JPH05503070A - 新規の細胞外基質レセプター／リガンド相互作用を利用した血管内皮に対するリンパ球接着の抑止方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 新規の細胞外基質レセプター／リガンド相互作用を利用した血管内皮に対するリ ンパ球接着の抑止方法 １、　［発明の利用分野］ 本発明は細胞どうしの接着を抑止する方法に係わり、α４β１細胞外基質レセプ ターが特定のペプチド鎖と結合することによって血管内皮細胞へのリンパ球の接 着を促進するとの所見に基づくものである。本発明の実施例においては、血管内 皮細胞とリンパ球の結合を抑止して、リンパ球が組織に入り込み、免疫応答を妨 げるのを防止するためにモノクローン抗体またはペプチドを利用する。

２、［発明の背景］ ２．１．　細胞外基質レセプター コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニンなどのような細胞外基質（ＥＣＭ）成 分に特異の細胞表面レセプターについては既に報告がなされている（Ｈ７ｎｅｓ 、　１９Ｈ。

Ｃｅ１ｌ、　４ｇ：５４９−５５４　；　Ｈｅ１ｍｅ＋、　１９８８．Ｉａ＋ｍ ｕｎｏｌ、　Ｔｏｄａｔ、　９　：ｌ０９）。細胞外基質レセプター（ＥＣＭＲ ｓ　Ｉ、ＩＩ及び■）の作用は、アフィニティー・クロマトグラフィーによって （Ｗａ７ｎｅ＋及びＣａ「ｔｅｌ、１９８７，１．　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、１ ０５　：　１８７３−１８８４　；　５ｔａｘｔＩ等、１９８９．　Ｊ、　Ｃｅ １ｌ　Ｂｉｏｌ、、１９８：　１９７１−１９２４）、さらには細胞と精製リガ ンドの相互作用を抑止するモノクローン抗体を製造することによって（Ｗａｙｎ ｅｒ及びＣａｒｔｅｒ、　１９８７．　Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、１０５　 ：　１８７３−１８８４　）または細胞とＥＣＭの相互作用を抑止し、するモノ クローン抗体を製造することによって（Ｗｘ７ｎｅ等、　１９８８．　Ｊ、　Ｃ ｅ１ｌ。

Ｂｉｏｌ、、１０７　：　１８８１−１８９１　）解明された。

上記の技術を利用して種々のＥＣＭＲｓが固定された。

モノクローン抗体を使用して、Ｗａ７ｎｅ＋及びＣａｒｔｅｒ　（１９ｇ？。

Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、　１０５　：　１８７３−１８８４　）はヒトの 線維肉腫細胞に固有のコラーゲンに対する２種類の細胞表面レセプターを発見し た。分類Ｉのレセプターはコラーゲン、フィブロネクチン及びラミニンとの細胞 接着に関与し、分類■のレセプターは固有のコラーゲンとの細胞接着にだけ関与 した。Ｌａ７ｎｅｒ等（１９ｇ８．　１．　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、１０７　： 　１８８１−１８９１　）はコラーゲン（ＰＩＨ５）、フィブロネクチン（ＰＩ Ｆ８またはＰＩＤ６）、及びコラーゲンとフィブロネクチン（Ｐ　Ｉ　Ｂ　５） の双方に対するヒト細胞の接着を抑止するモノクローン抗体を発見した。なお、 ＰＩＦ８及びＰＩＤ６はＥＣＭＲＶｌとして知られる１４０　ｋＤ表面レセプタ ーと反応することが判明した。Ｋｏｎｉｃｋｉ等（１９８８，Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　 Ｂ１０１、Ｃｈｅｍ、、　２５３　：　４５１６−４５１９　）は上記ＰＩＨ５ がコラーゲンＩ及び■に対する不活化されたヒト血小板の接着をも抑止するが、 フィブロネクチンとの接着は抑止しないことを報告した。フィブロネクチンとの 細胞接着を抑止するモノクローン抗体を使用してニワトリの胚線維芽細胞から少 なくとも３種類の糖蛋白を含む錯体が分離され（ＫＩｌｌｄｓｅｎ等、１９８５ ．　Ｅｘｐ、Ｃｅ１ｌ。

−・クロマトグラフィーを利用して哺乳類細胞から２種類の糖蛋白の錯体が分離 された（Ｐ７ｆｅｌａ等、　１９８５．　Ｐｒｏｃ。

白質ｎｂ及びＨａは血小板膜中に非共有結合１：１錯体として存在しくＩｅｎｎ ｉｎｇｓ及びＰｈ１ｌｌｉｐｓ、１９ｇ２．　Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

２４２１　；　Ｍｘｒｇｕｅｒｉｅ等、　１９８４．Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅ ｍ、、１３９　：　５−１１）、フィブロネクチン（Ｇａｕｄｉｅｒ及びＨ７ｎ ｅｓ　、　１９８５、　Ｃｅ１ｌ　、４２　：　４３９−４４８　；　Ｐｌｏｗ 等、　１９８５．　Ｂｌｏｏｄ、　６６　：　７２４−７２７）、フォノ・ウィ ルプラント因子（Ｒｏｇｇｅｒｉ等、　１９８２゜Ｐｒｏｃ、　Ｎａｌ　Ａｃａ ｄ、　Ｓｃｉ　Ｕ、Ｓ、Ａ１．７９　：　６０３８−６０４１　）及びヴ５６２ ）に対するＥＣＭＲとして作用することが判明している。

細胞外基質レセプターの多くは構造的に相同である。

ＥＣＭＲｓは細胞接着分子という１群のインテグリンに属し、インラグリンβ１ サブユニットと錯化合した特有１８ｇ＋−１８９１）。同じくインテグリン・レ セプターに属するものとしては、白血球接着蛋白及びＶＬＡ抗原がある。

白血球接着蛋白にはＬＦＡ−１，Ｍａ　ｃ−１，Ｐ１５０／９５などがあり、種 々のα鎖と共通の９５ｋＤａβ鎖から成る二量体糖蛋白である（厚木等、１９８ ７．　Ｃｅ１ｌ、　４８　：　６８１−６９０）。ＶＬＡ抗原は培養１９２３球 に極めて遅く現われると（ｖｅ＋７１ａｔｅ　ａｐｐｅａ＋ａｎｃｌ）ことから 命名された（Ｈｅトに対する抗血清がフィブロネクチンまたはラミニンへの細胞 接着を阻止することが確認されている（高田等。

１９８７、　Ｎｘｊｕｒｅ、　３２６　：　６０７−６１０　）。

これらのＥＣＭＲｓ間の相互関係が既に解明されている。ＥＣＭＲＶｌは基本型 フィブロネクチン・レセプタ（Ｐ７＋ｅｌａ等、　１９８５．　Ｃｅ１ｌ、月し １９１−１９８　）　、ａ　５β１、血小板糖蛋白（ｇｐ）Ｉｃ／ｎａ及びＶＬ Ａ５と同じであり、ＥＣＭＲＩ［はα２β１、血小板糖蛋白Ｉａ／ＩＩａ及びＶ ＬＡ２と同じであり（Ｈｅｍｌ！ｒ等、１９Ｈ，Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈ１８９１） 。α２β１．α３β１及びα５β１に対するモノクローン抗体（ＰＩＨ５，ＰＩ Ｄ６及びＰＩＢ５）はコラーゲン、フィブロネクチン及びラミニン被覆表面への 線維芽細胞または血小板の接着を抑止する（にｕｎｉｃｋｉ等。

１９８８　Ｊ、Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、、１０７　：　１８８１−１８９１　： Ｗａｌｎｅｔ等、１９８８、同上）。表１には上記インテグリンのいくっがを、 表■には種々のＥＣＭＲｓを認識するモノクローン抗体をそれぞれ表記した。

表　■ 抗　体　レセプター　リガンド　参　考　文　献ＰＩＨ５（２２β１　コラーゲ ン　（Ｗｔ７ｎｅ＋等、１９８７．　Ｊ。

ラミニン　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、　１０５　：　１８７３−１８８４：Ｗ＊７ ｎｅｒ等、１９１１Ｌ　Ｊ。

Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、　１０７　：　１８８１−１８９１　）ＰＩＢ５　ａｓ β、　コラーゲン　（ＷＨｖｅｒ等、１９８７．　Ｊ。

フィブロネクチンＣｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、　１０５　：　１１１７３−１８８４ 　）Ｐ４Ｃ２α４β１　フィブロネクチン （Ｃ８−１） ＰＩＤ６　（！５β、　フィブロネクチン　（ＷｔｙＩｌｅｒ等、１９８Ｌ　Ｊ 。

細胞　（ＡｒＨ−Ｇ１７−＾ｔｐ−５ｃｒ　）　Ｂｉｏｌ、、　１０５　：　１ ８７３−１８８４　）Ｐ４ＣＩＯβ、　ＦＮ、ＣＯＬ、ＬＡＭＰ４１１９　β、 （Ｃｄ１ｇ） β１インテグリンは培養された細胞と組織とで異なる形で発現され、活性化発現 に明らかな差異がある。例えば、造血細胞中でのα５β１の発現は胸腺細胞及び 末梢血液リンパ球、単球、急性リンパ性または骨髄性白血病細胞、活性化Ｔ細胞 、遊走造血前駆体細胞、及び培養Ｔ。

Ｂまたは赤白血痰細胞系のポピユレーション細区分に限られる（Ｂｅｒｎａｒｄ ｉ等、１９８７．　Ｉ、Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、、　１０５　：　４８９−４９ ８　；　Ｃｕｄａｒｅｌｌｉ等、　１９８８．　Ｊ、　Ｃｅ１ｌ、Ｂｉｏｌ、、 　１０６　：　２１８３−２１９０　；　Ｇａｒｃｉａ−Ｐａ＋ｄｏ等、　１９ １１９．Ｅｘｐ、　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｓ、、１８１：４２Ｇ−４３１；　Ｇｉａｎ ｏＮｉ等、１９８９．　Ｉ、Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、、　１０３　：　４２９− ４３７　；　Ｌｉａｏ等、　１９８７．Ｅｘｐ、　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｓ、、１７１ 　：３０６−３２０　；Ｗ＊７ｎｅｒ等、　１９８ｇ、Ｊ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉ ｏｌ、、１０７　：　１８８１−１８９１　）。

２．２．　フィブロネクチン フィブロネクチンは細胞外基質、血漿及びいくつかのタイプの細胞の表面に見出 される蛋白である（秋山及び山田、　１９８７．＾ｄｙ、Ｅｎｒｙｎｏ１．５９ 　：　１−５７）　ｏ血漿中ではフィブロネクチンはそれぞれが約２２Ｑｋ　Ｄ 　ａの分子量を有する２つの類似したサブユニット（Ａ及びＢ鎖）から成る糖蛋 白ヘテロダイマーとして存在する（秋山及び山田。

複数の特定分子内領域（Ｒｕｏｓｌａｈｊｉ等、　１９８１．　Ｊ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｆｆｌ、、２５６　＋　７２７７−７２８１　）を完全な分子と同様にコ ラーゲン、線維素、ヘパリン及び細胞表面と相互作用できるフラグメントに分割 することができる（Ｈ７ｎｅｓ及び山田。

１９８２、Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、　３５　：　３６９−３７７　）。

細胞及び血漿フィブロネクチン・ヘテロダイマーは類似した、ただし全く同じで はないポリペプチドを含む。

フィブロネクチン・サブユニットの構造が多様であるのはプレフィブロネクチン ｍ　ＲＮ　Ａの少なくとも２つの部位（ＥＤ及び■Ｃ８部位）におけるスプライ シングに起因するフィブロネクチンｍ　ＲＮ　Ａ　１次鎖の多様性による。

フィブロネクチンは種々のタイプの細胞、例えば、線維芽細胞（Ｇｒｉｎｅｌｌ 等、　ｌ９１７．Ｅｘｐ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｅｓ、、１１０　：　１７５−２１０ 　）　、７クロフアージ（Ｂｅｖｉｌａｃｑｕｅ等、　１９８１．Ｊ、Ｅｌｌｌ 、Ｍｅｄ、、　１５３　：　４２−６０　）　、多形核白血球（Ｍａｒｉｎｏ等 、　１９８５゜−６２）及びケラチン細胞（Ｃｌａｃｋ等、　１９８５．　Ｊ、 ＩｎｖｅｓｔＤｅ＋ｍａｔｏ１．、８４　：　３７８−３８３　）の接着を促進 する。このほかにも接着を促進される細胞がある（Ｌ目０等、　１９８９．　Ｅ ｌｌｌ。

フィブロネクチンと分子量が約１４０ｋＤａの細胞表面蛋白との相互作用が線維 芽細胞（Ｂｒｏｗｎ及びＪｕｌｉｘｎｏ、　１９ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ ｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、、８３　：　６００２−６００６　）　、リン４４８　）　、 筋肉細胞（［Ｉｏｒｏｖｉｔｘ等、　１９８５．　Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、 。

１９１−１９８　’）において観察されている。

細胞表面とのフィブロネクチンの結合はフィブロネクＯ）。合成ペプチドを使用 した最小細胞認識部位と考えられる鎖がテトラペプチドＡｒｇ　−Ｇ１７　−Ａ ｓｐ　−３ｅｒ　（ＲＧＤＳ）であると同定された（Ｐｉｅｒｓｃｈｂａｃｈｅ ｒ及びＲｕｏｓｌａｈｊｉ　、１９８４．　Ｎａｔｕｒｅ、３Ｈ：　３θ−３３ ；　Ｐｉｅｒｓｃｈｂａｃｈｅｒ２２７　；　Ｐｉｅｒｓｃｈｂａｃｈｅｒ等、 　１９８４．　Ｐｔｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

領域に存在するＲＧＤＳ鎖はＰ７ｔｅｌａ等が報告した基本型フィブロネクチン ・レセプターのリガンドである（＋９８５゜Ｃｅ１１．、　４０　：　１９１− １９８　）。

ＲＧＤＳ以外の部位がフィブロネクチン結合に関与することが種々の観察なら推 測された（Ｈａｍｐｈｒｉｅｓ等、１９８６、Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、１０ ３　：　２６３７−２６４７　）　、例えば、合成ペプチドの結合新和力はこれ よりも大きいフラグメントまたは完全なフィブロネクチンの結合新和力よりもは るかに低いことが明らかになっている（秋田等、　１９８５．　Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、２６０　：　１０４０２−１０４０５　；秋田等、　 １９１１５．１．　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　２６０　：　１３２５６−１３２ ６０　）　。ＭｃＣａｒ＋ｈ７等は血漿フィブロネクチンの３３ｋＤａとＢ　１ ６−　Ｆ　１０黒色腫細胞との間の結合新和力を報告している（１９８６．Ｊ、 　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、、　１０２　：　１７９−１８８　）　。Ｂｅｔｎ＊ ｒｄｉ等はリンパ前駆体細胞がフィブロネクチンの２つの異なる部位に接着し、 ＢａＦ３細胞系がＲＧＤ結合領域と相互作用し、ＰＤ３１細胞系がカルボキシ末 端セグメントにあってヘパリンに対する高親和力結合部位と関連する別の領域と 相互作用するＨｕｍｐｈｒｉｅｓ等は他の細胞との接着相互作用を形成するフィ ブロネクチン・フラグメントの能力を黒色腫細胞と線維芽細胞を対象に比較した （１９１１６．　Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、。

１０３　：　２６３７−２６４７　）。線維芽ＢＨＫ細胞はＲＧＤＳを含有する 細胞結合領域を表わす７５ｋＤａフラグメントに急速に付着したのに対して、Ｂ ＩＯ−ＦＩＯ黒色腫細胞は７５ｋＤａフラグメントには付着せず、タイプ■結合 セグメント（ＣＳ）弁別部位または（ｍＲＮＡのオルターナティブ・スプライシ ングが起こる）■一部位を含むフィブロネクチン部分から得られた１１３ｋＤａ フラグメントに付着した。フィブロネクチン・カルボキシル末端付近に位置する 上記■Ｃ８部位において鎖Ａｒｇ−Ｇｌｕ　−Ａｓｐ　−Ｍａｌ　（ＲＥＤＶ） が重要な機能を果すと推測された。

Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓ等は■Ｃ８部位にまたがる一連のオーバラップ合成ペプチド を観察した（１９８７．Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｂｅｍ、、２６２　：６８８６− ６８９２　）。その結果、互いに隣接しない２つのペプチドＣ８１及びＣ３５は 黒色腫細胞へのフィブロネタチンの接着を競合的に抑止するが、線維芽細胞への 接着は抑止しないことを発見した。なお、Ｃ８１はＣ３５よりも顕著な抑止作用 を示した。Ｌｉａｏ等はＩｇＡ−分泌リンパ細胞であるＭＯＰＣ３１５がＲＧＤ 相互作用を介して細胞結合領域に結合するだけでなく、ＲＧＤとは無関係のメカ ニズムによ−りてカルボキシ末端ヘパリン結合領域とも優先的に結合することを 報告している（１９８９．　Ｅｘｐ、　Ｃｅ１ｆ、　Ｒｅｓ、、１８１　：　３ ４ｇ−３６１）　。ただし、フィブロネクチンのカルボキシ末端部位に存在する 接着鎖及びこの接着鎖への細胞接着に関与する細胞表面レセプターは同定さ細胞 間の接着相互作用は組織の分化、成長、発育など種々の生物学的事象の過程で起 こり、種々の疾病の原因として重要な役割を果すらしいとの結論が出されている 例えは、免疫系において接着相互作用が極めて重要であることが知られており、 免疫仲介細胞の位置は少なくとも部分的要因として細胞間の接着相互作用によっ て決定されると考えられる。リンパ細胞の再循環はランダムではな（（Ｍａｌｅ 等、”Ａｄｎｎｃｅｄ　１ｍｍｕｎｏｌｏｇ７”、Ｊ、　Ｂ、　１゜１ｐｐｉｎ ｃａｔｔ　Ｃｏ、、Ｐｈ１ｌａｄｅｌｐｈｉａ、Ｐ、１４．４−１４．５　）　 、リンパ球は進入する２次リンパ器官のタイプに対する優先選択性を示す。２次 リンパ器官を通過する際にリンパ球は先ず該当の後毛細管率静脈の血管内皮細胞 と結合し、次いで内皮細胞間の強固な接合部を開らき、最終的にその下にある組 織内へ移動しなければならない。ホーミングと呼ばれる血液から特定リンパ組織 への再循環リンパ球の移動はリンパ球球表面及び高内皮小静脈の補完的接着分子 と関連した。

同様に、多形核白血球の血管内皮への接着は急性炎症性応答発生における重要な 事象であり、走化性応答やある種の好中球仲介血管損傷の必須条件であると考え られる。（ｚｉＩＩＩｍｅｒｍａｎ及びＭｃｌｎｔ７ｔｅ、１９８ｇ、Ｊ、Ｃｌ １ｎ、ＩｎｖｅｓＬ、８１　：　５３１−５３７　；　Ｈａｒｌａｎ等、１９８ ７．　”Ｌｅｏｋｏｃ７ｔｅ　Ｅｍｉｇｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｔｓ　５ｅｑ ｏｅｌｘｅ″、Ｍｏｖａｊ、ｅｄ、　Ｓ、Ｋａｔｇｅ＋　ＡＧ、Ｂａ５ｅｌ、　 ｐｐ、　９４−１０４　；　Ｘｉｍｍｅｒｍａｎ等、同論文、、　ｐｐ、　１０ ５−１１８）。

特定の作用物質によって刺戟されると、多形核白血球（Ｔｏｎｎｅｎｓｅｎ等、 １９８４．　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、、７４：１５８１−１５９２）、 内皮細胞（Ｘｉｍｍｅｒｍａｎ等、１９８５．　１．　Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｌ 、、７６　：２２３５−２２４６　；Ｂｅｖｉｌａｃｑｕｅ等、１．　Ｃｌ１ｎ 、Ｉｎｖｅｓｌ、、７６　：　２００３−２０１１　）、または双方（Ｇａｍｂ ｌｅ等、１９８５゜Ｐｒｏｃ、Ｎａ１１．　＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　υ、　Ｓ、 　Ａ、、　８２　：　８５６７−８６７１　）が接着性になり、その結果、内皮 細胞表面に多形核白血球が蓄積する。

また、免疫欠乏患者における特定の抗精蛋白抗体の研究の結果、有効な好中球の 化学走性及びその他の接着関連機能にはＣＤ１８錯体の１つまたは２つの以上の 成分が必要であることが明らかになった（２ｉｍｍｅｒｍａｎ及びＭｃ１１７ｒ ｅ、　１９８ｇ、Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、、８１　：　５３１−５３ ７　）　ｏ　ＣＤ１８錯体は上記β２インテグリン亜科と同じである。

成熟と分化の過程で、解剖学的に異なる部位においてリンパ球のポピュレーレヨ ン細区分が現われる。例えば、胸腺に未成熟Ｔ細胞が存在し、同様に、腸粘膜に ＩｇＡ−生成り細胞の存在が観察される（Ｐａｒｒｏ口、　１９７６、　Ｃｌ１ ｎ。

Ｇａ５ｔｒｏｃ＋＋ｊｅｒｏ１．、　５　：　２１１−２２８　）　ａ　これと は対照的に、ＩｇＧ−生成り細胞は主としてリンパ節に存在し、リンパ節から全 身的循環系へＩｇＧが必須される（Ｐａｒ「ｏｔ及びｄｅｓｏｕｓｘ、　１９６ ６、Ｎｘｊｕｒｅ　、　２１２　：　１３１６−１３１７　）　ｏ　Ｔ細胞は粘 膜内層よりも皮膚外フに豊富に存在するようである（Ｃａｈｉｌｌ等、　１９７ ７、　Ｊ、　Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、、　１４５　：　４２０−４２８　）。

（上記）白血球接着蛋白の生理的重要性はヒトの遺伝的疾病である白血球接着欠 乏（ＬＡＤ）の存在によって強調されている（Ａｎｄｅｒｓｏｎ等、１９８５． 　Ｊ、Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、。

＋５２　：６６ｇ　、＾ｒｎａｏｕｆ等、　１９８５．　Ｆｅｄ、Ｐｒｏｃ、　 、　４４　：　２６６４）。

種々の研究結果から、ＬＡＤに関連する分子欠乏が結果的には共通β鎖の合成ま たは合成速度の不足を招き、急速な劣化に至ることが判明した（Ｌｉｏｖｓｋａ −Ｇｒｏｓｐｉｅｒｒｅ等白血球膜にＬＦＡ−１，Ｍａｃ−１，ＰＩ３０／９５ が発現せず、中程度の疾病を持つ患者では低レベルの白血球膜発現が観察されて いる。その結果、炎症性反応の過程において血管系から組織への多形核白血球及 び単球の可動性が不足し、感染症の再発につながる（Ａｎｄｅｒｓｏｎ等、　Ｉ ｎｆｅｃｔ。

ＥＣＭＲｓが免疫系外の機能とも関連することが観察されている。ｎ　ｂ　／　 ｍ　ａ血小板表面糖蛋白錯体が失われると遺伝的疾病グランラマン血小板無力症 における血小板機能の低下を招くと考えられる（Ｈ７ｎｅｘ、１９８７．　Ｃｅ １ｌ。

４８　：　５４９−５５４　）　ａ　Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓ等は末梢神経系のニュ ーロンがフィブロネクチンの中央細胞結合領域及び■Ｃ８部位を有する基質に達 する神経突起を形成させることができることを発見した（１９８８．　Ｊ、　Ｃ ｅ１ｌ、　Ｂｉｏｌ、、　１０６　：　１２８９−１２９７）。また、発明者ら はラミニンまたはフィブロネクチンｊごおける神経突起形成をＥＣＭＲｓに対す る抗体によって抑止できることを最近発表した。

３、［発明の概要］ 本発明は細胞外基質レセプターとそのリガンドとの間の相互作用に干渉すること によって細胞どうしの接着を抑止する方法に係わる。

本発明はα４β１細胞外基質レセプターが特定のペプチド鎖に付着することによ って内皮細胞へのリンパ球の接着を促進するという所見に基づいている。本発明 がなされるまでは、α４βルセプターのリガンドは同定されておらず、リンパ球 付着におけるα４βルセプターの機能も知られていなかった。抗体または特定の ペプチド鎖を使用してα４βルセプターとそのリガンドとの相互作用を阻止する ことにより本発明はリンパ球が血管内皮を通過して組織内へ移動するのに初めて 介入を可能にするものであり、従って、本発明は免疫応答の抑止に臨床的有用性 を有する。本発明の種々の実施例において、内皮へのリンパ球接着を全身的に抑 止するか、あるいは特定の組織または部位に局限することができる。従って、本 発明は自己免疫やその他の慢性または再発生免疫系活性化、例えばアレルギー、 ぜん息及び慢性皮膚炎症などの疾病治療を可能にする。

３、■、略　語 本明細書に現われるペプチド鎖はアミノ酸残基に対する１文字記号により下記の ように表わされる：Ａ（アラニン）、Ｒ（アルギニン）、Ｎ（アスパラギン）、 Ｄ（アスパラギン酸）、Ｃ（システィン）、Ｑ（グルタミン）、Ｅ（グルタミン 酸）、Ｇ（グリシン）。

Ｈ（ヒスチジン）、■　（イソロイシン）、Ｌ（ロイシン）、Ｋ（リジン）９Ｍ （メチオニン）、Ｆ（フェニルアラニン）、Ｐ（プロリン）、Ｓ（セリン）、Ｔ （スレオニン）、Ｗ（トリプトファン）、Ｙ（チロシン）、■（バリン）。

４、［図面の説明］ 図１は、血漿フィブロネクチンへの１９２３球（Ｍ。

１ｔ４）、Ｋ５６２−１．ＲＤまたはＨＴ　１０８０細胞の接着、ＰＩＤ６モノ クローン抗体による抑止及びα５β１の細胞表面発現を示す。

５１Ｃｒ−標識細胞（１０５細胞／ｍ１）をＰＩＤ６モノクローン抗体（５０μ ｇ　／ｍｌ）と共に６０分間に亘って４℃に保温し、ＰＩＤ６　（塗りつぶしレ ノクー）またはマウスＩｇＧ（白抜きバー）の存在において３０分間（ＨＴ１０ ８０またはＲＤ）または４時間（Ｍｏｌｔ４またはに５６２）に亘り３７℃にお いてフィブロネクチン被覆（２０μｇ／ｍｌ）プラスチック表面に接着させた。

血漿フィブロネクチン（ｐＦＮ）への接着はプラスチック表面に結合する５＋（ ｒのｃｐｍで表わされる。α５β１の細胞表面発現はＰＩＤ６モノクローン抗体 によって細胞を懸濁液中で着色することによりフローサイトメトリーによって測 定した。

ｌｏｇ　ＰＩＤ６蛍光はパックグラウンド以上の平均チャンネル・ナンバー（０ −２５５’）として表わされる。

図２は、ＨＴ　１０８９０．　Ｍｏ　ｌ　ｔ　４または慢性的に活性化している ＣＤ８＋Ｔ　（ＬＡＫ）細胞の洗浄剤抽出物からのリンパ球フィブロネクチン・ レセプターの免疫沈降を示す。

プロテアーゼ抑止剤としてのフェニルメチル・スルフォニル・フルオライド（１ ｍＭ）、Ｎ−エチルマレイミド（１ｍＭ）、ロイペプチン（１ｔｔ　ｇ　／ｍｌ ）及びジイソプロピル・フルオロフォスフニー）（１ｍＭ）の存在において＋２ ５１−標識Ｍｏ　ｌ　ｔ　４．　ＬＡＫまたはＨＴ　１０８０細胞を１％トリト ンＸ　−１００で抽出した。これらの抽出物の部分サンプルをα３β１．α２β １及びα４β１に対するそれぞれのモノクローン抗体ＰＩＢ５．ＰＩＨ５及びＰ ３Ｅ３と共に免疫沈降させた。２−ＭＥ不在の条件下で免疫沈降抗原を７．５％ ５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルに塗布し、オートラジオグラフィーで可視測定した。Ｐ３ Ｅ３と共に１９２３球から免疫沈降した３本の帯が示された（矢印）。

図３は、リンパ球の特定フィブロネクチン・レセプターとインテグリンα４β１ との同定を示す。

１ｍＭのＣａＣ！２．１ｍＭジイソプロピル・フルオロフォスフェート、ＩＩＩ ＩＭのフェニルメチル・スルフォニル・フルオライド、１ｍＭのＮ−エチルマレ イミド、１μｇ／ｍｌのロイペプチン及び２μｇ／ａ＋１の大豆トリプシン抑制 剤の存在において、１２５Ｉ−表面標識Ｊｕｒｋａｊ細胞をＯＪ％ＣＨＡＰｓで 抽出した。抽出物の部分サンプルを骨髄腫（Ｓ　Ｐ　２）培養上澄みまたはモノ クローン抗体Ｐ３Ｅ３．Ｐ４Ｃ２，Ｐ２Ｏ３またはＰＩＤ６　（抗−α５β１） と共に免疫沈降させた。還元剤不在の条件下で免疫沈降物を８％ＳＤＳ　−ＰＡ ＧＥゲル上に塗布し、オートラジオグラフィーで可視測定した。左側に分子量マ ーカーを示す。Ｐ３Ｅ３Ｐ、４Ｃ２及びＰ２Ｏ３と共に得られた免疫沈降物中に 帯としてＣ５及びβ１サブユニットが示されている（矢印）。

図４Ａ、４Ｂ、４Ｃ及び４Ｄは、フィブロネクチン被覆表面における局部的接着 部位へのα４β１及びα５β１の集中度を示す。

ＲＤ細胞をトリプシン処理し、血清不在の条件下で１時間に亘り３７℃で、シラ ン処理されたフィブロネクチン被覆（２０μｇ／ｍｌ）ガラス・カバー・スリッ プに接着させた。この１時間が経過した時点で、（実験手順）の項で後述するよ うにレセプターを局部的接着部位に集中させた。パネルＡ及びＣはＰＤ細胞がフ ィブロネクチンに接着する過程で干渉反射顕微鏡で鏡検される局部的接着（矢印 ）を示す。パネルＢは抗体ＡＢ３３で着色されたＲＧＤ基本型フィブロネクチン ・レセプターα５β１の局部接着部位（矢印）への組織変化を示す。パネルＤは ＲＤ細胞がフィブロネクチンに接着する時にＰ２Ｏ３（ＦＩＴＣ）で着色された α４β１の局部的接着部位への組織変化（矢印）を示す。パネルＡ及びＢは同じ フィールドであり、パネルＣ及びＤは同じフィールドである。

図５Ａは、この研究に使用されるフラグメントの起点を示すヒト血漿フィブロネ クチン（ｐＦＮ）の領域構造を示す。

図５Ｂは、フラグメントの純度をめる５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析（１０％アクリ ルアミド）図を示す。

８０ｋＤａフラグメントはＮ−末端アミノ酸鎖ＳＤ　ＯＶ　Ｐ　Ｓ　Ｐ　ＲＯＬ 　Ｑ　Ｆを有し、従って、フィブロネクチン分子の位置８７４で始まる。（Ｋｏ ｔｎｂｌｉｈ目等。

１９８５、ＥＭＢＯＪ、、４　：　１７５５−１７５９　）。このフラグメント はフィブロネクチン（＊）の細胞結合領域（Ｃｅｌｌ）及びＲＧＤＳ鎖を含む。

５８ｋＤａ及び３８ｋＤａフラグメントはＮ−末端アミノ酸鎖ＴＡＧＰＤＱＴＥ ＭＴＩＥＧＬＱを有する。両フラグメントはＣ−末端ヘパリン結合領域（Ｈｅｐ ｎ）を含み、トリプシンによる２つのフィブロネクチン鎖の分割がそれぞれ異な る。３８ｋＤａフラグメントはフィブロネクチンのオルターナティブ・スプライ シングされた連結セグメント（ｍｃｓ）の最初の６７個のアミノ酸残基から成り （（＋ａｒｃｉａ　−Ｐａｒｄｏ、　１９８７．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｉ、　。

２４１　：　９２３−９２８　）　、従ってＡ鎖から誘導される。３８ｋＤａフ ラグメントはＢ　１６−　Ｆ’　１０黒色腫細胞によって認識されるＲＥＤＶ接 着部位を含まない（）ｌｕｍｐｈｒｉｅｓ等、１９８６．同上；　Ｈｕｍｐｈｒ ｉｅｓ等、１９Ｂ？、同上）。

５８ｋＤａフラグメントもフィブロネクチンのＢ鎖から誘導され、■Ｃ８領域を 含まない（Ｇｕｃｉａ−Ｐａｒｄｏ等、１９８９．ＥＭＢＯＪ）　、　５８ｋＤ ａフラグメントはフィブロネクチンのＣ−末端フィブリン結合領域（ＦｉｂＩ［ ）を含み、血漿フィブロネクチンのこの領域からの既に報告されているフラグメ ントと同様である（Ｃ１ｉｃｋ、　Ｅ、　Ｍ、及びＢａ１ｉａｎ、　Ｇ、、　１ ９８５．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　２４：６６８５−６６９６）。帯は銀汚染によ って可視化する。

図６Ａ、６Ｂ、及び６Ｃは、血漿フィブロネクチン・及びそＱ精製された３８ｋ Ｄａ及び８０ｋＤａトリプシン・フラグメントへの造血細胞の接着性を示す。

指示濃度の完全血漿フィブロネクチン（ｐＦＮ）または精製８０ｋＤａ及び３８ ｋＤａトリプシン・フラグメントで被覆したプラスチック表面に５１Ｃｒ−標識 に５６２　（赤白血痰）　、Ｊｕ＋ｋａｔ　（ＣＤ３＋　Ｔリンパ球）及びＹＴ （ＣＤ３−ＴＩＪンパ球）細胞（１０５／ウエル）を２時間に亘り３７℃で接着 させた。

この２時間が経過した時点で非接着細胞を洗い落とし、接着細胞をＳ　Ｄ　Ｓ　 ／　Ｎ　ａ　ＯＨに溶解して測定した。測定結果は結合している”Ｃｒのｃｐｍ で表わされる。

図７Ａ、７Ｂ及び７Ｃは、完全血漿フィブロネクチン（ｐＦＮ）または精製８０ ｋＤａ及び３８ｋＤａ）リプシン・フラグメントへのＴリンパ球接着に対する抗 インテグリン・レセプターα５β１及びα４β１モノクロ一ン抗体ＰＩＤ６．Ｐ ２Ｏ３の作用を示す。

精製ＰＩＤ６またはＰ４Ｃ２モノクローン抗体（５０μｇ　／ｍｌ）または精製 マウスＩ　ｇＧ　（（５０μｇ／ｍ１）と共に５１Ｃｒ−標識Ｍｏ１ｔ４細胞を １時間に亘り４℃に保温した。次いで指示濃度の完全血漿フィブロネクチンまた は８０ｋＤａ及び３８ｋＤａトリプシン・フラグメントで被覆したプラスチック 表面に１時間に亘って接着させた。この１時間が経過した時点で、非接着細胞を 洗い落とし、接着細胞を可溶化し、結合している”Ｃｒのｃｐｍをガンマカウン ターで測定した。測定結果は結合ｃｐｍで表わされた。

図８は、ＩＬ−１β活性化ＨＵＶＥ細胞への１９２３球に対するＣ３−ＩＢ１２ ペプチドの作用を示す。

図９Ａ及び９Ｂはそれぞれ ｍＣ８及びＣ５−１領域のダイヤグラム。及びＣ３−１，Ａ１３及びＢ１２のア ミノ酸鎖を示す。

５、［発明の詳細な説明］ リンパ球中でのα５β１の作用を検討する実験において、静止状態の末梢血液性 及び培養１９２８球（Ｍｏ　ｌ　ｔ　４またはＪｕｒｋａｊ）が基本型フィブロ ネクチン・レセプターα５β１に関係なくフィブロネクチンに対する親和性を示 すことが判明した。これらの細胞はフィブロネクチン被覆表面に付着することが モノクローン抗体ＰＩＤ６によって認識されるα５β１のレベルは低いか、また は検１８８１１８９１　）。また、フィブロネクチンへのＴリンパ球接着４ペプ チドを含有するＰＩＤ６またはＲＧＤによって部分的にしか抑止できなかった。

このことは接着プロセスに他のフィブロネクチン・レセプターが関与することを 示唆するものである。ただし、フィブロネクチンへの他の細胞、例えば悪性また は変性線維芽細胞や活性１９２３球（ＬＡＫ細胞）の接着はＰＩＤ６によって完 全に抑止された。このことは静止末梢血液性１９２８球及び培養１９２８球が多 様な独立的かつ機能的フィブロネクチン・レセプターを発現することを示唆する ものである。

本発明では、フィブロネクチンに対する１９２３球だけの接着を特定的に抑止す るモノクローン抗体を製造することによって代わりとなるフィブロネクチン・レ セプターを同定した。このレセプターはインテグリン・レセプターのα４β１と 同じであり、血漿フィブロネクチンへの末梢血液性リンパ球、培養Ｔ細胞系及び ＲＤ細胞の接着を仲介した。また、１９２３球はＣ３−１，Ｃ３−２及びＣ３− ３部位にまたがるタイプ■連結セグメント（ｍＣ８）（７）ヘパリン■領域及び ６９アミノ酸残基（Ｈｕを含有する血漿フィブロネクチンの３８ｋＤａ　）リプ シン・フラグメントに対する明確な優先選択を示した（Ｇａｒｃｉａ−Ｐａｒｄ ｏ等、　１９ｇ？、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、、２４１　＋　９２３−９２８　） 　。本発明では、１９２３球がＣ８−１にだけ付着し、α４β１に対するモノク ローン抗体（Ｐ３Ｅ３．Ｐ４Ｏ２，Ｐ２Ｏ３）が３８ｋＤａフラグメント及びＣ ８−１へのＴリンパ球接着４ベ全に抑止することが判明した。１９２３球が（極 めて低い親和力で）ヘパリンＨ領域中の部位に付着し、α４β１に対するモノク ローン抗体がこの相互作用を抑止することも明らかになった。α４β１に対する モノクローン抗体はＲＧＤ鎖を含有する血漿フィブロネクチンの８０ｋＤａトリ プシン・フラグメントへのＴリンパ球接着４ベ止せず、α５β１（基本型フィブ ロネクチン・レセプター）に対する抗体がこの相互作用を完全に抑止した。

本発明はα４βルセプターがリンパ球と内皮細胞との相互作用を仲介するという 発見にも係わる。本発明では、抗体またはペプチドを使用することによって内皮 細胞へのリンパ球接着を阻止することができる。

説明の便宜上、本発明を下記バラグラフに分けて記述ｉ）　細胞外基質レセプタ ー（ＥＣＭＲｓ）に対する抗体の製造； ｉｉ　）ＥＣＭＲ／リガンド相互作用の特徴づけ；１ｉｉ）細胞接着への介入方 法； １マ）本発明の実用性；及び Ｖ）　本発明のペプチド及び抗体。

体製遣方法を利用して行えばよい。完全な細胞または精製細胞外基質レセプター （ＥＣＭＲ）を免疫源として使用することができる。宿主の免疫処置は異種移植 片から得られた免疫源を使用して行うのが好ましい。抗体はポリクローンでもモ ノクローンでもよい。

所与のＥＣＭＲのエピトープに対するポリクローン抗体の製造には種々の公知方 法を利用すればよい。抗体の製造に際しては、ＥＣＭＲ蛋白、合成蛋白またはそ のフラグメントを注射することで種々の宿主動物を免疫処置することができ、完 全な細胞を使用してもよい。種々の補助剤を利用することにより、宿主の種類に 応じて免疫応答を増大させることができ、補助剤としては例えば（完全または不 完全な）水酸化アルミニウムのようなフロイントのミネラル・ゲル、リソレシチ ン、プルロニック・ポリオール、ポリオニオン、ペプチド、オイル・イマルジョ ン、キーホールφリムペット・ホモシアニンズ、ジニトロフェノールのような界 面活性物質、及びＢＣＧ（カルメット・ゲラン杆菌）やコリネバクテリウム・パ ルブムのようなヒト補助剤がある。

ＥＣＭＨのエピトープに対するモノクローン抗体は連続細胞系培養によって抗体 分子を生成させる方法で製造できる。このような技術としてはＫｏｈ　ｌ　ｅ　 ｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５，Ｎａｔｕｒｅ　、　２５６　：　４９５− ４９７　）やＴａｇｇｘＮ及びＳａｍｌｏｆｆ　（１９８３，５ｃｉｅｎｃｅ、 　２１９　：　１２２８−１２３０　）が発表したハイブリドーマ技術、さらに 新しいヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｘｂｏｒ等、　１９８３．　Ｉｍ＋ ＋＋ｕｎｏｌｏｇ７　Ｔｏｄａ７．　４　：　７２）及びＥＢＶ−ハイブリドー マ技術（Ｃｏｌｅ等、　１９８５．　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ＾ｎｔｉｂｏｄｉｅ ｓ　ａｎｄ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｈｅｒａｐ７．　＾ｆａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ。

Ｉｎｃ、　、　ｐｐ、　７７−９６　）などがある。

治療用モノクローン抗体としてはヒト・モノクローン抗体またはキメライン・ヒ ト・マウス（またはその他）モノクローン抗体がある。ヒト・モノクローン抗体 は公知の技術（例えば、Ｔｅｎｇ等、１９８３．Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　＾ｃ ａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、ｓ、＾、、　８０　：　７３０８−７３１２　；　Ｋｏｚｂ ｏ＋等、　１９８３．１ｍｍｕｎｏｌｏｇ７Ｔｏｄａ７．迭：　７２−４９　； 　０ｌｓｓｏｎ等、１９８２．　Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、。

Ｕ・３−１６）のいずれかによって製造すればよい。キメライン抗体分子はマウ ス抗原結合領域を含有するように作成すればよい（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ等、１９１ ｔ４．Ｐｒｏｃ、　Ｎａｊｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ。

Ｕ、　Ｓ、＾、、８１　：　６８５１　；竹田等、１９８５．　Ｎａｔｕｒｅ、 ３旦４２５）。

ＥＣＭＲエピトープに対する抗体の分子クローンは公知の技術で製造できる。組 換えＤＮＡ法（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ等、ｌ９８２．Ｍｏ１ｅｃｕｌａ＋　 Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ７　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐ ｒｉｎｇ　）Ｉａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｊｏｒ７．　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｔｉｎｇ 　Ｈａ＋ｂ。

ｒ、Ｎｅｗ　Ｙｏｌｋ　）を利用することにより、モノクローン抗体分子または その抗原結合部位を符号化する核酸鎖を構成することができる。

抗体分子は公知技術、例えば、免疫吸収または免疫アフィニティー・クロマトグ ラフィー、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）のようなりロフトグラフ法 、またはこれらの組合わせなどで精製すればよい。

分子のイディオタイプを含有する抗体フラグメントは公知技術で形成することが できる。例えば、このようなフラグメントとして、抗体分子のペプシン消化によ って得られるＦ　（ａｂ’　）　２フラグメント、Ｆ　（ａｂ’　）　２フラグ メントの二硫化物ブリッジを還元することによって得られるＦａｂ’　フラグメ ント、抗体分子をパパイン及び還元剤によって処理して得られる２Ｆａｂまたは Ｆａｂフラグメントがある。

同様に、上記方法によって得られたＥＣＭＲｓと反応する抗体は公知技術によっ て同定し、選択することができる。例えば、抗体がポリアクリルアミドの場合の ように他の蛋白から精製または分離された既知ＥＣＭＲと結合及び／またはこれ を免疫沈降させることを確認することによって同定してもよいし、既知ＥＣＭＲ 抗体と競合してＥＣＭＲｓと結合する能力によって同定してもよい。

ＥＣＭＲｓと結合する抗体はＥＣＭＲ／ＩＪガント相互作用を阻止する能力によ っても同定できる。例えば、フィブロネクチンと結合するＥＣＭＲ（それ自体は 同定されていなくても特徴が判明していなくてもよく、機能が解明されているだ けでよい）を含む細胞はフィブロネクチンに被覆された基質に接着することを実 証すればよい。

もし抗血清またはハイブリドーマ上澄みが基質への細胞接着を抑止することが実 証されるなら、抗血清または上澄みに含まれる抗体がＥＣＭＲレセプターを認識 するこ本発明では、α４βルセプターを認識する抗体を、上記方法で製造すれば よく、本発明の好ましい実施例では、α４β１をターゲットとするモノクローン 抗体を次のように製造する。即ち、ＲＢＦ／ＤＮマウスから得られたマウスを約 １００μｍのバック１９２８球で免疫処置したのち、その牌臓を摘出し、黒色腫 細胞、例えばＮ５−１／ＦＯＸ−ＮＹ黒色腫細胞と混合する（天井及び）ｌｅｕ ｅｎｂｅｒｇ、　１９８０．’５ｅｌｅｃＨｄ　Ｍｅｒｈｏｄｓ　Ｉｎ　Ｃｅ１ ｌｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎ。

ｌｏｇｙ’、Ｍｉｓｂｅｌｌ　ａｎｄ　Ｓｈｉｉｇｉ、ｅｄｓ、Ｆｒｅｅｍａｎ 　ａｎｄ　Ｃｏ、、５ａｎＦ＋ａｎｃｉｓｃｏ、　ｐｐ、　３５１−３７３　； 　Ｔａｇｇａｒｔ及びＳａｍｌｏｆｆ、　１９８３゜５ｃｉｅｎｃｅ、２１９　 ：　１２２８−１２３０　）　ｏ次いでアデニン／アミノプテリン／チミジンを 添加されたＲＰＭ１１６４０メディア中で生存可能なヘテロ核を選択する。リン パ球ＥＣＭＲ３をターゲットとする抗体を生成するハイブリドーマはフィブロネ クチン被覆表面への接着によってスクリーニングし、限界希釈によってクローン 化すればよい。具体的には、例えばＣ３−１ペプチドまたはその誘導体で被覆さ れた基質または内皮細胞へのリンパ球接着を抑止する能力によってα４β１に対 する抗体を同定することができる。ただし、α４β１を認識する抗体はα５βル セプターを有する細胞とＲＧＤペプチド被覆基質との結合は抑止しない。α４β １をターゲットとする抗体を同定する別の方法として、ｉ）（例えばＰ４Ｃ２ま たはＰ４Ｃ１０のような）既知の抗体α４β１の抗体の結合を競合的に抑止する 能力、または１ｉ）（例えば蛋白ゲル、つニスタン・プロット、または連続的免 疫沈降実験において）既知の抗体α４β１抗体と同じ蛋白と結合する能力によっ て同定することもできる。

５．２　ＥＣＭＲ／リガンド相互作用の特徴づけ細胞外基質レセプターとリガン ドとの相互作用は例えば下記の方法で特徴づけることができる。

ｉ）レセプターの分布及び機能の測定；１１）レセプター／リガンド結合への干 渉；１ｉｉ）レセプター及び／またはリガンドの分離及び化学的特徴づけ。

これらの方法を以下のパラグラフでさらに詳しく説明する。

５、２．１　レセプターの分布及び機能の測定本発明の方法では、公知の方法を 利用してレセプター分布を測定する。例えば、関連のＥＣＭＲをターゲットとす るモノクローン抗体を使用してこのＥＣＭＲを有する細胞ポピユレーションを明 らかにする。ＥＣＭＲと抗体の結合は免疫蛍光検査や免疫ペロキシダーゼ着色の ような免疫組織化学技術を利用して検出することができる。

あるいは、関連ＥＣＭＲを有する細胞ポピユレーションを蛍光活性化細胞選別法 を利用して採集することも可能である。

細胞が適当なリガンドを中心に成長する時、細胞表面の接着レセプターの組織が 特異な変化を起こして集中的接着を形成すると考えられるから（Ｂｕｒｒｉｄｇ ｅ等、１９１１８゜＾ｎｏ、　Ｒｅｙ、　Ｃｅ１ｌ、　Ｂｉｏｌ、、　４　：　 ４１１７−５２５　）　、所与のレセプターと潜在的リガンドとの相互作用を特 徴づける１つの方法として、関連のＥＣＭＲが細胞とリガンド基質との間に形成 された集中接着中に分布しているかどうかの判定を行う。例えば、下記の方法に より、レセプター／リガンド関係においてα４β１がフィブロネクチンと相互作 用することをは明らかにすればよい。リンパ球をフィブロネクチン基質に接着さ せ、干渉反射顕微鏡による鏡検によって細胞と基質との間の集中的接着を可視化 すればよい（Ｉｘｒａｒｄ等、　１９７６、Ｊ、　Ｃｅ１１．　Ｓｃｉ、、２１ 　：　１２９−１５９）。Ｐ４Ｇ９またはＰ４ＣＩＯのようなα４β１認識抗体 を使用すれば、例えばフルオロイソチオシアネートなどによる標準的な免疫組織 化学的方法によって、血清不在の状態でα４β１が集中接着中に再分布するのを 確認することができる。

ＥＣＭＲとリガンドの相互作用はＥＣＭＲが多様な基質に接着する能力をテスト することによってもその特徴を知ることができる。例えば、関連タイプの細胞ま たは関連のＥＣＭＲがフィブロネクチン、コラーゲン、ラミニンなどのような細 胞外膜の精製成分から成る基質と結合できる能力をテストすればよい。本発明の 一実施例では、α４β１を有する細胞がフィブロネクチンには接着するが、α４ β］−／′フィブロネクチン相互作用の結果としてコラーゲンやラミニンとは接 着しないことを解明する。

関連のＥＣＭＲが特定の蛋白リガンドと結合する本発明の他の実施例では、蛋白 リガンドのサブフラグメントを含む基質が細胞表面のＥＣＭＲと結合できる能力 をテストすることにより、ＥＣＭＲとリガンドとの結合部位で位置検出する。レ セプターがフィブロネクチンと結合するα４β１である本発明の一実施例では、 フィブロネクチンのサブフラグメントを含む基質が後述のようにα４β１を有す る細胞と結合できる能力をテストする。１９２３球はα４βルセプターを有する フィブロネクチンの８０ｋＤａ細胞結合領域に付着しているが（図５Ａ）、１９ ２３球は血漿フィブロネクチンのＡ（または重）鎖から誘導された３８ｋＤａト リプシン・フラグメントに位置する非ＲＤ含有部位を優先選択した。１９２３球 はまた５８ｋＤａフラグメントを含む他のＨｅｐＩＩを認識し、これと結合した 。ただし、高親和力リンパ球結合部位は３８ｋＤａフラグメントに位置すること が判明した。モル・ベースで３８ｋＤａフラグメントは仲介Ｔリンパ４接着にお いて５８ｋＤａフラグメントよりも３倍以上有力であった。図５Ａに示すように 、３８ｋＤａフラグメント及び５８ｋＤａフラグメントは血漿フィブロネクチン のＡ及びＢ鎖からそれぞれ誘導された。従って、両フラグメントは■Ｃ８の存否 に関係なく互いに異なる（Ｋｏ＋ｎｂｌｉｂＮ等、＋９８５．同上：　Ｇａｒｃ ｉａ−Ｐａｒｄｏ、　１９８７．同上）。

従って、ここに使用される３３ｋＤａフラグメント及び５８ｋＤａフラグメント はＨｅｐｎ領域に位置する共通の低親和力Ｔリンパ球結合部位を分は合うことが でき、■Ｃ８領域に３８ｋＤａフラグメントに固有の高親和力リンパ球結合部位 が別に存在することになる。即ち、１９２３球はＢＩ３黒色腫細胞及びトリ神経 堤細胞に対する高親和力接着部位として確認されているＣ８−１を特定的に認識 し、これと結合すると考えられる（Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓ等、　１９８７．同上； 　Ｈｏｍｐｈｒｉｅｓ等、１９８８．Ｊ、　Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、。

１０６　：　１２８９−１２９７　；　Ｄｕｌｏｕｒ等、１９１１８．　ＥＭＢ ＯＪ、、７　：　２６６＋−２６７１）。Ｃ３−１は血漿フィブロネクチンＡ鎖 のタイプ■Ｃ８領域に存在する（オルターナティブ・スプライシングによって形 成された）分子異質性部位である。

５、２．２．　レセプター／リガンド結合への干渉レセプター／リガンド結合を 妨害する因子を同定し、評価することによってＥＣＭＲ／リガンド関係をさらに 特徴づけることができる。

例えば、関連のＥＣＭＲをターゲットとする抗体を使用することによりリガンド ／レセプター結合を抑止することができる。特定の細胞タイプが所与のリガンド または細胞基質に接着するという観察事実から、相互作用に関与するＥＣＭＲを 同定すればよく、そのためには、それぞれが別々のＥＣＭＲをターゲットとする 一連のモノクローン抗体を、基質への細胞接着を阻止する能力についてテストす ればよい。特定の抗体によって結合が抑止されたとすれば、この抗体によって認 識されたＥ　ＣＭＲが接着相互作用に関与することを示唆するものである。

本発明の一実施例では、培養内皮細胞へのリンパ球接着を抗α４β１抗体によっ て抑止することができるが、その他のＥＣＭＲｓをターゲットとする抗体では抑 止できず、このことは内皮細胞へのリンパ球接着にα４β１が必要であることを 示唆するものである。また、モノクローン抗体を使用することにより、ＥＣＭＲ とリガンド基質との関係を解明することができる。

後述するように、３８及び５８ｋＤａフラグメントへのＴリンパ球接着４機能が 解明されている抗４αβ１モノクローン抗体によって完全に抑止できた。さらに 、（ＩｇＧ接合）ｃｓ−ｉ被覆表面へのＴリンパ球接着４機４Ｃ２，Ｐ３Ｅ３ま たはＰ４Ｇ９によって完全に抑止することができた。これらのデータから、α４ β１がＣ８−１に対するＴリンパ球レセプターであることは明らかである。しか し、これらの抗体は基本型接着鎖ｘｒｇ−ｇ１７−ｘｓｐ　（ＲＧ　Ｄ）を含有 する８ｏｋＤａフラグメントへのＴ細胞接着を抑止できなかった。８０ｋＤａフ ラグメントへのＴ細胞接着は抗α５β１モノクロ一ン抗体（ＰＩＤ６）またはＲ ＧＤＳによって完全に抑止することができた。ＰＩＤ６及びＲＧＤＳは３８及び ５８ｋＤａ７ラグメントまたはｃｓ−ｉへのＴリンパ球接着４機止できなかった 。これらのデータを総合すれば、α４β１がｍｃｓ　（Ｃ３−１）及びおそらく はＨｅｐＩ［におけるオルターナティブ接着鎖に対する血漿フィブロネクチンレ セプターのカルボキシ末端接着領域に対してレセプターとして作用することは明 らかである。

本発明の他の実施例では、リガンドの構造を解明することによってＥＣＭＲ／リ ガンド関係を特徴づけることができる。具体的には、ＥＣＭＲ／リガンド相互作 用において作用剤がリガンドと競合する能力を評価すればよい。例えば、リガン ドが蛋白である場合には種々の蛋白フラグメントを、レセプター／リガンド結合 を競合的に抑止できる能力についてテストすればよい。リンパ球が内皮細胞及び フィブロネクチンと結合することが観察される本発明の一実施例では、フィブロ ネクチンのペプチドフラグメントを、内皮細胞基質へのリンパ球結合を競合的に 抑止する能力についてテストすればよい。後述するように、Ｃ３−１及び特にペ プチドＥ　Ｉ　ＬＤＶＰＳＴはフィブロネクチン及び内皮細胞へのリンパ球結合 を競合的に抑止することができ、これによってＥ　ｒ　ＬＤＶＰＳＴと全く同じ か相同の部位に対するリガンドの結合部位を位置検出することができた。

本発明では、ＥＣＭＲ／リガンド相互作用に干渉することによって細胞どうしの 接着を抑止することができる。

本発明の一実施例においては、内皮細胞へのリンパ球結合を、α４β１とそのリ ガンドとの結合に干渉することで抑止することができる。この干渉はＥＣＭＲを ターゲットとする、またはそのリガンドをターゲットとする抗体を使用すること によって達成される（リガンドに対する抗体はＥＣＭＲに対する抗体と同様に作 成される）。

本発明の他の実施例では、α４β１とそのリガンドとの結合を抑止するペプチド を使用することにより、内皮細胞へのリンパ球接着を抑止することができる。

本発明の一実施例では、抗α４β１抗体またはそのフラグメントまたは誘導体を 使用することにより、α４βルセプターを有するリンパ球が血管内皮細胞に結合 するのを抑止することができる。好ましい実施例においては、抗体はモノクロー ン抗体、特に抗体Ｐ４Ｃ２（α４β１）またはＰ４Ｏ１０（β１）、またはその フラグメントまたは誘導体、例えば同じ結合特異性を有するキメラ抗体である。

本発明の他の実施例では、ペプチドを使用することにより、α４βルセプターを 有するリンパ球が血管内皮細胞と結合するのを抑止することができる。好ましい 実施例ではペプチドがフィブロネクチンの■Ｃ８可変領域の鎖の少なくとも一部 から成る。さらに好ましい実施例ではペプチドがその内容を参考のため本願明細 書に引用したＨｕｍｐｈｒｉｅｓ等のリポート（１９８７，Ｊ、　Ｒｉｏｔ、　 Ｃｈｅｌｌｌ、　、　２６２６８８６−６８９２　）に記載されているようなｃ ｓ−ｉペプチドの少なくとも一部またはほぼ相同のペプチドから成る。

最も好ましい実施例ではペプチドが鎖ＥＩＬＤＶＰＳＴの少なくとも一部、また はこれとほぼ相同の鎖から成る。

５．４．　発明の実用性 本発明ではＥＣＭＲとそのリガンドとの間の結合に干渉することにより細胞どう しの接着を抑止することができる。本発明の実施例ではリンパ球側のα４β１と 内皮細胞表面のリガンドとの結合に干渉することで内皮細胞へのリンパ球接着を 抑止する。本発明は別のＥＣＭＲを内皮細胞リガンドと相互作用させてＥＣＭＲ ／内皮細胞相互作用を妨げることにより内皮細胞へのこれら細胞の接着を抑止す る。例えば、内皮細胞へのマクロファージ接着もマクロファージＥＣＭＲ／内皮 細胞相互作用に干渉することで抑止することができる。同様に、Ｃ３−１ペプチ ドを認識する黒色腫細胞が転移して組織に進入するのを本発明のペプチドまたは 抗体を使用することで抑止できる。

従って、本発明の方法はリンパ球が血管内皮を通って組織に進入するのを防止す るのに有用である。即ち、本発明はヒト患者における免疫応答を抑制する方法を 提供する。実施例として、本発明は免疫系の慢性または再発性の活性化に伴なう 疾病、例えば、膠原血管疾患及びその他の自己免疫疾患（全身の紅斑性狼癒やリ ウマチ性関節炎など）のほか、多発性硬化症、ぜん息、アレルギーなどの治療法 を提供する。本発明はまた、例えば対宿主性移植片病、同種移植片拒絶反応、輸 血反応などのような比較的急性の免疫系活性化に対する治療法を提供する。

患者の異常の性質によっては、全身的または局部的に組織へのリンパ球移動を抑 止することが望ましい場合がある。例えば、全身の紅斑性狼癒のように複数の器 官系にまたがる疾病においては、病勢悪化の過程でリンパ球接着を全身的に抑止 することが望ましい。ただし、局部的な接触皮膚炎では関連組織へのリンパ球移 動だけを抑止することが好ましい。

本発明の方法を全身的に利用するか局部的に利用するかの制御は投与する抗体ま たはペプチドの組成に変化を加えるか、または作用薬の構造またはその薬学的組 成に変化を加えることによって達成することができる。例えば、本発明の抗体ま たはペプチドは皮下、筋肉内、脈管内、静脈内、動脈内、鼻腔内、経口、腸腔内 、直腸内。

気管内、鞘内など多様なルートで投与することができる。

ただし、内皮細胞へのリンパ球接着を局所的に抑止するには本発明の抗体または ペプチドを適当な基剤に適量混入したものを皮下または筋肉内投与するのが好ま しい。

リンパ球接着を全身的に抑止するには抗体またはペプチドを静脈内投与するのが 好ましい。

本発明の種々の実施例において、本発明の抗体、ペプチドなどの投与を容易にす る基剤を用いれば好都合である。例えば、慢性皮膚炎治療のため抗体、ペプチド などを皮膚に到達させたければ、角質、外皮及び真皮に対する浸透を助ける基剤 が好適である。

本発明のペプチドまたは抗体の拡散はペプチドまたは抗体の半減期または有効半 減期を変えることによって制御できる。例えば、本発明のペプチドはその半減期 が比較的短く、もしこれを持続放出性の埋没片の形で投与すると、埋没片に近い 組織部分（例えばリウマチ性関節炎患者の関節）にペプチドが作用するが、もっ と遠い組織に到達する前にペプチドは分解してしまう。これとは逆に、アミノ酸 置換、グリコジル置換、鏡像性変更体（即ち組成アミノ酸の鏡像異性体）の置換 、添加などのような化学的変性手段によって誘導体を生成させて半減期を長くす れば、ペプチドを持続的なレベルで広範囲に分布させることができる。さらに他 の例として、ペプチドのＮ末端またはＣ末端を変えることによって安定性を高め ることができる。

さらに別の実施例では、本発明の抗体またはペプチドを、これを特定の組織に向 ける他の抗体またはリガンドに接合する。例えば、本発明のペプチドを内皮細胞 をターゲットとする抗体に接合する。さらにまた、ＥＣＭＲを模倣して内皮細胞 リガンドに付着することにより、リンパ球接着を阻止する抗体を製造することも できる。

５．５．　本発明のペプチド及び抗体 本発明のペプチドは関連のＥＣＭＲと相互作用可能なすべてのペプチドを含む。

本発明の一実施例においては、α４βルセプターと相互作用可能なペプチドを使 用することにより、内皮細胞へのリンパ球結合を抑止する。

生体に使用する前に、試験管内で内皮細胞へのリンパ球接着を抑止する能力につ いてペプチドをテストするのが好ましい。本発明の好ましい実施例では、ペプチ ドがフィブロネクチン■Ｃ８領域の少なくとも一部から成る。

さらに好ましい実施例では、ペプチドがＣ３−１ペプチド鎖の少なくとも一部、 または図９（ａ）及び（ｂ）に示すようにＣ８−１鎖とほぼ相同の鎖から成る。

最も好ましい実施例では、ペプチドが鎖Ｅ　Ｉ　ＬＤＶＰＳＴの少なくとも一部 、またはこれとほぼ相同のペプチド鎖から成る。“はぼ相同”とは本発明のペプ チドがペプチド鎖中の１個または２個以上のアミノ酸を機能的にこれと等価のア ミノ酸で置換し、従って事実上変化のない変形銀でもよいということである。例 えば、ペプチド鎖内の１個または２個以上のアミノ酸残基を機能的に等価の作用 を有する極性が同じく他のアミノ酸で置換することができる。ペプチド鎖内のア ミノ酸に対する置換骨はこのアミノ酸と同種の他のアミノ酸から選択すればよい 。例えば、無極性（疎水）アミノ酸としてはアラニン、ロイシン、イソロイシン 、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニンなどがあ る。極中性アミノ酸としてはグリシン、セリン、スレオニン、システィン、チロ シン、アスパラギン、グルタミンなどがある。

正電荷（塩基性）アミノ酸としてはアルジニン、リジン。

ヒスチジンなどがある。負電荷（酸性）アミノ酸としてはアスパラギン酸、グル タミン酸などがある。さらに、既に述べたように、本発明は上記ペプチドの誘導 体にも係わる。

本発明の抗体にはモノクローン及びポリクローン抗体のほか、そのフラグメント や誘導体も含まれ、Ｆ（ａｂ’　）　２．　Ｆａｂ’及びＦａｂフラグメントも 含まれる。

６、［実施例コ 下記実験は有核造血細胞によって優先的に発現されるインテグリン・レセプター α４β１　（）ｌｅｍｌｅｒ等、　１９８７゜同上）と全く同じと考えられる新 しいフィブロネクチンを示唆した。α４β１を特異フィブロネクチン・レセプタ ーとして同定した根拠は（ｉ）モノクローン抗体（Ｐ２Ｏ３，Ｐ３Ｅ３及びＰ４ Ｏ９）によるフィブロネクチンへの細胞接着の抑止と、（１１）α４β１の再組 織及びフィブロネクチンによる局部接着への集中であった。これらの所見に照ら して、基本型フィブロネクチン・レセプターα４β１及びα５β１がフィブロネ クチンへの細胞接着を仲介する最も重要な要因として作用すると考えらフェニル メチル・スルフォニル・フルオライド、ｎ−エチルマレイミド、ロイペプチン、 ジイソプロピル・フルオロフォスフェート、２−メルカプトエタノール、ウシ血 清アルブミン（ＢＳＡ）、）リドンＸ−１００，プロティンＡ−アガロース、大 豆トリプシン。抑制剤、及び■８プロテアーゼ（Ｓｔａｐｈ７１ｏｃｏｃｃｕｓ 　ａｕｒｅｏｓ、株Ｖ８．プロテアーゼ・タイプＸＶ１．Ｉ）をＳｉｇｍａ　Ｃ ｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、　（ミズーリ州セントルイス）から購入した。ラクトペ ロキシダーゼ及びグルコース・オキシダーゼはＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ　（カリフ ォルニア州すンディエゴ）から、ＴＰＣＫ−）リプシンはＣｏｏｐｅｒ　Ｂｉｏ ｍｅｄｉｃａｌ　（ペンシルバニア州モーバーン）からそれぞれ入手した。フル オレスセイン接合（ヤギ）抗−マウスＩｇＧ及びＩ　ｇＭ　（Ｈ及びＬ鎖）また はローダミン接合（ヤギ）抗−ラビットＩｇＧ及びＩｇＭ（Ｈ及びＬ鎖）をＴａ ｇｏ、Ｉｎｃ、（カリフォルニア州バーリンゲーム）から入手した。Ｒ−紅藻素 接合ストレパビジンをＢｉｏｍｅｄａ　（カリフォルニア州フォスターシティ− ）から、ラビット抗＝マウスＩ　ｇＧ　（Ｈ＋Ｌ）抗血清をＣａｐｐｅｌ（Ｃｏ ｏｐｅｒ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ、ペンシンバニア州モーバーン）カらそれぞれ入 手した。クロム酸”Ｃｒ−ナトリウムはＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａ ｒから、　１２５ＩはＡｍｅ＋ｓｈｘｍ　（イリノイ州アーリントンハイツ）か らそれぞれ入手した。ヒト組換え型インターロイキン−２（ＨＬ−２）はＤｒ、 　Ｄ、Ｕ＋ｄａｌ（１ｍｍｕｎｅｚ　ＣｏＩｐ、、ワシントン州シアトル）から 供与された。ラミニンはＣｏ１１ａｂｏｒｊｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　Ｉｎ ｃ、　（７サチユーセツツ州ベツドフオード）から購入し、精製血漿フィブロネ クチン及びコラーゲン・タイプＩ及び■は上述したように製造した（Ｗａ７ｎｅ ＋、　Ｅ、　Ａ、及びＣａｒｔｅｒ、　Ｗ、　Ｇ、　、　１９８７同上及びＷａ ７ｎｅｒ等、　＋９８８．同上）。

６、１．２．　細胞及び細胞培養 ＲＤ（ヒト横絞筋肉腫）細胞及びＨＴ１０８０（ヒト線維肉腫）細胞を＾ｍｅ＋ １ｃａｎ　Ｔ７ｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　（メリーランド 州ロックビル）から入手した。健常な提供者からの末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ ）　、血小板及び顆粒球ポピユレーションを公知の方法（Ｋｕ＋＋１ｃｋｉ等、 　１９８ｇ、同上；　Ｗｘ７ｎｅｔ等、　１９１８、同上）で処理した。急性リ ンパ球の、大顆粒リンパ球（Ｌ　Ｇ　Ｌ）または骨髄性白血球患者の末梢血液細 胞をＤｒ、　ｌ、　Ｂｅｒｎｓｊｅｉｎ及びＤｒ、　Ｔ、　Ｌｏｕｇｈｒａｎ（ Ｆｒｅｄ　Ｈｕｊｃｂｉｎｓｏｎ　Ｃｘｎｃｅｔ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔ ｅｒ）から入手した。ヒトのリンフ才力イン（５００Ｕ／ｍｌ　Ｉ　Ｌ　−２） 活性キラー（ＬＡＫ）細胞及びモノクローンＨＬＡ　Ｂ７特異ヒト細胞素性Ｔリ ンパ球（ＣＴＬ）細胞系ＣｌＣ４を標準プロトコル（Ｇ＋ｉｍｍ等、　１９ｇ２ ．Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、、１５５　：　１９２３−１９４１　；　Ｇｌａｓｅｂ ｒｏｏｋ、＾、Ｌ、及びＦｉｔｃｈ、　Ｆ、Ｗ、、　１９８０．　Ｊ、　Ｅ！ｐ 、Ｍａｄ、、　１５１　：　８７６−８９５　；　Ｂｒｏｏｋｓ、　１９８３． 　Ｎａｔｕｒｅ、　３０５　：　１５５−１５８　；　Ｗａｙ＋＋ｅｒ、　Ｅ、 　Ａ、及びＢｒｏａｋｓ、　Ｃ，Ｇ、、　１９８４．　Ｊ、　１ｍｍａｎ。

ＣｌＣ４ＣＴＬ系の製造に使用される提供者の肺臓がらＥＢＶ転換Ｂ　ＩＪ　ン パ球細胞系（ＢＬＣＬ）ＳＴ−１を得た。その他の細胞系及び細胞培養条件はす べて公知の通りであった（Ｗａｙｎｅｒ、　Ｅ、＾　及びＣａｒｔｅｒ、　Ｗ、 　Ｇ、　、　１９８７．同上；　ＶＩＨｎｅｔ、等、　１９８８．　同上）。

６１．３　抗　体 フィブロネクチン・レセプターα５β１の細胞質領域に対して製造されたラビッ トのポリクローン抗体ＡＢ３３を使用して局部接着におけるα５β１を検出した 。ＶＬＡレセプター　（Ｈｅｍｌｅ＋等、　１９８７．　同上）の共通インテグ リン（Ｈｙｎｅ５　Ｒ，Ｏ，、１９８７、同上）βｌサブユニットに対するモノ クローン抗体ＡｌＡ３及びＶＬＡ４αサブユニット（Ｈｅｉｌｅ＋等、＋９８７ ．　同上）に対するモノクローン抗体Ｂ５−ＧＩＯをＤａｎａ　−Ｆａ＋ｂｅ＋ 　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ　（７サチユーセツツ州ボストン）のＤ＋、Ｍａ＋Ｉ ｏｎ　Ｈｅｍ１ｕから入手した。

インデグリン・レセプターα３β１（ＰＩＢ５）、α２β１　（ＰＩＨ５）及び α５β１　（ＰＩＤ６）に対するモノクローン抗体はこの研究所で開発された。

ＰＩＨ５及びＰＩＤ６はコラーゲン及びフィブロネクチン被覆基質への線維芽細 胞及び血小板の接着をそれぞれ抑止する（Ｗａｙｎｅｒ、　Ｅ、　Ａ、及びＣａ ｒＩｅｒ、　Ｗ、　Ｇ、　、　１９８７．　同上；　ｈｎｉｃｋｉ等、　１９ａ ８．同上；　Ｗａｙｎｅｒ等、＋９８８．　同上）。

リンパ球接着レセプターに対するモノクローン抗体をたＯｉ、Ｖ、Ｔ、及びＨｅ ｒ＋ｅｎｂｅ＋ｇ、Ｌ、Ａ、、ｌ９８０．　”１ｍｍａｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　 ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ｈｙｂ「ｉｄ　ｃｅｌｌ　１ｉｎｅｓ”　）及びＴａｇｇ ａ＋を及びＳａｍｌｏｌｌ　（Ｔａｇｇａｒｔ、Ｒ，Ｔ及び５ａ１ｏｊ１．１． 　Ｍ、　、　１９８３．５ｃｉｅｎｃｅ、皿：　１２２８−１２３０　）の方法 により、上述のように製造した（Ｗａ７ｎｅ＋及びＣａｒｔｅｌ、　１９８７； Ｗａ７ｎｅｒ等、　＋９８８）　。８７２１９２８球１００μｍで免疫処置され たＲ　Ｂ　Ｆ／Ｄ　Ｎマウスから肺臓を摘出し、Ｎ５−１／ＦＯＸ−ＮＹ骨髄腫 細胞と混合した。アデニン／アミノプテリン／チミジンを添加されたＲＰＭＩ中 で生存可能なヘテロ核を選択した。リンパ球接着レセプターをターゲットとする 抗体を生成するハイブリドーマをフィブロネクチン被覆表面へのリンパ球接着抑 止特性でスクリーニングし、限界希釈度によってクローン化した。

Ａ　Ｉ　Ａ　５　（Ｈｅｍｌｅｒ等、　１９＆７．　Ｊ、　Ｂｉａｌ、　Ｃｈｅ ｍ、　、　２６２　：　３３０（１−３３０９）はリンテグリン・レセプターの β１サブユニットと特定的に反応し、細胞接着を抑止すると報告されているが（ 竹田等、　１９８８．　Ｊ、Ｃｅ１ｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　、　３７　：　３８ ５−３９３　）、観察の結果、この試薬はいかなる表面へのリンパ球接着も抑止 しない。そこで上述した技術を利用し、複数のりガントへの細胞接着抑止をスク リーニングすることによって、機能が解明されている抗−β１モノクローン抗体 Ｐ４Ｃ１１１を製造した。Ｐ４Ｏ１０はフィブロネクチン。

ｃｓ−１，コラーゲン及びラミニン被覆表面への細胞接着を抑止し、標準的な生 化学基準によればβ１と反応する。

精製血漿フィブロネクチン、トリプシン・フラグメント及びｃｓペプチドへの細 胞接着に影響する抗体を公知の方法で（Ｗａ７ｎｅｔ及びＣｕｔｅｒ、　１９８ ７　）同定した。即ち、４８ウエルの未使用スチレン・プレートをヒト血漿フィ ブロネクチン（５μｌ／ｍｌ）で被覆し、ＩＯＢ／ｍｌ熱変質ＢＳＡ　（ＨＢＳ Ａ）を添加したＰＢＳでブロックし、Ｔリンパ球またはＨＴ１０８０細胞をＮ　 ａ　２　”Ｃｒ　０４（５０μＩｃｉ　／＋ｎｌ、２−４時間）で標識し、洗浄 し、５Ｘ］Ｑ’ＨＴ　１０８０または培養Ｔ細胞または５　ｘｌＯｌｏＰ　Ｂ　 Ｌ／ウェルを１ｆｆＨ／ｍｌ熱変質ＢＳＡを添加したＰＢＳで１：２希釈した） ハイブリドーマ培養上澄みまたは対照骨髄腫細胞培養上澄みと共に室温で１５分 間保温した。ハイブリドーマの存在において１５−３０分間（ＨＴ　１０８０） または２−４時間（リンパ球）に亘り３７℃で蛋白被覆表面に細胞を接着させた 。非接着細胞をＰＢＳ洗浄によって除去し、接着細胞をＳＤＳ／ＮａＯＨに溶解 させ、結合している”Ｃｒ−ｃｐｍをガンマ−・カウンターで測定した。

生存可能な細胞を公知の方法（ＷＨｎｅｒ及びＣａｒｔｅｒ、　１９８７）に従 って１２５−沃素で表面標識し、次いで５０ｍＭフォスフェート緩衝塩ｐＨ７， ２に１％Ｖ／Ｖ　）リドンＸ−１００洗浄剤または０．３％ＣＨＡＰＳ洗浄剤を 溶かした溶液で抽出した。場合によってはこのリーシス緩衝塩にＩＩｌ１ＭのＣ ａＣｌ２を添加した。１ｍＭのフェニルメチル・スルホンφフルオライド、１ｍ ＭのＮ−エチルマレイミド、１μｍ／ｍ１のロイペプチン及び１μｇ／ｍｌの大 豆トリプシンをプロテアーゼ抑制剤として使用した。免疫沈降試験及び逐次免疫 沈降試験は公知の方法（Ｗ２７ｎｅｒ及びＣａｍｅｌ。

１９８７、同上）に従って実施した。ペプチド分析はＣ１ｅｖａｌａｎｄ等の基 本的な方法（１９７７、１，Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　、２５２　：　１１０２ −１１０６　）にこれも公知の改良を加えた方法（Ｗａｙｎｅ＋及びＣａｒｔｅ ｒ、　１９８７　）に従って実施した。Ｌａｅｍｍｌｉの基本的なスラブキング ・ゲル方式（１９７０，Ｎａｔｕｒｅ、　２２７　：　６８０−６８５　）に従 って硫酸ナトリウム・ドデシルを含有するポリアクリルアミド・スラブ・ゲル（ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル）を製造した。

ヒト血漿フィブロネクチンはＤ＋＋、　Ｈｏｒｏｖｉ　ｔｚ及びＳｃｈｕｌｍａ ｎ　（Ｎｅｗ　ｙｏｌｋ　Ｂｌｏｏｄ　Ｃｅｎ１ｅ＋、ＮＹ）から供与された。

フィブロネクチンをＴＰＣＫ−）リプシンと共に３７℃で９０分間温浸処理し、 これを公知の方法（Ｇａ＋ｃｉａ−Ｐａ＋ｄｏ等、　１９８７、８ｉｏｃｈｅｍ 、　］、、　２４１　＋　９２３−９２８　；　Ｇａ＋ｃｉａ−Ｐａ＋ｄｏ等１ ９８９．　Ｅ及びイオン交換クロマトグラフィーによって分留した。

ヒト・フィブロネクチン■Ｃ８部位の初期４８残基にまたがる２つのオーバラッ プ・ペプチド（ｃ　ｓ　−ｉ及びＣ８−２）を公知の方法（Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓ 等、　１９８６．及びＨｕｍｐｈｒｉｅ＋等、　１９８７．　Ｉ、　Ｂｉｏｌ、 　Ｃｈｅｍ、、　２６２　：　６８８６−６８９２　）で合成し、ラビットＩｇ Ｇと結合した。

６１７、レセプター発現の蛍光分析 懸濁液中における細胞上のＥＣＭＲｓ発現をＥＰＩＣ８７５０デュアル・レーザ ー・セルソーダー（Ｃｅｎ１ｅ＋　。

フロリダ州ハイアリ−）による１色または２色フローサイトメトリーによって分 析した。ポジティブ蛍光を３０１ｏｇスケールで測定し、蛍光の強さくｌｏｇ　 Ｆ　Ｉ）を平均チャンネル・ナンバー（０−２５５）によって表わした。非免疫 １ｇＧ負対照に対するバックグラウンド蛍光を各細胞ポピユレーションごとに測 定し、これを差引いた。接着細胞をトリプシン処理し、フローサイトメトリーに 使用する前に、血清の存在において３７℃で１５分間回復するにまかせた。１色 または２色蛍光測定を行うため、懸濁液中の１０６個の細胞を蛋白Ｇ−セファロ ーゼ精製ヤギＩｇＧ（２０μｇ　／ｍｌ）と共に３０分間、次いで第１段抗体と 共に６０分間、４℃に保温し、ｌ０ｍｇ／ｍｌのＨＢＳＡ及び００２％アジ化ナ トリウムを含有するハンクス平衡塩溶液（Ｈａｎｋｓ　／　Ｂ　Ｓ　Ａ／　Ｓ　 Ａ）中て洗浄し、Ｈａｎｋｓ　／　Ｂ　Ｓ　Ａ／ＳＡ中でＦＩＴＣ配合ラビッう 抗マウスＩｇＧと共に６０分間４℃に保温した。次いでこれを（調製したばかり の）２％パラホルムアルデヒドの冷ＰＢＳ溶液中で洗浄し、固定した。２色蛍光 の場合には、精製したビオチニル置換モノクローン抗体を、Ｈａｎｋｓ　／ＢＳ Ａ／ＳＡ中の最終濃度が１μｇ／ｍｌとなるまで、ＦＩＴＣ着色された固定細胞 に添加し、６０分間、４°Ｃに保温した。あらかじめ２％パラホルムアルデヒド で固定したことはリンパ球インテグリン・レセプターの発現にほとんど影響しな かった。固定細胞を洗浄し、１１５０希釈比でフィコエリスリン配合ストレパビ ジン（Ｂｉｏｎｅｊｉｃｓ　）を含有する０、　５ｍＭ　Ｈａｎｋｓ　／　Ｂ　 Ｓ　Ａ／　Ｓ　Ａ中で３０分間、４℃に保温した。

最後に着色細胞を洗浄し、再びパラホルムアルデヒド２九ＰＢＳ溶液中に固定し 、ＥＰ　Ｉ　ＣＳフローサイトメーターによる分析のため暗処で４℃に維持した 。

接着細胞をトリプシン処理し、１μｇ／ｍ１ＢｓＡ及び１００μｇ／ｍｌ大豆ト リプシン抑制剤を添加したＲＰＭＩ中で洗浄し、酸洗浄及びシラン処理を施した フィブロネクチン、ラミニンまたはコラーゲン（２０μｇ／ｍｌ）被覆ガラス・ カバー・スリップに、１−４時間に亘り、血清不在の条件下で接着するにまかせ た。保温後、非接着細胞を除去し、接着細胞を１００ｍＭのカコジル酸ナトリウ ム、１００ｍＭのスクロース、４．５ｍＭのＣａＣ１：＋、２％ホルムアルデヒ ド中で２０分間に亘って固定した。５分間に亘り０．５％トリトンＸ−１００で 可浸透化したのち、ヤギ血清の２５％ＰＢＳ溶液で洗浄し、ブロックした。可浸 透化細胞を特定レセプターに対する抗体で着色しく室温で６０分間）、洗浄し、 ＦＩＴＣ配合ヤギ抗マウスまたはローダミン）配合ヤギ抗ラビットＩｇＧと共に （４５分間に亘って室温に）保温し、再び洗浄した。公知の方法で（ｌｘｚａ「 ｄ、　Ｓ、　Ｃ，及びＬｏｃｈｎｅｒ、　Ｌ、　Ｒ，、１９７５，Ｊ、　Ｃｅ１ １．　Ｓｃｉ、、　２１　：　１２９−１５９）カバー・スリップをガラス・ス ライド上に伏せ、蛍光試験及び干渉反射顕微鏡検（ＩＲＭ）した。

６．１．９２組織着色 低温切片を蛍光鏡検することにより組織中αインテグリン・レセプター分布を検 討した。低温切片（６μｍ）はイソペンタン／液体窒素中で急冷したのちＯＣＴ 媒中に埋没させたヒトの皮膚、扁桃、または腫瘍サンプルから作成した。公知の 方法で（Ｃｘｒｔｅｒ及びＷａ７ｎｅｒ、　１９８８．　Ｉ。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２６３　：　４１９３−４２０１　）すべての切片をパ ラホルムアルデヒド４九ＰＢＳ溶液中に固定してから１次抗体及び２次蛍光抗体 と共に保温した。対照実験では、フルオレセイン・フィルターを使用したところ 、ローダミンの蛍光は全く検出されなかった。

培養１９２８球（Ｍｏ　ｌ　ｔ　４）　、Ｋ５６２　、ＲＤ　（横絞肉腫）及び ＨＴＩ０８０（線維肉腫）細胞及び新鮮な（図示しない）ＰＢＬがフィブロネク チン被覆表面に接着した（図１＝白抜きバー）。ただしＭｏ１ｔ４及びＲＤ細胞 は低レベルまたは検出不能レベルの、モノクローン抗体ＰＩＤ６によって認識さ れる基本型フィブロネクチン・レセプター（インテグリンα５β１）を発現させ た（図１：縞付きバー）。これと符号して、フィブロネクチンへのＭｏ１ｔ４及 びＲＤ細胞の接着をＰＩＤ６によって完全には抑止できなかった（図１：塗りつ ぶしレバー）。

しかし、豊富なα５β１を発現させた細胞（ＨＴ　１０８０及びに５５２　）の フィブロネクチンへの接着はＰＩＤ６によって効果的に抑止された。また、合成 ペプチドＲＧＤＳは血漿フィブロネクチンへの１９２８球の接着を完全には抑止 しなかった（Ｍｏｌｔ４またはＪｕ＋ｋａｔ細胞では５０−７０％、線維芽細胞 では８０−９０％、Ｋ５６２−１細胞では１００％）。これらのデータに照らし て、１９２８球のようないくつかの細胞はα５β１以外のフィブロネクチン接着 レセプターを発現させると考えられる。

そこで発明者等は培養１９２８球に対するモノクローン抗体を作成し、フィブロ ネクチン被覆表面へのリンパ球の接着を特定的に抑止するが線維芽細胞の接着は 抑止しない性質に関してこれらの抗体をスクリーニングすることにより、推定さ れる他のフィブロネクチン・レセプターの同定を試みた。このようなプロトコル を使用して、フィブロネクチンへの培養１９２８球の接着を抑止するがＨＴ　１ ０８Ｇ細胞の接着は抑止しないいくつかのモノクローン抗体（Ｐ４Ｏ２，Ｐ３Ｅ ３．Ｐ２Ｏ３）を同定した（表■）。

表　■ モノクローン抗体Ｐ３Ｅ３．Ｐ４Ｃ２及びＰ２Ｏ３による血漿フィブロネクチン へのリンパ球接着の特異な抑止作用 フィブロネクチン接着 （対照の％） Ｐ　Ｂ　Ｌ　１００％　４３％　３８％　１０％　５２％Ｊ　ｕ　ｒ　ｋ　ａ　 ｔ　１００％　２２％　３３％　１２％　４８％Ｍａｌｔ　４　１００％　１８ ％　１２％　８％　３９％）（Ｔ１０８０　１００％　５％　９８％　９３％　 １０４％１２５■表面標識ＰＢＬ　（図示しない）、Ｍｏ１ｔ４またはＨＴ１０ ８０（図２）細胞をトリトンＸ　−１００洗浄剤に加えた溶液からの免疫沈降は 抑止性モノクローン抗体（Ｐ３Ｅ３に関するデータを図示）が還元剤の存在にお いて（図示しない）または不在の条件下で（図２）　Ｍ１５０．００反応するこ とを示唆した。このような免疫沈降条件下でｐ１５０には明白なα−βサブユニ ツト構造が欠けており、インテグリン・レセプターα２β１またはα３β１のα またはβサブユニットと共に移動しなかった（図２）。

慢性的に活性化したＣＤ８＋キラ−Ｔリンパ球（ＬＡＫ）またはＣＴＬ　（図示 しない）をトリトンＸ−１００洗浄剤に添加して得た抽出物から免疫沈降した抗 原はｐ　１５０のほかに、還元剤の存在において（図示しない）または不在の条 件下でＭ２Ｏ，０００及び７０．０００で移動する比較的多量の２種類の小蛋白 を含有していた。Ｖ８プロテアーゼ・ペプチド・マツピンクの結果、ｐ８０及び ｐ７０がｐ１５０の蛋白分解性フラグメントであることが判明した。これらの低 分子量フラグメントは洗浄剤抽出物が複数のプロテアーゼ抑制因子（図２、リガ ンド）の存在において調製された場合でも慢性活性化Ｔ細胞から免疫沈降させる ことができた。静止ＰＢＬ、培養Ｔ（Ｍｏｌｔ４、Ｊｏｒｋａｔ）またはＢ細胞 性白血病細胞及びＲＤ細胞で調製した抽出物からはｐ８０及びｐ７０はほとんど 検出されなかった。

ｐ１５０の生化学的特性はＶＬＡ４との関連性（Ｈｅｍｌｅｒ等、１９ｇ？）を 示唆した。このことはＶＬＡ４特異モノクローン抗体Ｂ５−ＧＩＯを使用した逐 次免疫沈降（図示しない）によって確認された。１ｍＭのＣａ”の存在において １２５Ｉ表面標識Ｔリンパ球をＣＨＡＰＳ洗浄剤（０，３％）で可溶化したα５ 免疫沈降試験を実施した結果、β１との関連性により、ｐ１５０はインテグリン ・スーパー・ファミリーのαサブユニットであることが明らかになった。このよ うな条件下でα４はβ１と共にヘテロダイマーとして沈降した。β１であること は■８プロテアー・ペプチド・マツピング（図示しない）によって確認された。

抑止性モノクローン抗体（Ｐ３Ｅ３．Ｐ４Ｃ２及びＰ４Ｇ９）と共に１９２３球 から免疫沈降したα４β１ヘテロダイマーはＰＩＤ６と共に免疫沈降した基本型 フィブロネクチン・レセプターα５β１とは次の３点で異なることが判明した。

１）　１９２３球の洗浄剤抽出物中に存在するα４β１及びα５β１の相対量は α５β１に比較してα４β１の存在が高レベルである点が目立ち（図３）、この ことはフローサイトメトリーを利用して得たデータとも一致した（図１）。２） 逐次免疫沈降試験において、α４β１に対するモノクローン抗体はα５β１をプ レクリアしなかった。３）モノクローン抗体Ｐ３Ｅ３及びＰＩＤ６と共に沈降し たα４及びα５サブユニツトから得られた■８プロテアーゼ・ペプチド・マツプ は互いにはっきりと区別できるものであった（図示しない）。さらにまた、Ｊｕ ｒｋａｔ細胞からのα４β１の配合体（図３）を可溶化するため設定された条件 （０，３％ＣＨＡＰＳ及び１ｍＭ　ＣａＣＬ）下で、分子量が比較的高い他の蛋 白（ｐ１８０）もモノクローン抗体と反応するか、またはα４β１と共に沈降し た。ＰＩＤ６モノクローン抗体（図３）で調製された抽出物、非リンパ細胞また はＣａ”＋不在の条件下で調製されたトリトンＸ　−１００洗浄剤抽出物からは ｐ１８０が検出されなかった。ｐ１８０と他のインテグリンとの関係は未知であ る。Ｃａ”が不在の条件下でＴ細胞をトリトンＸ　−１００で可溶化したのちα ４をβ１抜きで免疫沈降させることができるから、抑止性モノクローン抗体がα ４サブユニツトに存在するエピトープを認識することは明らかである（図２）。

既に報告されているように（Ｈｅｍｌｅｒ、　同上）、α４β１は有核造血細胞 に広く分布していた（表■）。

α４β１及びα５β１の分布 相対 蛍光強さ 細　胞　α４β１　α５βＩ ＬＧＬ　（ＣＤ３−、ＣＤｌ６＋）　＋＋＋　＋／−または一単球（ＣＤ１６＋ ）　＋＋　＋＋ 顆粒球　子 鹿小板　十 牌　臓　＋＋＋＋ 扁　桃　＋＋＋＋ Ｍｏ　ｌ　ｔ　４　（ＣＤ３＋、　ＣＤ４＋）　＋＋＋　＋Ｊｕｒｋａ　（ＣＤ ３＋、　ＣＤ４＋）　＋＋＋　＋＋ＹＴ　（ＣＤ３−）　＋＋　− ＰＨＡ芽細胞（ＣＤ４＋）　＋＋＋＋　＋＋ＣＴＬ　（ＣＤ３＋、　ＣＤ８＋） 　＋＋＋＋　＋＋＋ＬＡＫ　（ＣＤ３＋、　ＣＤ８＋）　＋＋＋＋　＋＋＋ＨＴ 　１０８０　＋　＋＋ ２色フローサイトメリーは肺臓、扁桃及び末梢血液から得られたリンパ球サブポ ピユレーションがいずれも豊富なα４β１を発現させることを明らかにした。さ らに、急性リンパ球（ＴまたはＢ）白血病細胞からの末梢血液単球、大顆粒リン パ球（Ｌ　Ｇ　Ｌ）及び骨髄性白血病及び培養Ｔ及びＢリンパ球細胞系はいずれ も豊富なα４β１を発現させる（表■）。健常なヒトの血小板及び顆粒球はα４ β１に関してはネガティブであった（表■）。これとは対照的に、α５β１を発 現させた造血細胞ポピユレーションは活性化Ｔ細胞、血小板、単球、顆粒球、急 性リンパ性（ＴまたはＢ）及び骨髄性白血病細胞及び培養に５６２　、ＨＬ−６ ０及びＵ９３７細胞であった。ある種の培養Ｔ（Ｍｏｌｔ４またはＪｕｔｔａｊ ）及びＢ　（ＳＴ−１）細胞系はＰＩＤ６モノクローン抗体による検出される低 レベルのα５β１を発現させる。数人の健常者ではフローサイトメトリーによっ て検出されるＰＩＤ６蛍光に関してＰＢＬサブポピユレーションがポジティブで あった。

発明者等はα５β１を発現させるこのＰＢＬサブポピユレーションの性質を究明 中である。ＴＹ細胞、ＣＤ３Ｔ細胞リンパ腫はフローサイトメトリーによればＰ ＩＤ６に関して完全にネガティブであった。これらの結果は静止Ｔリンパ球によ って発現させられる主要フィブロネクチン・レセプターがα４β１であり、発明 者等が既に報告したように（Ｗａ７ｎεＴ等、　１９１１１１）　、Ｔリンパ球 中のα５β１の発現は白血病または活性化培養細胞に限られることを示唆してい る。興味深いことに、線維芽細胞の多（は低レベルのα４β１を発現させたが、 フローサイトメトリーによれば、大脈管内皮細胞（ＨＵＶＥｓ）及び培養上皮細 胞はα４β１に関してネガティブであった。

組織においては、成人の肺臓、リンパ節、及び扁桃にα４β１が存在し、その他 の組織にはほとんど存在しなかった。さらに、特定の組織領域において細胞が発 現させるフィブロネクチン接着レセプターの相対量には大きいばらつきが見られ た。例えば、扁桃、皮質及び胚芽中心部におけるＰＢＬ及びリンパ球は多量のα ４β１を発現させたが、α５β１はほとんど発現させなかった。α４β１は成人 のリンパ組織中にも見られたが、このことがこの部位のリンパ球湿潤の結果なの か、あるいはリンパ上皮細胞によるα４β１発現なのかは不明であった。

細胞が血清不在の条件下で適当なリガンドを中心に成長すると細胞表面接着レセ プターに特異な組織変化が生じて局部接着が形成される（Ｂａｒｒｉｄｇｅ等、 　１９ｇ８．Ａｎｎ、ＲｅｖＣｅｌｌ　Ｂｉｏｌ、、　！　；　４８７−５２５ 　）　、線維芽細胞にはα４β１を発現させるものがあるから、発明者等はフィ ブロネクチンが接着基質として使用された場合、このレセプターが局部接着に分 布するかどうかを検討した。図４　（Ａ及びＣ）から明らかなように、主要な局 部的接触部位または接着部位を、ＲＤがフィブロネクチン中で成長する時に干渉 反射顕微鏡検によって視認することができた（Ｉｚｚａ＋ｄ、　Ｓ、　Ｃ，及び Ｌｏｃｈｎｅ＋、　Ｌ、　Ｒ，、１９７６、］、　Ｃｅ１１．　Ｓｃｉ、、　２ １　：　１２９−１５９　）。発明者等及び他の研究者が既に報告したように（ Ｒｏｍａｎ、　Ｊ、　、　ＬａＣｈａｎｃｅ、　Ｒ，、Ｂｒｏｅｋｅｌｍａｎ、 　Ｔ、Ｊ、　、　Ｒｏｂｅｒｔｓ、　Ｃ、Ｉ、　、　Ｗａ７ｎｅｒ、　Ｅ、＾、 　、　Ｃａｒｔｅｒ、　Ｗ、　Ｇ、　及びＭａｃｄｏｎａｌｄ、　Ｊ、　、　１ ９８１１゜１、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、１０１１　：　２５２９−２５４３　） 　、血漿不在の条件下でＲＤ細胞がフィブロネクチンで（図４Ｂ、矢印）ただし ラミニン被覆表面においてでなく成長すると、α５β１が局部的接着部位に集中 した。同様に、モノクローン抗体Ｐ４Ｇ９　（図４Ｄ、矢印）で着色した結果、 細胞がフィブロネクチンで、ただしラミニン被覆表面でなく成長するとα４β１ も局部的接着部位に集中した（図示しない）。これらの結果に局部接着部位、即 ち、培養細胞の主要接着構造に存在するフィブロネクチンとα４β１の特異な相 互作用を示すものである。

局部的接触部位に両レセプターが存在することでα４β１及びα５β１がフィブ ロネクチンの別々の接着部と結合する可能性が示唆された。事実、この可能性は Ｐ２Ｏ３及びＰＩＤ６を同時に使用して完全な血漿フィブロネクチンへの細胞接 着を抑止した時に実証された。−緒に使用すると、ＰＩＤ６及びＰ２Ｏ３は完全 な血漿フィブロネクチンへの１９２８球の接着を完全に抑止し、ＲＤ細胞の接着 を部分的に抑止した（表Ｖ）。

表　■ フィブロネクチンへの１９２８球及びＲＤ細胞の接着に対するモノクローン抗体 ＰＩＤ６及びＰ２Ｏ３の複合効果興味深いことに、１９２８球と異なり、ＰＩＤ ６だけでもＰ２Ｏ３だけでも完全な血漿フィブロネクチンへのＲＤ細胞接着に対 するすぐれた抑止因子とはならなかった。

フィブロネクチンへのＲＤ細胞接着はＰＩＤ６及びＰ２Ｏ３を併用することで効 率よ（抑止できた。

上記結果（表■２表ｖ１図１２図４）から明らかなように、血漿フィブロネクチ ンへの細胞接着は２つの互いに独立の細胞表面レセプターα４β１及びα５β１ によって仲介される。フィブロネクチン中のα５β１に対応するリガンドが８０ ｋＤａ細胞結合領域であり、該領域がＲＧＤ鎖を含有することは既に発表されて いる（Ｐ７ｊｅｌａ、　Ｒ，、Ｐｉｅｒｓｃｈｂａｃｈｅｒ、　Ｌ　Ｄ、　、及 びＲｏｕｓｌａｎｔｉ、　Ｅ、、　１９８５．　ＣｅＩ＋、４０　：　１９１− １９８　）。α４β１と相互作用するフィブロネクチンの部位を突き止めるため 、（図５Ａ及びＢ参照）発明者等は血漿フィブロネクチンの種々の蛋白分解性フ ラグメントへの培養１９２８球の接着と、これらのフラグメントへのリンパ球接 着に対するモノクローン抗体ＰＩＤ６及びＰ２Ｏ３の作用を検討した。図６に示 すように、Ｊｕｒｋａｔ、ＹＴ及びＭｏ１ｔ４細胞は含ＲＧＤ７ラグメント（８ ０ｋＤａ）に対してよりもヘパリン（Ｈｅ　ｐ）■領域を含有する３８ｋＤａフ ラグメントに対して効率よく接着する。Ｊｕｒｋａｔ及びＭｏ１ｔ４細胞は、５ ８ｋＤａフラグメントを含有する他のＨｅｐＩ［領域にも依存態様で接着してい る。ただし、５８ｋＤａへの細胞接着は最大でも３８ｋＤａフイブロネクチン・ フラグメントによって達成される接着の３０％に過ぎない。このことは３８ｋＤ ａフラグメントが１９２３球との高親和力接着部位を含むことを示唆する。１９ ２３球は血漿フィブロネクチンのＨｅｐＩ領域を含有するＮ−末端２９ｋＤａフ ラグメントには接着しなかった。一般に、新鮮なＰＢＬはＪｕｒｋａｔまたはＭ ｏ１ｔ４細胞と同様の接着パターンを示し、新鮮なＰＢＬが８０ｋＤａフラグメ ントと結合する能力はα５β１の発現と相関した。他の造血細胞系、例えばに５ ６２細胞（図６）は血漿フィブロネクチンの８０ｋＤａフラグメントを優先的に 選択し、ＲＤ細胞はＮ−末端２９ｋＤａフラグメント以外のすべての血漿フィブ ロネクチン・フラグメントと無差別に接着した。ＲＤＧ　Ｓ　（１ｍｇ／　ｍｌ ）は完全フィブロネクチンへのＪｕ＋ｋａｔ細胞の接着を部分的に（５０％）抑 止し、８０ｋＤａフラグメントへの接着を完全に（１００％）抑止した。３８ｋ ＤａフラグメントへのＪｕｒｋａ＋細胞接着は（１ｍｇ／ｍｌまでの）ＲＦＤＳ には影響されなかった。

表３及び図１に示すように、α４β１及びα５β１に対するモノクローン抗体は 完全な血漿フィブロネクチンへのＴ　ＩＪンパ球接着を部分的に抑止した（図７ 、上）。

予期した通り、ＰＩＤ６はＲＧＤ接着接着金有する８０ｋＤａフラグメントへの Ｔ細胞接着を完全に抑止した（図７、中）。ＰＩＤ６は３８ｋＤａ　（図７、下 ）または５８ｋＤａフラグメントへのＴリンパ球接着を抑止しなかった。これと は対照的に、Ｐ２Ｏ３は３８ｋＤａフラグメントへのＴリンパ球接着を完全に抑 止し、８０ｋＤａフラグメントへの接着には全く作用しなかった（図７）。また 、Ｈｅｐｎを含有する５８ｋＤａフラグメントへのＴリンパ球接着はＰ２Ｏ３に よって抑止できなかった。いずれの場合にも、（例えばＪｕｒｋａｔ細胞のよう に）α４β１及びα５β１の双方を発現させる他の１９２８球細胞系はＭｏ１ｔ ４細胞と全く同様の挙動を示した（図７）。表４から明らかなように、Ｋ５６２ 細胞はα５β１だけを発現させた。３８（図６）及び５８ｋＤａフラグメントへ のに５６２細胞の接着は８０ｋＤａフラグメント（図６）への接着に比較しては るかに少なかった。

完全な血漿フィブロネクチン（図１）または８０ｋＤａフラグメントへのこれら の細胞の接着はＰＩＤ６によって完全に抑止することができた。他方、α５β１ を発現させないＹＴ細胞（表■）は完全血漿フィブロネクチン及び８０ｋＤａフ ラグメント（図６）に対して接着し難い。これらの細胞が血漿フィブロネクチン 被覆表面に接着するにはＪｕｒｋａｔまたはＭｏ１ｔ４細胞よりも２〜３倍長い 時間がかかる。ただし、ＹＴ細胞は３８ｋＤａフラグメント（図６）に効率よく 、かつ投与量に応じて接着し、３８ｋＤａフラグメントへのこの細胞の接着はＰ ２Ｏ３によって完全に抑止することができた。以上のデータはα４β１の発現と ＨｅｐＩＩ及び■Ｃ８領域を含む血漿フィブロネクチン・フラグメントへの接着 能力との間に直接的な相関関係が存在することを示唆するものである。これらの データはまた、α４β１がこのオルターナティブ細胞接着領域に対応するレセプ ターとして作用することを明白に示す。

血漿フィブロネクチンＡ鎖に存在する■Ｃ８領域（図５）はフィブロネクチンへ の細胞接着を仲介する少なくとも２つの部位を含む（Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓ等、　 １９８６．　Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉ。

連のオーバラップ合成ペプチド（ＣＳペプチド）を使用して、Ｈｕｍｐｈ＋ｉｅ ｓとその協力書違はＣ８−１（Ｎ−末端）ペプチドがマウス黒色腫細胞によって 認識される接着部を含むことを立証した（Ｈｕｍｐｈｒｉｅｇ等、　１９８６． １９８７）　、発明者等は３８ｋＤａフラグメントがヒトＴリンパ球によって認 識される高親和力接着部位を含み、α４β１が３３ｋＤａへのＴリンパ球接着を 仲介するレセプターであることを立証した。このフラグメントはＣ３−５部位を 含まず、黒色腫細胞に対する高親和力接着部位として確認されている（Ｈｕｍｐ ｈｒｉｅｓ等、１９８７，１．Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２６２　：６８８６−６ ８９２　）全Ｃ３−１領域を含む（Ｇａｒｃｉａ−Ｐａ＋ｄｏ等。

１９８７、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、、　ユ４１　：　９２３−９２８　）　。

従って、Ｔリンノ々球がｃｓ−ｉを認識し、これに接着するかどうか、α４β１ がこの相互作用に関与するレセプターであるかどうかを確認することが重要であ った。

１９２３球（ＩｏｒｋａｊまたはＭｏ　ｌ　ｔ　４細胞）はＣＳ−１（ラビット ＩｇＧ配合）被覆プラスチック表面を認識し、これに接着する（表■）。１９２ ８球（Ｊｕｔｋａ＋）はＣ３−２（ラビットＩｇＧ配合）被覆表面またはラビッ ト１ｇＧだけで被覆したプラスチック表面には接着しない。また、α４β１に対 するモノクローン抗体（Ｐ４Ｃ２）はＣ３−１へのＴリンパ球接着０抑全に抑止 したが、α５β１に対する抗体（Ｐ　Ｉ　Ｄ　６）は全く作用しなかった（表■ ）。既に示した通り、α４β１に対する抗体は３８ｋＤａフラグメントへの１９ ２８球の接着を完全にかつ特定的に抑止しく表■）、α５β１に対する抗体は８ ０ｋＤａフラグメントを含むＲＧＤへの接着を特定的に抑止した。

表　■ α４β１に対するモノクローン抗体によるＣ３−１ペプチドへのＴリンパ球接着 ０抑止 抗体１ リガンド　ＩｇＧ　Ｐ４Ｃ２ＰＩＤ６ ８０ｋＤａ　８５８０±２１４　７１５４±３９８　２０２±１０５３８　ｋ　 Ｄ　ａ　２２６８０±１０１４　１１４±７８　２４９１７±３５２Ｃ３−１４ ４３３９±５１３　８４１±５５５　４２８９１±７２８ＣＳ　−２２５７６± ２１４　５３５±２５８　４３５±１６８６．３．　検　討 モノクローン抗体技術（Ｗａ７ｎｅｒ、　Ｅ、＾、　、　Ｃａｒｔｅｒ、　Ｗ、 　Ｇ、　。

Ｐｉｏｊ＋ｏｖｉｃｘ、　Ｒ，及びＫｕｎｉｃｋｉ、　Ｔ、　１．、１９８８． 　Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉａｌ、。

１０　：　ｊ８１１１−１８９１　）を利用して、発明者等は新しいフィブロネ クチン・レセプターα４β１を同定した。モノクローン抗体Ｐ３Ｅ３．Ｐ４Ｃ２ 及びＰ４Ｇ９はα４サブユニツトのエピトープを認識し、カルボキシ末端ヘパリ ン■領域及びタイプ■連結セグメント（Ｉ［Ｃ３）の一部を含有する血漿フィブ ロネクチンの３８ｋＤａ）リプシン・フラグメントへの末梢血液及び培養１９２ ８球の接着を完全に抑止した。α４β１に対応する■Ｃ３中のリガンドは黒色腫 細胞接着部位として既に確認されているＣ３−１領域であった。α４に対する既 に機能の明らかなモノクローン抗体は完全血漿フィブロネクチンへのＴリンパ球 接着０抑分的に抑止し、ＲＧＤ接着接着金む８０ｋＤａ　トリプシン・フラグメ ントへの接着には全く作用しなかった。上述したフィブロネクチン・レセプター α５β１に対するモノクローン抗体（ＰＩＤ６及びＰＩＦ８）は８０ｋＤａフラ グメントへのＴリンパ球接着０抑全に抑止したが３８ｋＤａフラグメントまたは Ｃ３−４への接着には全く作用しなかった。α４β１も、α５β１これらのレセ プターを発現させる線維芽細胞がフィブロネクチン被覆表面で成長する時、局部 的接着部位に集中した。以上の知見から局部的接触部位における両レセプターと フィブロネクチンとの特異な相互作用が裏付けられた。

最近になって、いくつかの８９２８球細胞系がカルボキシ末端ＨｅｐＩＩ領域内 の血漿フィブロネクチン部位と胞にインテグリン状のレセプターを同定した（１ ９８７．　同上）。しかし、彼等が報告した蛋白がα４β１．α２β１、α５β １のいずれであるかは明確でない。Ｂｅｒｎａｒｄｉ等（１９８７、同上）も８ ９２８球によって発現されるフィブロネクチン・レセプターを同定した。この研 究では、ＨｅｐＩＩを含むフラグメントに接着するＢ細胞がα４β１に似たレセ プターを発現させたのに対し、細胞接着領域を含むＲＧＤに接着する細胞はα５ β１に似たレセプターを発現させた。ただし、これらのデータから接着に関与す るレセプターを明らかにすることは不可能であった。これらのリポートと本発明 の知見を総合すれば、１）血漿フィブロネクチンのカルボキシ末端にオルターナ ティブ接着部位が存在することと、１１）α４β１がこのオルターナティブ接着 部位に対応するレセプターの役割を有することを立証することができる。α４β １とフィブロネクチンの相互作用に関与する正確なアミノ酸鎖を解明できれば有 意義である。３８ｋＤａフラグメントも５８ｋＤａフラグメントもＣ３−１もＲ ＧＤ鎖を含まないから（ＫｏｒｎｂｌｉＨ等、１９８５．同上；　Ｇａｒｃｉａ −Ｐａｒｄｏ等、　１９８７１　同上；　Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓ等、１９８６．同 上；及びＨｕｍｐｈｒｉｅｓ等、１９８７、同上）、α４β〕、に対応のリガン ドを特徴づけることでフィブロネクチンへの細胞接着に不可欠な新しいアミノ酸 鎖を同定できることは明らかである。３８ｋＤａフラグメントはＣ３−５を含ま ないから（Ｇａｒｃｉａ−Ｐａｒｄｏ。

１９８７、同上）、３８ｋＤａへのＴリンパ球接着０抑与する最小限のアミノ酸 鎖、従ってこれらの細胞中のα４β１に対応のリガンドはａｒｇ−ｇｌｕ−ａｓ ｐ−ｖａｌでもＲＥＤＶでみない（ｌｕｍｐｈｒｉｅｓ等、１９８６．同上）。

α２β１と同様に、α４サブユニツトもβ１サブユニットとの関連性が弱い。図 ２に示すデータと発明者等がこれまでに得た知見（Ｗｘ７ｎｅｔ、　Ｅ、　Ａ、 及びＣａｒｔｅｒ、　Ｗ、　Ｇ、　、　１９８７、同上；及びＷａ７ｎｅｒ等、 　１９８８．同上）を総合すると、α２β１及びα４β１に対する既に機能が解 明されているモノクローン抗体がサブユニット分離後、β１抜きでα２またはα ４の免疫沈降に基づき、αサブユニットに存在するエピトープと選択的に相互作 用することは明らかである。この結果は各α〜β錯体のリガンド結合特異性を決 定するのがユニークなαサブユニットであることを示唆する。このことはいずれ もβ１と錯体を形成するα５及び４がフィブロネクチンの特定部位との接着を仲 介するという所見によっても裏付けられる。これはβサブユニットが接着に重要 でないというのではなく、レセプター／リガンド相互作用の特異性がαまたはユ ニークなα−β錯体によって決定されることを示唆する。

ＬＡＫ細胞は豊富な細胞表面α４β１を発現させたが機能的レセプターとは考え られず、フィブロネクチンへのＬＡＫ細胞接着をＰＩＤ６が完全に抑止したこと は興味深い。おそらくはＬＡＫ細胞が劣化した形のα４（図２参照）を発現させ るからであろう。また、ＬＡＫ細胞は活性化状態にあるから、静止末梢血液また は白血病Ｔ細胞に比較してα５β１を過剰に発現させる（表■）。

α４β１に比較して多量のα５β１を発現させる他の細胞（Ｋ５６２−１及びＨ Ｔ　１０８０）では、α５β１を介した８０ｋＤａの含ＲＧＤ領域への接着が支 配的である（図６、　Ｋ５６２−１細胞を参照）。このことはレセプター発現の 制御によって細胞がフィブロネクチンの種々の部位を認識し、これに接着する能 力が決定されることを意味する。さらに、フィブロネクチンに対応する２つのレ セプターを同時発現させることにより、細胞の結合親和力を増大させることがで き、例えば、Ｊｕｒｋａｔ及びＲＤ細胞はα４β１だけを発現させるＹＴ細胞よ りも無差別にフィブロネクチンに接着する。

フィブロネクチンへの細胞接着制御はα５β１及びα４β１が互いに独立に機能 し、フィブロネクチンの２つの結合部位との相互作用中にオーバラップしないと いう最も単純な状態においても複雑になり易い。この単純な状態からのバリエー ションによって細胞接着の極めて敏感な制御を行う可能性がある。最も単純なレ ベルでこの制御は１）リガンドの結合部位の合成及び／または露出の制御とｉｉ ）レセプターの機能的発現の制御に大別される。種々のレベルで制御例は既に公 知であり、例えば、リンフ才力イン及び特定抗原が１９２８球におけるα５β１ 発現を誘発するとフィブロネクチンへの細胞接着が増大するという所見がある（ Ｗａ７ｎｅｔ等、＋９８８．同上）。傷の癒合または炎症の過程でフィブロネク チン■Ｃ８領域におけるｍ　ＲＮ　Ａスプライシングを制御することによって、 静止または活性Ｔ細胞におけるレセプター／リガンド結合の特異性を決定するこ とができる（Ｋｏｒｎｂｌｉｂｌｔ等、＋９８５．同上）。単純な状態からのバ リエーションは興味深いが多様なメカニズムを究明するだけでもさらに実験を重 ねる必要がある。

結論として、培養１９２８球がフィブロネクチンへの接着時に２つの独立レセプ ターを使用することと、ｉ）α５β１が含ＲＧＤ細胞接着領域に対応するレセプ ターであり、ｉｉ）α４β１がヘパリン■及び■Ｃ８領域を含むカルボキシ末端 細胞接着領域に対応するレセプターであることは上記知見から明白である。さら にまた、これらのデータは１９２８球がフィブロネクチンプレｍＲＮＡのオルタ ーナティブ・スプラインによって形成されるＩ［３Ｃ８（Ｃ３−１）における分 子異質性領域を優先選択することと、α４β１がこの接着部位に対応するレセプ ターであることを示唆する。

７、［実施例コ 活性化血管内皮細胞へのリンパ球接着はフィブロネクチンのオルターナテイブ・ スプライシングされた■Ｃ８領域におけるインテグリン・レセプタ以下にの述べ る実験により、炎症応答に関連する種々の細胞分裂、例えばＩＬ−１、腫瘍壊死 因子α（ＴＮＦα）、腫瘍壊死因子β（ＴＮＦβ）で活性化された培養大脈管皮 内細胞へのＴ細胞接着を仲介するα４βルセプター及びそのリガンドＣ３−１の 役割を明らかにした。

さらに、α４β１を介してリンパ球が皮内細胞に接着するのを阻止するモノクロ ーン抗体及びペプチドの能力をも明らかにした。

使用した試薬は６．１．１節に記載した通りであった。

７、１．２．　細胞及び細胞培養 Ｊｕｒｔｘｔ　（ヒトＴ細胞白血病）はＤｒ、Ｐａ１ｌ　Ｃａｎ１ｏｎ　（１ｍ ｍｕｎｅｘ、　Ｃｏｒｐ、、ワシントン州シアトル）から、ｌａｍｏｓ　（ヒト Ｂ細胞白血病）はＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔ７ｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃ ｔｉｏｎ（メリーランド州ロックビル）からそれぞれ入手した。

ＬＡＤ　（白血病接着欠乏）及び５Ｔ−ＩＢ細胞はヒトＢリンパ球のＥＢウィル ス変換によって調製した。ＬＡＤ細胞系はβ２インテグリン系接着レセプター欠 乏患者のＢ細胞から発生させたものであり、Ｄｒ、Ｊｏｈｎ　Ｈａｒｌａｎ　（ Ｈａ＋ｂｏ＋ｗｉｅｖ　Ｍｅｄｉｃｉｌ　Ｃｅｎｔｅｒ、ワシントン州シアトル ）から入手した。ヒト屓静脈内皮細胞（ＨＵＶＥｓ）はＣｅ１ｌ　５７ｓｊｅｌ ｎ、ワシントン州シアトルから購入した。ＨＵＶＥｓは同じ（Ｃｅ１ｌ　５７ｓ ｌｅ＋ｎから購入した規定の（無血清）メディア（ＣＳ−１０ｆｌメデイア）中 に維持した。

！Ｌ−１β（ｌｎｇ／ｍｌ）またはいくつかの実験ではＴＮ　Ｆ　ａ　（ＩＱｎ ｇ／ｍｌ）と共にＨＵＶＥｓを６−２４時間に亘り保温した。この保温が終った 時点でＨＵＶＥ単層を洗浄し、接着試験に使用した。

？、１．４．　ＣＳペプチドの合成 血漿フィブロネクチンＣ３−１領域から誘導されるペプチドはＯｎｃｏｇｅｎ　 ＣａＩｐ、、ワシントン州シアトルにおいてＤｒ、Ｉａｍｅｓ　Ｂｌλｋｅが標 準プロトコルに従って合成し、ＨＰＬＣ精製した。ＣＳ−ペプチドは同じ（ｆＪ 「、］２ｍｅｓ　Ｂｌａｋｅが標準プロトコルに従ってラビット血清アルブミン またはＫＬＨに配合された。ＲＧＤＳ対照ペプチドはＰｅｎ１ｎ＋ｕｌａ　Ｌａ ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　（カリフォルニア州ベルモント）から入手した。

７、１．５．　モノクローン抗体 下記の抗体は発明者等のラボラトリ−において開発された：α２βルセプターを 認識するＰ　Ｉ　Ｈ５（Ｗａ７ｎｅｒブタ−を認識するＰＩＢ５　（同上）　； 　Ｐ７ｔｅｌａ等が報告したα５β１基本型フィブロネクチン・レセプターを認 識するＰ　Ｉ　Ｄ　６　（Ｃｅ１１．　４０　：　１９１−１９８　）　；β１ サブユニットを認識するＰ４ＣＩＯ；及びβ２　（ＣＤ１ｇ）を認識するＰ４Ｈ ９゜これらは参考のため本願明細書中に引用し、表■にも掲げたＷａ７ｎｅｒ等 の方法を使用して開発した（Ｗａ上記方法により、４８ウエル・プレートでヒト 腑静脈内皮細胞（ＨＵＶＥｓ）を培養した。ＨＵＶＥ単層力ルチュアへのリンパ 球接着を測定するため、リンパ球にＮａ２”Ｃｒ０ａ　（５０μＣｉ　／ｍｌ） を２−４時間に亘って標識付けしたのち、洗浄し、次いで抑止性抗体またはＣ３ −１誘導ペプチドの存在において、または不在の条件下で１０５　リンパ球をＨ ＵＶＥ単層と共に保温した。３７℃で３０分間に亘りリンパ球を接着させた。非 接着細胞をＰＢＳ洗浄によって除去し、接着細胞をＳ　Ｄ　Ｓ　／　Ｎ　ａ　Ｏ Ｈに溶解させた。結合”Ｃｒｃｐｍをガンマカウンターで測定した。いくつかの 実験では、接着試験に先立ち、規定のＣ５−１００メデイア（Ｃｅｌｌ　ＳＳ７ ５ｔｅ、　’７シントン州シアトル）中でＩＬ−１β（ｌｎｇ／ｍｌ）またはＴ ＮＦ−β（１０ｎｇ／ｍｌ）と共に６−２４時間に亘り保温することによって内 皮細胞を活性化した。

遊出の過程でリンパ球がいかなるメカニズムを用いるかを知るため、発明者等は 先ずインテグリン・レセプターに対する健常及びＬＡＤリンパ球の表面表現型を 観察した。このデータは表■に示した通りであり、ＬＡＤ細胞が含β１インテグ リンに対して正常な細胞表面表現型を有することを示唆している。予期した通り 、ＬＡＤ患者からのＢ細ＩＨ１β２についてネガティブであったから、ＬＡＤリ ンパ球が内皮細胞に接着し、かつこれを通過する過程で含β１インテグリンを使 用することは明白である。

表　■ 健常及びＬＡＤリンパ球によるインテグリン・レセプター発現の蛍光分析 ａ、蛍光の強さは３０　ｌｏｇスケールで測定さね、任意の単位で表わされ、各 ＋は０−２５５　（チャンネル・ナンバー）からの５ａ単位を示す。＋／−はバ ックグランド（＜５ａ単位）以上の再現可能なずれを示す。

表　■ 静止型及び活性型ＨＵＶＥ単一層への Ｔ及び８９２８球の接着 ＬＡＤ　（Ｂ）　２９３６０　９４５８ＧＳＴ−１（Ｂ）　１１５７２　１４３ ８６０Ｒａｍｏｓ　（Ｂ）　１０８８　１１１６８Ｊ　ｕ　ｒ　ｋ　ａ　ｔ　（ Ｔ）　７４１９６　３５２０２８ＹＴ　（Ｔ）　４３３９６　１８９３８４ａ、 　ｃｐｓ　＝カウンター／１ｎｎ０データは１つの代表的な実験から得たもので ある。

各種細胞系からのＣｒ−標識リンパ球を静止または活性化内皮細胞に接着する能 力に関してテストした（表■）。テストした細胞系はいずれもある程度静止内皮 細胞に接着するが、ＩＬ−１またはＴＮＦによって活性化した内皮細胞へのＴ及 びＢリンパ原液着は１０倍も顕著であることが判明した。内皮細胞へのＬＡＤ患 者リンパ球の接着は健常なり細胞からの５Ｔ−１細胞系と大差がなかった。ＩＬ −１活性化内皮細胞とＴＮＦ活性化内皮細胞への接着については細胞系間に差は 見られなかった。

７、２．３．　内皮細胞へのリンパ球接着に対する抗レセプター抗体の作用 ハイブリドーマ上澄みの存在において内皮細胞へのＣｒ−標識リンパ球接着をテ ストしたところ、α４β１またはβ１ターゲットとするモノクローン抗体だけが 接着を抑止し、基本型フィブロネクチン・レセプターやα３βルセプターなどの ような他のレセプターをターゲットとするモノクローン抗体はほとんど抑止動作 を示さなかった（表■）。（α４β１をターゲットとする）モノクローン抗体Ｐ ４Ｃ２及び（β１をターゲットとする）モノクローン抗体Ｐ４ＣＩＱの存在にお いて内皮細胞へのＣｒ−標識リンパ球接着は完全に制止された。興味深いことに 、ＬＡＤ細胞の接着も抗−α４β１抗体（Ｐ４Ｃ２）によって抑止され、ＣＤｌ ８レセプターが接着性に関与していないことを示唆した。また、α２β１．α５ β１（表■）及び（表には示されていない）β２がリンパ球によって発現させら れたが、これらのレセプターに対する抗体は静止型または活性化ＨＵＶＥｓへの リンパ球接着を抑止しなかった（表■参照）。これらのデータはインテグリン・ レセプターの表面発現及びこのレセプターと抑止性抗体の結合が必ずしも内皮細 胞へのリンパ球接着の抑止とはならないことを示唆するものである。これは遊出 の初期段階として内皮細胞へのリンパ球接着を仲介するα４β１の特異な役割を 暗示する。また、α４β１に対する抗体が内皮細胞へのリンパ球接着を抑止した ことはα４β１に対応のリガンドであるアミノ酸鎖ＥＩＬＤＶＰＳＴ　（表Ｘｌ ！　）も内皮細胞表面に発現するリガンド中に存在するこのアミノ酸鎖へのα４ β１結合を介してリンパ球遊出に関与する可能性を示唆した。

表　■ （ＩＬ−１β活性化）ＨＵＶＥ単一層へのリンパ球接着に対する抑止性モノクロ ーン抗体の作用接着（ｃｐｍ　） 細胞系　抗体　特異性　静穆＋　Ｉ　Ｌ　−Ｉ　ＢＬＡＤ　（Ｂ）　ＳＰ２　１ ９５４２　１０４６７２ＰＩＤ６　α、β、　１５６８８　１１３６９６ＰＩＢ ５　α２β、　１９０６４　９０９１２Ｐ４Ｃ２α４β、　６４５８　３１１１ ３２Ｐ４Ｃ１０β、　６３６０　５２５５２Ｒａｍｏｓ　（Ｂ）　ＳＰ２　９７ ２　１２１５７ＰＩＤ６　α、β、　１１０１１　１１１９６ＰＩＢ５　α２β 、　１２４　１００２８Ｐ４Ｃ２α４β、　４５６　３６８８ Ｐ４Ｃ１０β、　６０４　３１５２ Ｊｕｒｋａｔ　（Ｔ）　ＳＰ２　８３９２４　３７２１５９ＰＩＤ６　α、β、 　８３９５６　４１７５８８ＰＩＢ５　α２β、　６６５８［１４ｇ９９５２Ｐ ４Ｃ２α４β、　２３１０８　１３６６３２Ｐ４Ｃ１０β、　３６８９２　２３ ０４１６？、　２．４．　内皮細胞へのリンパ球接着における活性化内皮細胞へ のＣｒ−標識リンパ球の接着を抑止する合成Ｃ３−１及び誘導ペプチドの能力を 各種ペプチドを使用して測定した。静止または活性化内皮細胞単層へのＴまたは Ｂリンパ原液着に対して合成Ｃ５−１ペプチドは強力な抑止作用を示した（表Ｘ 及びＸＩ）。興味深いことに、Ｅ　Ｉ　ＬＤＶＰＳＴ鎖は静止または活性化ＨＵ ＶＥｓへのリンパ球接着に必要な最小ペプチドであった（表Ｘ及びＸＩ）。Ｒａ ｍｏｓ細胞系などの場合にはＨＵＶＥＳへの接着をＥ　Ｉ　ＬＤＶＰＳＴペプチ ドによって完全に抑止することができた。対照実験（表Ｘ＋）において、基本型 フィブロネクチン・レセプターα５β１に対抗するリガンドであるＲＧＤＳ鎖は 静止または活性化ＨＵＶＥＳへのリンパ球接着を抑止しなかった。

表　Ｘ ＨＵＶＥ’Ｓへのリンパ球接着に対するｃｓ−１及びｃｓ−１誘導ペプチドの作 用 接着（ｃｐｓ　） 細胞系　ペプチド＃　鎖　静止型　＋ＩＬ−１βＬＡＤ　（Ｂ）　２９３Ａ　無 関係　２０８５６　７４０９６３４４　Ｃ５−１１７５００２ｆｉ＋７２３５０ 　ＶＰＳＴ　ＮＤ　１２７Ｈ ３５２Ｅ　Ｉ　ＬＤＶＰＳＴ　ＮＤ　２９８４３５１　ＧＰＥＩＬＤＶＰＳＴ　 ＮＤ　２７２＋９Ｒａｍｏｓ　（Ｂ）　２３９Ａ　無関係　１８５６　１１１３ ２３４１　ＣＳ−１１６６０２Ｂ２８ ３５０　ＶＰＳＴ　ＮＤ　４５６８ ３５２　ＥＩＬＤＶＰＳＴ　ＮＤ　２５８４３５４　ＧＰＥＩＬＤＶＰＳＴ　Ｎ Ｄ　２２６５Ｊ　ｕ　ｒｋａ　ｔ　（Ｔ）　２３９Ａ　無関係　５１０８１　１ ２９８６４３１４　ＣＳ　−１２９５６８７５７７２３５０ＶＰＳＴ　ＮＤ　１ ２７５４１ ３５４−　ＥＩＬＤＶＰＳＴ　ＮＤ　９３０５６表　Ｘ＋ ＨＵＹＥＳへのリンパ球接着に対するｃｓ−１及びペプチドまたはＲＧＤＳの作 用Ｃ３−ＩＦＩ導接着（ｃｐＨ） 細胞系　ペプチド＃　鎖　静止型　＋ＩＬ−ＩＢＪｕｒｋａｔ（Ｔ）　−−１６ １０９２３１４８４８−ＲＧＤＳ　２９８６８８　３５７６１６３４４　ＣＳ− １８２４０４２４８９７６３５０Ｖ　Ｐ　Ｓ　Ｔ　２Ｇ３７１６　３２２２０８ ３５１　ＬＤＶＰＳＴ　１６６９４８　３２６２６０３５２　ＥＩＬＤＶＰＳＴ 　８４４５６　２３４７９６ＬＡＤ　（Ｂ）　− −ＲＧＤＳ　７０６５２　１ｆｉ２ｆ１７６３４４　ＣＳ−１２２９７６５＋５ ６０３５０　ＶＰＳＴ　３Ｂ１７６　９８８６０３５１　Ｌ　Ｄ　Ｖ　Ｐ　Ｓ　 Ｔ　３９７００　９２７９２３５２　ＥＩＬＤＶＰＳＴ　２９９６４　５ｇ７８ ４−　ＲＧＤＳ　１６９２０　２８１０４３４４　ＣＳ　−１１８４４５＋６０ ３５０　Ｖ　Ｐ　Ｓ　Ｔ　４１６８　１５３２０３５１　Ｌ　Ｄ　Ｖ　Ｐ　Ｓ　 Ｔ　３５３２　１５０９２３５２　ＥＩＬＤＶＰＳＴ　１６９６　４９６４表　 Ｘ１１ Ｃ３−１−Ｂ１２優等ペプチドによるフィブロネクチンへのリンパ球接着の抑止 ペプチド　鎖　抑止 ＡＩ３　ＤＥＬＰＱＬＶＴＬＰＨＰＮ　−ＢＩ３　ＬＨＧＰＥＩＬＤＶＰＳＴ　 ＋＋＋３５２　ＥＩＬＤＶＰＳＴ　＋＋＋ ３５４　ＧＰＥＩＬＤＶＰＳＴ　＋＋＋７．３゜検　討 （上記第６節にのべた）実験所見は血漿フィブロネクチン中の対Ｔリンパ０高親 和力結合部位が■Ｃ８領域のＣ８−１部位にあることを強く示唆した。Ｃ３−１ 部分は２５個のアミノ酸から成る（図■）。従って、リンパ球α４βルセプター とフィブロネクチンの結合に関与する最小ペプチド鎖を突き止めねばならなかっ た。最初のステップとして、発明者等はＣ８−１ペプチドを２つの小さいペプチ ドＡ１３及びＢ１２に分割しく図■）、そのいずれかがα４βルセプターとの結 合に関してフィブロネクチンと競合してフィブロネクチンへのリンパ球接着を抑 止するかどうかを検査した。検査データによれば、抑止作用がＣ５−１のカルボ キシ末端部分から誘導されるＢ１２ペプチドにあることが明らかになった。次の ステップとして、発明者等はフィブロネクチン及びＣ５−１（Ｒ８Ａ配合）被覆 表面へのリンパ球接着に対するＢ１２のカルボキシ末端部分からの誘導ペプチド の抑止能力を鎖が短い方から順次測定した。測定データによれば、血漿フィブロ ネクチン及びＣ３−１へのリンパ球接着に関して、α４β１の結合に必要な最小 アミノ酸鎖はＥＩＬＤＶＰＳＴである。

白血球接着欠乏（ＬＡＤ）患者からの多形核白血球（好中球）はβ２インテグリ ン・サブユニットの発現が不足であり、従って、血管内皮細胞への接着に際して 含β２レセプター（ＬＦＡ−１，Ｍａｃ−１またはｐ１５Ｑ／９５）を使用でき ない。従って、これらの患者からの好中球は周辺組織への血流を妨げる。ただし 、ＬＡＤリンパ球は遊出によって内皮細胞を通過し、この疾病を有する患者から 得られる組織中に見出される。従って、このことはリンパ球が血流から周辺組織 へ移る際に含β２インテグリンとは別のメカニズムを利用することを暗示する。

以下に述べる一連の実験は遊出の過程で末梢血液リンパ球が利用するメカニズム を解明するために発明者等が試みたものである。

この実験で、血管内皮細胞へのリンパ球接着におけるα４βルセプターの重要な 役割が明らかになった。

テストされたリンパ球細胞系はいずれも蛍光分析の結果によればα４β１及び／ またはα５β１を発現させ、培養されたヒト請静脈内皮細胞に接着するのが観察 された。この接着はα４β１をターゲットとするモノクローン抗体によってのみ 抑止され、その他のレセプターをターゲットとする抗体はほとんど抑止作用を持 たず、リンパ球と内皮細胞の接着相互作用におけるα４βルセプターの重要性が 明らかになった。

さらにまた、合成Ｃ５−１及び誘導ペプチド（表■。

Ｘ及びＸＩ）は内皮細胞へのリンパ球接着を抑止した。アミノ酸鎖ＥＩＬＤＶＰ ＳＴは相互作用にとって特に重要であることが判明した。なお、リンパ球α４β １が内皮細胞表面のフィブロネクチンと実際に相互作用するかどうかを判断でき なかったことを強調しなければならない。

α４β１が他の非フィブロネクチン蛋白との関連においてペプチドＥ　Ｉ　ＬＤ ＶＰＳＴまたは同様の鎖を認識するということも考えられる。

８、細胞系の寄託 下記の細胞系をＡＴＣＣ，メリーランド州ロックビルに寄託し、下記受入れ番号 を与えられた：細胞系　受入れ番号 Ｐ　４　Ｃ２ＨＢ　−ＩＱ２＋５ Ｐ　４　Ｇ　９　ＨＢ　−１０２１３ Ｐ　３　Ｅ　３　ＨＢ　−１０２１２ Ｐ　４　Ｃ１０ＨＢ　−１０２１４ 本発明は以上に例示した遺伝子及び蛋白または寄託された微生物によってその範 囲を制限されるものではなく、これらは説明の便宜上記述したに過ぎない。以上 の説明及び添付図面から多様な変更実施態様を創出できることは当業者にとって 明白であろう。このような変更は後記する請求の範囲に包含されるものとする。

八 仝 卿 藝 ＦｉＧ、２ 還元剤不在 ＰＩＢ５　Ｐｉ）１５　Ｐ３Ｅ３ ＦＩＧ、３ ＦＩＧ、４Ａ　ＦＩＧ。４８ ＦＩＧ、４ＣＦＩＧ、４Ｄ 堰く 智−一 ＦＩＧ、５Ｂ ＦＩＧ、８ ＤＥＬＰＱＬＶＴＬＰＨＰＮＬＨＧＰＥＩＬＤＶＰＳＴＶＱＫＴＰＦＶＴＨＰＧ ＹＤＴＧＮＧＩＱＬＰ５−ｔ ＦＩＧ、９Ｂ 国際調査報告 Ｉ崗＋−ｍｅ＋ｌ　Ａ帥瞬−１馴−１Ｋ丁／ＵＳ匍ｌ倶９７８ＰｒＴ／Ｉ°Ｓ９ ０１０４９７１１

Claims (39)

【特許請求の範囲】
1. １．α４β１と結合する有効量の抗体またはそのフラグメントまたは誘導体をリ ンパ球に作用させることを特徴とする血管内皮細胞へのリンパ球接着抑止方法。
2. ２．抗体がモノクローン抗体であることを特徴とする請求項１記載の方法。
3. ３．抗体がＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌ ｅｃｔｉｏｎ）に寄託された、受入れ番号がＨＢ−１０２１５のＰ４Ｃ２である ことを特徴とする請求項２記載の方法。
4. ４．抗体がβ１と結合することを特徴とする請求項１記載の方法。
5. ５．抗体がＡＴＣＣに寄託された、受入れ番号がＨＢ−１０２１４のＰ４Ｃ１０ であることを特徴とする請求項４記載の方法。
6. ６．α４β１と結合する有効量のペプチドをリンパ球に作用させることを特徴と する血管内皮細胞へのリンパ球接着抑止方法。
7. ７．血管内皮細胞をターゲットとする抗体にペプチドを接合することを特徴とす る請求項６記載の方法。
8. ８．ペプチドがフィブロネクチンのＩＩＩＣＳ部位の少なくとも一部、またはそ の誘導体を含むことを特徴とする請求項６記載の方法。
9. ９．ペプチドがフィブロネクチンのＣＳ１部位の少なくとも一部、またはその誘 導体を含むことを特徴とする請求項６記載の方法。
10. １０．ペプチドが鎖ＥＩＬＤＶＰＳＴの少なくとも一部、その誘導体またはほぼ 同族の鎖を含むことを特徴とする請求項６記載の方法。
11. １１．血管内皮細胞へのリンパ球接着抑止に使用できることを特徴とする抗体、 または抗体フラグメントまたはその誘導体。
12. １２．α４β１レセプターと結合することを特徴とする請求項１１記載の抗体、 フラグメント、または誘導体。
13. １３．モノクローン抗体であることを特徴とする請求項１２記載の抗体。
14. １４．ＡＴＣＣに寄託された、受入れ番号がＨＢ−１０２１５の、ハイブリドー マによって得られたＰ４Ｃ２であることを特徴とする請求項１３記載の抗体。
15. １５．ＡＴＣＣに寄託された、受入れ番号がＨＢ−１０２１４の、ハイプリドー マによって得られたＰ４Ｃ１０であることを特徴とする請求項１３記載の抗体。
16. １６．モノクローン抗体Ｐ４Ｃ２によって形成されるエピトープを認識すること を特徴とする抗体、またはそのフラグメントまたは誘導体。
17. １７．モノクローン抗体Ｐ４Ｃ２の結合を競合的に抑止することを特徴とする請 求項１６記載の抗体、フラグメントまたは誘導体。
18. １８．モノクローン抗体Ｐ４Ｃ１０によって形成されるエピトープを認識するこ とを特徴とする抗体、フラグメントまたは誘導体。
19. １９．モノクローン抗体Ｐ４Ｃ１０の結合を競合的に抑止することを特徴とする 請求項１８記載の抗体、フラグメントまたは誘導体。
20. ２０．リンパ球の細胞外基質レセプターが血管内皮細胞に接着するのを抑止する 有効濃度の抗体、抗体フラグメント、またはその誘導体を製薬上好適な基剤中に 含有することを特徴とする薬剤。
21. ２１．抗体、フラグメントまたは誘導体がα４β１レセプターと結合することを 特徴とする請求項２０記載の薬剤。
22. ２２．抗体がモノクローン抗体であることを特徴とする請求項２１記載の薬剤。
23. ２３．抗体がＡＴＣＣに寄託された、受入れ番号がＨＢ−１０２１５の、ハイプ リドーマによって得られたＰ４Ｃ２であることを特徴とする請求項２２記載の薬 剤。
24. ２４．抗体がＡＴＣＣに寄託された、受入れ番号がＨＢ−１０２１４の、ハイプ リドーマによって得られるＰ４Ｃ１０であることを特徴とする請求項２２記載の 薬剤。
25. ２５．血管内皮細胞へのリンパ球の接着を抑止する有効濃度のペプチドを製薬上 好適な基剤中に含有することを特徴とする薬剤。
26. ２６．ペプチドがα４β１と結合することを特徴とする請求項２５記載の薬剤。
27. ２７．ペプチドがフィブロネクチンのＩＩＩＣＳ部位の少なくとも一部、または その誘導体を含むことを特徴とする請求項２６記載の薬剤。
28. ２８．ペプチドがフィブロネクチンのＣＳ−１部位の少なくとも一部、またはそ の誘導体を含むことを特徴とする請求項２６記載の薬剤。
29. ２９．ペプチドが鎖ＥＩＬＤＶＰＳＴの少なくとも一部、その誘導体、またはほ ぼ同族の鎖を含むことを特徴とする請求項２５記載の薬剤。
30. ３０．細胞外基質レセプターを介してリンパ球が血管内皮細胞に接着するのを防 止する有効量の抗体、またはそのフラグメントまたは誘導体を治療を必要とする 被験者に投与するすることを特徴とする組織内へのリンパ球移動防止方法。
31. ３１．抗体、フラグメント、または誘導体がα４β１と結合することを特徴とす る請求項３０記載の方法。
32. ３２．抗体がモノクローン抗体であることを特徴とする請求項３１記載の方法。
33. ３３．抗体がＡＴＣＣに寄託された、受入れ番号がＨＢ−１０２１５のＰ４Ｃ２ であることを特徴とする請求項３２記載の方法。
34. ３４．抗体がＡＴＣＣに寄託された、受入れ番号がＨＢ−１０２１４のＰ４Ｃ１ ０であることを特徴とする請求項３２記載の方法。
35. ３５．血管内皮細胞へのリンパ球接着を防止する有効量のペプチドを製薬上好適 な基剤中に含有する薬剤を治療を要する被験者に投与することを特徴とする組織 内へのリンパ球移動防止方法。
36. ３６．ペプチドがα４β１と結合することを特徴とする請求項３５記載の方法。
37. ３７．ペプチドがフィブロネクチンのＩＩＣＳ部位の少なくとも一部、またはそ の誘導体を含むことを特徴とする請求項３６記載の方法。
38. ３８．ペプチドがフィブロネクチンのＣＳ１部位の少なくとも一部、またはその 誘導体を含むことを特徴とする請求項３６記載の方法。
39. ３９．ペプチドが鎖ＥＩＬＤＶＰＳＴの少なくとも一部、またはその誘導体、ま たはほぼ同族の鎖を含むことを特徴とする請求項３６記載の方法。