JPH04501960A - 神経細胞移植 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ４、前記分裂阻止の特徴が分裂の進行に必要な蛋白質の発現の阻害の結果である 、請求項１に記載の細胞系。

５、前記分裂阻止の特徴が化学的もし７くは物理的変異誘発又はウィルス感染の 結果である、請求項１に記載の細胞系。

６、前記変異誘発が、生理的温度以外の温度では現われない温度感受性変異であ る、請求項５に記載の細胞系。

７、神経活性物質の合成及び放出を行うことができる前記特徴が、該神経活性物 質の生産のための代謝経路中の酵素をコードする遺伝子により前記前駆体細胞を 形質転換した結果である、請求項１に記載の細胞系。

８、前記神経伝達物質がドパミンである、請求項７に記載の細胞系。

９、前記分裂阻止の特徴が、ｔ　ｓ　１１遺伝子からのアンチセンス配列により 前記前駆体細胞系を形質転換した結果である、請求項７に記載の細胞系。

１０、前記細胞系がマウス細胞系である、請求項７に記載の細胞系。

１１、前記細胞系がヒトゲノムＤＮＡにより形質転換されそして前記神経活性物 質の合成及び放出について選択されたものである、請求項８に記載の細胞系。

１２、前記神経活性物質が神経伝達物質である、請求項１１に記載の細胞系。

１３、ニューロン細胞の神経活性物質の放出又は合成に対する化合物の効果を決 定するための方法であ７．て、咳二、−ロン細胞が、 （１）吐乳類性であり： （２）中枢神経系の細胞に対して適合性であり；（３）分裂阻止され； （４）神経活性物質の合成及び放出を行うことができ；ここで上記特徴の少なく とも１つが前駆体細胞のイン−ビトロ修飾により付与されたものである、ことを 特徴し、ており、 この方法が、 前記化合物が前記細胞に結合する条件下で該細胞を該化合物と接触せしめ；そし て 神経活性物質の放出又は合成の少なくとも１つに対する前記化合物の効果を決定 する： ことを含んで成る方法。

１４．前記ニューロン細胞が構成物によりトランスフェクトされてチロシンヒド ロシキラーゼの増強された生産をもたらす、請求項１３に記載の方法。

１５、前記神経活性物質が神経伝達物質である請求項１３に記載の方法。

明　細　書 神経細胞移植 本発明の分野は、神経活性物質（ｎｅｕｒｏａｃｔｉｖｅ　５ｕｂｓｔａｎｃｅ ）の合成及び放出、を評価するための変異及び／又は組換ニューロン又は非−ニ ューロン細胞系神経活性物質の合成及び放出に対する化合物の効果、並びに中枢 神経系環境において神経活性物質を提供するための遺伝子操作された細胞の使用 に関する。

背景 衰弱化（ｄｅｂ　ｉ　Ｉ　１ｔａｔ　ｉｎｇ）神経疾患（例えば、パーキンソン 病、ハンチングトン舞踏病、アルツハイマー痴呆及びテンカン）はしばしば特定 の神経解剖学的部位における１又は複数の伝達物質（ｔｒａｎｓａ＋１ｔｔｅｒ ）供給の個渇により特徴付けられる。

この様な個渇はおそらく、特定の神経活性物質の合成を担当するニューロンの漸 進的喪失によるものであろう。従って、この様な疾患の軽減は伝達物質合成能力 を補充することにより達成され得るであろう。この線にそった考えの概略はＬ− ドーパ（パーキンソン病の過程で個渇する伝達物質であるドーパミンの合成前駆 体である）によるパーキンソン病の治療において比較的成功している。不都合な ことに、この治療は短期間の回復のみをもたらす。なぜなら、影響を受けた個体 はドーパミン作動性ニューロンの慢性的喪失を経験し、そして最終的に苦痛の進 行した段階に達し、これにより生き残ったドーパミン合成ニューロンは必要なド ーパミン作動性経路を適切に活性化することができないからである。

従って、神経活性物質、例えば神経伝達物質、例えばＧＡＢＡ（Ｔ−アミノ酪酸 ）、ドーパミン、グリシン、アセチルコリン、ノルエピネフリン（ｎｏｒｅｐｉ ｎｅｐｈｒｉｎｅ）　、エピネフリン（ｅｐｉｎｅｐｈｒｉｎｅ）及びセロトニ ン、並びに神経活性ペプチド、例えばエンケファリン、サブスタンスＰ１ソマト スタチン及び神経成長因子（ＮＧＦ）の合成の研究において使用し得るモデル系 を開発できることに実質的な関心が寄せられている。神経活性物質合成能力を有 する生存天然細胞を提供することにより、神経活性物質合成に関連する種々の機 構を検討することができるのみならず、該細胞を療法において用いることができ 、そして生来的に合成される神経活性物質の量が適、当でない生体内部位におい て神経活性物質の安定供給をもたらす。

概念的には、この方法は、慢性的に衰弱する運動及び情緒障害のより広範な軽減 （それを除去しないにしても）をもたらすであろう。

関連文献 Ｋｕｈｎら（１９８３）、Ｍｏｌ、Ｂｉｏｌ、Ｍｅｄ、　希１　：　３３５−３ ５２は宿主細胞におけるＭＨＣ抗原の機能的発現を記載しており、他方Ｃｈａ。

ら（１９８６）　５ｃｉｅｎｃｅ、　２３２　：　４１８−４２１はｒｎａｉｖ ｅ」宿主の表面上でのＮＧＦ受容体の発現を記載している。クローン化されたラ ットチロシンヒドロキシラーゼ（ｒＴＨ）遺伝子がＢｒｏｗｎら（１９８７）Ｂ ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２６　：　５２０８−５２１２により報告されている 。

Ｔａ１ａｖｅｒａ及びＢａ５ｉｌｉｃｏ　（１９７７）Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｐｈｙｓ ｉｏｌ、　９２：　４２５−４３５は、細胞サイクルのＧ１を通しての発達にお いて３７℃においてブロックされるがしかし３２℃においてはブロックされない ＢＨＫ　２１５ｙｒｉａｎハムスター細胞系を記載している。さらに、変異ＢＨ Ｋ２１細胞系におけるＧ１ブロックの維持を補完するヒ）　ｃＤＮＡのクローニ ングを報告しているＧｒｅｃｏら（１９８７）　Ｐｒｏｃ。

インビトロ修飾の結果として次の性質：神経活性物質の合成及び放出能カニ中枢 神経系環境との適合性；及び細胞分裂が阻止される、の少なくとも１つを有する 哺乳類細胞系が提供される。上記の特徴の１又は複数個を有しそして目的とする 細胞系を提供するようにインビトロ修飾されている利用可能な細胞系が選択され る。次に、この細胞系は、神経活性物質の合成及び放出に影響を与える薬物の評 価、神経活性物質の合成及び放出の機構、並びに神経活性物質のインビボ源とし ての細胞系の療法的用途のために使用することができる。

特定の態様の記載 本発明に従えば、中枢神経系に適合性でありそして神経活性物質の合成及び／又 は放出の発現のために使用することができる。神経活性物質の合成及び放出に関 する代謝経路に対する効果について、生物学的に活性な化合物を研究することが でき、あるいは細胞は、宿主中でのこれらの神経活性物質を欠く部位での１又は 複数の神経活性物質源として役立つことができる。

神経活性物質は神経伝達物質及び神経ペプチドを含み、これらは中枢神経系に影 響を与える化合物である。神経活性物質の検討のためにはＲｅｔｉｎａ　Ｒｅ５ ｅａｒｃｈ　Ｆｏｕｒｄａｔｉｏｎ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ。

ｖｏｌ、　ｉ　、　Ｄｏｍｉｎｉｃ　Ｍ−Ｋ　Ｌａｍ編、１９８８、Ｐｏｒｔｆ ｏｌｉｏ　ＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ、　、ヒユーストン、ＴＸを参照のこと。

本発明の細胞は、中枢神経性の細胞と適合性であり、注目の神経活性物質を合成 及び／又は放出し、そして機能的に生存していながら分裂が阻止されていること により特徴付けられる。さらに、これらの細胞は通常、安定に培養され得るがし かし１又は複数の上記の性質を欠いている細胞に由来する。

現在入手可能であり又は開発することができる広範囲の種類の細胞系を本発明に おいて使用することができる。細胞系は脳、目、中枢及び末梢神経系、例えば神 経、ダリア要素（ｇｌｉａｌ　ｅｌｅｍｅｎｔ）等から得ることができ、ここで 細胞系は分化の中間又は成熟レベルにあるであろう。通常、使用される細胞系は 前記特徴の０又は１個を有し、残りの特性はＤＮＡ源の導入による遺伝的操作の 結果であろう。代表的な細胞系には網膜芽腫、好クローム性細胞腫、神経芽腫、 膠質芽腫及びこれらのバイブリドが含まれる。セルラインの目的に応じ、それは 注目の任意の１乳類細胞系、例えば霊長類、例えばヒト、げっし類、ウシ、ヤギ 、ブタ、イヌ、ネコ等であることができる。

はとんどの場合、使用される細胞は中枢神経系と適合性であり、そして与えられ るべき他の性質の一方又は両方を要求するであろう。その限りで、使用される細 胞系は分裂活性を有しそして機能的に生きており、そして神経活性物質合成／放 出能力を有していてもよく又は有しなくてもよい。

分裂阻止（ｍｉｔｏｔｉｃ　ａｒｒｅｓｔ）を達成するために種々の技法を用い ることができる。１つの方法は古典的な変異誘発を用いる方法である。この変異 誘導は、■もしくは複数の化学物質による処理又は物理的処理であることができ る。化学的変異原にはジー（２−クロロエチル）フルフィト、ジー（２−クロロ エチル）アミン、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソＮ′−二トロソグアニジン、エチル メタンスルホネート、５−ブロモデオキシウリジン等が含まれる。物理的処理に は電磁波照射、例えばＵＶ−線又はＸ−線の照射が含まれる。次に、生理的温度 （３７℃）において分裂阻止をもたらしそして異る温度、通常は約３℃以上異る 温度、好ましくは約４℃以上異る温度において分裂するごとができるクローンを 選択することができる。

分裂阻止はまた、分裂号イクルに関連する１又は複数の遺伝子の発現を阻害する ことによっても達成することができる。

この結果を達成する１つの技法は遺伝子の発現を阻害するために役立つアンチセ ンス配列の使用である。遺伝子の転写物のいずれかの部分に結合する配列を提供 することによって、その遺伝子の発現を、完全には阻害できないにしても実質的 に減少させることができる。例えば、遺伝子ｊｓｌ　ｌ　（Ｇｒｅｃｏら、１９ ８７、前掲）の発現に関連するアンチセンス配列は細胞サイクルの８期に入るこ とと関連するｔｓｌｌ蛋白質の発現を阻害しそしてそれによってＧ１ブロック及 び分裂阻止をもたらすのに役立つであろう。

注目の神経伝達物質にはＧＡＢＡ、ドパミン、グリシン、ノルエピネフリン、エ ピネフリン、アセチルコリン、セロトニン等が含まれる。神経ペプチドにはエン ケファリン、サブスタンスＰ１ソマトスタチン、神経成長因子等が含まれる。特 定の神経活性物質、特に律速酵素の生産のための代謝経路における１又は複数の 遺伝子の発現について選択することにより、神経活性物質の発現又は神経活性物 質の増強された発現をもたらすことができる。細胞系が欠陥のある代謝経路を有 する状況においては、発現のための条件下で適切な制御配列を有する適切な遺伝 子の導入によりその欠陥を正すことができ、それによって神経伝達物質が生産さ れるであろう。

例えば、チロシンヒドロキシラーゼはドーパミンの生産に関与するカテコールア ミン合成経路の律速酵素である。増強されたドーパミン生産をもたらすため、目 的とする神経伝達物質の生産を可能にするであろう内因性又は外来性遺伝子のコ ピーである遺伝子により細胞系を形質転換することができよう。他の神経伝達物 質のため、注目の遺伝子はグルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子及びトリプトフ ァンヒドロキシラーゼ遺伝子を含むであろう。さらに、上記の１又は複数の神経 活性ペプチドは、これらのペプチドの増強された生産を提供するために同様に導 入されそして発現され得るであろう。

目的のＤＮＡ配列を宿主細胞系に導入するため、種々の技法を用いることができ る。注目のＤＮＡ配列及びマーカーを単独で含む裸のＤＮＡを用いそしてリン酸 カルシウム法等により細胞系を形質転換することができる。（Ｇｒａｈａｍ及び Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ　（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５２　：　４５６−４ ６７）あるいは、宿主細胞中で安定な維持が可能なベクター又は細胞の染色体に 一体化するであろうベクターにより宿主細胞をトランスフェクト、トランスジュ ース又はトランスホームすることができる。注目のＤＮＡを宿主細胞に導入する ための種々の手法、例えば侵入性（ｉｎｖａｓｉｖｅ）細菌、ウィルス又はリボ ゾームとの接触、エレクトロポレーション、音波処理／すりつけ、キャリヤー介 在エンドサイト−シス等が存在する。

使用されるＤＮＡ構成物は転写カセット及び選択のためのマーカーを有するであ ろう。マーカーは、しばしばストレス、例えば抗物質、毒素等に対する耐性に基 いて選択をもたらすであろう。選択は、０４１８　、クロラムフェニコール等に より達成することができる。耐性を提供する遺伝子が宿主細胞中で機能するプロ モーターの構成的制御のもとに正常に存在する発現カセットが提供される。マー カーは通常、宿主細胞中で機能するプロモーター、転写されるべきＤＮＡ配列、 及び転写停止領域を含んで成る転写カセットに連結される。

転写カセットのため、プロモーターの選択は望まれる転写のレベルに依存して異 るであろう。例えば、分裂阻止により例示されるようにアンチセンスが使用され る場合、高レベルのアンチセンス配列を提供するように強力なプロモーターが用 いられるであろう。神経活性物質の放出に関心が持たれる場合、神経活性物質の 生産レベルがプロモーターの選択を決定するであろう。

哺乳類細胞のための多数のプロモーターが文献に報告されている。これらにはβ −アクチンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター、グロビンプロモー９− １５ＳＲＮＡプロモーター、長末端反復、又はシマン（Ｓｉｍａｎ）ウィルス、 アテツウイルス、バビロ−７ウイルス等のごときウィルスの後期もしくは前記プ ロモーターが含まれる。

しばしば、２つのカセットが原核細胞、特に反復クローニングのための大腸菌に おいて機能する複製系と一緒に連結されるであろう。幾つかの場合には、構成物 を哺乳類宿主細胞中に勤人する前に原核性配列を除去するのが望ましいであろう 。さらに、安定な保持を提供するように哺乳類宿主中で機能する複製系を用意す るのが有用であろう。種々の複製系、通常は、種々のプロモーターについて前に 示したようなウィルスに由来するウィルス複製系が存在する。特定の機能が望ま れる場合、構成物中に他の機能要素が存在することもできる。

複合構成物を調製した後、それを宿主細胞に導入することができる。導入に続き 、これらの細胞は、宿主細胞中での構成物の存在を示す、１又は複数の薬剤に対 する耐性について選択されるであろう。次にこれらの細胞は目的とする神経物質 の生産についてスクリーニングすることができる。測定は、放射性ラベルされた 代謝中間体を提供することによって、又はイムノアッセイ等により神経活性物質 について直接測定することにより、行うことができる。標準をもうけることによ り、細胞内アルカリホスファターゼ活性を測定して種々の細胞の値を標準化する ことができる。

次に、−次スクリーニングからのクローンは神経活性物質の所望の生産について 選択され、そして神経活性細胞の合成の維持及び再現性を確立するために反復し てクローニングされるであろう。さらに、神経活性物質の放出の誘導機構、例え ば分泌促進剤による誘導、カルシウムの存在下での細胞外カリウムの上昇、又は カルシウムの細胞質レベルの上昇に応答して選択され得る。

二次スクリーニングに続き、各クローンは単細胞培養又は単クローン培養に拡大 される。得られる細胞系は今や神経活性物質の合成及び放出の機構を研究するた めに使用されるであろう。さらに、この細胞系は、神経活性物質の生産及び／又 は放出に影響を与える化合物の種々のアゴニスト又はアンタゴニスト性の評価の ために使用することができる。生理的温度において分裂阻止されるが異る温度に おいて増加することができる温度感受性変異クローンを得ることにより、細胞は インビトロでそして分裂阻止の条件下で使用されるまで連続的に拡張され得る。

細胞は、核細胞により供給され得る１又は複数の神経伝達物質を欠く中枢神経系 、特に脳の部位に移植され得る。外科的移植はよく知られており、そしてドパミ ンの生産のための同系副腎細胞の移植について記載されている。細胞の特定の数 、細胞が特定の部位に導入される態様、使用し得る補助物質、等は当業者の知識 の範囲内であり、そしてここで例示を必要としない。

次に実施例を限定のためではなく例示のために記載する。

実施例 細胞サイクルのＧ１を通っての進行が３７℃においてブロックされる変異体を用 いる宿主として用いられるＢＨＫ１２５ｙｒｉａｎハムスター細胞系を用いる。

この変異体ｔｓｌｌは代謝的欠陥を示さず、Ｇ１においてブロックされるが３３ ℃において細胞サイクルが進行する。この細胞系及び次のヒト細胞系は、ドパミ ンの生産を達成するために実質的に同じ方法で処理される。

ハムスター細胞系及び神経ダリア由来細胞系、例えばＹ７９ヒト網膜芽腫がトラ ンスフェクションのために用いられる。

すでに記載されている（Ｇｒａｈａｍ及びＶａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ、　１９７３． 前掲）条件下で、完全なラットチロシンヒドロキシラーゼ遺伝子がｐｓｖ２．、 。と共に同時トランスフェクトされる。細胞は、選択培地上で６４１８に対する 耐性についてスクリーニングされる。

次に、生き残った細胞を、約１００ｎｔのプローブによりラットチロシンヒドロ キシラーゼ遺伝子とのハイブリダイゼーションについてスクリーニングし、ここ でラットの遺伝子はヒト及びハムスターの遺伝子から容易に区別される。クロー ンのスクリーニングのためにサザン法及びノーサン法が使用され、そして強いハ イブリダイゼーションシグナルを有するクローンがさらなる研究のために使用さ れる。

次に、細胞は溶解され、そしてチロシンヒドロキシラーゼの生産レベルを決定す るためにウェスタンプロットが行われる。

次に、細胞がチロシンヒドロキシラーゼ活性についてスクリーニングされる。

最後に、細胞外及び細胞内のカリウム及びカルシウムの変化に対する応答が決定 され、カテコールアミンの誘導的放出が評価される。

示された特徴を満たすクローンが拡張され、そして均一に再クローニングされる 。さらに修飾して分析阻止を得るために１つのクローンが選択される。

オープンリーディングフレームの少なくとも部分がアンチセンス方向にあるよう にヒトｔｓｌｌ遺伝子が修飾される。ｔｓｌ１５′−非一コード領域及び３′− 非−コード領域が保持される。選択されたクローンは前記のごとくアンチセンス 構成物によりトランスフェクトされる。

次に、クローンが、ナサン法及び３７℃に細胞を保持することにより評価される 分裂阻止を用いて、アンチセンスＲＮＡ転写物の発現についてスクリーニングさ れる。これらの細胞は、その機構が障害されているか否かについて決定するため にさらに評価され、そして少なくとも３ケ月間寿命が評価される。最後に、ウェ スタンプロット及び神経化学的測定を用いることにより、チロシンヒドロキシラ ーゼの連続発現が評価さυ、る、４ 前記の特ｍ　”ｆｉ−６’　するｌｊｌ　）７；１りｒ’ｉ　−ンｈ＜　ｈＺ大 さｉ、−１１、ぞし、−ｒｊ、ｉ）に再りＫｌ−−−ｒンクされ、る。次（４” −１外材的移・植！、乙−！、す１．脳領）城が確立されたドバミ、／欠償・タ イ、Ｘｌ−′る肝Ｔ　Ｐ−処理さイア、Ｉ、二すル属（閏ａｃａｃｕｓ）のどと きＱｆｉ乳類宿−１，０脳領域の基礎神経節１．゛移植される。次に１、パーキ ンソノ症候群に対する該細艙の存在の効果が、既知の神経学的基準を用いて評価 される。

−１ユ記の結果から明らかなように、神経物質の生産及び放出と関連する中枢神 経系の種４の属性を研究するために使用することができる新規な細胞系を提供す ることができる。さらに、これらの細胞は、病変への実質的に正常な応答に従っ て制御可能であり、その結果中枢神経系の部位での本発明の細胞の存在は神経活 性物質の制御されない生産をもたらさないであろう。これらの細胞は、非腫瘍性 でありそして悪性状態への逆転から保護される点において安全である。

本明細書中に記載したすべての公表及び特許出願は本発明が属する分野における 当業者のレベルを示すものである。各個々の公表又は特許出願が特別にそして個 別に引用により組み込まれるように示されているごとく、すべての公表及び特許 出願は引用により本明細書に組み入れられる。

本発明は今や十分に記載され、添付された請求の範囲の本質又は範囲を逸脱する ことなく多くの変更が行われ得ることが当業者に明らかであろう。

圃　党　調　４・ｔ　報　考

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（１）哺乳類性であり； （２）中枢神経系の細胞に対して適合性である；（３）分裂阻止される； （４）神経活性物質の合成及び放出を行うことができ、ここで上記特徴の少なく とも１つが前駆体細胞のイン−ビトロ修飾により付与されたものである、ことを 特徴とずる細胞系。 ２．前記前駆細胞がニューロン細胞由来のものである、請求項１に記載の細胞系 。 ３．前記前駆細胞が非−ニューロン細胞系である請求項１に記載の細胞系。 ４．前記分裂阻止の特徴が分裂の進行に必要な蛋白質の発現の阻害の結果である 、請求項１に記載の細胞系。 ５．前記分裂阻止の特徴が化学的もしくは物理的変異誘発又はウイルス感染の結 果である、請求項１に記載の細胞系。 ６．前記変異誘発が、生理的温度以外の温度では現われない温度感受性変異であ る、請求項５に記載の細胞系。 ７．神経活性物質の合成及び放出を行うことができる前記特徴が、該神経活性物 質の生産のための代謝経路中の酵素をコードする遺伝子により前記前駆体細胞を 形質転換した結果である、請求項１に記載の細胞系。 ８．前記神経伝達物質がドパミンである、請求項７に記載の細胞系。 ９．前記分裂阻止の特徴が、ｔｓ１１遺伝子からのアンチセンス配列により前記 前駆体細胞系を形質転換した結果である、請求項７に記載の細胞系。 １０．前記細胞系がマウス細胞系である、請求項７に記載の細胞系。 １１．前記細胞系がヒトゲノムＤＮＡにより形質転換されそして前記神経活性物 質の合成及び放出について選択されたものである、請求項８に記載の細胞系。 １２．前記神経活性物質が神経伝達物質である、請求項１１に記載の細胞系。 １３．ニューロン細胞の神経活性物質の放出文は合成に対する化合物の効果を決 定するための方法であって、該ニューロン細胞が、 （１）哺乳類性であり； （２）中枢神経系の細胞に対して適合性であり；（３）分裂阻止され； （４）神経活性物質の合成及び放出を行うことができ；ここで上記特徴の少なく とも１つが前駆体細胞のイン−ビトロ修飾により付与されたものである、ことを 特徴しており、 この方法が、 前記化合物が前記細胞に結合する条件下で該細胞を該化合物と接触せしめ；そし て 神経活性物質の放出又は合成の少なくとも１つに対する前記化合物の効果を決定 する； ことを含んで成る方法。 １４．前記ニューロン細胞が構成物によりトランスフェクトされてチロシンヒド ロシキラーゼの増強された生産をもたらす、請求項１３に記載の方法。 １５．前記神経活性物質が神経伝達物質である請求項１３に記載の方法。