JPH04502011A - ポリペプチド誘導体 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 ポリペプチド誘導体 本出願は誘導体化されたポリペプチド、特に細胞分化抗原ＣＤ４およびＨＩＶ感 染の処置のための治療薬としてそれを使用することに関する。

ＨＩＶによる感染の結果として起こる第一の免疫異常は、ＣＤ４細胞表面糖タン パク質を発現するＴリンパ球の進行性の減少および機能的な損傷である［８．　 Ｌａｎｅら、Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　３：　４７７（１９８５ ）］。

ＣＤ４は非多形性の糖タンパク質であり、免疫グ白プリン遺伝子上科に相同性を 有する［Ｐ、　１ｌａｄｄｏｎら、　Ｃｅ１ｌ　４２　：　９３（１９８５）］ 。ＣＤ８表面抗原と共にＣＤ４は成熟末梢Ｔ細胞の２つの異なるサブセットを規 定し［Ｅ、　Ｒｅ１ｎｈｅｒｚら、　Ｃｅ１ｌ　１９　：　８２１（１９８０） ］、これらはそれぞれクラスＩおよびクラスＩＩ主要組織適合コンプレックス（ ＭＨＣ）抗原に関連して名目上の標的抗原と相互作用する能力によって区別され る［Ｓ、Ｓｗａｉｎ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　７８　 ：　７１０１（１９８１）　；　Ｅ、Ｅｎｇｌｅｌａｎら、Ｊ、Ｉｗａ＋ｕｎｏ １．　１２７　：　２１２４（１９８１）　；　Ｈ，５ｐｉｔｚら、Ｊ、Ｉ＋＋ ｕｅｕｎｏ１．　１２９：　１５６３（１９８２）　；　ｆ、Ｂｉｄｄｉｓｏｎ ら、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、１５６　：　１０６５（１９８２）　；およびり、　 ｆｉｌｄｅら、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１３１　：　２１７８（１９８３） ］。ＣＤ４　Ｔ細胞の大部分はヘルパー／インデューサー下細胞表現型を示すが ［Ｅ、　Ｒｅ１ｎｈｅｒｚ、同上］、細胞障害性／サプレッサーＴ細胞と特徴付 けられるＣＤ４　Ｔ４細胞も同定されている［Ｙ、　ＴｈｏＩＩｌａｓら、　Ｊ 、　Ｅｘｐ、１ｌｅｄ、　１５４：４５９（１９８１）　；　Ｓ、　Ｍｅｕｅｒ ら、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７９　：　４３９５（ １９８２）；および＾、　Ｋｒｅｎｓｋｙら、　ｊ’ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃ ａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７９　：　２３６５（１９８２）］。ＣＤ４ヘルパ ー／インデューサーＴ細胞機能の損失は、おそらく後天性免疫不全症候群（ＡＩ ＤＳ）の日和見感染および悪性腫瘍の特徴を導く細胞性および体液性免疫におけ る重篤な欠陥の基礎となるものである［ｔｌ、　Ｌａｎｅ、同上］。

正常提供者およびＡＩＤＳ患者から得たＣＤ４およびＣＤ８　Ｔ細胞分画のＨＩ Ｖ−Ｉ感染についての研究の結果、ＣＤ４　Ｔ細胞の減少は、このＴリンパ球サ ブセットに選択的に感染し、その中で複製し、最終的にこれを破壊するＨ　Ｉ　 Ｖ　−１の能力に起因するものであることが明らかとなったＥＤ、　Ｋ１ａｔｚ ＋ｍａｎｎら、　５ｃｉｅｎｃｅ　２２５　：　５９（１９８４）］。ＣＤ４自 体がＩ（Ｎ　Ｖ−川に対する細胞レセプターの必須構成部分であるという可能性 は、ＣＤ４に対して指向性のモノクロ・−ナル抗体がＨＩＶ−１感染およびシン ／チウム誘導を）［、′Ｉラックるという観察によって最初に示された［＾、　 Ｄａｌｇｌｅｉｓｈら、粋赳仔（Ｌｏ口ｄｏ口）３ｊ２　：　７６’７Ｃ１９８ ４）　；　Ｊ、　ＭｃＤｏｕｇａｌら。Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３５　：　３１ ５１（１９８５）］。

Ｊ−の仮説は、（，１：　ｌ）　４とｇｐ１２０（Ｉ（ＩＶ−川の主エンベＬ７ −プ糖タ〕／バク質）の間で分子コンプレックスが形成されることが示された二 と１．’Ｊ、　ＭｃＤｏｕｇａｌら、　５ｃｉｅｎｃ、ｅ　２３１　：　３８２ （１９８６）］により、およびＣ１）４ｃＤＮＡの安定した発現に続いてＨＩ　 Ｖ−１同性（トロビズ人）が通常は非許容性のヒ）・細胞に付与され得ることが 発見されたこと［Ｐ。

Ｍａｄｄｏｎら、　Ｃｅ１ｌ　４７　：　３３３（１９８６）］により確認され た。さらに、ＨＩＶ−Ａ感染個体において中枢神経系の機能不全が高頻度で起こ ることにより示されるｉ（Ｉ　Ｖ　−１の神経親和性の性質［１，５ｎｉｄｅｒ ら、＾ｎｎ。

を髄液においてＨＩＶ−１の検出がｂ１能であること［Ｇ、　Ｓｈａｍら、　Ｓ ｃｉ：　１４９８（１９８５）　；　Ｊ、　Ｌｅｖｙら１則＝！具：　５８６（ １９８５）］は、ニューロン、ゲリア細胞および単球、／マクロファージ起源の 細胞におけるＣＤ４０発現を説明するものであるようである［Ｐ、　１ｌａｄｄ ｏｎ、　Ｃｅ１ｌ　４７　：　４４４（１９８６）　；　１．　Ｆｕｎｋｅら、 Ｊ、Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、１６５　：　１２３０（１９８６）　；　Ｂ’、Ｔｏｕ ｒｖｉｃｉｌｌｅら、５ｃｉｅｎｃｅ　２３４　：　６１０（１９８６）ｌ。

ＨＩＶ−１感染に対する感受性の決定に加えて、感染宿主細胞における細胞変性 作用の出現にはＣＤ４が関係しているようである。

ＣＤ４に対する抗体はインビトロで１−１１　’Ｖ　−１感染細胞と未感染ＣＤ ４　Ｔ細胞の融合を抑制することが見いだされ、さらにこの現象より生じる多核 巨細胞は生成後短時間で死に至り、ＣＤ４細胞数が減少する結果になることが見 いだされた［Ｊ、Ｌｉｆｓｏｎら、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３２：　１１２３（１ ９８６）コ。また、シン／チウムの生成はｇｐｌ、２０の発現を必要とし、他の ウィルスの構造タンパク質または調節タンパク質の非存在下でＣＤ４陽性セルラ インをＨＩＶ−１ｅｎｖ遺伝子を発現するセルラインと同時培養することによ− て誘導することができるＵＪＳｏｄｒｏｓｋｉら、Ｎａｔｕｒｅ　３２２　：　 ４７０（１９８６）；　Ｊ、　Ｌｉｆｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ　３２３　：　７ ２５（１，９８６）］。即ち、ＨＩ　Ｖ　−、Ｉによる最初の感染ならびに最終 的な細胞の死の両者を媒介する際のｇｐｉ２０とＣＤ４の相互作用が、治療的な 介入を加え易いウィルスのライフサイクルにおける重要な着目点の一つを構成す る［Ｈ，Ｍｉ　ｔｓｕｙａら、　Ｎａｔｕｒｅ　３２５　：　７７３（１９８７ ）］。

ＣＤ４前駆体の既知の配列は、疎水性のシグナルペプチド、約３７０アミノ酸の 細胞外領域、クラスＩＩＭＨＣベータ鎖のメンブランースパニング・ドメインに かなりの同一性を有する疎水性の高い部分、および高荷電の４０残基の細胞内配 列を予想させる［Ｐ、　）ｌａｄｄ。

ｎ、　Ｃｅ１ｌ　４２　：　９３（１９８５）］。ＣＤ４の細胞外ドメインは４ つの隣接領域からなり、そのそれぞれが免疫グロブリンＬ鎖の可変および結合（ ■−Ｊ）ドメインならびに免疫グロブリン遺伝子工科の他の構成メンバー中の関 連領域にアミノ酸および構造的類似性を有している。

ＣＤ４のこれら構造的に類似する領域はｖｌ、ｖ２、■３およびｖ４ドメインと 称されている。

多くの受容体が関与する異常を治療するための薬物の開発において成功を収めて きた方法は、天然のりカントの結合をブロックする拮抗薬を同定することであっ た。通常、ＣＤ４はＨＩ　Ｖエンベロープの認識部位に結合するので、これらＨ ＩＶ部位を治療的に封鎖し、それによりウィルスの感染性をブロックするための 候補となると考えられる。しかし、天然のＣＤ４は細胞の脂質二重層に固定され る細胞膜タンパク質である。

天然のＣＤ４の膜固定の性質は、製造、精製および臨床使用という見地からは望 ましくなく、その結果、トランスメンブラン・ドメインが削除されたＣＤ４アミ ノ酸配列変異体が作成されている。インビトロの細胞培養において、これらのＣ Ｄ４変異体は水溶性であり、ＨＩＶ複製を抑制することが示されている［例えば 、５Ｉｉｔｈら。

５ｃｉｅｎｃｅ　２３８　：　１７０４−１７０７（１９８７）　；　Ｆｉｓｈ ｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ　３３１　：　７６−７８（１９８８）　：　Ｈｕｓｓｅ ｙら、Ｎａｔｕｒｃｙ　３３１　：　７８−８２（１９８８）　；　Ｄｅｅｎら 、Ｎａｔｕｒｅ　３３１　：８２−８４（１９８８）］。免疫グロブリンＬｉｎ ｔとＣＤ４の融合体が記載されている［Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、　Ｎａｔｕｒ ｅ　３３１　：　８４−８６（１９８８）］。

ある種のタンパク質をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリオキシエチ レンとポリオキシプロピレンの共重合体で共有結合修飾することにより、インビ ボでの血漿半減期を上昇させ、免疫原性を減少させ、モして／または水溶性を上 昇させることが示されている。例えば、Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉら［Ｊ、　Ｂｉｏ ｌ、　Ｃｈｅｗ、　２５２：３５８２−３５８６（１９７７）］；＾ｂｕｃｈｏ ｗｓｋｉら［Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｒｅａｔｓｅｎｔ　Ｒｅｐ、　６３　：　１１２ ７−１１３２（１９７９）］　；　Ｐｙａｔａら［Ｒｅｓ、　Ｃｏｍａ＋ｕｎ、 Ｃｈｅｔ　Ｐａｔｈｏｌ、Ｐｈａｒｗａｃｏｌ、２９：　１１３−１２７（１９ ８Ｑ）］　；　Ｎａｏｉら［Ｊ、＾ｐｐ１．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　６　：　９ｌ −１０２（１９８４）］　；およびＵ、Ｓ、　４゜６０９、５４６を参照。しか し、ＰＥＧを用いた共有結合によるタンパク質の修飾は、生物学的活性の損失を 招くことが多い。Ｆｌａｒｒｉｓ　［Ｒｅｖ。

Ｍａｃｒｏｉｏｌ　Ｃｈｅｗ、　Ｐｈｙｓ、　２５（３）　：　３２５−３７３ （１９８５）］が記載しているように、過度のタンパク質の失活を生じることに 関しては、［作用が系ごとに太き（変化するので、一般的な規則はないようであ る」。

最近のデータによりリジン残基がｇｐ１２０との結合において重要な役割を担っ ているらしいことが示唆されている。Ｐｅｔｅｒｓｏｎおよび５ｅｅｄは、ＣＤ Ｊ中の８アミノ酸セグメント（アミノ酸４２−４９；５ｅｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ− Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−３ｅｒ）がｇｐｔ２ｏの結合に必須であるこ とを見い出した［Ｃｅ１ｌ　５４　：　６５　（１９８８）］。例えば、このセ グメントを削除するとｇｐ１２０の結合が失われるだけでな（、Ｌｙｓ４６をＡ ｓｎと、そしてＧ　ＩＹ４７をＶａｌと置換することによってもｇｐ１２０の結 合が失われる。その後、Ｃ１ａｙｔｏｎらも、ＣＤ４のこの領域のりジン残基を 除去するアミノ酸置換によりｇｐ１２０の結合が大きく変化することを示したＵ Ｎａｔｕｒｅ、　３３５　：　３６３（１９８８月。例えば、Ｌ　ｙｓ５０の代 わりにＰｒｏを、Ｌｅｕ５１の代わりにＳｅｔを、モしてＧ１ｙ４８の代わりに Ｐｒｏを置換することによりｇｐ１２０の結合が失われる。

我々は、ＣＤ４の先端切除した形態が、皮下または筋肉内注射後の不完全な生物 利用性および血清タンパク質に比べてインビボで短い血漿半減期を有することを 見い出した。これは、患者に存在するＨＩＶ、ＨＩＶ（Ｄｇｐｌ　２０、または ＨＩＶ感染細胞に結合スル循環ＣＤ４のインビボでの迅速かつ持続的な利用性に 依存するであろうＣＤ４治療法に関しては望ましくない。持続注入によりＣＤ４ を投与することは可能であるが、これは患者にとって不便かつ費用がかかり、患 者において達成し得る安定濃度を制限するものである。

従って本発明の目的は、延長された生物学的半減期を示す新規ＣＤ４分子を提供 することである。

本発明のもう１つの目的は、細胞表面ＣＤ４へのｇｐ１２０の結合をブロックし 、インビボおよびインビトロでＨＩＶの複製を抑制するＣＤ４の能力を改善する ことである。

さらに別の目的はＣＤ４の生物利用性を高めることである。

本発明の別の目的は、ＣＤ４の溶解性、ｐｉ、および分子量の修飾を含む物理化 学的性質を改良することである。

もう１つの目的は、ＣＤ４の免疫学的性質を改良すること、特に、不都合な免疫 学的反応および免疫が関与するクリアランス（浄化）を防ぐために免疫原性を減 少させることである。

本発明者らは、非タンパク性のポリマーをＣＤ４にコンジュゲートさせ、それに よって水溶性かつ他の所望の性質を示すＣＤ４誘導体を調製することにより上の 目的が成し遂げられることを見い出した。好ましい態様では、このポリマーはポ リエチレングリコール（ＰＥＧ）であり、これがトランスメンブラン領域を除去 したＣＤ４アミノ酸配列変異体のアミノ基に共有結合してＬ）る。

他の態様においては、非タンパク性のポリマ”−１特にＰＥＧはＣＤ４などの糖 タンパク質の炭水化物°買換基に共有結合しており、それにより水溶性ポリペプ チド誘導体が得られる。

本明細書におけるＣＤ４とは、天然の完全長ＣＤ４、または天然ＣＤ４のｇｐ１ ２０結合特性を有し、ＣＤ４のｇｐ１２０結合ドメインを含有するあらゆるポリ ペプチド、ならびにｇｐ１２０に結合することができる天然ＣＤ４のアミノ酸配 列変異体であると定義される。

有用なＣＤ４アミノ酸配列変異体は、実施例に記載の自体既知の分析方法に従い ｇｐ１２０に結合するその能力を測定することにより簡単に同定される。一般に は、このような変異体は２つのグループの一方または両方に属する。】、つのグ ループは、細胞膜挿入が不可能となるように少なくともトランスメンブラン・ド メインが不活性化されているＣＤ４変異体を包含する。これは通常、トランスメ ンブラン・ドメインの削除により為され、所望により、ＣＤ４の最初の２つの可 変領域様ドメインの下流に位置する細胞外配列の全ておよび細胞質ドメインを削 除することを含む。第二のグループは、アルダこン、トランスノエリ：２または 免疫グロブリンなどの長い血漿半減期を６′夕る血ｔｆ１ｙンバク質とＣＤ４の 融合体を包含する。ＣＤ４ポリペプチドはり〉゛ンＮ末端（天然の配列）である か、またはリジンの代わりにアスパラギンもしくは他の適当な残基をＮ末端に有 する。

ＣＤ４変異体は親、出願に記載され”Ｃいる。

ＣＤ　４は咄乳動物組換え細胞培質において発現さね、そして天然から糖タンパ ク質とｌ−Ｃ単離されるが、これは炭水化物置換基を含むポリベブナトと１７て 定義される。糖タンパク質においでは、通常、炭水化物はフコース、Ｎ−アセチ ルグル」ザミン、ガラクト−ス、。

マンノース、Ｎ−”Ｆセチル２ノイラ−ン酸（シアル酸）およびその他の糖残基 を含む分岐型のポリ勺ツカリドである。炭水化物はＮ結合グリコ２・ル化部位（ ａｓｐ　Ｘ　ｔｈｒ／ｓｅｒ；こ、−１てＸは任意の残基）で置換されるか、ま たは他のポリペブチｌ−においては０結合部位（通常はセリシンもしくはＯおよ びＮ結合部位の両方で置換されている。組換えＣＨＯ細胞由来の先端切除ＣＤ４ の炭水化物組成を以下に示す（２つのＮ結合部位が存在するが、２つの部位間の それぞれの糖の配分比は今のところ未知である）。

ｒＣＤ４の炭水化物組成 フコース　０．５４±０．０３ Ｎ−アセチルゲルコサミノ　６．３　±０．Ｊ」ガラクトース　４．０　±０． １２ ′平均±Ｓ、Ｄｌｎ＝２） 他の組換え宿主細胞から得たＣＤ４は別の糖を含むことがあり、上に示した糖の 相対比が変わることもあることは理解されるであろう３．炭水化物−ポリマー置 換基の数を増加させたり位置を変化させるために、ＣＤ４ポリペプチドの部位指 向性の突然変異誘発によりグリフンル化部位を移動、追加もしくは削除すること は本発明の範囲内にあるものとする。また、ＣＤ４に結合させる非タンパク性の ポリマーが、天然もしくは出発のＣＤ４分子に存在するであろうオリゴサツカリ ド以外のものであることは理解されるであろう。即ち、このポリマーはＣＤ４に 対して外性もしくは異種のものである。

通常、非タンパク性のポリマーは親水性の合成ポリ′マー、即ち他の方法では天 然に見い出されないポリマ〜１゛ある。３し、かし、天然に存在するポリマーで あって組換えもしくは・インビトロでの方法により製造されるポリマーが、天然 から単離されるポリマーと同様に有用である。親水性のポリビニルポリマー、例 えばポリビニルアルコールおよびポリビニルピロリドンが本発明の範囲内にある 。特に有用なポリマーは、ポリエチレングリコール、ポリプロピし・ングリコー ル、ポリオキシエチレンエステルもしくはメトキンポリエチレングリコールなど のポリアルキレンエーテル、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン、およ びポリオキシエチレンとポリオキシプロピレンのブロック共重合体（プルロニッ ク）などのポリオキンアルキレン１ポリメタクリレート、カルボマー、ザッカリ ド単量体であるＤ−マンノース、ＤおよびＩ、−ガラクトース、フコース、フル クトース、Ｄ−キシロース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−グルクロン酸、シアル酸、 Ｄ−カラクツロン酸、Ｄ−マンヌロン酸（即ち、ポリマンヌロン酸またはアルギ ン酸）、Ｄ−グルコサミン、Ｄ−ガラクト−ｆ　Ｅ　：／、■〕−グルフースお よびノイラミン酸からなる分岐型もしく・は非分岐型のポリサツカリド［ラクト −ス、アミロペクチン、スターチ、ヒト「Ｊキンエチルスターチ、アミロース、 硫酸デキストラン、デキストラン、デキストリン、グリコーゲン、もしくは酸性 ムコポリサツカリド（ヒアルロン酸）のポリサツカリドサブユニットなどのホモ ポリサツカリドおよびヘテロポリサツカリドを含む〕；ポリソルビトールおよび ポリマンニトールなどの糖アルコールのポリマー；ヘパリン、およびポリセリ） またはポリアラニンなどのポリアミドＴ゛ある。ポリサツカリドに、天然のグリ コ／ル化もしくはＣＤ４の組換え発現に何階するグリコーゲンがなされている場 合には、通常の置換部位はＣＤ４のＮまたはＯ結合グリコジル化部位以外の位置 にあるか、またはＣＤ４は追加もしくは置換のＮまたはＯ結合部位が分子中へ導 入されているアミノ酸配列変異体である。このようなポリマーの混合物を用いる か、もしくはポリマーは均一であってもよい。架橋前のポリマーは水溶性である 必要はないが（水溶性であるのが好ましい）、最終コンジュゲートは水溶性でな くてはならない。さらに、このポリマーはＣＤ４に結合したときに高い免疫原性 を有していてはならず、静脈内注入もしくは静脈内注射による投与が意図されて いるときにはそれに適合しない粘度を有していてはならない。

ポリマーはＣＤ４と反応する基を１つだけ含んでいるのが好ましい。これがＣＤ ４分子の架橋を避けるための助けとなる。しかし、反応条件を最適なものにして 架橋を減少させるが、または反応生成物をゲル濾過もしくはクロマトグラフィー ・シーブによって精製して実質的に均一な誘導体を回収することが本発明の範囲 内に含まれる。

ポリマーの分子量は約１００から５００，０００の範囲であり、好ましくは約１ ．０００から２０，０００の範囲である。選択される分子量はポリマーの性質お よび置換の程度に依存するであろう。一般に、ポリマーの親水性が高くなり置換 の度合が大きくなるほど、使用可能な分子量は小さくなる。最良の分子量は通常 の実験により決定されるであろう。通常、ＣＤ４−ポリマーコンジュゲートの分 子量は約７０，０００を越えるものであろうが、より低分子量の分子が適当であ る。

通常、ポリマーは、ポリマーおよびＣＤ４の１もしくはそれ以上のアミノ酸もし くは糖残基と反応する多官能性架橋剤によりＣＤ４に共有結合させる。しかし、 誘導体化したポリマーをＣＤ４と反応させるか、もしくはその逆によりポリマー をＣＤ４に直接架橋させることも本発明の範囲内にある。ＣＤ４とポリマーの非 共有結合会合コンプレックスも本発明の範囲内にある。このようなコンプレック スは、硫酸デキストラン、ヘパリン、ヘパラン、硫酸コンドロイチンもしくは他 のグリコサミノグリカンなどの電気的に負に荷電したポリマー；もしくは電気的 に負のドメインを有する両性のポリマーをＣＤ４と非共有結合により会合させる ことによって最も好都合に製造される。ＣＤ４のアルカリｐＩはこの様なコンプ レックスの生成を容易にし、これらのコンプレックスは、ポリマーおよびＣＤ４ の溶液または懸濁液を混合し、続いて塩を除去するかまたは乾燥してポリマーお よびＣＤ４の間の会合を促進することにより製造される。

ＣＤ４の共有結合架橋部位は、好ましくはＮ−末端アミノ基およびリジン残基上 にあるε−アミノ基であるが、他のアミノ、イミノ、カルボキシル、スルヒドリ ル、ヒドロキシルまたは他の親水基もＣＤ４分子上での有用な置換部位として作 用する。多官能性（通常は２官能性）の架橋剤を用いずに、ポリマーをＣＤ４抗 原に直接共有結合させることもできる。このような架橋剤の例には、１．１−ビ ス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロ キシスクシンイミドエステル、例えば４−アジドサリチル酸とのエステル、３， ３°−ジチオビス（スクシンイミジル−プロピオネート）などのジスリジンイミ ジルエステルを含むホモ２官能性イミドエステルおよびビス−Ｎ−マレイミド− １，８−オクタンなどの２官能性マレイミドが含まれる。メチル−３−［（ｐ− アジド−フェニル）ジチオコプロピオイミデートなどの誘導化剤は、光の存在下 で架橋を生成させることができる光活性化が可能な中間体を与える。別法では、 米国特許第３．９５９．０８０号；３，９６９．２８７号；３，６９１，０１６ 号；４，１９５，１２８号；４．２４７．６４２号；４，２２９，５３７号；４ ，０５５，６３５号および４．３３０゜４４０号に開示されている臭化シアンに より活性化された炭水化物などの反応性の水溶性マトリックスおよび系を、ポリ マーおよびＣＤ４の架橋用に適切に修飾する。ＣＤ４アミノ基に対する共有結合 は、塩化シアヌリン、カルボニルジイミダゾール、アルデヒド反応性基（ＰＥＧ アルコキシド＋ブロモアセトアルデヒドのジエチルアセタール：　ＰＥＧ＋ＤＭ ＳＯおよび無水酢酸、または塩化ＰＥＧ十４−ヒドロキシベンズアルデヒドのフ ェノキシト）スクシンイミジル活性エステル、活性化ジチオカルボネ−１４’Ｅ Ｇ、　２，４．５−トリクロロフェニルクロロホルメートまたはｐ−ニトロフェ ニルクロロホルメート活性化ＰＥＧに基づく既知の化学により行われる。カルボ キシル基はカルボジイミドを用いるＰＥＧ−アミンの結合により誘導化される。

オリゴサツカリドをビオチ〕ノもしくはアビジンでラベルする目的化学酸化（例 えば、メタベリオデ−１・）または酵素酸化（例えば、グル１−スオートシダ・ −ゼも１、くはカラクトースオキシダーゼ）によって炭水化物のアルデヒド誘導 体を得、続いてヒドラジドもしくはアＳノ誘導化ポリ−２−と反応さυ−ること によ・・でオリゴリ・ツカリド置換基にポリマーを−Ｊンン、ｙ−ｐさせる。さ らに、オリゴ−ｊｌ”ツカリドおよびポリマ・−ロｉ、結合１”ト１−るために こ第１まで用いられていた１也の化学法＜＞　Ｌ　＜は酵素法も適し７ているで あろう。置換さ第１ノ、−オリゴサツカリドがＣＤ　４に特に有利であるが１、 −れは、炭水化物置換基が細胞外トメ・ｒンのＣ末端領域に位置し２、それゆえ にＨＩ　Ｖへの結合に関与しないためである。このことは、本ヂ；明の他の目的 を達成しつ一つＣｒ、）４の活オ・１を保存４゛る助けとなろう。また、誘導体 化のためのアーノ醗部位より少ない置換し４、か存在しないから、一般にオリゴ サツカリド生成物は比較的均一なものとなろう。最後に、ポリマーの誘導体化の 前に、ＣＤ４オリゴづツカリド置換基を酵素によって、例えばノイラミニダーゼ 消化によって修飾して糖を除去することができる。

糖タンパク質の治療学的使用に関する本発明の目的を達成するためにＣＤ４と同 じ方法で、ＣＤ４以外の糖タンパク質のオリゴサツカリドを好ましバ＋；！　Ｐ 　Ｅ　Ｇによって共有結合置換する。

Ｊ−のポリマーは、ＣＤ４のアミノ酸側鎖またはｈ＋もしくはＣ末端（後記実施 例を参照）と直接反応Ｊる基、または多官能性架橋剤と反応する基を有するゴ° あろう３、一般に、この様な反応性基を有するポリマーは、固定化夕〉バク算の 調製用に知られている。この様な化学を本発明で使用するためには、これまでタ ンパク質の固定化に用いられていた不溶性のポリマーと同じ方法で誘導体化した 水溶性のポリマーを用いるべきである。臭仕、シアンｒ、よる活性化は、ＣＤ４ にポリサツカリドを架橋させるのに用いる特に有用な方法である。

コンジュゲーｔ−について用いる”水溶性゛なる用語は、コンジュゲー）・が治 療学的有効濃度を得る（′−十分な量で血液などの生理学的液体に溶けるという ことを意味する。従って、これはＨＩＶまたはｇｐ１２０を精製するための親和 性りｌコマトゲラフイーにおいて用いられるようなマトリックスで不溶化された Ｃ　Ｄ　４を含まない。

出発ポリマーについて用いる”水溶性”なる用語は、コンジュゲート反応に用い られるポリマーまたはその反応性中間体が、ＣＤ４との誘導化反応に関与するに 十分な水溶性を有することを意味する。

ＣＤ４の置換の程度は、タシパク質上の反応性部位の数、使用するＣＤ４が全体 もり、＜はフラグメントのいずれであるが・、ＣＤ４がＣＤ４に対して異種のタ ンパク質との融合物であるか否か、分子量、ポリ・７−の親水性および他の性質 、および特に選択した部位に依存して変化するであろう。通常、コンジュゲート のＣＤ４ドメインは約１〜１０ポリマー分子で置換されるが、ＣＤ４部分の活性 に有意な悪影響を与えない限り、ＣＤ４に融合される任意の異種配列は木質的に 限定されない数のボ１１マー分子で置換することができる。最適の架橋度は、時 間、温度および他の反応条件を変えて置換の程度を変化させる実験マトリックス により容易に決定され、この後に細胞培養物中インビトロでｇｐ１２０に結合す る、および／またはＨＩＶの複製を阻害するコンジュゲートの能力を測定する。

好ましい態様では、ＰＥＧはＣＤ４のリジン残基およびＮ末端アミノ基を介し５ てＣＤ４に架橋させる。上述の当分野での研究と一致する本発明者らの研究によ り、リジン残基の修飾がｇｐ１２０結合に望ましくない影響を与えるらしいこと が示唆された。ＣＤ４のわずか３個程度のりジン残基を無水酢酸でアセチル化し た後に、ｇｐｌ、２０結合は大きく減少することが観察された。４個のりジン残 基のアセチル化の後にはｇｐ１２０結合は観察されなかった。このように、本発 明らは、ｇｐ１２０結合の減少を最少限にしながらＣＤ４のリジン残基を成功裏 にＰＥＧなとのポリマーで修飾しうろことを予想外に見い出した。

コンジュゲートされるポリマー、例えばＰＥＧの分子量は約５００〜１．００． ０００の範囲内Ｉこある。通常の分子量は２．０００．５゜０００または２０． ０００である。

ＰＥＧなどの非タンパク性のポリマーでタンパク質を共有結合修飾するための自 体既知の多種多様の方法により、ポリマー、例えばＰＥＧをＣＤ４に架橋させる 。しかし、これらの方法の一部は本発明の目的にとって好ましくない。塩化シア ノリンの化学（法）はタンパク質の架橋を含む多（の副反応をもたらす。さらに 、スルヒドリル基を含むタンパク質の不活性化を招く可能性が特に挙げられよう 。

カルボニルジイミダゾールの化学［Ｂｅａｕｃｈａｍｐら、　Ａｎａｌ、　Ｂｉ ｏｃｈｅｓ、　１３］　：　２５−３３（１９８３）］は高いｐＨ（＞８．５） を必要とし、これはタンパク質を不活性化し得る。さらに、”活性化ＰＥＧ”中 間体は水と反応し得るから、タンパク質に対して大過剰モルの“活性化ＰＥＧ” が必要となる。例えば、本発明者らは、カルボニルジイミダゾールを用いて８０ ％の組換えＣＤ４をＣＤ４−ＰＥＧに転換するためには１０００倍モル過剰の“ 活性化ＰＥＧ”と１２時間のインキュベートが必要であることを見い出した。ま た、カルボニルジイミダゾールの化学法に必要な高濃度のＰＥＧは、ゲル濾過ク ロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィーの両者に悪影響を及 ぼすので、精製の面で問題がある。さらに、本発明者らは、高濃度の”活性化Ｐ ＥＧ”がＣＤ４を沈殿させ、共有結合修飾の減少を導くことを見い出した。この 問題自体は既に知られていたことである（Ｄａｖｉｓ、米国特許第４．１７９． ３３７号）。他方、アルデヒドの化学剤（Ｒｏｙｅｒ、米国特許第４．００２． ５３１号）は、４０倍モル過剰のＰＥＧおよび１〜２時間のインキュベートを必 要とするのみであるから、より効率的である。

しかし、ＰＥＧアルデヒドの製造用にＲｏｙｅｒにより示された二酸化マンガン は、［金属ベースの酸化剤とでコンプレックスを形成するＰＥＧの傾向が明らか であるためＪ　［ｌ１ａｒｒｉｓらＪ、　Ｐｏｌｙｍ、　Ｓｃｉ、、Ｐｏｌｙｍ 、　Ｃｈｅｗ、　Ｅｄ、　２２：３４１−３５２（１９８４）］問題がある。本 発明者らはＤＭＳＯおよび無水酢酸を用いるＭｏｆｆａｔｔ酸化を行うことによ り、この問題をうまく回避した。さらに、Ｒｏｙｅｒにより示された水素化ホウ 素ナトリウムは高いｐＨで用いなければならず、ジスルフィド結合を減少させる 著しい傾向があった。これに対して、本発明者らの用いたナトリウム・シアノボ ロヒドリドは中性ｐＨで有効であり、ジスルフィド結合を減少させる傾向はほと んどなかった。

本発明のコンジュゲートは、ゲル濾過により未反応の出発物質から分離する。こ れをさらに抗ＣＤ４（ＯＫＴ４モノクローナル抗体）または固定化されたｇｐ１ ２０マトリックス上に吸着させることにより精製するが、この後者は置換度また は置換部位がｇｐ１２０結合の不活性化を起こさないフンシュゲートにのみ結合 するから有利である。ＰＥＧ［換したＣＤ４をさらに疎水性相互作用クロマトグ ラフィーで精製する。最も簡便には、コンジュゲートをアルキルセファロースな どの疎水性クロマトグラフィー媒体から、減少させて行く塩勾配液により溶離す る。上述のゲル濾過法による精製と同様、この方法は置換度に基づいてコンジュ ゲートを分離し、従ってＰＥＧによるモル置換度が実質的に均一であるＣＤ４− ＰＥＧを得ることができる。すなわち、２置換または１置換のＣＤ４を実質的に 含まない１［換または２Ｗ換のＣＤ４をそれぞれ得ることができる。また、本発 明のＣＤ４誘導体は、はとんどの場合、イオン交換クロマトグラフィーによって 精製される（ＣＤ４を陽イオン交換樹脂に吸着させ、次いで溶離するか、または 不純物を陰イオン交換樹脂に吸着させる）。

本発明のコンジュゲートは、治療に用いるため、生理学的に許容される担体に配 合して滅菌濾過する。治療用製剤中のＣＤ４の濃度は限定されるものではないが 、通常は約１〜２０　ｍｇ／ｍｌである。本コンジュゲートは所望によりツイー ン２０もしくは８０などの非イオン性の界面活性剤、塩、緩衝液および他の賦形 剤を含む。これらは水溶液としてまたは凍結乾燥して保存する。

本フンシュゲートは皮下、筋肉内、静脈内または脳を髄内注射により、肺内もし くは鼻内エアゾル、経皮バッチ、胞注入などにより投与される。投与量は臨床上 の慣例に従って決定されるが、初回投与量は約１０〜３００μｇ／ｋｇ／（１週 間に１〜３回）であろう。本発明のコンジュゲートの利点の１つは、インビボで の治療用量を維持するためにコンジュゲートを不定期に投与することであり、継 続的に注入する必要がないことである。

他のＨＩＶ治療法が本発明のコンジュゲートと共に用いられるが、それらは例え ば誘導体化されていない可溶性のＣＤ４、ＡＺＴ、ＤＤＣ，中和抗体、免疫サイ トトキ７ン、ｇｐｌ、２０フラグメントおよびＨＩ　Ｖワクチンである。

Ｍｏｆｆａｔｔ酸化法のｓ　ｖｅｒｎ改良型を用いて、ＰＥＧ誘導体（メトキ／ ＰＥＧ　２０００、メトキシＰＥＧ　５０００、および１）ＥＧ２ｏ、　ｏ　ｏ 　ｏ）のアルデヒドへの酸化を行った。簡単に説明すると、所望のＰＥＧ誘導体 （Ｓｉｇｍａ　；　１０〜４０ｍモル）と乾燥ＤＭＳＯ（ＡｉｄＴｉｃｈ：５〜 ６ｘ容量／重量）の混合物を５０〜６０℃まで暖めてＰＥＧ固形物を溶解し・、 室温近くまで冷却し、窒素−トで乾燥り　Ｍ　Ｓ　０（３０囚１）中の無水６１ 酸（０，５ｉ１　：　５０ｍモル）に加えた３、室温で３０＝−４０時間撹拌し た後、この混合物を５容量の無水エーテル中に注Ｌ・だ、ＰＥＣ；　２０，００ ０に対しては、エーテルの添加とそれに続く激し、い混合が生成物を沈澱させる のに十分であった。メトギシＰＥＧ誘導体に対しては、エーテルの添加とそれに 続く激しい混合によって油性のエマルジョンが得られた。酢酸エチル（約１００ 　ｍｌ、）ヲ添加すると生成物が沈澱した。この沈澱を、焼結ガラス製ロートで 濾過することによって集め、エーテルで１回洗浄し、次いで真空下で一晩乾燥し た。５ｃｈｉｆｆ試験によってアルデヒド誘導体の合成を確認した。

Ｂ、ＣＤ４−ＰＥＧの製造 ナトリウム・シアノボロヒドリドを用いるアミノ基の還元メチル化によって、Ｐ ＥＧアルデヒドをＣＤ４に共有結合させた。簡単に説明すると、組換えＣＤ　４ 　（ｒＣＤ　４　Ｘアミノ酸残基３６８のところで先端を切除したアスパラギン Ｎ−末端のＣＤ４；４０μＭ）を、０゜１ＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７，２）中 、３７℃で２時間、ＰＥＧアルデヒド（１〜４ｍＭ）およびナトリウム・シアノ ボロヒドリド（Ｓｉｇｍａ　；　２０ｍＭ）と共にインキュベートした。これら の条件のもとでは、ＣＤ４分子は約１〜４個のＰＥＧ残基で置換された。別の方 法によれば、さらに高濃度のＰＥＧアルデヒド（例えば、９．５ｉＭ）により、 約１　＝　ｉ−０個のＰＥＧ残基で置換されたＣＤ４分子が導かれた。

カラムクロマトグラフィーによって、残留するＰＥＧアルデヒドおよび修飾され でいないｒＣＤ４を含まないようにＣＤ４−ＰＥＧを零１苛づ＼νしｔ、二。

２．６ｘ１．００ｅａのカラムでＡｃＡ３４樹脂を用い、リン酸緩衝食塩水（Ｐ ＢＳ）を用いて０．３ｍｌ／分の流速でゲル濾過クロマトグラフィーを行った。

反応混合物を、希釈またはさらに後処理することなく直接このカラムにかけた。

ＨＲ５／　５　Ｆ　Ｐ　Ｌ　Ｃカラム（Ｐ　ｈａｒｍａｃｉａ）でフェニルセフ ァ０−ス樹脂を用いて疎水性相互作用クロマトグラフィーを行った。飽和硫酸ア ンモニウムを反応混合物に加えて最終濃度を１２とし、１．２硫酸アンモニウム ／１／３リン酸緩衝食塩水（ｐＨ７，２）で平衡化したカラムにかけた。このカ ラムを、硫酸アンモニウム濃度が減少する勾配液で溶離した。これらの条件のも とでは、ｒＣＤ４はカラムから流、出する。ＣＤ４−ＰＥＧはこの勾配溶離中に 置換が最も少ないものから最も多いものの順序で連続的に溶出し、置換の程度が 異なるＣＬ）４−ＰＥＧが他の置換ＣＤ４−ＰＥＧコンンユゲートを含まないよ うに回収される。以下の実施例では、９，５ｏ＋ＭのＰＥＧアルデヒドを用い、 実施例Ｊ−Ｂに従ってｒＣＤ　４　（、Ａｓｎ　Ｎ−末端またはＬｙｓＮ−末端 ）、ＰＥＧ（Ｍｙ　５０００）を用いてＣＤ４−ＰＥＧを製造した。

実施例２　ＣＤ４−ＰＥＧのｇｐ１２０結合ｇｐ１２０に結合するｒＣＤ４およ びＣＤ４−ＰＥＧの能力を競争ＥＬＩＳＡ法で測定した。簡単に説明すると、ｒ ＣＤ４を一晩インキコベートによって９６ウエルのブｌ／−）に被覆した。次い で、ｇｐｌ−２０を種々モル濃度のｒＣＤ４またはＣＤ４−ＰＥＣ中でインキュ ベートし、この反応混合物をｒＣＤ４被覆したウェル中でインキュベートした。

洗浄した後、ｒＣＤ４被覆したウェルに結合したｇｐ１２０の量を、酵素結合し た抗ｇｐ１２Ｑ抗体とインキニーベートすることによって測定した。ｇｐ１２０ 結合を競争するｒＣＤ４およびＣＤ４−ＰＥＧの能力をこの検定によって測定し た。１〜１０個のＰＥＧ分子で共有結合修飾したときにｇｐ１２０と競争するｒ ＣＤ４の能力（ＡｓｎまたはＬｙｓＮ−末端アミノ酸のいずれかを有する）は、 約３倍で減少するにすぎなかった。

実施例３　ＣＤ４−ＰＥＧの半減期 ｒＣＤ４およびＣＤ４−ＰＥＧの血漿半減期を、ニューシーラント白ウサギへの 静脈内注射によって測定した。１００μｇ／ｋｇのＣＤ４−Ｐ　Ｅ　Ｇ　（Ａｓ ｎまたはＬｙｓＮ−末端アミノ酸のいずれかを有する）を静脈内注射し、血漿の ＣＤ４濃度を注射後の種々の時間にＥＬＩＳＡによって測定した。誘導体化され ていないｒＣＤ４のウサギでの最終的な半減期は約１５分であった。対照的に、 ゲル濾過溶出液の分析および動力学試験によって、ＣＤ４−ＰＥＧは２つの生な サブ集団を有する大きく延長された半減期を示すことがわかった。約６０％のＣ Ｄ４−ＰＥＧ物質の最終的な半減期は４〜８時間であり、一方、約２０％のＣＤ ４−ＰＥＧ物質は２５〜５０時間の最終的半減期を有していた。この半減期が長 い方の物質は一層密度高く置換されていたが、逆にｇｐｌ、２０結合は劣ってい た。最後に、この長い半減期のＣＤ４−ＰＥＧは１日目にウサギ血漿中に存在し ており、ＨＩＶのエンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０に結合する能力をなお保 持していた。

実施例４デキストランまたは硫酸デキストラン修飾したＣＤ４水（２５０ｍｌ） 中のデキストランまたは硫酸デキストラン（２，５ｇ）を水酸化ナトリウムでｐ Ｈ１０，７に調節し、これを臭化シアン（３回で０．８ｇ）と混合した。１時間 激しく撹拌（水酸化ナトリウムの添加によってｐＨを１０．５〜１１に維持）し た後、この混合物を０．２Ｍ炭酸ナトリウム溶液（ｐＨ９，４℃）に対して透析 した。次いで、この活性化したデキストランまたは硫酸デキストランの溶液をｒ ＣＤ４とインキュベートし、４℃で１２〜２４時間カップリングさせた。

実施例５フイコール修飾したＣＤ４ 水（１００ｍｌ）中のフィコール（Ｍｙ　４００，０００　；　Ｉｇ）を上記の ように臭化シアン（０，５ｇ）で活性化した。次いで、この活性化したフィコー ルを、ｐＨ７〜９．４℃で１２〜２４時間、ＣＤ４にカップリングさせた。

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Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. １．ＣＤ４と親水性の非タンパク質性ポリマーの水溶性コンジュゲート。
2. ２．ポリマーがポリエチレングリコールまたはメトキシポリエチレングリコール である請求項１に記載のコンジュゲート。
3. ３．ポリマーがポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリオキシアル キレン、またはポリオキシエチレンとポリオキシプロピレンのブロックコポリマ ーである請求項１に記載のコンジュゲート。
4. ４．ポリマー１がオリゴサッカリド以外のものである請求項１に記載のコンジュ ゲート。
5. ５．ポリマーが、天然のＮ−結合グリコシル化部位以外の部位のところでＣＤ４ 抗原に共有結合しているオリゴサッカリドである請求項１に記載のコンジュゲー ト。
6. ６．ポリマーが、ＣＤ４のＮ−末端アミノ基またはリジン残基のところでＣＤ４ に共有結合している請求項１に記載のコンジュゲート。
7. ７．約１〜１０モルのポリマーで置換されている請求項１に記載のコンジュゲー ト。
8. ８．ＣＤ４がＣＤ４のトランスメンプラン・ドメインを含まないものである請求 項１に記載のコンジュゲート。
9. ９．ＣＤ４が免疫グロブリン配列を含有するものである請求項８に記載のコンジ ュゲート。
10. １０．滅菌した生理学的に許容しうる溶液中の、治療学的有効量の請求項１に記 載のコンジュゲート。
11. １１．ＣＤ４とポリエチレングリコールまたはメトキシポリエチレングリコール からなるコンジュゲート。
12. １２．ポリエチレングリコールまたはメトキシポリエチレングリコールによる実 質的に均質なモル置換を有する、ＣＤ４とポリエチレングリコールまたはメトキ シポリエチレングリコールからなるコンジユゲート。
13. １３．１モルのＣＤ４あたり約１〜１０モルのポリエチレングリコールまたはメ トキシポリエチレングリコールで置換されている請求項１２に記載のコンジュゲ ート。
14. １４．ＣＤ４がポリマーに共有結合している請求項１に記載のコンジュゲート。
15. １５．ＣＤ４が、ＣＤ４のオリゴサッカリド置換基のところでポリマーに共有結 合している請求項１に記載のコンジュゲート。
16. １６．ＣＤ４とポリエチレングリコールのコンジュゲートを精製する方法であっ て、コンジュゲートを疎水性相互作用樹脂に吸着させ、このコンジュゲートを減 少していく濃度の塩で溶離することを特徴とする方法。
17. １７．アルデヒド置換した非タンパク質性ポリマーとのＣＤ４コンジュゲートを 合成する方法であって、ＣＤ４とポリマーを含有する反応混合物をシアノポロヒ ドリドで還元的にメチル化することを特徴とする方法。
18. １８．ポリマーが糖タンパク質のオリゴサッカリドのところで糖タンパク質に共 有結合している、糖タンパク質と非タンパク質性ポリマーの水溶性コンジュゲー ト。
19. １９．ポリマーがポリアルキレングリコールまたはポリオキシアルキレンである 請求項１８に記載のコンジュゲート。
20. ２０．ポリマーが水溶性である請求項１８に記載のコンジュゲート。
21. ２１．ポリマーがオリゴサッカリドのところでのみコンジュゲートしている請求 項１８に記載のコンジュゲート。