JPH08509128A - 外部シグナルへの細胞反応性を調節するための方法および産物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ＭＥＫＫのための単離された核酸配列、ＭＥＫＫアミノ酸配列および蛋白質、ＭＥＫＫに対する抗体、ならびにこのような配列、蛋白質、および抗体を使用するための方法が記載される。ＭＥＫＫ（ＭＥＫキナーゼ）のアミノ酸配列は、６７２のアミノ酸残基（７２キロダルトン）からなる蛋白質をコードするｃＤＮＡ配列から誘導された。ＭＥＫＫが発現される際には、それはＭＥＫをリン酸化および活性化する。ＭＥＫＫによるＭＥＫのリン酸化および活性化は、ＭＥＫをやはりリン酸化する成長因子調節化プロテインキナーゼであるＲａｆに非依存的である。従ってＭＥＫＫおよびＲａｆは、ホルモン、成長因子、および神経伝達因子によるＭＡＰＫの活性化を媒介するプロテインキナーゼネットワーク内のＭＥＫに収束する。

Description

【発明の詳細な説明】 外部シグナルへの細胞反応性を調節するための方法および産物 発明の分野 本発明は、単離化ＭＥＫキナーゼ核酸配列、実質的に純粋なＭＥＫＫ蛋白質、 ならびにＭＥＫＫ、ＭＥＫ、およびＭＡＰＫ酵素の調節および使用に係わる方法 に関する。 発明の背景 マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）（細胞外シグナル調節キ ナーゼすなわちＥＲＫとも称される）は、チロシンキナーゼである成長因子レセ プター（上皮成長因子（ＥＧＦ）レセプターのようなもの）およびトロンビンレ セプターのようなヘテロ三量体のグアニンヌクレオチド結合性蛋白質（Ｇプロテ イン）に結合するレセプターの両方によるリガンド結合に応答して迅速に活性化 される。ＭＡＰＫは、種々の第二メッセンジャーにより伝達される多重細胞内シ グナルを統合するようである。ＭＡＰＫは、酵素、ならびにＥＧＦレセプター、 Ｒｓｋ９０、ホスホリパーゼＡ₂、アラキドン酸代謝物、ｃ−Ｍｙｃ、および恐 らくｃ−Ｊｕｎを初めとする転写因子をリン酸化し、そしてその活性を調節する 。チロシンキナーゼであるレセプターによるＭＡＰＫの迅速な活性化はＲａｓに 依存するものの、ＭＡＰＫのＧ−プロテイン介在性活性化はＲａｓに非依存的な 経路を通して主に生じるらしい。 イーストにおけるフェロモン−誘導性シグナル変換経路の相補性分析により、 ＭＡＰＫのスキゾサッカロミセス ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙ ｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）およびサッカロミセス セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏ ｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）相同物 であるＳｐｋ１およびＦｕｓ３−Ｋｓｓ１の活性を制御するプロテインキナーゼ 系が特定されている（例えば、Ｂ．Ｒ． Ｃａｉｒｎｓ ｅｔａｌ．、Ｇｅｎｅ ｓ ａｎｄ Ｄｅｖ．６、１３０５（１９９２）；Ｂ．Ｊ．Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖ． ６、１２９３（１９９２）； Ｓ．Ａ．Ｎａｄｉｎ−Ｄａｖｉｓｅｔ ａｌ．、ＥＭＢＯ Ｊ．７、９８５（１ ９８８）；Ｙ．Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１、 ３５５４（１９９１）、を参照せよ）。Ｓ．セレビシアエ（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉ ｓｉａｅ ）ではプロテインキナーゼＳｔｅ７は、Ｆｕｓ３−Ｋｓｓ１活性の上流 レギュレーターであり、プロテインキナーゼＳｔｅ１１がＳｔe７を調節する。 Ｓ．ポムベ（Ｓ． ｐｏｍｂｅ）の遺伝子産物であるＢｙｒ１およびＢｙｒ２は 、それぞれＳｔｅ７およびＳｔｅ１１に相同である。ＭＥＫ（ＭＡＰＫキナーゼ もしくはＥＲＫキナーゼ）あるいはＭＫＫ（ＭＡＰキナーゼのキナーゼ）酵素は Ｓｔｅ７およびＢｙｒ１に配列が類似する。ＭＥＫは、チロシンとスレオニンの 両方の残基でＭＡＰＫをリン酸化し、このことがＭＡＰＫの活性化をもたらす。 哺乳類のセリン−スレオニンプロテインキナーゼＲａｆはＭＥＫをリン酸化およ び活性化し、このことがＭＡＰＫの活性化につながる。Ｒａｆは成長因子レセプ ターチロシンキナーゼ活性に応答して活性化され、そしてそのためＲａｆは膜会 合性チロシンキナーゼの刺激化に応答してＭＡＰＫを活性化することができる。 ＲａｆはＳｔｅ１１およびＢｙｒ２とは配列が無関係である。従ってＲａｆは、 イーストにおいて特定されるフェロモン−反応性プロテインキナーゼ系からの哺 乳類細胞における分岐を表すことができる。ＭＡＰＫの調節における細胞および レセプター特異 性の差異は、哺乳類のＭＥＫの他のＲａｆ非依存的レギュレーターが存在するこ とを示唆する。 発明の要約 本発明は、新規の遺伝子、表示されるＭＥＫＫ、もしくは哺乳類のＭＥＫキナ ーゼに関する。ＭＥＫＫの調節は分化および有糸分裂誘発に係わる様々な治療的 適用に有用である。具体的には本発明は、マイトジェン活性化プロテインキナー ゼ（ＭＡＰＫ）に関し、本発明者が発見したこのプロテインキナーゼはＭＥＫＫ により活性化される。ＭＡＰＫは酵素および／または転写因子をリン酸化し、そ してその活性を調節することが知られているため、本発明はＭＥＫＫをコードす る核酸配列の操作、および／または所望の細胞集団へのＭＥＫＫの投与のいずれ かを介するそのような活性の調節に関する。本発明はまた、所望のレベルのＭＡ ＰＫ活性をもたらし、そしてチロシンキナーゼのような成長因子レセプターおよ びトロンビンレセプターのようなＧプロテインに結合するレセプターの両方によ るリガンド結合への典型的な応答を変化させるためのＲａｆおよびＭＥＫＫによ る二重調節に関する。従って本発明は、実質的に純粋なＭＥＫＫ、ＭＥＫＫをコ ードする単離化核酸配列、ＭＥＫＫ遺伝子で形質転換させた宿主細胞、およびＭ ＥＫＫ蛋白質に対する抗体に関する。更に本発明は、成長因子レセプターおよび Ｇプロテイン結合性レセプターによるリガンド結合への応答を調節するためにＭ ＥＫＫ遺伝子を使用する遺伝子療法にも関する。 本発明の一つの態様は、転移、様々な形態の癌、自己免疫疾患、アレルギー性 応答、および炎症性応答を阻害するためのＭＥＫＫの不活化を必要とする。他の 態様は、創傷治癒活性を容易にさせるためのＭＥＫＫ 産物の剌激化を必要とする。従って本発明は、肺および様々な他の組織における 炎症性応答時に、好中球、マクロファージ、好塩基球細胞の活性を制御するのに 有用である。本発明は、血小板活性化因子およびトロンビンレセプターにより調 節される経路に影響を与えるのに有用である。本発明はまた、脈管形成および一 定の種類の腫瘍、具体的には肺癌および他の上皮癌の阻害、ならびに平滑筋およ び動脈組織の治療における適用を見いだしている。その上、本発明を使用して好 中球およびマクロファージの走化性応答を阻害し、同様にアレルギー応答を改善 することができる。 本発明はまた、神経親和性成長因子として作用することにより分化および有糸 分裂誘発の刺激化を達成して、例えばパーキンソン病およびアルツハイマー病の ような特定の種類の細胞の萎縮を緩和することができる遺伝子療法におけるＭＥ ＫＫ遺伝子の使用をも含む。 他の態様においてはＭＥＫＫを、スクリーニングアッセイを用いることによる 癌遺伝子および腫瘍作用物質についてのスクリーニング法として使用してこのよ うな蛋白質がＭＥＫＫにより活性化されるか否かを決定する。ＭＥＫＫに対して 作成される抗体を使用して、所定の癌および自己免疫疾患に関与する可能性のあ るＭＥＫＫの発現レベルにおける変化を決定することができる。 本発明人はリガンドがＢ細胞もしくはＴ細胞の表面レセプターに結合する時期 を認識しており、ＭＥＫＫはそのレセプターの連結から生じる主なリン酸化産物 である。ＭＥＫＫはそれ自体、Ｔ細胞およびＢ細胞のシグナル変換経路における 主要調節蛋白質であると考えられている。従ってＭＥＫＫ発現の調節は、Ｔおよ びＢ細胞の増殖および分化の調節に有 用であると考えられる。 ＭＥＫＫを使用して診断的および治療的適用における使用のための抗体を産生 することができる。例えば、ＭＥＫＫに対する抗体を使用して、ＭＥＫＫにより 活性化される腫瘍細胞発現性腫瘍蛋白質についてのスクリーニングを行うことが できる。 本発明の他の態様では、ＭＥＫＫ蛋白質をインビトロでの細胞増殖、有糸分裂 誘発、および分化の剌激化のために用いることができる。例えば、拡張および分 化させることが所望される細胞のいずれかの具体的な集団は、このような細胞を ＭＥＫＫの有効量に露出することにより達成することができる。 本発明の更に他の態様ではＭＥＫＫ蛋白質を、抗炎症性応答に影響をもたらす ための所望される細胞への投与に適する製剤で提供することができる。 本発明の他の態様では、宿主細胞をＭＥＫＫ遺伝子で形質転換させる。従って ＭＥＫＫ遺伝子は、癌、自己免疫疾患、神経性疾患、筋肉性疾患、アレルギー性 疾応答、および炎症性応答を初めとする様々な疾患の治療のための遺伝子療法に おける道具として有用である。本明細書に用いられる際に「遺伝子療法」は、所 望の遺伝子をある具体的な細胞集団に輸送してこのような細胞集団内の遺伝子の 発現に影響をもたらすことを意味する。 図面の簡単な記述 図１Ａは、数々の細胞株およびマウス組織における単一な７．８ｋｂＭＥＫＫ ｍＲＮＡのノザン（ＲＮＡ）ブロットである。 図１Ｂは、ＭＥＫＫ遺伝子のサザン（ＤＮＡ）ブロットを示す。 図１Ｃは、齧歯類細胞株における７８−ｋｄおよび５０−ｋｄ形態のＭＥＫＫ の発現を示す免疫ブロットである。 図２Ａは、ＭＥＫＫでトランスフェクトさせたＣＯＳ細胞内のＭＡＰＫの活性 化を示す。 図２Ｂは、ベクター単独（対照）、あるいはＭＥＫＫをコードするべクターで 形質転換させた、ＥＧＦで処理したかもしくは未処理の細胞中のＭＥＫＫの発現 を示す免疫ブロットである。 図３は、ＭＥＫＫでトランスフェクトさせたＣＯＳ細胞中のＭＥＫの活性化お よびリン酸化を示す。 図４Ａは、ＭＥＫＫによるＭＥＫ−１のリン酸化を示す。 図４Ｂは、ＣＯＳ細胞中で発現されるＭＥＫＫによるＭＥＫ−１のリン酸化の 時間経過を示す。 図４Ｃは、ＣＯＳ細胞中で過剰発現されるＭＥＫＫの免疫ブロットである。 図５Ａは、活性化されるＭＥＫ−１によるＭＡＰＫのリン酸化を示す。 図５Ｂは、免疫沈降化されるＭＥＫＫによるＭＥＫ−１のリン酸化を示す。 図６Ａは、活性化されるＲａｆによるＭＥＫ−１のリン酸化を示す。 図６Ｂは、ＥＧＦで処理され、ＭＥＫＫを過剰発現するＣＯＳ細胞中のＲａｆ の活性を示す。 図７は、ＭＥＫＫ抗血清を用いるＭＥＫＫ蛋白質の免疫沈降を示す。 図８は、免疫沈降化ＭＥＫＫもしくはＲａｆ−Ｂによるキナーゼ不活性ＭＥＫ −１のリン酸化を示す。 図９は、ＥＧＦで刺激化したＭＥＫＫおよびＲａｆ−Ｂの活性化の時 間経過を示す。 図１０は、ＭＥＫＫ免疫沈降物からのＲａｆ−Ｂの免疫枯渇を示す。 図１１は、Ｒａｆ−Ｂの免疫枯渇がＲａｆ−Ｂの活性を減少させることを示す 。 図１２は、優性のネガティブＮ¹⁷ＲＡＳ発現によるＭＥＫＫおよびＲａｆ−Ｂ の活性化の阻害を示す。 図１３は、ホルスコリン（ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ）によるＭＥＫＫのＥＧＦ活性 化の阻害を示す。 図１４は、脊椎動物およびイーストのシグナル経路の概略図である。 図１５は、切断化ＭＥＫＫ分子による改善化ＭＥＫＫ活性を示す。 発明の詳細な記述 本発明は、細胞中のシグナル変換を調節することが可能な新規のＭＥＫＫ蛋白 質に関する。本発明のＭＥＫＫ蛋白質は全長のＭＥＫＫ蛋白質もしくはＭＥＫＫ 蛋白質の一部分を含むことができる。本発明のＭＥＫＫ蛋白質はＭＥＫ蛋白質を リン酸化することおよび／またはＭＥＫＫキナーゼ活性を阻害することが可能で ある。本発明のＭＥＫＫ蛋白質はＭＥＫＫ触媒ドメインの少なくとも一部分を含 み、そのためその蛋白質がＭＥＫ蛋白質をリン酸化することが可能となり、かつ ／またはＭＥＫＫ調節ドメインの少なくとも一部分を含み、そのためその蛋白質 がＭＥＫＫキナーゼ活性を阻害することが可能となることが好ましい。 Ｓｔｅ１１およびＢｙｒ２核酸配列を使用して哺乳類のＭＥＫキナーゼ（ＭＥ ＫＫ）ｃＤＮＡを同定した。Ｓｔｅ１１およびＢｙｒ２遺伝子間の配列相同性の 領域に相当する非反復の縮重イノシンオリゴデオキシヌクレオチドを設計した。 プライマー、およびＮＩＨ ３Ｔ３細胞から のポリアデニル化ＲＮＡから取得されるｃＤＮＡ鋳型を用いて３２０塩基対（ｂ ｐ）のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅産物を単離し、そしてこれがＳｔｅ １１ およびＢｙｒ２の両方に対して配列が類似することを見いだした。この３２ ０ｂのｃＤＮＡをプローブとして用いて、マウス脳のｃＤＮＡライブラリーから ３２６０ｂｐのＭＥＫＫ ｃＤＮＡ（本明細書ではＭＥＫＫ１として引用される ）を同定した。ＭＥＫＫ１のヌクレオチド配列を二本鎖ＤＮＡのジデオキシヌク レオチド配列決定により決定した。ＭＥＫＫ１についての核酸配列および翻訳さ れるアミノ酸配列を表１に示す。 追加的な独特なＭＥＫＫ蛋白質であるＭＥＫＫ２、ＭＥＫＫ３、およびＭＥＫ Ｋ４をＰＣＲにより同定した。ＭＥＫＫ１のアミノ酸配列と比較するＭＥＫＫ２ およびＭＥＫＫ３についてのアミノ酸配列を表２に示す。 太字のアミノ末端−調節ドメイン 下線を施してある配列−調節ヒンジ配列 太字イタリック−触媒ドメイン ＭＥＫＫ４のキナーゼドメインのアミノ酸配列を、ＭＥＫＫ１、ＭＥＫＫ２、お よびＭＥＫＫ３のキナーゼドメインと比較して表３に示す。 表１を参照し、開始コドンについてのＫｏｚａｋ共通配列に基づくと、開始用 のメチオニンはヌクレオチド４８６に生じることを予想することができる。この メチオニンで開始すると、このｃＤＮＡは７３ｋＤの分子サイズに相当する６７ ２アミノ酸の蛋白質をコードする。位置４４１には他の読み枠内メチオニンが存 在し、これはＫｏｚａｋ規則には従わないが、６８７のアミノ酸残基（７４．６ ｋＤ）を生じるであろう。このサイズ範囲はＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電 気泳動（ＰＡＧＥ）および免疫ブロットにより決定されるＭＥＫＫの７８〜８０ ｋＤの見かけの分子サイズに対応する。 ＭＥＫＫ蛋白質の一次配列は２つの機能的ドメインを示唆し、それらは、（ｉ ）調節的役割を担う可能性があるセリンおよびスレオニンに富むＮＨ₂−末端部 分、および（ｉｉ）ＣＯＯＨ−末端プロテインキナーゼ触媒ドメイン、である。 ＮＨ₂−末端の４００アミノ酸の内の２０パーセントがセリンもしくはスレオニ ンである一方で、２つのみのチロシンが存在する。プロテインキナーゼＣによる リン酸化の幾つかの可能な部位がＮＨ₂−末端領域に含まれることが明白である が、ＭＥＫＫ配列内にはＳＨ２もしくはＳＨ３ドメインは全くコードされていな い。触媒ドメインはＭＥＫＫのＣＯＯＨ−末端側半分に位置している。 ＭＥＫＫは、数々の細胞株およびマウス組織内に発現される７．８ｋＤのｍＲ ＮＡによりコードされる。図１Ａは、数々の細胞株およびマウス組織内の単一な ７．８−ｋｂ ＭＥＫＫ ｍＲＮＡのノザン（ＲＮＡ）ブロットを示す。臭化エ チジウム染色により示されるように等量（２０μｇ）の総ＲＮＡをゲルにかけた 。ブロットは、ＭＥＫＫキナーゼドメインの一部分をコードする３２０−ｂｐの ｃＤＮＡ断片もしくはＭＥＫＫのＮＨ₂末端領域の一部分をコードする８５８− ｂｐ断片のいずれかで探索した。ＭＥＫＫのｍＲＮＡはマウスの心臓および脾臓 ではかなり発現される一方で、肝臓には低い量が存在する。７．８ｋｂのＭＥＫ Ｋ ｍＲＮＡは、ＭＥＫＫのｃＤＮＡの５’および３’末端の両方から取得され るプローブで同定した。従って、ＭＥＫＫのｃＤＮＡは、約４ｋｂの仮定的な非 翻訳配列を失っている。 ＭＥＫＫは単一遺伝子の産物であると考えられる。図１ＢはＭＥＫＫ遺伝子の サザン（ＤＮＡ）ブロットを示す。マウスゲノムＤＡＮ（１０μｇ）をＢａｍ ＨＩ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、もしくはＥｃｏ ＲＩのい ずれかで消化し、そしてゲルにかけた。ブロットをＭＥＫＫ遺伝子の３２０−ｂ ｐ断片で探索した。Ｂａｍ ＨＩとＨｉｎｄ ＩＩＩとの消化物における一本の バンドの出現は、ＭＥＫＫは一つの遺伝子によりコードされることを示唆する。Ｅｃｏ ＲＩ消化物における２本のバンドの出現は、そのプローブがまたがるイ ントロン配列内のＥｃｏ ＲＩ部位が存在するらしいことを示す。ＭＥＫＫ ｍ ＲＮＡはマウスの心臓および脾臓内でかなり発現される一方で、肝臓内には低い 量が存在する。７．８ｋｂのＭＥＫＫ ｍＲＮＡが、ＭＥＫＫ ｃＤＮＡの５’ および３’末端の両方から取得されるプローブで同定された。従って、ＭＥＫＫ のｃＤＮＡは約４ｋｂの仮定的な非翻訳配列を失っている。 ＭＥＫＫのＣＯＯＨ−末端から取得される１５アミノ酸ペプチドＤＲＰＰＳＲ ＥＬＬＫＨＰＶＥＲ に対する親和性精製化抗体で探索した細胞溶菌物の免疫ブ ロットは、７８ｋＤに遊走する顕著なバンドを特定した。 図１Ｃは、齧歯類の細胞株内のＭＥＫＫの７８−ｋＤおよび５０−ｋＤ形態の 発現の免疫ブロットを示す。可溶性細胞性蛋白質（１００μｌ）もしくは組換え ＭＥＫＫ ＣＯＯＨ−末端融合蛋白質（３０μｌ）を、親和性精製化ＭＥＫＫ抗 体（１：３００希釈）での免疫ブロットのためのゲルにかけた。クロム親和性細 胞腫（ＰＣ１２）、Ｒａｔ １ａ、およびＮＩＨ ３Ｔ３細胞は同じ７８−ｋＤ の免疫反応性蛋白質を含み、これはしばしばＳＤＳ−ＰＡＧＥ上では二重線とし て遊走する。顕著な５０−ｋＤ免疫反応性種も共通して存在するが、調製毎にそ の強度が変化する。これは７８−ｋＤ蛋白質の蛋白質分解断片であると考えられ る。免疫ブロット上での７８−および５０−ｋＤの免疫反応性バンドの両方 の可視像は、１５−アミノ酸ペプチド抗原のその抗体とのインキュベーションに より阻害された。免疫ブロットにより検出されるＭＥＫＫ蛋白質はＭＥＫＫ ｃ ＤＮＡの読み取り枠から予測される分子サイズに類似している。 ＭＥＫＫ蛋白質をＣＯＳ−１細胞内で発現させて、ＭＡＰＫを含むシグナル変 換系を調節することにおけるその機能を特定した。図２Ａを参照すると、ＭＥＫ ＫがＣＯＳ−１細胞内で過剰発現された際には、ＭＡＰＫ活性は、ＭＥＫＫ ｃ ＤＮＡ挿入断片を欠くプラスミドでトランスフェクトさせた対照細胞におけるも のと比較して４〜５倍高かった。１００ｍｍの培養皿内のＣＯＳ細胞をｐＣＶＭ Ｖ５発現ベクター単独（１μｇ：対照）もしくはｐＣＶＭＶ５ ＭＥＫＫ構築物 （１μｇ：ＭＥＫＫ）のいずれかでトランスフェクトさせた。４８時間後に、細 胞をウシ血清アルブミン（０．１パーセント）を含む無血清培地内に１６〜１８ 時間入れて休止を誘導した。その後に細胞をヒトＥＧＦ（３０ｎｇ／ｍ１）（＋ ＥＧＦ）もしくは緩衝液（対照）で１０分間処理し、冷却リン酸緩衝化食塩水（ ＰＢＳ）中で２回洗浄し、そして５０ｍＭのβ−グリセロリン酸エステル（ｐＨ ７．２）、１００μＭのバナジン酸ナトリウム、２ｍＭのＭｇＣｌ₂、１ｍＭの ＥＧＴＡ、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（０．５パーセント）、ロイペプチン（２μ ｇ／ｍｌ）、アプロチニン（２μｇ／ｍｌ）、および１ｍＭのジチオスレイトー ル（６００μｌ）を含む細胞溶菌緩衝液内で溶菌させた。ミクロフュージ内での 最大速度で１０分間の遠心後、０．５〜１ｍｇの可溶性蛋白質を含むＣＯＳ細胞 溶菌物をＭＯＮＯ ＱカラムでのＦＰＬＣに供し、そして溶出分画をＭＡＰＫ活 性についてアッセイした。ＭＡＰＫの活性化は、血清が剥奪さ れかついずれかの添加成長因子の非存在下にあるＣＯＳ細胞内で生じた。ＭＡＰ Ｋの活性は、ＥＧＦでの対照細胞の刺激化後に観察されるものに類似していた。 一時的にＭＥＫＫを過剰発現するＣＯＳ細胞のＥＧＦでの刺激化は、ＭＥＫＫ発 現単独に関して観察されたものと比較してＭＡＰＫ活性をわずかに増加したに過 ぎなかった。 ＭＥＫＫ蛋白質は、免疫ブロットによりトランスフェクト化ＣＯＳ細胞内で検 出された。図２Ｂは、ベクター単独（対照）、あるいはＭＥＫＫをコードするベ クターでトランスフェクトさせ、ＥＧＦで処理したかもしくは未処理の細胞内で のＭＥＫＫの発現を示す免疫ブロットを示す。ＣＯＳ細胞からの等量（１００μ ｇ）の可溶性蛋白質溶菌物を免疫ブロット用のゲル上に置いた。対照ＣＯＳ細胞 からの溶菌物中には５０−ｋＤのＭＥＫＫのみが検出された。ＣＯＳ細胞内での ＭＥＫＫの一過性発現は顕著な８２ｋＤのバンドを生じ、これはＰＣ１２、Ｒａ ｔ １ａ、もしくはＮＩＨ ３Ｔ３細胞において観察されたものと比較して若干 大きかった。これは、翻訳の開始用の位置４８６よりはむしろ位置４４１のメチ オニンの使用からもたらされるものと考えられる。８２ｋＤのＭＥＫＫ以上のバ ンドはＭＥＫＫのリン酸化からもたらされるようである。８２−ｋＤのＭＥＫＫ 以下のバンドの群は蛋白質分解からもたらされると思われる。免疫ブロット中の １５−アミノ酸ＭＥＫＫペプチド抗原の抗血清への添加は全ての免疫反応性バン ドの検出を妨げたが、これらのバンドは対照ＣＯＳ細胞の抽出物中には検出され ず、このことはそれらが発現化ＭＥＫＫ蛋白質に由来することの表れである。 ＣＯＳ細胞中のＭＥＫＫの発現は、ＭＡＰＫをリン酸化および活性化するキナ ーゼであるＭＥＫを活性化することを見いだした。組換えＭＡ ＰＫを使用して、Ｍｏｎｏ Ｓカラムでの高速蛋白質液体クロマトグラフィー（ ＦＰＬＣ）により分画化されたＣＯＳ細胞溶菌物中のＭＥＫ活性をアッセイした 。（キセノプス ラエビス）（ゼノパス レービス）（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅ ｖｉｓ ）からのｐ４２ ＭＡＰＫをコードするｃＤＮＡをｐＲＳＥＴＢ発現ベク ター内にクローン化した。この構築物を大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ ｌｉ ）ＢＬ２１（ＤＥ３）のＬｙｓＳ株内での、ＮＨ₂−末端にポリヒスチジン 配列を含むｐ４２ ＭＡＰＫ融合蛋白質の発現のために用いた。発現プラスミド を含む培養物は３７℃下で、０．７〜０．９の６００ｎＭでの光学密度にまで増 殖させた。イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（０．５ｍＭ）を添加し て融合蛋白質合成を誘導し、そしてこの培養物を３時間インキュベー卜した。そ の後に細胞を回収し、そして凍結、解凍、および超音波処理によって溶菌させた 。この溶菌物を１０，０００ｇで１５分間、４℃で遠心した。その後に上清をＮ ｉ²⁺−電荷セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）樹脂に通し、そして可溶性組換 えＭＡＰＫをリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）中で溶出させた。精製され た組換えＭＡＰＫは８０パーセント以上純粋であった。精製された組換えＭＡＰ ＫはＭＥＫのための基質として役立ち、そしてＥＧＦレセプターの残基６６２〜 ６８１（ＥＧＦＲ^662〜681）からなるペプチドのリン酸化の触媒反応を行う。 一時的にＭＥＫＫでトランスフェクトさせたＣＯＳ細胞、ｍｏｃｋ−トランス フェクト化（対照）ＣＯＳ細胞、もしくはｍｏｃｋ−トランスフェクトさせかつ ＥＧＦ（３０ｎｇ／ｍｌ） （＋ＥＧＦ）で処理したＣＯＳ細胞からの可溶性細 胞溶菌物をＭｏｎｏ Ｓカラム上でのＦＰＬＣ により分画化し、そして内因性ＭＥＫ活性を測定した。内因性ＭＡＰＫは分画２ 〜４内に溶出される一方で、ＭＥＫは分画９〜１３内に含まれていた。内因性Ｍ ＥＫ活性をアッセイするために細胞を冷却ＰＢＳ中で２回洗浄し、そして５０ｍ Ｍのβ−グリセロリン酸エステル、１０ｍＭの２−Ｎ−モルホリノエタン−硫酸 （ｐＨ６．０）、１００μＭのバナジン酸ナトリウム、２ｍＭのＭｇＣｌ₂、１ ｍＭのＥＧＴＡ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（０．５パーセント）、ロイペプチ ン（５μｇ／ｍｌ）、アプロチニン（２μｇ／ｍｌ）、および１ｍＭのジチオス レイトールを含む６５０μｌの溶液中で溶菌させた。ミクロフュージ内で最大速 度で１０分間遠心させた後に、可溶性細胞溶菌物（１〜２ｍｇの蛋白質）を、溶 出緩衝液（５０ｍＭのβ−グリセロリン酸エステル、１０ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ６ ．０）、１００μＭのバナジン酸ナトリウム、２ｍＭのＭｇＣｌ₂、１ｍＭのＥ ＧＴＡ、および１ｍＭのジチオスレイトール）内で平衡化させたＭｏｎｏ Ｓカ ラムにかけた。このカラムを緩衝液（２ｍｌ）で洗浄し、そして結合蛋白質を溶 出緩衝液中の０〜３５０ｍＭのＮａＣｌの３０ｍｌの直線濃度勾配液で溶出させ た。各分画の一部分（３０μｌ）を、４０μｌの最終容積中の緩衝液（２５ｍＭ のβ−グリセロリン酸エステル、４０ｍＭのＮ−（２−ヒドロキシエチル）ピペ ラジン−Ｎ’−（２−エタノール硫酸）（ｐＨ７．２）、５０ｍＭのバナジン酸 ナトリウム、１０ｍＭのＭｇＣｌ₂、１００μＭのγ−³²Ｐ−ＡＴＰ（３０００ 〜４０００ｃｍｐ／ｐモル）、インヒビタープロテイン−２０（ＩＰ−２０；Ｔ ＴＹＡＤＦＩＡＳＧＲＴＧＲＲＮＡＩＨＤ；２５μｇ／ｍｌ）、０．５ｍＭのＥ ＧＴＡ、組換えＭＡＰキナーゼ（７．５μｇ／ｍｌ）、および２００μＭのＥＧ ＦＲ^662〜681）と混合すること によりＭＥＫ活性についてアッセイした。３０℃で２０分間インキュべートした 後に、ＥＧＦＲ^662〜681内へのγ−32Ｐ−ＡＴＰの取り込みを測定した。このア ッセイにおいては添加された組換えＭＡＰＫを活性化させる各カラム分画の能力 を、ＥＧＦレセプター（ＥＧＦＲ）に由来するペプチドであるＭＡＰＫ基質内へ のγ−³²Ｐ−ＡＴＰの取り込みにより測定した。図３を参照すると、溶出される 活性の第一ピークは、ＥＧＦＲペプチド基質を直接リン酸化する内因性の活性化 ＭＡＰＫを表す。 活性の第二ピークはＣＯＳ細胞内の内因性ＭＥＫを表す。内因性ＭＥＫ活性は Ｍｏｎｏ Ｓ ＦＰＬＣの分画化により特徴決定した。図４Ａは、内因性ＭＥＫ はＭＥＫＫを過剰発現する細胞内で活性化されることを示し、ＭＥＫの活性はＥ ＧＦで刺激化された調節細胞において観察されるものの約半分であった。従って ＭＥＫＫの発現はＭＥＫを活性化することによりＭＡＰＫを活性化するようであ る。 ＣＯＳ細胞溶菌物をＭｏｎｏ ＱカラムでのＦＰＬＣにより分画化して、発現 されるＭＥＫＫを部分的に精製した。その後に精製化組換えＭＥＫ−１をγ−³² Ｐ−ＡＴＰの存在下においてＭＥＫＫのための基質として用いて、ＭＥＫＫが直 接ＭＥＫ−１をリン酸化するか否かを決定した。 ＭＥＫ−１をコードするｃＤＮＡを、ポリメラーゼ連鎖反応、ならびにＭＥＫ −１の５’コーディング領域および３’非翻訳領域の部分に相当するオリゴデオ キシヌクレオチドプライマーを用いてマウスＢ細胞のｃＤＮＡから取得した。触 媒的に不活性なＭＥＫ−１をＬｙｓ³⁴³のＭｅｔへの部位特異的突然変異誘発に より作成した。野生型のＭＥＫ−１および触媒的に不活性なＭＥＫ−１蛋白質を 、それらのＮＨ₂−末端に ポリヒスチジン配列を含む組換え融合蛋白質としてｐＲＳＥＴＡ内で発現させた 。 ＭＥＫＫでトランスフェクトしたＣＯＳ細胞もしくはｍｏｃｋ−トランスフェ クト化（対照）ＣＯＳ細胞からの溶菌物を先に記載するＭｏｎｏ Ｑカラムでの ＦＰＬＣに供した。ＭＥＫＫを含む分画の一部分（２０μｌ）を、５０ｍＭのβ −グリセロリン酸エステル（ｐＨ７．２）、１００μＭのバナジン酸ナトリウム 、２ｍＭのＭｇＣｌ₂、１ｍＭのＥＧＴＡ、５０μＭのＡＴＰ、ＩＰ−２０（５ ０μｌ）、および１０μのγ−³²Ｐ−ＡＴＰを含む緩衝液と４０μｌの反応容積 で混合し、そして４０分間、触媒的に不活性な組換えＭＥＫ−１（１５０ｎｇ） （キナーゼ−ＭＥＫ−１）の存在下（＋）および非存在下（−）でインキュベー トした。反応は、５×ＳＤＳ試料用緩衝液（１０μｌ）の添加により停止させ、 １×ＳＤＳ緩衝液は、２％のＳＤＳ、５パーセントのグリセロール、６２．５ｍ Ｍのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、５パーセントのβ−メルカプトエタノール 、および０．００１パーセントのブロモフェノールブルーを含む。試料を３分間 沸騰させ、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーに供した。自 己リン酸化された組換え野生型ＭＥＫ−１（ＷＴ ＭＥＫ−１）はリン酸化され た触媒的に不活性なＭＥＫ−１と共に共遊走した。ＭＥＫＫはＭＥＫ−１をリン 酸化することが可能であった。しかしながら対照細胞からの溶菌物の対応分画は ＭＥＫ−１をリン酸化することが可能ではなかった。触媒的に不活性なＭＥＫ− １の修飾化形態をリン酸化アッセイに用いて、それが野生型ＭＥＫ−１がそうで あるようには自己リン酸化しないことを確認した。触媒的に不活性なＭＥＫ−１ のＭＥＫＫによるリン酸化は時間依存的であ り（図４Ｂ）、ＭＥＫＫもリン酸化された。Ｍｏｎｏ Ｑカラム（２０μｌ）で のＦＰＬＣからの分画２２を指示時間の間、触媒的に不活性な組換えＭＥＫ−１ （０．１５μｇ）と共にもしくはそれなしでインキュベートした。キナーゼＭＥ Ｋ−１およびＭＥＫＫのリン酸化は５分後には可視化され、そして約２０分後に は最大に達した。ＭＥＫＫのリン酸化における時間依存的増加はＳＤＳ−ＰＡＧ Ｅ中のＭＥＫＫ蛋白質の移動度の減少に対応していた。免疫ブロットは、ＭＥＫ Ｋ蛋白質がＭＥＫをリン酸化する活性のピーク（分画２２）と共に共溶出される （Ｍｏｎｏ ＱカラムでのＦＰＬＣ後）ことを示した（図４Ｃ）。ＭＥＫＫのゆ っくり遊走する種も免疫ブロットにより検出された。 過剰発現されるＭＥＫＫによるＭＥＫのリン酸化がＭＥＫの活性化をもたらす か否かを決定するために、野生型組換えＭＥＫ−１および触媒的に不活性なＭＡ ＰＫの修飾化形態を結合アッセイ系に用いた。ＣＯＳ細胞溶菌物をＭｏｎｏ Ｑ −ＦＰＬＣにより分離し、そしてＭＥＫＫを含む分画を、添加された野生型ＭＥ Ｋ−１を活性化してその野生型ＭＥＫ−１がγ−³²Ｐ−ＡＴＰの存在下で触媒的 に不活性な組換えＭＡＰＫをリン酸化する能力についてアッセイした。ＭＥＫＫ でトランスフェクトさせたＣＯＳ細胞もしくはｍｏｃｋ−トランスフェクト化（ 対照）ＣＯＳ細胞からの溶菌物をＭｏｎｏ ＱでのＦＰＬＣにより分画化し、そ してＭＥＫＫを含む分画の一部分（２０μｌ）を緩衝液と混合した。各分画を、 精製された野生型組換えＭＥＫ−１（１５０ｎｇ）の存在下（＋）もしくは非存 在下（−）、および触媒的に不活性な（キナーゼ^-）精製化組換えＭＡＰＫ（３ ００μｇ）の存在下でインキュベートした。図５Ａを参照すると、ＭＥＫＫでト ランスフェクトさせたＣＯＳ細胞の溶 菌物からの分画２０〜２４はＭＥＫ−１を活性化させた。従ってＭＥＫＫはＭＥ Ｋ−１をリン酸化および活性化し、ＭＡＰＫのリン酸化を導いた。 ＭＥＫＫがＭＥＫを直接活性化し、そしてカラム分画内に含まれる一つもしく は複数の他のキナーゼの活性化を介してＭＥＫを活性化するのではないことを確 認するために、過剰発現されるＭＥＫＫを、ＣＯＯＨ−末端ＭＥＫＫ融合蛋白質 に対する抗血清を用いてＣＯＳ細胞溶菌物から免疫沈降させた。ＭＥＫＫ ｃＤ ＮＡをＰｓｔ ＩおよびＫｐｎ １で消化させ、このことによりＭＥＫＫの触媒 ドメインをコードする１６７０−ｂｐの断片を作成した。この断片を、ＮＨ₂− 末端にポリヒスチジン配列を含む組換え融合蛋白質としてｐＲＳＥＴＥＣ内で発 現させた。精製化ＣＯＯＨ−末端ＭＥＫＫ融合蛋白質を使用してポリクローナル 抗血清を作成した。免疫沈降化ＭＥＫＫを１０〜１５μｌのＰＡＮ（１０ｍＭの ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス−２−エタンスルホン酸（Ｐｉｐｅｓ）（ｐＨ７． ０）、１００ｍＭのＮａＣｌ、およびアプロチニン（２０μｇ／ｍｌ）中に再懸 濁させ、そして２０μｌの最終容積での２０ｍＭのｐｉｐｅｓ（ｐＨ７．０）、 １０ｍＭのＭｎＣｌ₂、およびアプロチニン（２０μｇ／ｍｌ）中で、触媒的に 不活性なＭＥＫ−１（１５０ｎｇ）および２５μＣｉのγ−³²Ｐ−ＡＴＰと共に （＋）もしくはそれなしで（−）インキュベートした。反応は５×ＳＤＳ試料用 緩衝液（５μｌ）の添加により停止した。この試料を３分間沸騰させ、そしてＳ ＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーに供した。図５Ｂを参照すると、 ＭＥＫＫはＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で野生型のＭＥＫ−１と共に共遊走する触媒的に 不活性なＭＥＫ−１をリン酸化した。過剰発現されるＭ ＥＫＫの数々のリン酸化バンドがこの免疫沈降物内に検出された。これらのバン ドは恐らくはＭＥＫＫの自己リン酸化からもたらされ、そしてＭＥＫＫでトラン スフェクトさせたＣＯＳ細胞からの溶菌物の免疫ブロットにより同定されたＭＥ ＫＫの形態に対応するものと思われる（図１Ｃ）。前免疫血清で取得された免疫 沈降物はＭＥＫＫを全く含まず、そしてＭＥＫ−１をリン酸化しなかった。従っ て、ＭＥＫＫはＭＥＫを直接リン酸化するように思われるが、ＭＥＫＫを明瞭に 排除することができない関連キナーゼはＭＥＫＫと共免疫沈降化される。 この結果はＭＥＫＫがＭＥＫをリン酸化および活性化することができ、このこ とが次にはＭＡＰＫをリン酸化および活性化することを示す（図６）。Ｒａｆも やはりＭＥＫをリン酸化および活性化することができる（図６）。血清を剥奪し てあるＣＯＳ細胞をＥＧＦで刺激化し、そしてＲａｆを、Ｒａｆ−１のＣＯＯＨ −末端に対する抗体で免疫沈降させた。Ｃｏｓ細胞をベクター単独（対照）もし くはＰＣＶ／Ｍ５−ＭＥＫＫ構築物（ＭＥＫＫ）で一時的にトランスフェクトさ せた。休止対照細胞をヒトのＥＧＦ（３０μｇ／ｍｌ）でかあるいはそれなしで １０分間処理し、そしてＲａｆをＲａｆからのＣＯＯＨ−末端ペプチドに対する 抗体で細胞溶菌物から免疫沈降させた。免疫沈降させたＲａｆを、触媒的に不活 性なＭＥＫ−１（１５０ｎｇ）および２５μｌのγ−³²Ｐ−ＡＴＰと共にインキ ュベートした。免疫沈降させたＲａｆはγ−³²Ｐ−ＡＴＰの存在下でＭＥＫ−１ をリン酸化した（図６Ａ）。ＭＥＫＫを過剰発現するＣＯＳ細胞からのＲａｆの 免疫沈降物中にはＲａｆによるＭＥＫ−１のリン酸化がほとんどもしくは全く観 察されなかった。ＥＧＦでのＭＥＫＫを過剰発現するＣＯＳ細胞の処理は、免疫 沈降させたＲａｆによ るＭＥＫ−１の類似の度合いのリン酸化をもたらした（図６Ｂ）。ＭＥＫＫでト ランスフェクトさせ、かつ血清を剥奪してある細胞をＥＧＦで処理し、そしてＲ ａｆを免疫沈降させ、そして触媒的に不活性なＭＥＫ一１と共にインキュベート した。Ｒａｆに対する抗体での免疫ブロットにより示されるように、各試料中に 等量のＲａｆが免疫沈降された。最もゆっくりと遊走するバンドはＲａｆもしく はＭＥＫ−１に無関係な免疫沈降化リン蛋白質を意味する。対照細胞およびＭＥ ＫＫでトランスフェクトした細胞からの免疫沈降物は、後続のＳＤＳ−ＰＡＧＥ およびＲａｆに対する抗体での免疫ブロットにより示されるように類似していた 。従って、ＭＥＫＫおよびＲａｆの両方は独立にＭＥＫを活性化することが可能 である。 マウスからのＭＥＫＫの同定は更に、イーストと哺乳類との間のＭＡＰＫ系の 調節における保存を実証する。この結果は、ＭＡＰＫを制御する哺乳類の調節ネ ットワークはイーストにおけるものと比較してより複雑であることを示す。ＭＥ ＫＫおよびＲａｆの両方共がＭＥＫ、すなわち細胞表面からの様々なシグナルの ためのＭＡＰＫのすぐ上流の収束点を活性化する。Ｒａｆは関連するチロシンキ ナーゼ活性を有するレセプターに一次的に応答してＭＡＰＫネットワークを調節 する一方で、ＭＥＫＫはＧプロテインおよびプロテインキナーゼＣを活性化する レセプターから発生する一次シグナルを媒介することができるらしい。この可能 性は、プロテインキナーゼＣの負の方向の調節は成長因子に応答してＭＡＰＫの 活性化を阻害することはないが、ムスカリン性Ｍ₁レセプターを剌激する作用物 質に応答してＭＡＰＫの活性化を阻害する特異的細胞種における所見によって支 持される。Ｓ．セレビシアエ（Ｓ． ｃｅ ｒｅｖｉｓｉａｅ ）中のプロテインキナーゼＳｔｅ２０がフェロモンー応答経路 中ではＳｔｅ１１の上流にあるという証拠もこの仮説を支持する。ＰＣ１２細胞 では優性のネガティブ突然変異体Ｒａｓの発現は、Ｇプロテイン結合化レセプタ ーの刺激化もしくはプロテインキナーゼＣの活性化に応答してＭＡＰＫの活性化 を阻害することはないが、神経成長因子（ＮＧＦ）もしくは繊維芽細胞成長因子 （ＦＧＦ）に応答してＭＡＰＫの活性化を阻害する。しかしながら、チロシンキ ナーゼとＧプロテイン共役シグナル変換を統合する際の、ＲａｆとＭＥＫＫとの より複雑で細胞種に特異的な役割が存在するものと考えられる。ＭＥＫＫおよび ＲａｆをＭＡＰＫネットワーク中の分岐として特定することは、この系の分化調 節のための機構を提供する。 本発明はまた、本発明のＭＥＫＫ蛋白質に選択的に結合することが可能な抗体 をも含む。このような抗体は、本明細書中では抗−ＭＥＫＫ抗体として引用され る。抗−ＭＥＫＫ抗体のポリクローナル集団がＭＥＫＫ抗血清中に含まれている 可能性がある。ＭＥＫＫ抗血清は、親和性精製化ポリクローナル抗体、硫酸アン モニウム留分抗血清、もしくは全抗血清を意味することができる。本明細書に用 いられるように、用語「〜に選択的に結合する」は、ＭＥＫＫ蛋白質に優先的に 結合するこのような抗体の能力を意味する。結合は、免疫ブロットアッセイ、免 疫沈降アッセイ、酵素免疫アッセイ（例えばＥＬＩＳＡ）、放射線免疫アッセイ 、免疫蛍光抗体アッセイ、および免疫電子顕微鏡を初めとする当業者に知られる 様々な方法を用いて測定することができ、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ．ａ ｌ．、Ｍｏｌｅｃｕａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎ ｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ r Ｌａｂｓ Ｐｒｅｓｓ、１９８９、を参照せよ。 本発明の抗体は、ポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体のいずれか であることができる。本発明の抗体は、抗体断片、および一本鎖抗体を初めとす る遺伝子的に作成された抗体のような機能的等価物を含み、これらは抗体を取得 するために用いられる蛋白質のエピトープの内の少なくとも一つに選択的に結合 することが可能である。抗体を、少なくとも部分的にはＭＥＫＫ核酸分子により コードされる蛋白質に応答させて作成することが好ましい。抗体を、ＭＥＫＫ蛋 白質の少なくとも一部分に応答させて作成することがより好ましく、そして抗体 を、ＭＥＫＫ蛋白質のアミノ末端もしくはカルボキシル末端のいずれかに応答さ せて作成することが更により好ましい。 本発明の抗体を産生させるための好ましい方法は、ある動物にＭＥＫＫ蛋白質 の有効量を投与して抗体を産生させ、そしてその抗体を回収することを含む。本 発明の抗体は様々な使用可能性を有し、これらは本発明の範囲内に含まれる。例 えば、このような抗体を使用して独特なＭＥＫＫ蛋白質を同定し、そしてＭＥＫ Ｋ蛋白質を回収することができる。 本発明の一つの態様はＭＥＫＫ１のアミノ末端をコードする核酸分子を含み、 これをｐＲＳＥＴ細菌ベクター内にクローン化してｐＭＥＫＫ−１組換え分子を 産生した。ｐＭＥＫＫ−１組換え分子を大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）内で発現させ 、そしてこの組換え分子にコードされる蛋白質を回収し、そして当業者に知られ る標準方法を用いて精製した。ＮＺＷウサギを精製された組換えＭＥＫＫ１アミ ノ末端蛋白質で免疫化し、そして抗血清を当業者に知られる標準方法を用いて回 収した。前述の方法はまた、ＭＥＫＫ１蛋白質のカルボキシル末端をコードする 核酸分子 を用いても実施した。抗−ＭＥＫＫ抗体を含む抗血清を、セファロース（Ｓｅｐ ｈａｒｏｓｅ）に結合されるＭＥＫＫ１蛋白質を固定化させてある親和性カラム に通した。親和性精製される抗−ＭＥＫＫ抗血清は、様々な細胞の種類からのＭ ＥＫＫ蛋白質に選択的に結合するが、Ｒａｆ−１、Ｂ−Ｒａｆ、もしくはＮ−Ｒ ａｆ蛋白質には結合しない抗体を含む。 ＥＧＦで剌激化した細胞もしくは刺激化していない細胞を溶菌し、そして既述 のようにＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した。この細胞溶菌物に含まれるＭＥＫＫ 蛋白質を、ＭＥＫＫ１のアミノ末端領域に特異的なＭＥＫＫ抗血清およびＭＥＫ Ｋ１のカルボキシル領域に特異的なＭＥＫＫ抗血清を用いる免疫ブロットにより 同定した。図７を参照すると、ＭＥＫＫ１、ならびにＭＥＫＫ活性を有する２つ のより高い分子量の蛋白質ＭＥＫＫαおよびＭＥＫＫβを、アミノ末端領域（Ｎ Ｈ₄）に特異的なＭＥＫＫ抗血清を用いて同定した。ＭＥＫＫ１はＭＥＫＫ１の カルボキシル領域（ＣＯＯＨ）に特異的なＭＥＫＫ抗血清を用いて同定されたが 、ＭＥＫＫαおよびＭＥＫＫβはそうではなかった。ＰＣ１２細胞溶菌物中に存 在する約９５ｋＤと８２ｋＤとの２つのＭＥＫＫ免疫反応性種が、ＭＥＫＫのア ミノ末端の一部分に対して作成したＭＥＫＫ抗血清により認識された。これらの 蛋白質の両方の可視像は、精製される組換えＭＥＫＫ ＮＨ₂−末端融合蛋白質 抗原の抗体とのインキュベーションにより阻害された。単一の９５ｋＤ ＭＥＫ Ｋ蛋白質がＭＥＫＫ免疫沈降物内に存在したが、前免疫血清を用いた免疫沈降物 内にはこれは存在しなかった。この９５ｋＤのＭＥＫＫは、ＰＣ１２細胞の細胞 溶菌物中、ならびにＲａｔ１ａ、ＮＩＨ３Ｔ３、およびＳｗｉｓｓ３Ｔ３繊維芽 細胞 中に存在する約９５ｋＤのＭＥＫＫ蛋白質と共に共遊走した。繊維芽細胞の細胞 株と比較すると、より多くの９５ｋＤ ＭＥＫＫがＰＣ１２細胞中で発現された 。Ｒａｆ−１もしくはＲａｆ−Ｂを特異的に認識する抗体での免疫ブロットは、 これらの酵素の内のいずれのものもＭＥＫＫ免疫沈降物の混入物として存在する のではないことを示した。ＭＥＫＫ免疫沈降物中の９５ｋＤのＭＥＫＫはＰＣ１ ２細胞溶菌物中のＲａｆ−１もしくはＲａｆ−Ｂと一緒には共遊走せず、そして ＭＥＫＫとＲａｆ抗体との間には交差反応性は全く観察されなかった。 本発明のＭＥＫＫ蛋白質は、ＭＥＫＫ蛋白質を含む細胞の成長因子による刺激 化に応答させて活性化することができる。飢餓培地（ＤＭＥＭ、０．１％ＢＳＡ ）内での１８〜２０時間のインキュベーションによりＰＣ１２細胞から血清を剥 奪し、そしてＭＥＫＫを、未処理対照、あるいはＥＧＦ（３０ｎｇ／ｍｌ）もし くはＮＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）で処理した細胞からの等量の蛋白質を含む溶菌 物から、ＭＥＫＫのＮＨ₄−末端部分に特異的な既述の抗−ＭＥＫＫ抗体で免疫 沈降させた。免疫沈降させたＭＥＫＫを８μｌのＰＡＮ［１０ｍＭのピペラジン −Ｎ，Ｎ’−ビス−２−エタンスルホン酸（Ｐｉｐｅｓ）（ｐＨ７．０）、１０ ０ｍＭのＮａＣｌ、およびアプロチニン（２０μｇ／ｍｌ）］中に再懸濁させ、 そして２０μｌの最終容積の万能キナーゼ緩衝液［２０ｍＭのピペラジン−Ｎ， Ｎ’−ビス−２−エタンスルホン酸（Ｐｉｐｅｓ）（ｐＨ７．０）、１００ｍＭ のＭｎＣｌ₂、およびアプロチニン（２０μｇ／ｍｌ）］中で、触媒的に不活性 なＭＥＫ−１（１５０ｎｇ）および４０μＣｉの［γ−³²Ｐ］ＡＴＰと共に２５ 分間、３０℃でインキュベートした。反応は２×ＳＤＳ試料用緩衝液（２０μｌ ）の添加により停止 させた。この試料を３分間沸騰させ、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジ オグラフィーに供した。Ｒａｆ−Ｂは、先のものと同じ未処理細胞溶菌物および 処理化ＰＣ１２細胞溶菌物から、Ｒａｆ−ＢのＣＯＯＨ−末端ペプチドに対する 抗血清（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．社）で 免疫沈降させ、そして同様にアッセイした。Ｒａｆ−１は、Ｒａｆ−１のＣＯＯ Ｈ−末端の１２のアミノ酸に対する抗血清（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅ ｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．社）で免疫沈降させた。血清飢餓状態のＰＣ１２細 胞の上皮成長因子（ＥＧＦ）処理はＭＥＫＫ活性の増加をもたらした。これらの 結果は、インビトロでのキナーゼアッセイにおいて、ＭＥＫＫの免疫沈降物によ る精製化ＭＥＫ−１（キナーゼ不活性形態）のリン酸化を測定することにより取 得した（図８）。ＮＧＦは、未処理細胞からの対照免疫沈降物と比較してＭＥＫ Ｋ活性の僅かながらの上昇を剌激化した。ＮＧＦおよびＥＧＦによるＭＥＫＫ活 性の刺激化はこれらの作用物質によるＲａｆ−Ｂの活性化に類似していたが、Ｒ ａｆ−Ｂは高い基本的活性を示した。ＮＧＦおよびＥＧＦによるｃ−Ｒａｆ−１ の活性化はＭＥＫＫもしくはＲａｆ−Ｂのものと比較して殆ど無視できるもので あった。 ＥＧＦ（３０ｎｇ／ｍｌ）で０、１、３、５、１０、もしくは２０分間処理し たＰＣ１２細胞の溶菌物からＭＥＫＫもしくはＲａｆ−Ｂを免疫沈降させ、そし て既述のように触媒的に不活性なＭＥＫ−１（１５０ｎｇ）および［γ−³²Ｐ］ ＡＴＰと共にインキュベートした。データは、典型的な実験からの放射線活性ゲ ルのホスホリルイメージー分析により定量化される各時間点についての応答の相 対的強度を表す。ＥＧＦ処理の時間経過は、ＭＥＫＫの活性化が５分後に最大レ ベルに達し、そし て少なくとも３０分間は持続することを示した（図９）。Ｒａｆ−Ｂは、類似の 時間経過を示し、ピーク活性はＥＧＦ処理後３〜５分以内に生じ、そして最高２ ０分間は持続した。 Ｒａｆ−ＢのものからＥＧＦ−刺激化ＭＥＫＫ活性を更に解離させるために、 ＭＥＫＫの免疫沈降前にＲａｆ−Ｂを細胞溶菌物から免疫沈降させた。Ｒａｆ− Ｂを、ＥＧＦ（３０ｎｇ／ｍｌ）で５分間処理してあるか、あるいは処理してい ないかのいずれかである血清飢餓状態のＰＣ１２細胞の溶菌物から予備浄化した 。Ｒａｆ−Ｂを、Ｒａｆ−Ｂに対する抗血清を用いるか、あるいは対照として前 免疫ＩｇＧ抗血清を用いて２回予備浄化させた。予備浄化した上清はその後にＭ ＥＫＫもしくはＲａｆ−Ｂ抗血清のいずれかで免疫沈降させ、そして先に詳細に 記載されるように触媒的に不活性なＭＥＫ−１および［γ−³²Ｐ］ＡＴＰと共に インキュベートした。ＥＧＦ−刺激化もしくは未刺激化ＰＣ１２細胞溶菌物をＩ ｇＧもしくはＲａｆ−Ｂ抗血清のいずれかで予備浄化し、そしてその後にＭＥＫ Ｋ抗血清もしくはＲａｆ−Ｂ抗体での免疫沈降に供した。図１０に示される結果 は、Ｒａｆ−Ｂでの予備浄化はＲａｆ−Ｂインビトロキナーゼアッセイのホスホ ルイメージャー分析により測定したところ、Ｒａｆ−Ｂ活性の６０％の減少をも たらしたことを示す。ＥＧＦ−刺激化ＭＥＫＫ活性はＲａｆ−Ｂ枯渇により影響 を受けず、このことはＲａｆ−ＢがＭＥＫＫの免疫沈降物の構成成分ではないこ とを示唆する。少なくとも４０％のＲａｆ−Ｂ活性がＲａｆ−Ｂ抗体での予備浄 化に対して耐性である。ＣＯＳ細胞内で過剰発現される組換え野生型ＭＥＫＫは セリンおよびレオニン残基が容易に自己リン酸化され、そしてＭＥＫＫのアミノ 末端はセリンおよびスレオニンにかなり富んでいる。 ＰＣ１２細胞の免疫沈降物内に含まれるＭＥＫＫを、インビトロキナーゼアッセ イにおいて精製化組換えＭＥＫＫアミノ−末端融合蛋白質の選択的リン酸化につ いてテストした。 血清飢餓状態のＰＣ１２細胞をＥＧＦ（３０ｎｇ／ｍｌ）で５分間処理し、そ して同じ細胞溶菌物からの等量の蛋白質を、ＭＥＫＫ、Ｒａｆ−Ｂ、もしくは対 照としての前免疫抗血清のいずれかで免疫沈降させた。免疫沈降物を、先に記載 するように、精製化組換えＭＥＫＫ ＮＨ₂−末端融合蛋白質（４００ｎｇ）お よび［γ−³²Ｐ］ＡＴＰと共にインキュベートした。図１１に示される結果は、 ＥＧＦ−刺激化および未刺激化ＰＣ１２細胞の溶菌物から免疫沈降させたＭＥＫ Ｋは不活性な５０ｋＤ ＭＥＫＫ ＮＨ₂−融合蛋白質をしっかりとリン酸化さ せた一方で、Ｒａｆ−Ｂ、あるいはＥＧＦ−刺激化もしくは未刺激化細胞からの 前免疫血清免疫沈降物は基質としてＭＥＫＫ ＮＨ₂−融合蛋白質を使用しなか った。従ってＭＥＫＫ免疫沈降物中に含まれるＥＧＦ−刺激化ＭＥＫＫ活性は混 入性のＲａｆキナーゼに起因するものではない。 ＭＥＫ−１およびＭＥＫＫ ＮＨ₂−融合蛋白質の両方のリン酸化が９５ｋＤ のＰＣ１２細胞のＭＥＫＫの活性に起因するものであることを保証するために、 ＥＧＦ−剌激化および未刺激化細胞から調製された細胞溶菌物をＭｏｎｏ−Ｑカ ラムでのＦＰＬＣにより分画化して、内因性ＭＥＫＫを部分精製した。未剌激化 対照ＰＣ１２細胞もしくはＥＧＦ（３０ｎｇ／ｍｌ）で５分間処理した細胞から の溶菌物をＭｏｎｏ−ＱカラムでのＦＰＬＣにより、０〜５２５ｍＭのＮａＣｌ の直線濃度勾配液を用いて分画化した。偶数番号の付いた各分画の一部分（３０ μｌ）を、４０μｌの最終容積中、基質として精製化組換えＭＥＫ−１（１５０ ｎ ｇ）を含む緩衝液（２０ｍＭのピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス−２−エタンスルホ ン酸（Ｐｉｐｅｓ）（ｐＨ７．０）、１０ｍＭのＭｎＣｌ₂、アプロチニン（２ ０μｇ／ｍｌ）、５０ｍＭのβ−グリセロリン酸エステル（ｐＨ７．２）、１０ ｍＭのＥＧＴＡ、ＩＰ−２０（５０μｇ／ｍｌ）、５０ｍＭのＮａＦ、および３ ０μＣｉの［γ−³²Ｐ］ＡＴＰ）と混合して、そして３０℃で２５分間インキュ ベートした。反応は２×ＳＤＳ試料用緩衝液（４０μｌ）の添加により停止させ 、沸騰させ、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーに供した。 ＭＥＫＫ活性のピークは分画１０〜１２に溶出された。ＥＧＦ−処理化ＰＣ１２ 細胞の溶菌物からの偶数番号の付いた各分画の一部分（３０μｌ）を、ＭＥＫ− １の代わりの基質として精製化組換えＭＥＫＫ ＮＨ₂−末端融合蛋白質（４０ ０ｎｇ）を含むこと以外は先に記載されるとうりの緩衝液と混合した。その後に キナーゼ不活性な精製化組換えＭＥＫ−１もしくはＭＥＫＫ ＮＨ₂−末端融合 蛋白質を［γ−³²Ｐ］ＡＴＰの存在下で基質として使用して、９５ｋＤのＭＥＫ Ｋがいずれかの基質を直接リン酸化するかを否かを決定した。ＥＧＦで処理した ＰＣ１２細胞からの溶菌物の分画１０〜１４はＭＥＫ−１をリン酸化した一方で 、未処理対照分画ではＭＥＫ−１のリン酸化が殆ど生じなかった。ＭＥＫＫ Ｎ Ｈ₂−末端融合蛋白質もＭＥＫ−１と同じ分画でリン酸化されたが、活性のピー クはやや広範囲であった（分画８〜１６）。 カラム分画の免疫沈降は、９５ｋＤのＭＥＫＫ蛋白質が、添加された外因性の キナーゼ不活性ＭＥＫ−１もしくは５０ｋＤのＭＥＫＫ ＮＨ₂−末端融合蛋白 質のいずれかをリン酸化する活性のピークと共に共溶出されることを示した。偶 数番号の付いたカラム分画の一部分（９００ μｌ）をトリクロロ酢酸での沈殿により濃縮し、そしてＭＥＫＫ抗体で免疫ブロ ットした。免疫反応性のピークは分画１０〜１２に溶出された。 ９５ｋＤのＰＣ１２細胞のＭＥＫＫおよびＲａｆ−Ｂが成長因子介在性シグナ ル伝達に機能的Ｒａｓ蛋白質を必要とするか否かを検査するために、優性のネガ ティブＨａ−ｒａｓ（Ａｓｎ１７）（Ｎ¹⁷Ｒａｓ）をＰＣ１２細胞内で発現させ 、そしてＥＧＦ−刺激化ＭＥＫＫもしくはＲａｆ−Ｂ活性化を、基質としてキナ ーゼ不活性ＭＥＫ−１を用いる免疫沈降においてアッセイした。デキサメサゾン 誘導可能Ｎ¹⁷Ｒａｓを安定に発現するＰＣ１２細胞を、１μＭのデキサメサゾン と共にもしくはそれなしで、０．１％のＢＳＡを含む培地中で１８〜２０時間血 清飢餓状態にさせ、そしてその後に未処理、もしくはＥＧＦ（３０ｎｇ／ｍｌ） で５分間処理した。細胞溶菌物からの等量の可溶性蛋白質をＭＥＫＫもしくはＲ ａｆ−Ｂ抗血清のいずれかで免疫沈降させ、そして先に記載するように、触媒的 に不活性な精製化組換えＭＥＫ−１および［γ−³²Ｐ］ＡＴＰと共にインキュベ ートした。Ｎ¹⁷Ｒａｓの発現を、Ｎ¹⁷Ｒａｓ遺伝子で安定にトランスフェクトし たＰＣ１２クローン内でその飢餓培地へのデキサメサゾンの添加により誘導した 。Ｎ¹⁷Ｒａｓ発現は、キナーゼ不活性ＭＥＫ−１をリン酸化させる能力により測 定したところＥＧＦによるＭＥＫＫの活性化を阻害した（図１２を参照せよ）。 Ｒａｆ−ＢのＥＧＦ−介在性活性化もやはり、非誘導化Ｎ¹⁷Ｒａｓ形質転換体と 比較すると、Ｎ¹⁷Ｒａｓ発現性ＰＣ１２では非常に減少していた。野生型ＰＣ１ ２細胞へのデキサメサゾンの添加は、ＥＧＦにより誘導されるＭＥＫＫもしくは Ｒａｆ−Ｂ活性化の度合いに全く影響を及ぼさなかった。Ｎ¹⁷Ｒａｓ遺伝子で安 定にトランスフェクトされたＰＣ１２細胞クロー ンは野生型のＰＣ１２細胞と比較するとＭＥＫＫ活性のＥＧＦ−介在性活性化に 対する反応性が低い。これらの結果は、ＰＣ１２細胞中のＲａｆ−ＢおよびＭＥ ＫＫの両方の成長因子剌激性活性化には機能的なＲａｓが必要であることを示し 、このことはＲａｓはその細胞増殖および分化におけるその影響を、Ｒａｆおよ びＭＥＫＫファミリーの両方からの多重プロテインキナーゼエフェクターの活性 化を介して媒介することができることを示唆する。 従って、ＥＧＦはＭＥＫＫ活性のピークを５分以内に剌激化し、これは処理後 少なくとも３０分間は持続し、そしてこれはＲａｆ−Ｂ活性化の時間経過に類似 していた。神経成長因子（ＮＧＦ）およびフォルボールエステルＴＰＡもまたＭ ＥＫＫを活性化するが、ＥＧＦと比較するとその度合いは低い。免疫沈降物もし くはカラム分画内のＭＥＫＫ活性は、ＥＧＦ−刺激化ｃ−Ｒａｆ−１およびＲａ ｆ−Ｂ活性のものから解離可能であった。ホルスコリンの予備処理は、ＥＧＦ、 ＮＧＦ、およびＴＰＡによるＭＥＫＫとＲａｆ−Ｂの両方の活性化を廃止させた 。ＥＧＦに応答するＭＥＫＫとＲａｆ−Ｂの両方の活性化は、優性なネガティブ Ｎ¹⁷Ｒａｓの安定な発現により阻害された。これらの所見は、成長因子によるＲ ａｓ−依存的ＭＥＫＫ調節の最初の証明を表し、そしてＲａｓが別の場合ではＲ ａｆおよびＭＥＫＫファミリーの一員との間で共役することができる複雑な細胞 内ネットワークの出現を示唆する。 ＭＥＫＫは多数の種類の細胞（Ｔ細胞、神経細胞、および繊維芽細胞）におけ るＪＵＮキナーゼ活性を選択的に調節する。ＪＵＮキナーゼはＭＡＰキナーゼの 遠い親戚である。ＪＵＮキナーゼを活性化するＭＥＫＫの能力は、ＪＵＮキナー ゼを活性化するＲａｆのものと比較すると約１ ００倍高い。ＪＵＮキナーゼは、様々な細胞の種類の成長および分化を制御する ことに拘わる転写因子ＪＵＮの活性を調節する。 様々な種類の細胞における細胞死および他の機能を調節する腫瘍壊死因子（Ｔ ＮＦ）はＭＥＫＫ活性を剌激化する。ＭＥＫＫのＴＮＦ刺激化はＲａｆ非依存的 である。細胞のＵＶ損傷により開始されるシグナル伝達経路はＴＮＦ応答経路と 重複し、そしてまたＭＥＫＫを活性化するがＲａｆは活性化しない。従って、Ｔ ＮＦとＵＶとの両方がＲａｆを活性化することなしにＭＥＫＫ活性を剌激化する 。ＭＥＫＫのＵＶとＴＮＦとの両方がＲａｓ依存的である。 従って様々な種類の細胞におけるＭＥＫＫ活性のＲａｓ依存的調節は、Ｒａｓ がＲａｆファミリーの一員に加えてＭＥＫＫファミリーの活性化を制御すること を示す。 ９５ｋＤのＰＣ１２細胞ＭＥＫＫの成長因子介在性活性化がＰＫＡにより阻害 されるか否かを決定するために、ホルスコリンを用いて細胞内ｃＡＭＰを上昇さ せ、そしてＰＫを活性化させた。血清飢餓状態のＰＣ１２細胞をホルスコリン（ ５０μＭ）で、もしくはそれなしで３分間前処理してプロテインキナーゼＡを活 性化させ、そしてその後にＥＧＦ（３０ｎｇ／ｍｌ）、ＮＧＦ（１００ｎｇ／ｍ ｌ）、もしくはＴＰＡ（２００ｎＭ）で５分間処理し、そしてＭＥＫＫを細胞溶 菌物からの等量の可溶性蛋白質から免疫沈降させ、そして先に記載のように触媒 的に不活性な精製化組換えＭＥＫ−１および［γ−³²Ｐ］ＡＴＰと共にインキュ ベートした。Ｒａｆ−Ｂ活性も同じ細胞溶菌物からアッセイして、その調節がＭ ＥＫＫのものと異なるか否かを検査した。Ｒａｆ−Ｂを先に記載されるように同 じ細胞溶菌物から免疫沈降させ、そして先に記載される ようにＭＥＫ−１をリン酸化させる能力についてアッセイした。ホルスコリンの 前処理は、キナーゼ不活性ＭＥＫ−１をリン酸化させる能力により測定したとこ ろ、ＥＧＦ、ＮＧＦ、およびＴＰＡによるＭＥＫＫとＲａｆ−Ｂとの両方の活性 化を廃止させた（図１３）。ホルスコリン処理単独ではいずれのキナーゼにも感 知できる程の影響は全く及ぼさなかった。これらの結果は、Ｒａｆ−１およびＲ ａｆ−Ｂに加えてＰＫＡ活性化は９５ｋＤのＰＣ１２細胞ＭＥＫＫの成長因子刺 激化を阻害することを示し、Ｒａｓと上流との間もしくはＲａｓの下流、あるい はこれら３つのキナーゼの各レベルにおいて存在するＰＫＡ作用のための共通な 調節制御地点の存在を示唆する。 類似するもしくは個別のＭＥＫ活性がＧ_iプロテイン結合化レセプターを介す るＭＡＰＫの活性に関与しているかどうかを決定するために、トロンビン活性化 Ｒａｔ １ａ細胞からの細胞溶菌物中のＭＥＫ活性を調査した。トロンビン刺激 化細胞は、ＥＧＦ刺激化細胞中に検出される主要ＭＥＫピークと共分画化される ＭＥＫ活性を示した。トロンビン攻撃誘発化細胞からのＭＥＫ活性の度合いは、 ＥＧＦ剌激化で観察されるものと比較して一般的に２〜３倍低く、このことはト ロンビン攻撃誘発化細胞において本発明者が観察した一層少ないＭＡＰＫ応答に 対応する。 ｇｉｐ２、ｖ−ｓｒｃ、ｖ−ｒａｓ、もしくはｖ−ｒａｆを発現するＲａｔ １ａおよびＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるＭＥＫの分化調節が、ＭＥＫ−１の仮定的 レギュレーターであるプロテインキナーゼを調査するよう本発明者を導いた。最 近、Ｒａｆ−１がＭＥＫをリン酸化および活性化することが示された。Ｒａｆの 活性化を以下に記載の様式でアッセイした。細胞を血清飢餓状態にさせ、そして 先に記載されるように適切 な成長因子の存在下もしくは非存在下で攻撃誘発させた。血清飢餓状態のＲａｔ １ａ細胞を緩衝液単独もしくはＥＧＦで攻撃誘発し、そしてＲａｆを、Ｒａｆ のＣ末端を認識する抗体で免疫沈降させた。細胞を氷冷ＲＩＰ緩衝液（５０ｍＭ のトリス、ｐＨ７．２、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＳＤＳ、０．５％の デオキシコール酸ナトリウム、１．０％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００、１０ｍＭの ピロリン酸ナトリウム、２５ｍＭのグリセロリン酸ナトリウム、２ｍＭのバナジ ン酸ナトリウム、２．１μｇ／ｍｌのアプロチニン）中でこすることにより溶菌 させ、そして１０分間ミクロフュージにかけて核を除去した。この上清を蛋白質 含有量について標準化し、そしてＲａｆ−１のＣ末端に対するウサギ抗血清での 免疫沈降前にプロテインＡセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）で予備浄化させ 、そして４℃で２〜３時間プロテインＡセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）に かけた。このビーズを氷冷ＲＩＰＡで２回、そしてＰＮＡ（１０ｍＭのＰｉｐｅ ｓ、ｐＨ７．０、１００ｍＭのＮａＣｌ、２１μｇ／ｍｌのアプロチニン）で２ 回洗浄した。免疫沈降物の一部分をＳＤＳ試料緩衝液で希釈し、そして免疫ブロ ット分析に使用した。残りのものを５０μｌの最終容積でのキナーゼ緩衝液（２ ０ｍＭのＰｉｐｅｓ ｐＨ７．０、１０ｍＭのＭｎＣｌ₂、１５０ｎｇのキナー ゼ不活性ＭＥＤＫ−１、３０μＣｉのγ−³²Ｐ−ＡＴＰ、および２０μｇ／ｍｌ のアプロチニン）中に３０℃で３０分間再懸濁させた。野生型の組換えＭＥＫ− １をマーカーとして並行させて自己リン酸化させた。反応は１２．５μｌの５× ＳＤＳ試料緩衝液の添加により停止させ、５分間沸騰させ、そしてＳＤＳ−ＰＡ ＧＥおよびオートラジオグラフィーに供した。 γ−³²Ｐ−ＡＴＰの存在下では、免疫沈降化させたＲａｆはＭＥＫ−１を自己 リン酸化させることが可能であった。このアッセイに用いられた組換えＭＥＫ− １はキナーゼ不活性であり、野生型ＭＥＫ−１に関して観察されたようには自己 リン酸化を行わないことが確認された。対照細胞からの免疫沈降物においてもＲ ａｆによるＭＥＫ−１のリン酸化はほとんどもしくは全く観察されなかった。Ｅ ＧＦ刺激誘発は明らかにＲａｆを刺激化してＭＥＫ−１のリン酸化の触媒反応を 行わせ、それとは対照的にＲａｔ １ａ細胞のトロンビン刺激誘発は、内因性Ｍ ＥＫが明らかに活性化されているとしても測定可能な程度にＲａｆを活性化する ことはなかった。ＥＧＦは、基本値の約２．６倍、組換えＭＥＫ−１のＲａｆリ ン酸化を刺激化した。Ｇｉｐ２もしくはｖ−Ｓｒｃ発現性Ｒａｔ １ａ細胞から のＲａｆ免疫沈降物中では、ＲａｆによるＭＥＫのリン酸化はほとんど観察され なかった。ＥＧＦ刺激はこれらの細胞株におけるＭＥＫ−１のＲａｆ触媒化リン 酸化を各々１．８倍および１．４倍活性化することが可能であった。Ｇｉｐ２お よびｖ−Ｓｒｃ発現性細胞におけるＥＧＦ応答の鈍化は、ＭＡＰＫの構成性活性 化へのＥＧＦレセプターの脱感作の結果であるらしい。後続のＳＤＳ−ＰＡＧＥ 、およびＲａｆ抗体を用いる免疫ブロットにより、この免疫沈降物中のＲａｆの 量が類似することが示された。ＭＥＫのトロンビン刺激化が基準値の２〜３倍で あるために、Ｒａｆがこの成長因子によるＭＥＫ活性化に有意に寄与している場 合にはＭＥＫリン酸化の少なくとも１．５倍の刺激化が予期される。このレベル の活性化はＥＧＦで刺激化したＧｉｐ２およびｖ−Ｓｒｃ発現性細胞株中におい て検出可能であった。従って、Ｒａｆのトロンビン活性化の検出の不成功はアッ セイの感度に起因するので はなさそうである。ＭＡＰＫのトロンビン刺激化は３分目に最大となる。トロン ビンでの１〜５分間のＲａｔ １ａ細胞の刺激化はＲａｆ活性を増加させなかっ た。 Ｒａｔ １ａ細胞と同様にＮＩＨ３Ｔ３細胞においては、ＥｇｆはＲａｆを約 ２．７倍活性化させたが、一方でトロンビンはそのような活性化を行わなかった 。ｖ−Ｒａｆ発現性ＮＩＨ３Ｔ３細胞はＭＥＫ−１のリン酸化において何の増加 も見せなかった。この結果は予期されぬものであり、それはｖ−Ｒａｆ発現性Ｎ ＩＨ３Ｔ３細胞中ではＭＥＫが明らかに活性化されているためである。ｃ−Ｒａ ｆ−１に加えてｐ９０およびｐ７５の両方のｇａｇ−ｒａｆ融合蛋白質を、抗血 清によりｖ−Ｒａｆ ＮＩＨ３Ｔ３細胞から免疫沈降した。ｐ７５ｇａｇ−ｒａ ｆはプロテインキナーゼ活性を示すことが判明しているが、インビトロのアッセ イ系ではＮＨ₂末端ｇａｇ融合蛋白質が立体的に組換えＭＥＫ−１のＲａｆリン 酸化を阻害することが可能である。ｖ−Ｒａｆキナーゼ活性を測定するためには 更に詳細な研究を行う必要があるであろう。この結果は、ＭＥＫの活性化はＲａ ｆの活性化だけによってはその理由を説明できないことを主張している。トロン ビン刺激化を受けたＧ_iプロテイン共役化経路、ならびにｇｉｐ２およびｖ−ｓ ｒｃ トランフェクト化細胞におけるＭＥＫ活性化に寄与するＭＥＫのための追加 的な調節的キナーゼが存在する必要がある。 ＭＡＰＫは、様々なシグナル変換経路での主要中間体分子であると考えられる セリン／スレオニンキナーゼである。ＭＡＰＫは次にはＭＥＫによるリン酸化お よび活性化を受ける。 ＭＥＫの構成性活性化は、癌遺伝子トランスフェクト化細胞の内の大 半の、そうでなければ全てのＭＡＰＫ活性の増加の理由を説明する。ｇｉｐ２お よびｖ−ｓｒｃはＲａｔ １ａ細胞中のＭＥＫを活性化させた一方で、ｖ−Ｒａ ｆはＮＩＨ３Ｔ３細胞中で最も効率よくＭＥＫを活性化した。これらの癌蛋白質 は成長因子として類似のＭＥＫ活性を活性化した。ｖ−Ｒａｓトランスフェクト 化ＮＩＨ３Ｔ３細胞中では有意なレベルのＭＥＫ活性化は全く検出されなかった 。この所見は、ＭＡＰＫとＭＥＫとの活性化の間のより密接な関連を示す。本発 明者は、癌遺伝子発現性成長因子剌激化細胞中では、ＭＥＫ活性化に非依存的な ＭＡＰＫの有意な活性化の所見は得ていない。 キナーゼ不活性ＭＥＫ−１のリン酸化を必要とするＲａｆ活性化アッセイの感 度は、Ｒａｔ １ａおよびＮＩＨ ３Ｔ３細胞の両方のＥＧＦ刺激化について観 察される２０〜２５％のＲａｆ活性を容易に検出することが可能であるはずであ ることを示唆する。ＭＥＫおよびＭＡＰＫの両方の活性が容易に検出される際の トロンビンに応答するＲａｆ活性化の検出の不成功は、Ｒａｔ １ａおよびＮＩ Ｈ ３Ｔ３細胞中ではＲａｆがトロンビンによっては有意に活性化されないこと を示唆する。この所見は、Ｒａｆ以外の追加的プロテインイキナーゼがＭＥＫ− １をリン酸化および活性化することが可能であることを示唆する。本発明者は最 近、Ｒａｆに無関係かつ非依存的なマウスのＭＥＫキナーゼ（ＭＥＫＫ）をクロ ーン化および発現させた。ＭＥＫＫおよびＲａｆの両方がＭＥＫ−１をリン酸化 および活性化することを見いだした。ＭＥＫＫはイーストのプロテインキナーゼ Ｓｔｅ１１とＢｙｒ２とのマウス相同物であり、ＭＥＫはイーストのプロテイン キナーゼＳｔｅ７とＢｙｒ１とのマウス相同物である。ＲａｆはＳｔｅ１１およ びＢｙｒ２とは配列が無関係で あり、このことはＲａｆはイーストにおいて特定されるフェロモン反応性プロテ インキナーゼからの哺乳類における分岐を表すことを示唆する。 実験は、ＲａｆとＭＥＫＫとの両方がＭＥＫを活性化させ、このＭＥＫはＭＡ ＰＫ活性化に必要な多重プロテインキナーゼのための収束点として機能すること を示す（図１４を参照せよ）。従ってＲａｆおよびＭＥＫＫは、様々な細胞表面 レセプターにより開始されるシグナル入力のための分岐におけるプロテインキナ ーゼである。ＭＥＫＫは、Ｒａｔ １ａおよびＮＩＨ ３Ｔ３細胞内でＭＥＫを 調節するトロンビン調節化キナーゼであると考えられる。ＲａｆおよびＭＥＫＫ は分化的には癌蛋白質により調節されているとも考えられている。 ＭＡＰＫとＭＡＰＫの上流レギュレーターとの間でのＭＥＫの設置は、統合ば かりでなく成長因子レセプターにより開始されるシグナルネットワークの独立性 も提供する。例えば、セリン／スレオニンキナーゼであるＲａｆおよびＭＥＫＫ はＭＥＫをリン酸化することができるが、同様に他の蛋白質もリン酸化しそうで ある。ＭＥＫはＭＡＰＫの選択的調節用に特殊化された複式のチロシン／スレオ ニンキナーゼである。 本発明の一つの態様は、ＭＥＫＫがＭＡＰＫを活性化することの認識に関する 。例えば、ＭＡＰＫは哺乳類系における様々な細胞性経路に関与することが知ら れている。ＭＡＰＫは、哺乳類の細胞性有糸分裂誘発、ＤＮＡ合成、細胞分裂、 および分化に関与することが知られている。ＭＡＰＫはまた、ｃ−Ｊｕｎおよび ｃ−Ｍｙｃのような癌遺伝子の活性化に関与することも認識されている。理論に 縛られる訳ではないが、本発明者はＭＡＰＫは遺伝的起源を有する様々な異常に も密接に関与していると考えている。ＭＡＰＫは核膜を横断することが知られて おり、そし て様々な遺伝子の発現を調節することの少なくとも部分的な原因となっていると 考えられている。ＭＡＰＫはそれ自体、癌、神経性疾患、自己免疫性疾患、アレ ルギー性反応、創傷治癒、および炎症性応答の誘因もしくは進展における有意な 役割を演じるもの考えられる。本発明者は、ＭＥＫＫをコードする核酸配列を最 初に同定することにより、その配列がＭＥＫＫの発現を調節し、そしてそのため ＭＡＰＫの活性化を調節することが可能であることを今回認識した。 ＭＥＫＫはＭＡＰＫの活性化以外にも様々な他の能力において機能することも 知られている。ＭＥＫＫによる刺激化もしくは阻害のいずれかにより調節される 他の細胞性活性の調節を実施するためにＭＥＫＫの発現を調節することはそれ自 体、本発明の範囲内に含まれる。 本発明の他の態様は、ＭＥＫＫおよびＲａｆの両方がＭＡＰＫを活性化するこ とが可能であるということの認識に関する。本発明者は、ＭＥＫＫは構造的には Ｒａｆとは異なるものの、ＲａｆとＭＥＫＫとの両方がＭＡＰＫ活性の調節に関 与することを発見した。従って、所望の調節的結果を達成するためにＲａｆおよ びＭＥＫＫの発現の刺激化もしくは阻害のいずれかを行うことは本発明の範囲内 に含まれる。従って一つの態様においては、ＭＥＫＫ活性を遮断する目的でＭＥ ＫＫ発現を、例えばアンチセンス核酸配列の使用により阻害することができる。 別法では、Ｒａｆの発現を同一細胞内で同様に調節してＭＡＫＫ活性の最大阻害 を達成することができる。従ってＭＡＰＫ系の調節は、ＲａｆおよびＭＥＫＫ発 現のいずれかもしくは両方の阻害および／または刺激化により微調整することが できる。 よく知られる組換えＤＮＡ発現技術の使用を介してＭＥＫＫの発現を 調節することは本発明の範囲内に含まれる。例えば、適切な宿主細胞をＭＥＫＫ 配列で形質転換することができ、そして適切な制御因子をＭＥＫＫ配列と操作的 に連結させて所望の発現を達成することができる。 その細胞内に存在するＭＥＫＫ酵素の量は、実質的にその酵素の合成を抑制解 除する、その酵素をコードする核酸配列のコピー数を増幅させる、およびそれら の組み合わせを初めとするが、これらには限定されない様々な様式で増加させる ことができる。 本明細書で用いられる際には「酵素の合成を実質的に抑制解除する」は、通常 に野生型細胞により産生されるのと比較して一層多くの量の酵素を産生し、その 結果基質から産物への変換の量および／または率が野生型細胞におけるものと比 較して高くなることを意味する（すなわち、基質から産物への変換が亢進される ）。ＭＥＫＫ酵素合成の抑制解除は、その酵素をコードする遺伝子の転写および ／または翻訳に通常及ぼされる調節的制御を妨害すること、ならびにその酵素に 対応するメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の安定性を増加させることを初めと する様々な様式で達成することができる。例えば、各々のリプレッサーを少なく とも部分的に不活化させること、および／またはオペレーター配列を改変してそ れに結合するリプレッサーの能力を減少させることにより、通常は抑制に供され る酵素の合成を増加させることができる。転写（例えば、プロモーター）および ／または翻訳（例えば、シン−デルガルノ（Ｓｈｉｎｅ Ｄｅｌｇａｒｎｏ）配 列）制御シグナル（例えば、開始、伸長、および／または停止シグナル）の改変 もやはり、酵素産生の率および量の両方を亢進させることができる。酵素合成を 抑制解除するための方法には組換えＤＮＡ技術が含まれる。 本明細書に用いられる際には、細胞内の核酸配列のコピー数の増幅は、その細 胞のゲノム内でその核酸配列のコピー数を増加させるか、もしくは形質転換によ りその細胞内にその核酸配列の追加的コピーを導入することのいずれかにより達 成することができる。コピー数増幅は、より多くの量の酵素が産生されて、基質 から産物への変換の亢進が導かれるような様式において実施される。例えば、本 発明の核酸を含む組換え分子を細胞内に形質転換させて酵素合成を亢進させるこ とができる。形質転換は、核酸配列をある細胞内に挿入することによるいずれか の方法を用いて達成することができる。形質転換技術には、トランスフェクショ ン、電気穿孔、マイクロインジェクション、リポフェクション、吸着、およびプ ロトプラスト融合が含まれるが、これらには限定されない。形質転換後にはその 細胞は、染色体外ベクター上に留まっているか、あるいは宿主ゲノム内に取り込 まれるかのいずれかである可能性があるその核酸配列の多重コピーを産生するこ とができる。形質転換前に組換え分子上の核酸配列を操作して、より高い比活性 を有する酵素をコードさせることができる。 本発明の一つの態様は実質的に純粋なＭＥＫＫ蛋白質である。本発明に従うと 、実質的に純粋であるか、あるいは単離された蛋白質は、その天然の環境から取 り出されてきた蛋白質である。「単離された」および「実質的に純粋な」はそれ 自体、蛋白質が精製された度合いを反映する必要は必ずしもない。実質的に純粋 なＭＥＫＫ蛋白質は、その天然の源から取得することができる。実質的に純粋な ＭＥＫＫ蛋白質はまた、組換えＤＮＡ技術もしくは化学的合成を用いて産生する こともできる。本明細書に用いられる際には、実質的に純粋なＭＥＫＫ蛋白質は 全長のＭ ＥＫＫ蛋白質あるいはそのような蛋白質の相同物であることができ、この相同物 とは、アミノ酸が削除（例えば、ペプチドのようなその蛋白質の切断版）、挿入 、逆位、置換、および／または誘導化（例えば、グリコシル化、ホスホリル化、 アセチル化、ミリスチル化、プレニル化、パルミチン酸付加、アミド化、および ／またはグリコシルホスファチジルイノシトールの付加による）が施されていて 、その結果その相同物がキナーゼ活性を有し、そして／またはＭＥＫＫ蛋白質に 対する免疫応答を誘導することが可能な少なくとも一つのエピトープを含む（す なわち、当業者に知られる技術を使用してこの相同物が免疫原としてある動物に 投与される際には、この動物はＭＥＫＫ蛋白質の少なくとも一つのエピトープに 対する液性および／または細胞性免疫応答を生じるであろう）ＭＥＫＫ蛋白質の ようなものである。キナーゼ活性、キナーゼ調節活性、ならびに免疫応答をもた らすある蛋白質の能力を当業者に知られる技術を用いて測定することができる。 全長蛋白質の相同物を初めとする本発明のＭＥＫＫ蛋白質は更に、表１に開示 されるように、緊縮条件下で、ＭＥＫＫ蛋白質をコードする核酸配列の少なくと も一部分を含む核酸と（すなわち、それに）ハイブリダイズすることが可能な核 酸分子によりコードされることを特徴とする。本明細書に使用される際には、句 、ある実在物の「少なくとも一部分」は、その実在物の機能的側面を有するのに 少なくとも十分であるその実在物の量を意味する。例えば本明細書に用いられる 場合、ある核酸配列の少なくとも一部分は、緊縮条件下で安定なハイブリッドを 形成することが可能な核酸配列の量である。核酸は配列はあるｃＤＮＡ（相補的 ＤＮＡ）核酸分子の演繹化配列を表し、この産生法は以下に開示される。 （核酸配列決定技術は完璧に過誤を含まないという訳ではないため、表１に示さ れる核酸配列は、良くてもＭＥＫＫ蛋白質の少なくとも一部分をコードする核酸 分子の見かけの核酸配列を表すことが銘記されるべきである）。本明細書に使用 される際には、緊縮ハイブリッド形成条件は、オリゴヌクレオチドを初めとする 核酸分子（もしくは配列）を用いて類似配列を同定する標準的なハイブリッド形 成条件を意味する。このような標準条件は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、前述、において開示されている。本発明の好ましいＭＥＫＫ蛋白質は、 表１に示される核酸配列と少なくとも約８０パーセントの相同性（類似領域内で の同一性）を有する核酸配列によりコードされる。本発明のより好ましいＭＥＫ Ｋ蛋白質は、表１に示される核酸配列と少なくとも約８５パーセントの相同性を 有する核酸配列によりコードされ、そして本発明の更により好ましいＭＥＫＫ蛋 白質は、表１に示される核酸配列と少なくとも約９０パーセントの相同性を有す る核酸配列によりコードされる。 ＭＥＫＫ蛋白質相同物は、天然の対立遺伝変異もしくは天然の突然変異の結果 であることが可能である。ＭＥＫＫ蛋白質相同物はまた、その蛋白質への直接的 改変、あるいは無作為的もしくは標的化突然変異誘発を実施するための例えば古 典的技術もしくは組換えＤＮＡ技術を用いるその蛋白質をコードする遺伝子への 改変を初めとするが、これらには限定されない当業者に知られる技術を使用して 産生することもできる。相同物を初めとする本発明の単離された蛋白質を、哺乳 類のＭＥＫ蛋白質をリン酸化する、および／またはＭＥＫＫ蛋白質に対する免疫 応答を誘導するその蛋白質の能力により簡単な様式で同定することができる。本 発明のＭＥＫＫ蛋白質への改変は全長ＭＥＫＫ蛋白質を切断することを 含む。本発明のＭＥＫＫ蛋白質への好ましい改変は例えば、少なくとも一部分の 調節ドメイン（表２に示される）を欠損させて構成的に活性なＭＥＫＫ蛋白質を 産生すること、少なくとも一部分の触媒ドメイン（表２に示される）を欠損させ て、ＭＥＫＫ活性を調節することが可能な蛋白質のインヒビターとして作用する ことが可能な不活性ＭＥＫＫ蛋白質を産生すること、ＭＥＫＫ蛋白質の内の少な くとも一部分の調節ドメインを単離してＭＥＫＫ調節蛋白質を阻害することが可 能な分子を産生させること、および触媒ドメイン（すなわち、ホスホトランスフ ェラーゼドメイン）中のリシン残基をメチオニン残基で置換して触媒ドメインを 不活化させることを含む。 触媒ドメインを含むが調節ドメインは含まないＭＥＫＫ１の２つの切断形態を 標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して作成した。表２を参照すると、第一切断化 ＭＥＫＫ分子は残基１から残基２１５まででＭＥＫＫ１を切断することにより産 生され、そのことによりＰＰＰＳＳヒンジ配列および調節ドメインの欠損が生じ て切断化ＭＥＫＫ分子ＰＰＰＳＳ−ｔｒｕｎｃが形成された。第二のより小さい 切断化ＭＥＫＫ分子は残基１から残基１まででＭＥＫＫ１を切断することにより 産生され、このことによりＰＰＰＳＳヒンジ配列および調節ドメインが除去され て切断化ＭＥＫＫ分子Ｎｃｏ１−ｔｒｕｎｃが形成された。ＰＰＰＳＳ−ｔｒｕ ｎｃおよびＮｃｏ１−ｔｒｕｎｃのＭＡＰＫ活性を活性化させる能力を全長ＭＥ ＫＫ蛋白質および陰性対照蛋白質と比較した。図１５に示される結果は、切断化 ＭＥＫＫ分子は全長ＭＥＫＫよりも一層活性であることを示す。実際に切断化Ｍ ＥＫＫ分子は、全長ＭＥＫＫ蛋白質と比較すると少なくとも約１．５倍高い活性 であった。従って、ＭＥＫＫの調節 ドメインの除去は触媒ドメインの活性の抑制解除を行い、酵素活性の改善をもた らす。 本発明の単離化蛋白質の最低限のサイズはエピトープを形成するのに十分であ り、これは典型的には少なくとも約７から約９までのアミノ酸のサイズである。 当業者は気づいているように、エピトープは、天然の状態で互いに接近している アミノ酸、ならびに天然の蛋白質の三次構造に起因して、ごく十分に接近してエ ピトープを形成するアミノ酸を含むことができる。 機能的に等価な核酸配列は、生物学的に活性な酵素をコードする核酸配列の能 力を実質的に妨害することのないヌクレオチド欠損、添加、逆位、および／また は置換のような改変を含む核酸配列を含むことができる。すなわち本発明の機能 的に等価な核酸配列は、それらの天然の対応物に類似する生物学的活性を有する 酵素をコードする。機能的に等価な真核生物の核酸配列はまた、その核酸配列の コーディング領域の周辺および／またはその中に含まれる介在配列および／また は非翻訳配列を含むことができる。 機能的に等価な核酸配列は、当業者に知られる方法を用いて取得することがで きる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、前述、を参照せよ）。例えば 、核酸配列は、部位特異的突然変異誘発、突然変異を誘導するための核酸の化学 的処理、核酸断片の制限酵素開裂、核酸断片の連結、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ ＣＲ）増幅、および／または核酸配列の選択される領域の突然変異誘発、核酸配 列の混合物を「構築」するためのオリゴヌクレオチド混合物の合成および混合群 の連結、ならびにそれらの組み合わせ物のような古典的突然変異誘発技術および 組換えＤ ＮＡ技術を初めとするが、それらには限定されない様々な技術を使用して改変す ることができる。機能的に等価な核酸は、その核酸配列によりコードされる蛋白 質の機能についてスクリーニングすることにより改変化核酸配列の混合物から選 択することができる。数々のスクリーニング技術が当業者に知られており、それ らには、相補性アッセ、結合アッセイ、および酵素アッセイが含まれるがこれら には限定されない。形質転換は、核酸配列を細胞内に挿入することによるいずれ かの方法を使用して達成することができる。形質転換技術には、トランスフェク ション、電気穿孔、マイクロインジェクション、リポフェクション、吸着、およ びプロトプラスト融合が含まれるが、これらには限定されない。組換え細胞は単 細胞性のままであることができるか、あるいは組織もしくは多細胞生物体内で増 殖することができる。本発明の形質転換化核酸配列は染色体外に留まることがで きるか、あるいは発現されるそれらの能力を保持するような様式で宿主の染色体 内の一つもしくは複数の部位内に組み込まれることができる。本発明の酵素をコ ードする核酸配列の発現がプラスミド配列の発現もしくは宿主ゲノム内へ組み込 まれる配列に起因する可能性があるということは、それ自体本発明の範囲内に含 まれる。 組換え細胞を、一つもしくは複数の組換え分子で宿主細胞を形質転換させるこ とにより産生させ、その組換え分子の各々が、一つもしくは複数の転写制御配列 を含む発現ベクターに操作的に連結される本発明の一つもしくは複数の核酸配列 を含むことが好ましい。細胞は一つもしくは複数の組換え分子で形質転換させる ことができる。 本明細書において使用される際には、節「操作的に連結される」は、ある核酸 配列の、宿主細胞内に形質転換させた際にその配列が発現され ることが可能であるような様式における発現ベクター内への挿入を意味する。本 明細書において使用される際には発現ベクターは、宿主細胞を形質転換させるこ と、宿主細胞内で複製すること、および特定される核酸配列の発現を実施するこ とが可能なＤＮＡもしくはＲＮＡベクターである。発現ベクターは原核生物性も しくは真核生物性のいずれかであることができ、そして典型的にはウイルスもし くはプラスミドである。 本発明の核酸配列を、プロモーター、オペレーター、リプレッサー、エンハン サー、停止配列、複製起点、ならびに宿主細胞に適合しかつ核酸配列の発現を制 御する他の調節配列を含む発現ベクターに操作的に連結させることができる。具 体的には、本発明の発現ベクターは転写制御配列を含む。転写制御配列は、転写 の開始、伸長、および停止を調節する配列である。特に重要な転写制御配列は、 プロモーター、エンハンサー、オペレーター、およびリプレッサー配列のような 転写開始を制御するものである。適切な転写制御配列は、本発明の宿主細胞の内 の少なくとも一つにおいて機能することができ、かつ細菌、イースト、真菌類、 昆虫、動物、および植物の転写制御配列を含むことができるいずれかの転写制御 配列を含む。 本発明の組換え分子は、形質転換される予定の細胞内の核酸配列の発現を効果 的に調節することが可能ないずれかの転写制御配列に操作的に連結される、本明 細書に記載されるいずれかの核酸配列組み合わせ物であることができる。 本発明の組換え細胞は、本発明のいずれかの核酸配列で形質転換されるいずれ かの細胞を含む。 組換えＤＮＡ技術の使用は、例えば、宿主細胞内での核酸配列のコピ ー数、それらの核酸配列が転写される効率、得られる転写物が翻訳される効率、 および翻訳後改変の効率を操作することにより形質転換化核酸配列の発現を改善 することができる。酵素をコードする核酸配列の発現を増加させるのに有用な組 換え技術は、高コピー数プラスミドへの核酸配列の操作的連結、一つもしくは複 数の宿主細胞染色対内への核酸の組込み、プラスミドへのベクター安定化配列の 添加、転写制御シグナル（例えば、プロモーター、オペレーター、エンハンサー ）の置換もしくは改変、翻訳制御シグナル（例えば、リボソーム結合部位、シン −デルガルノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄｅｌｇａｒｎｏ）配列））の置換もしくは改変、 酵素をコードする核酸配列の宿主細胞のコドン使用に対応させるための改変、転 写物を脱安定化させる配列の欠失、および培養中の組換え酵素産物から組換え細 胞増殖を一時的に分離する制御シグナルの試用を含むがこれらには限定されない 。本発明の発現化組換え酵素の活性は、既述の経路に関連する酵素をコードする 核酸配列を断片化、壊変、もしくは誘導化することにより改善することができる 。 本発明はまた、細胞の表面上のレセプターから開始するシグナルを調節するこ とが可能な化合物を同定する方法も含む。このような方法は、（ａ）ＭＥＫＫ蛋 白質を含む細胞を仮定的な調節化合物と接触させる段階、（ｂ）その細胞を、そ の細胞の表面上のレセプターに結合することが可能なリガンドと接触させる段階 、（ｃ）ＭＥＫＫ蛋白質のリン酸化を決定することによりその仮定的な調節配列 の細胞性シグナルを調節する能力を評定する段階、を含む。段階（ｃ）は、ＭＥ ＫＫ蛋白質のＭＥＫ蛋白質をリン酸化する能力を測定することによりＭＥＫＫ蛋 白質の活性化を決定することを含む。 他の態様においては、細胞内でのシグナル変換を調節することが可能な化合物 を同定する方法は、（ａ）仮定的な阻害性化合物をＭＥＫＫ蛋白質と接触させて 反応混合物を形成する段階、（ｂ）その反応混合物をＭＥＫ蛋白質と接触させる 段階、および（ｃ）その仮定的な阻害性化合物のＭＥＫＫ蛋白質によるＭＥＫ蛋 白質のリン酸化を阻害する能力を評定する段階、を含む。段階（ｃ）から取得さ れる結果をＭＥＫ蛋白質をリン酸化するＲａｆ蛋白質の能力を阻害する仮定的阻 害性化合物の能力と比較して、その化合物がＲａｆ蛋白質に非依存的なＭＥＫＫ 蛋白質を必要とするシグナル変換を選択的に調節することができるかどうかを決 定することができる。前述の方法において用いられるＭＥＫＫ、ＭＥＫ、および Ｒａｆ蛋白質は組換え蛋白質もしくは天然に取得される蛋白質であることができ る。 本発明の他の態様は、細胞の表面上のレセプターから開始されるシグナルを調 節する化合物を同定するためのキットを含む。このようなキットは、（ａ）ＭＥ ＫＫ蛋白質を含む少なくとも一つの細胞、（ｂ）その細胞の表面上のレセプター に結合することが可能なリガンド、および（ｃ）仮定的な調節化合物のＭＥＫＫ 蛋白質のリン酸化を変化させる能力を評定するための手段、を含む。リン酸化を 決定するためのこのような手段は、例えばリン酸化をホスホセルロースブロット 用試薬を用いて検出することができる当業者に知られる方法および試薬を含む。 他の態様では本発明のキットは、（ａ）ＭＥＫＫ蛋白質、（ｂ）ＭＥＫ蛋白質 、および（ｃ）仮定的阻害性化合物のＭＥＫＫ蛋白質によるＭＥＫ蛋白質のリン 酸化を阻害する能力を評定するための手段、を含むことができる。本発明のキッ トは更に、Ｒａｆ蛋白質、およびＭＥＫ蛋白 質をリン酸化するＲａｆ蛋白質の能力を阻害する仮定的阻害性化合物の能力を決 定するための手段を含むことができる。 本発明の一つの態様は、ある動物に有効な様式で投与した際に、その動物の細 胞内でのシグナル変換を調節することが可能な治療的組成物である。具体的には 、このような治療的組成物は、癌、自己免疫疾患、炎症性応答、アレルギー性応 答、ならびにパーキンソン病およびアルツハイマー病のような神経性疾患のよう な医学的疾患を治療するための動物への投与に有用である。治療的組成物は、Ｍ ＥＫＫ蛋白質の少なくとも一部分、および／または本発明のＭＥＫＫ蛋白質の少 なくとも一部分をコードする核酸を含むことができる。治療的組成物は、キナー ゼ活性および／またはキナーゼ調節的活性を有するＭＥＫＫ蛋白質を含むことが できる。治療的組成物は、キナーゼドメインおよび／またはキナーゼ調節ドメイ ンを有するＭＥＫＫ蛋白質を含むことができることが好ましい。 治療的組成物は適切な担体を含むこともできる。本明細書において用いられる 際には「担体」は、本発明の化合物をインビトロもしくはインビボで作用の適切 な部位に輸送するための輸送機関として適切ないずれかの物質を意味する。担体 はそれ自体、本発明の化合物を含む治療的組成物の賦形剤もしくは製剤として作 用することができる。 本発明のこれまでの記述は詳細な説明および記述の目的で提示されている。そ の上この記述は、本発明内に開示される形式表現に本発明を制限することを意図 してはいない。結果として先の教示にふさわしい変法および改変物、ならびに関 連技術分野内の技術もしくは知識は本発明の範囲内に含まれる。本明細書内に記 述される好ましい態様は更に、本発明を実施することの既知の最善方法を説明し 、そして様々な態様におい て、かつ本発明の具体的な適用もしくは試用により必要とされる様々な改変法を 用いて本発明を利用することを当業者に可能にさせることを意図する。添付され る請求の範囲は、従来の技術により許容される範囲までの代理態様を含むものと みなすことが意図される。

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９５年５月１５日 【補正内容】 請求の範囲 １．表１に示されるアミノ酸配列を含む、実質的に純粋な蛋白質。 ２．表２に示されるアミノ酸配列を含む、実質的に純粋な蛋白質。 ３．前記蛋白質がＳｒｃ相同物２もしくはＳｒｃ相同物３ドメインを含まない 、請求の範囲１もしくは２の蛋白質。 ４．前記蛋白質がセリンおよびスレニンに富む部分を含む、請求の範囲１もし くは２の蛋白質。 ５．前記蛋白質がキナーゼ触媒ドメインを含む、請求の範囲１もしくは２の蛋 白質。 ６．前記蛋白質がＭＥＫもしくはＭＡＰＫ蛋白質を活性化することが可能な、 請求の範囲１もしくは２の蛋白質。 ７．前記蛋白質が、Ｒａｆ蛋白質に非依存的に哺乳類のＭＥＫをリン酸化する ことが可能な蛋白質をコードする核酸配列によりコードされる、請求の範囲１も しくは２の蛋白質。 ８．前記蛋白質を用いてＭＥＫＫ蛋白質に結合することが可能な抗体を産生す る、請求の範囲１もしくは２の蛋白質。 ９．前記抗体がモノクローナルである、請求の範囲７の蛋白質。 １０．表１に示される核酸配列によりコードされる、実質的に純粋な蛋白質。 １１．哺乳類のＭＥＫ蛋白質をリン酸化することが可能であり、そしてセリンお よびスレオニンに富む部分ならびにキナーゼ触媒ドメインを含み、かつＳＨ２も しくはＳＨ３ドメインを含まない実質的に純粋なＭＥＫＫ蛋白質。 １２．前記蛋白質が、ＭＥＫもしくはＭＡＰＫ蛋白質を活性化するこ とが可能な、請求の範囲１１の蛋白質。 １３．前記蛋白質が少なくとも６７２のアミノ酸を含む、請求の範囲１１の蛋白 質。 １４．前記蛋白質が表２に示されるアミノ酸配列を含む蛋白質としての様式で機 能する、請求の範囲１１の蛋白質。 １５．ＭｇＣｌ₂およびＡＴＰを含む反応混合物中に約４０分間、前記混合物を 約ｐＨ６．０とｐＨ８．０との間のｐＨに維持した後にＭＥＫ蛋白質をリン酸化 することが可能であって、かつ前記蛋白質がＲａｆ蛋白質から区別されるアミノ 酸配列を有するものである請求の範囲１１の実質的に純粋な蛋白質。 １６．Ｒａｆ蛋白質に非依存的にＭＡＰＫ蛋白質の活性を調節することが可能で あって、かつ前記蛋白質は前記Ｒａｆ蛋白質から識別されるアミノ酸配列を有す るものである請求の範囲１１の実質的に純粋なＭＥＫＫ蛋白質。 １７．ＭＡＰＫ蛋白質の活性を調節することにより、ある細胞の表面上の成長因 子レセプターから開始されるシグナルを調節することが可能であって、かつ調節 する前記能力が、Ｒａｆ蛋白質シグナル調節から分岐しているものである請求の 範囲１１の実質的に純粋なＭＥＫＫ蛋白質。 １８．前記成長因子レセプターがヘテロ三量体のグアニンヌクレオチド結合性蛋 白質に結合する、請求の範囲１６の蛋白質。 １９．前記成長因子レセプターが、トロンビンレセプターおよびムスカリン性レ セプターからなる群より選択される、請求の範囲１７の蛋白質。 ２０．イーストのフェロモン−応答性プロテインキナーゼ系からの哺 乳類細胞における分岐を表し、かつ前記蛋白質が、Ｒａｆ蛋白質に非依存的にＭ ＡＰＫ蛋白質を調節することが可能なものである請求の範囲１１の実質的に純粋 なＭＥＫＫ蛋白質。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．哺乳類のＭＥＫ蛋白質をリン酸化することが可能な実質的に純粋なＭＥＫ Ｋ蛋白質（前記ＭＥＫＫ蛋白質は触媒ドメインを含む）。 ２．前記蛋白質の活性が抑制解除される、請求の範囲１の蛋白質。 ３．実質的に純粋なＭＥＫＫ蛋白質（前記蛋白質はＭＥＫＫ活性を阻害するこ とが可能であり、前記蛋白質はＭＥＫＫ調節的ドメインを含む）。 ４．ＭＡＰＫ蛋白質の活性を調節することが可能な実質的に純粋なＭＥＫＫ蛋 白質（前記蛋白質はＲａｆ蛋白質から区別されるアミノ酸配列を有する）。 ５．ＭＡＰＫ蛋白質の活性を調節することにより、ある細胞の表面上の成長因 子レセプターから開始されるシグナルを調節することが可能な実質的に純粋なＭ ＥＫＫ蛋白質（調節する前記能力はＲａｆ蛋白質シグナル調節から分岐している ）。 ６．表１、表２、および表３において示される配列からなる群より選択される アミノ酸配列を含む実質的に純粋な蛋白質。 ７．実質的に純粋な蛋白質（前記蛋白質は、哺乳類のＭＥＫ蛋白質をリン酸化 することが可能でありかつＲａｆ蛋白質に非依存的にＭＡＰＫＥ蛋白質の活性を 調節することが可能なＭＥＫＫ蛋白質に選択的に結合することが可能な抗体を試 用して単離され、前記抗体は、（ａ）ある動物に請求の範囲１に示される実質的 に純粋な蛋白質の有効量を投与すること、および（ｂ）前記ＭＥＫＫ蛋白質に選 択的に結合することが可能な抗体を回収すること、を含む方法により産生するこ とが可能である）。 ８．ＭＥＫＫ蛋白質に選択的に結合することが可能な単離された抗 体（前記抗体は、ある動物に請求の範囲１に示される実質的に純粋な蛋白質の有 効量を投与すること、および前記ＭＥＫＫ蛋白質に選択的に結合することが可能 な抗体を回収することを含む方法により産生することが可能である）。 ９．Ｒａｆ蛋白質に非依存的に哺乳類のＭＥＫをリン酸化することが可能であ り、かつＭＡＰＫ蛋白質の活性を調節することが可能な蛋白質をコードする配列 を有する単離された核酸分子。 １０．表１、表２、および表３に示される配列からなる群より選択されるアミノ 酸配列をコードする単離された核酸分子。 １１．ある細胞の表面上のレセプターから開始されるシグナルを調節することが 可能な化合物を同定する方法であって、 ａ）ＭＥＫＫ蛋白質を含む細胞を仮定的な調節化合物と接触させるこ と、 ｂ）前記細胞を前記レセプターに結合することが可能なリガンドと接 触させること、および ｃ）前記ＭＥＫＫ蛋白質のリン酸化を決定することにより前記シグナ ルを調節する前記仮定的な調節化合物の能力を評定すること、を含む、前記方法 。