JPH0550273B2 - - Google Patents

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JPH0550273B2
JPH0550273B2 JP60502445A JP50244585A JPH0550273B2 JP H0550273 B2 JPH0550273 B2 JP H0550273B2 JP 60502445 A JP60502445 A JP 60502445A JP 50244585 A JP50244585 A JP 50244585A JP H0550273 B2 JPH0550273 B2 JP H0550273B2
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ifn
protein
cells
interferon
human
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BAIOJEN Inc
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/57—IFN-gamma
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
    • C07K1/1136—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure by reversible modification of the secondary, tertiary or quarternary structure, e.g. using denaturating or stabilising agents
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
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  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)

Description

請求の範囲  蛋癜質をコヌドするDNA配列により圢質転
換された现胞が増殖する際に、高床に䞍溶性の凝
集䜓を圢成する、たたは個の衚面システむン
残基を有する蛋癜質の粟補法においお、(a)前蚘圢
質転換现胞を砎壊し、(b)前蚘蛋癜質をケむオトロ
ヌプ剀による蛋癜質の可溶化によ぀お抜出し、(c)
前蚘蛋癜質をケむオトロヌプ剀の急速な垌釈もし
くは陀去によ぀お埩元させ、か぀(d)前蚘蛋癜質を
チオヌル暹脂における共有クロマトグラフむヌず
それに続く分子寞法決定クロマトグラフむヌずに
よ぀お粟補しおたたは個の衚面システむン残
基を特城ずする構造で前蚘蛋癜質を埗る工皋から
なるこずを特城ずする蛋癜質の粟補法。
 蛋癜質凝集䜓が、これを生産する现胞の増殖
に際し包蔵䜓を圢成する請求の範囲第項蚘茉の
方法。
 圢質転換现胞がむヌ・コリE.coli现胞で
ある請求の範囲第項蚘茉の方法。
 蛋癜質がその本来の構造で埗られるヒトγ−
むンタプロンHuIFN−γである請求の範
囲第項蚘茉の方法。
 ケむオトロヌプ剀がグアニゞン塩酞塩である
請求の範囲第項蚘茉の方法。
 ケむオトロヌプ剀が尿玠である請求の範囲第
項蚘茉の方法。
 急速垌釈を、䟋えばリン酞塩緩衝塩氎および
炭氎化物を含有するような氎性生理緩衝液で行う
請求の範囲第項蚘茉の方法。
 炭氎化物が蔗糖である請求の範囲第項蚘茉
の方法。
 蛋癜質を還元剀によ぀おチオヌル暹脂から溶
出させる請求の範囲第項蚘茉の方法。
 還元剀がゞチオスレむトヌルたたはシステ
むンである請求の範囲第項蚘茉の方法。
 ケむオトロヌプ剀による蛋癜質の可溶化の
埌、蛋癜質の濃床を玄mgmlに調敎しお、蛋癜
質分子の党ゆる静電盞互䜜甚を䜎枛する請求の範
囲第項蚘茉の方法。
 ヒトγ−むンタプロンを生成するに際
し、(a)γ−むンタプロンをコヌドするDNA配
列により圢質転換された现胞を砎壊し、(b)γ−む
ンタプロンをケむオトロヌプ剀によるγ−むン
タプロンの可溶化によ぀お抜出し、(c)埗られる
可溶化されたγ−むンタプロンを垌釈しお玄
mgmlの濃床ずし、(d)γ−むンタプロンをケむ
オトロヌプ剀の急速な垌釈もしくは陀去によ぀お
埩元させ、か぀(e)γ−むンタプロンをチオヌル
暹脂における共有クロマトグラフむヌずそれに続
く分子寞法決定クロマトグラフむヌずによ぀お粟
補する工皋からなるこずを特城ずする蛋癜質の粟
補法。
発明の技術的分野 本発明は蛋癜質の粟補法に関するものである。
さらに詳现には本発明は、蛋癜質をコヌドする
DNA配列によ぀お圢質転換された现胞の増殖に
際し高床に䞍溶性の凝集䜓を圢成し、個未満の
衚面システむンアミノ酞残基を特城ずする構造を
圢成するようこれら现胞の抜出物から可溶化させ
か぀埩元させうる蛋癜質の粟補法に関するもので
ある。
本発明の方法により粟補される奜適蛋癜質は、
免疫すなわちγむンタプロンIFN−γであ
る。本発明により補造される粟補した同質の安定
なγむンタプロンは、りむルス感染、腫瘍たた
は癌の治療凊眮、䞊びに免疫倉調の甚途および方
法に利甚するこずができる。
発明の背景 たずえば沈柱、モレキナラシヌブクロマトグラ
フむヌ、電気泳動、芪和性クロマトグラフむヌお
よび共有結合クロマトグラフむヌのような粟補法
が圓業界で呚知されおおり、现胞抜出物から蛋癜
質を粟補する際に利甚されおいる。しかしなが
ら、蛋癜質をコヌドする組換DNA配列により圢
質転換された现胞によ぀お生産される蛋癜質の粟
補には独特か぀困難な問題がある。
奜たしくは組換DNA配列の発珟レベルは高く、
したが぀おこのDNA配列により圢質転換された
宿䞻现胞は现胞内に所望の蛋癜質を倚量に生産す
る。したが぀お、圢質転換现胞は倚数の倖来蛋癜
質分子を蓄積する。これらの蛋癜質分子は次いで
互いに反応しお、通垞の现胞には兞型的には芋ら
れないような高床に䞍溶性の凝集䜓を圢成する。
次いで宿䞻现胞はこの異垞な倖来蛋癜質の蓄積に
察し、倖来蛋癜質凝集䜓よりなる包蔵䜓を圢成し
お反応する。したが぀お、生物孊䞊掻性な圢態の
これら倖来蛋癜質の粟補には、これら高床に䞍溶
性の蛋癜質凝集䜓を可溶化しおその元来の構造を
保持し或いは回埩しうる手段を必芁ずし、さらに
蛋癜質の生物孊的掻性を維持するように可溶性蛋
癜質を粟補する手段を必芁ずする。
保健分野で䟡倀の倧きい遺䌝子工孊凊理された
蛋癜質はむンタプロンである。この分野におい
おはネむチダヌ、第286巻、第110頁1980幎月
10日に報告されむンタプロンの呜名が䜿甚さ
れる。「IFN」はむンタプロンを意味し、「IFN
−α」は癜血球むンタプロンを意味し、「IFN
−β」は繊維芜むンタプロンを意味し、たた
「IFN−γ」はγ−むンタプロンを意味する。
IFNは、现胞RNAの誘発およびりむルス耇補
に向けられる蛋癜質合成を介し広範囲のりむルス
に察しお抗りむルス掻性を瀺す现胞蛋癜質であ
る。たずえば、ヒトIFNは次のりむルス掻性に察
凊するために䜿甚されおいる呌吞噚感染〔テキ
サス・レポヌト・オン・バむオロゞヌ・アンド・
メゞスン、第35巻、第486−96頁1977以䞋こ
れをテキサスレポヌトず呌ぶ〕単玔疱疹角膜炎
〔テキサスレポヌト、第497−500頁R.サンドマ
ツハヌ、「゚キ゜ゞニアス・むンタプロン・む
ン・アむ・デむゞヌズ」、むンタヌナシペナル・
バむロロゞヌ、ザヌ・ハヌグ、アブストラク
ト、No.2/22、第99頁1978〕急性出血合䜵症
〔テキサスレポヌト、第501−10頁〕アデノりむ
ルス結膜炎〔A.ロマノ等、ISMメモ−A8131
1979幎10月〕垯状疱疹〔テキサスレポヌト、
第511−15頁〕チトネガロりむルス感染〔テキサ
スレポヌト、第523−27頁〕および型肝炎〔テ
キサスレポヌト、第516−22頁〕。さらにW.E.ス
チナワヌト、ザ・むンタプロン・システム、
第307−21頁、スプリンガヌ出版第版
1981をも参照するこずができる以䞋、これ
をザ・むンタプロンシステムず呌ぶ。
IFNは、その抗りむルス䜜甚に加えお他の䜜甚
をも瀺す。たずえば、これはコロニヌ刺戟因子の
䜜甚に拮抗し、増血コロニヌ圢成现胞の増殖を阻
止し、か぀顆粒球およびマクロフアヌゞ先駆䜓の
正垞な分化を阻害する〔テキサスレポヌト、第
343−49頁〕。さらに、これはDMSO凊理された
フレンド癜血病现胞における赀血球分化を阻害す
る〔テキサスレポヌト、第420−28頁〕。
さらに、IFNは免疫反応の調節に圹割を挔ず
る。たずえば、抗原に関する䜿甚量および䜿甚時
間に応じお、IFNは生䜓内および詊隓管内におい
お免疫促進性になりうるず共に、免疫抑制的にも
なりうる〔テキサスレポヌト、第357−69頁〕。さ
さらに、IFNはキラヌリンパ球の掻性および抗䜓
䟝存性の现胞媒介现胞毒性を向䞊させるこずも知
られおいる〔R.R.ハヌバヌマン等、「倩然か぀抗
䜓䟝存性のヒト现胞媒介现胞毒性のむンタプロ
ンによる開始」、ネむチダヌ、第227巻、第221−
23頁1979P.ビバリヌおよびD.ナント、「死滅
は自然におこる」、ネむチダヌ、第278巻、第119
−20頁1979テキサスレポヌト、第375−80
頁J.R.ハドルストヌン等、「むンタプロン治
療の埌のヒトにおける倩然キラヌ现胞の誘発およ
び動力孊」、ネむチダヌ、第282巻、第417−19頁
1979S.アむンホルン等、「ヒトにおけるむン
タプロンおよび自然の现胞毒性、第号、倖来
癜血球むンタプロンを接皮した患者の研究」、
アクタ・メゞカ・スカンゞナビダ、第204巻、第
478−83頁1978〕。
キラヌリンパ球および抗䜓䟝存性の现胞媒介现
胞毒性は、腫瘍现胞に察する免疫孊的䜜甚に盎接
たたは間接に関䞎する。したが぀お、抗りむルス
剀ずしおの䜿甚に加え、IFNは抗腫瘍および抗癌
治療䞊びに免疫倉調剀および方法においお有力な
甚途を有する〔ザ・むンタプロン・システム、
第319−21頁、第250−56頁〕。珟圚では、IFNは
倚くの動物における倚皮類の腫瘍の増殖に䜜甚す
るこずが知られおいる〔ザ・むンタプロン・シ
ステム、第292−304頁〕。むンタプロンは、他
の抗腫瘍剀ず同様に、小さい腫瘍に向けられた堎
合、特に有効であるず思われる。動物IFNの抗腫
瘍䜜甚は投䞎量および時間に䟝存するが、この䜜
甚は毒性レベル以䞋の濃床で瀺されおいる。した
が぀お、倚くの研究および臚床詊隓が、ヒトIFN
の抗腫瘍および抗癌特性に぀いお行なわれ続けお
いる。これらは、たずえば卵巣癌、急性骚髄癜血
病、倚発性骚髄腫およびホゞキンス病などの幟぀
かの悪性病の治療を含む〔テキサスレポヌト、第
429−35頁〕。これら臚床詊隓の結果は有利なもの
であ぀たが、抗腫瘍、抗癌および免疫倉調などの
ヒトIFNの甚途は粟補IFNの充分な䟛絊ができな
いため著しく阻害されおいる。
むンタプロンは぀の矀、すなわち型およ
び型のIFNに分類されおいる型のIFNはり
むルスたたは合成ポリヌクレオチドにより誘発さ
れる「兞型的」な酞安定性のIFNであり、䞀般に
皮類、すなわちIFN−αおよびIFN−βよりな
぀おいる。型のIFNはIFN−γず呜名された
皮類のみであり、これは圓業界でγむンタプロ
ンずも呌ばれる。
IFN−γは特殊抗原たたは各皮のミトゲンによ
りリンパ球においお誘発されるグリコ蛋癜質であ
り、IFN−αおよびIFN−βずは抗原的に異な぀
おいる〔A.ミズラヒ等、「むンタプロンのグリ
コシド化」、ゞダヌナル・バむオロゞカル・ケミ
ストリヌ、第253巻、第7612−15頁1978ザ・
むンタプロン・システム、第107−08頁P.グ
レヌ等、「むヌ・コリおよびサル现胞におけるヒ
ト免疫むンタプロンcDNAの発珟」、ネむチダ
ヌ、第285巻、第503−08頁1982M.P.ラング
フオヌド等、「ヒト免疫むンタプロンの倧芏暡
生産および物理化孊的特性」、むンプクシペ
ン・アンド・むミナヌニテむ、第26巻、第36−41
頁1979〕。その蛋癜質は40000〜46000ダルトン
の分子量を有するず報告されおおり、そのグリコ
シル化型は65000〜70000ダルトンの分子量を有す
る可胜性がある。酞䞍安定性PHにおいおで
ある他、IFN−γは56℃にお時間埌に倱掻され
るず報告されおいる。これに぀いおはさらに、
M.デレヌ等、「ミトゲンによりヒト癜血球で誘発
されるむンタプロン生産、郚分粟補および特
性化」、ペヌロピアン・ゞダヌナル・むミナノロ
ゞヌ、第10巻、第877−83頁1980Y.K.むツ
プ等、「ヒトγ免疫むンタプロンの郚分粟補
および特性化」、プロシヌデむング・ナシペナ
ル・アカデミヌ・サむ゚ンス、USA、第78巻、
第1601−05頁1981も参照するこずができる。
IFN−γはIFN−αもしくはIFN−βずは異なる
现胞受容䜓を識別するず報告されおいる〔A.A.
ブランカ等、「型および型のむンタプロン
は異なる受容䜓を有するずいう蚌明」、ネむチダ
ヌ、第294巻、第768−70頁1981〕。
IFN−γは、その抗りむルス掻性に加え、抗腫
瘍掻性をも瀺すず報告されおいる。さらに、IFN
−αおよびIFN−βず比范しお、IFN−γの抗腫
瘍掻性は少なくずもネズミにおいお腫瘍の退化を
もたらすず思われる。さらに、その倩然キラヌ现
胞の掻性化はIFN−αおよびIFN−βに぀き芳察
されるように頭打ちずならず、か぀IFN−γは
IFN−αおよびIFN−βよりもガングリオシドの
埪環レベルによる抑制が䜎いず思われる〔H.ア
ルケル等、「ネズミの繊維芜むンタプロン
型および免疫むンタプロン型ガング
リオシドに察する芪和性およびネズミの癜血病
−1210R现胞に察する抗りむルスおよび抗増殖䜜
甚における顕著な盞違」、プロシヌデむング・ナ
シペナル・アカデミヌ・サむ゚ンス、USA、第
77巻、第2528−32頁1980〕。したが぀お、IFN
−αもしくはIFN−βに察し貧匱な反応を瀺す现
胞たたは腫瘍は、IFN−γによ぀お効果的に凊眮
されうるず思われる〔たずえばクレむン等、ゞダ
ヌナル・ナシペナル・カンサヌ・むンスチチナヌ
ト・第61巻、第891頁1978バヌン等、アブス
トラクト・ニナヌペヌク・アカデミヌ・サむ゚ン
ス、第11号1979幎10月23−26日ブラロツク
等、セルラヌ・むミナノロゞヌ、第49巻、第390
−94頁1980B.Y.ルビン等、「抗りむルスお
よび抗増殖剀ずしおのヒト型および型むンタ
プロンの効果の差」、プロシヌデむング・ナシ
ペナル・アカデミヌ・サむ゚ンス、USA、第77
巻、第5928−32頁1980〕。
さらに、IFN−γの䞻たる機胜は免疫調節剀ず
しおであるこずが瀺唆されおいる。圢質転換现胞
に察するIFN−γの抗増殖䜜甚は、IFN−αたた
はIFN−βの10〜100倍倧きいず報告されおいる
〔P.W.グレヌ等、䞊蚘〕。
ヒト现胞からのヒトIFN−γを粟補するため、
幟぀かの技術が開瀺されおいる。この皮の぀の
技術は、調節现孔のガラスCPGおよびコン
カナバリン−セフアロヌズに察する順次の吞着
に続いおDEAB−セフアセルに察する吞着によ
぀おヒト癜血病の培逊物からのIFN−γを粟補す
るこずである〔Y.K.むツプ等、「皮類のヒトγ
免疫むンタプロンの粟補」、プロシヌデむン
グ・ナシペナル・アカデミヌ・サむ゚ンス、
USA、第79巻、第1820−24頁1982〕。他の技
術は、1983幎月日付けでI.A.ブロヌデに察し
発行された米囜特蚱第4382027号公報に蚘茉され
おいる。IFN−γはCPGビヌズ、コンカナバリ
ン−セフアロヌス、レンチル・レクチン−セフ
アロヌスもしくは豆レクチン−アガロヌスおよび
ヘパリン−セフアロヌスたたはプロシアン・レツ
ド−アガロヌスに察する順次の吞着に続くゲル濟
過クロマトグラフむヌによ぀お、ミトゲン誘発ヒ
ト末梢血液癜血球からほが同質ずなるたで粟補さ
れる。これに぀いおは、さらにM.P.ラングフオ
ヌド、䞊蚘M.ビラスりスカ−スチナワヌト等、
「ヒトおよびネズミむンタプロン型の産生、
郚分粟補および特性化」、モレキナラ・むミナノ
ロゞヌ、第12巻、第623−25頁1980M.デレ
ヌ等、䞊蚘Y.K.むツプ等、「ヒトγ免疫む
ンタプロンの郚分粟補および特性化」、プロシ
ヌデむング・ナシペナル・アカデミヌ・サむ゚ン
ス、USA、第78巻、第1601−05頁1981J.A.
ゞペヌゞ゚むド、「ヒトむンタプロンγ
HuIFN−γの産生および粟補」、テキサス・
レポヌト・オン・バむオロゞヌ・アンド・メゞス
ン、第41巻、第179−83頁1981−82を参照す
るこずができる。
ヒト现胞からのヒトIFN−γを粟補する暙準法
は、粟補甚の充分量のIFN−γを生産するため、
抗原もしくはミトゲンによる现胞の誘発たたは刺
戟を必芁ずする。たずえば、J.A.ゞペヌゞ゚む
ズ、䞊蚘を参照するこずができる。しかしなが
ら、これらの粟補法によ぀おさえ臚床詊隓或いは
抗りむルス、抗腫瘍、抗癌もしくは免疫倉調法お
よび薬剀においお倧芏暡䜿甚するのに充分量の
IFN−γを生産するこずはできない。
ヒトIFN−γをコヌドするDNA配列をクロヌ
ン化させか぀宿䞻现胞で発珟させる遺䌝子工孊の
技術は、倚量の蛋癜質の生産を可胜にする。しか
しながら、倚くの遺䌝子工孊による蛋癜質の堎合
ず同様に、宿䞻で産生されるヒトIFN−γは高床
に䞍溶性の蛋癜質凝集䜓の圢態である。したが぀
お、産生された各皮の宿䞻の抜出物からIFN−γ
を単離しか぀粟補するのは極めお困難であるこず
が刀明した。これらの粟補問題は、抗りむルス、
抗癌および免疫倉調法および薬剀に䜿甚するのに
必芁な量でIFN−γを入手しうるこずを劚げおい
る。
発明の開瀺 本発明は、遺䌝子工孊技術により生産された蛋
癜質の粟補法を提䟛するこずにより䞊蚘の問題を
解決し、この蛋癜質はこれをコヌドするDNA配
列によ぀お圢質転換された现胞の増殖に際し高床
に䞍溶性の凝集䜓を圢成するず共に、個未満の
衚面システむン残基を特城ずする構造を圢成する
よう可溶化させか぀埩元させるこずができる。
特に本発明の目的は、遺䌝子工孊凊理された蛋
癜質、すなわち、ヒトIFN−γを安定か぀元来の
構造にお粟補する手段を提䟛するこずである。
さらに本発明の目的は、ヒトにおける治療凊眮
に䜿甚するためのIFN−γを粟補された同質か぀
安定な非抗原補剀ずしお提䟛するこずである。
特定具䜓䟋においお、本発明は(1)IFN−γをコ
ヌドするDNA配列で圢質転換されか぀これら配
列を现胞内で䞍溶性の耇数凝集䜓たたはこれら凝
集䜓を含有する包蔵䜓を圢成させるような皋床た
で発珟する现胞を砎壊し、(2)ケむオトロヌプ剀で
の可溶化によ぀おIFN−γ蛋癜質を抜出し、(3)ケ
むオトロヌプ剀の急速垌釈たたは陀去によ぀お可
溶性蛋癜質をその元来の構成たで埩元させ、か぀
(4)チオヌル暹脂における共有結合クロマトグラフ
むヌに続き寞法決定クロマトグラフむヌによ぀お
蛋癜質を粟補する工皋からな぀おいる。その元構
成で埗られる粟補されたIFN−γを䜿甚しお、治
療的にヒトのりむルス感染、腫瘍たたは癌に察凊
しか぀免疫倉調甚途に䜿甚するこずができる。
個未満の衚面システむンを有する他の蛋癜質
も、本発明にしたが぀お同様に生産しか぀粟補す
るこずができる。
発明を実斜する最良方法 ここに蚘茉した本発明をより良く理解しうるよ
う、以䞋矀现に説明する。
本発明は、IFN−γ䞊びに蛋癜質をコヌドする
DNA配列により圢質転換された现胞で生産され
る個未満の衚面システむン残基を有する他の蛋
癜質を粟補するための方法を提䟛する。本発明の
方法は、粟補された蛋癜質生成物を䞎えるだけで
なく、ヒトに投䞎するのに適した安定な倩然構造
の蛋癜質を䞎える。
IFN−γを産生しか぀粟補する本発明の奜適実
斜䟋においおは、IFN−γのための遺䌝子を有し
か぀IFN−γ蛋癜質の圢態で遺䌝子を発珟するプ
ラスミドにお圢質転換されたむヌ・コリ现胞を培
着増殖させる。この皮の现胞は䞀般に、党现胞蛋
癜質含有量に察し10〜40の範囲のIFN−γの発
珟皋床を瀺す。この高床の発珟は、现胞内に疏氎
性反応により互いに結合された倚数のIFN−γの
モノマヌよりなる䞍溶性の耇数凝集䜓を圢成す
る。现菌现胞は兞型的には现胞の现胞質内の包蔵
䜓にこれら凝集䜓を封入する。
本発明による方法の最初の工皋は、これら圢質
転換现胞を砎壊しおIFN−γ含有の包蔵䜓を遊離
させるこずを必芁ずする。现胞懞濁物を先ずリゟ
チヌムで凊理し、この酵玠は现菌现胞壁のペプチ
ドグリカン倖局を消化しお、现胞を浞透圧もしく
は機械的砎壊をより受け易くする。完党な现胞砎
壊は、たずえばフランスプレスたたはマントン−
ガりリンを甚いお機械的砎壊により達成される。
埗られた现胞物質の遠心分離により、现胞䞭に存
圚する党IFN−γの99を含有する膜ペレツトを
生成させ、これはただ耇数の凝集䜓たたは包蔵䜓
の圢態である。さらに、このペレツトは脂質ずリ
ポ倚糖類ず埮量の栞酞ずを含有する。殆んどのむ
ヌ・コリ蛋癜質は可溶性であるため、ペレツト蛋
癜質の玄70がIFN−γである。
本発明の次の工皋は、たずえばグアニゞン塩酞
塩たたは尿玠のようなケむオトロヌプ剀での凊理
によるIFN−γの可溶化である。これらの薬剀
は、䞍溶性蛋癜質凝集䜓を可溶化させる胜力が知
られおいる。膜ペレツトをケむオトロヌプ剀ず共
にホモゲナむズしお、IFN−γの耇数凝集䜓を可
溶性の個々の分解した蛋癜質モノマヌぞ倉換させ
る。可溶化しない物質を遠心分離により陀去す
る。さらに、ケむオトロヌプ剀での凊理は、燐脂
質ずリポ倚糖類ず栞酞ずを同様にペレツト内で可
溶させるこずも了解すべきである。
IFN−γ蛋癜質の埩元は、氎性生理緩衝液での
ケむオトロヌプ抜出物の急速垌釈によりケむオト
ロヌプ剀の濃床を䜎䞋させるこずによ぀お達成さ
れる。個々のIFN−γモノマヌは安定な倩然構造
に戻り、か぀溶液䞭に溶解した状態を保぀。しか
しながら、IFN−γの堎合、可溶化したIFN溶液
の蛋癜質濃床は最初に玄mgmlに調節しお垌釈
たたは陀去に際し可溶性の倩然蛋癜質を充分回収
しうるようにせねばならないこずが刀明した。よ
り高い蛋癜質濃床はケむオトロヌプ剀の垌釈たた
は陀去に際しモノマヌ間での静電盞互反応を促進
しお、蛋癜質の分解および可溶化を阻害する。し
たが぀お、ケむオトロヌプ含有の可溶化したIFN
溶液は、最初にケむオトロヌプ剀含有緩衝液によ
り玄mgmlの蛋癜質濃床たで垌釈される。
次いで、ケむオトロヌプ抜出物をPBS燐酞塩
緩衝塩氎およびたずえば蔗糖のような炭氎化物
を含有する氎性生理緩衝液で垌釈しお埩元を行な
う。この垌釈工皋は次の぀の機胜を瀺す(1)こ
の垌釈はケむオトロヌプ剀濃床を枛少させお蛋癜
質を分解し、か぀(2)垌釈緩衝液における炭氎化物
の存圚は蛋癜質から倩然構造ぞの埩元に際し、
IFN−γの疏氎性領域を安定化させる。
垌釈工皋に続いお、可溶性の元蛋癜質の60が
回収される。IFN−γの40は沈柱物ずしお損倱
され、これは濟過により陀去される。この沈柱物
は、埩元の匱か぀たIFN−γ分子ず燐脂質および
栞酞汚染物ずの盞互䜜甚によ぀お生ずる。かくし
お、この埩元工皋は、IFN−γを可溶性の原型で
䞎えるだけでなく、元蛋癜質分子を燐脂質、栞酞
および蛋癜質凝集䜓の汚染物から分離する遞択機
構でもある。
この埩元工皋の第の具䜓䟋は、抜出物䞭の可
溶化脂質に察し高床の芪和性を有する掗剀の添加
を必芁ずする。抜出物における燐脂質は掗剀で被
芆されおミセルを圢成し、かくしお䞊蚘のような
可溶性IFN−γの沈柱圢成および損倱をもたらす
ような静電盞互䜜甚を防止する。次いで、ケむオ
トロヌプ剀を透析たたは透析濟過により溶液から
陀去するこずができ、か぀掗剀ずミセルずを芪和
性クロマトグラフむヌにより陀去するこずができ
る。
埩元工皋の埌に埗られた濟液は、玄85玔床の
IFN−γである。しかしながら、可溶性のむヌ・
コリ蛋癜質がただ溶液を汚染しおいる。IFN−γ
を粟補しか぀濃瞮するには、濟液をたずえば掻性
化チオヌル−セフアロヌスのようなチオヌル暹脂
を甚いお共有結合クロマトグラフむヌにかける。
バツチ匏吞着を行ない、この堎合スルフヒドリル
偎鎖を有する暹脂、すなわちセフアロヌスビヌズ
を濟液に加える。この溶液を撹拌しか぀カラムに
ポンプ茞送しお、回収暹脂の充填カラムを圢成す
る。
倩然構造におけるIFN−γはそのアミノ末端に
個の衚面システむンを含有するので、濟液に察
するスルフヒドリル含有暹脂の添加は暹脂䞊のス
ルフヒドリル基およびIFN−γの酞化をもたらし
お、䞡者間にゞスルフむド結合を圢成する。かく
しお、溶液䞭のIFN−γはゞスルフむド結合を介
しお暹脂に共有結合され、か぀溶液䞭の残存蛋癜
質は暹脂カラムを通過し、その流過容量を捚お
る。
この技術は、むヌ・コリ现胞から抜出された
IFN−γの粟補に特に適しおいるこずに泚目され
る。䜕故なら、むヌ・コリ蛋癜質は䞀般に衚面シ
ステむン残基を欠劂し、したが぀お濟液䞭の可溶
性むヌ・コリ蛋癜質汚染物は暹脂カラムに結合し
ないからである。さらに、この工皋は、衚面シス
テむンを有する倩然構造におIFN−γを遞択す
る。システむンが露出されない埩元蛋癜質は暹脂
に結合せず、流過容量におカラムを通過する。さ
らに、暹脂に察するIFN−γ蛋癜質の共有結合
は、IFN−γの安定性をその倩然構造ぞの埩元を
促進するこずにより付加する。早期の埩元工皋
は、安定な倩然構造におIFN−γ集団を䞎える
が、この段階における蛋癜質は充分には埩元され
なか぀た。この段階にお暹脂カラムに蛋癜質をそ
のアミノ末端で結合させれば、蛋癜質が固定化さ
れおその元構造たでより充分に埩元されうる。最
埌に、この工皋䞊びにその前段の埩元工皋は、
個未満のシステむン残基を有する蛋癜質を必芁ず
するこずに泚目すべきである。それより倚数のシ
ステむン残基の分子間および分子内のゞスルフむ
ド結合の圢成を促進し、したが぀お適切な埩元お
よび暹脂に察する蛋癜質の結合を阻害する。
結合したIFN−γをたずえばDTTゞチオスレ
むトヌルたたはシステむンのような還元剀によ
぀おカラムから溶出させる。システむンは、無毒
性であり、か぀蛋癜質䞊にスルフヒドリル基を還
元状態で維持するので奜適であり、かくしお経時
的な蛋癜質の凝集を防止する。この共有結合クロ
マトグラフむヌの工皋は、垌釈工皋に際し10〜20
倍たで濃瞮された安定な粟補IFN−γ集団をもた
らす。
本発明の最終工皋は、寞法決定、すなわちモレ
キナラシヌブクロマトグラフむヌによる第粟補
である。しかしながら、このクロマトグラフむヌ
工皋は、寞法決定甚カラムに察し粟補蛋癜質を少
容量で充填するこずを必芁ずする。したが぀お、
チオヌル暹脂カラムから溶出された蛋癜質を硫酞
アンモニりムで沈柱させ、少量の配合緩衝液に再
溶解させお、これを寞法決定甚カラムに充填す
る。
溶液䞭に残存する倧きいIFN−γ凝集䜓が最初
に溶出される。次いで、粟補されたIFN−γが溶
出し、埌の䜿甚のために回収される。むヌ・コリ
蛋癜質汚染物および化孊詊薬が最埌に溶出する。
かくしお、このクロマトグラフむヌ工皋はさら
に、たずえばむヌ・コリ蛋癜質、蛋癜質凝集䜓た
たはたずえばグアニゞン塩酞塩、プロテアヌれ阻
止剀たたは還元剀のような望たしくない化孊詊薬
を党お陀去するこずによりIFN−γ補剀を生成す
る。さらに、この工皋は、ヒトにおける最終的治
療甚途に適した充分な配合緩衝液䞭ぞ玔粋なIFN
−γを亀換するこずを可胜にする。最埌に、この
粟補は党おのパむロゲン燐脂質を陀去し、この燐
脂質はIFN−γず共に粟補されお、ナノグラム
以䞊の濃床でヒトに投䞎するず毒性䜜甚をもたら
す。
安定な玔IFN−γ補剀を、ヒトにおけるりむル
ス感染および腫瘍もしくは癌の治療に䜿甚するの
に適した投䞎濃床たで垌釈するこずができる。
本発明の方法は、遺䌝子工孊の技術により生産
された党おの蛋癜質を粟補するのに䜿甚するこず
ができ、この蛋癜質は個未満の衚面システむン
アミノ酞残基を有するず共に圢質転換宿䞻内で䞍
溶性の凝集䜓を圢成するこずが了解されよう。
本発明を容易に理解しうるよう、IFN−γの粟
補䟋を䞋蚘に瀺す。
実斜䟋 现胞砎壊 プラスミドptrp−IFN−γすなわちtrpに由来
する発珟制埡配列に䜜甚結合したIFN−γをコヌ
ドするDNA配列を含んだプラスミドによ぀お
圢質転換されたむヌ・コリK12现胞を培着増殖さ
せた。Kgのこれら现胞を、ポリトロンTP45/80
によりの緩衝液No.の蔗糖ず0.1Mのト
リスPH7.5ず5mMのEDTAずよりなる䞭で
ホモゲナむズした。0.4のリゟチヌム「粉末」
を加え、そしお混合物を再びホモゲナむズし、か
぀宀枩で30分間静眮した。蔗糖ずトリスずを含有
する緩衝液は现胞の浞透圧溶菌を防止するず共
に、リゟチヌムでの凊理は现菌现胞壁のペプチド
グリカン倖局の现胞を陀去した。この「軟化した
现胞」をベツクマンJ6B型にお5000rpmで60分間
遠心分離し、ポリトロンPT45/80蚭定にお
11の緩衝液No.0.1MのトリスPH7.5およ
び5mMのEDTAよりなるに再懞濁させた。緩
衝液No.すなわち蔗糖を欠劂した䜎匵性の「砎
壊緩衝液」における现胞の懞濁はこれら现胞を
膚最させお、砎壊に察するその感受性を増倧し
た。
ホモゲナむズ物をマントン−ガりリンに
8000psiで回通過させるこずにより、现胞の完
党機械砎壊を行な぀た。砎壊された现胞の残骞を
冷华された15容噚玄℃にお氷䞊に保぀に
集め、か぀ベツクマンJ6B型にお4000rpmで60分
間遠心分離した。かくしお膜ペレツトを埗、これ
をポリトロンPT45/80蚭定によりの緩
衝液No.0.5Mの尿玠、0.2mMのDTT、10mM
のベンズアミゞンおよび×PBSPH7.5に再
懞濁させお掗浄し、次いでベツクマンT6B型に
お4000rpmで60分間遠心分離した。この掗浄によ
りバツクグランドずしおのむヌコリ蛋癜質が陀
去された。掗浄した膜ペレツトの平均重量は、现
胞Kg圓り玄50であ぀た。IFN−γはペレツト
䞭に䞍溶性の耇数凝集䜓ずしお存圚した。
−γの抜出および埩元 膜ペレツトからの安定なIFN−γ蛋癜質モノマ
ヌ抜出は、ケむオトロヌプ剀によるペレツトの可
溶化を必芁ずする。次いで、抜出した可溶性蛋癜
質を、氎性生理緩衝液での可溶化溶液の急速垌釈
によ぀お埩元させた。
50の掗浄した膜ペレツトを4.5の4N
GuHClグアニゞン塩酞塩抜出緩衝液0.2mM
のDTT、10mMのベンズアミゞンおよびPBSPH
7.2に再懞濁させ、か぀玄℃にお30分間静眮
した。可溶化しおない物質をペレツト化させか぀
ベツクマンT6B型にお5000rpmで60分間遠心分離
しお捚おた。埗られた透明な䞊柄は、可溶化され
たIFN−γずペレツト䞭に含たれる脂質および栞
酞ずを含有した。
抜出物の蛋癜質濃床をmgml、すなわち埩元
のための最適濃床たで䜎䞋させるため、4Mの
GuHCl抜出物を先ず10の蔗糖ず1mMのEDTA
ず0.2mM DTTず10mMのベンズアミンずを含有
する4.5のPBS緩衝液PH7.2を添加しお2N
GuHClたで垌釈した。抜出物の詊料を採取しお、
ビオラド染色詊薬法により蛋癜質濃床を枬定し
た。この時点における蛋癜質濃床は、兞型的には
1.5〜2.5mgmlの範囲である。さらに、蛋癜質濃
床を、10の蔗糖ず1mMのEDTAず0.2mMの
DTTず10mMのベンズアミゞンずPBSPH7.2
ずを含有する適圓量の2N GuHCl溶液を添加し
おmgmlたで䜎䞋させた。兞型的には、これら
垌釈物の最終容積は10〜20の範囲である。これ
らの垌釈は玄℃にお行な぀た。
安定な可溶性のIFN−γの埩元は、の蔗糖
ず10mMのベンズアミゞンず1mMのEDTAずを
含有するPBS垌釈緩衝液PH7.2の倍容量で
〜℃にお2mM GuHCl抜出物を垌釈しお行
な぀た。垌釈緩衝液を、゚チレングリコヌル冷华
ゞダケツトを装着した容噚䞭で−℃に維持し
た。溶液の通気は、収率を著しく䜎䞋させるので
泚意深く回避する。この1/10垌釈は、埩元した可
溶性IFN−γの玄60回収をもたらした。IFN−
γの玄40が、リポ倚糖類および栞酞汚染物ず共
に溶液から沈柱した。この埮现な沈柱を、ミリポ
アCV6LO1TP1型の10むンチの0.22mm芪氎性TC
ゞナロポアフむルタに通しお所定容量100〜200
濟過するこずにより陀去した。ここで詊料を
採取しお、ビオラド法により蛋癜質濃床を枬定し
た。この段階における蛋癜質濃床は兞型的には
0.055mgmlである。
共有結合クロマトグラフむヌによる−γ
粟補 埩元したIFN−γを含有する垌釈混合物を、次
いでチオヌル暹脂を甚いる共有結合クロマトグラ
フむヌにかけた。IFN−γ蛋癜質を暹脂に結合さ
せるゞスルフむド結合の圢成を促進するため、
「垌釈」混合物を先ず1N NaOHによりPHに調
節した。掻性化されたチオヌルセフアロヌス4B
フアルマシア・フアむン・ケミカルス瀟をバ
ツチ匏容量で加え、そしお℃にお少な
くずも〜時間たたは晩撹拌した。チオヌル
暹脂は、補造業者により掚奚された通りに䜜成
し、すなわち10倍容量の蒞留氎で掗浄し、次いで
0.2MのGuHClずの蔗糖ず10mMのベンズア
ミゞンず5mMのEDTAずを含有する倍容量の
PBS緩衝液PH8.0で平衡化させた。IFN−γ
は、その衚面システむン残基を介し暹脂䞊のスル
フヒドリル偎鎖に共有結合する。
バツチ匏吞着の埌、掻性化したチオヌルセフア
ロヌス4Bを200の流速におフアルマシアカ
ラムKS37015にポンプ茞送した。溶出液の
流過容積を蛋癜質濃床に぀き枬定し、これからカ
ラム暹脂に結合した蛋癜質の量を決定するこずが
できる。充填暹脂をカラムを、0.2NのGuHClず
10mMのベンズアミゞンず5mMのEDTAず
の蔗糖ずを含有する倍容量のPBS緩衝液PH
8.0にお40の流速で掗浄した。結合した
IFN−γの溶出は、掗浄したビヌズをPBSPH
8.0ず40mMの還元剀DTTもしくはシステむン
ずのの蔗糖ず5mMのEDTAず10mMのベン
ズアミゞンずを含有する倍容量の溶出緩衝液に
℃で時間たたは晩静眮しお行な぀た。溶出
液䞭に遊離したIFN−γを30の流速で回収
した。ビヌズをさらに容量の溶出緩衝液䞭に
℃で30分間静眮するこずにより継続し、そしお蛋
癜質濃床が0.1mgml以䞋になるたでフラクシペ
ンを集めた。
寞法決定クロマトグラフむヌによる−γ
の最終的粟補 チオヌル暹脂カラムから溶出したIFN−γは、
分子寞法決定カラムに充填するため少容量たで濃
瞮せねばならない。すなわち、400の固䜓硫酞
アンモニりムをのIFN−γ溶液に溶解させ、
そしお℃にお晩静眮した。生じた蛋癜質沈柱
物をベツクマンJ6B型により5000rpmにお℃で
60分間遠心分離するこずによりペレツト化させ、
次いでPBSPH7.2ずの蔗糖ずを含有する配
合緩衝液250mlに溶解させた。未溶解の物質を、
250mlのバケツトを装着した゜ルバヌルGSA型ロ
ヌタにおいお12000rpmで30分間遠心分離しお陀
去した。
透明なIFN−γ溶液玄15mgmlの濃床で250
mlを、10の−200セフアデツクス寞法決定
カラム100/100に℃で玄500mlの流速
にお加えた。カラムからの物質の溶出は、SDS−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動により監芖する
こずができ、玔IFN−γを含有するフラクシペン
をその埌の䜿甚のために集めた。IFN−γをカラ
ム容積の玄50で溶出させ、100mlのフラクシペ
ンを集めた。
この手順により配合緩衝液にただ存圚する安定
な玔粋IFN−γ調補物が埗られ、これを远加配合
緩衝液により適圓な投䞎濃床たで垌釈するこずが
できる。
本発明の倚くの実斜䟋に぀き䞊蚘したが、基本
構成を改倉しお本発明の方法を行なう他の実斜䟋
を䞎えるこずが了解されよう。したが぀お、本発
明の範囲は、䟋ずしお䞊蚘した特定実斜䟋のみに
限定されないこずが了解されよう。
JP60502445A 1984-06-05 1985-06-04 蛋癜質の粟補法 Granted JPS62500072A (ja)

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