【発明の詳細な説明】
新規ＴＮＦペプチド
本発明ｌよ腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）から誘導した新規のペプチド、その製造お之
びその医薬としての用途に関する。
Ｃａｒｓｗｅｌｌ ｅｔ ｉｌ、 （Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｅａｄ、Ｓｃｉ、
ＵＳ人７２、３６６６、１９７５ ）により、あらかじめミコバクテリア菌株力
ルメット・ゲラン（Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ） （ＢＣＧ）で感染させ
たエンドトキシン地理した動物の血清ば、マウスの多様な腫瘍において出血性壊
死を引き起こすことが報告された。この活性は腫瘍壊死因子にあるとぎ系に対し
て静細胞性また１よ細胞毒性の作用を示すが、正常なヒトおよび動物の細胞系は
それによって作用されない（Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ Ｒｅｐｏｒｔｓ Ｖｏｌ、
、２． ｐｐ ２３５７２７５゜Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、 Ｎｅｗ Ｙ
ｏｒｋ、 １９８１） 、最近では、生化学的特性の解明およびヒトＴＮＦの遺
伝子について記載されている（ Ｎａｔｕｒｅ ３１２．７２４．１９８４；
Ｊ、 Ｂｉｃｌ。
Ｃｈｅｗ、 ２６０．２３４５，１９８５； Ｎｕｃｌ、 Ａｃ１ｄｓ ＲＱＳ
、 １３．６３６１゜１９８５） 。
これらのデータから、成熟したヒトＴ Ｎ Ｆについて、次のタンパク質構造を
導き出すことができる。
νａ ｌＡｒｇＳｅｒＳｅｒＳｅｒＡｒｇＴｈｒＰｒｏＳｅｒＡｓｐＬｙｓＰｒ
、ｏｖａ Ｉ Ａ １ ａＨｌ５Ｖａ ｌ Ｖａ Ｉ Ａ 戟@ａＡｓｎＰｒａ
Ｇ ＩｎＡ ｌ ａＧ ＩｕＧ ＋ｙＧ Ｉ ｎＬｅｕＧ Ｉ ｒ＋ＴｒｐＬｅ
ｕＡＳｎＡｒｇＡｒｇＡ ｌ ａＡｓｎＡ ｌ ａＬｅｕＬ■kＩＡ ｌ ａＡ
ｓｎＧ ｌ ｙ
ＶａＩＧＴｕＬｅｕＡｒｇＡｓｐＡｓｎＧｌｎＬｅｕＶａ １ＶａｌＰｒｏｓｅ
ｒＧＩｕＧＩｙＬｅｕＴｙｒＬｅｕ１１ｅＴｙｒｓｅｒＧ １ｎＶａ Ｉ Ｌｅ
ｕＰｈｅＬｙｓＧｌ ｙＧ ｌ ｎＧ１ ｙＣｙｓＰｒｏＳｅｒＴｈｒＨｌ ｓ
Ｖａ ｌ ＬｅｕＬｅｕ’ｌ’ｈｒgｌ ５Ｔｈｒ Ｉ ｌ ｅ
ＳｅｒＡｒｇ Ｉ ｌｅＡ ｌ ａＶａ ｌ５ｅｒＴｙｒＧ １ ｎＴｈｒＬｙ
ｓＶａ Ｉ ＡｓｎＬｅｕＬｅｕＳｅｒＡ ｌ ａ Ｉ １@ｅＬｙ ５ｓｅｒ
Ｐｒ。
ＣｙｓＧ ｌ ｎＡｒｇＧ １ ｕＴｈｒＰｒｏＧ １ ｕＧ １ ｙＡ １
ａＧ ｌ ｕＡ １ ａＬｙｓＰｒｏＴｒｐＴｙｒＧ ｌ 浮oｒｏ Ｉ ｌ
ｅＴｙｒＬｅｕ
ＧＩｙＧｌｙＶａｌＰｈｅＧｌｎＬｅｕＧｌｕＬｙｓＧす＾ｓｐＡｒｇＬｅｕｓ
ｅｒＡ１ａＧ１ｕｌ １ｅＡｓｎＡｒｇＰｒｏＡｓｐＴｙｒＬｅｕＡＳｐＰｈｅ
Ａ ｌ ａＧＩｕ５ｅｒＧｌ ｙＧｌｎＶａ １ＴｙｒＰｈａＧｌ ｙｌ ｌｅ
ｌ １ｅＡｌ ａＬｅｕさらに、ウシ、ウサギおよびマウスのＴＮＦ遺伝子が記
載されティる（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ、 Ｑｕａｎ
ｔ。
Ｂｉｏｌ、 ５１．５９７．１９８６） 。
ＴＮＦＩよその細胞毒性のほかに、炎症反応に関与する主因子の一つである（Ｐ
ｈａｒｍａｃ、 Ｒｅｓ、 ５．１２９．１９８８）、動物モデルにおいて、Ｔ
ＮＦの関与は、敗血性のショックの場合（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９．８６９．１
９８５）および抗宿主移植片症（Ｊ、 Ｅｘｐ、 Ｍｅｄ、 １６６、１２８０
．１９８７）の場合に認められた。
極めて低い分子量のペプチドが有利な特性を有することが見出された。
本発明の目的は、式ｒ：
Ｘ−Ａ−Ｂ−Ｅ−Ｌｅｕ−Ｙ Ｉ
［式中、Ａは、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎを表し、Ｂは、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ
またはＡｓｐを表し、Ｅは、ＧｉｎまたはＳｅｒを表し、
ｘ番よ、 基 ： Ｇ−ＮＨ−Ｃ）［Ｍ−ＧＯ−１Ｇ−Ｎ１（−ＣＩ（Ｍ−ＣＯ
−Ｉ’ｌ−１Ｇ−Ｒ−Ｎ）Ｉ−Ｃ）［Ｍ−ＧＯ−Ｔ−た番よＧ−Ｒ−Ｎ）！−Ｃ
ＨＭ−Ｃｏ−１’ｌ−を表し、およびｙ＋ｉ、基ニーＺ、−ＮＨ−Ｃ）［Ｑ−Ｃ
Ｏ−Ｚ、−Ｖ−ＮＨ−Ｃ）ＩＱ−Ｇｏ−Ｚ、−Ｎ）Ｉ−ＧＨＱ−ＧＯ−Ｕ−Ｚ
＊ タ＋＊−Ｖ−Ｎ）Ｉ−Ｃ）［Ｑ−Ｇｏ−Ｕ−Ｚ Ｔｈ表し、その際、Ｘおよ
びＹにおいて、
Ｇは、水素原子友だｔよアミノ保護基を表し、２ば、ＯＫ−またばＮＨ，基また
１よりルポキシル保護基を表し、または
ＧおよびＺぼ、−緒になって、共有結合または基、−ＣＯ−（ＣＨ，） 、−Ｎ
Ｈ−を表しくただしａは１〜１２の数を表す）ＲおよびＵは、１〜５個の天然由
来のα−アミノ酸からのペプチド鎖を表し、
Ｗは、ペプチド鎖：
または５〜１１個のアミノ酸基の長さの前記ペプチド鎖のひとつの部分配列また
（よ１〜４の天然由来のα−アミノ酸を有するペプチド鎖を表し、
■はペプチド鎖：
または５〜１１個のアミノ酸基の長さの前記ペプチド鎖のひとつの部分配列また
は１〜４の天然由来のα−アミノ酸を有するペプチド鎖を表し、
ＭおよびＱｉよ、水素原子また番よ基ニーＣＨ（ＣＨ３）２．−ＣＨ（ＣＨ３）
−Ｃ２Ｈ５，−Ｃ６Ｈ５，−ＣＨ（０８１−ＣＨ３゜（ただし、ｂは１〜６の数
を表し、Ｔは水素原子または０Ｈ−１Ｃ）［、０−１Ｃ）［、Ｓ−１ＣＣＨｓ）
ｚＣＨ−５ＣＪ＋−１ｐ−ＨＯ−Ｃ４Ｈ６−１Ｈ３−１Ｈ！ Ｎ−１ＨＯ−ＣＯ
−１ＨｘＮ−ＣＯ−１Ｈ！ Ｎ−Ｃ（＝Ｎｌ（）−ＮＨ−を表す）を表し、また
は
ＭおよびＱは一緒になって−（ＣＨｉ）−５−３−（ＣＨｉ）＊−１−（ＣＨｚ
）、−ＧＯ−Ｎｌ（−（ＣＨｔ） を−または−（ＣＨ，） 、−ＮＨ−ＣＯ−
＜Ｃ）ｔｌ）、−Ｎ）［−ＧＯ−（ＣＨＩ） Ｉ−架橋基（ただし、Ｃおよびｄ
ば１〜４の数を表し、ｅおよびｆは１〜６の数を表し、ｇは１〜１２の数を表す
）を表す］のペプチド、ならびに生理学的に認容性の酸とのその塩である。
弐工のペプチドは、Ｌ−アミノ酸から構成されているが、しかし１〜２個のＤ−
アミノ酸を含存していてもよい、三官能性ｌミノ酸の側鎖は、保護基を有するか
または保護されていないで存在していてもよい。
生理学的に認容性の酸として、特に次のものが挙げられる。
塩酸、クエン酸、酒石酸、乳酪 リン酸、メタンスルホン酸、酢酸、ギ酸、マレ
イン酸、フマル酸、リンゴ酸、コハク酸、７０ン酸、硫酸、Ｌ−グルタミン酸、
Ｌ−アスパラギン酸、熱性ブドウ酸、粘液酸、安息香酸、グルクロン酸、シュウ
酸、アスコルビン酸、アセチルグリシン。
新規ペプチドば、開鎖であってもよ＜ （Ｇ＝Ｅ（、アミノ酸保護基、Ｚ＝ＯＨ
％ＮＨ，、カルボキシル保護基；ＭおよびＱｔよ相互に結合していない）かつ特
にジスルフィド架橋であってもよ＜（Ｇ＝Ｈ、アミノ保護基；Ｚ＝ＯＨ％ＮＨ，
、カルボキシ保護基、 Ｍ ＋ Ｑ ＝−（ＣＨＩ）、−５−Ｓ−（Ｃ）ｒｔ）
ｎ−）また１よ側鎖架橋であってもよ＜ （Ｇ＝Ｈ、アミノ保護基、Ｚ ＝ＯＨ
１ＮＨ，、ガルボキシ保護基、Ｍ＋ Ｑ ＝−（ＣＨｘ）−Ｎ）Ｉ−Ｇｏ−（Ｃ
Ｈｔ） ｒ−または−（ＣＨｓ）、−ＮＨ−ＧＯ−（ＣＨ，）、−ＮＨ−ＣＯ−
（ＣＨｔ）、−） 、頭−尾結合していてもよい（Ｇ＋Ｚ＝共有結合友た各社−
Ｃｏ（ＣＨ，）、−ＮＨ） 。
新規化合物はペプチド化学で公知の方法により製造・ することができる。
ペプチド
【よ、逐次的にアミノ酸からまたは好適な小さいペプチドのフラグメン
ト結合により形成することができる。逐次的構成の際に、ペプチド鎖はＣ末端で
開始し、段階的にその都度Ｎｉｌのアミノ酸を延長する。
フラグメントカップリングの際、種々の長さのフラグメントを相互に結合させる
ことができ、この場合、フラグメントもまた、アミノ酸からの逐次的構成により
またはフラグメントカップリングにより得られる。環状ペプチドは、開鎖ペプチ
ドの合成後に、高い希釈度で実施する環化反応により得られる。
逐次的構成でも、またフラグメントカップリングでも、構成要素をアミド結合の
形成により結合しなｌすればならない、このために番よ、酵素的方法および化学
的方法が適している。
アミド結合を形成するための化学的方法ｌよ、Ｍｕｅｌｌｅｒ、Ｍｅｔｈｏｄｅ
ｎ ｄｅｒ ０ｒｙａｎｉｓｃｈａｎ Ｃｈｅｍｉｅ Ｖｏｌ ＸＶ／２． ｐ
ｐ １−３６４． Ｔｈｉｅｍｅ Ｖｅｒｌａｇ、 Ｓｕｔｔｇａｒｔ、 １９
７４； Ｓｔｅｗａｒｔ、 Ｙ。
ｕｎｇ、 ５ｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ ５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、
ｐｐ ３１−３４．７１−８２．Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａ
ｎｙ、 Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、 １９８４； Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ、 Ｋｌａｕｓ
ｎｅｒ、 ０ｎｄｅｔｔｉ、 Ｐｅｐｔｉｄｅ ５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、 ｐｐ８
５−１２８． Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ ５ｏｎｓ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、
１９７６ および他のペプチド化学の標準的論文に詳しく扱われている。特に優
れているのは、アジド法、対称および混合アンヒドリド法、その場で生成もしく
は予備形成される活性エステルならびにカップリング試薬（活性剤）、特にジシ
クロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣ） 、ジイソプロピルカルボジイミド（Ｄ
ＩＣ）、１−エトキシカルボニル−２−二トキシ−１，２−ジヒドロキノリン（
ＥＥＤＱ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミ
ドヒドロクロリド（Ｅ Ｄ ＣＩ ） 、 ｎ−プロパンホスホン酸無水物＜ｐ
ｐＡ） 、Ｎ、Ｎ−ビス（２−オキソ−３−オキサゾリジニル）アミドリン酸ク
ロリド（ＢＯＰ−ＣＩ）、ジフェニルホスホリルアジド（ＤＰＰＡ）、キャスト
ロ試薬（Ｃａｓｔｒｏ’ｓ Ｒｅａｇｅｎｚ ； Ｂ ＯＰ ） 、Ｏ−ベンゾ
トリアゾリル−Ｎ、Ｎ、Ｎ’ 、Ｎ’ −テトラメチルウロニウム塩（ＨＢＴＵ
）、２．５−ジフェニル−２，３−ジヒドロ−３−オキソ−４−ヒドロキシチオ
フェンジオキシド（Ｓｔｅｇｌｉｃｈｓ Ｒｅａｇｅｎｚ ； ＨＯＴ Ｄ Ｏ
）およびｌ。
１′ −カルボニル−ジイミダゾール（ＣＤＩ）を用いるアミド結合形成である
。カップリング試薬ｌよ、単独でまたは添加物、たとえばＮ、Ｎ’ −ジメチル
−４−アミノピリジン（ＤＭＡＰ）、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯ
Ｂｔ） 、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアジン（ＲＯＯＢ ｔ） 、Ｎ−ヒドロキ
シスクシンイミド（Ｉ（Ｏ３ｕ）または２−ヒドロキシピリジンと組み合わせて
使用することができる。
一般に酵素的ペプチド合成の場合、保護基を使わなくてもよいが、化学的合成の
場合、アミド結合形成に関与しない双方の反応成分の反応性官能基の可逆的保護
が必要である。化学的ペプチド合成の場合、文献により公知の３フの保護基法が
優れている。ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）−１ｔ−ブチルオキシカルボニル
ＣＢｏｃ）−および９−フルオロエニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ ）
−保護基法、それぞれ、連鎖が延長する構成要素のα−アミノ官能基の保護基で
ある。
三官能性アミノ酸の側鎖保護基は、それが必然的にα−アミノ酸保護基と一緒に
脱離されないように選択される。アミノ酸保護基に関する詳細は、Ｍｕｅｌｌｅ
ｒ、 Ｍｅｔｈｏｄｅｎ ｄｅｒ Ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ Ｃｈｅｍｉｅ Ｖ
ｏｌ ＸＶ／１． ｐｐ２０−９０６゜Ｔｈ１ｅ＋ｎｅ Ｖｅｒｌａｇ、 Ｓｔ
ｕｔｔｇａｒｔ、 １９７４に記載されている。
ペプチド鎖の構成に有用な構成要素番よ、溶液中で、Ｉ！濁液中でまたｔよメリ
フィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉａｌｄ）によるＪ、 Ａｍｅｒ、 Ｃｈｅｉ、 Ｓ
ａｃ、 ８５．２１４９．１９６３に記載されたような方法により反応させるこ
とができる０反応酸分を溶液中で反応させて、逐次的にまたｔｉ：フラグメント
カップリングによりＺ−１Ｂｏｃ−またはＦｍｏｃ−保護基法を適用しながらペ
プチドを＃ｌ成する方法ならびに前記のメリフィールド法と同様に、反応成分を
不溶のポリ７−担体（以下樹脂ともいう）に結合させて反応させる方法が特に優
れている。この場合、ペプチドをＢｏｃ−またはＦｍｏｃ−保護基法を適用して
ポリマー担体に構成させるのが代表的であり、その際成長するペプチド鎖は、Ｃ
末端で不溶性樹脂粒子と共有結合している（第１図および第２図参照）、この操
作法は、試薬および副生成物を濾過により除去することができ、従って中間生成
物の再結晶（よ不必要である。
この保護したアミノ酸は任意の適当な重合体に結合させることができ、この重合
体は、使用する溶剤中に不溶性であり、かつａ単な濾過が可能な物理的に安定な
形を有していなければならない、この重合体は、保護した最初のアミノ酸と共有
結合により固く結合することのできる官能基を有していなければならない、この
ため、多様な重合体、たとえばセルロース、ポリビニルアルコール、ポリメチル
アクリレート、スルホン化ポリスチレン、スチレンとジビニルベンゼンとのクロ
ロメチル化共重合体（メリフィールド樹脂ン、４−メチルベンゾヒドリルアミン
−１！１ｌｌｉ （ＭＢＨＡ−樹脂）、フェニルアセトアミにメチル樹脂（Ｐａ
ｎ−樹脂）、ｐ−ベンゾオキシベンジルアルコール樹脂、ベンゾヒドリルアミン
樹脂（ＢＨＡ−樹脂）、４＝（ヒドロキシメチル）−ベンゾイルオキシメチル樹
脂、Ｂｒｅｉｐｏｈｌ ａｔ ａｌ、 （Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ−
２８，５６５，１９８７； Ｆａ、 ＢＡＣＨＥＭ）による樹脂、ＨＹＣＲＡＭ
樹脂（Ｆａ、 ０ＲＰＥＧＥＮ）また１よ５ＡＳＲｒＮ樹脂（Ｆａ、 ＢＡＣＨ
ＥＭ ）が適している。
溶液中で行うペプチド合成には、反応条件下に不活性であることが明らかな全て
の溶剤、特に水、Ｎ、 Ｎ′−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ） 、ジメチルス
ルホキシドＣＤＭＳＯ）、アセトニトリル、ジグロロメタン（ＤＣＭ） 、１．
４−ジオキサン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、Ｎ−メチル−２−ピロリドン
（ＮＭＰ）ならびに前記溶剤の混合物が適している。ポリマー担体を用いたペプ
チド合成は、使用したアミノ酸誘導体が可溶性である全ての不活性有機溶剤中で
実施することができるが、付加的に樹脂ａｆＩｉ特性を有する溶剤、たとえばＤ
Ｍ Ｆ 、 Ｄ ＣＭ 、 Ｎ Ｍ Ｐ、アセトニトリルおよびＤ Ｍ Ｓ
Ｏならびにこれらの溶剤の混合物が優れている。
良好な結果の合成の後に、ペプチドをポリマー担体から分離する。多様な樹脂タ
イプを分離することができる条（４Ｊよ、文献に公知である。酸性のパラジウム
接触性分離反応が、最も頻繁に適用され、特に、液状の無水フッ化水素、無水ト
リフルオロメタンスルホン酸、＃またば濃トリフルオロ酢酸中での分離、もしく
シよたとえばモルホリンのような弱塩基の存在で、ＴＨＦまたはＴＨＦ−ＤＣＭ
混合物中で行うパラジウム接触反応が適用される。保護基の選択に応じて、この
保護基は、分離条件下で保持されるか友たは同様の条件下で脱離することができ
る。さらに、特定の誘淳化反応または環化を実施すべぎ場合には、ペプチドの部
分的脱保護が有効である。
新規ペプチド（よ、一部で良好な細胞毒性を示す。このペプチドの他の一部（よ
、細胞ＴＮＦレセプターに対して高い親和性を有するが、細胞毒活性を有してい
ない、従って、これはＴＮＦアンタゴニストである。これは天然のＴＮＦに拮抗
して細胞ＴＮＦレセプターに結合し、ＴＮＦ作用を抑制する。この新規ペプチド
は、新生物疾患および自己免疫疾患の治療ならびに感染、炎症および移植の場合
の拒否反応の治療および予防に使用することができる有用な医薬であることが明
らかになった。ａ単な実験により、個々のペプチドがどのような作用を有するか
を解明することができる。ＴＮＦ感受性細胞を用いてこのペプチドの細胞毒性を
ペプチドの存在で細胞系のインキュベートにより測定する。
第２の実験バッチで番よ、致死ＴＮＦ量の存在で、細胞系を相応するペプチドと
共にインキュベートする。これによりＴＮＦ拮抗作用を検出することができる。
さらに、試験管内結合試験により、細胞ＴＮＦレセプターに対するペプチドの親
和性を測定する。
新規ペプチドのアゴニスト友た番よアンタゴニスト作用に関する生物学的特性の
解明を次に試験系で行った：１、ＴＮＦ感受性指示細胞に対する細胞毒性試験Ｉ
１．ＴＮＦ感受性指示細胞に対する競合細胞毒試験Ｉ Ｉ １．ＴＮＦレセプ
ターである指示細胞に対する競合レセプター結合試験
１、細胞毒性試験
新規ペプチドのアゴニストとしての評価は、ＴＮＦ感受性細胞（たとえばＬ９２
９、ＭＣＦ −７、Ａ２０４、Ｕ９３７）に対する細胞毒性作用に基づ＜、Ｌ９
２９およびＭＣＦ−７を泪いた試験は次のように実施した。
１、 ３〜５×ｌＯゝ個の、トリプシン処理したての、指数的に成長しているＬ
９２９−細胞（マウス）またはＭＣＦ−７−細ｆｆ１ａｌト）を有する培養基１
ｏＯμｌを、９６大の平底の培養プレートの凹みにピペット装入したにのプレー
トを定温器中で３７℃で−晩中インキュベートした。定温器中の水蒸気で飽和し
た空気番よＣＯｚ ５ ＠量％を含んでいた。
Ｌ９２９−培養基は、ＭＥＭ Ｅａｒｌｅ ＩＸ （Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ。
Ｍａｎｎｈｅｉｍ） ５００ ｍ ｌ 、熱により失活化（５６℃で３０分間）
させたウシ胎児血清（Ｆｅ２） ５０ｍ１、Ｌ−グルタミン（２００ｍＭ）５ｍ
ｌ、１００Ｘ非必須アミノ酸５ ｍ ｌ、ＩＭＨｅｐｅｓ−緩衝液ｐＨ７゜２
３ｍｌおよびゲンタマイシン５０ｍｌ（５０ｍｇ／ｍ１）を含有していた。
ＭＣＦ−７−培養基は、ＭＥＭ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ ｌｘ （Ｂｏｅｈｒｉｎｇ
ｅｒ、 Ｍａｎｎｈｅｉｍ） ５００ ｍ ｌ 、熱により失活させた（３０分
、５６℃）Ｆｅ２ １００ｍ１．Ｌ−グルタミン５ ｍ ｌおよび１０ＱＸ非必
須アミノ酸５ ｍ ｌを含有していた。
２、翌日、試験すべきペプチド溶液１００μｍを、この細胞培地に添加し、連続
して２回滴定した。さらに、若干の細胞対照（つまり、ペプチド希釈液で処理し
ていない細胞培地）および若干のｒｈｕ−ＴＮＦ対照（二組換えヒトＴＮＦで処
理した細胞培地）を−緒に設置した０次いで、この培養プレートを３７℃で４８
時間、Ｃ０１５容量％を有する水蒸気で飽和した空気からなる雰囲気中でインキ
ュベートした。
３、ペプチド希釈液で処理した培地中で生き残った細胞のパーセンテージは、ク
リスタルバイオレット染色を用いて測定した。このため、テストプレートをひっ
くり返して、凹みから液体を除去した。それぞれの凹みに、クリスタルバイオレ
ット溶液５０μ】をピペットで入れた。
このクリスタルバイオレット溶液霧よ次の組成を存していた：
クリスタルバイオレット ３．７５ｇ
ＮａＣ１１，７５ｇ
エタノール １６１．５ｍ１
３７％ボルムアルデヒド ４３．２ｍｌ水 全量５００ ｍ ｌ
このクリスタルバイオレット溶液を、この凹みに２０分間滞留させ、次いで同様
にひっくり返して除いた。
引き続き、このプレートをそれぞれ５回水に漬けることで洗浄し、細胞に結合し
ていない染料を除去した。
細胞に結合した染料を試薬溶液１００μｌ（エタノール５０％、氷酢酸０．１％
、水４９．９％）をそれぞれの凹みに添加することで細胞から抽出した。
４、このプレートを５分間振盪させることにより、それぞれの凹みでは、均質に
着色した溶液が得られた。
生き残った細胞を測定するため、個々の凹みの中の着色溶液の吸光度を５４０ｎ
ｍで測定した。
５、その後、細胞対照に関して５０％の細胞毒性値を規定し、５０％の細胞毒性
を引き起こす試料希釈液の逆数を試験試料の細胞重性活性とした。
Ｉｌ、競合−細胞毒性試験
ペプチドのアンタゴニストとしての評価番よ、ｒｈｕ−ＴＮＦのＴＮＦＦＪ受性
細胞（たとえば、Ｌ９２９、ＭＣＦ−７、Ａ２０４、Ｕ９３７）に対する細胞毒
性作用に競合するその特性に基づいている。Ｌ９２．９お１．３〜５Ｘ１０’個
の、トリプシン処理しだての、指数的に成長しているＬ９２９−細胞（マウス）
またはＭＣＦ−７−細胞（ヒト）を有する培養基１００μｍを、９６大の平底の
培養プレートの凹みにピペット装入した。このプレートを定温器中で３７℃で一
晩中インキユベートした。定温器中の水蒸気で飽和した空気はＣ０，５容量％を
含んでいた。
Ｌ９２９−培養基は、 ＭＥＭ Ｅａｒｌｅ ＩＸ （Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ。
Ｍａｎｎｈｅｉｍ） ５００ ｍ ｌ、５６℃で３０分間熱により失活化させた
ＦＣ３５０ｍｌ、Ｌ−グルタミン（２００ｍＭ）５ｍｌ、ｌ ＯＯｘ非必須アミ
ノ酸５ｍｌ、ＩＭＨｅｐｅｓ−８４衝液ｐ８７．２ ３ｍｌおよびゲンタマイシ
ン５００μｌ （５０ｍｇ／ｍｌ）を含有していた。
ＭＣＦ −７−培養基は、ＭＥＭ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ ｌＸ （Ｂｏｅｈｒｉｎ
ｇｅｒ、 Ｍａｎｎｈｅｉｍ） ５００ ｍ ｌ 、熱により失活させた（３０
分、５６℃＞Ｆｅ８ ｌｏｏｍｌ、Ｌ−グルタミン（２００ｍＭ）５ｍｌおよび
１００×非必須アミノ酸５ ｍ ｌを含有していた。
２、翌日、試験すべきペプチド溶液１００μｌを、こ□の細胞培地に添加し、連
続して２回滴定した１次いで、この細胞培地に、細胞培地中で最終濃度において
８０〜１００％の細胞毒性作用を有する培養基中のｒｈｕ−ＴＮＦ＃釈液１００
μｌを添加した。さらに、若干の細胞対照（つまり、ペプチド溶液で処理してい
ないおよびｒｈｕ−ＴＮＦ溶液で処理していない細胞培地）および若干のｒｈｕ
−ＴＮＦ対照（＝ｒｈｕ−ＴＮＦ溶液で処理しただけの細胞培地）を−緒に設置
した。
次いで、この培養プレートを３７℃で４８時間、ＣＯ３５容量％を有する水蒸気
で飽和した空気からなる雰囲気中でインキュベートした。
３、物質溶液で処理した培地中で生き残った細胞のパーセンテージは、クリスタ
ルバイオレット染色を用いて測定した。このため、テストプレートをひつくり返
して、凹みから液体を除去した。それぞれの凹みに、クリスタルバイオレット溶
液５０μ■をとベットで入れた。
このクリスタルバイオレット溶液は１１．３に記載した組成を宥していた。
このクリスタルバイオレット溶液を、この凹みに２０分間滞留させ、次いで同様
にひっくり返して除いた。
引き続き、このプレートをそれぞれ５回水に漬けることで洗浄し、細胞に結合し
ていない染料を除去した。
細胞に結合した染料を試薬溶液１００μｌ （エタノール５０％、氷酢酸０．１
％、水４９．９％）をそれぞれの凹みに添加することで細胞から抽出した。
４、このプレートを５分間振盪させることにより、それぞれの凹みでは、均質に
着色した溶液が得られた。
生き残った細胞を測定するため、個々の凹みの中の着色溶液の吸光度を５４０ｎ
ｍで測定した。
５、その後、細胞対照およびｒｈｕ−ＴＮＦ対照に関して５０％の競合値を規定
し、適用したｒｈｕ−ＴＮＦａ度において、ｒｈｕ−ＴＮＦ細胞毒性の５０％の
競合を起こさせる試料濃度が、試験試料のアンタゴニスト活性とした。
ＩＩｌ、競合−レセプター結合試験
ペプチドのアゴニスト作用もアンタゴニスト作用も、ペプチドがＴＮＦレセプタ
ーに結合することを前提としている。このことば、アゴニストもしくはアンタゴ
ニストの作用を有するペプチドとｒ ｈ ｕ −Ｔ Ｎ Ｆとが、ＴＮＦ−感受
性の指示細胞（たとえばＵ９３７）上のＴＮＦレセプターへの結合をめぐって競
合することを意味している。この競合−レセプター結合試験は次のように実施し
た。
１、試験すべきペプチドならびにｒｈｕ−ＴＮＦ （＝対照ンを異なる濃度で含
有する培地１００μＩを反応容器にピペットで入れた。この培地はＰ Ｂ Ｓ
（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ、 Ｍａｎｎｈｅｉｍ） ５００ ｍ ｌ 、熱により
失活させた（３０分、５６℃）Ｆｅ２ １０ｍ１およびナトリウムアジド１００
ｍ ｇを含有していた。
２、引ぎ続き、′１ヨウ素−標識したｒｈｕ−ＴＮＦｌ ｎ ｇ （Ｂｏｌｔｏ
ｎによるラクトペルオキシダーゼ法）を有する培地１００μｌを、反応容器に入
れ、混合した。
非特異的結合（ＮＳＢ）を測定するために、反応容器中で、目１ヨウ素−標識し
たｒｈｕ−ＴＮＦ （培地１００μｌ中の＋！Ｉヨウ素−ｒｈｕ−ＴＮＦ ｌｎ
ｇ）を、２００倍の過剰量の放射線により標識していないｒｈｕ−ＴＮＦ（培地
１００μｌ中ｒｈｕ−ＴＮＦ ２００ｎｇ）と混合した。
３、次に、Ｕ９３７細胞（ヒト）２Ｘ１０’個を有する培地１００μｌを、反応
容器にピペットで入れ、混合した。この反応容Ｈ（テスト容量３００μｌ）を、
０℃で９０分インキュベートした。４５分後に、この反応バッチを再度十分温合
した。
４、インキュベート時間の後、細胞を４℃で５分間１８００ ｒｐｍで遠心分離
し、培地で３回洗浄し、定量的に計数管に移し、細胞と結合した放射能をＣ１１
ｎｉ Ｇａｍｍａ Ｃｏｕｎｔｅｒ １２７２ （ＬＫＢ Ｗａｌｌａｃ）で測
定した。
５、測定値を非特異的結合だけ校正することにより、全結合に関して５０％の競
合値を規定し、かつ、適用した目５ヨウ素−ｒｈｕ−ＴＮＦ濃度において、１′
ヨウ素−ｒｈｕ−ＴＮＦ結合の５０％の競合を引き起こす試料濃度を、試験試料
の競合活性とした。
次の実施例により、本発明を詳説する。プロテオゲンアミノ酸は、例中で、公知
の三文字コードで略記しである。その他ｌよ次の意味である。
Ａｃ＝酢酸、Ａｈｐ＝７−アミノへブタン酸、Ａｈｘ ＝ ６−アミツヘキナン
酸、入０ｃ＝８−アミノオクタン酸、Ａ ｐ ｅ ＝ ５−アミノペンタン酸、
Ｈｃｙ＝ホモシスティン、Ｏｒｎ＝オルニチン、Ｄａｐ＝２．３−ジアミノプロ
ピオン酸。
Ａ、一般的な作業法
■、請求項１によるペプチドの合成を、固相ペプチド合成の標準方法を用いて、
ＡＰＰＬＩＥＤ ＢｒＯ５ＹＳＴＥＭＳ社の完全自動ペプチド合成装置Ｍｏｄｅ
１１４３ＯＡで実施した。この装置は、Ｂｏｃ〜およびＦｒｎｏｃ−保護基法に
ついて異なる合成サイクルを利用する。
ａ ） Ｂｏｃ−保護基法についての合成サイクル１、ＤＣＭ中の３０％のトリ
フルオロ酢酸１× ３分
２、ＤＣＭ中の５０％のトリフルオロ酢酸１×１７分
３、ＤＣＭ洗浄工程 ５× １分
４、ＤＣＭ中の５％のジイソプロピルエチルアミン１× １分
５、ＮＭＰ中の５％のジイソプロピルエチルアミン１× １分
６、ＮＭＰ洗浄工程 ５Ｘ １分
子、あらかじめ活性化し、保護したアミノ酸の添加（ＮＭＰ／ＤＣＭ中のＤＣＣ
１当量およびＨＯＢｔｌ当量により活性化）；ペプチドカップリング（第１部）
１×１０分
８．２０％のＤＭＳＯの容量割合まで反応混合物にＤＭＳＯを添加
９、ペプチドカップリング（第２部）１×１６分１０、反応温合物にジイソプロ
ピルエチルアミン３゜８当量を添加
１１、ペプチドカップリング（第３部）ＩＸ７分１２、ＤＣＭ洗浄工樫 ３×
１分
１３、不完全な反応の場合、カップリングを繰り返す（５に戻る）
１４、ＤｃＭ中の１０％無水酢酸、５％ジイソプロピルエチルアミン １× ２
分
１５、ＤＣＭ中の１０％の無水酢酸 １× ４分１６、ＤＣＭ洗浄工程 ４Ｘ
１分
１７．１に戻る
ｂ ） Ｆｍｏｃ−保護基法についての合成サイクル１、ＮＭＰ洗浄工程 ＩＸ
１分
２、ＮＭＰ中の２０％のピペリジン ｌｘ ４分３、ＮＭＰ中の２０％のピペリ
ジン Ｉ×１６分４、ＮＭＰ洗浄工程 ５Ｘ １分
５、あらかじめ活性化し、保護したアミノ酸の添加（ＮＭＰ／ＤＣＭ中のＤＣＣ
１当量および）（ＯＢｔｌ当量により活性化）：ペプチドカップリング１×６１
分
６、ＮＭＰ洗浄工程 ３Ｘ １分
７、不完全な反応の場合、カップリングを繰り返す（５に戻る）
８、ト丁ＭＰ中の１０％の無水酢酸 ＬＸ ８分９、ＮＭＰ洗浄工程 ３ｘ １
分
１０．２に戻る
Ｉｌ、Ｉａにより得られたペプチド樹脂の後処理Ｉａにより得られたペプチド樹
脂を真空中で乾燥し、Ｔｅｆｌｏｎ−ＨＦ−装置（ＰＥＮｌＮ５ＵＬＡ社）の反
応容器に移した。
スカベンジャー、有利にアニソール（樹脂１ｇあたりｌ ｍ ｌ ） 、ならび
に、トリプトファン含有のペプチドの場合、インドール性のホルミル基の除去の
ためチオール、有利にエタンジチオール（樹脂１ｇあたり０゜５ｍ１）を添加し
た後、液体Ｎ、で冷却しなからフッ化水素を凝縮させたく樹脂１ｇあたり１０
ｍ ｌ ） 、この混合物を０℃に昇温させ、この温度で４５分間撹拌した。引
き続きフッ化水素を真空中で留去させ、残分を酢酸エステルで洗浄して残留した
スカベンジャーを除去した。このペプチドを３０％の酢酸で抽出し、濾過し、こ
の濾液を凍結乾燥した。
ペプチドヒドラジドを製造するために、このペプチド樹脂（Ｐａｎ−友たはメリ
フィールド樹脂）をＤＭＦに＠濁させ（樹脂１ｇあたり１５ ｍ ｌ ） 、ヒ
ドラジンヒトレート（２０当りを添加した後、室温で２日間撹拌した。後処理の
ために、樹脂を濾別し、濾液を蒸発乾固させた。残分をＤＭＦ／Ｅｔ２０または
Ｍ ｅ ＯＨ／ＥｔｔＯから晶出させた。
Ｉｒ１．Ｉｂにより得られたペプチド樹脂の後処理ｒｂにより得られたペプチド
樹脂を、真空中で乾燥し、引き続きアミノ酸組成に依存して、次の分離処理の１
つを行った（Ｗａｄｅ、 Ｔｒｅｇｅａｒ、 Ｈｏｗａｒｄ Ｆｌｏｒｅｙ Ｆ
ｍ。
ｃ−Ｗｏｒｋｓｈｏｐ Ｍａｎｕａｌ、 Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ １９８５） 。
適当なＴＦＡｉ合物中のペプチド樹脂懸濁液を、室温で上記の時間撹拌し、次い
で、この樹脂を濾別し、ＴＦＡならびにＤＣＭで洗浄した。この濾液および洗浄
溶液を十分に濃縮し、ペプチドをジエチルエーテルの添加により沈殿させた。水
浴で冷却した後、沈殿物を濾別し、３０％酢酸中に取り、凍結乾燥した。
ＩＶ、ペプチドの精製および特性調査
精製を、ゲルクロマトグラフィー（ＳＥＰＨＡＤＥＸＯＧ−１０、Ｇ−１５／］
０ＸＨＯＡｃ； ５ＥＰＨＡＤＥＸＯＬＨ２０／ＭｅＯＨ）および引き続き中圧
クロマトグラフィー（固定相： ＨＤ−５ＩＬ Ｃ−１８、２０−４５μ、 １
００人；移動相： Ａ−０，ｌＸ ＴＦＡ／Ｍｅ□Ｈ，Ｂ＝０．１％ ＴＦ＾／
Ｈ１０での勾配）を用いて行った。
得られた最終生成物の純度は、分析ＨＰＬＣ（固定相： １００Ｘ２．１ｍｍ
ＶＹＤＡＣＣ−１８，５μ、 ３００人；移動相＝ＣＨ，ＣＮ／Ｈ，Ｏ勾１ａ、
ｏ、 ｘｘｒｐＡ−ｃ ｌＬ街、４０’Ｃ）テ測定した。
特性調査のため、アミノ酸分析および高速原子衝撃質量分析を利用した。
Ｂ、特別な作業法
例Ｉ
Ｈ−Ｐｒｏ−Ｇ Ｉｎ−Ａ ｌａ −Ｇ １ ｕ−Ｇ ｌ ｙ−Ｇ Ｉｎ−Ｌｅ
ｕ−ＮＨ２Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−ＭＢＨＡ樹脂１．２ｇ（置換約０．４２ｍｍ。
１／ｇ、０．５ｍｍｏｌのバッチ量に相当）をＡｌａにより、それぞれ２ｍｍｏ
ｌの
Ｂｏｃ−Ｇｌｎ−ＯＨＢｏｃ−Ａｌａ−０）１と反応させた。
合成が完了した後、ペプチド樹脂のＮ−末端を脱保護しくＡＩａによる工程１〜
３の実施）、真空中で乾燥した；収率は１．４９ｇであった。
こうして得られた樹脂０．７５ｇをＡＩＩによるＨＦ分割にかけた。この粗製生
成物（１４１ｍｇ）をゲル濾過（５ＥＰＨＡＤＨＸ■Ｇ−１０）および中圧クロ
マトグラフィー（ＡＩＶ参照；２０−４０％ Ａ、０．２５１ ％ｗｉｎ−’
）により精製した。９７ｍｇの最終生成物が得られた。
例２
＾Ｃ−＾１ａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｉｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｒ＋−ＯＨＦｍｏｃ−Ｇ
ｉｎ−ｐ−アルコキシベンジルアルコール樹脂０゜４７ｇ（置換約０．５３ｍｍ
ｏ Ｉ／ ｇ、０．２５ｍｍ０１のバッチ量に相当）をＡｌｂにより、それぞれ
１ｍｏｌ
Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨＦｍｏｃ−Ｇｌｕ［ＯｔＢｕ）−０８Ｆｍｏｅ−Ｇｌｎ
−ＯＨＦｍｏｃ−ｘｌａ−ＯＨＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−０）１
と反応させた。
合成が完了した後、Ｎ−末端をアセチル化した（Ａｒｂによる工程２〜４および
８〜９の実施）、得られたペプチド樹脂を真空中で乾燥し、この収率は０．５７
ｇであった。
ＡＩＩＩによるＴＦＡ分離により得られた組成ペプチド（１３７ｍｇ）を、ゲル
濾過（ＳＥＰ）ＩＡＤＥＸ＠ Ｇ−１０）および中圧クロマトグラフィー（ＡＩ
Ｖ参照；２０〜４０％、０．２５％ｍ１ｎ−’）で精製した。純粋生成物８９ｍ
ｇが得られた。
ｇ４１および２と同様に次のものを製造することができた：
＋２． Ａｃ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｉｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−ＮＨ２１３
、Ｈ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇ
ｌｙ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｓ氏|Ａｒｇ−Ａｒｇ−
Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｌａ−ＯＨ１５、Ｈ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａ
ｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｔ
ｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｓ氏|Ａｒｇ−Ａｒｇ−
Ａｌａ−ＡＳｎ−ＡＩａ’Ｎ）＋２
１６、 Ａｃ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇ
ｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−`ｓｎ−Ａｒｇ−
Ａｒ９−Ａｌａ−ＡＳｎ−＾１ ａ−ＮＨ２Ｈｏｅ−Ｃｙｓ（ｐＭＢ）−ＭＢ）
ＩＡ樹脂０．５２ｇ（置換約０． ９７ｍｍｏ ｌ／ｇ、０．５ｍｍｏ １のバ
ッチ量に相当）をＡＩａによりそれぞれ２ｍｍｏｌの
と反応させた０合成の終了後、Ｎ−末端をアセチル化した（Ａｌａによる工程１
〜６および１４〜１６の実施）。
得られたペプチド樹脂を真空中で乾燥させた。収量は１．３ｇであフた。
こうして得られた樹脂０．６５ｇをＡｌｌによりＨＦ分離を行フた。凍結乾燥し
た粗製生成物を０，１％酢酸２１中に取り、引き続きアンモニア水を用いてｐＨ
を８−４に調節した。アルゴン界囲気下で０．０１Ｎ ＫＪＦｅ（ＣＮ）−］溶
液を黄緑色の呈色が１５分以上持続するように徐々に漬加した。なお１時間後撹
拌し、次いで氷酢酸でｐｉ（４，５に酸性にし、アニオン交換体（ＢＩＯＲＡＤ
Ｏ３Ｘ４Ａ、クロリド形）の水性懸濁液１５ｍ１を添加した。３０分後に、この
イオン交換樹脂を濾別し、濾液を回転蒸発器で１００ ｍ、 Ｉに濃縮し、引き
続き凍結乾燥した。
使用した全ての溶剤１よ、あらかじめ窒素で飽和して、場合により起こる遊離シ
スティン基の酸化を回避した。
この粗製生成物をゲルクロマトグラフィー（５ＥＰＨＡＤＥＸ■Ｌｌ（−２０）
で精製した。純粋生成物１７ｍ、ｇが得られた。
例１７）同様に、次のものを製造することができた（ペプチド酸の製造のために
ＰＡＭ樹脂を使用した）。
１Ｂ、Ｈ−Ｃ，ｙＳ−Ｖａｔ−Ｖａｔ−ＡＩａ−ＡＳｎ−ＰｒＯ−Ｇｉｎ−Ａｌ
ａ−ＧＩＵ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ２３． ＡＣ−Ｃｙｓ−ｐｒｏ−Ｇｉｎ−Ａｌａ−
ＧＩＬＩ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｌ４ｕ−ＣｙＳ−ＮＨ２２９、Ｈ−Ａｌａ−Ｈｊｓ
−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ
−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙ刀|
３０、Ａｃ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌ
ｎ−１ａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙ刀|
−Ｌｅｕ−ＡＳｎ−ＮＨ２
３４、ＡＣ−１１Ｊｓ−ＡＳｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−ＧＩＬＩ−Ｇｌｙ−
Ｇｌｎ−ＬｅＵ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−ＣｙＳ−ＮＨ２ＡＣ−ＬｙＳ−Ｐｒｏ−Ｇｌ
ｎ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−ＧＩｙ−Ｇｉｎ−ＬｅＬＪ−Ａｓｐ−ＮＨ２ブライボール
（Ｂｒｅｉｐｏｈｌ ｅｔ ａｔ、、 ＢＡＣＨＥＭ社）による樹脂１ ｇ （
０，５ｍｍｏ ｌのバッチ量に相当）をＡＩｂにより、それぞれ２ｍｍｏｌの
Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕｌ−ＯＨＦｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨＦｍｏｃ−Ｇｌｙ
−ＯＨＦｍｏｃ−ＬｙＳ （Ｂｏｃ ｌ−ＯＨＦｍｏｃ−Ｇｌｕｌ−０ＨＦ １
−ＯＨと反応させた６合成の終了後、Ｎ末端をアセチル化した（ＡＩｂによる工
程２〜４および８〜９を実施）。
このペプチド樹脂を真空中で乾燥した；収量】、６２ＡＩＩＩによるＴＦＡ分離
により得られた粗製生成物（４２５ｍｇ）を精製し、脱ガスＤＭＦ５００ｍｌ中
に溶かした。 ＮＥｔｉＯ、−２４ｒｎ ｌおよび一２５℃でジフェニルホスボ
リルアジド０．２４ｍ１を添加した後、−２５℃で２時間撹拌した。その後、−
２０℃で２日間、４℃で２日問および室温で２日間放置した。次いで蒸発乾固さ
せ、この粗製ペプチドをゲルクロ７トグラフイー（ＳＥＰＩ（ＡＤＥＸＯＬＨ２
０）により精製した。単離した単量体（１７５ｍｇ）をＡＩＩによるＨＦで脱保
護し、中圧クロマトグラフィー（ＡＩＶ参照、２０〜３５％、０．２５％ｍ１ｎ
−’）で精製した。純粋生成物５８ ｍ ｇが得られた。
Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）メリフィールド樹脂２．４４ｇ（置換約０．４１
ｍｍｏ １７ｇ、バッチ量の１ｍｍｏｌに相当）をＡＩｂにより、それぞれ４ｍ
ｍｏｌのＦｍｏｃ−Ｇｌｎ−ＯＨＦｍｏｃ−Ｇｉｎ−ＯＨＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｏ
ＨＦｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨと反応させた。
引き続き、ｔ−ブチル−およびＢｏｃ保護基を分離した（Ａｒａによる工程１〜
６の実施）、樹脂での環化【よ、ＮＭＰ中で、ＢＯＰＩ−７７ｇおよびジイソプ
ロピルエチルアミン１．７４ｍ１を添加しながら行った（４８時間）、このペプ
チドをＮ−末端脱保護しくＡｒｂによる工程２〜４の実施）、真空中で乾燥させ
た。収量は３．０５ｇであった。
ＡＩｒによるＥ（Ｆ分離により得られた粗製生成物を、ゲル濾過（ＳＥＰＨＡＤ
ＥＸ［Ｆ］ Ｇ−２５）および中圧クロマトグラフィー（ＡｒＶ参照；２０〜４
０；０．２５ｍ１ｎ−’）で精製した。純粋生成物３２Ｋが得られた。
例４２および４３と同様に、次のものをｔｉｎすることができた：
５２、 ＡＣ−ＨＩＳ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−ＡＳｐ−ＡＳｎ−ＰｒＯ−Ｇｌｎ−Ａ
ｌａ−Ｇ＋ＬＩ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｏａｐ|
ＬｅＬＩ−＾５ｎ−ＮＨ２
５４、Ａｃ−ＬｙＳ−Ｐｒｏ−Ｇｉｎ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｉｎ−Ｌｅ
ＬＩ−Ａｓｐ−ＮＨ２ｆＰＪ５５
Ｐｒｏ−Ｇｉｎ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｉｎ−Ｌｅｕ−ＡｏｃＦｍｏｃ−
Ｌｅｕ−ｐ−アルコキシベンジルアルコール樹脂１゜２２に（置換約（１４１ｍ
ｍｏ ｌ／ｇ、パッチ量の０゜５ｍｍｏｌに相当）をＡｌｂにより、それぞれ２
ｍｍＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨＦｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨＦｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｚ
ｌ １−ＯＨＦｍｏｃ−＾ＱＣ−ＯＨと反応させた０合成の終了後、ペプチド樹
脂をＮ−末端脱保護しくＡＩｂによる工程２〜４の実施）、引き続き真空中で乾
燥した。収量は１．５３ｇであフた。
ＡＩＩＩによるＴＦＡ分離により得られた粗製ペプチドを、脱ガスしたＤＭＦ５
００ｍｌに溶かした。 ＮａＨＣｏ、２１０ｍｇおよびジフェニルホスホリルア
ジド０．２４ｍ１ （−２５℃で）添加した後、−２５℃で２時間および室温で
２日間撹拌した０次いで、蒸発乾固させ、粗製ペプチドを、ゲルクロマトグラフ
ィー（ＳＥＰＨＡＤＥＸＯＬ）Ｉ ２０）により精製した。この単離した単量体
を、ＡＩＩによるＨＦ分離で脱保護し、中圧クロマトグラフィー（ＡＩＶ参照；
２５〜４５％、０．２５％ｍ１ｎ−’）でＭ製した。８４ｍｇの粗製生成物が得
られた。
例５５と同様に、次のものを製造することができた。
５６、Ａｓｎ−ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｌ＠ｕ−Ｇ
ｌｎ−Ａｈｐ第１図：ポリマー担体を使ったＢｏｃ保護基法Ｂｏｃ＝ｔ−ブチロ
キシカルボニル保護基ＳＧ＝側鎖保護基
Ｒ＝二アミノ側饋
第２図：ポリマー担体を使ったＦｍｏｃ−保護基法Ｆｍｏｃ＝９−フルオレニル
メチロキシカルボニル保護基ＳＧ＝側鎖保護基
Ｒ＝アミノ酸側鎖
国＠調審］１１１失
□、□１灯ｌ四８９１０１４６６