JPH02501192A - 可溶性ｔ４蛋白を製造するためのｄｎａ配列、組換ｄｎａ分子および方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の技術分野］ 本発明は、可溶性Ｔ４蛋白を製造するためのＤＮＡ配列、組換ＤＮＡ分子および 方法に関する。より詳細には本発明は、可溶性型のＴ４、Ｔ４＋リンパ球の表面 上のリセプタもしくはその誘導体を適当な単細胞宿主にて発現する際にコードす ることを特徴とするＤＮＡ配列に関する。本発明によれば、本発明のＤＮＡ配列 、組換ＤＮＡ分子および方法を用いて、実質的にヒト由来の他の蛋白を含まない 可溶性Ｔ４を製造することができる。次いで、この可溶性蛋白は本発明の免疫治 療、予防および診断用の組成物および方法に有利に使用することができる。

本発明による可溶性Ｔ４蛋白に基づく免疫治療組成物および方法は、主たる標的 がＴ４＋リンパ球である感染物質によ症候群（ＡＩＤＳ）に関連する合併症およ びＨＩＶ感染を予防し、治療しまたは検出するのに有用である可溶性のＴ４蛋白 に基づく組成物および方法に関するものでおる。

［従来技術］ Ｔ細胞リンパ球として知られた免疫調整細胞の種類は２つの広範な機能種類に分 類することができ、第１の種類はＴヘルパーもしくはインジューサ細胞で構成さ れてＴ細胞増殖とリンホキン放出と１ｇ放出のためのヘルパー細胞相互作用とを 媒介し、ざらに第２の種類はＴ細胞毒性もしくは抑制細胞で構成されてＴ細胞媒 介の死滅および免疫反応抑制に関与する。一般に、これら２種類のリンパ細胞は ２種の表面グリコ蛋白［すなわちＴヘルパー細胞もしくはインジューサ細胞上で 恐らくモノマー蛋白として発現されるＴ４（分子ｉ５５，０００〜６２，０００ ダルトン）またはＴ細胞毒性もしくは抑制細胞上にダイマー蛋白として発現され るＴ８（分子量３２　、０００ダルトン）］の一方の発現によって区別される。

Ｔ４およびＴ８の主構造は、その各ＣＤＮＡ配列から推定されている［Ｐ、Ｊ、 マトン等、「Ｔ細胞表面蛋白Ｔ４をコードするＣＤＮＡの分離およびヌクレオチ ド配列：免疫グロブリン遺伝子群の新規な一員」、セル、第４２巻、第９３〜１ ０４頁（１９８５）　：　Ｄ、　Ｒ，リットマン等、ｒＴ８をコードする遺伝子 の分離および配列二丁リンパ球の機能的種類を規定する分子」、セル、第４０巻 、第２３７〜２４６頁（１９８５）　］。両者の予測される蛋白配列は、蛋白の カルボキシル末端に位置する経膜ドメインと細胞質内ドメインとを包含する表面 抗原につき予測される各ドメインを有する分子を規定する。ざらに、両蛋白は免 疫グロブリンおよびＴＭｉ胞リセすタの可変領域に極めて類似性を有しかつ標的 細胞の識別に際し作用しうるアミノ末端領域を有する［マトン等、上記］。

免疫競合性の個人において、Ｔ４リンパ球は他の特定細胞種類の免疫系と相互作 用して、感染に対し免疫性を付与し或いは感染を防御する［Ｅ、Ｌ、ラインヘル ツおよびＳ、Ｆ。

シュロスマン、［ヒトＴ−細胞の分化機能」、セル、第１９巻、第８２１〜８２ ７頁（１９８０）　］。より詳細には、Ｔ４リンパ球は、たとえば、これらの防 御抗体の産生を促進するＢ細胞、すなわち造血幹細胞の後代を刺戟するよう作用 する。ざらに、これらはマクロファージ（「キラー細胞」）を活性化させて、感 染したまたはその他の異常な宿主細胞を攻撃すると共に単核細胞（「スカベンジ ャ細胞」）を浸蝕性微生物を包封しかつ破壊するよう誘発させる。

成る種の感染物質の主たる標的もしくはリセプタはＴ４表面蛋白であることが判 明した。これらの物質は、たとえばウィルスおよびレトロウィルスを包含する。

Ｔ４リンパ球は、この種の物質に露呈されると、非反応性になる。その結果、宿 主の複合免疫防御系が破壊されて、宿主は広範囲の偶発的な感染に対し感受性と なる。

この種の免疫抑制は、後天的免疫不全症候群（ｒＡＩＤＳＪ）に罹患した患者に 見られる。エイズ（ＡＩＤＳ）は重大な、すなわち典型的には完全な免疫抑制を 特徴とする病気であって、広範囲の偶発的感染症および悪性腫瘍に対する宿主の 感受性を伴う。成る場合には、エイズ感染は、中枢神経系の障害を伴う。エイズ の完全な臨床上の徴候は一般にエイズ関連の合併症（ｒＡＲｃＪ　）が先行し、 すなわちたとえば全般的な永続性リンパ節症、発熱および体重低下のような徴候 を伴う症候群である。ヒト免疫不全症ウィルス（ｒＨＩＶＪ）レトロウィルスが エイズ感染およびその先行症ＡＲＣの原因となる病因であると考えられる［Ｍ、 Ｇ、サルンガダーラン等、「エイズおよびプリエイズを有する患者からの細胞病 因レトロウィルス（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ）の検出、分離および連続的産生」サイエ ンス、第２２４巻、第４９７〜５０８頁（１９８４）　］。［本出願においては 、ヒト免疫不全症ウィルス（ｒＨＩＶＪ）、すなわちヒト下細胞リンパ趨向性ウ ィルス型ＩＩＩ　（ｒＨＴＬＶ−■」）、リンパ節症関連ウィルス（ｒＬＡＶＪ 　）　、ヒト免疫不全症ウィルス型工（「ＨＩｖ−１」）およびＡＩＤＳ関連レ トロウィルス（ｒＡＲＶＪ　）を包含するエイズ患者からの独立した分離物につ きウィルスの分類に関する国際委員会のヒトレトロウィルス下部委員会により採 用された一般的用語を使用する］。

ＡＩＤＳ／ＡＲＣ３群の試験ニオケル８５〜１００％力ＨＩｖにつき血清陽性で ある［Ｇ、Ｎ、ショー等、「後天的免疫不全症候群におけるヒトＴ−細胞白血症 （リンパ趨向性）ウィルス型■の分子特性化」、サイエンス、第２２６巻、第１ １６５〜１１１０頁（１９８４）　］。ＨＩＶに感染した米国における成人数は ｉ　、　ｏｏｏ、　ｏｏｏ〜２，５００，０００であると推定される［Ｄ、バー ンズ、「エイズワクチンのための戦略」、サイエンス１．第２３３巻、第１０４ ９〜１０５３頁（１９８Ｂ）　：Ｍ、リース、「エイズの悲観的展望」、ネイチ ャー、第３２６巻、第３４３〜３４５頁（１９８７）　］。

これらの推定は、エイズの危険性があると確認された群に属さない６４，９００ 人の個人を含む［Ｓ、Ｌ、シバツクおよびＧ。

Ｐ、ウォームサー、［米国にてＨＴＬＶ−Ｉ［１感染が如何に蔓延しているか」 、ニュー・イングリコシュ・ジャーナル・メジスン、第３１３巻、第１３５２頁 （１９８５）　］。トＩＩＶウィルスに感染した患者の見掛は上の作問診断率は １〜２％であり、この割合は将来著しく増加するであろう。

たとえばＨＩＶのようなレトロウィルスのゲノムは、構造蛋白をコードする３つ の領域を有する。ｑａＱ領域はピリオンのコア蛋白をコードする。ｐ０１領域は ピリオンＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）をコードする。

ｅｎｖ領域はウィルスの膜エンベロブおよび感染細胞の細胞質膜に存在する主た るグリコ蛋白をコードする。標的細胞リセプタに付着して細胞膜の融合を生ぜし めるウィルスの能力は、ｅｎｖ遺伝子により制御される２種のＨＩＶ特性である 。

これらの性質は、ウィルスの病理学に基本的な役割を演すると思われる。

ＨＩＶ　ｅｎｖ蛋白は先駆体ポリペプチドから生じ、このポリペプチドは成熟型 において約４８１個のアミノ酸よりなる高度にグリコジル化された大型の外膜蛋 白（ｇｐｌ　２０＞と、グリコジル化しうる約３４５個のアミノ酸よりなる小さ い経膜蛋白（ｇｐ４１）とに切断される［Ｌ、ラトナー等、「エイズウィルスＨ ＴＬＶ−ＩＩの完全ヌクレオチド配列、ネイチャー、第３１３巻、第２７７〜２ ８４頁（１９８５）　］。

ＨＩＶウィルスの宿主範囲は、表面グリコ蛋白Ｔ４を有する細胞に関連する。こ の種の細胞はＴ４リンパ球および脳細胞を包含する［Ｐ、Ｊ、マトン等、ｒＴ４ 遺伝子はエイズウィルスリセプタをコードすると共に、免疫系および脳において 発現される」、セル、第４１巻、第３３３〜３４８頁（１９８６）　］。

宿主がＨＩＶウィルスにより感染すると、Ｔ４リンパ球は非官能性となる。ＡＩ ＤＳ／ＡＲＣ３症候群の進行は、１４表面グリコ蛋白を示すＴ４＋リンパ球の欠 失に対し相関する。

その後の免疫学的調和を伴うこのＴ細胞欠失は、感染の再発サイクルとウィルス の細胞媒介伝染からの溶解性増殖との両者に関連しうる。ざらに臨床学的観察は 、ＨＩＶウィルスが多くのエイズ患者に見られる中枢神経系の障害の直接的原因 であることを示唆している。

Ｔ４＋細胞に対するＨＩＶウィルスの指向性は、膜結合したウィルスリセプタと してのＴ４細胞表面グリコ蛋白の役割に基因すると思われる。Ｔ４はＨＩＶウィ ルスリセプタとして挙動するので、その細胞外配列は恐ら＜１（ＩＶを結合する 際に直接的役割を演する。より詳細には、ＨＩＶエンベロブは選択的にＴ４エピ トープに結合すると思われ、この相互作用を用いて宿主細胞中への組込みを開始 する［Ａ、Ｇ、ダルグリコシュ等、ｒＣＤ４　（Ｔ４）抗原はエイズレトロウィ ルスに対するリセプタの必須成分である」、ネイチャー、第３１２巻、第７６３ 〜７６７頁（１９８４）　；　Ｄ、クラララマン等、［ヒトレトロウィルスＬＡ Ｖに対するリセプタとしてのＴ４リンパ球Ｔ４分子の挙動」、ネイチャー、第３ １２巻、第７６７〜７６８頁（１９８４）　］。したがって、Ｔ４の細胞発現は ＨＩＶ結合につき充分であると思われ、Ｔ４蛋白はＨＩＶウィルスに対するリセ プタとして作用する。

ＨＩＶウィルスのＴ４特性がインごトロで示されている。

エイズ患者から分離されたＨＩＶウィルスを表面Ｔ４につき予備選択されたＴヘ ルパーリンパ球と一緒に培養すると、リンパ球は効率的に感染されて多核シンシ チウム形成を含む細胞病理作用を示すと共に、溶解成長により死滅する［Ｄ、ク ラララマン等、［ヘルパー・インジューサＴリンパ球に対するリンパ節症関連ウ ィルス（ＬＡＶ）の選択特性］、サイエンス、第２２５巻、第５９〜６３頁（１ ９８４）　：　Ｆ、ウォングースタールおよびＲ，Ｃ，ガロ、［ヒトＴリンパ趨 向性レトロウィルス］、ネイチャー、第３１７巻、第３９５〜４０３頁（１９８ ５）　］。

ヒトＴ４のクローン化ＣＤＮＡは、ネズミ細胞および繊維芽細胞を包含する非− ■細胞系列からのトランスフェクト細胞の表面で発現されると、これら細胞にＨ ＩＶを結合する能力を付与することが示されている［Ｐ、Ｊ、マトン等、「Ｔ４ 遺伝子はエイズウィルスリセプタをコードし、かつ免疫系および脳において発現 される」、セル、第４７巻、第３３３〜３４８頁（１９８６）　１゜ ＨＩＶ感染の過程で、宿主はウィルスに対する液素および細胞の免疫反応の両者 を増大する。これらの反応は、多数のウィルス生成物に結合しかつ中和作用また は抗体依存性の細胞毒性機能を示す抗体の発生を包含する［Ｍ、グロフーロバー ト等、「エイズおよびエイズ関連合併症を有する患者におけるＨＴＬＶ−Ｉｌｌ −中和性抗体」、ネイチャー、第３１６巻、！７２〜７４頁（１９８５）　；　 Ｄ、　Ｄ、　Ｆ、　ハＩ）＞等、ｒＨＴＬＶ−ｍのウィルスエンベロブ蛋白はエ イズ患者における抗体の主標的抗原を示す」、サイエンス、第２２８巻、第１０ ９４〜１０９６頁（１９８５）　；Ａ、　Ｈ，）Ｉツ’７等、ｒＨＴＬＶ−１／ ＬＡＶ抗体陽性患者からの血清はＨＴＬＶ−１／ＬＡＶ感染−「細胞に対し抗体 依存性の細胞毒性を媒介する」、ジャーナル・イミュノロジー、第１３８巻ミ第 １０６４〜１０６８頁（１９８７）　］。１−ＩＩＶエンベロブのエピトープは 、中和抗体反応を示す際の重要な決定因子であると同定されている。ざらに、抗 体依存性の細胞毒性（ｒＡＤＣＣＪ　）活性における決定因子は、ＨＩＶｅｎｖ および恐らくｇａｇエピトープを包含する。

エイズに対する効果的な治療は現在まで存在しないため、この病気を予防するた めに多くに努力が払われている。この種の予防手段は全血液、器官および精子ド ナーに対するＨＩＶ抗体スクリーニングおよびこの病気の伝染に関しエイズの高 い危険性を有する群の教育を含む。

ＡＩＤＳおよびＡＲＣ８状態の実験的および初期段階の臨床的処置は、たとえば ＨＰＡ−２３、ホスホノホルメート、スラミン、リバビリン、アジドチミジン（ ｒＡＺＴＪ　）およびジデオキシサイチジンのような抗ウィルス剤の投与を含み 、これらは明らかに逆転写酵素阻止によりウィルスの複製を阻害する。これらの 薬剤はそれぞれＨＩＶに対しインビトロで活性を示すが、ＡＺＴのみが臨床試験 において強力な作用を示した。しかしながら、有効量のＡＺＴ投与は望ましくは ない衰弱副作用、たとえば骨髄陥没のような副作用を伴う。したがって、血液学 的毒性がＡＺＴの長期使用において主たる制限因子になると思われる。

ＡＩＤＳを治療するための他の提案された方法は、逆転写以外のウィルス複製サ イクルにおける過程に対し活性を有する薬剤を開発することに集中している。こ の種の方法はインクフエロンの投与またはハイブリドーマ技術の応用を含む。

これら処置技術の殆んどは、たとえばインタロイキン−２のような免疫モジュレ ータの同時投与を必要とすると思われる。

現在まで、ＡＩＤＳ、ＡＲ３Ｃ，ＨＩＶ感染ａＪ：びＴす／パ球欠失もしくは異 常により引起こされるその他の免疫不全症を処置するための有効な免疫治療剤お よび方法を開発することが必要とされている。

［発明の開示］ 本発明は、Ｔ４＋リンパ球の１４表面蛋白を主たる標的とする感染物質のリセプ タとして作用する可溶性Ｔ４およびその可溶性誘導体を多量に提供することによ り上記諸問題を解決する。有利には、本発明はざらに、ヒト由来の他の蛋白を実 質的に含有せずかつたとえばＨＩＶまたはＢ型肝炎ウィルスのようなウィルスに より汚染されてない形態の可溶性Ｔ４を提供する。

以下の開示から明らかなように、本発明のＤＮＡ配列および組換ＤＮＡ分子は、 適当な宿主において可溶性Ｔ４もしくはその誘導体の産生を指令することができ る。本発明のポリペプチドは、宿主にて産生されたままで或いはざらに誘導化も しくは改変した後に、主たる標的がＴ４＋リンパ球である感染物質により引起こ された病気を有する免疫不全症の患者を治療するための各種の免疫治療組成物お よび方法に有用である。本発明の各実施態様によれば、この種の組成物および方 法はＨＩＶのための可溶性リセプタ、可溶性Ｔ４蛋白およびポリペプチド並びに その抗体に関連する。本発明の可溶性Ｔ４蛋白およびポリペプチドは一価の形態 、並びに多価の形態を包含する。

可溶性Ｔ４蛋白、ポリペプチドもしくはペプチドおよびこれに対する抗体に基づ く本発明による組成物および方法は、ＨＩＶ関連の感染ＡＩＤＳおよびＡＲＣの 予防、治療もしくは検出につき特に有用である。より詳細には、本発明の可溶性 Ｔ４に基づく組成物および方法は、可溶性Ｔ４−類似ポリベブチド（すなわち１ ４表面蛋白を発現する細胞のＨＩＶ感染を阻止する競合結合メカニズムによりＴ ４／ＨＩＶ相互作用を有利に阻害するポリペプチド）を使用する。これらの可溶 性Ｔ４類似ポリペプチドは、Ｔ４リンパ球とＴ４リンパ球を標的とする感染物質 との間の付着を阻止すると共に、Ｔ４＋リンパ球とＴ４＋リンパ球媒介死滅に関 する抗原形成細胞および標的との間の相互作用を阻止する。可溶性ウイルスリセ ブタとして作用することにより、本発明の組成物は、Ｔ４＋細胞に対するＨＩＶ 結合を阻止する抗ウイルス治療剤として使用しうると共に、リセプタ結合のレベ ルにおいてウィルス誘発されるシンシチウム形成を阻止する。

本発明は、適当な単細胞宿主にて可溶性Ｔ４蛋白およびその可溶性誘導体を発現 に際しコードするＤＮＡ配列を提供することによりこれらの目標を達成する［本 明細書中に使用する「可溶性Ｔ４蛋白」、［可溶性Ｔ４Ｊおよび［可溶性Ｔ４類 似ポリペプチド」という用語は全て、天然もしくは組換の可溶性Ｔ４蛋白もしく はその可溶性誘導体でありかつ可溶性Ｔ４蛋白の免疫治療（抗−レトロウィルス ）または免疫活性を特徴とする全ての蛋白、ポリペプチドおよびペプチドを包含 する。これらは各種の原料からの可溶性Ｔ４−類似化合物、たとえば天然原料か ら誘導される可溶性Ｔ４蛋白、組換可溶性Ｔ４蛋白および合成もしくは半合成の 可溶性Ｔ４蛋白を包含する］。

ざらに本発明は、これらのＤＮＡ配列を含む組換ＤＮＡ分子およびこれらにより 形質転換された単細胞宿主をも提供する。これらの宿主は、広範な種類の治療、 予防および診断組成物および方法に使用するための本発明の新規な可溶性Ｔ４蛋 白、ポリペプチド、ペプチドおよび誘導体を多量に製造することを可能にする。

本発明のＤＮＡ配列は、 （ａ）ｐ１９９−７、ｐＢＧ３７７、Ｉ）ＢＧ３８０゜１）ＢＧ３８１、ｐ２０ ３−５、ｐＢＧ３９１、ｐＢＧ３９２、ｐＢＧ３９３．１）ＢＧ３９４、ｐＢＧ ３９５、ｐＢＧ３９６、ｐＢＧ３９７．１）２１１−１１、ｐ２１４−１０およ びｐ２１５−７のＤＮＡ挿入体： （ｂ）前記ＤＮＡ挿入体の１種もしくはそれ以上にハイブリッド化しかつ発現に 際し可溶性Ｔ４類似ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列：および （Ｃ）発現に際し前記ＤＮＡ挿入体および配列のいずれかによりコードされた可 溶性Ｔ４類似ポリペプチドを発現に際しコードするＤＮＡ配列 よりなる群から選択される。

他の実施態様によれば、本発明はざらにｐ１７０−２のＤＮＡ挿入体からなるＤ ＮＡ配列に関し、この配列は発現に際しＴ４類似ポリペプチドをコードする。ざ らに本発明は、この種のＤＮＡ配列を用いてＴ４蛋白を産生させるための組換Ｄ ＮＡ分子および方法にも関する。

［図面の簡単な説明］ 第１図は免疫親和性クロマトグラフィーによるＵ９３７細胞からのＴ４蛋白の精 製を示す放射能写真でおる。

第２図は免疫親和性精製された可溶化天然Ｔ４蛋白がＨＩ■エンベロブ蛋白に結 合する様子を示す放射能写真およびウェスタンプロットデータを示す。

第３図はＰＢＬクローンλ２３０−４から得られたＴ４ｃＤＮＡのヌクレオチド 配列および誘導アミノ酸配列を示し、この図面においてアミノ酸は次のような単 一文字のコードによって示される： ＊＝停止コドンが存在する位置。

第３図において、Ｔ４蛋白翻訳開始部（ＡＡ　２３＞はヌクレオチド２０１〜２ ０３におけるメチオニンに位置し、かつ成熟Ｎ−末端はヌクレオチド２７６〜２ ７８におけるリジン（ＡＡ３）に位置する。

第４図はｃＤＮＡクローンｐＢＧ３１２．Ｔ４　（ｐｌ　７１−１とも呼ばれる ）およびｐ１７０−２の作成の略図である。

第５図はプラスミドｐＥＣ１００の作成の略図である。

第６図は各種の７４　ＣＤＮＡクローンに関する位＠３．６４および２３１のア ミノ酸比較を示す。

第７Ａ図および第７Ｂ図は精製された可溶化Ｔ４蛋白および組換可溶性Ｔ４突然 変異体の蛋白ドメイン構造を示す。

第８Ａ〜８Ｄ図は本発明の組換可溶性Ｔ４　（ｒｒｓＴ４Ｊ　）を発現すべく使 用される各種の中間プラスミドおよびその他のプラスミドの作成を示す略図であ る。

第９Ａ図はプラスミドｐ１９９−７の作成の略図である。

第９Ｂ図および第９Ｃ図はプラスミドｐ２０３−５の作成の略図である。

第１０図は本発明により各種の作成に使用される合成オリゴヌクレオチドリンカ を示す。

第１１図はｐ１９９　７（ＰＬミューチット−ｒｓＴ４）およびそのｒＳＴ４． ２挿入体により規定される全プラスミドのヌクレオチド配列およびｒＳＴ４配列 から推定されるアミノ酸配列を示し、これはＭｅｔ完全ｒＳＴ４．２コ一ド配列 を規定するＣＩａＩ−Ｃ１ａＩカセツトを包含する。

第１２図は５Ｇ９３６／ｐ１９９−７からのｒＳＴ４．２発現の誘発に関する蛋 白プロット分析を示す。

第１３図はプラスミドｐＢＧ３６８の作成の略図である。

第１４Ａ−１００図は本発明による各種プラスミドの作成の略図である。

第１５図はプラスミドｐＢＧ３９１のヌクレオチド配列を示す。

第１６図はプラスミドｐＢＧ３９２のヌクレオチド配列をはヌクレオチド１２０ ７−１２０９におけるメチオニンに位置しかつ成熟Ｎ−末端はヌクレオチド１２ ８１−１２８４におけるリジン（ＡＡ３）に位置する。

第１７図は本発明による各種プラスミドの作成の略図である。

第１８図は本発明による各種の作成に用いられる合成オリゴヌクレオチドリンカ を示す。

第１９図はプラスミドｐＢＧ３９４のヌクレオチド配列を示す。

第２０図はプラスミドｐＢＧ３９６のヌクレオチド配列を示す。

第２１図はプラスミドｐＢＧ３９３のヌクレオチド配列を示す。

第２２図はプラスミドｐＢＧ３９５のヌクレオチド配列を示す。

第２３図はプラスミドｐ１９６−１０のｐＢＧ３８ｏトランスフェクトＣＨＯ細 胞ライン８Ｇ３８０Ｇの状態調節培地から精製されたｒＳＴ４．２のクーマシー 染色ゲルである。

第２４図はプラスミドｐ１９６−１．０の作成の略図である。

第２５図はプラスミドＩ）ＢＧ３９４の作成の略図である。

第２６図はＩ）２１１−１１の作成の略図である。

第２７図はプラスミドｐ２１５−７の作成の略図である。

第２８図はプラスミドｐ２１Ｂ−８の作成の略匡である。

第２９Ａ図はｐＢＧ２１１−１１でトランスフェクトされたイー・コリの状態調 節培地から精製されたｒｓＴ４．−１１３．１のクーマシー染色ゲルである。

第２９Ｂ図はイー・コリで発現されたｒｓ１’−４，−１１３，１のウェスタン ・プロット分析を示す放射能写真である。

第３０図のパネル（ａ）−（Ｃ）はイー・コリ形質転換体からのｒＳＴ４，１１ ３．１の精製を示す。

第３１図のパネル（ａ）−（Ｃ）は精製ｒｓＴ４．−１１３．１のレフォールジ ング（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ　）を示す。

第３２図は組換可溶性Ｔ４を産生する３３５−代謝標識されたＣＨＯ細胞ライン の免疫沈澱を示す放射能写真である。

第３３図は組換可溶性Ｔ４を産生するＣＯ３７細胞ラインの免疫プロット分析を 示す。

第３４図は０ＫＴ４Ａもしくは０ＫＴ４に結合するｒＳＴ４．１１３．１とｒＳ Ｔ４．３との間の競合分析の結果をグラフで示す。

第３５〜３７図はそれぞれ０ＫＴ４Ａ、Ｌｅｕ−３Ａおよび０ＫＴ４に結合する ｒＳＴ４．１１１とｒＳＴ４．３との間の競合分析の結果をグラフで示す。

第３８図はイー・コリ形質転換体からのｒｓＴ４．−１１３．１に関するＥＬＩ ＳＡ分析をグラフとして示す。

第３９図は本発明による組換可溶性Ｔ４を用いるｐ２４放射線免疫分析の結果を グラフとして示す。

第４０図および第４１図は本発明による組換可溶性Ｔ４蛋白を用いるシンシチウ ム阻止分析の結果を示す。

第４２図はプラスｐＢｉＶ、１の作成の略図である。

第４３図はｐＢｉｖ、１により産生された二価の組換可溶性Ｔ４蛋白を示す。

［発明の詳細な説明］ 本発明のＤＮＡ配列を２種の保存物：すなわちＴ細胞腫瘍ラインＲＥＸから得た λｃａｔ　ＣＤＮＡ保存物および末梢血液リンパ球から得たλＱｔ１０　ｃＤＮ Ａ保存物から分離した。しかしながら、ざらにＴ４を発現する他の細胞から作成 した保存物をも使用することができるであろう。これらはたとえがＨ９およびＵ ９３７を包含する。ざらに、ＴＪｉ伝子の各種の断片を分離するためヒトゲノム 保存物をも用いた。

これら保存物をスクリーニングするため、マトン等（１９８５）（上記）に示さ れたＴ４蛋白配列に基づく一連の化学合成された反対方向オリゴヌクレオチドＤ ＮＡプローブを用いた。

スクリーニングするため、オリゴヌクレオチドプローブをプラーク・ハイブリッ ド化・スクリーニング分析によりＣＤＮＡ保存物にハイブリッド化した。数種の プローブにハイブリッド化するクローンを選択した。ざらに、選択したクローン のＣＤＮＡ挿入体を分離しかつプラスミド中にサブクローン化した後、そのヌク レオチド配列を決定すると共に、これらヌクレオチド配列から推定されるアミノ 酸配列をマトン等（１９８５）　（上記）に示されたアミノ酸配列と比較した。

ミノ酸配列をコードするＣＤＮＡ挿入体を特徴とすることが確認された。

寄託されたクローンｐ１７０−２から得た全長Ｔ４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列 、およびそれから推定されるアミノ酸配列を第３図に示す。このＣＤＮＡ配列を 次いでインビトロにおける部位特異性突然変異および制限断片置換にかけて、そ のｃＤＮＡ配列がマトン等の配列と同一になるようにした。

Ｔ４　ｃＤＮＡ配列をマトン等の配列に同一となるよう改変した後、その試料を 各種の位置で切断して、経膜ドメインおよび細胞質内ドメインのコード領域を除 去した。残留するＣＤＮＡ配列は可溶性Ｔ４をコードし、細胞外領域を保持して ＨＩＶ結合の原因になると思われる。

次いでヒト可溶性Ｔ４をコードするこの種のＣＤＮＡ挿入体を特徴とする各種の クローンを作成した。これらのｃＤＮＡ配列を、本発明にしたがい各種の方法で 使用することができる。より詳細には、これらの配列またはその部分、或いはそ の合成もしくは半合成コピーをＤＮＡプローブとして使用することにより、他の ヒトもしくは動物ＣＤＮＡもしくはゲノム保存物をスクリーニングして可溶性Ｔ ４に関連する他のＤＮＡ配列をハイブリッド化によって選択することができる。

典型的には、この種の選択には慣用のハイブリッド化条件（たとえばＴｍより約 ２０〜２７℃低い）が使用される。

しかしながら、保存物を得たものとは異なる種類からのプローブにより保存物を スクリーニングする場合、たとえばヒトプローブによりネズミ保存物をスクリー ニングする場合には、大して厳密でない条件しか必要としない。

この種のＣＤＮＡ挿入体、その部分またはその合成もしくは半合成コピーも、各 種の突然変異体を作成するための出発物質として使用することができる。この種 の突然変異体は縮退（すなわち突然変異は突然変異コドンによりコードされるア ミノ酸配列を変化させない）または非縮退（すなわち突然変異は突然変異ロドン によりコードされるアミノ酸配列を変化させる）のいずれかとすることができる 。両種類の突然変異は、本発明による可溶性Ｔ４を産生させ或いは使用するのに 有利である。たとえば、これらの突然変異は可溶性Ｔ４の高レベルの産生もしく は容易な精製またはより高いＴ４活性を可能にする。

これら全ての理由から本発明のＤＮＡ配列は、（ａ）ｐ１９９−７、ｐＢＧ３７ ７、ｐＢＧ３８０゜ｐＢＧ３８１．１）２０３−５、ｐＢＧ３９１、ｐＢＧ３９ ２、ｐＢＧ３９３、ｐＢＧ３９４、ｐＢＧ３９５、ｐＢＧ３９６、ｐＢＧ３９７ 、ｐ２１１−１１、ｐ２１４−１０５よびｐ２１５−７のＤＮＡ挿入体： （ｂ）前記ＤＮＡ挿入体の１種もしくはそれ以上にハイブリッド化しかつ発現に 際し可溶性Ｔ４類似ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列：および （Ｃ）発現に際し前記ＤＮＡ挿入体および配列のいずれかによりコードされる可 溶性Ｔ４類似ポリペプチドを発現に際しコードするＤＮＡ配列 よりなる群から選択される。

好ましくは本発明のＤＮＡ配列は、 第３図の式ＡＡ−２３ＡＡ３６２のポリペプチド、第３図の式ＡＡ１−３６２の ポリペプチド、第３図の式Ｍｅｔ−ＡＡ１　３６２のポリペプチド、第３図の式 ＡＡ１−３７４のポリペプチド、第３図の式Ｍｅｔ−ＡＡ１−３７４のポリペプ チド、第３図の式ＡＡ１−３７７のポリペプチド、第３図の式Ｍｅｔ−ＡＡ１　 ３７７のポリペプチド、第３図の式ＡＡ　−ＡＡ　のポリペプチド、第３図の式 ＡＡ−２３ＡＡ３７７のポリペプチドまたはその部分よりなる群から選択される ポリペプチドをコードする。

好ましくは本発明によるＤＮＡ配列は、ざらに第１６図の式ＡＡ　−ＡＡ　のポ リペプチド、第１６図の式ＡＡ１　ＡＡＩＢ２のポリペプチド、第１６図の式Ｍ ｅｔ−ＡＡ１　１Ｂ２のポリペプチド、第１６図のＡＡ　−ＡＡ　に続いてアミ ノ酸アスバラギンーロイシンーグルタミンーヒスチジンーセリンーロイシンの配 列を有するポリペプチド、 第１６図の式ＡＡ１　ＡＡ１Ｂ２に続いてアミノ酸アスパラギン−ロイシン−グ ルタミン−ヒスチジン−セリン−ロイシンの配列を有するポリペプチド、 第１６図の式Ｍｅｔ−ＡＡ１．８２に続いてアミノ酸アスパラギン−ロイシン− グルタミン−ヒスチジン−セリン−ロイシンの配列を有するポリペプチド、 第１６図の式ＡＡ−２３ＡＡｌｌｌのポリペプチド、第１６図の式ＡＡ１　ＡＡ ｌｌｌのポリペプチド、第１６図の式Ｍｅｔ−ＡＡ１　１１１のポリペプチド、 第１６図の式ＡＡ−２３−ＡＡ１３１のポリペプチド、第１６図の式ＡＡ−２３ −ＡＡ１４５のポリペプチド、第１６図の式ＡＡＩ　ＡＡ１４５のポリペプチド 、第１６図の式Ｍｅｔ−ＡＡ１−１４５のポリペプチド、その部分よりなる群か ら選択されるポリペプチドをコードする。

ざらに、本発明のＤＮＡ配列は、 たはその部分よりなる群から選択されるポリペプチドをコードする。

ざらに本発明によるＤＮＡ配列は、 スバラギンーロイシンーグルタミンーヒスチジンーセリンーロイシンの配列を有 するポリペプチド、成熟Ｔ４蛋白の式ＡＡＩ　ＡＡ１Ｂ２に続いてアミノ酸アス パラギン−ロイシン−グルタミン−ヒスチジン−セリン−ロイシンの配列を有す るポリペプチド、 成熟Ｔ４蛋白の式Ｍｅｔ　ＡＡｌ　１Ｂ２に続いてアミノ酸アスパラギン−ロイ シン−グルタミン−ヒスチジン−セリン−ロイシンの配列を有するポリペプチド 、成熟Ｔ４蛋白の式ＡＡ−２３ＡＡ１’ｌ’ｌのポリペプチド、成熟Ｔ４蛋白の 式ＡＡＩ　ＡＡｌｌｌのポリペプチド、成熟Ｔ４蛋白の式Ｍｅｉ−ＡＡ１　１６ ６のポリペプチドまたはその部分よりなる群から選択されるポリペプチドをコー ドする。

■細胞から分離された成熟Ｔ４蛋白のアミノ末端アミノ酸はリジン、すなわち第 １６図に示した配列の第３アミノ酸から始まる。したがって、可溶性Ｔ４蛋白は ざらに、第１６図の式ＡＡ３　ＡＡ３７７のポリペプチドまたはその部分をも包 含する。この種のポリペプチドは、第１６図の式ＡＡ３　ＡＡ１１３のポリペプ チド、第１６図の式ＡＡ３　ＡＡ１３１のポリペプチド、ざらに、可溶性Ｔ４蛋 白はＮ−末端メチオニン基に先行する上記ポリペプチドをも包含する。

本発明による可溶性Ｔ４蛋白構造はさらに、全長Ｔ４蛋白配列を種々の位置で切 断して軒膜ドメインと細胞質内ドメインとのコード領域を除去すると共にＨＩＶ 結合の原因になると思われる細胞外領域を保持することにより、作成することも できる。より詳細には、可溶性Ｔ４ポリペプチドは、オリゴヌクレオチド特異性 突然変異；制限切断に続くリンカの挿入：または酵素による仝長Ｔ４蛋白の切断 などの慣用技術により作成することができる。

或いは可溶性Ｔ４ポリペプチドは、たとえば同相合成のような慣用のペプチド合 成技術［Ｒ，Ｂ、メリフィールド、「同相ペプチド合成、工：テトラペプチドの 合成」、ジャーナル・アメリカン・ケミカル・ソサエティー、第８３巻、第２１ ４９〜２１５４頁（１９６３）　］によって化学合成することもできる。

本発明のＤＮＡ配列は、主要組織適合遺伝子複合体抗原および成る種のレトロウ ィルス（たとえばＨＩＶ）のエンベロブグリコ蛋白に結合すると思われる可溶性 蛋白および誘導体をコードする。好ましくは、これらはさらに細胞内ＨＩＶウィ ルスの伝播方式であると思われるシンシチウム形成をも阻止する。ざらに、これ らはＴ４＋リンパ球とＴ４＋細胞媒介死滅に関する抗原形生細胞および標的との 間の相互作用をも阻止することができる。特に好ましくは、これらはざらにＴ４ ＋リンパ球と主たる標的がＴ４＋リンパ球であるたとえばトＩＩＶウィルスのよ うな感染物質との間の付着をも阻止する。

本発明のＤ　Ｎ　Ａ　配列はざらに、これらＤＮＡ配列により形質転換される単 細胞動物にてこれらにより発現に際しコードされた可溶性Ｔ４もしくはその誘導 体を産生させるにも有用である。当業界で周知されているように、本発明のＤＮ Ａ配列を発現させるには、ＤＮＡ配列を適当な発現ベクターにおける発現制御配 列に作用結合させると共に、この発現ベクターで使用して適当な単細胞宿主を形 質転換せねばならない。

勿論、発現制御配列に対する本発明のＤＮＡ配列の作用結合は、ＤＮＡ配列の上 流にあける正確な読粋に翻訳開始信号を組込むことを含む。本発明の発現される 特定ＤＮＡ配列がメチオニンから開始しない場合は、出発信号は生成物のＮ−末 端に位置する他のアミノ酸（すなわちメチオニン）を生ぜしめる。この種のメチ オニン含有生成物を本発明の組成物および方法に直接用いうるが、一般に使用前 にメチオニンを除去することがより望ましい。これらにより発現されたポリペプ チドからこの種のＮ−末端メチオニンを除去する方法は当業界で知られている。

たとえば、成る種の宿主および醗酵条件は、インビボにてほぼ全部のＮ−末端メ チオニンの除去を可能にする。他の宿主はインビトロにおけるＮ−末端メチオニ ンの除去を必要とする。しかしながら、これらのインビボおよびインビトロの方 法は当業界で周知されている。

広範な種類の宿主／発現ベクターの組合せを、本発明のＤＮＡ配列を発現させる 際に使用することができる。たとえば有用な発現ベクターは染色体配列、非染色 体配列および合成りＮＡ配列の断片、たとえばＳＶ４０の各種の公知誘導体およ び公知の細菌プラスミド、たとえばＣｏｔ　Ｅｌ、ｐｃＲｌ、ｐＢＲ３２２、ｐ ＭＢ９およびその誘導体を包含するイー・コリからのプラスミド、広範な宿主範 囲のプラスミド、たとえばＲＰ４、ファージＤＮＡ、たとえば多くのファージλ の誘導体、たとえばＮＭ９８９およびその他のＤＮＡファージ、たとえばＭ１３ ．Ｂよびフィラメント状一本鎖ＤＮＡファージ、酵母プラスミド、たとえば２μ プラスミドもしくはその誘導体、並びにプラスミドとファージＤＮＡとの組合せ から誘導されるベクター、たとえばファージＤＮＡもしくは他の発現制御配列を 用いるよう改変されたプラスミドで構成することができる。動物細胞の発現には 、プラスミドｐＢＧ３６８、すなわちｐＢＧ３１２の誘導体［Ｒ。

ケート等、「ミウラー阻止物質に対する牛およびヒト遺伝子の分離および動物細 胞におけるヒト遺伝子の発現」、セル、第４５巻、第６８５〜６９８頁（１９８ ６）　］を使用するのが好適であり、これはアデノウィルス２の主たる後期プロ モータを含有する。

ざらに、広範な種類の発現制御配列（作用結合した際にＤＮＡ配列の発現を制御 する配列）をこれらのベクターに使用して、本発明のＤＮＡ配列を発現すること もできる。この種の有用な発現制御配列は、たとえばＳＶ４０もしくはアデノウ ィルスの初期および後期プロモータ、Ｉａｃ系、ｔｒｐよびプロモータ領域、ｆ ｄコート蛋白の制御領域、３−ホスホグリセシー１〜キナーゼもしくはその他の 糖分解酵素のプロモータ、酸ホスファターゼのプロモータ（たとえばＰ　ｈ　ｏ 　５　＞。

酵母α−接合因子のプロモータ、バキュロウィルス系および原核もしくは真核細 胞またはそのウィルスの遺伝子の発現を制御することが知られたその他の配列の ポリへドロンプロモータ、並びに各種のその組合せを包含する。動物細胞の発現 には、アデノウィルス２の主たる後期プロモータから誘導された発現制御配列を 使用するのが好適である。

広範な種類の単細胞宿主細胞も、本発明のＤ　Ｎ　Ａ　！！ｆｉｌ！列を発現す るのに有用である。これらの宿主は周知の真核および原核宿主、たとえばイー・ コリ、シュードモナス、バチルス、ストレプトミセス、真菌類（たとえば酵母） の菌株、並びに動物細胞、たとえばＣＨＯおよびネズミ細胞、アフリカ緑サル細 胞、たとえばＣＯ３１、ＣＯ３７、Ｂ５Ｃ１、Ｂ５Ｃ４０およびＢＭＴｌｏ、昆 虫細胞、並びに組織培養にあけるヒト細胞および植物細胞を包含する。動物細胞 の発現には、ＣＨＯ細胞およびＣＯ３７細胞が好適である。

勿論、必ずしも全てのベクターおよび発現制御配列が本発明のＤＮＡ配列を発現 するのに同等に機能するとは限らないことを了解すべきである。また全ての宿主 が同じ発現系につき同等に機能するとも限らない。しかしながら、当業者はこれ らのベクター、発現制御配列および宿主から不当な実験なしにかつ本発明の範囲 を逸脱することなく選択することができる。たとえば、ベクターを選択する際、 ベクターが宿主内で複製せねばならないので、宿主を考慮せねばならない。ベク ターのコピー数、このコピー数を制御する能力、およびベクターによりコードさ れるその他任意の蛋白の発現、たとえば抗生物質マーカーをも考慮すべきである 。

発現制御配列を選択する際、各種の因子をも考慮せねばならない。これらはたと えば系の相対強度、その制御特性および本発明の特定特定ＤＮＡ配列に対するそ の適合性を、特に有力な第２構造に関して包含する。単細胞宿主は、選択された ベクターに対するその適合性、発現に際し本発明のＤＮＡ配列によりコードされ た生産物の毒性、その分泌特性、正確に蛋白を折重ねる能力、その醗酵要件、お よび発現に際し本発明のＤＮＡ配列によりコードされた生産物の精製の容易さな どを考慮して選択すべきである。

これらパラメータのうちから当業者は、醗酵または大規模の動物培養、たとえば ＣＨＯ細胞もしくはＣＯ３７細胞にて本発明のＤＮＡ配列を発現する各種のベク ター／発現制御系／宿主組合せを選択することができる。

本発明のＤＮＡ配列の発現に際し産生されたポリペプチドは、ｋ１酵もしくは動 物細胞の培養物から分離しかつ各種の慣用方法を用いて精製することができる。

当業者は、本発明の範囲を逸脱することなく最も適する分離および精製技術を選 択することができる。

本発明のＤＮＡ配列の発現に際し産生されたポリペプチドは、実質的にヒト由来 の他の蛋白を含有しない。したがって、これらはヒトリンパ球からＭ製されたＴ ４？Ｊ白とは相違する。

本発明のポリペプチド（；免疫治療用の組成物および方法に有用である。たとえ ば本発明のポリペプチドは、主たる標的がＴ４＋リンパ球である物質による感染 をこれら標的リンパ球に対するその相互作用を阻害することにより阻止するのに 有用である。より好ましくは、本発明のポリペプチドを用いて、Ｔ４−標的感染 物質のＴ４４リセプタ位を飽和することができる。したがって、これらは細胞表 面Ｔ４４リセプタ位に対し競合結合することにより抗ウィルス活性を発揮する。

この作用は、たとえばＡＩＤＳｌＡＲＣおよびＨＩＶ感染のような病気に対し極 めて有益であることが明らかである。したがって、本発明のポリペプチドおよび 方法を用いてＡＩＤＳ、ＡＲＣ１ＨＩＶ感染またはＨＩｖに対スル抗体を有する ヒトを処置することができる。さらに、これらのポリペプチドおよび方法を用い てレトロウィルス（たとえばサル免疫不全症ウィルス）によりヒトを含む哺乳動 物にて引起こされたエイズ類似の病気を処置することもできる。

本発明の一興体例によれば、可溶性Ｔ４蛋白およびポリペプチドに対する抗体を ＡＩＤＳ、ＡＲＣおよびＨＩＶ感染の治療、予防または診断に使用することがで きる。

本発明のポリペプチドはざらにＡＩＤＳＳＡＲＣ，ｔ；よびＨＩＶ感染の治療に 使用される他の治療剤と組合せて使用することもできる。たとえば、可溶性Ｔ４ ポリペプチドは逆転写酵素を阻止する抗レトロウィルス剤、たとえばＡＺＴ。

ＨＰＡ−２３、ホスホノホルメート、スラミン、リバビリンおよびジデオキシシ チジンと組合せて使用することもできる。

ざらに、これらのポリペプチドはたとえばα−インクフエロン、β−インクフエ ロンおよびγ−インクフエロンを包含するインクフエロン類またはたとえばカス タノスペルミンのようなグルコシダーゼ阻止剤などの抗ウィルス剤と共に使用す ることもできる。この種の組合せ治療剤は有利には、これら薬剤の低投与量を用 いて、生じうる毒性を防止することができる。

ざらに、本発明のポリペプチドは、血液からウィルス汚染物を選択除去するため の血漿搬出技術または血液袋で使用することもできる。本発明のこの具体例によ れば、可溶性Ｔ４ポリペプチドを、たとえば血漿搬出装置に組込みうるプラスチ ックもしくはガラス玉またはフィルタからなる固体支持体に結合することができ る。

ざらに、本発明の組成物は移植片宿主病、自己免疫病、同種移植拒絶反応を予防 しまたは治療するのに有用な免疫抑制剤として使用することもできる。

本発明の組成物は、典型的には免疫治療上有効量の本発明によるポリペプチドと 医薬上許容しうるキャリヤとで構成される。本発明の治療法は、これらの組成物 により医薬上許容しうる方法で患者を処置することからなっている。

これらの治療に使用するための本発明の組成物は各種の形態とすることができる 。これらはたとえば固体、半固体および液体の投与形態、たとえば錠剤、丸薬、 粉末、溶液もしくは懸濁液、リポソーム、座薬、注射溶液、潅流溶液などを包含 する。好適形態は、目的とする投与方式および治療用途に依存する。これらの組 成物はさらに、好ましくは慣用の医薬上許容しうるキャリヤおよび当業者に周知 されたアジュバントを含む。

一般に、本発明の医薬組成物は、他の医薬上重要なポリペプチド（たとえばα− インクフエロン）につき使用されると同様な方法および組成物を用いて処方しか つ投与することができる。したがって、これらポリペプチドは凍結乾燥型で貯蔵 し、投与直前に無菌水で再編成し、かつ通常の投与ルート、たとえば非経口、皮 下、静脈内、筋肉内もしくは病巣内径路によって投与することができる。有効投 与量は０．５〜５．Ｏｍａ／体重１　ｋｇ／　１日の範囲としうるが、それより 少ない或いは多い投与量も用いることが了解されよう。

ざらに本発明は、可溶性のリセプタおよびこれらリセプタを標的とし或いは結合 するウィルス物質を診断し或いは処置する際のその使用にも関するものである。

この種の可溶性リセプタは、ウィルス性物質を吸収すると共にウィルス感染の拡 大を阻止するための手段としても使用することもできる。

或いは、ウィルス死滅剤をこれら可溶性蛋白リセプタに結合させて、ウィルスに 対するこれら薬剤の直接的供給方式を与えることもできる。

特に、本発明のポリペプチドは、ＨＩＶ感染の経過を検出し或いは監視するため の診断組成物および方法に有用である。

有利には、これらのポリペプチドは感染性）−ＩＩＶ物質の由来とは無関係にＨ ＩＶウィルスの変種を診断するのに有用である。

たとえばＩ（ＩＶに対し高い親和性を有する本発明の可溶性Ｔ４蛋白およびポリ ペプチドは、有利には現在モノクローナルもしくはポリクロナール抗体に基づい ているＨＩＶ分析システムの感度を向上させるために使用することができる。よ り詳細には、これら可溶性Ｔ４蛋白およびポリペプチドを用いて、試験面素を予 備処理することにより極く少量でも存在するＨＩＶを濃縮して、これを抗体によ り一層容易に確認することができる。ざらに、可溶性Ｔ４蛋白およびポリペプチ ドを用いて、ＨＩＶエンベロブ蛋白Ｃｌ１２０を精製することもできる。

或いは、本発明の可溶性Ｔ４蛋白およびポリペプチドを用いて、現在各種の分析 に用いられている抗−ＨＩＶ抗体に代替させることもできる。これらの可溶性Ｔ ４蛋白およびポリペプチドは、２つの理由から抗−ＨＩＶ抗体よりも好適である 。第１に可溶性Ｔ４は約１０−９のＨＩＶに対する親和性を示し、このレベルは 抗ＨＩＶ抗体の１０−７〜１０−８よりも高い。ざらに、抗−ＨＩＶ抗体は種々 異なるＨＩＶ分離物に対し特異性が大きい思われるが、種類の変化は可溶性Ｔ４ 蛋白に基づく分析に影響を及ぼさない。何故なら、全てのＨＩＶ分離物は感染性 に対する前提としてＴ４リセプタと相互作用できねばならないからである。

たとえば可溶性Ｔ４蛋白もしくはポリペプチドはたとえば酵素のようなインジケ ータと結合することができ、したがつてＥＬＩＳＡ分析に使用することができる 。ここでは可溶性Ｔ４は、有利には試験試料におけるＨＩＶと遊離ＨＩＶエンベ ロブＣ１ｐ１２０蛋白との両者の尺度として作用する。

さらに、多価型の可溶性Ｔ４蛋白もしくはポリペプチドは、たとえば化学結合も しくは遺伝子融合技術により製造されてＨＩＶに対する可溶性Ｔ４の結合性をず っと高めることもできる。

本発明を一層よく理解しうるよう、以下実施例により説明する。これらの実施例 は例示の目的のみであり、決して本発明の範囲を制限するものと解釈してはなら ない。

大凰望 然可溶化Ｔ４の精製 天然Ｔ４を組織法リンパ腫から得られたＴ４＋−前単球細胞ラインＵ９３７から 免疫親和性クロマトグラフィーにより約り０％純度まで次のように精製した。

Ｕ９３７細胞［ニュー・イングランド・ディーコネス病院のスコツト・ハンマー 博士から寄贈コをＲＰＭ　Ｉ　１６４０．１０％ＦＣ３にて１０６細胞／Ｉｎｌ まで増殖させ、収穫しかつ１ｘＰＢＳで洗浄した。次いで、細胞ペレットを２０ ｍＭ　トリス−ＨＣｆｆ　（ｐＨ７，７＞、０．５％ＮＰ−４０（非イオン型洗 剤）、０．２％ＮａＤＯＣ，０，２ｍＨＥＧＴＡ、０．２ｍＭ　ＰＭＳＦおよび ５μｉ／ｍｉＢ　Ｐ　Ｔ　Ｉ中で４Ｘ１０７細胞／ｍｆ！にて溶菌させた。この 精製は非イオン型洗剤の存在下に行なったので、一般に疎水性の軽膜ドメインを 介して膜結合しているＴ４が可溶化蛋白として分離された。この溶解物をＧ５３ ０−タにて１０、　ＯＯＯｒｐｍで１０分間遠心分離し、かつ上澄液を一７０℃ で保存スおよび／次いで蛋白Ａセファローズにより予備吸着させ、次いでアフィ ゲル−１０上に固定化した１９Ｔｈｙ抗−Ｔ４モノクローナル抗体［マサチュー セッツ州、ポストン在、ダナ・ハーバ−・キャンサー・インステイチュート、エ リス・ラインヘルツ博士から寄贈］からなる免疫親和性カラムに通した。このカ ラムを徹底的に洗浄し、かつ結合物質を５０ｍＭグリシン−ＨＣｘ　（ｐＨ２， ５）、０．１５ｍＭ　ＮａＣ１，０，５％Ｎ　Ｐ−４０，５ｉ１９／ｍｆｆＰ　 ８　Ｔ　Ｉおよび０．２ｍＭ　ＥＧＴＡで溶出させた。

次いで、各溶出フラクションの１０成を還元条件下で１０％５ＤＳ−ＰＡＧＥに より分離し、各バンドを銀染色により可視化させた。第１図に示すように、主た る５５Ｋｄの銀染色されたバンドが見られる。次いで、５５Ｋｄ蛋白につき２種 の分析を行ない、この蛋白のアミン末端を配列決定して天然可溶化Ｔ４であると 確認した。

熱可溶性Ｔ４の配列決定 上記のように免疫親和性クロマトグラフィーによりＵ９３７細胞の洗剤抽出物か ら分離した上記可溶化天然Ｔ４のＮ−末端アミノ酸配列を決定した。

これらから得られた各種の蛋白およびペプチドのアミノ酸配列を決定する技術は 当業界で周知されている。自動化エドマン減成を選択して、可溶化天然Ｔ４のア ミノ末端を決定した。より詳細には、精製されかつ電気溶出された約５μ９の可 溶化天然Ｔ４をゲル化させ、次いでこれを気相配列決定装置（アプライド・ビオ システムズ４７０Ａ　＞により自動化エドマン減成にかけた。次いで、エドマン 減成の各サイクルで生成されたＰＴＨ−アミノ酸を、配列決定装置にオンライン 接続した高圧液体クロマトグラフィーによりＰＴＨ−アミノ酸分析装置（アプラ イド・ビオシステムス１２０Ａ　＞で同定した。

蛋白の直接的分析はアミン末端配列の情報を与え、これをヒトＴ４として同定さ れた精製蛋白におけるヒトＴ４のｃＤＮＡ配列から決定されるアミノ酸配列［マ トン等（１９８５）上記］と比較した。

然可溶化Ｔ４の放射線免疫分析 上記精製工程でＴ４が濃縮されたことを確認するため、免疫親和クロマトグラフ ィーの溶出工程から得られたフラクションをＰ、Ｅ、ラオ等のＥＬＩＳＡ分析［ セルラー・イミュノロジー、第８０巻、第３１０〜３１９頁（１９８３）　］に 基づ＜７４−特異性サンドイッチ放射線免疫分析で分析した。レモバウエル・ス トリップ［バージニア州、アレキサンドリア在、ダイナチク・ラプス社コの各ウ ェルを０．０５　Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，４＞における１０成／Ｉ ｎＩ！０ＫＴ４抗体（Ａ　Ｔ　ＣＣＮｏ、ＣＲＬ８ｏｏ２＞もしくはＭＯＰＣ１ ９５（バックグランド結合比較）の５０成により４℃にて１晩被覆した。ウェル を洗浄し、次いでこれらにＰＢＳ中の１％ＦＣ３を満たしてプラスチックの蛋白 結合容量を飽和した。１％ＦＣ３溶液を除去した後、これらウェルに５０ｄの量 で試験試料を添加した。次いで、試料を空温にて４時間培養した。次いで試料を 除去し、ウェルをＰＢＳ中の０．０５％ツイーン−２０で４回洗浄した。次いで 、１１２５−標識１９Ｔｈｙ抗体を添加しくウェル１個当り５０，０００〜１０ ０，０００ｃｐｍ）　、かつウェルを４℃にて１晩培養した。次いで、ウェルを ４回洗浄し、かつ各ウェルを分離して、結合１１２５検出をベックマンＴ検出器 で行なった。

バックグランドを引算した後の数値をプロンｌ〜した第１図に示したように、放 射線免疫分析により検出された可溶化天然Ｔ４蛋白のピークフラクションは、銀 染色により見られる５５Ｋｄ蛋白の溶出物と一致した。

Ｔ４のウェスタンプロット分析 Ｔ４抗原を検出するための多くの抗体が開発されているが、いずれも蛋白プロッ ト分析には有用でない（エリス・ラインヘルツ博士の私信）。Ｔ４および組換可 溶性Ｔ４の精製を追跡するため可溶性Ｔ４のウェスタンプロット検出に有用な抗 体を開発すべく、ウサギにて３種の合成オリゴペプチドに対するポリクローナル 高免疫性の抗−Ｔ４抗体を生成させた。

これらのオリゴペプチドを第３図に示し、次の通りであった：オリゴペプチド　 アミノ酸配位 ＪＢ−１４４−６３ ＪＢ−２１３３−１５６ ＪＢ−３３２５−３４３ 予めこれらペプチドを慣用のホスホアミドＤＮＡ合成技術［たとえばテトラヘド ロン・レターズ、第２２巻、第１８５９〜１８６２頁（１９８１）参照］を用い て合成した。これらペプチドをアプライド・ビオシステムス３８０Ａ　Ｄ　Ｎ　 Ａ合成装置にて合成し、かつゲル電気泳動により精製した。

（ｉ　）ＢＴＧに対するＴ４ペプチドの結合これらペプチドのそれぞれを、Ｊ、 ロスバード等、ジャーナル・エキスペリメンタル・メソツズ、第１６０１、第２ ０８〜２２１頁（１９８４）およびＲ，Ｃ，ケネディー等、「合成ペプチドに対 する抗血清はＨＴＬＶ−ＩＩＩエンベロブグリコ蛋白を識別する」、サイエンス 、第２３１巻、第１５５６〜１５５９頁（１９８６）に示された方法の変法にし たがって、キャリヤ蛋白である牛チロゴブリン（ｒＢＴＧＪ　）（ミズーリ州、 セントルイス在、シグマ社）に結合させた。

より詳細には、１１７１１２のＰＢＳで希釈された１　０ｍｇのＢＴＧを１．３ ｍＱのｍ−マレイミド−ベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ ｒＭＢｓＪ　’）と０．５ｍのジメチルホルムアミド（ｒＤＭＦＪ　）中にて混 合した。この反応混合物を充分混合すると共に、これを２５℃にて約１時間反応 させた。

次いで、混合物を予め０．１Ｍ　ＰＢＳ　（ｐＨ６，０＞で平衡化されたセファ デックスＧ２５ゲル濾過カラム（スエーデン国、ファルマシア社）に充填した。

次いで、３２ｄの溶出フラクションを全部集め、かつ各フラクションにつき２８ ０ｎｍの吸光度を測定した（ｒＡ　Ｊ）。次いで、３個のピーフッラフジョン（ １５，１６および１７）を集めて活性化キャリヤを形成した。

溶解して、硼水素化ナトリウム溶液を作成した。次いで、約８ｍＣｌの各合成Ｔ ４ペプチドＪＢ−１、ＪＢ−２６よびＪＢ−３を１ｄの０．１ＭＩ酸塩緩衝液で 希釈し、次いで各溶液を２００μｅの硼水素化ナトリウム溶液と混合し、この混 合物を氷上で５分間にわたり培養した。次いで、各ペプチド溶液を２５℃まで加 温し、各溶液を１Ｎ　ＨＣＪ！によりｐ）１１．０となしくその間に発泡が生ず る）、次いで各溶液を１ＮＮａＯＨでｐＨ７，０にした（発泡が止まった後）。

次いで、１．２ｄのペプチド溶液を６−の活性化キャリヤ溶液に添加することに より、各ペプチドをＢＴＧに結合させた。

反応混合物を室温で培養することにより結合反応を１晩進行させた。

（ｉｉ）試験動物の接種 上記で作成したＢＴＧ−結合ペプチドのそれぞれを無菌フロイント完成アジョバ ントにＰＢＳ中の結合ペプチド１μ９／ｄの最終濃度まで溶解させた。次いで、 ３匹のウサギにュージーランド白色種）に筋肉内注射により上記各結合ペプチド ５００ｉを接種した。４番目のネズミにュージーランド白色種）には、同様にし て３種の結合ペプチドの混合物を接種した。全ウサギをブースト前に予備出血さ せて、測定すべき各反応につき平均ベースラインを確立した。ウサギを５００４ の結合ペプチドと共に不完全フロインドアジュバントにて６週間ブーストさせた 。

各ウサギから免疫化後の４か月間にわたり血清を毎月集め（ｉｉｉ　）ペプチド 被・プレートに対する抗ペプチド血清によるＥＬＩＳＡ この分析では、ペプチドＪＢ−１、ＪＢ−２６よびＪＢ−３のそれぞれにより動 物内に生成させた抗血清がそのペプチドに結合することを確認した。したがって 、これらのペプチドは免疫性でありかつ試験動物において反応を誘発する。

分析を行なうため、イミュロンー２（バージニア州、アレキサンドリア在、ダイ ナチク・ラプス社）ミクロ測定板をウェル１個には５０成のＰＢＳ中の非結合ペ プチド５０ｔＩ９／ｍｉで被覆し、かつこれらのプレートを４℃にて１晩培養し た。比較として作用させるペプチド４６Ｒ［ペプチド４６はＨＩＶゲノムのｅｎ ｖ遺伝子におけるアミノ酸（ｒＡＡＪ　’）７２８−７５１に対応し、アミノ酸 ナンバーはし、ラトナー等、ｒＡＩＤＳウィルス、ＨＴＬＶ−Ｉｌｌの完全ヌク レオチド配列」、ネイチャー、第３１３巻、第２７１〜２８４頁（１９８５）に 示したものに対応し、ペプチド４６は配列： を有する］で被覆されたプレートも同様に処理した。次いで、これらプレートを ＰＢＳ−ツイーン（０，５％）で４回および水で４回洗浄した。ブυ−トを軽く 紙タオルで叩いて吸取り乾燥させた。プレートを吸取った後、各ウェルに２００ １ＩＩ！の５％ＦＣ３／ＰＢＳ溶液を添加し、かつこれらのプレートを室温にて １時間培養した。

次いで、上記のように作成した予備被覆板にてウサギからの血清試料を分析した 。ｉ：ｉｏｏの初期希釈にてイミュノゲンペプチドに対する抗体反応を分析し、 次いで５％ＦＯ３／ＰＢＳにおける一連の１０倍希釈物について分析した。

室温にて２時間培養した後、プレートを洗浄しかつ上記と同様に吸取り乾燥させ た。次いで、５％ＦＣ３／ＰＢＳにおける西洋ワサビペルオキシダーゼ（ｒＨＲ ＰＪ　）−結合ヤギ抗−ウサギＩＣ７Ｇ［ペンシルバニア州、マルバーン在、ク ーパー・ビオメジカル社］の１　：　１５００希釈物の５Ｑｄを各ウェルに添加 し、かつプレートを室温にて１時間培養した。これらプレートをＰＢＳ−ツイー ン０．５％で洗浄し、次いで５０μｅの板読取装置［バージニア州、アレキサン ドリア在、ダイナチク・ラプス社］により４５０止にて分光光度法で分析した。

ペプチドＪＢ−１、ＪＢ−２６よびＪＢ３のそれぞれに対する抗血清は対応のペ プチドに結合することが観察された。

ざらに、ペプチドＪＢ−１とＪＢ−２とＪＢ−３との混合物に対する抗血清は上 記条件下でペプチドＪＢ−１６よびＪＢ−３に結合することも観察された。固相 ＥＬＩＳＡにてベプチｒにつき試験した４種の抗血清のそれぞれに関する測定値 を下記に示し、ここでｒＮＤＪは数値が決定されなかったこ大凡のタイター ＪＢ　１　＞１１５０，０００　０　ＮＤＪＢ−２０１１５０，０００ＮＤ Ｊ３−３　０　０　１／１０，０００ ＪＢ−１＋ＪＢ−２１／４，０００　ＮＤ　１／７，０００＋ＪＢ−３ 個々のペプチドに対して生成した３種の抗ペプチド血清のの１ｇのフラクション は、上記の１９Ｔｈｙ（抗−７４）モノクローナル抗体親和性カラムから溶出さ れた蛋白のウスタンプロット分析にて天然可溶化Ｔ４の５５Ｋｄ　Ｔ４抗原バン ドを識別した。天然可溶化Ｔ４の放射線免疫分析の場合と同様に、５５Ｋｄの検 出値は親和性カラムからのその出現溶出物と一致した。これは、Ｔ４精製工程が 可溶化Ｔ４を濃縮したことを示す他の証明となる。

したがって、これらのポリクローナル血清は、ウェスタン分析によるＴ４（天然 および組換の両者）のナノグラム量の検出に有用である。

１−ＩＩＶエンベロブに対する細胞フリーＴ４の結合次いで、Ｕ９３７細胞から 分離された精製可溶化天然Ｔ４をＨ１ｖエンベロブ蛋白ｇｐ１６０／ｇｐ１２０ に対スルソの結合能力につき試験した。この直接的結合分析を行なうため、組換 細胞ライン７ｄ２［ダナーフ１−バー・キャンサー・インステイチュート、マー ク・コワルスキーおよびウィリアム・ハビルチン博士の寄贈コから得られた３３ ５−標識ｇｐ１６０／ｇｐ１２０洗剤細胞抽出物を、予めモノクローナル抗体の １種類と共に予備培養された可溶化天然Ｔ４の試料と共に培養した。

より詳細には、５成の可溶化Ｔ４を微小遠沈管にて５馬（約３１１ｆりの０ＫＴ ４　（ＡＴＣＣＮαＣＲＬ８００２）　、・すなわちＨＩＶ結合を阻害しないＴ ４上のエピトープを識別するモノクローナル抗体［Ｊ、Ａ、ホクシー等、ジャー ナル・イミュノロジー、第１３６巻、第３６１〜３６３頁（１９８６”）コまた は５馬の０ＫＴ４Ａ　（オルト・ダイアグノスチックスＮα７１４２）　、すな わちＴ４陽性細胞に対するＨＩＶ結合を阻害するモノクローナル抗体［Ｊ、ステ イーブン・マクドーガル等、ジャーナル・イミュノロジー、第１３７巻、第２９ ３７〜２９４４頁（１９８６）　］と混合した。或いは、５０μｅの可溶化Ｔ４ を５馬のαＨＴＬＶ−ＩＩＩ　ｇｐ１２０（デュポンＮｏ、Ｎ　Ｅ　Ｎ−９２８ ４）と混合した。

次いで、これら混合物を氷上で１時間培養した。

次イテ、１５０／ｆ（７）Ｓ３５−Ｆ識ｇｐ１６０／ｃ＋ｐ１２０１１抽出物ま たは５３５−標識比較細胞抽出物（蛋白Ａセファロースで予備精製）を予備培養 された可溶化Ｔ４／モノクローナル抗体混合物に添加し、かつチューブを４℃に て１晩揺動させた。゛次いで、３０μｅの蛋白−へセファロースを各チューブに 添加しかつ４℃にて２時間にわたり揺動させて蛋白−へセファロースを抗体複合 体に結合させることにより、Ｔ４／Ｃ１ｐ１６０／ｇｐ１２０免疫複合体を沈澱 させた。次いで、エツベンドルフ微小遠心分離器でビーズを遠心分離しかつ激し く洗浄した後、４０μｅのＳＤＳ試料緩衝液により６５℃にて１０分間溶出させ た。次いで、２０１Ｊｉの溶出された物質を７．５％５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルに充 填して、これを還元条件下で操作した。

第２図はＴ４／Ｑｌ）１６０／Ｑｐ１２０同時免疫沈澱の放射能写真およびウェ スタンプロットの結果を示している。第２図において、レーン１〜５は４０％サ リチル酸ナトリウムで処置した後の放射能写真であり、レーン６〜７はウサギ抗 血清ＪＢ−２につきウェスタンプロットで展開したものである。

第２図に示したように、Ｃｌ１）１６０／Ｃ１ｐ１２０蛋白は０ＫＴ４　（レー ン５）と共にＴ４の存在下で同時免疫沈澱されたが、０ＫＴ４Ａ　（レーン４） についてはＴ４の存在下に沈澱されなかった。レーン３は、αＨＴＬＶ−ＩＣＪ ｐＩ　２０モノクローナル抗体を用いたｇｐ１６０／（７ｐ１２０に対する陽性 比較を示している。３３５−標識比較抽出物（レーン１）または蛋白−へセファ ロース単独（レーン２）による陰性比較はいずれもｇｐ１６０／Ｃ１ｐ１２０の 位置に移動バンドを示さなかった。ウェスタンプロットで展開したバンドに基づ き、０ＫＴ４　（レーン６）または０ＫＴ４Ａ　（レーン７）と共に沈澱したＴ ４の量は同じであると思われる。

これは、天然膜結合した精製可溶化天然Ｔ４がまだ溶液中のＨＩＶグリコ蛋白と 相互作用することを示す。したがって細胞フリーの可溶性Ｔ４はＨＩＶとＴ４＋ リンパ球のＴ４リセプタとの間の結合相互作用を防止するのに有用であると思わ れる。ＨＩＶエンベロブ蛋白（Ｈ）１２０に対する結合につき細胞表面Ｔ４と競 合させることにより、可溶性Ｔ４はＨＩＶ感染を阻止するのに有用である。

オリゴヌクレオチドＤＮＡプローブの合成完全ヒトＴ４蛋白をコードすると言わ れるｃＤＮＡに関するヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列が報告されてい る［マトン等（１９８５）上記］。Ｔ４蛋白の推定される主構造は、これを下記 するようなドメインに分割しうろことを示し疎水性／分泌性信号　−２３〜−１ Ｖ−領域／細胞外に対する類似性　＋１〜＋９４Ｊ−領域／細胞外に対する類似 性　＋９５〜＋１０９グリコジル化領域／細胞外　＋１１０〜＋３７４疎水性／ 軽膜配列　＋３７５〜＋３９５極めて親水性／細胞質内　＋３９６〜＋４３５上 記ドメインの配列に基づき、慣用のホスホアミドＤＮＡ合成技術［たとえばテト ラヘドロン・レタース、第２２巻、第１８５９〜１８６２頁（１９８１）　］を 用いて反対方向オリゴヌクレオチドＤＮＡプローブを化学合成した。アプライド ・ビオシステムズ３８０Ａ　Ｄ　Ｎ　Ａ合成装置を用いてプローブを合成し、か つこれらをゲル電気泳動により精製した。

ざらに、アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列に対し相補的となるよう、すなわ ちプローブが反対方向となるようプロ識別しかつこれにハイブリッド化しうるよ うにした。Ｔ４蛋白の１１種の選択領域におけるヌクレオチド配列［マトン等（ １９８５）　（上記）に示されたヌクレオチドナンバーに対応する］は次の通り であった： ２　７４２〜７６５ ３　１４１４〜１４４０ ６　４２７〜４５３ ７　１３０３〜１３２９ ８　１０１２〜１０３８ ９　９７〜１１８ １０　１０〜３６ １１　１６９８〜１７２４ １２　３９７〜４２３ １４　２６１〜２８マ スクリーニング用に上記ＤＮＡプローブを使用する前に、−末鎖ＤＮＡプローブ を［γ−Ｐ３２］−ＡＴＰｔ３よσＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、− 末鎖ＤＮＡプローブのそれぞれを実質的にＡ、Ｍ、マキサムおよびＷ、ギルバー ト、ｒＤＮＡを配列決定するための新規な方法」、プロシーディング・ナショナ ル・アカデミ−・サイエンス・ＵＳＡ、第７４巻、第５６０〜５６４頁（１９７ ７）　］に実質的に記載されたように５′末喘標識した。

λＱｔ１０末′血液リンパ球ｃＤＮＡ保存１の作成末梢血液リンパ球（ＰＢＬ） ｃＤＮＡ保存物を作成するため、単一のロイコ・ホレシスドナーからのＰＢＬを １回の吸収により処理して単核細胞を除去した。次いで、非付着性細胞をＩＦＮ −γ１０００Ｕ／ｄおよび１０ｕ９／ｒｎｌｌ　Ｐ　ＨＡで２４時間刺戟した。

フェノール抽出［マニアチス等、モレキュラ・クローラトリー（１９８２）　］ を用いて、これら細胞からＲＮＡを分離しかつ１回のオリゴｄＴセルロースクロ マトグラフィーによりポリＡ＋ｍＲＮＡを作成した。ＲＮＡをエタノール沈澱さ せ、これをスピードバックで乾燥させ、かつＲＮＡを１０１ＩＩｌのＨ２０に再 懸濁した（　０．５１＃ｅ）。このＲＮＡを室温にて１０分間にわたりＣＨ３Ｈ ｇＯＨ（５ｍＨの最終濃度）およびβ−メルカプトエタノール（０，２６Ｍ）で 処理した。次いでＱメチル水銀処理されたＲＮＡを４３℃のｏ、ｉＭヒトス−Ｈ Ｃｆｆ（ｐＨ８，３＞、０．０１ＭｆＶ１ｇ、０．０１　Ｍ　ＤＴＴ１２ｍＨバ ナジル錯体、５ＪＩ９オリゴ”１２−１８．２０ｍＨＫ　Ｃｌ、１ｍＨｄＣＴＰ ＳｄＧＴＰ、ｄＴＴｌ）、０．５ｍＨｄＡＴＰ。

２　μｃ　ｉ　［α−Ｐ３２］　ｄＡＴＰｃｔｊＪ：ヒ３０単位（Ｄ　Ｌ５ｐｌ ＡＭＶ逆転写酵素（生化学・アメリカ社）に５０ハの全旦にて添加した。この混 合物を空温で３分間培養し、次いで４４℃にて３時間培養した後、反応を２．５ 成の０．５Ｍ　ＥＤＴＡの添加により停止させた。

反応混合物を同容積のフェノール：クロロホルム（１：１）で抽出し、かつ水層 を０．２容量の１０Ｍ　ＮＨ４ＡＣと２．５容量のＥＴＯＨとで２回沈澱させ、 これを減圧乾燥した。

ｃＤＮＡの収量は１．５周であった。

オカヤマおよびヘルツの方法［モレキュラ・セルラー・バイオロジー、第２巻、 第１６１頁（１９８２）　］並びにガブラーおよびホフマン［ジーン、第２５巻 、第２６３〜２６９頁（１９８３）　］の方法にしたがって、第２のストランド を合成したが、ただしこの合成にはＤＮＡポリメラーゼ工大型断片を用いた。

８０成のＴＡ緩衝液（０，０３３Ｍ　トリスアセテート（ｐＨ７，８）　：０、 ０６６Ｍ　Ｋアセテート：　０．０１　Ｍ　Ｍｇアセテート；０．００１Ｍ　Ｄ ＴＴ：５０ｕ９／ｍｆｆＢｓＡ）と５ｍＲＮアーゼＡと４単位ＲＮアーゼＨと５ ０ＭＭのβ−ＮＡＤと８単位のイー・コリ・リガーゼと０．３１２５ｍＨのｄＡ ＴＰ、ｄＣＴＰ。

ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰと１２単位とＴ４ポリメラーゼとにＤＮＡを再懸濁させ ることにより、二本鎖ＤＮＡをプラント末端処理しかつ反応混合物を３７℃にて ９０分間培養し、１／２０容積の０．５Ｍ　ＥＤＴＡを添加し、さらにフェノー ル：クロロホルムで抽出した。水層をＧ　１５０セフアデツクスカラムにて０． ０１　Ｍのトリス−ＨＣｌ１（ｐＨ７，５＞と０．１ＭのＮａＣ１と０．００１ ＭのＥＤＴＡとでクロマトグラフにかけ、二本鎖ＣＤＮＡを含有する先端ピーク を集め、かつこれを工コノ二本ｆＡｃＤＮＡをリンカ−３５／３６　：５部ＭＴ ＴＣＧＡＧＣＴＣＧＡＧＣＧＣＧＧＣＣにＣ３’３’　ＧＣＴＣＧＡＧＣＴＣＧ ＣＧＣＣＧＧＣＧ５１に常法で結合させた。次いで、８００ｂｐおよびそれより 長い断片につぎＣＤＮＡを５５００セフアクリルカラムで寸法選択し、これをＥ Ｃ０ＲＩ−切断されたバクテリオファージスベクターＣ１ｔｌＯ［エリス・ライ ンヘルツ博士により寄贈］に結合させた。ギガパック（ストラテジーン社）に製 造業者の指示にしたがい結合反応物の１部を充填した。充填したファージを用い てイー・コリＢＮＮ１０２細胞に感染させ、かつ細胞をプレート接種して増殖さ せた。得られた保存物は１．１２５ｘ　１．ＱＢ個の独立した組換体を含有した 。

さらに、バクテリオファージスベクターｇｔｉｏ　［エリス・ラインヘルツ博士 により寄贈］にてＰＢＬ　ＣＤＮＡ保存物をスクリーニングし、これはＲＥＸと 呼ばれるＴ４＋腫瘍細胞ラインから得たｍＲＮＡから合成し、これは高レベルに てＴ４蛋白を発現する［０．アクト等、［ヒトＴ細胞すセプタ：ＩＬ−２依存性 クローンおよびＴＩ［８胞腫瘍に対するλおよびβサブ単位の個体発生論および 生化学的関係」、セル、第３４巻、第７１７〜７２６頁（１９１３）　］。

保存物のスクリーニン 次いで、ｐ３２−標識された合成オリゴヌクレオチド反対方向プローブの３種（ すなわちプローブ３．６および９）を用いて２種のλＱｔｌＯＣＤＮＡ保存物を 並行的にスクリーニングし、その際Ｒ，ケート等、［ミュラー阻止物質に対する 牛およびヒト遺伝子の分離、並びに動物細胞におけるヒト遺伝子の発現」、セル 、第４５巻、第６８５〜６９８頁（１９８６）′に記載されたプラークハイブリ ッド化スクリーニング技術を僅かに改変して用いた。塩化テトラメチルアンモニ ウムを用いることなくハイブリッド化ざぜることによりケート等の方法を改変し て、混合物でなく独特のプローブを使用することによりプラークフィルタを試験 した。

予めＡ、マキサムおよびＷ、ギルバート、メソッズ・エンチモロジー、第６８巻 、第４９９〜４８０頁（１９７９）　］の方法にしたがって［λ−ｐ３２］ＡＴ Ｐで５′末端標識された３種のプローブを用いて、ＰＢＬ　ＣＤＮＡ保存物と上 記ＲＥＸＣＤＮＡ保存物とを並行スクリーニングした。

ＰＢＬ保存物のスクリーニングにより、ＥＣ０ＲＩでλｇｔ１０ベクターから切 断しうる３、０６４Ｋｂ挿入体を含有するほぼ全長の可溶性７４　ＣＤＮＡクロ ーン、すなわちλ２０３−４　（すなわちλＱｔ１０．ＰＢＬ、Ｔ４）を分離し た。

ＲＥＸ細胞保存物のスクリーニングにより、１２００ｂｐＣＤＮＡ挿入体を含有 する不完全Ｔ４　ＣＤＮＡクローンを分離した。次いで、ざらにＤＮＡ配列決定 分析により、これらクローンからのＤＮＡを特性化した。

ざらにマーク、パセク博士によりベクターＥＭＢＬ３で作成されたバクテリオフ ァージスヒトゲノム保存物（マサチューセッツ州、ケンブリッジ在、バイオジエ ン・インコーポレーション社）　［Ｎ、マレ−、ラムダ２版、Ｒ，ヘンドリック ス、Ｊ、ロバーツ、Ｆ、スタール、Ｒ，ワイスベルブ、第３９３５〜３４２２頁 （１９８３）　］をスクリーニングした。この保存物は、ヒトリンパ芽細胞ライ ンＧＭ’１４１６．４８、ｘｘｘｘにュージャージー州、カムデン在、ヒユーマ ン・ジエネティック・ミュータント・セル・デポジトリ−）から入手した染色体 ＤＮＡを５ａｕ３ａで部分切断し、マニアチス等（１９８２）　（上記）に記載 した方法にしたがってＢａｍＨＩで予め切断したＥＭＢＬ３アームに結合させる ことにより作成したＤＮＡ断片を含む。ファージ保存物のプレート接種、溶菌お よびニトロセルロースへのファージＤＮＡの移動は、Ｗ。

Ｄ、ベントンおよびＲ，Ｗ、デビット「単一プラークに対しその場でハイブリッ ド化させることによるλｇｔ組換クローンのスクリーニング」、サイエンス、第 １９６巻、第１８０頁（１９７７）およびマニアチス等（１９８２）に記載され たように行なった。ハイブリッド化条件はケート等（１９８６）　（上記）によ り記載された条件としたが、ただし塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣＪ ２）を洗浄用緩衝液から省略した。

約２，０００，０００個のプラークを並行ハイブリッド化により上記プローブ１ およびプローブ３でスクリーニングした。主たるスクリーニング物にてプローブ ３とハイブリッド化した０Ｍ４７と呼ばれる１種のファージをＤＮＡ配列分析に かけて、予想される細胞外ドメインおよび経膜ドメインに関するコード化配列間 のイントロンの存在および位置を決定した。

Ｔ４配列を有するファージクローンは、プローブ１でスクリーニングした場合に 見出されなかった。これは恐らくイントロンにより中断された配列を含むためと 思われる［０．Ｒ。

リットマンおよびＳ、Ｎ、ゲラトナー、ネイチャー、第３２５巻、第４５３〜４ ５５頁（１９８７）　：および発明者等の観察］。

０Ｍ４７の部分配列分析は、Ｔ４につき推定される主配列のバリン（アミノ酸３ ６３）に対するコドンに対応する配列をイントロンが中断することを示す（第３ 図においてイントロン実線で示される）。このイントロンは、停止コドンを導入 して可溶性型のＴ４を発現するための有力な部位を形成する。Ｔ４に対するコー ド化配列内に見られる他のイントロンは、アルギニン（アミン１２９５＞に対す るコドンを中断すると共に、０Ｍ４７にあける第３のイントロンがアルギニン（ アミノ酸４０２）とアルギニン（アミノ酸４０３）とに関するコドン間に存在す る（第３図）。

ＣＤＮＡクローンの配列決定 次いで、クローンλ２０３−４からのＥＣ０ＲＩ切断ＤＮＡを動物発現ベクター ｐＢＧ３’ｌ　２　［Ｒ，ケイト等、上記］にサブクローン化して、配列分析を 容易化させた。より詳細には、第４図に示すように、λＣ１ｔ１０．ＰＢＬ、Ｔ ４をＥＣ０ＲＩで切断して、全長７４　ＣＤＮＡを含有する３、０６４ｋｂｐの ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片を切除した。

可溶性Ｔ４および全長Ｔ４に対する全体コード化領域を含むこのｃＤＮＡ配列を ｐｌ　７０−２として寄託した。Ｔ４リガーゼを用いて、この断片を予めＥＣ０ ＲＩで切断された動物発現ベクターｐＢＧ３１２（上記）に結合させることによ り、ｐＢＧ３１２．Ｔ４およびｐ１７０−２を作成した（第４図λ次いで、マキ サム・ギルバートの技術［Ａ、Ｍ、マキサムおよびＷ、ギルバート、ｒＤＮＡを 配列決定するための新規に方法」、プロシーディング・ナショナル・アカデミ− ・サイエンス・ＵＳＡ、第７４巻、第５６０〜５６４頁（１９７７）　］を用い て、ｐＢＧ３１２．Ｔ４のＥＣ０ＲＩ断片のヌクレオチド配列を決定した［マト ン等（１９８５）　（上記）に報告されたものと比較してＰＢＬ　ＣＤＮＡ配列 を示す第３図参照］。

この分析は、Ｔ４　ＣＤＮＡの３．０６４ｋｂ［）のＰＢＬ全長相補ＤＮＡコピ ーがＴ４に対するコード化配列と５′非コ一ド化配列の約２００ｂｐと３′非コ 一ド化配列の約１５００ｂｐとを含むことを示した。　次いで、Ｐｓｔ工により ｐＢＧ３１２．Ｔ４を切断し、かつ得られた３′突出末端をクレノーで除去し、 ざらに約２．５ｋｂｐの断片を分離した。次いで、この断片をｐＢＧ３１２のポ リリンカー（予めＳｍａＩ部位にて制限したもの）に挿入してプラスミドｐ１７ ０−２を作成し、これは全長ＰＢＬ　Ｔ４　ｃＤＮＡ配列を有する（第３図参照 ）。

第３図に示したように、ＰＢＬ　Ｔ４　ｃＤＮＡはマトン等（１９８５）　（上 記）に報告された約１，７００ｂｐの配列にほぼ同一のヌクレオチド配列を有す る。しかしながら、このＰＢＬ　Ｔ４　ｃＤＮＡは、このＣＤＮＡの翻訳生成物 にてマトン等により報告された配列と比較して３個のアミノ酸置換を有する蛋白 を産生する３種のヌクレオチド置換を有する。

第３図に示したように、これらの相違はアミノ酸位置３に存在し、ここでマトン 等のアスパラギンはリジンより置換されており、位置６４ではマトン等のトリプ トファンがアルギニンにより置換されており、ざらに位置２３１においてはマト ン等のフェニルアラニンがセリンにより置換されている。すジンではなくマトン 等の位置３で報告されたアスパラギンは、配列決定ミスの結果である［リチャー ド・アクセル博士私信］。

対立多形性を示しうる位置６４２１”３よび２３１におけるアミノ酸置換の意味 ［Ｔ、Ｃ，フラー等、ヒユーマン・イミュノロジー、第９巻、第８９〜１０２頁 （１９８２）　：Ｗ、ストールおよびＨ，Ｇ、クンケル、スカンジナビャ、ジャ ーナル・イミュノロジー、第２０巻、第２７３〜２７８頁（１９８４）　：Ｎ、 アミノ等、ランセット、第２巻、第９４〜９５頁（１９８４）　：およびＭ、サ トー等、ジャーナル・イミュノロジー、第１３２巻、第１０７１〜１０７３頁（ １９８４）　］は不明である。

ＲＥＸクローンのｐＥｃｌｏｏにおける挿入体のＤＮＡ配列分析［マキサムおよ びギルバート、上記］は、これが切断ミスの生産物を示すことを示唆している。

何故なら、５′非コ一ド化配列はグリシン（アミノ酸４９）に対するＧＧＴコド ンで始まるコード化配列により切断されていると思われるからである（第３図お よび第５図）。グリシン（アミノ酸４９）からイソロイシン（アミノ酸４３５　 ’）までのｐＥＣ１００＊におけるＴ４コード化配列は、マトン等（１９８５） 　（上記）の配列と同一である［＊ＲＥＸ保存物からの不完全Ｔ４　ＣＤＮＡク ローンをＥＣ０ＲＩで切断しかつ１．２２ｂｐ　ｃＤＮＡ挿入体を分離すること により、ｐＥｏｌｏｏを作成し、次いでこれを予めＥＣ０ＲＩで切断してｐＥＣ ｌｏｏを形成させたｐＵｃｌ　２　（インジアナ州、インジアナポリス在、ベー リンガー・マンハイム社）に結合させたコ。

比較のため、Ｕ９３７細胞から精製された天然Ｔ４蛋白の初期のＮ−末端蛋白配 列分析は、アミノ酸３としてアスパラギンを有するＴ４発現生産物を示す。これ らの相違をも第６図に示し、この図面はざらにＲＥＸ細胞ライうλｑｔ１０保存 物；λＥＭＢＬ保存物からのゲノムクＯ−ン；ネズミＴ４配列 ［ツールビエリ等、サイエンス、第２３４巻、第６１０頁（１９８６）　］　： およびヒツジＴ４配列［クラツソン等、イミュノゲネテイツクス、第２３巻、第 １２９頁（１９８６）　］からの部分クローンの対応位置における比較をも示し ている。

可溶性Ｔ４突然変異種の作成 次いで、インビトロでの部位特異性突然変異および制限断片置換の技術を用いて 、順次の工程でｐ１７０−２のＴ４ＣＤＮＡコード化配列をマトン等により報告 された配列と同一になるよう改変した。先ず最初にオリゴヌクレオチド特異性突 然変異を用いて、位置３および６４におけるアミノ酸を改変した。次いで、Ｔ４ 陽性リンパ球ライン［０，カクト等、セル、第３４巻、第７１７〜７２６頁（１ ９８３）　］保存物から分離されたλＱｔ１１　（エリス・ラインヘルツ博士に より寄贈）における部分子４　ｃＤＮＡのセリン２３１コドンを含む断片による 制限断片置換を用いて、位置２３１におけるアミノ酸を変化させた。次いで、改 変した７４　ＣＤＮＡ配列を切断して、経眼ドメインと細胞質内ドメインとのコ ード化領域を除去した。次いで、制限部位間へのリンカ挿入により全長Ｔ４クロ ーンＰＢＬ　Ｔ４から３種の異なる可溶性Ｔ４突然変異種を作成して、安定な分 泌性１４分子を実験的に見出す確率を高めた。これら突然変異種のそれぞれの構 造を第７Ａ図に示す。

第７Ａ図のラインＡは、Ｊ、カイトおよびＲ，Ｆ、ドーリトル、ジャーナル・モ レキュラ・バイオロジー、第１５７巻、第１０５〜１３２頁（１９８２）にした がうベプロット（ライスコンシン大学・遺伝子コンピュータグループ）と呼ばれ るコンピュータプログラムを用いて行なった全長可溶性Ｔ４のヒトロバシー分析 を示している。ラインＢは、全長Ｔ４の蛋白ドメイン構造［マトン等（１９８５ ）上記］を示しており、ここでｒＳＪは分泌性信号配列を示し、ｒＶＪは免疫グ ロブリン−類似の可変領域配列を示し、ｒＪＪは免疫グロブリン−類似の結合領 域配列を示し、ｒＵＪは独特な細胞外領域配列を示し、ｒＴＭＪは経眼配列を示 し、かつｒＣＪは細胞質領域配列を示す。ラインＢにおいて経眼アミノ酸配列と 成る種の整列配列とをＴＭドメインの下に示す。ラインＣは、組換可溶性Ｔ４突 然変異種ｐＢＧ３７７におけるｒｓＴ４．１、ｐ８Ｇ３８０におけるｒｓＴ４． ２およびｐＢＧ３８１におけるｒＳＴ４．３の蛋白ドメイン構造を示している。

ラインＤは、Ｔ４　Ｎ−末端信号配列（Ｓ）を欠失したイー・コリｒｓＴ４遺伝 子（Ｍｅｔ完全構造）（ｐ１９９−７＞の蛋白ドメイン構造を示している。

全長可溶性Ｔ４　ＣＤＮＡをイントロン／エキラン境界またはヒトロバシー分析 予測により規定される蛋白ドメイン境界のいずれかに対応する位置にて切断する ことにより、先ず最初に３種の可溶性Ｔ４突然変異遺伝子断片を作成した。より 詳細には、合成リンカを経眼／細胞外ドメインの境界に対し５′である独特なＡ ｖａＩ部位に導入して、枠内の翻訳停止コドンを生成させ、かくして全長Ｔ４配 列の経眼ドメインと細胞質ドメインとを欠失するＲ４遺伝子を作成した。

たとえばｐＢＧ３７７における突然変異種ｒｓＴ４．１を、アミノ酸３６２（す なわち細胞外および経眼ドメインのエキランを分離するイントロンの位置に相当 するリジン）の後の停止コドンの挿入によって切断した。このイントロンと経眼 ドメインおよび細胞質ドメインを分断する隣接イントロンとの両者の位置を、上 記λＥＭＢＬ３ゲノム保存物から分離された染色体Ｔ４クローンのＤＮＡ配列分 析により決定した。

Ｔ４経膜ドメインを整列するイントロン位置の意味は不明であるが、遺伝子構造 の決定はｒＳＴ４突然変異種を設計するための重要な情報を与える。何故なら、 エキランはしばしば機能的ドメインを形成するからである［Ｗ、ギルバート、「 遺伝子が分断される理由」、ネイチャー、第２７１巻、第５０１頁（１９７８） 　］。

次いでＴ４　ｃＤＮＡを、アミノ酸３７４にて経眼ドメインおよび細胞外ドメイ ンの境界で切断することにより、ｐＢＧ３８０における突然変異種ｒｓＴ４．２ を作成した。

ざらに、アミノ酸３７７（すなわち経眼／細胞外ドメインの境界から３個のアミ ノ酸だけ下流かつ経眼ドメイン内の位置）にてＴ４　ｃＤＮＡを切断することに より、ｐＢＧ３８１における突然変異種ｒＳＴ４．３を作成した。

Ｄ、シュドラウス等、「トリオースホスフェートイソメラーゼの活性部位：改変 酵素のインビトロ突然変異および特性化」、プロシーディング・ナショナル・ア カデミ−・サイエンス・ＵＳＡ、第８２巻、第２２７２〜２２７６頁（１９８５ ）　］にしたがうオリゴヌクレオチド部部位特異性突然具の技術を用いて、全長 Ｔ４クローンＰＢＬ　Ｔ４から第４の可溶性Ｔ４突然変異種を作成した。この突 然変異種の構造を第７Ａ図のラインＤに示し、これはＴ４　Ｎ−末端信号配列（ Ｓ）を欠失したイー・コリｒｓＴ４遺伝子（Ｍｅｔ−完全ｒｓＴ４．２）作成物 （ｐ１９９−７として寄託）の蛋白ドメイン構造を示す。

ざらに、他の各種の可溶性Ｔ４欠失突然変異種を作成して、Ｔ４４部のどの小型 断片がＨＩＶに結合する蛋白を生成するかどうかを決定した。これらの作成は、 Ｔ４のアミン末端配列がＨＩＶに結合するのに必要とされるという知見に基づい た。この知見は、ざらにモノクローナル抗体０ＫＴ４ＡがＨＩＶによるＴ４陽性 細胞の感染を阻止すると共に、Ｔ４のアミノ部分におけるエピトープを識別する と思われる［フラー等、上記］という観察に基づいている。グリコジル化を欠失 しかつＨＩＶを結合すると共に感染を阻止しうろこの種のＴ４の断片は、イー・ コリで産生させ或いは化学合成することができる。

これら欠失突然変異種の各構造を第７Ｂ図に示す。この図面において、ラインＡ は全長Ｔ４の蛋白ドメイン構造［マトン等（１９８５）　、上記、第７Ａ図］を 示す。ラインＢにおいては、組換可溶性Ｔ４突然変異種の蛋白構造が次のように 示されている：ｐ２０３−５にあけるｒＳＴ４．７、ｐＢＧ３９２におけるｒＳ Ｔ４．７、ｐＢＧ３９３におけるｒｓＴ４．８．１）ＢＧ３９４におけるｒＳＴ ４．９、ｐＢＧ３９５におけるｒｓＴ４．１０．　ｐＢＧ３９７におけるｒｓＴ ４．１１、ｐＢＧ３９６にあけるｒｓＴ４．１２、ｐＢＧ２１５−７におけるｒ ｓＴ４．１１１、ｐＢＧ２１１−１１にあけるｒｓＴ４．１１３．１およびｐＢ Ｇ２１４−１０におけるｒｓＴ４．１１３．２゜ ｒｓＴ４．２遺伝子をｒＳＴ４．２のアミノ酸１８３および２６４における５ｔ ｕＩ部位の後で切断することにより、可溶性Ｔ４誘導体ｐ２０３−５、ＤＢＧ３ ９２、ｐＢＧ３９３、ｐＢＧ３９４およびｐＢＧ３９６を作成した。

より詳細には、ｒｓＴ４．２　ｃＤＮＡをアミノ酸１８２にて切断することによ り、ｐ２０３−５６よびＩ）ＢＧ３９２における誘導体ｒＳＴ４．７を作成した 。ざらに、ｒｓＴ４．２　ｃＤＮＡをそれぞれアミノ酸１１３および・１６６で 切断することにより、誘導体ｐＢＧ３９４におけるｒＳＴ４．９ｃｌ”；よびｐ ＢＧ３９６におけるｒＳＴ４．１２を作成した。ざらに、ｒｓＴ４．２　ｃＤＮ Ａをそれぞれアミノ酸１３１および１４５で切断することにより、誘導体ｐＢＧ ３９５におけるｒｓＴ４．１０およびｐＢＧ３９７におけるｒｓ７４．１１を作 成した。

細菌細胞におけるＴ４および可溶性Ｔ４ポリペプチドの発現本発明のＣＤＮＡ配 列を使用して、当業界で周知された技術で真核および原核宿主細胞を形質転換さ せることにより、組換可溶性Ｔ４ポリペプチドを臨床上および産業上有用な量に て産生ずることができる。

たとえば第９Ａ図に示したような発現ベクターｐ１９９−７を次のように作成し た。

先ず最初に、第８Ａ〜８Ｄ図に示したような各種の中間プラスミドの作成により 第９Ａ図に示した作成を行なった。これらの作成は、慣用の組換技術を用いて行 なった。それらの作成に用いたリンカ−を第１０図に示す。

第８Ａ図および第８Ｂ図に示したように、マトン等（１９８５’）（上記）の配 列とは異なる３種のアミノ酸を特徴としたＴ４をコードする仝長Ｔ４ＤＮＡ配列 を有するｐ１７０−２から出発し、可溶性Ｔ４の発現を指令する各種の構成物を 作成した。これら構成物の幾つかは、そのアミノ酸の１種もしくはそれ以上がマ トン等の各アミノ酸に対応するよう変化されたことを特徴とする。この図面およ び他の図面において、アミノ酸変化は矢印によって示される。

プラスミド１）１９２−６は、第８Ｃ図に示したような全７４　Ｎ−末端信号配 列を除去するオリゴヌクレオチド部位特異性突然変異によって誘導されたＭｅｔ 完全ｒＳＴ４．２く、第８Ｄ図に記載した工程を行なって、ｐ１９５−８（すな わちＣ１ａ工制限部位に整列したＭｅｔ完全ｒｓＴ４．２配列を有するプラスミ ド）を作成した。ｐ１９５−８のＭｅｔコドンとの間の間隔を最適化する。第８ Ｄ図において、５Ｔ８ｒＣ１−はテトラサイクリン耐性をコードするｐＡＴ１５ ３に基づくプラスミドであって、高プラスミドコピー数を可能にするｒｏｐ−突 然変異と、バタテリオファージ遺伝子３２からのプロモータおよびリボンーム結 合部位と、遺伝子３２転写停止配列とを有する。

Ｃ１ａＩによるｐ１９５−８の切断はｐ１９９−７を作成するために使用する断 片を生成し、その作成はＰＬプロモータの制御下でＭｅｔ完全ｒＳＴ４．２の発 現を指令する（第９Ａ図）。第１工程として、ｒＳＴ４．２の発現がＰＬプロモ ータの制御下におるベクターを作成するため、ｐ１０３４（ｐ　１ｍｕＧｃｓＦ ）からベクターｐ１９７−１２を作成した（第９Ａ図）。

次いで、Ｉ）１０３４をＥＣＯＲ工および［３ＢｍＨＩで切断して、ＧＣ３Ｆ　 ｃＤＮＡ挿入体およびファージｍｕリポソーム結合部位配列の１部を切除し、こ れをその後にオリゴヌクレオチドで再編成した。用いた合成リンカ−はリンカ− ５７−６０とした（第１０図）。

次いで、合成リンカ−をＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ切断ｐ１０３４に結合させて、 ｐ１９７−１２を作成した。代案として、これら工程の代りにプロモータとター ミネータとの配列間に適切に位置するＣｌａＩ部位を有する任意適当なイー・コ リ発現ベクターから出発することもできる。ｐ１９７−１２をＣ１ａＩで切断し 、か’）ｐＢＧ３８１におけるｒＳＴ４．３のＣＤＮＡ配列とＩ）１０３４から 得られたファージ転写ターミネータとを有するＣ１ａＩ−Ｃ１ａＩカセツトを挿 入した。このカセットの配列を第１１図に示す。得られたプラスミドｐ１９９− ７は、そのベクター中にｒＳＴ４．２　ｒＭｅｔ完全」遺伝子を有する。

或いは、Ｍｅｔ完全ｒＳＴ４．２配列を本出願と共に寄託したプラスミドｐＢＧ ３８０から誘導することもでき、かつ信号配列を切除してｐ１９２−６を形成す ることもできるであろう。

ｐ１９９−７の発現につき次のように試験した。

５Ｇ９３６、すなわちイーーコ＋）　ｌ　ｏｎ　ｈｔｐｒダフル突然変異種（Ａ ＴＣｏ　３９６２４）　［ｓ、ボッおよびＡ、ゴールドヘルク、「イー・コリに おけるＡＴＰ−依存性蛋白減成」、マキシマイジング・ジーン・エクスプレッシ ョン、Ｗ、レツニコフおよびり、ゴールド（編集＞　（１９８６）　］を常法［ マニアチス等（１９８２）　１によりｐ１９９−７で形質転換させて、５Ｇ９３ ６／ｐ１９９−７、すなわちＰＬプロモータの背後にＭｅｔ−完全ｒＳＴ４．２ 遺伝子を有するプラスミドを持った突然変異体を形成した。これら突然変異体を １０ｍｃｇ／ｒａｉｌのテトラサイクリ（ｔｅＢを含有するＬＢ寒天板にて選択 した。単一コロニーを分離するため数種の単一コロニーを塗抹した後、ｒＳＴ４ ．２合成の誘発を試験すべく１種をランダムに選択した。単一コロニーをＬＢ− 寒天ｔｅｔ＋プレートから、１２５ｄの振どうフラスコにおける２０ｒｄのルリ アブロス（ＬＢ）および１０ｍｃａ　／ｍｅのｔｅｔに釣上げ、かつこれを振と う通気培養装置にュージャージー州、ニュー・プルンスウイツク・サイエンティ フィック社）にて３０℃で１晩増殖させた。

次いで、０．５ｍの１晩培養物を５００ｄのフラスコにおける５０ｄのＬＢおよ びｔｅｔに添加することにより誘発培養を開始させ、これを３０℃にて振とう通 気培養器で増殖させた。培養が０．４のＯＤ　（６００）に達した後、これを４ ２℃の水浴に移しかつ緩和に約２０分間振とうした。４２℃にて熱誘発させた後 、フラスコを３９℃の通気培養器にュージャージー州、ニュー・ブルンスウイツ ク・サイエンティフィック社）に移し、これを激しく　２５０ｒｐｍで振とうし た。４２℃の熱ショックの直後および４時間にわたる各時点および次いで１晩増 殖させ　。

た後に、試料を抜取った。これら試料をＯＤ　（６００）により増殖につき測定 し、かつ蛋白合成のパターンにつきクーマシー・ブルー蛋白染色およびウサギ抗 ペプチド抗体プローブ（上記）でのウェスタンプロット分析により５ＯＳ−ＰＡ ＧＥの後に分析した。相対的分子量および蛋白プロット分析に基づき、ｒｓ７４ ．２の発現を４２℃での熱誘発後に５Ｇ９３６／ｐ１９９−７から誘発させた（ 第１２図）。

照）にて形質転換させた。ｐ１９９−７のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列 を第１１図に示す。

イー・コリにおけるｐ１９９−７からの可溶性Ｔ４の発現を、５ＤＳ−ＰＡＧＥ 後の全細胞抽出物のウェスタンプロット分析により測定し、その際ウサギポリク ローナル抗ペプチドＪＢ−１または抗ペプチドＪ８−２抗体をプローブとして使 用した（第１２図）。

さらに、第９Ｂ図に示した発現ベクター１）２０３−５を次のように作成した。

ｐ１９７−７から出発し、これはＰＬ　ｍｕベクターｐ１９７−１２（第９Ａ図 参照）と同じ配列を有するが、ただしＰＬプロモータに続く５′非コード化領域 に単一のヌクレオチド欠失が存在する。ｐ１９７−１２のヌクレオチドＮα４０ （すなわちアデニン）の欠失であるこの欠失部（第１１図参照）は、リンカ−５ ４〜６０（第１０図参照）から作成された領域における欠失によって生ずる。ｐ １９７−７は、３７４個のアミノ酸からなるｒｓＴ４．２遺伝子を有する。

或いは、出発プラスミドとしてｐ１９７−７を使用することもできる。

ｐ１９７−７をＣＩａＩで切断した。さらに、ｐ１９５−８（第８Ｄ図および第 ９Ａ図参照）をもＣ１ａＩで切断して、ｒＳＴ４．２のｃＤＮＡ配列を有するＣ １ａＩ−ＣＩａＩ力゛セットを除去した。次いで、Ｃ１ａＩ−Ｃ１ａＩカセツト をｐ１９７−７に挿入してｐ１９Ｂ−２を作成した。

次いで、ｐｉ９Ｂ−２を５ｔｕＩで切断して、成熟Ｔ４蛋白コード化配列の８０ （［ｉｌのアミノ酸（アミノ酸１８５からアミノ酸２６４まで）を除去した。し かしながら、予想外のメチル化により第２の５ｔｕＩ部位における切断が妨げら れた結果、アミノ酸１８４におけるＳｔｕ工部位のみが切断された。結合の後、 プラスミドＤＮＡをイー・コリに形質転換させ、かつ常法により欠失につぎ数種 のプラスミドクローンを検査した。これらプラスミドのいずれも、予想のＳｔｕ 工欠失を持たなかった。

ｐ２０３−５と呼ばれるこれらプラスミドの１種に関するその後のＤＮＡ配列分 析は、５ｔｕＩ識別配列における２個のグアニン残基（アミノ酸１８３および１ ８４；第３図のヌクレオチド８１８および８１９）が、エキソヌクレアーゼ汚染 されたＳｔｕ工酵素の使用により生じたエキソヌクレアーゼ切断に基づく切断の 後に欠失されていることを示した。このジヌクレオチド欠失はアミノ１１１８２ （グルタミン）の後の翻訳フレームシフトをもたらし、かつフレームシフトから 下流に６個のアミノ酸コドンよりなる停止コドンを導入したく第９Ｃ図）。第２ の５ｔｕＩ部位の予想外のメチル化と、新たな停止コドンをもたらす欠失とは一 緒になって、ｒＳＴ４．７と呼ばれる組換可溶性Ｔ４の短縮型をコードする遺伝 子を形成した。ｒｓＴ４．７配列は、成熟Ｔ４配列の１８２個のアミノ＠Ｎ−末 端セグメントとＣ−末端における非Ｔ４配列の６個のアミノ酸（すなわちアスパ ラギン−ロイシン−グルタミン−ヒスチジン−セリン−ロイシン）と最後にＴＡ Ａ停止コドンとをコードする。

イー・コリにおけるｐ２０３−５からの可溶性Ｔ４の発現を、上記のウェスタン プロット分析により測定した。

動物細胞におけるＴ４および可溶性Ｔ４ポリペプチドの発可溶性Ｔ４遺伝子と膜 結合Ｔ４をコードする未改変遺伝子との両者を、動物発現ベクターｐＢＧ３６Ｂ に挿入した。より詳細には、可溶性遺伝子構成物のそれぞれを、アデノウィルス 後期プロモータの転写制御の下でｐＢＧ３６８に挿入してプラスミドｐＢＧ３７ ７、ｐＢＧ３８０およびｐＢＧ３８１を作成した。ざらに、ｐＢＧ３７８および ｐＢＧ３７９と呼ばれる２種のｐＢＧ３１２に基づく構成物を作成し、これらは 組換仝長Ｔ４蛋白の発現を指令する。

ｐＢＧ３７８およびｐＢＧ３７９は同じ全長Ｔ４蛋白をコードするが、ｐＢＧ３ ７９においては３′未未翻訳列の１部が除去されている。次いで、組換可溶性Ｔ ４．ｌｊよび組換全長Ｔ４の発現を試験するため、支那ハムスター卵巣細胞（ｒ ｃＨＯＪ　）を前記プラスミドの１種およびプラスミドｐＡｄＤ２６により同時 トランスフェクトした。

先ず最初に、ｐＢＧ３６８を次のように作成した。第１３図に示したように、動 物細胞発現ベクターｐＢＧ３１２　［Ｒ。

ケート等、「ミュラー阻止物質に対する牛およびヒト遺伝子の分離および動物細 胞におけるヒト遺伝子の発現」、セル、第４５巻、第６８５〜６９８頁（１９８ ６）］　ＥＣ０ＲＩおよび得られたプラスミドｐＢＧ３６８は、クローン化領域 に残した。

より詳細には、それぞれ制限酵素ＥＣ０Ｒｉおよびをクレノーで埋め、次いで４ 個のヌクレオチドを再結合させ可溶性Ｔ４の一時的発規が証明された後、可溶性 Ｔ４を連続的に発現する安定な細胞ラインを作成した。これを行なうため、安定 な細胞発現宿主、すなわちジヒドロホレートレダクタ゛−ゼ欠失突然変異種（Ｄ ＨＦＲ″″）支那ハムスター卵巣細胞ライン［Ｆ、カオ等、「哺乳動物細胞の遺 伝およびグリシン必要性突然変異種の補足分析」、プロシーディング・ナショナ ル・アカデミ−・サイエンス、第６４巻、第１２８４〜１２９１頁（１９６９） 　：　Ｌ、チェシンおよびＧ、アーラブ、「ジヒドロホレートレダクテーゼ活性 を欠失した支那ハムスター細胞突然変異種の分離」、プロシーディング・ナショ ナル・アカデミ−・サイエンス、第７７巻、第４２１６〜４２８０頁（１９８０ ）　］を用いた。

この系を用いることにより、ネズミＤＨＦＲ２伝子を有するｐＡｄＤ２６　［Ｒ ，Ｊ、カウフマンおよびＰ、Ａ、シャープ、「モジュラ−・ジヒドロホレート・ レダクテーゼ相補ＤＮＡ遺伝子で同時トランスフェクトされた配列の増殖および 発現」、ジャーナル・モレキュラ・バイオロジー、第１５９巻、第６０１〜６２ １頁（１９８２）　］でＴ４遺伝子構成物を同時トランスフェクトした。同時ト ランスフェクトを行なう前に、制限酵素切断により全プラスミドを直線化させ、 かつ１〜ランスフエクト前に各プラスミドをｐＡｄＤ２６と混合してｐＡｄ　Ｄ 　２６対Ｔ４のモル比を１：１０とした。これはトランスフェクト体１個当りの Ｔ４ｉ伝子コピー数を最大化した。

細胞内でこれらプラスミドを互いに結合させて、異常な組換により宿主染色体配 列に一体化しうるポリマーを形成させた［Ｊ、ハイネスおよびＣ，ワイズマン、 「クローン化インクフエロン遺伝子の複数コピーを有するハムスター細胞による ヒトインターフェロンの構成的長期産生」、ヌクレイツク・アシッド・リサーチ 、第１１巻、第６８７〜７０６頁（１９８３）　：Ｓ、Ｊ、スカヒル等、「支那 ハムスター卵巣細胞におけるヒト免疫インターフェロンｃＤＮＡ遺伝子の産生物 の発現および特性化」、プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエン ス・ＵＳＡ、第８０巻、第４６５４〜４６５８頁（１９８３）　］。

ヌクレオチドを含まない培地にてミズミＤＨＦＲ遺伝子を発現するトランスフェ クト体を選択した。次いで、これらのトランスフェクト体を一連の増加する濃度 のメトトレキセート（すなわちＤＨＦＲを結合する毒性フオレート同族体）に露 出させて、ＤＨＦＲの細胞レベルを選択した。

ＤＩ−ＩＦＲの発現増大によるメトトレキセートに対する耐性はしばしばＤＨＦ Ｒ遺伝子増殖の結果であり、これは増殖単位と呼ばれる大型染色体セグメントの 反復を含みうる［Ｒ。

Ｊ、カウフマンおよび、Ｐ、Ａ、シャープ、「支那ハムスター卵巣細胞ラインに おけるジヒドロホレートレダクテーゼ遺伝子の増殖および喪失の発現」、モレキ ュラ・セルラー・バイオロジー、第１巻、第１０６９〜１０７６頁（１９８１） 　］。したがって、ＤＨＦＲとｒｓＴ４配列との同時組込みは、ｒ　ｓ　Ｔ　４ 　遺伝子の増殖を可能にした。安定にトランスフェクトされた細胞ラインを選択 的増殖培地でのクローン化により分離し、次いでＴ４抗原（ＲＩＡ＞［Ｄ、タラ ツクマン等、ネイチャー、第３２１巻、第７６７〜７６８頁（１９８４）　］に て１４４発にっきスクリーニングし、ざらに［Ｓ３５］システイン（ｒＳ３５− ｃｙｓＪ　）代謝標識の後に状態調節培地から免疫沈澱させることにより分離し た。

ざらに、可溶性Ｔ４誘導体ｒＳＴ４．７遺伝子を動物細胞発現プラスミドに次の ように挿入した。

第１４Ｃ図に示したように、プラスミドｐＢＧ３８１　（第１４Ａ図）をＥＣ０ ＲＩおよびＮｈｅＩで切断した。次いで、Ｆ１８６−６をＥＣＯＲ工ａよびＮｈ ｅＩで切断して、７８６塩基対断片を除去した。この断片を切断ｐ８Ｇ３８１に 結合して、プラスミドｐＢＧ３９１を作成した。。

ｐＢＧ３９１におけるＴ４４部は、位置６４（トリプトファン）および２３１（ フェニルアラニン）におけるマトン等（１９８５）　（、上記）の配列およびＩ ）ＢＧ３８１の配列の両者と同一である。しかしながら、位置３においてマトン 等により報告されかつＩ）ＢＧ３８１に存在するアスパラギンはリジンで置換さ れている。ｐＢＧ３９１のヌクレオチド配列を第１５図に示す。

次いで、ｐ２０３−５をＮｈｅＩおよび０ｘａｎＩで切断０ＸａｎＩ切断された ｐＢＧ３９１に挿入して、プラスミドｐＢＧ３９２、すなわちｒｓＴ４．７の動 物細胞発現構成物を形成させた。ｒＳＴ４．７におけるＴ４配列は、アミノ酸位 置６４（トリプトファン）および２３１（フェニルアラニン）においてマトン等 の全長配列と同一のアミノ酸を含有する。しかしながら、位置３において、マト ン等により報告されたアスパラギンはリジンで置換されている。ｐＢＧ３９２の ヌクレオチド配列を第１６図に示す。

第１４Ｄ図は、ｐ８Ｇ３９４におけるｒＳＴ４．９およびｐＢＧ３９６における ｒｓＴ４．１２の欠失をコードする配列を持った他の動物細胞発現構成物の作成 を示している。これらの作成は、慣用の組換技術を用いて行なった。これらの作 成に用りたリンカ−を第１８図に示す。ｐＢＧ３９４およびｐＢＧ３９６のヌク レオチド配列を第１９図および第２０図に示す。

第１７図に示したプラスミドｐＢＧ３９３はｒＳＴ４．８、すなわちｒＳＴ４． ７の完全型を有する。ｐＢＧ３９３は成熟Ｔ４配列の１８２個のアミノ酸を有し 、アミノ酸１８２に続くＣ−末端には非−丁４．６アミノ酸を含まない。

ｐＢＧ３９３のヌクレオチド配列を第２１図に示す。

本発明による他の動物細胞発現プラスミドは、第１７図に示したように作成する こともできる。これらは、ｐＢＧ３９５におけるｒｓＴ４．１０およびｐＢＧ３ ９７におけるｒＳＴ４．１１を包含する（特定リンカ−に関する第１８図参照） 。

ＢＧ３９５のヌクレオチド配列を第２２図に示す。

組換可溶性Ｔ４の精製 ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞で発現された組換可溶性Ｔ４構成物１）ＢＧ３８０を、１ ０％の胎児牛血清と１ｍＨのグルタミンと抗生物質ペニシリンおよびストレプト マイシン（それぞれ１００７５／ｍ＆）とが補充されたα−改変イーグル培地（ ギブコ社）にて、融合するまで増殖させた。これら細胞を２個の２乏細胞ファク トリ−システム（ヌーク社）にて３７℃で増殖させた。次いで、胎児牛血清を含 まない融合細胞を胎児牛血清を含まないα−改変イーグル培地で洗浄し、かつ細 胞をα−改変イーグル培地にて３７℃で４日間培養した。次いで、状態調節培地 を回収し、これをミリボア・ミリディスク０．２２　μ親水性フィルターカート リッジ（ミリボアＮαＭＣＧＬ　３０５−０１＞で濾過し、かつ分泌された蛋白 を急速Ｓ−イオン交換カラム（Ｓ−セファロース急速流動型、ファルマシ７Ｎｏ 、１７−０５１１−０１）にて２０ｍ）ｌのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５，・５）で濃 縮させた。

次いで、結合蛋白を２０ｍＨのトリス−ＨＣｊ２　（ｐＨ７，７）と０、３Ｍの ＮａＣ１とで溶出させた。次いで、溶出プールを２倍容量の２０ｍＭトリス−Ｈ Ｃｌ（１）Ｈ７，７＞で希釈し、次いでこれをアフィゲル−１０に結合した固定 化１９Ｔｈｙ抗−Ｔ４モノクローナル抗体［マサチューセッツ州、ポストン在、 ダナ・ファーバー・キャンサー・インスティチュート、エリス・ラインヘルツ博 士により寄贈］からなるカラムに充填した。

このカラムを徹底的に洗浄し、かつ結合物質を０．５ｒｄづつのフラクションと して５０ｍＨのグリシン−ＨＣｊ！　（ｐ）−１２，５＞と１５０ｍＨのＮａＣ Ｊ２と０．１ｍＨのＥＧＴＡと５ｉ／ｍｆｆの牛膵臓トリプシン阻止剤アプロチ ニン（シグマＮ（ｌＡ１１５３）とで溶出させた。ペプチドＪＢ−２に対して生 じたウサギ抗血清により展開されたウェスタンプロットを用いて精製を追跡した 。結合に続く銀染色ゲルを用いて、クロマトグラフィーの際のｒＳＴ４．２の結 合および溶出を追跡した。第２３図は精製ｒＳＴ４．２のクーマシー染色ゲルを 示している。

ｐＢＧ３８０でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞ライうＢＧ３８０Ｇからの精 製ｒ！ＳＴ４．２のゲル寸法決定カラムクロマトグラフィー分析は、ｒｓＴ４が 生理学的ＩＩおよび塩濃度の下でモノマーであることを示唆している。

組　可溶性Ｔ４蛋白の配り決 次いで組換可溶性Ｔ４、特にｒｓＴ４．２　（すなわちｐＢＧ３８０でトランス フェクトされたＣ　Ｉ−Ｉ　Ｏ細胞ラインＢＧ８０Ｇの状態調節培地から精製さ れた分子）のＮ−末端アミノ酸配列を上記のように決定し、その際アプライド・ ビオシステムス４７０Ａ型気相配列決定装置での自動化エドマン減成を行なった ［Ｒ，Ｂ、ペピンスキー等、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第２ ６１巻、第４２３９〜４２４６頁（１９８６）　］　。

このアミノ末端配列は、Ｕ９３７細胞（上記）から分離された可溶化天然Ｔ４に つき予め決定されている配列と一致した。天然可溶化Ｔ４（ｓＴ４）および精＠ ｒｓＴ４蛋白の７ミノ末端配列はマトン等（１９８９）　（上記）により予測さ れたアミン末端配列と比較してΔ２蛋白であって、成熟アミノ末端はこの配列の 位置３に存在する。可溶化天然Ｔ４　（Ｓｒ１）と、ｐＢＧ３８０を含有するＣ ＨＯトランスフェクト体ＢＧ３８０Ｇにより分泌された組換可溶化Ｔ４（ｒｓＴ ４．２＞と、マトン等（１９８５）　（、上記＞４ＣＪ＝１定された蛋白配列と は次の通りである： 上記配列において、アミノ酸は単一文字コードにより次のように示される： Ｘ：決定しないか或いは不明である。

アミノ酸位置１３と８６とにおけるシスティンの間の単一ジスルフィド架橋を特 徴とした蛋白をコードするこの構成物は、便利にはイー・コリで発現される。

第２４図に示したように、ｐ２１１−１１を作成するため、先ず最初にｐ１９５ −８　（第８Ｄ図および第９Ａ図参照）をＣＩａＩで切断して、ｒＳ■４．２の 　ＣＤＮＡ配列を有するＣ１ａＩ−ＣＩａＩカセットを除去した。次いで、ｐＡ Ｔｌ　５３７”３ＳＨ１６ΔＡｍ１ｄ、すなわちγ−インタフかつγ−インクフ エロンをコードするＣＤＮＡを除去した。

次いで、このＣ１ａＩ−Ｃ１ａ１カセツトをＣ１ａＩ切断されたイー・コリプラ スミド中にトリプトファンオペロンプロモータの前で挿入し、かつ結合させてｐ １９６−１０を生成させた。

第２５図に示したように、次いで１）ＢＧ３８０をオリゴヌクレオチド特異性突 然変異にかけて、ｐＢＧ３８０におけるアミノ酸−２３〜１１３をコードする７ ４　ＣＤＮＡ配列に続く３個の直列翻訳停止コドンを挿入することにより、ｐＢ Ｇ３９４を作成した。

次いで第２６図に示すように、ｐ１９６−１０、ｐＢＧ３９４およびｐ１０３４ のそれぞれの断片からｐ２１１−１１を作成した。ベクター配列を有する第１断 片は、ｐｉ９６−１０をＨｉｎｄＩｌｌおよびＣＩａＩで制限してｒＳＴ４．２ のアミノ１６１〜３７４からＴ４コード化配列を除去すると共にｒｓＴ４３ｍ伝 子の３′末端の後にベクター配列を入れることにより作成した。第２断片（すな わちｒＳＴ４．９のＴ４アミノ酸６１−１１３に対するコドンの直後に直列で停 止コドンのトリプレットを有する）−１ｉｎｄｌ−ＢｇＩ　ＩＩ上セグメントを ｐＢＧ３９４のＨｉｎｄＩＩＩ／旦旦工■切断により分離した。第３断片（すな わちバタテリオファジーＴ４転写停止信号［Ｈ，Ｎ、キルシロよびＢ、プレット 、「バクテリオファジーＴ４ｉ伝子３２翻訳自己調節に関与するヌクレオチド配 列」、プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエンス・ＵＳＡ、第７ ９巻、第４９３７〜４９４１頁（１９８２）　］を有するＢａｍＨＩ−ｃ　Ｉ　 ａＩ断片）をｐ１０３４のＢａｍＨＩ−Ｃｌ　ａＩ断片により分離した。次いで 、これら３種の断片を結合させてｐ２１１−１１、すなわちアミノ酸位置３にア スパラギンを有する１１３アミノ酸可溶性型のＴ４蛋白をコードするＴ４構成物 を生ぜしめた（すなわちｒｓＴ４．１１３．１）。

次いで、ｐ２１１−１１をオリゴヌクレオチド部位特異性突然変異（第２７図） にかけて、位置３にあけるアミノ酸をアスパラギンからリジンに変化させ、その 際オリゴヌクレオを用いた。　Ｃ３１・ これはプラスミドり２１４−１０．すなわちアミノ酸位置３にリジンを有するＴ ４蛋白の１１３アミノ酸可溶性型をコードする完全修正された１１３アミノ酸可 溶性Ｔ４ベクター（すなわちｒｓＴ４．１１３．２＞を生ぜしめた。第２７図に 示したように、ｐ２１４−１０をオリゴヌクレオチド部位特異性突然変異にかけ てＴ４配列のそれぞれアミノ酸位置１および２におけるグルタミンおよびグリシ ンを除去し、その際オリゴヌクレオチドＴ４ＡＩ　Ｄ−８７を用いた：これはｐ ２１５−７、すなわちアミノ酸位置３にリジンを有するＴ４蛋白の１１１アミノ 酸可溶性型の発現を指令するｔｒｐプロモータを持った１１１アミノ酸可溶性Ｔ ４構成物（すなわちｒＳＴ４．１’１１）を生ぜしめた。

次いで、ｐ２１８−８、すなわちアミノ酸位置３にリジンを有するＴ４蛋白の１ １１アミノ酸可溶性型の発現を指令する１１１アミノ酸構成物（すなわちｒｓＴ ４．１１１＞を、第２８図に示したように、ＰＬプロモータの制御下で作成した 。

より詳細には、ｐ１９７−１２（第９Ａ図）をＣＩａＩで切断してリンカおよび ターミネータ配列を有する１０１ｂｐ−８を生ぜしめた。

ｒｓＴ４．１１３．１を発現させるため、イー・コリＡ８９を慣用技術［マニア チス等（１９８２）上記］によりｐ２１１−１１で形質転換させてイー・コリＡ ８９／ｍｌ　ＩＪ　Ｓ　Ｇ　９３６のテトラサイクリン感受性誘導体である。イ ー・コリＡ８９を５Ｇ９３６からＳ、Ｒ，マロイおよびＷ。

Ｄ、ヌンの方法［「大腸菌によるテトラサイクリン耐性の喪失に対する選択」、 ジャーナル・バタテリオロジー、第１４５巻、第１１０〜１１２頁（１９８１） 　］にしたがって分離し、この方法は耐性菌株を選択的に阻止する親油性キレー ト剤フザリン酸の能力に基づいている。より詳細には、イー・コリ５Ｇ９３６を 、１Ｊ２当り５ｇのトリプトンと５ｇの酵母抽出物とｉｏｇのＮａＣｊと１０９ のＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２０と５０ｍｇのクロルテトラサイクリン−ＨＣｊ２と１ ２ｍｇのフザリン酸と０．１ｍ１（のＺｎＣｊ２と１５ｇの寒天とを含有する培 地に塗抹した。３０℃で増殖したコロニー（推定テトラサイクリン感受性菌株） を、５μａ／ｒｄのテトラサイクリンを含有するし一寒天プレートにてテトラサ イクリン感受性につき再試験した。

Ａ８９と称する１種のテトラサイクリン感受性菌株は４２℃でＬＢ寒天上にて増 殖しえないことが示され、したがってｈｔｐＲ突然変異の存在を証明した。

テトラサイクリン耐性により形質転換体を選択した。単一コロニーを２０μでの 最小培地＋０．２％カザミノ酸＋トリプトファン（１００馬／ｍｌ）＋テトラサ イクリン（１ａＩｇ／ｄ）中に釣上げ、これを１００ｄの振とうフラスコに入れ て振どう通気培養器で３０℃にて培養することにより、細胞を１晩増殖させた。

翌朝、４０ｄの最小培地＋０．２％カザミノ酸＋１〜リプトファン（１００μ９ ／ｄ）＋テトラサイクリン（ｉｏｔＩ！４〜ｍｌ）に５００ｄフラスコ内の０Ｄ ６ｏｏ＝０．０５の１晩培養物を接種した。細胞を中間対数期まで増殖させ、次 いでベレット化し、最小培地で１回洗浄し、次いで最小培地＋０．２％カザミノ 酸十テトラサイクリン（１０，ｆｌ／ｄ＞とにトリプトファンの不存在下で再懸 濁させることにより誘発を行なった。０．１．２．３および４時間の培養後およ び１晩増殖させた後に０．６−〇Ｄ　の細胞を除去した。

これらを遠心分離し、かつ細胞ベレットをレムリのゲル充填緩衝液中で煮沸する ことにより溶菌させた。遠心分離して細胞残骸を除去した後、各試料の半分を５ ＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、次いでウサギ抗−ペプチド抗体プローブでのウェスタン プロット分析にかけ、或いはクーマシーブルー蛋白染色にかけた（第２９Ａ図お よび第２９Ｂ図）。

を２つの実質的に定量的な工程で精製し、これらの工程は週元条件および変性条 件の下で行なった陰イオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過クロマトグラ フィーを含む。

°より詳細には、４１の振どうフラスコ醗酵からの１４（Ｊの湿潤細胞を、２０ μ９／ｍｉのＤＮアーゼと２０Ｊ１９／ｄのＲＮアーゼと１１１ＩＨのフェニル メチルスルホニルフルオライド″（ｒＰＭＳＦＪ）とを含有する１００ｍ１の２ ０ｍＨトリス（ｐＨ７，５）緩衝液に懸濁させた。この懸濁液を１０００ｐｓ　 ｉのフレンチプレスに２回通過させ、次いでＡＳ６００型ロータにてｉｓ、ｏｏ ｏｇで１５分間にわたり４℃で遠心分離した。得られたベレットを、７Ｍの尿素 と１０ｍ）１の２−メルカプトタノールとを含有する２０ｍｅの２０ｍ）ｌトリ ス（ｐＨ７，５＞緩衝液に溶解させた。次いで、この懸濁液を８５　、０００　 Ｇの超遠心分離に４℃にて４０分間かけた。上澄液を、７Ｍの尿素と１０ｍＨの ２−メルカプトエタノールとを含有する８０７の２０ｍＨトリス（ｐｌ−１７， ５＞緩衝液の添加によって希釈し、かつ４０７の試料を予め同じ緩衝液で平衡化 された３Ｘ４ＣｍのＱ−セファロース急速流動カラム（ミズーリ州、セントルイ ス在、シグマ社）に施した。このカラムを、同じトリス／尿素／２−メルカプト エタノール緩衝液における０〜０．３Ｍの増加するＮａＣｊ！の濃度勾配を有す る全指４００ｒｎｌｌで展開させた。カラムフラクションを２８０ｎｍにあける 吸収につき監視し、かつ蛋白含有量につき５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（１５％アクリル アミド）で監視した。さらに、これらフラクションをウェスタンプロットによっ て分析した。第３０図のパネル（ａ）は、イオン交換クロマトグラフィーによる ｒｓＴ４．１１３．１の精製を示すクロマトグラフである。この図面において、 ｒｓＴ４．１１３．１を含有するピークが確認される。

ｒｓＴ４．１１３．１は、Ｎａｃｇｓ度勾配にて最初に溶出しかつ低分子量の汚 染物から充分分離されることが判明した。

ｒｓＴ４，１１３．１を高分子量汚染物から分離するため、ｒｓＴ４．１１３． １を含有する保存物につきゲル濾過クロマトグラフィーを行なって、最終的に蛋 白をほぼ均質性（〉９５％純度）まで精製した。より詳細には、２０ｍｇの蛋白 を５０７中に含有する保存物を作成し、次いで撹拌セル限外濾過装置（マサチュ ーセッツ州、ダンパー在、アミコン社）にてＰＭ−３０膜（アミコン社）を用い ることにより１ｏｄまで濃縮した。次いで、５．（７の濃縮物を平衡化された１ 、５ｘ９５ｃｍの一 ３００カラム（シグマ社）に施し、かつ同じトリス／尿素／２−メルカプトエタ ノール緩衝液で展開した。カラムフラクションを２８０ｎｍにて吸収につぎ監視 し、かつ蛋白含有量にっき５ＤＳ−ＰＡＧＥで監視した。これらフラクションを ざらにウェスタンプロットにより分析した。ｒｓＴ４．１１３．１（約４１１１ ０）を１５７中に含有する保存物がかくして作成された。

第３０図のパネル（ｂ）は、ｒｓＴ４．１１３．１保存物のゲル濾過分離による ｒｓＴ４，１１３．１の精製を示すクロマトグラフである。この図面において、 ｒＳＴ４．１１３．１を含有するピークが確認される。

第３０図のパネル（Ｃ）は、遠心分離およびクロマトグラフィーの工程仝休にお けるｒｓＴ４誘導体の精製を示す５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析に関するものである。第 ３０図のパネル（Ｃ）において、レーンは次のものを示す：レーンＡ：分子量標 準 レーンＢ：細胞抽出物 レーンＣ：非変性条件下で細胞抽出物を可溶化した後の細胞ベレット レーンＣ：非変性条件下にて細胞抽出物を可溶化した後の上澄液 レーンＥ：超遠心分離工程の後の上澄液レーンＦ：Ｑ−セファロース保存物 レーンＧ：５−３３ゲル濾過保存物。

精製されたｒｓＴ４．１１３．１のレフオールジン精製されたｒｓＴ４．１１３ ．１を非変性条件および酸化ングした。より詳細には０．５　０Ｄ　（２８０） ／ｄの濃度における蛋白のレフォールジングは、５００倍容積の３Ｍ尿素、２０ ｍ）ｌ　トリス（ｐＨ７，５）　：　５００倍容積の１Ｍ尿素、０．１Ｍ酢酸ア ンモニウム（ｐＨ６，８）　：および最後に同容積の燐酸塩緩衝塩水溶液に対す る段階的透析によって達成された。レフオールジン精製程の全体にわたり蛋白の 試料をスペクトル分析および１５０Ａ液体クロマトグラフシステム（カリホルニ ア州、ホスター・シティ−在、アプライド・ビオイステムス・インコーポレーシ ョン社）で行なわれる高性能液体クロマトグラフィー（ｒＨＰＬＣＪ　）により 相対的濃度につき監視した。オクタシリルカラム（アクアボアＲＰ−３００，０ ，４６ｘ３、　Ｏｃｍ　）を８０％のｏ、ｉ％トリフルオロ酢酸（ｒＴＦＡ」’ ）／水（溶媒Ａ）と２０％の０．０８５％ＴＦＡ／７０％アセトニトリル（溶媒 Ｂ）とで平衡化させ、かつ２０％から８０％までの増加アセトニトリル濃度の直 線濃度勾配（溶媒Ｂ）にて０．５ｄ／ｍｉｎの流速で４５分間にわたり展開させ た。

第３１図のパネル（ａ）に示したように、７Ｍ尿素、１０ｍＨ２−メルカプトエ タノールおよび２０ｍＨトリス（ｐＨ７，５＞における蛋白を濃度勾配４９％の アセトニトリルにてＨＰＬＣカラムから溶出させた。次の工程にて、１Ｍ尿素／ １ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ６，８＞　（第３１図のパネル（ｂ））から燐酸 塩緩衝塩水（第３１図のパネル（Ｃ））まで、増加割合のｒｓＴ４．１１３．１ が４７％アセトニトリルのＨＰＬＣｉＱ度勾配にて最初に溶出することが判明し た。酸化生成物として最初に溶出するピークの確認は、非−ケイオトロビック溶 液におけるｒｓＴ４．１１３．１の還元によって証明され、かつこのように処理 された試料を同じ条件下でＨＰＬＣに施こした。

ＨＰＬＣに還元蛋白を施こす前の酸化ｒｓＴ４．−１１３．１の溶出は、単一の ジスルフィド架橋の形成が蛋白の相対的疎水性を低下させることを示唆する［Ｊ 、Ｌ、ブラウイング等、アナリチカル・バイオケミストリー、第１５５巻、第１ ２３〜１２８頁（１９８６）］。ｒｓＴ４．１１３．１のスペクトル分析をレフ ォールジングの工程全体にわたり行なって、この工程における可溶性蛋白の相対 的収率を監視した。レフォールジング法はｒｓＴ４．１１３．１の約２０％の回 収率を与えた。ＨＰＬＣ分析は、この調製物における１５％未満の還元蛋白の汚 染物を示した（第３０図のパネル（Ｃ）、レーンＧ）。

再生されｒＳＴ４．１１３のスクリーニング次いで、９００Ａデータシステムを 備えたアプライド・ビオシステムズ４７０Ａ型気相配列決定装置にて自動化エド マン減成によりｒｓＴ４．１１３．１のアミノ酸分析を行なった。

減成反応の過程で発生したフェニルチオヒダントインアミノ酸をオンラインで分 析し、その際ＰＴＨ−０１８型２．ｌＸ２２０ｍｍカラムを備えたアプライド・ ビオシステムス１２０Ａ型ＰＴＨ分析器を用いた。配列分析のための蛋白（１０ μｇ）を５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（１５％アクリルアミド）に施こし、Ｐ、マツダイ ラ、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第２６２巻、第１００３５〜 １００３８頁（１９８７）に記載されたように固定化膜（マサチューセッツ州、 ベッドフォード在、ミリポア・コーポレーション社）で電気ブロン］・シた。

蛋白試料のアミノ酸分析は、減圧下にて６Ｎ　ＨＣｌ中で１００℃にて２４時間 にわたり蛋白を゛加水分解することにより行なった。加水分解物を次いでニンヒ ドリンによるポストカラム検出部を備えたベックマン６３００型分析器に施した 。５ＤＳＪＢ−１を用いる標準技術によって行なった。配列分析は：Ｍｅｔ−に １ｎ−に１ｙ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｖａｌ　＋＋＋のアミノ末端配列を示 した。

精製されたｒｓＴ４．１１３．１蛋白は、イー・コリで発現させるための蛋白構 成物に存在するアミノ末端メチオニンとプラスミド作成から生じた配列に一致す る完全ポリペプチド鎖との理論量を含有することが判明した。減成反応の第１サ イクルにおけるフェニルチオヒダントイニルーメチオニンの回収は、自動化エド マン減成で得られる初期の正常収率に一致して６０％であった。この観察は、ｒ ｓＴ４．１１３．１の相当な割合が開始メチオンを欠如する可能性を排除し、す なわちＮＨ２−メチオニンはｒｓＴ４．１１３．１のイー・コリにおける発現に より除去されず、或いは配列分析は減成反応の第１サイクルにてグルタミンの存 在により阻害されなかった。配列分析を４０サイクルにわたって行ない、かつリ ジンのカルバミル化の証明は観察されなかった。アミノ酸分析はアミノ酸の実測 値と理論値との近接した相関関係を示し、したがって発現もしくは精製またはそ の両者の過程で蛋白分解減成が明らかに存在しないことを示す。

可溶性Ｔ４を産生するＣＨＯ細胞ラインの免疫沈澱Ｔ４突然変異作成物ｐＢＧ３ ７７、Ｉ）ＢＧ３８０、ｐＢＧ３８１、全長組換Ｔ４構成物１）ＢＧ３７９の１ 種、本発明またはベクターのみでトランスフェクトした５３５−ＣｙＳ代謝標識 ＣＨＯ細胞からの状態調節培地を試験して、抗−Ｔ４モノクローナル抗体１９Ｔ ｈＶにより識別される分子を産生したかどうか決定した。この試験を行なうため 、ｐＢＧ３８０．　ｐＢＧ３８１、ｐＢＧ３７７、ｐＢＧ３７９またはＩ）ＢＧ ３１２のいずれかでトランスフェクトされた約１０７個のＣＨＯ細胞を３７℃で ５時間にわたり４ｄのＲＰＭＩ　ＣＶＳ−培地（ギブコ社）中で１８０μＣｉ／ ｍｉの３３５−標識システィン［デュポン、ニューイングランド・ヌクレア社］ と共に培養した。細胞を標識した後、１ｄの濾過された状態調節培地をフェニル メチル−スルホニルフルオライドで０．５ｍＭとなし、かつ０ＫＴ４および蛋白 Ａセファロースで免疫沈澱させた［Ｐ、　Ｈ，サイレおよびＥ、、Ｌ、ラインベ ルン、ヨーロピアン・ジャーナル・イミュノロジー、第１５巻、第２９１〜２９ ５頁（１９８５）　］。次いで、３３５−標識細胞からの培地を０ＫＴ４　（Ａ ＴＣＣＮ（ｌｃＲＬ８００２）と共に培養した。次いで、蛋白Ａセファ０−スで 免疫沈澱させ、かつ免疫沈澱物を還元条件下で１０％ポリアクリルアミドゲルに て５ＤＳ−ＰＡＧＥにかけた［Ｕ、に、レムリ、ネイチャー、第２２７巻、第６ ８０〜６８５頁（１９８０）　］。］Ｘ−オマットＸ線フィルムイーストマン・ コダック社〉を用いて放射能写真測定を行なった。

第３２図のレーン３〜５に示したように、ｐＢＧ３８０（ｒｓＴ４．３）および ｐＢＧ３８１　（ｒｓＴ４．３＞の両者は、０ＫＴ４抗−Ｔ４抗体により識別さ れる分泌免疫３３５−標識Ｔ４蛋白の合成を指令した。免疫沈澱した切断分子は ４９Ｋｄ蛋白として移動し、この結果はその予測分子量と一致した。これに対し 、可溶性Ｒ４抗原は、ｐＢＧ３７７（ｒｓＴ４．１）またはｐＢＧ３７９　（ｒ ｆ　１Ｔ４）で安定にトランスフェクトされた細胞ラインの状態調節培地には検 出できなかった。ｐＢＧ３７７でトランスフェクトされた細胞ラインの細胞抽出 物における免疫沈澱分析は、ｒｓＴ４．１ｉ伝子がミスフォールドされて、その 分泌を阻止する原因となることを示唆している［Ｍ、Ｊ、ゲシング等、セル、第 ４６巻、第９３９〜９５０頁（１９８Ｂ）　］。

第３２図において、これらのレーンは次のものを示す：レーン１：ベクターｐＢ Ｇ３１２およびｐＡｄＤ２６で安定に同時トランスフェクトされたＣＨＯ細胞の 状態調節培地からの免疫沈澱。レーン２ニブランク。レーン３および４：ｐ’Ｂ Ｇ３８０　（ＥＧＴＡ、２＞およびｐＡｄＤ２６で安定に同時トランスフェクト されたＣＨＯ細胞の状態調節培地からの免疫沈澱。レーン５および６：ｐＢＧ３ ８１（ＥＧＴＡ、３＞およびｐＡｄＤ２６で安定に同時トランスフェクトされた ＣＨＯ細胞の状態調節培地からの免疫沈澱。

レーン７：組換全長Ｔ４　（ｐＢＧ３７９）およびｐＡｄＤ２６で安定に同時ト ランスフェクトされたＣＨＯ細胞の状態調節培地からの免疫沈澱。第３２図にお いて、矢印は、標準分子量マーカーの移動に対比したｐＢＧ３８０もしくはｐＢ Ｇ３８１からの可溶性Ｔ４の予測位置を示している。

組、可溶性Ｔ４を産生するＣＯ３７細胞ラインの　疫沈澱実質的にＧ、チュー等 ｒＤＮＡによる哺乳動物細胞の効率的トランスフェクションのためのエレクトロ ポレーション」ヌクレイツク・アシッド・リサーチ、第１５巻、第１３１１〜１ ３２６頁（１９８７）　］に記載されたように、エレクトロポレーションにより ＣＯ５７細胞にて組換可溶性Ｔ４誘導体ｐＢＧ３９２、ｐＢＧ３９３およびｐＢ Ｇ３９４を発現させた。より詳細には、２０μ９の開田形プラスミドＤＮＡと３ ８０ｊ１９のキャリヤ（音波処理された鮭精子ＤＮＡ）とを３Ｘ１０７個のＣＯ ３７細胞に導入した。これら細胞を、３００ボルトに設定された遺伝子パルサー （ビオラド社）を用いてエレクトロボレー１〜させた。次いでＣＯ３７細胞を、 １０％胎児牛血清が補充されたジュルベツコ改変イーグル培地にて２４時間培養 した。次いで、状態調節培地を収穫し、これをミリボア・ミリディスク０．２２ 　μ親水性フィルタカートリッジ（ミリボアＮｏ、ＭｃＧＬ３０５−０１　）に よって濾過し、かつ分泌された蛋白を急速Ｓ−イオン交換カラム（Ｓ−セファロ ース急速流動型、ファルマシアＮ（１１７−０５１１−０１）にて２０ｍＨのＹ ＥＳ緩衝液（ｐＨ５，５＞で濃縮した。

次いで、結合した蛋白を２０ｍＨのトリス−ＨＣＪ！　（ｐ）（７，７＞および ０．３ＭのＮａＣ１で溶出させた。次いで、溶出保存物を２倍容積）２０ｍ）ｌ 　トリス−ＨＣ！　（ｐＨ７，７＞で希釈し、次いでこれを１９Ｔｈｙ抗−Ｔ４ モノクローナル抗体および蛋白Ａセファロース或いは０ＫＴ４Ａおよび蛋白Ａセ ファロースのいずれかからなるカラムに充填した。このカラムを決定的に洗浄し 、かつ結合物質を５０ｍ）ｉのグリシン−ＨＣｆｆｌ　（ｐＨ２，５＞　、１５ ０ｍＨのＮａＣ１，０，１ｍＨのＥＧＴＡおよび５ｉＩ９／−の牛膵臓トリプシ ン阻止剤アプロチニン（シグマ社ＮαＡ１１５３）により０．５ｄつづのフラク ションとして溶出させた。

免疫沈澱物を５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（１０％ゲル）にかけ、次いでペプチドＪ８− １に対して生ぜしめたウサギ抗血清に対し免疫プロットした。銀染色ゲルを用い て、クロマトグラフィーの際のＥＧＴＡの結合および溶出を追跡した。

第３３図は、一時的に発現されたｐＢＧ３９２（ＥＧＴＡ、７＞［レーン１０お よび１１］　：　ｐＢＧ３９３（ＥＧＴＡ、８＞［レーン４．７および８］、並 びにｐＢＧ３９４　（ＥＧＴＡ、９＞［レーン５］の免疫プロット分析を示して いる。標準は５００９の精製ｒｓ７４．３　（レーン’ｌ　）　；　１５０ｎｇ の精製ｒｓＴ４．３　（レーン２）および２５０ｎｇの精ＩＪｒｓＴ４．３　（ レーン３）である。矢印は、ＥＧＴＡ、７の相対分子量、すなわち２１，０００ ダルトンを有する蛋白の移動の予測位置を示している。レーン４に充填された試 料は喪失し、レーン６および９はブランクである。

第３５図のレーン１０および１１に示したように、ｐＢＧ３９２　（ＥＧＴＡ、 ７）は、抗−Ｔ４抗体０ＫＴ４Ａおよび１９ＴＭにより識別される分泌免疫蛋白 の合成を指令した。ざらにレーン４．７および８は、ｐＢＧ３９３（ＥＧＴＡ、 ８）が０ＫＴ４Ａおよび１９Ｔｈｙにより識別される分泌免疫蛋白の合成を指令 したことを示している。この分析は、ＥＧＴＡ、７が０ＫＴ４Ａエピトープを含 有することを示している。ざらに、これはＨＩＶエンベロブ結合のための結合領 域がＴ４のアミノ１８２東端残基に存在することを示唆する。

これに対し、ｐＢＧ３９４　（ＥＧＴＡ、９）でトランスフェクトされた細胞ラ インの培地には可溶性Ｔ４を検出できなかった（レーン５参照）。しかしながら 、ｐＢＧ３９７でトランスフェクトされた細胞ラインにおける細胞抽出物の免疫 沈澱分析は、ＥＧＴＡ、９が０ＫＴ４Ａにより識別されたことを示している。Ｅ ＧＴＡ、９、すなわち１１３個のアミノ酸構成物はＨＩＶウィルスに結合すると 思われる。ざらに、これは第２の発現可溶性Ｔ４を示し、２個のみのシスティン および３個のジスルフィド架橋の１個を有する。したがって、ＥＧＴＡ、９はイ ー・コリまたは酵母系にて容易に産生される。

同様に、ｐＢＧ３９６　（ＥＧＴＡ、１２＞でトランスフェクトされた細胞ライ ンの培地には可溶性Ｔ４を検出できなかったが、これら細胞ラインの細胞抽出物 の分析はＥＧＴＡ、１２が０ＫＴ４Ａにより識別されたことを示した。

したがって、ＥＧＴＡ、１２もＨＩＶウィルスに結合することができる。

ＥＧＴＡ、１１３の放射線免疫　析およびエピトープ分析０ＫＴ４Ａ、Ｌｅｕ− ３Ａおよび０ＫＴ４に結合する構造決定子をＥＧＴＡの１１３断片が含有するか どうかを決定するため、競合阻止放射線免疫分析［Ｃ，Ｊ、ニュービー等、「固 相放射線免疫分析」、ハンドブック・オブ・エキスペリメンタル・ゴミ１ノロジ ー、Ｄ、Ｍ、ウェアー（編）、第１轡、第３５．１〜３４．８頁（１９８Ｂ）　 ］を用いてＥＧＴＡ、１１３の放射線免疫分析およびエピトープ分析を行なった 。インビトロにてＨＩＶの感染を０ＫＴ４ＡおよびＬｅｕ−３Ａが阻止し［ダル グレイシュ等、上記］かつＣＩｐ１２０／１６０に対するＴ４の結合を阻止する ［マクビーガル等、上記］ので、この分析はＥＧＴＡ、１１３がＨＩＶと相互作 用する構造要素を有するかどうかを最初に推定するのに役立つ。

まず最初に、Ｕ字型底部の９６ウエルのミクロ測定板（ファルコン社）をＰＢＳ 　（ｐＨ７，０＞における５０ＪＩＲ／ウエルのヤギー抗−ネズミＩｏＧ（ユタ 州、ローガン在、ハイクロン・タイピング・キット社）により５０ｉ／ＩＲＲの 濃度まで被覆し、かつこれらプレートを４℃にて１晩培養した。次いで、これら プレートをＩＸＰＢＳで濯ぎ、かつこれらを吸取り乾燥させた。次いでプレート を、５％牛血清アルブミンを含有する１ｘＰＢＳ溶液を１００ｔｌｊ／ウエルの 量で添加することにより空温にて１時間ブロックした。これらプレートをＰＢＳ で）Ｋぎ、吸取り乾燥させ、次（で０ＫＴ４　（ブロック緩衝液にあける１０馬 ／ｍ！”）：０ＫＴ４Ａ　（ブロック緩衝液にあける５００ｎ（１／ｒ／ｄ；り またはしｅｕ−３Ａ（ベクトンージキンラン）（ブロック緩衝液における５００ ０ｇ／ｄ）のいずれかを含有する３種の抗体溶液の１種の５０ｄをスポットした 。これらプレートを空温にて２時間静置させた。次いで、プレートをＰＢＳ／　 ０．０５％ツイーン−８０溶液で３回および１ｘＰＢＳで２回洗浄し、かつこれ を吸取り乾燥させた。

別のプレートにて、２０ｔｔｓ／ｍｌｌおよび各ウェルにつき２５成の最終容積 にてシリーズで２倍希釈された（競合比較を含まない）ものからの未標識ｒｓＴ ４．１１３．１の競合試料を滴定した。この分析のための陽性比較は、未標識ｒ ＳＴ４．３（３７５個アミノ酸）に対する競合である。次いで、ｉｏ、ｏｏ。

ｃｐｍ　／２５．Ｓを含有する■１２５−ｒｓＴ４．３の２５ｔ１１［Ａ、Ｅ。

ポルトンおよびＷ、Ｍ、ハンター、「放射線免疫分析法および関連法」、第２Ｃ 章にしたがって作成］を添加した。次いで、各ウェルの５０μｅの全量を、それ ぞれ３種の抗体溶液を含有する分析プレートにスポットし、これらを空温にて２ 時間培養した。次いで、プレートをＰＢＳ／　０．５％ツイーン−８０溶液で３ 回およびＩＸＰＢＳで２回洗浄し、これらを吸取り乾燥させ、次いで放射能につ きベックマンγカウンタでウェルを計数した。

第３４図に示したように、ｒｓＴ４．１１３．１は、０ＫＴ４Ａ同相に対する吸 収につき投与量に依存して１１２５−ｒｓＴ４．３に対し競合する。ざらに、ｒ ｓＴ４．１１３．１は、Ｌｅｕ−３Ａ固相に対する吸収につき投与量に依存して １１２５−ｒｓＴ４．３と競合する。未標識ｒＳＴ４．３と比較して、ｒｓＴ４ ．１１３．１はこれらの抗体に対し係数３以内でモル親和性を示す。試験した０ 、４〜２５１１９／ｒｄｌの濃度範囲にて、ｒｓＴ４．１１３は０ＫＴ４に対す る結合につき放射標識ｒＳＴ４．３と競合しなかった。同じ分析において、ｒｓ Ｔ４．１１１も０ＫＴ４Ａおよび１ｅｕ−３Ａに対する結合についてはに１１２ ５　ｒｓ７４．３と競合するが０ＫＴ４には競合しないことが観察された（第３ ５〜３７図）。

これらの結果に基づき、０ＫＴ４Ａｃｌよび１ｅｕ−３ＡのエピトープはＴ４の アミノ末端１１アミノ酸に含まれると思われる。さらに、０ＫＴ４結合のエピト ープはＴ４ポリペプチドのカルボキシ末端に位置すると思われる。

したがって、ｇｐｌ　２０−結合ドメインはＴ４蛋白のアミノ末端１１３もしく は１１１アミノ酸の内部に位置すると思われる。この知見に基づき、前記構造ド メイン内に配列を有する各種の構成オリゴペプチドを合成した。。これらのオリ オリゴペプチド　アミノ酸配位 ＪＢ−１４４−６３ ｒｓＴ４Ｎｏ、６　１８−２９ ｒＳＴ４Ｎ（１７５−５６ ｒＳＴ４ＮＱ８　８４−９７ ｒｓＴ４Ｎｃ９　３０−６３ これらのペプチドは、慣用のホスホアミドＤＮＡ合成技術［テトラヘドロン・レ ターズ、第２２巻、第１８５９〜１９６２頁（１９８１）　］を用いて合成した 。さらに、これらペプチドをアプライド・ビオシステムス３８０Ａ型ＤＮＡ合成 装置で合成しかつゲル電気泳動により精製した。

ｒｓＴ４．１１３のＥＬＩＳＡ分析 さらに、ｐ２１１−１１形質転換イー・コリにより産生されたｒｓＴ４．１１３ ．１につきＥＬＩＳＡ分析を行なった。

この分析全体にわたり、遮断溶液につき希釈を行ないかつ各た。より詳細には、 イミュロン２（バージニア州、キャンヂリ在、ダイナチク社）のウェルを０．０ ５Ｍ重炭酸塩緩衝液における０、　００５　０Ｄ　（２８０ｎｍ　＞／ｄのＯＫ Ｔ４（ＩｇＧ２ｂ）により５０１１ｆｆ／ウエルの容積まで被覆し、かつこれら プレートを４℃にて１晩培養した。次いで、プレートをＰＢＳ中の５％牛血清ア ルブミン（２５０ｍ／ウェル）で遮断しかつ空温にて３０分間培養した。

次いで、各ウェルに５Ｏｔｔｅの５０ｎ（］／ｄのｒＳＴ４．３を添加し、４℃ で１晩培養した。次いで、５０１１１／ウエルのｒｓＴ４．１１３．１と１０ｎ ｇ／／ｄの０ＫＴ４Ａとの混合物を添加し、かつ空温にて２．５時間培養した。

ハイクロンキット（バンクロン社）を用いて、次の工程を行なった。先ず最初に 、各ウェルに１滴のウサギ抗ネズミＩｇＧ２ａを添加し、かつプレートを空温に て１時間培養した。次いで、１００ｔ１ｊのペルオキシダーゼ標識された抗−ウ サギＩｇＧを添加し、各ウェルを遮断緩衝液により１　：　４０００に希釈し、 空温にて１時間培養した。

基質試薬を次のように作成した。基質試薬を１：１０まで蒸溜水により希釈し、 かつ基質１０７！当り２個のＯ−フェニル−エチレンジアミン（ｒＯＰＤＪ　’ ）発色性錠剤を添加した。回動しながら混合することにより、混合物を充分溶解 させた。

或いは、ＴＭＢペルオキシダーゼ基質系（カーケガード・アンド・ぺり−・カタ ログＮα５Ｏ−７６−００）を使用することもできる。次いで、各ウェルに１０ ０μ！の発色性溶液を添加し、室温で１０〜１２分間培養し、次いで１ｏｏｔ１ １の１Ｎ　Ｈ２ＳＯ４で発色を停止させた。次いで、ＥＬＩＳＡプレート読取装 置を用いて４９０ｎｍにてＯＤを測定した。

分析の結果を第３８図に示す。

次いで、本発明のＴ４作作動物より産生された可溶性Ｔ４蛋白を各種のは能分析 にかけた。

可溶性Ｔ４の抗ウィルス活性の分析 本発明による可溶性化４の抗ウィルス活性を、抗ウィルス剤および中和性抗体の 試験に使用される各種のインビトロ方式の改変により評価した［Ｄ、Ｄ、ツー等 、［組換ヒトαインタフエロン（Ａ＞はインごトロにてＨＴＬＶ−Ｉ［１複製を 抑制する」、ランセラ１〜、第６０２〜６０４頁（１９８５）　］　：　Ｋ、ハ ートショーン等、「ホス：・、ノホルメートおよび組換αインタフエロンーＡに よるインビトロでのＨＴＬＶ−ｍｌ複製の相乗的抑制」、アンチマイクロブ・Ａ ＣＩ・ケモテラピー、第３０巻、第１８９〜１９１頁（１９８６）　］。

これら分析のぞれぞれにつき、可溶性Ｔ４の段階的濃度を作成し、これらをＨＩ ＶのＨ９誘導ｌｌｌ５分離物［メリーランド州、ベセスダ在、ナショナル・キャ ンサー・インスティチュート、Ｍ、ポビックおよびＲ，ガロ博士の寄贈］と共に 予備培養した。この分離物を慢性感染培養物としてＨ９細胞内に維持した。細胞 フリーのＨＩＶ保存物をＨＴＬＶ−ＩＩＩ感染Ｈ９培養物の上澄液から得た（培 養条件：生存細胞７５％を有するＩ　Ｘ　１０６個の細胞／ｍ１）　、　１０ｐ Ｍｍｆｆ　〜ｉｏ４．／ｉの範囲の１０倍希釈の一連の組換可溶性Ｔ４を作成し 、これらをＨＩＶの５０％組織組織感染投与物（ＴＣＩ　Ｄｓｏ）　５０個と共 に３７℃にて１時間にわたり、２０％熱失活された胎児牛血清（Ｆｅ２）の補充 されたＲ　ＰＭ　ｌ−１６４０にて培養した。次いで、１５０μｊのＨ９細胞を 最終濃度０．５Ｘ１０６個／ｄまで添加し、組換可溶性Ｔ４／ＨＩＶ混合物の１ 部を含有するウェルにはＨＩＶ感染させなかった。

各ウィルス接種物を２５０Ｔ　ＣＩ　Ｄｓｏ／ｍｆｆの濃度に調整した。

１００１ＩＲのウィルス接種物を２００成の組換可溶性Ｔ４もしくは１００成の 三速の２倍希釈物で作成されたイミュノグロブリンと共に３７℃にて１時間予備 培養した後、胎児牛血清（２０％）とＨＥＰＥＳ　（１０ｍ）ｌ）とペニシリン （２５０Ｕ／ｍｆり、ストレプトマイシン（、２５０１１９／ｒｄ＞とＬ−グル タミン（２ｍＭ）とが補充された５ｄのＲＰＭＩにて１．５〜２ｘ１０６個のＨ ９細胞まで接種した。５日目、６日目、７日目、１０日目および１４日目に、各 培養物を特徴的な細胞病理作用（ｒｃＰＥＪ　）につき検査した。中和は、比較 と対比したシンシチウム形成の阻止として定義される。

用いた陽性比較はＨＩＶ血清陽性の中和用血清とし、これはり、Ｄ、ツー等、「 ヒト免疫不全性ウィルス中和抗体はエンベロブグリコ蛋白における数種の保持ド メインを識別する」Ｊ、パイロロジー、第６１巻、第２０２４〜２ｏ２８頁（１ ９８７）　］に記載されている。用いた陰性比較は、ＨＩＶ血清陰性の血清のみ 或いは緩衝液単独とした。

細胞病理作用の分析（ＣＰＥ） この分析には、慣用の細胞病理作用分析法［クラララマン等（１９８４）　（上 記）およびウオングースタールおよびガロ（１９８５）　（上記）］にしたがっ て、ト１９細胞をＨＩＶの細胞病理作用を証明すべく顕微鏡検査した。

ＣＰＥを１十〜４＋に至る４点尺度で評価し、４＋はＣＰＥの最高程度を示す。

１４日目に、１０／！ｉ／ｄにて本発明による組換可溶性Ｔ４（ｐＢＧ３８０で トランスフェクトされたＣＨＯ細胞ライうＢＧ３８０から誘導されたｒｓＴ４． ２＞を含有するウェルは、ＣＰＥの存在を示さなかったのに対し、陰性比較は１ ＋〜３＋のＣＰＥを示した。

ｐ２４の放射線　疫　析 次いでり、Ｄ、ツー等、ジャーナル・パイロロジー、第６１巻、第２０２４〜２ ０２８頁（１９８７＞およびＪ、ソドロスキー等、ネイチャー、第３２２巻、第 ４７０〜４７４頁（１９８６）にしたがい、ＨＩＶウィルス複製分析におけるウ ィルス複製の阻止剤として可溶性Ｔ４を試験した。この分析を上記文献に実質的 に記載されたように行なったが、ただし培養物は２００成を含有するミクロ測定 ウェルで繁殖させた。この分析において、ＨＩＶ複製を阻止する本発明による可 溶性Ｔ４ポリペプチドの能力を、ＨＩＶ　ｐ２４抗原産生により測定した。下記 するように、１−ＩＩＶ　ｐ２４抗原につき上澄液を毎週２回サンプリングした 。

分析キット［ＨＴＬＶ−Ｉ［１１）２４放射線免疫分析システム、カタログＮｏ 、ＮＨＫ−０４０Ａ、バイオテクノロジー・システムス、ニュー・リサーチ・プ ロダクツ・デュポン社］を入手し、このキットは親和性精製された■１２５−標 識ＨＩＶｐ２４抗原とウサギ抗−ｐ２４抗体と抗原−抗体複合物を沈澱させるべ く使用される第２のヤギ抗−ウサギ抗体とを含有する。キット内に含まれた指示 にしたがって分析を行なった。

したがって、分析すべき試料または一通の未標識ｐ２４抗原の１つを所定量の１ １２５−標識ｐ２４ｔ３よび所定制限量のウサギ抗−ｐ２４抗体と混合した。こ れらこれら試料を空温で１晩培養し、次いでヤギ抗−ウサギ免疫グロブリン調整 物を４０℃にて５分間かけて添加した。これら試料を微小遠心分離器で遠心分離 し、かつ上澄液を吸引した。ペレット化した■１２５−標識１）２４を各試料に つきγ線計数により計量し、かつ標準チューブに既知量の抗原が添加された１１ ２５−ｐ２４に関する標準曲線を作成した。次いで未知試料に存在する抗原によ り変位した１１２５−標識ｐ２４を標準試料に含有された既知量のｆ）２４抗原 から作成されている標準曲線を用いる内挿によって計算した。これらの結果を下 表に示す。

ＨＩＶ？！製阻止のｐ２４分析 ｒＳＴ４．２　患者の　平　均　％結合／旦数（Ｉ１ｇ／ｄ）　血　清　ＣＰＭ 　未結合７　−　陰性　３４４　８．５ −　陽性　２．２３７　１１２．４ ０．５”　５５１　１９．９ ５．０”　−１，７６６８６，６ １０陰性　２３０　２．２ １４　陰性　２２１　１．８ −　陽性　２，２８４　１１５．０ これらの結果は、５ｊｉ９／ｄの濃度における本発明の可溶性Ｔ４がこの標準１ ４日分析で測定されるようにウィルス複製を完全に阻止することを示している。

これらの結果をざらに第３９図にグラフとして示す。第３９図において、数値は 分析キットの指示にしたがいｐ２４の標準曲線から計算した。

傘　：この濃度は先ず最初に２８０ｎｍにおける吸光度の１単位（ｒＡ　Ｊ）が １ｍｇのｒＳＴ４．２に等しいという予備２．８０ 的概算に基づいて１　、０ｆｌ　／　ｄであると思われる。２８０ｎｍにおける 吸光度は、蛋白濃度の一般的に用いられる第１近似である。しかしながら、蛋白 のアミノ酸分析に基づき、これは初期に概算されるよりも高い吸光係数を有し、 ｒＳＴ４．２の１Ａ　単位はｏ、　５ｍｇの蛋白に相当することが判明した。

＊＊：この濃度は最初に２８０ｎｍにおける吸光度の１単位（「Ａ　」）がｉｍ ｇのｒｓＴ４．２に等しいという予備的近似に基づいて１ｈ９／ｍｅであると思 われる。２８０ｎｍにおける吸光度は蛋白濃度の一般的に用いられる第１近似で ある。しかしながら、蛋白のアミノ酸分析に基づき、これは初期に概算されるよ りも高い吸光係数を有し、ｒＳＴ４．２のＩＡ　単位はｏ、ｓｍｇの蛋白に相当 することが判明した。

次いで上記と同様にｐ２４複製分析を行なったが、ただし可溶性Ｔ４を３日目、 ７日目および１００日目再供給に際し感染培養物に添加して、感染期間にわたり 一定（７ｐｒＳＴ４の濃度を維持した。この分析の結果を下表に示す。

一定濃度のｒｓＴ４によるＨＩＶ複製の阻止ｒｓＴ４．２　ｐ２４ ０．００８　７７０ ０．０３１　９７０ ０．１２５　８５ 未感染　Ｏ これらの結果は、本発明による可溶性Ｔ４蛋白が感染期間にわたり一定濃度に維 持されれば、０．１２５１１９／ｄ程度に少ない蛋白がＨＩＶ−１の２５０Ｔ　 ＣＩ　Ｄｓｏ／ｒｒＩＩｌの複製を実質的に阻止したことを示している。

有利には、本発明による可溶性Ｔ４蛋白は、ウィルス複製を阻止するのに要する 量よりもずっと高い濃度にて、３種のリンパ球増殖分析（すなわち混合リンパ球 反応、フィトヘマグルチニン、および破傷風毒素刺戟反応）により測定してイシ ンシチウム阻止分析 ＨＩＶ　ｅｎｖ−Ｔ４結合に対する可溶性Ｔ４の作用をざらに評価するため、同 時培養分析におけるＨＩＶのシンシチウム形成特性に対する可溶性Ｔ４蛋白の２ 種の調製物の作用を測定した。Ｂ、Ｄ、ウォーカー等、プロシーディング・ナシ ョナル・アカデミ−・サイエンス・ＵＳＡ、第８４巻、第８１２０〜８１２４頁 （１９８４）に記載されたようなＣ８１６６細胞融合分析を行なった。

ＨＴＬＶ−ＩＩＩＢで慢性感染した１ｘ１０９個の８９Ｉ［ｉｌｍを、２０％胎 児牛血清が補充された１５０威のＲＰＭＩ−１６４０培地にてｒＳＴ４．２の２ 種の調製物における種々の濃度の１種と共に５％Ｃ０２中で３７℃にて１時間培 養した。次いで、５０．［の培地中における３Ｘ１０４個の０８１６６細胞（Ｔ ４＋形質転換されたヒト饋尾血液リンパ球ライン［ソドロスキー等、上記］を各 ウェルに０．２ｒｄの最終容積まで添加した。可溶性Ｔ４の最終ウェル濃度は調 製物Ｎα１につき０．５焉／ｄ”および５．Ｏ１ｌ！ｇ／ｒｄ、＊とし、かつ調 製物Ｎα２については１．２５　ｆｌ／ｄ＊および１２．５．ｃｉ／ｒｄ＊とし た。次いで、ウェル１個当りのシンシチウムの全数を、５％ＣＯ２にて３７℃で ０８１６６細胞を添加してから２時間後および４時間後に計数した。並行の同時 培養物は緩衝液単独（陰性比較）または２５ＩＪ９／ｄの０ＫＴ４Ａ　（＠性比 較）を比較として用いた。１０４個の感染Ｈ９細胞当り少なくとも１００個のシ ンシチウムが比較培養物中に存在する時点にて、比較に対比してシンシチウムの ５０％低下を陽性結果とみなす。この分析の結果を下表および第４０図に示す（ ２時間のデータ）。

＊：これらの濃度は、２８０ｎｍにおける吸光度１単位（ｒＡ　Ｊ）が１ｍｇの ｒＳＴ４．２に等しいという予備概算に基づいて、それぞれ１周／ｄ、　１０乃 ／ｄ１２．５μ９／威および２５焉／Ｉｎｌ１であると思われた。しかしながら 、蛋白のア光係数を有し、１Ａ　単位のｒＳＴ４．２が０．５ｍｇの蛋白に等し いことが判明した。

Ｃ８１６６融合分析の阻止 ［ｒｓ７４．２］　阻止％＊ 調製物　（ｔＩ９／威）　２時間　４時間緩衝液　ＯＯ０ ｒｓＴ４．２　０．５＊＊　３０　４２ｒｓＴ４．２　５．０＊＊　５４　４７ ｒｓＴ４．２　１．２５＊＊　１６　２１ｒｓＴ４．２　１２．５＊＊　７７　 ５５０ＫＴ４Ａ　Ｏ１００１００ （２５焉／ｄ） ＊：全での分析は３反復で行ない、かつウェル１個当りに計数されたシンシチウ ムの個数を平均して阻止％を計算した。阻止％は、陰性比較（ｒＳＴ４もしくは ０ＫＴ４Ａなし）におけるシンシチウムの平均数と、分析の際にｒｓＴ４もしく は０ＫＴ４Ａのいずれかが存在する場合に計数されたシンシチウムの平均数との 差を陰性比較に対する平均シンシチウム数で割算して１００を掛けた数値を示す 。

＊＊：これらの濃度は、２８０ｎｍにおける吸光度の１単位（ｒＡ　Ｊ）が１ｍ ｇのｒＳＴ４．２に等シイとイウ予備的概算に基づいて、それぞれ１ｕ９／ｍｌ 、　１０μ９／ｒＩｄｌ、２．５４７ｍ１および２５μ９／ｒｎｌｌであると思 われた。しかしながら、蛋白のアミノ酸分析に基づき、これは初期に概算された よりも高い吸光係数を有し、１Ａ　単位のｒＳＴ４．２は０．５ｍｇの蛋白に相 当することが判明した。

この表および第４０図に示したように、ｓ、ｏ、ｃ６／７および１２６５μ９／ ｄにおける本発明による可溶性Ｔ４は緩衝液単独と比較して２時間でシンシチウ ム形成を阻止した。Ｃ８１６６細胞を添加してから４時間後、１２．５ＪＩ９／ ｄの可溶性Ｔ４は陰性比較と対比して５０％以上のシンシチウム形成を阻止し続 けた。

ざらに、同様な同時培養分析にてＨＩＶのシンシチウム形成特性に対、する可溶 性Ｔ４蛋白ｒＳＴ４．７の２種の調製物Ｃ８１６６融合分析における阻止 分析臼：１日日 平均シンシチウム ｒｓＴ４．７　１５０μｆｆ　２時間口調製物　（μ９／ｄｌ　）　部　分　の 阻止％Ｈ９細胞　０ＯＮ／Ａ （比較） Ｃ８１６６細胞　０ＯＮ／Ａ （比較） Ｃ８１６６細胞に添加　０１１８　０ されたＨＩＶ感染Ｈ９細胞 （比較） ＯＫＴ４Ａ　ＯＯ１００ ＊：この濃度は、最初に２８０成ｍにおける吸光度の１単位（ｒＡ　Ｊ）が１ｍ ＯのｒＳＴ４．２に等しいという予備的近似に基づいて１０庫／　Ｉｎｌ１であ ると思われる。しかしながら、蛋白のアミノ酸分析に基づき、これは初期に概算 されるよりも高い吸光係数を有し、ｒＳＴ４．２の１Ａ　単位は０、５ｍｇの蛋 白に相当することが判明した。

ば梶旦土ユ旦旦■ 平均シンシチウム ｒｓＴ４．７　１５０成　２時間口 調製物　（ｌＩ９／ｄ！’）　部　分　の阻止％Ｈ９細胞　０ＯＮ／Ａ （比較） Ｃ８１６６細胞　０ＯＮ／Ａ （比較） Ｃ８１６６細胞に添加　０１４１　０ されたＨＩＶ感染Ｈ９細胞 （比較） ＯＫＴ４Ａ　ＯＯ１００ （比較） ｒＳＴ４．７の作成物２　さ５．０＊　２７　Ｂｏ、９＊：この濃度は、最初に ２８０止における吸光度の１単位（ｒＡ２Ｂ□Ｊ）がｉｍｐのｒＳＴ４．２に等 しいという予備的近似に基づいて１　ｏｊＩｇ／　ｄでおると思われる。しかし ながら、蛋白のアミノ酸分析に基づき、これは初期に概算されるよりば近旦上１ ユ旦旦 平均シンシチウム ｒｓＴ４．７　１５０μ９　２時間口 調製物　（μ９／ｒＩＩＩり　部　分　の阻止％Ｈ９細胞　０ＯＮ／Ａ （比較） Ｃ８１６６細胞　０ＯＮ／Ａ （比較） Ｃ８１６６細胞に添加　０１２８　０ されたＨＩＶ感染Ｈ９細胞 （比較） ＯＫＴ４Ａ　ＯＯ１００ （比較） ｒＳＴ４．７の作成物１　＝５．０＊　３５　７２．７ｒＳＴ４．７の作成物２ 　＝５．Ｏ＊　２　９８．４＊：この濃度は、最初に２８０成ｍにおける吸光度 の１単位（ｒＡ２８ＱＪ）が１ｍｇのｒＳＴ４．２に等しいという予備的近似に 基づいて１０１Ｉ９／　ｄであると思われる。しかしながら、０、５ｍｇの蛋白 に相当することが判明した。

これらの表に示したように、可溶性Ｔ４蛋白ｒＳＴ４．７はＨＩＶ−感染Ｈ９細 胞にてシンシチウム形成を阻止した。

ざらに、同時培養分析におけるＨＩＶのシンシチウム形成特性に対するｒｓＴ４ ．１１３．１およびｒｓＴ４．１１１の作用を評価した。ウォーカー等（上記） に記載されたようにＣ８１６６細胞融合分析を行なった。

ＨＴＬＶ−Ｉ［ＩＢで慢性感染した１Ｘ１０４個（７）Ｈ９細胞ヲ、２０％胎児 牛血清が補充された１５０μｅのＲＰＭＩ−１６４０培地にて５〜５０１５／ｄ のｒｓＴ４．１１３．１もしくはｒｓＴ４．１１１と共に９６ウエルのミクロ測 定板を用い５％ＣＯ２中で３７℃にて１時間培養した。次いで、これらつ工／Ｌ ｋ：３Ｘ１０４個の０８１６６細胞を５０ｎづつ添加した。

これらプレートを５％ＣＯＺ中で３７℃にて２時間培養し、かつこの培養後にウ ェル１個当りのシンシチウムの個数を計数シンシチウムは、３個の細胞直径より も大きい膨張した細胞質を有する細胞として定義される。全ての試料につき２回 計数した。並行同時培養は、０ＫＴ４Ａ単独またはｒＳＴ４．３単独を２５μ９ ／ｄの濃度にて使用しく陽性比較）、或いはＨ９細胞単独またはＣ８１６６細胞 単独（陰性比較）。

Ｃ８１６６融合分析における阻止 Ｈ９細胞（比較）　Ｏ０ Ｃ８１６６細胞（比較）ＯＯ ｒｓＴ４．１１３．１　１．２５　３５ｒｓＴ４．１１３．１　２．５　６３ ｒｓＴ４．１１３．１　４．２５　６３ｒｓＴ４．．１１３．１　６．２５　８ ２ｒｓＴ４．１１３．１　１２．５　９６ｒｓＴ４．３　１２．５　１００ ０ＫＴ４Ａ　（２５ｉ／、ｄ＞　０　１００この表および第４１図に示したよう に、ｒｓＴ４．１１３．１はＨＩＶ−誘発シンシチウム形成の投与量依存性阻止 を示した。ｒｓＴ４．１１３．１の分子阻止比活性は、より長い組換可溶性Ｔ４ の抗ウィルス活性と比較して相当低下すると思われる。したがって、ｒｓＴ４． １１３．１がインビトロにてＨＩＶ−依存性細胞融合の中和に対し有効であるの に対し、その分子阻止比活性は係数１０だけ低下する。この低下程度がイー・コ リ誘導蛋白の不完全中和、または哺乳動物細胞で作成されたｒＳＴ４．２もしく はｒＳＴ４．３に欠如するｒｓＴ４．１１３．１のＮ−末端における３種の追加 アミノＭ　（Ｍｅ　ｔ−Ｇ　ｌ　ｎ−Ｇ　ｌ　ｙ）の存在、またはＨＩＶに対す る高親和性結合に要するｒｓＴ４．１１３．１における追加＠造の不存在に基づ くかどうかは未決定である。

ざらに、ｒｓＴ４．１１３．１につき記載したように、ｒｓＴ４．１１１につい てもＣ８１６６細胞融合分析を行なった。この分析の結果を下記に示す。

Ｃ８１６６融合分析における阻止 調製物　ｒｓＴ４　（ｌｉ９／ｍｌ＞　阻止％Ｈ９細胞（比較）００ Ｃ８１６６細胞（比較）　Ｏ０ ｒｓＴ４．１１１　１．２５　０ ｒｓＴ４．１１１　２．５　４０ ｒＳＴ４．１１１　４．２５　２０ ｒｓＴ４．１１１　６．２５　６７ ｒｓＴ４．１１１　１２．５　１００ ｒｓＴ４．１１１　２５．０　１００ ｒｓＴ４．３　１２．５　１００ ｒｓＴ４．３　２５．０　１００ ０ＫＴ４Ａ　（２５μｇ／ｍｆ！＞　０　１００この表に示したように、ｒｓＴ ４．１１１はＨＩＶ−誘発シンシチウム形成の投与量依存性阻止を示した。１２ ．５ｘ／ｄおよび２５．０ｔ１９／Ｉｎｉの濃度にて、細胞融合の完全阻止が得 られた。可溶性Ｔ４の筋肉的注射のキネチックス筋肉内注射後の血清中における 本発明による組換可溶性Ｔ４蛋白（特にｐＢＧ３８１トランスフェクトされた細 胞ラインＢＧ３８１からのｒｓＴ４．３）の出現のキネチツクスを次のように検 査した。

感染症を持たずかつ良好な健康状態にある２匹のカニクイザル（ムスカ・）７シ クラリス）を入手した。各サルを可溶性Ｔ４蛋白の投与前に６週間隔離した。投 与期間全体にわたり、各サルを新鮮な果実が補充された慣用のザルの餌で維持し た。カテーテルと静脈挿入口とを処理前の各動物の大腿動脈に手術して設け、血 液採取を容易化させた。

２８日間にわたり、各動物には腿および尻の筋肉に筋肉的注射して組換可溶性Ｔ ４蛋白を毎日２回接種した。各動物には８時間毎に注射を施こし、かつ各注射は 全量で０．５ｎ＋ｇ／　ｋＭ日／サル１匹につき０．１ｓ　ｄ／ｋｇ（０，２５ ｍｃ＋　／＋＋＋ｇ）の量のｒＳＴ４．３を含有した。比較測定のための血清試 料を第１回目の処理の１日前に集め、かつ第１回の注射の１時間、２時間、４時 間および８時間後、並びに第２回目の注射の１時間、２時間、４時間、１４時間 および１６時間後に、７日、１４日および２８日目で採取した。

筋肉的注射された可溶性Ｔ４は、注射してから１〜２時間で血清中の最高レベル に達成したことが判明し、このレベルは徐々に低下して注射の約６時間後に最大 値の半分に達した。

静脈内投与につき得られたデータ（示さず）によれば、血清中のｒＳＴ４．３の レベルは、静脈内注射のほぼ２時間後に筋肉的注射により得られるレベルよりも 低下する筈である。

したがって、筋肉内注躬後の血清中の最大ｒｓＴ４−３レベルは、静脈内注射に より得られるレベルに達しないが、これは徐々に血液流中に放出されて長時間に わたり血清中で検出することができる。筋肉的注射ルートに関連したこの遅い放 出メカニズムは、可溶性Ｔ４蛋白の高レベルを所定濃度につき長時間にわたって 利用することができ、したがってレベルが保持されるので有利である。可溶性Ｔ ４蛋白の筋肉的投与は、ウィルスが感染するのを防止するため初期段階のＨＩＶ 感染患者を処置したり或いはウィルスに露呈されたがまだ血清陽性でない患者を 処置するのに特に有用である。

ＥＬＩＳＡ分析を用いて、ｒｓＴ４．３の血清レベルを測定した。この分析にお いて、遮断溶液にて希釈物を作成し、かつ各工程間でプレートをＰＢＳ／　０． ０５％ツイーン２０で洗浄した。より詳細には、イミュロン２プレー１〜のウェ ルを０．０５Ｍ重炭酸塩緩衝液における０、０１　０Ｄ　（２８０ｎｍ　）／ｄ の０ＫＴ４　（ＩｇＧ２ｂ）により５０成／ウエルの容積まで被覆し、かつこれ らプレートを４℃にて１晩培養した。次いで、プレートをＰＢＳ中の５％牛血清 アルブミン（２００μｅ／ウエル）で阻止し、かつ室温にて３０分間培養した。

次いで、５０μεの試料もしくは標準を各ウェルに添加し、室温にて４時間培養 した。次いで、５ｈｊ／ウエルの０ＫＴ４Ａを０．ＩＩｊ９／ｍの量で添加し、 かつ４℃で１晩培養した。次いで、ハイクロンキット（ハイクロン社）を用いて 、次の工程を行なった。最初に、１滴のウサギ抗−ネズミＩｇＧ２ａを各ウェル に添加し、かつプレートを室温にて１時間培養した。

次いで、５％ＢＳＡ／ＰＢＳにて１　：　４０００まで希釈したｉｏｏｍのペル オキシダーゼ標識抗−ウサギｌＱＧを各ウェルに添加し、室温で１時間培養した 。

基質試薬を次のように作成した。基質試薬を蒸溜水で１＝１０に希釈し、かつ基 質１０ｒｄ当り２個のＯ−フェニル−エチレン−ジアミン（ｒＯＰＤＪ　）発色 錠剤を添加した。回動して混合することにより°、混合物を充分溶解させた。或 いは、ＴＭＢペルオキシダーセ基質系（キルケガード・アンド・ベリー・カタロ グＮｏ、５０−７６−００　＞も使用することができる。次いで、１００μｅの 発色溶液を各ウェルに添加し、室温で１０〜１５分間培養し、次いで１００μＱ の１Ｎ　）（２３０４により発色を停止させた。次いで、ＥＬＩＳＡプレート読 取器を用いてサルＮα７〜９１ ｒＳＴ４レベル ０　２２．７−　９６．５　１５８．０　１９．８１　２７Ｂ、８　１９９．６ 　３６０．７　２３８．３２　２Ｂ１．８　３６６．８　３０６．４　４４１． １４　２１４．９　２４６．６　３６３．９　３９３．２５　２９０．４ ８　７２．３　１０５．０　１９９．４９＊−２４６，２ １０２５９，６ サルＮα７〜９２ ｒＳＴ４レベル ０　６．７＄　５６．０　１０６．３　６０．９１　８７．２　２２５．８　１ ７８．０　４３７．７２　２５４．２　３７７．９　２５３．２　７７０．６４ 　１７０．０　１６７．３　３０８．２　８２１．５５　８９８．３ ８　１１Ｂ、９　１０１，２　１７６．５９＊＊　４０５．１ １０　５２３．５ ＊二バックグランド ＊＊二８時間目の試料を採取した後に行なった第２回の注射。

価型の組換−溶性Ｔ４ リセプタは、特異性リガンドに対するその親和性により特［Ｒｆ］　［Ｌｆ］と して定義することができ、ここで［ＲＬ］はりガントＬに結合したリセプタ（Ｒ ＞の濃度であり、・［Ｒｆ］および［Ｌｆ］はそれぞれ遊離リセプタおよびリガ ンドの濃度である［Ｐ、Ａ、アンダーウッド、アトパンシス・イン・ウィルス・ リサーチ、Ｋ、マラモロシュ等編、第３４巻、第２８３〜３０９頁（１９８８） 　］。

多価リガンド（ｍの電荷を有する）に結合する多価リセプタ（ｎの電荷を有する ）につき、官能親和性はｎ　［Ｒｂ］／ｎ　［Ｒｆ］ｍ　［Ｌｆ］として規定す ることができ、ここで［Ｒｂ］は結合リセブタ部位の濃度であり、かつｎ［Ｒｆ ］およびｍ［Ｌｆ］はそれぞれ遊離リセブタおよびリガンド結合部位の濃度であ る。電荷（結合部位の個数）が増加する効果は、リガンドーリセプタ複合体の安 定性を高めることで市る。多価リガンドに対する多価リセプタの親和性は、次の ３種の因子に依存する：すなわち各結合部位の固有結合定数、電荷（結合部位の 個数）、およびリセプタと結合部位とリガント結合部位との間の位置的関係。成 る種の条件下で、多価結合の相互作用は、より高い機能親和性をもたらす。多価 リガンドと多価リセプタとの減少した解離速度は、機能親和性の増大をもたらす ［Ｃ，Ｌ、ホーニックおよびＦ、カルシュ、イミュノケミストリー、第９＠、第 ３２５〜３４０頁（１９７２）　：■、オテルネスおよびＦ、カルシュ、「抗体 反応の原理」、アンチボディー・アズ・ア・ツール、Ｊ、Ｊ、マルシャロネーお よびＧ、Ｗ、ワール編、第９７〜１３７頁（１９８２）　］。

機能的親和性を増大させる多価リセプタの最も簡単な場合は、それぞれ独立して 等しい親和性をもって抗原を結合しうる２個の同一リガント結合部位を有する二 価の可溶性リセプタ（たとえば抗体分子）によって示される。抗原が多価を示し 、たとえば固体支持体に化学結合して抗原部位の間の間隔が抗体の２個の抗原結 合アームにより架橋されれば、固体支持体に結合した抗原に対する抗体の機能親 和性は、−価抗原に対する抗体結合部位の固有の親和性よりも大である［Ｄ。

クロザースおよびＨ，メツツガ−、イミュノケミストリー、第９巻、第３４１〜 ３５７頁（１９７２）　］。ウィルス粒子は多価抗原を示すので、多価抗原に対 する抗体の大きい機能親和性は、抗体依存性ウィルス中和に関し重要な因子とな る。

組換可溶性Ｔ４とＨＩＶ主エンベロブグリコ蛋白ｃ＋ｐ１２０との結合が、−価 リガントに結合する一価すセプタの例である。この相互作用の親和性が測定され ており、Ｔ４と（Ｈ）１２０との間の結合は解離定数Ｋｄ＝４Ｘ１０−９Ｍを有 する［Ｌ、ラスキー等、セル、第５０巻、第９７５〜９８８頁（１９８７）　］ 。

抗体類似性を用いて、多価ｒｓＴ４はＣ１ｐ１２０を示す・ＨＩＶ−感染細胞に つき一価ｒＳＴ４よりも大きい親和性を示すと思われ、ウィルス粒子上のＣ１１ ）１２０と感染細胞表面との間の位置的関係は多価ｒｓ”［−４がｍ個ｒｓＴ４ よりも高い機能親和性を示す程度を決定する。多価ｒＳＴ４の一例を、アミノ酸 ３〜１７８の２個の直列反復物に続いてｒＳＴ４．３のＣ−末端１９９アミノ酸 よりなる組換二価ｒｓＴ４の産生に関し下記に説明する。本発明によれば、「多 価」リセプタは、所定のリガンドにつき２個もしくはそれ以上の結合部位を有す る。ざらに、所定の多価リセプタにおける各リガンド結合部位の固有の親和性は 同一である必要がない。

第４２図に示したように、二価ｒＳＴ４を作成するため、ｐＢＧ３９１をＮｈｅ Ｉで切断してｒｓ丁４における位置１７８のバリンの俊で切断し、かつインゲン 豆ヌクレアーゼによりＮｈｅＩ　５’部分を除去した。次いで、ＢＣＩＩＩＩで 切断して１）ＢＧ３９１におけるｒＳＴ４コード配列のＣ−末端の半分を除去し た。最後に、ｒＳＴ４アミノ酸３（リジン）〜３７７（イソロイシン）に関する コード配列を有する［）ｒａミニ−８１ＩＦ断片を切断ｐＢＧ３９１に結合させ て、ｐ８ｉｖ、１（すなわちｒｓＴ４のＮ−末端１７６アミノ酸に続＜ｒｓＴ４ ．３のＣ−末端１７６アミノ酸を有する直列複合物を持った融合蛋白をコードす るプラスミド）を形成させた。したがって、このプラスミドにより産生される蛋 白は、２個の隣接するＮ−末端ｇｐ１２０結合ドメインまたは０ＫＴ４Ａ−結合 ドメイン（ｒｓＴ４．１１１のアミノ酸残基３〜１１１により規定される）に続 く１個の０ＫＴ４結合性Ｃ−末端ドメインを含有する（第４３図）。

ｐＢｉＶ、１をエレクトロポレーションによりＣＯ３７細胞中にトランスフェク トさせて、二価のｒｓＴ４蛋白の発現を試験した。３日後に、トランスフェクト された細胞の状態調節培地を免疫沈澱に続く沈澱蛋白のウェスタンプロットによ りｒＳＴ４二価蛋白の存在につき試験した。０ＫＴ４Ａおよび０ＫＴ４の両者を 免疫沈澱に用いて、０ＫＴ４エピトープと０ＫＴ４Ａエピトープの少なくとも１ つが正確に折畳まれたかどうかを決定した。両波体は、予測された見掛は分子量 （６０，０ＯＯｄ　）の沈澱蛋白を細胞の状態調節培地から沈澱させた。

二価ｒｓＴ４は０ＫＴ４カラムから免疫親和性精製により精製することができ、 次いで精製蛋白を用いてｒＳＴ４．３に対する定量的競合分析を行なうことがで きる。二価分子は０ＫＴ４Ａ結合につきｒＳＴ４．３に対して同等のの競合を示 すと思われるが、０ＫＴ４Ａ結合についてはｍ個ｒｓＴ４に対しずっと大きい競 合性を示す。シンシチウム形成を阻止する二価組換可溶性Ｔ４の能力も、Ｃ８１ ６６融合分析で示すことができる。ざらに、二価組換可溶性Ｔ４もシンシチウム 形成をｍ個ｒｓＴ４より顕著に低い濃度で阻止すると思われる。これはＣ１１２ ０に対する二価組換可溶性Ｔ４の高い機能親和性に基づいている。

本発明の他の実施例によれば、多価ｒｓＴ４の他の産生方法も用いることができ る。たとえば、ｒＳＴ４を任意の臨床上許容しうるキャリヤ分子、すなわちフィ コール、ポリエチレングリコールおよびデキストランよりなる群から選択される 重合体に慣用の結合技術によって化学結合させることにより、多価ｒｓＴ４を産 生ずることができる。或いは、ｒｓＴ４をビオチンに化学結合させ、次いでビオ チン−ｒｓＴ４結合体をアビジンに結合させて四価のアビジン／ビオチン／ｒｓ Ｔ４分子を生成させることもできる。ざらに、ｒｓｌ”４をジニトロフェノール （ＤＮＰ）またはトリニトロフェノール（ＴＮＰ）に共有結合させることもでき 、かつ得られた結合体を抗−ＤＮＰもしくは抗−ＴＮＰ−ＩＣｌｍによ或いは、 免疫グロブリン分子重鎮および軽鎖のいずれか一方または両者の可変ドメインが 置換されたｒｓＴ４配列を有する組換キメラ抗体分子を産生させることもできる 。組換可溶性Ｔ４はｇｐ１２０結合活性を有するので、２種の可溶性Ｔ４ドメイ ンを有しかつ未改変の一定領域ドメインを有するキメラ抗体の作成は、Ｃｌ１２ ０を発現するＨＩＶ感染細胞の標的死滅の媒体として作用しうるであろう。

Ｃｌｃ）およびｒＳＴ４／Ｓ上４１重鎖キメラ（ｒｓＴ４．１つそれぞれ抗生物 質Ｇ４１８もしくはミコフェノール酸に対し動物細胞宿主で選択するための細菌 ｎｅｏ耐性もしくは―菌ｇｐｔマーカーのいずれかを含有する動物細胞選択ベク ターにサブクローン化されている。

ド配列のＮ−末端１１０アミノ酸残基とを含みかつスプライスドナーもしくはそ の１部を含むｒｓＴ４ｆｔ伝子断片を、断片１６よびにの一定ドメインエクソン の上流に位置せしめる。

適する制限酵素を用いて、所望のｒｓＴ４コード配列の下流にてイントロン内で 切断し、ドナースプライス部位を形成することができる。次いで、適する制限酵 素を用いて、におよびγ−１のコード領域の上流にてイントロン内で切断するこ とができる。次いで、ｒＳＴ４配列をにもしくはγ−１の一定領域配列に結合さ せ、ｒｓＴ４イントロン配列がγ−１６よびにイントロンに対し連続するように する。このようにして、にもしくはＴ−１の一定領域イントロンによりアクセプ タスプライす部位が形成される。或いは、ｒｓＴ４キメラ遺伝子は、適当なｒｓ Ｔ４　ｃＤＮＡ遺伝子断片をγ−１もしくはにコード領域に直接融合させてイン トロンの使用なしに作成することもできる。

しくは非リンパ球の宿主細胞中に同時トランスフェクトすることができる。２種 のキメラ遺伝子の転写および翻訳の後、遺伝子生産物をキメラ抗体分子中に組込 むことができる。

ともできる。ｒｓＴ４／ＩＣ＋Ｇ１キメラの活性は、これらをＨＩＶ感染細胞と 共にヒト補体の存在下で培養し、次いでこれら細胞の補体媒介溶菌を定量化して 測定することができる。

或いは、活性は上記のようなＨＩＶ複製およびＨＩＶシンシチウム分析にて測定 することもできる。

二価ｒＳＴ４が一価ｒＳＴ４よりも大きい能力を有するかどうかを決定すべく、 種々の濃度にて０ＫＴ４を一定濃度のｒｓＴ４と０ＫＴ４　：　ｒｓＴ４のモル 比が０．２〜４の範囲テ変化するよう混合した。この混合物を４℃にて１晩予備 培養した後、その１部を上記のＨＩＶシンシチウム分析にかけた。

０ＫＴ４は、この分析にて単独使用した場合、効果を観察しえなかった。ざらに 、選択した組換可溶性Ｔ４の濃度は、この分析で阻止を示さなかった。したがっ て、０ＫＴ４／ｒｓＴ４混合物はｒｓＴ４単独よりも能力が大であることを示唆 している。０．２よりも高い０ＫＴ４　：　ｒｓＴ４の比にて、シンシチウム形 成の部分的乃至完全な阻止が観察された。２個のｒＳＴ４分子が１個の０ＫＴ４ 分子に結合する条件下で、最大の阻止効果が得られると思われる。

多価および一価の形態の組換可溶性Ｔ４は、したがって本発明の組成物および方 法に有用である。

本発明の方法により作成された微生物および組換ＤＮＡ分子は１９８７年９月２ 日付けでメリーランド州、リンチクム在、イン・ビトロ・インターナショナル・ インコーポレーション・カルチャー・コレクションに寄託した培養物で例示され 、次のように同定されている： ＢＧ３７８：イー・コリＭＣ１０６１／ｐＢＧ３７８１９９−７　：イー・コリ ＭＣｌ０６１／ｐ１９９−７１７０−２　：イー・コリＪＡ２２１／ｐ１７０− ２ＥＣ１００：イー・コリＪＭ８３／ｐＥＣ１００ＢＧ３７７：イー・コリＭＣ １０６１／ｐＢＧ３７７８Ｇ３８０：イー・コリＭＣ１０６１／ｐＢＧ３８０が 付与されている。

トロ・インターナショナル・インコーポレーション・力゛ルチャー・コレクショ ンに寄託した培養物で例示され、かつ次のように同定されている： ２０３−５　：イー・コリ５Ｇ９３６／ｐ２０３−５これらの培養物は、それぞ れ受託番号ｉｖ■１ｏｉｓｉ−１０１５６が付与されている。

口・インターナショナル・インコーポレーション・カルチャー・コレクションに 寄託した培養物で例示され、かつ次のように同定されている： これらの培養物は、それぞれ受託番＠Ｉｖ１１０１８３−１０１８５が付与され ている。

以上、本発明を多数の実施例につき説明したが、この基本構成を改変して本発明 の方法および組成物を利用する他の具体例を構成しうろことが了解されよう。し たがって、本発明の範囲は実施例により示された特定具体例のみに限定されない ことが了解されよう。

ＦＩＧ、／ ＦＩＧ２ ＦＩＧ、　３ ＤＴＶ！ＬＴＣＴＡＳＱＩＣＫＳ！ＱＦＨＷＸ−Ｋ　Ｌ　Ｎ　Ｄ　Ｉ　Ａ　Ｄ　 ！　ＲＲＳ　Ｌ　ＲＤ　Ｑ　Ｇ　Ｎ　Ｆ　Ｆ　！、−ＸＸＫＨＬＫＸＥＤＭＤＴ ＹＸＣ１１ＶＥＤＱ−ｊＣＥ！ＶＱ！、ＬＶＦＧ！、？ＡＮＳＤＴ）ＩＬＬ−ｏ ａｏｓ　Ｌｒｚｔｚｚｓｐｐａｓｓ　Ｐｓｖｏ−Ｆ／θ３（ｃｏｎｌ’ｄ） ＥＬＱＤＳＧＴＶＴＣ？ＶＬＱＮＱＫＫＶＥ−ＦＷ！Ｄ！ＶＶＬＡＦＱＩＣＡＳ ＋！！ＶＴＫＫ−！　Ｇ　Ｅ　Ｑ　Ｖ　Ｅ　Ｆ　ｇ　Ｆ　Ｐ　Ｌ　Ａ　Ｆ　Ｔ　 Ｖ　Ｅ　ｘＬ　Ｔ　Ｇ−！ＧＥＬｉｆ賛ｏｘｚｙｔｘｓｓｓ＊ｓｗｘ〒５−ＤＬ ＫＮＫＥＶＳＶＫＲＶ？ＱＤＰＫＬＯＭ−ＯＮＬ？！、ＡＬＫＡＩＣ？ＧＫ！、 ＨＯ！ＶＮＬ−ＶＶＭＲＡＴＱＬＯＫ）ｒ！、ＴＣ！ＶＷＧＰ？−５Ｐ　Ｋ　Ｌ 　ＨＬ　１　ｆ、　Ｋ　Ｌ　冨Ｍ　Ｋ　！　Ａ　Ｋ　Ｖ　Ｓ　Ｋ　Ｒ−ＥＸＡＶ ＶＶ！、ＮＰｔＡＧＭ％ＦＱ（：ＬＬＩＤ−ｓａ　Ｑ　ｖ　！、！１　ｚｓｗｘ 　Ｋ　ｖｒ、ｐｒｗｓ’ｒｐｖ−ＯＰＭＡＬ！ＶＬＧＧＶＡＧＬＬＬＦ！０Ｌ− Ｇ！ＦＦＣＶＲＣＲＭＲＲＩＱＡ！Ｒ）ｌ！ＪＱ−ＡＰｊＬＦＬＰＡＤＯＭＮＶ ＡＤＰＲＰ！、ＡＳ−Ｃｇｌ’ＰＬＱＦＡ！ＶＳＰＧＬＧＰＯＦ？Ｇ−Ｑ　↑　 ）！！！、〒　ＬＩＩＫＱＰＬ　賀　〒　Ｑ　Ｐ　１１　Ｖ　Ｍ　Ｃ−Ｆ／θ３ （ｃｏｎ／ｄ） ＨＧＫＧＰＳＱＲｒＴＥＱＧ＊ＲＰＰ（：ＬＫ−Ｆｌｏ、　３（ｃｏｎｉ’ｄ） ＦＬ！ＩＩＦＳＱＤＰ！、！ＳＹＰＳＳＰＬＰＳ−ｈｐＢＧ３１２−　ＥｃｏＲ Ｉ　（４，７５ｋｂｐ）Ｆ／６５ ”ｎｕｍｂｅｒｓ　１ｎｐａｒｅｎｆｈｅｓｅｓ　ｒｅｆｅｒん円Ｌ　Ｔ４　ｃ ＤＮＡ　Ｃｏｏｒｔｌｔｎａｆｅｓ１般窄鱈１ｓｏ娩ｆ、３ｋｂＰｆｒａ３術ト ’Ｍｅ／−、ｏｅｒｆｅｄ’ｃａｓｓｅｆｌｅ　ｆ；ｐｒ　Ｅ、ｃｏｈ’　ｅｘ ｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｒｓＴ４ＩＧ９Ｃ Ｆ／Ｇ１０ ５’ｒＧＣＣＣＡＣＡ？（、ＧτＣＣ＾ＣＣＣＣＧＧ）ＣＣＡＣ（ＣＡＡＴＣＴ ＣＡ３゜Ｓ　’　ＴＣＣｃｃＡＣＡＧ　（ｉｃ　Ｃ’：Ｇ　ＣＴＣＣＡＡ　ＴＣ ＣＡＡＣＡＴＣＡＡＣＴＣＡ　Ａ　３　’３’　（：Ｔｃ　ＴＣＣ八ＣＣ入Ｃロ 　Ａ（ＣＴＴＡ　００丁　ｂｙ−Ａに’ｒ　ＴＣＡ　ＣＴ’：　ＣＴＡ　Ｃ；　 Ｓ’５’　ＣＡＧ　ＣＣＡ　ＣＣＣＡＡＣＣＡＡλＣＡ　ＡＡＧ　ＴＩＪ　３１ 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Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（ａ） Ｐ１９９−７、ｐＢＧ３７７、ＰＢＧ３８０、０、 ｐＢＧ３８１、Ｐ２０３−５、ｐＢＧ３９１、ｐＢＧ３９２、ＰＢＧ３９３、Ｐ ＢＧ３９４、ｐＢＧ３９５、ＰＢＧ３９６、ｐＢＧ３９７、Ｐ２１１−１１、Ｐ ２１４−１０およびＰ２１５−７のＤＮＡ挿入体（ｂ）前記ＤＮＡ挿入体の１種 もしくはそれ以上にハイブリツド化しかつ発現に際し可溶性Ｔ４類似ポリペプチ ドをコードするＤＮＡ配列；および （ｃ）発現に際し前記ＤＮＡ挿入体および配列のいずれかによりコードされる可 溶性Ｔ４類似ポリペプチドを発現に際しコードするＤＮＡ配列 よりなる群から選択されることを特徴とするＤＮＡ配列。 ２．前記ＤＮＡ配列（ｂ）は、Ｔ４＋リンパ球とＴ４＋リンパ球を標的とする感 染物質との間の付着を阻止すると共にＴ４＋リンパ球とＴ４＋リンパ球媒介死滅 に関する抗原・形成細胞および標的との間の相互作用を阻止する可溶性Ｔ４−類 似ポリペプチドを発現に際しコードする請求の範囲第１項記載のＤＮＡ配列。 ３．請求の範囲第１項または第２項記載のＤＮＡ配列よりなる群から選択される ＤＮＡ配列を有し、このＤＮＡ配列が組換ＤＮＡ分子における発現制御配列に作 用結合していることを特徴とする組換ＤＮＡ分子。 ４．発現制御配列がＳＶ４０もしくはアデノウイルスの初期もしくは後期プロモ ータ、Ｉａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣ系、ＴＲＣ系、ファージλの主オペレータお よびプロモータ領域、ｆｄコート蛋白の制御領域、３−ホスホグリセレートキナ ーゼもしくはその他の糖分解酵素に関するプロモータ、酸ホスファターゼのプロ モータ、バキュロゥィルス系のポリヘドロンプロモータおよび酵母α−接合因子 のプロモータよりなる群から選択される請求の範囲第３項記載の組換ＤＮＡ分子 。 ５．請求の範囲第３項または第４項記載の組換ＤＮＡ分子よりなる群から選択さ れる組換ＤＮＡ分子により形質転換された単細胞宿主。 ６．イー・コリ、シュードモナス、バチルス、ストレブトミセ、真菌類の菌株、 組織培養における動物細胞、植物細胞、昆虫細胞およびヒト細胞よりなる群から 選択される請求の範囲第５項記載の宿主。 ７．請求の範囲第１項または第２項記載のＤＮＡ配列よりなる群から選択される ＤＮＡ配列により発現に際しコードされかつ実質的にヒト由来の他の蛋白を含ま ないポリペプチド。 ８．第３図の式ＡＡ−２３−ＡＡ３６２のポリペプチド、第３図の式ＡＡ１−３ ６２のポリペプチド、第３図の式Ｍｅｔ−ＡＡ１−３６２のポリペプチド、第３ 図の式ＡＡ１−３７４のポリペプチド、第３図の式Ｍｅｔ−ＡＡ１−３７４のポ リペプチド、第３図の式ＡＡ１−３７７のポリペプチド、第３図の式Ｍｅｔ−Ａ Ａ１−３７７のポリペプチド、第３図の式ＡＡ−２３−ＡＡ３７４のポリペプチ ド、第３図の式ＡＡ−２３−ＡＡ３７７のポリペプチドよりなる群から選択され る請求の範囲第７項記載のポリペプチド。 ９第１６図の式ＡＡ−２３−ＡＡ１８２のポリペプチド、第１６図の式ＡＡ１− ＡＡ１８２のポリペプチド、第１６図の式Ｍｅｔ−ＡＡ１−１８２のポリペプチ ド、第１６図のＡＡ−２３−ＡＡ１８２に続いてアミノ酸アスパラギン−口イシ ン−グルタミン−ヒスチジン−セリン−口イシンの配列を有するポリペプチド、 第１６図の式ＡＡ１−ＡＡ１８２に続いてアミノ酸アスバラギン−ロイシン−グ ルタミン−ヒスチジン−セリン−ロイシンの配列を有するポリペプチド、 第１６図の式Ｍｅｔ−ＡＡ１−１８２に続いてアミノ酸アスパラギン−口イシン −グルタミン−ヒスチジン−セリン−ロイシンの配列を有するポリペプチド、第 １６図の式ＡＡ−２３−ＡＡ１１３のポリペプチド、第１６図の式ＡＡ１−ＡＡ １１３のポリペプチド、第１６図の式Ｍｅｔ−ＡＡ１−１１３のポリペプチド、 第１６図の式ＡＡ−２３−ＡＡ１１１のポリペプチド、第１６図の式ＡＡ１−Ａ Ａ１１１のポリペプチド、第１６図の式Ｍｅｔ−ＡＡ１−１１１のポリペプチド 、第１６図の式ＡＡ−２３−ＡＡ１３１のポリペプチド、第１６図の式ＡＡ１− ＡＡ１３１のポリペプチド、第１６図の式Ｍｅｔ−ＡＡ１−１３１のポリペプチ ド、第１６図の式ＡＡ−２３−ＡＡ１４５のポリペプチド、第１６図の式ＡＡ１ −ＡＡ１４５のポリペ７チド、第１６図の式Ｍｅｔ−ＡＡ１−１４５のポリペプ チド、第１６図の式ＡＡ−２３−ＡＡ１６６のポリペプチド、第１６図の式ＡＡ １−ＡＡ１６６のポリペプチド、第１−６図の式Ｍｅｔ−ＡＡ１−１６６のポリ ペプチドまたはその部分から選択される請求の範囲第７項記載のポリペプチド。 １０．成熟Ｔ４蛋白の式ＡＡ−２３−ＡＡ３６２のポリペプチド、 成熟Ｔ４蛋白の式ＡＡ１−３６２のポリペプチド、成熟Ｔ４蛋白の式Ｍｅｔ−Ａ Ａ１−３６２のポリペプチド、成熟Ｔ４蛋白の式ＡＡ１−３７４のポリペプチド 、成熟Ｔ４蛋白の式Ｍｅｔ−ＡＡ１−３７４のポリペプチド、成熟Ｔ４蛋白の式 ＡＡ１−３７７のポリペプチド、成熟Ｔ４蛋白の式Ｍｅｔ−ＡＡ１．−３７７の ポリペプチド、成熟Ｔ４蛋白の式ＡＡ−２３−ＡＡ３７４のポリペプチド、成熟 Ｔ４蛋白の式ＡＡ−２３−ＡＡ３７７のポリペプチドまたはその部分よりなる群 から選択される請求の範囲第７項記載のポリペプチド。 １１．成熟Ｔ４蛋白の式ＡＡ−２３−ＡＡ１８２のポリペプチド、 成熟Ｔ４蛋白の式ＡＡ１−ＡＡ１８２のポリペプチド、成熟Ｔ４蛋白の式Ｍｅｔ −ＡＡ１−１８２のポリペプチド、成熟Ｔ４蛋白のＡＡ−２３−ＡＡ１８２に続 いてアミノ酸アスパラギン−ロイシン−グルタミン−ヒスチジン−セリン−ロイ シンの配列を有するポリペプチド、成熟Ｔ４蛋白の式ＡＡ１−ＡＡ１８２に続い てアミノ酸アスパラギン−ロイシン−グルタミン−ヒスチジン−セリン−ロイシ ンの配列を有するポリペプチド、成熟Ｔ４蛋白の式Ｍｅｔ−ＡＡ１−１８２に続 いてアミノ酸アスパラギン−ロイシン−グルタミン−ヒスチジン−セリン−ロイ シンの配列を有するポリペプチド、成熟Ｔ４蛋白の式ＡＡ−２３−ＡＡ１１３の ポリペプチド、成熟Ｔ４蛋白の式ＡＡ１−ＡＡ１１３のポリペプチド、成熟Ｔ４ 蛋白の式Ｍｅｔ−ＡＡ１−１１３のポリペプチド、成熟Ｔ４蛋白の式ＡＡ−２３ −ＡＡ１１１のポリペプチド、成熟Ｔ４蛋白の式ＡＡ１−ＡＡ１１１のポリペプ チド、成熟Ｔ４蛋白の式Ｍｅｔ−ＡＡ１−１１１のポリペプチド、成熟Ｔ４蛋白 の式ＡＡ−２３−ＡＡ１３１のポリペプチド、成熟Ｔ４蛋白の式ＡＡ１−ＡＡ１ ３１のポリペプチド、成熟Ｔ４蛋白の式Ｍｅｔ−ＡＡ１−１３１のポリペプチド 、成熟Ｔ４蛋白の式ＡＡ−２３−ＡＡ１４５のポリペプチド、成熟Ｔ４蛋白の式 ＡＡ１−ＡＡ１４５のポリペプチド、成熟Ｔ４蛋白の式Ｍｅｔ−ＡＡｌ−１４５ のポリペプチド、成熟Ｔ４蛋白の式ＡＡ−２３−ＡＡ１６６のポリペプチド、成 熟Ｔ４蛋白の式ＡＡ１−ＡＡ１６６のポリペプチド、成熟Ｔ４蛋白の式Ｍｅｔ− ＡＡ１−１６６のポリペプチドまたはその部分よりなる群から選択される請求の 範囲第７項記載のポリペプチド。 １２．請求の範囲第７〜１１項のいずれか一項に記載のポリペプチドよりなる群 から選択されるポリペプチドを産生させるに際し、請求の範囲第３項または第４ 項記載の組換ＤＮＡ分子よりなる群から選択される絹換ＤＮＡ分子により形質転 換された単細胞宿主を培養することを特徴とするポリペプチドの産生方法。 １３．請求の範囲第７〜１１項のいずれか一項に記載のポリペプチドよりなる群 から選択されるポリペプチドの免疫治療上もしくは免疫抑制上有効量と医薬上許 容しうるキャリヤとからなる医薬組成物。 １４．請求の範囲第１３項記載の組成物よりなる群から選択される組成物により 医薬上許容しうる方法で検体を処置することを特徴とする処置方法。 １５．検体を組成物の筋肉内注射により処置する請求の範囲第１４項記載の方法 。 １６．請求の範囲第７〜１１項のいずれか一項に記載のポリペプチドよりなる群 から選択されるポリペプチドの診断上有効量からなることを特徴とするＨＩＶ感 染の経過を検出しまたは監視するための診断組成物。 １７．請求の範囲第１６項記載の組成物よりなる群から選択される組成物を診断 剤として用いることを特徴とするＨＩＶ感染の経過を検出しまたは監視する方法 。 １８．請求の範囲第１６項記載の組成物よりなる群から選択される組成物を含む ことを特徴とするＨＩＶ感染の経過を検出しまたは監視する手段。 １９．請求の範囲第７〜１１項のいずれか一項に記載のポリペプチドよりなる群 から選択されるポリペプチドに対する免疫治療上もしくは免疫抑制上有効量の抗 体と医薬上許容しうるキャリヤとからなる医薬組成物。 ２０．請求の範囲第１９項記載の組成物により医薬上許容しうる方法で検体を処 置することを特徴とする検体の処置方法。 ２１．ＨＩＶウィルスを精製するための請求の範囲第７〜１１項のいずれか一項 に記載のポリペプチドよりなる群がら選択されるポリペプチドの使用。 ２２．ＨＩＶウィルスを生物学的試料から精製する請求の範囲第２０項記載の使 用。 ２３．請求の範囲第７〜１１項のいずれか一項に記載のポリペプチドよりなる群 から選択されるポリペプチドに試料を露呈することを特徴とするＨＩＶウィルス を試料から精製する方法。 ２４．試料が生物学的試料である請求の範囲第２２項記載の方法。 ２５．Ｐ１７０−２のＤＮＡ挿入体を含み、発現に際しＴ４類似ポリペプチドを コードするＤＮＡ配列。 ２６．請求の範囲第２５項記載のＤＮＡ配列よりなる群がら選択されるＤＮＡ配 列を含み、このＤＮＡ配列が組換ＤＮＡ分子における発現制御配列に作用結合し ている組換ＤＮＡ分子。 ２７．請求の範囲第２６項記載の組換ＤＮＡ分子により形質転換された単細胞宿 主。 ２８．請求の範囲第２５項記載のＤＮＡ配列により発現に際しコードされかつ実 質的にヒト由来の他の蛋白を含まないポリペプチド。 ２９．免疫治療もしくは免疫抑制量の可溶性蛋白リセブタと医薬上許容しうるキ ャリヤとからなる医薬組成物。 ３０．請求の範囲第２９項記載の医薬組成物により医薬上許容しうる方法で検体 を処置することを特徴とする検体の処置方法。 ３１．診断上有効量の可溶性蛋白リセブタからなることを特徴とするウィルス感 染の経過を検出しまたは監視するための診断組成物。 ３２．診断上有効量の可溶性蛋白リセ７タを診断剤として使用することを特徴と するウィルス感染の経過を検出しまたは監視する方法。 ３３．可溶性蛋白リセブタからなることを特徴とするウィルス感染の経過を検出 しまたは監視するための手段。 ３４．（ａ）ｐＢｉｖ．１のＤＮＡ挿入体、（ｂ）ｐＢｉｖ．１のＤＮＡ挿入体 にハイブリッド化しかつ発現に際し多価の可溶性Ｔ４−類似ポリペプチドをコー ドするＤＮＡ配列、および （ｃ）ＰＢｉｖ．１のＤＮＡ挿入体によりコードされる多価の可溶性Ｔ４−類似 ポリペプチドを発現に際しコードするＤＮＡ配列 よりなる群から選択されるＤＮＡ配列。 ３５．請求の範囲第３４項記載のＤＮＡ配列よりなる群がら選択されるＤＮＡ配 列を含み、このＤＮＡ配列が組換ＤＮＡ分子における発現制御配列に作用結合さ れている組換ＤＮＡ分子。 ３６．請求の範囲第３５項記載の組換ＤＮＡ分子により形質転換された単細胞宿 主。 ３７．請求の範囲第３４項記載のＤＮＡ配列よりなる群がら選択されるＤＮＡ配 列により発現に際しコードされかつ実質的にヒト由来の他の蛋白を含まないポリ ペプチド。 ３８．ポリペプチドが多価である請求の範囲第７項記載のポリペプチド。 ３９．（ａ）請求の範囲第３項または第４項記載の組換ＤＮＡ分子により形質転 換された単細胞宿主を培養してポリペプチドを産生させ、かつ （ｂ）前記ポリペプチドをキャリヤに結合させて多価ポリペプチドを生成される ことを特徴とする多価ポリペプチドの製造方法。 ４０．（ａ）免疫グロブリン重鎖の一定領域をコードするＤＮＡ配列からなる第 １部分と、 （ｂ）請求の範囲第１項または第２項記載のＤＮＡ配列またはその部分からなり 、前記第１部分の上流に結合している第２部分と からなることを特徴とするＤＮＡ配列。 ４１．（ａ）免疫グロブリン重鎖の一定領域をコードするＤＮＡ配列からなる第 １部分と、 （ｂ）請求の範囲第１項または第２項記載のＤＮＡ配列またはその部分からなり 、前記第１部分の上流に結合している第２部分と からなることを特徴とするＤＮＡ配列。 ４２．請求の範囲第４０項記載のＤＮＡ配列を有する発現ベクター。 ４３．請求の範囲第４１項記載のＤＮＡ配列を有する発現ベクター。 ４４．請求の範囲第４０項記載のＤＮＡ配列および請求の範囲第４１項記載のＤ ＮＡ配列を有する発現ベクター。 ４５．請求の範囲第４２項記載の発現ベクターおよび請求の範囲第４３項記載の 発現ベクターにより宿主細胞を同時トランスフェクトすることを特徴とするキメ ラｒｓＴ４／１ｇＧ１の産生方法。 ４６．請求の範囲第４４項記載の発現ベクターにより宿主細胞をトランスフェク トすることを特徴とするキメラｒｓＴ４／１ｇＧ１の産生方法。 ４７．．請求の範囲第４５項または第４６項記載の方法により産生されたキメラ ｒｓＴ４／１ｇＧ１。 ４８．免疫治療上もしくは免疫抑制上有効量の請求の範囲第３７項または第３８ 項記載のポリペプチドを含む医薬組成物。 ４９．請求の範囲第４８項記載の組成物により医薬上許容しうる方法で検体を処 置することを特徴とする検体の処置方法。 ５０．診断上有効量の請求の範囲第３７項または第３８項記載のポリペプチドを 含むことを特徴とするＨＩＶ感染の経過を検出しまたは監視するための診断組成 物。 ５１．免疫治療上もしくは免疫抑制上有効量の請求の範囲第４７項記載のキメラ ｒｓＴ４／１ｇＧ１を含む医薬組成物。 ５２．請求の範囲第５１項記載の組成物により医薬上許容しうる方法で検体を処 置することを特徴とする検体の処置方法。