫瘍細 胞の侵入を阻害することが示された。この効果はペプチドによるフィブロネクチ ンレセプター機能の阻害によるものであると考えられる（　Ｇｅｈ　１ｓｅｎら 、ＪＣＢ　１０６：９２５−９３０（１９８８）、これは参考文献としてここに 組み込まれている）。Ｍｎ”は、フィブロネクチンレセプターの、フィブロネク チンに対シテよリモＧＲＧＤｓＰに対してのアフィニティーを、より増大させる ことから、合成ペプチドの効果は、Ｍｎ２ゝの存在下で、上記の侵入アッセイに 従って試験した。ＧＲＧＤＳＰは濃度を変化させて（ｔｏ　〜１０００μｇ／ｍ ｌ）、　１００　ｕ　Ｍ　ＭｎＣｌ２またはＣａＣｌ２と共に、侵入アッセイに 添加された。細胞侵入は、このようにして７２時間計数された。

第６図の結果により、侵入を５０％阻害するのに必要なペプチドの濃度は、Ｃａ ”の場合は１．２Ｘ　１０−’Ｍであるのに対して、　Ｍｎ２″′ノ場合は、５ ＸＩＯ−５Ｍであったことを示す。コントロールペプチドであるＧＲＧＥＳＰ（ Ｅはグルタミン酸）は、いずれのカチオンの存在下でも効果がなかった。データ は、Ｍｎ”の存在下では、Ｃａ２＋の存在下に比べて、侵入を阻害するために、 必要とされるペプチドが少ないことを示す。

実施例ＩＸ インビトロ“創イ”モデルにおける細　の−節種々の接着タンパク質でコートさ れた創傷（無細胞）領域の中への細胞の移動に対するＭｎ２＋の影響を調べるた め、インビトロの創傷アッセイを開発した。このアッセイは、移動の過程に含ま れる、特異的リガンドおよびその各々のレセプターの測定を可能にする。より詳 細には、このアッセイは、様々な基質について、Ｍｎ”存在下での細胞の移動を 測定するために使用される。Ａ３７５Ｍ細胞を、６個のウェルカルチャーディツ シュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ＮＹ）中で密集状態になるまで 生育させた。４−２＋ｎｏ＋幅のレーンをかき取るように特別に設計された櫛を 、細胞を除去して細胞層にクロス状のパターンをっ（るために使用した。次に、 細胞の無いレーンを、フィブロネクチン、ビトロネクチン、Ｉ型またはＩＶ型コ ラーゲン、ウシ血清アルブミンあるいはラミニンのリガンドの一つを用いて、１ 時間３７°Ｃでコートした。これらのタンパク質は、１０μｇ／ｍｌの濃度でＰ ＢＳに溶解し、次に直接、創傷細胞層に付与した。

Ｃａ２＋およびＭｇ２＋、そして１００　μＭ　ＭｎＣｌ２を含む標準培養培地 をカルチャーディツシュに添加する一方、コントロールディツシュにはＭｎ”を 含まない同様の培地を加えた。　細胞移動は可視化することにより検出した。

Ｍｎ２＋の存在下では、Ａ３７５Ｍ細胞は、その移動、言い換えればフィブロネ クチンおよびＩＶ型コラーゲンでコートされた空きスペースを埋めていくことが 、コントロールに比べ増大した。

これらのデータは、基質に対する細胞の移動が、Ｍｎ”の供給により増大され得 ることを示す。

実施例Ｘ Ｇｄ３＋はリガンドに・　るインテグリンの　Ａを１１　るＧｄ３＋がインテグ リンの結合を阻害する能力を、リポソーム付着系でアッセイした。フィブロネク チンレセプター（ＦＮＲ）およびビトロネクチンレセプター（ＶＮＲ）のリポソ ームは、ｌ　ｍＭＣａＣ１２およびＬ　ｍＭ　ＭｇＣｌ２を含むＴＢＳへの透析 により調製した。

アッセイの開始時に、ＧｄＣｌ３を各リポソームに加えた。表６に示すように、 ０．３　ｍＭ以上の濃度で、Ｇｄ３＋は、フィブロネクチンレセプターおよびビ トロネクチンレセプターの、それらのりガントへの付着を有意に減少した。これ らの結果から、Ｇｄ３“はインテグリンの機能の一般的な阻害剤であり、これは インテグリン活性の好ましくない効果を緩和するために使用され得ることが示唆 される。このような事態は、例えば心臓または脳の梗塞に伴う虚血によって起こ る組織の損傷部位に対する炎症性細胞の結合が含まれる。

（以下余白） ム≠ インチブタンっｉ：８Ｆり７ヲシｃｒｄ”ｔｓよる１且智（ｍＭ） ｎ迅　ｙ肚Ｂ 本発明を現在の好ましい態様に関連して述べてきたが、本発明の精神から離れる ことなく、様々の変更が可能であることが理解される必要がある。従って本発明 は以下の請求の範囲によってのみ限定される。

一口 ○ ′ノぎンームイ丁几うクン←０−１しく一ン丁）ふ馨少き（系９　。

ＦＩＧ、　２ ＦＩＧ、　３ ＰＬ号剤凛Ａ　（Ｍ） ＦＩＧ、４ 特表平４−５σ１７１５　（１１） 国際調査報告 １＋１Ｉｌｒ”ｊｌ’ａ’ｌａｌＡ６ＩＣｊｌｎＭｌｌｅ、ｏ（７／ＵＳ３９／ Ｑ３９７９＋”１．−４１！！：、−一、ｌ；ＣＴ＋’ｕＳ田７つＣつ７つ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．インテグリン結合改変性の活性を有するカチオンを供給することにより、イ ンテグリンの、そのリガンドに対する結合アピディティーを改変する方法。 ２．前記カチオンが二価または三価カチオンである請求項１に記載の方法。 ３．前記カチオンカＭｎ２＋、ＣＯ２＋、Ｃｄ２＋、Ｎｉ２＋、Ｚｎ２＋および Ｇｄ３＋からなる群から選択される請求項１に記載の方法。 ４．前記改変が、前記インテグリンの、そのリガンドに対する結合アピディティ ーの増大を、さらに包含する請求項１に記載の方法。 ５．前記改変が、前記インテグリンの、そのリガンドに対する結合アビディティ ーの減少を、さらに包含する請求項１に記載の方法。 ６．前記カチオンがランタニド系列である請求項５に記載の方法。 ７．前記改変が、前記インテグリンの、そのリガンドに対する結合アフィニティ ーの増大を包含する請求項１に記載の方法。 ８．前記改変が、前記インテグリンの、そのリガンドに対する結合アフィニティ ーの減少を包含する請求項１に記載の方法。 ９．前記インテグリンがフィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、Ｉ型コ ラーゲンおよびＩＶ型コラーゲンのレセプターからなる群から選択される請求項 １に記載の方法。 １０．Ｍｎ２＋を供給することにより、フィブロネクチンに対するフィブロネク チンレセプターの結合アピディティーを増大させる方法。 １１．Ｍｎ２＋を供給することにより、ビトロネクチンレセプターの、そのリガ ンドに対する結合アビディティーを増大させる方法。 １２，Ｍｎ２＋を供給することにより、Ｉ型コラーゲンレセプターの、そのリガ ンドに対する結合アビディティーを増大させる方法。 １３．Ｍｎ２＋を供給することにより、ＩＶ型コラーゲンレセプターの、そのリ ガンドに対する結合アビディティーを増大させる方法。 １４．Ｇｄ３＋を供給することにより、インテグリンの、そのリガンドに対する 結合アビディティーを減少させる方法。 １５．前記インテグリンがフイブロネクチンレセプターまたはビトロネクチンレ セプターである請求項１４に記載の方法。 １６．インテグリンリガンドの結合したマトリックスを有するカラムにレセプタ ーを通し溶離することによりレセプターを精製する方法において、結合用溶液中 にインテグリン結合促進性のカチオンを供給することを包含する改良法。 １７．インテグリン結合促進性のカチオンがさらにＭｎ２＋を含む請求項６に記 載の方法。 １８．前記リガンドが１１０ｋＤフイブロネクチン断片である請求項１６に記載 の方法。 １９．前記リガンドがＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐのアミノ酸配列を含むペプチドで あり、該ペプチドが細胞の付着を促進する活性を有する請求項１６に記載の方法 。 ２０．前記改良法がさらに、前記レセプターをＥＤＴＡを用いて溶離することを 包含する、請求項１６に記載の方法。 ２１．Ｍｎ２＋を供給することにより、溶液からリガンドでコートされた表面へ のインテグリンの結合を増大させる方法。 ２２．インテグリン結合促進性のカチオンを供給することにより、溶液中でのイ ンテグリンレセプターとリガンドとの結合を増大させる方法。 ２３．前記リガンドがＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐのアミノ酸配列を含むペプチドで あり、該ペプチドが細胞の付着を促進する活性を有する請求項２２に記載の方法 。 ２４．前記リガンドが、フイブロネクチン、ビトロネクチン、Ｉ型コラーゲンお よびＩＶ型コラーゲンからなる群から選択される請求項２２に記載の方法。 ２５．前記カチオンが二価カチオンである請求項２２に記載の方法。 ２６．前記カチオンが、Ｍｎ２＋、ＣＯ２＋、Ｃｄ２＋、Ｎｉ２＋およびＺｎ２ ＋からなる群から選択される請求項２２に記載の方法。 ２７．インテグリンのリガンドに対する結合を検出する方法であって ａ．インテグリン結合改変性のカチオンの存在下で該インテグリンを該リガンド に結合させる工程、ｂ．該インテグリン−リガンド結合を検出する工程、を包含 する方法。 ２８．前記インテグリン−リガンド複合体と反応する、標識された抗体を供給す ることにより、該インテグリン−リガンド結合を検出する、請求項２７に記載の 方法。 ２９．インテグリンの、そのリガンドに対する結合を検出する方法であって、 ａ．該インテグリンを検出可能なように標識化する工程；および ｂ．インテグリン結合促進性のカチオンの存在下で、該標識化インテグリンを該 リガンドに結合させる工程；ｃ．該結合した標識化インテグリンの存在を検出す る工程を包含する方法。 ３０．前記検出可能な標識が、放射性核種、酵素、蛍光または発光分子からなる 群から選択される請求項２９に記載の方法。 ３１．インテグリンの存在を決定する方法であって、ａ．インテグリン結合促進 性のカチオンの存在下で、該インテグリンを固定化リガンドに結合させる工程； ｂ．該インテグリンと反応する、検出可能な抗体を供給する工程；および ｃ．該抗体と該インテグリンとの間の結合を決定する工程を包含する方法。 ３２．インテグリンリガンドの存在を決定する方法であって、ａ．インテグリン を該インテグリンリガンドに結合させる工程；および ｂ．該インテグリンと該リガンドとの結合を決定する工程；を包含する方法。 ３３．インテグリン結合促進性のカチオンを供給することにより細胞の移動を促 進する方法。 ３４．前記インテグリン結合促進性カチオンが二価カチオンである請求項３３に 記載の方法。 ３５．前記インテグリン結合促進性カチオンが、Ｍｎ２＋、ＣＯ２＋、Ｃｄ２＋ およびＮｉ２＋からなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。 ３６．インテグリン結合促進性のカチオンを供給することにより創傷の治癒を促 進する方法。 ３７．前記インテグリン結合促進性のカチオンが二価イオンである請求項３６に 記載の方法。 ３８．前記インテグリン促進性カチオンが、Ｍｎ２＋、ＣＯ２＋、Ｃｄ２＋およ びＮｉ２＋からなる群から選択される請求項３６に記載の方法。 ３９．Ｍｎ２＋および適当な担体を含む、創傷治癒を促進するのに有用な組成物 。 ４０．Ｍｎ２＋および可溶性リガンドを供給することにより、インテグリンの、 リガンドヘの結合を阻害する方法であって、該リガンドが、Ａｒｇ−ｇｌｙ−Ａ ｓｐのアミノ酸配列を含み、そして細胞の付着を促進する活性を有する、方法。