JPH04502308A - 新規ｔｎｆペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 新＠ＴＮＦペプチド 本発明１よ腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）から誘導した新規のペプチド、その製造およ びその医薬としての用途に関する。

Ｃａｒｓｗｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ−（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ ｉ、　ＵＳＡ７２、３６６６、１９７５　）により、あらかじめミニバクテリア 菌株ガルメット・ゲラン（Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）　（ＢＣＧ）で霧 染させたエンドトキシン処理した動物の直溝ｌよ、７ウスの多様な腫瘍において 出血性壊死を引き起こすことが報告された。この活性番よ腫瘍壊死因子にあると された。ＴＮＦは、試験管内で形質転換した多数の細胞系に対して静細胞性また は細胞毒性の作用を示すが、正常なヒトおよび動物の細胞系はそれによって作用 されない（Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　Ｖｏｌ、　２．　ｐｐ　２ ３５−２７５゜Ａｃａｄｓｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８ １）　、最近では、生化学的特性の解明およびヒトＴＮＦの遺伝子について記載 されている（　Ｎａｔｕｒｅ　３１２．７２４．１９８４；　Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｗ、　２６０．２３４５，１９８５；　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ 、　１３．６３６１゜１９８５）　。

これらのデータから、成熟したヒトＴＮＦについて、次のタンパク質構造を導き 出すことができる。

Ｖａ　ｌ　ＡｒｇＳｅｒＳｅｒＳｅｒＡｒｇＴｈｒＰｒｏＳｅｒＡｓｐＬｙｓＰ ｒｏＶａ　ｌ　Ａ　ｌ　ａＨｉ　ｓＶａ　ｌ　Ｖａ　Ｉ　Ａ@１　ａＡｓｎＰｒ 。

Ｇ　Ｉ　ｎＡｌ　ａＧ　ｌ　ｕＧ　１ｙＧ　ｌ　ｎＬｅｕＧ　ｌ　ｎＴｒｐＬｅ ｕＡｓｒ＋ＡｒｇＡｒｇＡ　ｌ　ａＡＳｎＡ　ｌ　ａＬｅｕkｅｕＡ　ｌ　ａＡ ＳｎＧ　Ｉ　Ｙ Ｖａ　ｌ　Ｇ　ｌ　ｕＬｅｕＡｒｇＡｓｐＡｓｎＧ　ｌ　ｎＬｅｕＶａ　ｌ　Ｖ ａ　ｌ　ＰｒｏＳｅｒＧ　ｌ　ｕＧ　ｌ　ｙＬｅｕＴｙｒＬ■普@Ｉ　ｌ　ｅ　 ＴｙｒＳｅｒ Ｇ１ｎＶａｌＬｅｕＰｈｅＬｙｓＧ１ｙＧｌｎＧ１ｙＣｙｓＰｒｏＳｅｒ丁ｈｒ ＨｉｓＶａＩＬｅｕＬｅｕＴｈｒＨｉｓＴｈｒｒｌｅＳｅｒＡｒｇ　Ｉ　ｌ　ｅ Ａ　ｌ　ａＶａ　Ｉ　５ｅｒＴｙ　ｒＧ　ｌ　ｎＴｈｒＬｙｓｖａ　Ｉ　ＡＳｎ ＬｅｕＬｅｕＳｅｒＡ　１　ａ　h　ｌ　ｅＬｙｓｓｅｒＰｒ。

ＣｙｓＧ　１　ｎＡｒｇＧ　ｌ　ｕＴｈｒＰｒｏＧ　ｌｕＧ　ｌ　ｙＡ　ｌ　ａ Ｇ　１　ｕＡ　１　ａＬｙＳＰｒｏＴｒｐＴｙｒＧ　１　ｕoｒｏ　Ｉ　１ｅＴ ｙｒＬｅｕ Ｇ　ｌ　ｙＧ　ｌ　ｙＶａ　ｌ　ＰｈｅＧ　ｌ　ｎＬｅｕＧ　ｌ　ｕＬｙｓＧ　 ｌ　ｙＡｓｐＡｒｇＬｅｕＳｅｒＡ　１　ａＧ　ｌ　ｕ　Ｉ@ｌ　ｅＡｓｎＡｒ ｇＰｒｏＡｓｐ ＴｙｒＬｅｕＡｓｐＰｈｅｘ　１　ａＧ　１　ｕｓｅｒＧ　ｌ　ｙＧ　ｌ　ｎＶ ａ　ｌ　ＴｙｒＰｈｅＧ　１　ｙ　［ｌ　ｅ　Ｉ　ｌ　ｅＡ@ｌ　ａＬｅｕ さらに、ウシ、ウサギおよびマウスのＴＮＦ遺伝子が記載されている（Ｃｏｌｄ 　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｓｙｍｐ、　Ｑｕａｎｔ。

Ｂｉｏｌ、　５１．５９７．１９８６）　。

ＴＮＦはその細胞毒性のほかに、炎症反応に関与すル主因子ノ一ツである（Ｐｈ ａｒｍａｃ、　Ｒｅｓ、　５．１２９．１９８８）、動物モデルにおいて、ＴＮ Ｆの関与は、敗血性のショックの場合（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２９．８６９．１９ ８５）および抗宿主移植片症（Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１６６、１２８０． １９８７）の場合に認められた。

極めて低い分子量のペプチドが有利な特性を有することが見出された。

本発明の目的は、式！＝ Ｘ−Ａ−Ｙ　！ ［式中、Ａは、 を表し、 Ｘｉｉ、基：Ｇ−１Ｇ−ＮＨ−ＣＨＭ−ＧＯ−、Ｇ−ＮＨ−ＣＨＭ−ＧＯ−Ｗ− １Ｇ−Ｒ−ＮＨ−ＣＨＭ−ＣＯ−またばＧ−Ｒ−Ｎｌ（−Ｃ）ＩＭ−ＣＯ−Ｗ− を表し、およびＹは、基：　−Ｚ、　−ＮＨ−ＣＨＱ−Ｇｏ−Ｚ、　−ｖ−ＮＨ −ＣＨＱ−Ｇｏ−Ｚ、　−ＮＨ−ＣＩ（Ｑ−ＣＯ−Ｕ−Ｚ　＊たｊ！−Ｖ−ＮＨ −Ｃ）ｔＱ−Ｇｏ−Ｕ−Ｚ　ヲ表し、その際、ＸおよびＹにおいて、 Ｇは、水素原子またはアミノ保護基を表し、Ｚｌよ、ＯＨ−また番よＮＨ，茎皮 たはカルボキシル保護基を表し、またば ＧおよびＺは、−緒になって、共有結合または基ニーＣ０−（ＣＨｄ、−ＮＨ− を表しくただしａは１〜１２の数を表す）Ｒ，ＵおよびＷば、１〜４個の天然由 来のα−アミノ酸からのペプチド鎖を表し、 ■は、１〜１０個の天然由来のα−アミノ酸からのペプチド鎖を表し、および ＭおよびＱｌ！、水素原子または基ニ ーＣＨ（ＣＨ３１，、−ＣＨ（ＣＨ３１−Ｃ２Ｈ５，−Ｃ６Ｈ５，−ＣＨ（ＯＨ Ｉ−ＣＨ３゜は０Ｈ−１ＣＨ，０−１Ｃ）［、Ｓ−、（ＣＨ，）、ＣＨ−１Ｃｓ Ｈｓ−１ｐ−ＨＯ−ＣａＨ４−１）［５−１Ｈ，Ｈ−１ＨＯ−ＣＯ−１＋（、Ｎ −ＧＯ−１Ｈ！Ｎ−Ｃ（＝Ｎ）ｌ）−ＮＨ−を表す）を表し、または ＭおよびＱは一緒になって−（ＣＬ）　、−３−Ｓ−（Ｃ１（、）、−１−（Ｃ Ｌ）、−ＧＯ−ＮＨ−（Ｃ）ｌり　、−または−（Ｃ）［ｔ）、−Ｎ）ｌ−ＣＯ −（ＣＨ，）、−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨｚ）　ｌ−架橋基（ただし、Ｃおよびｄは １〜４の数を表し、ｅおよびｆは１〜６の数を表し、ｇは１〜１２の数を表す） を表す］のペプチド、ならびに生理学的に認容性の酸とのその塩である。

式１のペプチドは、Ｌ−アミノ酸から構成されているが、しかし１〜２個のＤ− アミノ酸を含有していてもよい、三官能性アミノ酸の側鎖は、保護基を有するか または保護されていないで存在していてもよい。

生理学的に認容性の酸として、特に次のものが挙げられる。

塩酸、クエン酸、酒石酸、乳酸、リン酸、メタンスルホン酸、酢酸、ギ酸、マレ イン酸、フフル酸、リンゴ酸、コハク酸、マロン酸、硫酸、Ｌ−グルタミン酸、 Ｌ−アスパラギン酸、無性ブドウ酸、粘液酸、安息昏酸、グルクロン酸、シュウ 酸、アスコルビン酸、アセチルグリシン。

新規ペプチドは、開鎖であってもよ＜　（Ｇ＝Ｈ、アミノ酸保護基；　Ｚ　＝Ｏ Ｈ，ＮＨｍ、カルボキシル保護基；ＭおよびＱは相互に結合していない）かつ特 にジスルフィド架橋であってもよ＜（Ｇ＝Ｈ、アミノ保護基；Ｚ　＝ＯＨ，ＮＨ ，、カルボキシ保護基、　Ｍ　＋Ｑ　＝−（ＣＨ，）、−５−ｓ−（ＣＨｔ）　 、＋　）または側鎖架橋であってもよ＜　ＣＧ＝Ｈ、アミノ保護基、Ｚ　＝ＯＨ ，ＮＨ，、カルボキシ保護基、Ｍ＋　Ｑ　”−（ＣＨｚ）　、−ＮＨ−Ｃｏ−（ ＣＨｔ）＋−または−（ＣＨｔ）−ＮＨ−ＧＯ−（ＣＨＩ）、−ＮＨ−ＧＯ−（ ＣＨＩ）ｌ−）　、または、頭−尾結合していてもよい（Ｇ＋Ｚ＝共有結合また は−Ｃｏ（ＣＨ，）、−ＮＨ）　。

新規化合４ｅＮよペプチド化学て公知の方法により製造することができる。

ペプチド番よ、逐次的にアミノ酸からまた番よ好適な小さいペプチドの７ラグメ ント結合により形成することができる。逐次的構成の際に、ペプチド鎖番よＣ末 端で開始し、段階的にその都度１個のアミノ酸を延長する。

フラグメントカップリングの際、種々の長さの７ラグメントを相互に結合させる ことができ、この場合、フラグメント−ｔ＋マた、アミノ酸からの逐次的構成に よりまた１ヨ７ラグメントカツプリングにより得られる。環状ペプチド番よ、開 鎖ペプチドの合成後に、高い希釈度で実施する環化反応により得られる。

逐次的構成でも、友たフラグメントカップリングでも、構成要素をアミド結合の 形成により結合しなければならない、このためにＪｉ、酵素的方法および化学的 方法が適している。

アミド結合を形成するための化学的方法ば、Ｍｕｅｌｌｅｒ、Ｍｅｔｈｏｄｅｎ 　ｄｅｒ　Ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ　Ｃｈａｓｔｅ　Ｖｏｌ　ＸＶ／２．　ｐｐ 　１−３６４．　Ｔｈｉｅｍｅ　Ｖｅｒｌａｇ、　Ｓｕｔｔｇａｒｔ、　１９７ ４；　Ｓｔｅｗａｒｔ、　Ｙ。

ｕｎｇ、　５ｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、　 ｐｐ　３１−３４．７１−８２．Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａ ｎｙ、　Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、　１９８４；　Ｒｏｄａｎｓｚｋｙ、　ＩＣ１ａｕ ｓｎｅｒ、　０ｎｄｅｔｔｉ、　Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、　ｐｐ ８５−１２８．　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、 　１９７６　および他のペプチド化学の標準的論文に詳しく扱われている。特に 優れているのは、アジド法、対称および混合アンヒドリド法、その場で生成もし くは予備形成される活性エステルならびにカップリング試薬（活性剤）、特にジ シクロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（Ｄ ＩＣ）、１−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリン（ ＥＥＤＱ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミ ドヒドロクロリド（ＥＤＣＩ）、ｎ−プロパンホスホン酸無水物（ＰＰＡ）　、 Ｎ、Ｎ−ビス（２−オキソ−３−オキサゾリジニル）アミドリン酸クロリド（Ｂ ＯＰ−ＣＩ）、ジフェニルホスボリルアジド（ＤＰＰＡ）、キャストロ試薬（Ｃ ａｓｔｒｏ’ｓ　Ｒｅａｇｅｎｚ　；　Ｂ　ＯＰ　）　、Ｏ−ｘ、ンゾトリアゾ リルーＮ、Ｎ、Ｎ’　、Ｎ’　−テトラメチルウロニウム塩（Ｉ（ＢＴＵ）、２ ．５−ジフェニル−２，３−ジヒドロ−３−才キソー４−ヒドロキシチオフェン ジオキシド（Ｓｔｅｇｌｉｃｈｓ　Ｒｅａｇｅｎｚ　；　ＨＯＴ　Ｄ　Ｏ）およ び１゜１′−カルボニル−ジイミダゾール（ＣＤＩ）を用いるアミド結合形成で ある。カップリング試薬は、単独でまたは添加物、たとえばＮ、Ｎ’　−ジメチ ル−４−アミノピリジン（ＤＭＡＰ）、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（Ｈ ＯＢｔ）、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアジン（ＨＯＯＢｔ）、Ｎ−ヒドロキシス クシンイミド（ＨＯＳ　ｕ　）または２−ヒドロキシピリジンと組み合わせて使 用することができる。

一般に酵素的ペプチド合成の場合、保護基を使わなくてもよいが、化学的合成の 場合、アミド結合形成に関与しない双方の反応成分の反応性官能基の可逆的保護 が必要である。化学的ペプチド合成の場合、文献により公知の３つのａｌ［方法 が優れている：ベンジルオキシカルボニル（・ｚン一、ｔ−ブチルオキシカルボ ニル（Ｂｏａ　）−および９−フルオロエニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏ ｃ）−保護基法、それぞれ、連鎖が延長する構成要素のα−アミノ官能基の保護 基である。

三官能性アミノ―の側鎖保護基は、それが必然的にα−アミノ酸保護基と一緒に 脱離されないように選択される。アミノ酸保護基に関する詳細番よ、Ｍｕｅｌ　 ｌｅｒ、　Ｍｅｔｈｏｄｅｎ　ｄｅｒ　Ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ　Ｃｈｅｍｉｅ 　Ｖｏｌ　ＸＶ／１．　ｐｐ　２０−９０６゜Ｔｈｉｅｍｅ　Ｙｅｒｌａｇ、　 Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、　１９７４に記載されている。

ペプチド鎖の構成に有用な構成要素は、溶液中で、！！濁液中でまたはメリフィ ールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）によるＪ、　Ａｍｅｒ、　Ｃｈｅ＋ａ、　Ｓｏ ｃ、　８５．２１４９．１９６３に記載されたような方法により反応させること ができる０反応成分を溶液中で反応させて、逐次的にまたはフラグメントカップ リングにより２−１Ｂｏｃ−またはＦｍｏｃ−保護基法を適用しながらペプチド を構成する方法ならびに前記のメリフィールド法と同様に、反応成分を不溶のポ リマー担体（以下樹脂ともいう）に結合させて反応させる方法が特に優れている 。この場合、ペプチドをＢｏｃ−またはＦｍｏｃ−保護基法を適用してポリマー 担体に構成させるのが代表的であり、その際成長するペプチド鎖は、Ｃ末端で不 溶性樹脂粒子と共有結合している（第１図および第２図参照）、この操作法番よ 、試薬および副生成物を濾過により除去することができ、従って中間生成物の再 結晶番よ不必要である。

この保護したアミノ酸は任意の適当な重合体に結合させることができ、この重合 体は、使用する溶剤中に不溶性であり、かつ間車な濾過が可能な物理的に安定な 形を有していなければならない、この重合体ｌヨ、保護した最初のアミノ酸と共 有結合により固（結合することのできる官能基を有していな（すればならない、 このため、多様な重合体、たとえばセルロース、ポリビニルアルコール、ポリメ チルアクリレート、スルホン化ポリスチレン、スチレンとジビニルベンゼンとの タロロメチル化共重合体くメリフィールド樹脂）、４一メチルベンゾヒドリルア ミンー樹脂ＣＭＢＨＡ−１１１１８）、フェニルアセトアミドメチル樹脂（Ｐａ ｎ−樹脂）、ｐ−ペンゾオキシベンジルアルコール樹脂、ベンゾヒドリルアミン 樹脂（ＢＨＡ−樹脂）、４−（ヒドロキシメチル）−ベンゾイルオキシメチル樹 脂、Ｂｒｅｉｐｏｈｌ　ｅｔ　ａｌ、　（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、 　２８．５６５，１９８７；　Ｆａ、　ＢＡＣ）ＩＥＭ）による樹脂、■ＹＣＲ ＡＭ樹脂（Ｆａ、　０ＲＰＥＧＥＮ）または５ＡＳＲＩＮ樹脂（Ｆａ、　ＢＡＣ ＨＥＭ）が適している。

溶液中で行うペプチド合成には、反応条件下に不活性であることが明らかな全て の溶剤、特に水、Ｎ、Ｎ′−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホ キシド（ＤＭＳＯ）、アセトニトリル、ジクロロメタン（ＤＣＭ）　、ｌ、４− ジオキサン、テトラヒドロフラン（ＴＥ（Ｆ）、Ｎ−メチル−２〜ピロリドン（ ＮＭＰ）ならびに前記溶剤の混合物が適している。ポリ７−担体を用いたペプチ ド合成は、使用したアミノ酸誘導体が可溶性である全ての不活性有機溶剤中で実 施することができるが、付加的に樹脂膨潤特性を有する溶剤、たとえばＤＭＦ、 ＤＣＭ、ＮＭＰ、アセトニトリルおよびＤＭＳＯならびにこれらの溶剤の混合物 が優れている。

良好な結果の合成の後に、ペプチドをポリマー担体から分離する。多様な樹脂タ イプを分離することができる条件は、文献に公知である。酸性のパラジウム接触 性分離反応が、最も頻繁に適用され、特に、液状の無水フッ化水素、無水トリフ ルオロメタンスルホン酸、希または濃トリフルオロ酢酸中での分離、もしくはた とえばモルホリンのような弱塩基の存在で、ＴＨＦまたはＴＨＦ−ＤＣＭ混合物 中で行うパラジウム接触反応が適用される。保護基の選択に応じて、この保護基 は、分離条件下で保持されるかまたは同様の条件下で脱離することができる。さ らに、特定の誘導化反応または環化を実施すべき場合には、ペプチドの部分的脱 保護が有効である。

新規ペプチドは、一部で良好な細胞毒性を示す、このペプチドの他の一部は、細 胞ＴＮＦレセプターに対して高い親和性を有するが、細胞毒活性を有していない 、従って、これはＴＩＪＦアンタゴニストである。これば天然のＴＮＦに拮抗し て細胞ＴＮＦレセプターに結合し、ＴＮＦ作用を抑制する。この新規ペプチド番 よ、新生物疾患および自己免疫疾患の治療ならびに感染、炎症および移植の場合 の拒否反応の治療および予防に使用することができる有用な医薬であることが明 らかになった。筒革な実験により、個々のペプチドがどのような作用を有するか を解明することができる。ＴＮＦ感受感受性合胞いてこのペプチドの細胞毒性を ペプチドの存在で細胞系のインキュベートにより測定する。

第２の実験バッチでは、致死ＴＮＦ量の存在で、細胞県会相応するペプチドと共 にインキュベートする。これによりＴＮＦ拮抗作用を検出することができる。さ らに、試験管内結合試験により、細胞ＴＮＦレセプターに対するペプチドの親和 性を測定する。

新規ペプチドのアゴニストまたはアンタゴニスト作用に関する生物学的特性の解 明を次に試験系で行った：１、ＴＮＦｇ受性指示細胞に対する細胞毒性試験Ｉ　 １．ＴＮＦ感受性指示細胞に対する競合細胞毒試験ｒ　ｆ　Ｉ　、　ＴＮ’Ｆレ セプターである指示細胞に対する競合レセプター結合試験 ！、細胞毒性試験 新規ペプチドのアゴニストとしての評価は、ＴＮＦ感受性細胞（たとえばＬ９２ ９、ＭＣＦ−７、Ａ２０４、Ｕ９３７）に対する細胞毒性作用に基づく、Ｌ９２ ．９およびＭＣＦ−７を用いた試験（よ次のように実施した。

１、　３〜５Ｘ１０”個の、トリプシン処理したての、指数的に成長しているＬ ９２９−細胞（マウス）また（よＭＣＦ−７−細胞（ヒト）を有する培養基１０ ０μｍを、９６大の平底の培養プレートの凹みにピペット装入した。このプレー トを定温器中で３７℃で一晩中インキユベートした。定温器中の水蒸気で飽和し た空気ばＣ０１５容量％を含んでいた。

Ｌ９２９−培養基は、ｌｊＥＭ　Ｅａｒｌｅ　ＩＸ　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ。

Ｍａｎｎｈｅｉｍ）　５００　ｍ　ｌ　、熱により失活化（５６℃で３０分間） させたウシ胎児血清（Ｆｅ２）　５０ｍ１゜Ｌ−グルタミン（２００ｍＭ）５ｍ ｌ、１ｏｏｘ非必須アミノ酸５ｍｌ、ＬＭ　Ｈｅｐｅｓ−ａ街液ｐＨ７゜２３ｍ １およびゲンタマイシン５０ｍｌ（５０ｍｇ／ｍ１）を含有していた。

ＭＣＦ−７−培養基は、ＭＥＭ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ　ＩＸ　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇ ｅｒ、　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）　５００　ｍ　ｌ　、熱により失活させた（３０分 、５６℃）ＦＣ３１００ｍｌ、Ｌ−グルタミン５　ｍ　ｌおよび１００×非必須 アミノ酸５ｍｌを含有していた。

２、翌日、試験すべきペプチド溶液１００μｌを、この細胞培地に添加し、連続 して２回漬定した。さらに、若干の細胞対照（つまり、ペプチド希釈液で処理し ていない細胞培地）および若干のｒｈｕ−ＴＮＦ対照（＝組換えヒトＴＮＦで処 理した細胞培地）を−緒に設置した１次いで、この培養プレートを３７℃で４８ 時間、ＧＯ１５容量％を有する水蒸気で飽和した空気からなる雰囲気中でインキ ュベートした。

３、ペプチド希釈液で処理した培地中で生き残った細胞のパーセンテージは、ク リスタルバイオレット染色を用いて測定した。このため、テストプレートをひつ くり返して、凹みから液体を除去した。それぞれの凹みに、クリスタルバイオレ ット溶液５０μｌをとベットで入れた。

このクリスタルバイオレット溶液は次の組成を存していた： クリスタルバイオレット　３．７５ｇ ＮａＣ１１，７５ｇ エタノール　１６１．５ｍ１ ３７％ホルムアルデヒド　４３．２ｍｌ水　全量５００ｍ１ このクリスタルバイオレット溶液を、この凹みに２０分間滞留させ、次いで同様 にひつくり返して除いた。

引き続き、このプレートをそれぞれ５回水に漬けることで洗浄し、細胞に結合し ていない染料を除去した。

細胞に結合した染料を試薬溶液１００μｌ（エタノール５０％、氷酢酸０．１％ 、水４９．９％）をそれぞれの凹みに添加することで細胞から抽出した。

４、このプレートを５分間振盪させることにより、それぞれの凹みで］よ、均質 に着色した溶液が得られた。

生き残った細胞を測定するため、個々の凹みの中の着色溶液の吸光度を５４０ｎ ｍで測定した。

５、その後、細胞対照に関して５０％の細胞毒性値を規定し、５０％の細胞毒性 を引き起こす試料希釈液の逆数を試験試料の細胞毒性活性とした。

Ｉｌ、競合−細胞毒性試験 ペプチドのアンタゴニストとしての評価は、ｒｈｕ−ＴＮＦのＴＮＦ感受性細胞 （たとえば、Ｌ９２９、ＭＣＦ−７、Ａ２０４、Ｕ９３７）に対する細胞毒性作 用に競合するその特性に基づいている。Ｌ９２９およびＭＣＦ−７−細胞を用い たこの競合−細胞毒性試験は、次のように実施した。

１．３〜５Ｘ１０’個の、トリプシン処理したでの、指数的に成長しているＬ９ ２９−細胞（マウス）またはＭＣＦ−７−細胞（ヒト）を有する培養基１００μ ｌを、９６大の平底の培養プレートの凹みにピペット装入した。このプレートを 定温器中で３７℃で一晩中インキユベートした。定温器中の水蒸気で飽和した空 気はＣ０１５容量％を含んでいた。

Ｌ９２９−培養基は、ＨＥＭ　Ｅａｒｌｅ　ＬＸ　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ。

Ｍａｎｎｈｅｉｍ）　５００　ｍ　ｌ、５６℃で３０分間熱により失活化させた ＦＣ３５０ｍｌ、Ｌ−グルタミン（２００ｍＭ）５ｍｌ、１ＯＯＸ非必須アミノ 酸５ｍｌ、ＩＭ　Ｈｅ　ｐ　ｅ　ｓ　−１１衝液ｐＨ７，２３ｍｌおよびゲンタ マイシン５００μｌ　（５０ｍｇ／ｍ　！　）を含有していた。

ＭＣＦ−７−培養基は、ＭＥＭ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ　ＩＸ　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇ ｅｒ、　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）　５００　ｍ　ｌ　、熱により失活させた（３０分 、５６℃）Ｆｅ２　１００瓜１．Ｌ−グルタミン（２００ｍＭ）５ｍｌおよび１ ００Ｘ非必須アミノ酸５　ｍ　ｌを含有していた。

２、翌日、試験すべきペプチド溶液１００μｌを、この細胞培地に添加し、連続 して２回滴定した０次いで、この細胞培地に、細胞培地中で最終濃度において８ ０〜１００％の細胞毒性作用を存する培養基中のｒｈｕ−ＴＮＦ希釈液１００μ ｍを添加した。さらに、若干の細胞対照（つまり、ペプチド溶液で処理していな いおよびｒｈｕ−ＴＮＦＮａ液で処理していない細胞培地）および若干のｒｈｕ −ＴＮＦ対照（＝ｒｈｕ−ＴＮＦ溶液で処理しただけの細胞培地）を−緒に設置 した。

次いで、この培養プレートを３７℃で４８時間、Ｃ０，５容量％を有する水蒸気 で飽和した空気からなる雰囲気中でインキュベートした。

３、物質溶液で処理した培地中で生き残った細胞のパーセンテージは、クリスタ ルバイオレット染色を用いて測定した。このため、テストプレートをひつくり返 して、凹みから液体を除去した。それぞれの凹みに、クリスタルバイオレット溶 液５０μｍをピペットで入れた。

このクリスタルバイオレット溶液番よＩｌ、３に記載した組成を有していた。

このクリスタルバイオレット溶液を、この凹みに２０分間滞留させ、次いで同様 にひつくり返して除いた。

引き続き、このプレートをそれぞれ５回水に漬けることで洗浄し、細胞に結合し ていない染料を除去した。

細胞に結合した染料を試薬溶液１００μｌ（エタノール５０％、氷酢酸０．１％ 、水４９．９％）をそれぞれの凹みに添加することで細胞から抽出した。

４、このプレートを５分間振盪させることにより、それぞれの凹みでは、均質に 着色した溶液が得られた。

生き残った細胞を測定するため、個々の凹みの中の着色溶液の吸光度を５４０ｎ ｍで測定した。

５、その後、細胞対照およびｒｈｕ−ＴＮＦ対照に関して５０％の競合値を規定 し、適用したｒｈｕ−ＴＮＦ濃度において、ｒｈｕ−ＴＮＦ細胞毒性の５０％の 競合を起こさせる試料濃度が、試験試料のアンタゴニスト活性とした。

ＩＩｌ、競合−レセプター結合試験 ペプチドのアゴニスト作用もアンタゴニスト作用も、ペプチドがＴＮＦレセプタ ーに結合することを前提としている。このことは、アゴニストもしく（よアンタ ゴニストの作用を有するペプチドとｒｈｕ−ＴＮＦとが、ＴＮＦ−感受性の指示 細胞（たとえばＵ９３７）上のＴＮＦレセプターへの結合をめぐフて競合するこ とを意味している。この競合−レセプター結合試験は次のように実施した。

】５試験すべきペプチドならびにｒｈｕ−ＴＮＦ　（＝対照）を異なる濃度で含 有する培地１００μＩを反応容器にピペットで入れた。この培地はＰ　Ｂ　Ｓ　 （Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ、　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）　５００　ｍ　ｌ　、熱により 失活させた（３０分、５６℃）ＦＣ３ＩＯｍｌおよびナトリウムアジドｌｏｏｍ ｇを含有していた。

２、引き続き、′！′ヨウ素−標識したｒ　ｈ　ｕ　−Ｔ　Ｎ　Ｆｌ　ｎ　ｇ　 （Ｂｏｌｔｏｎによるラクトペルオキシダーゼ法）を有する培地１００μｌを、 反応容器に入れ、混合した。

非特異的結合（ＮＳＢ）を測定するために、反応容器中で、目１ヨウ素−標識し たｒｈｕ−ＴＮＦ（培地１００μｌ中の１１′ヨウ素−ｒ　ｈ　ｕ　−Ｔ　Ｎ　 Ｆ　１　ｎ　ｇ　）を、２００倍の過剰量の放射線により標識していないｒｈｕ −ＴＮＦ（培地ｔｏｏμ＋中ｒｈｕ−ＴＮＦ　２００ｎｇ）と混合した。

３、次に、Ｕ９３７細胞（ヒト）２ｘｌＯ’個を有する培地１００μｍを、反応 容器にとベットで入れ、温合した。この反応容器（テスト容量３００μｌ）を、 ０℃で９０分インキュベートした。４５分後に、この反応バッチを再度十分混合 した。

４、インキュベート時間の後、細胞を４℃で５分間１８００ｒｐｍで遠心分離し 、培地で３回洗浄し、定量的に計数管に移し、細胞と結合した放射能をＣ１１ｎ ｉ　（ｉａｍｍａ　Ｃｏｕｎｔｅｒ　１．２７２　（ＬＫＢ　Ｗａｌｌａｃ）で 測定した。

５．１ｊｔｌ定値を非特異的結合だけ校正することにより、全結合に関して５０ ％の競合値を規定し、かつ、適用したロ１ヨウ素−ｒｈ、ｕ−ＴＮＦ濃度におい て、ロ１ヨウ素−ｒｈｕ−ＴＮＦ結合の５０％の競合を引き起こす試料濃度を、 試験試料の競合活性とした。

次の実施例により、本発明を詳説する。プロテオゲンアミノ酸番よ、例中で、公 知の三文字コードで略記しである。その他は次の意味である。

Ａ　ａ　ｄ士α−アミノオクタン酸、Ａ　ｃ　＝酢酸、Ａｄｅ＝１０−アミノデ カン酸、Ａｈｐ＝７−アミンへブタン酸、人ｈｘ＝６−アミノヘキサン酸、Ａ　 ｎ　ｏ　＝　９−γミノノナン酸、Ａ　ｏ　ｃ　＝　８−アミノオクタン酸、Ｂ ａ１＝β−アラニン、ＨＣＹ＝ホモシスティン、Ｈ１ｙ＝ホモリシン、Ｏｒｎ＝ オルニチン、Ｄａｐ＝２゜３−ジアミノプロピオン酸。

人、一般的な作業法 ■、請求項１によるペプチドの合或会、固相ペプチド合成の標準方法を用いて、 ＡＰＰＬＩＥＤ　ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ社の完全自動ペプチド合成装置Ｍｏｄｅ １１４３ＯＡで実施した。この装置（よ、Ｂｏａ−およびＦｍｏｃ−保護基法に ついて異なる合成サイクルを利用する。

ａ　）　Ｂｏｃ−保護基法についての合成サイクル１、ＤＣＭ中の３０％のトリ フルオロ酢酸ＩＸ　３分 ２、ＤＣＭ中の５０％のトリフルオロ酢酸１ｘ１７分 ３、ＤＣＭ洗浄工程　５Ｘ　１分 ４、ＤＣＭ中の５％のジイソプロピルエチルアミン１×　１分 ５、ＮＭＰ中の５％のジイソプロピルエチルアミン７、あらかじめ活性化し、保 護したアミノ酸の添加（ＮＭＰ／ＤＣＭ中のＤＣ０１当量およびＨＯＢｔＬ当量 により活性化）；ペプチドカップリング（第１部）ＩＸ３０分 ８．２０％のＤＭＳＯの容量側合皮で反応温合物にＤＭＳＯを添加 ９、ペプチドカップリング（第２Ｍ）ＩＸ１６分１０、反応混合嵜にジイソプロ ピルエチルアミン３゜８当量を添加 １１、ペプチドカップリング（第３部）１×　７分１２、ＤＣＭ洗浄工程　３Ｘ 　１分 １３、不完全な反応の場合、カップリングを繰り返す（５に戻る） １４、ＤＣＭ中の１０％無水酢酸、５％ジイソプロピルエチルアミン　１×　２ 分 １５、ＤｃＭ中の１０％の無水酢酸　１×　４分１６、ＤＣＭｆｉ浄工程　４× 　１分 １７．１に戻る ｂ　）　Ｆｍｏｃ〜保護基法についての合成サイクル１、ＮＭＰ洗浄工程　ＬＸ 　１分 ２．ＮＭＰ中の２０％のピペリジン　１×　４分３、ＮＭＰ中の２０％のピペリ ジン　ＩＸＬ６分４、ＮＭＰ洗浄工Ｎ　５　ｘ　１分 ５、あらかじめ活性化し、保護したアミノ酸の添加（ＮＭＰ／ＤＣＭ中のＤＣ０ １当量お上びＨＯＢｔｌ当量により活性化）；ペプチドカップリング１×６１分 ６、ＮＭＰ洗浄工程　３ｘ　１分 子、不完全な反応の場合、カップリングを繰り返す（５に戻る） ８、ＮＭＰ中の１０％の無水酢酸　ｌＸ　８分９、ＮＭＰ洗浄工程　３×　１分 １０．２に戻る Ｉｌ、Ｉａにより得られたペプチド樹脂の後処理Ｉａにより得られたペプチド樹 脂を真空中で乾燥し、Ｔｅｆｌｏｎ−ＨＦ−装置（ＰＥＮｌＮ５ＵＬＡ社）の反 応容器に移した。

スカベンジャー、有利にアニソール（樹脂１ｇあたり１　ｍ　Ｉ　ン、ならびに 、トリプトファン含有のペプチドの場合、インドール性のホルミル基の除去のた めチオール、有利にエタンジチオール（樹脂１ｇあたり０゜５ｍ１）を添加した 後、液体Ｎ、で冷却しながらフッ化水素を凝縮させた（樹脂１ｇあたり１０ｍ１ ）、この混合物を０℃に昇温させ、この温度で４５分間撹拌した。引き続きフッ 化水素を真空中で留去させ、残分を酢酸エステルで洗浄して残留したスカベンジ ャーを除去した。このペプチドを３０％の酢酸で抽出し、濾過し、この濾液を凍 結乾燥した。

ペプチドヒドラジドを製造するために、このペプチドｍ脂（Ｐａ＠−またはメリ フィールド樹脂）をＤＭＦに懸濁させ（樹脂１ｇあたり１５ｍ１）、ヒドラジン ヒトレート（２０当量）を添加した後、室温で２日間撹拌した。後処理のために 、樹脂を濾別し、濾液を蒸発乾固させた。残分をＤＭＦ／Ｅ　ｔｗｏまたばＭ　 ｅ　ＯＨ／Ｅｔ、Ｏから晶出させた。

ＩＩｌ、Ｉｂにより得られたペプチド樹脂の後処理ｒｂにより得られたペプチド 樹脂を、真空中で乾燥し、引き続きアミノ酸組成に依存して、次の分離処理の１ つを行った（　Ｗａｄｅ、　Ｔｒｅｇｅａｒ、■ａｗａｒｄ　Ｆｌｏｒｅｙ　Ｆ ｍ。

ｃ−Ｗｏｒｋｓｈｏｐ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ　１９８５）　。

適当なＴＦＡ混合物中のペプチド樹脂懸濁液を、室温で上記の時間撹拌し、次い で、この樹脂を濾別し、ＴＦＡならびにＤＣＭで洗浄した。この濾液および洗浄 溶液を十分に濃縮し、ペプチドをジエチルエーテルの添加により沈殿させた。水 浴で冷却した後、沈殿物を濾別し、３０％酢酸中に取り、凍結乾燥した。

ＴＶ、ペプチドの精製および特性調査 ＭＫを、ゲルクロマトグラフ　イー（５ＥＰ）［ＡＤＥＸ■Ｇ−１０、Ｇ−１５ ／１０％ＨＯＡｃ；　５ＥＰＨＡＤＥＸＯＬＨ２０／ＭｅＯＨ）および引き続き 中圧クロマトグラフィー（固定相、　ＨＤ−３ＩＬ　Ｃ−１８、２０−４５μ、 　１００人：移動相：　Ａ＝０．１％　ＴＦＡ／Ｍｅａｌ（、Ｂ＝０．１％ＴＦ Ａ／Ｈ１Ｏでの勾配）を用いて行った。

得られた最終生成當の純度番よ、分析ＨＰＬＣ（固定相：　１００Ｘ２．１ｍｍ 　ＶＹＤＡＣＣ−１８，５μ、　３００人；移動相＝ＣＨ，ＣＭ／Ｈ，Ｏ勾Ｅ、 ０−ＩＸＴＦＡ７！Ｍ街、４０℃）テ測定シタ。

特性調査のため、アミノ酸分析および高速原子衝撃質量分析を利用した。

Ｂ、特別な作業法 倒１ Ｈ−Ｔｌｅ−Ａｓｎ−＾ｒ９−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−ＩＪＵ−Ａｓｐ−ＮＨ ２Ｂｏｃ−Ａｓｐ（ＯＣｈｘ）−ＭＢＨＡ樹脂０．９８ｇ（置換約０．−５１ｍ ｍｏ　ｌ／ｇ、０．５ｍｍｏ　ｌのバッチ量に相当）をＡ　Ｉ　ａにより、それ ぞれ２ｍｍｏｌの８ｏｃ−Ａｓｐ（ＯＣｈｘ）−０ＨＢｏｃ−１１ｅ−ＯＨＢｏ ｃ−ｐｒｏ−ＯＨ と反応させた。

合成が完了した後、ペプチド樹脂のＮ−末端を脱保護しくＡＩａによる工程１〜 ３の実施）、真空中で乾燥した；収率は１．６ｇであった。

こうして得られた樹脂０．８ｇを、ＡｌｌによるＨＦ分離にかけた。この粗製生 成物（１９０ｍｇ）をゲル濾過（ＳＥＰ）［ＡＤＨＸ■Ｇ−１０）および中圧ク ロマトグラフィー（Ａ　Ｉ　Ｖ参照、１５−３０％Ａ；０．２５％ｗｉｎ−１） により精製した。９７ｍｇの最終生成嵜が得られた。

！２ Ａｃ−５ｅｒ−＾１ａ−Ｇｌｕ−１１ｅ−＾５ｎ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｅ−Ｔ ｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−＾１ａ−Ｇｌｕ−ＯＨＦｍｏｃ−Ｇｌｕ（Ｏｔ Ｂｕ）−ｐ−アルコキシヘンシルアルコール樹脂０．４６ｇ（置換約０．５５ｍ ｍｏ　ｌ／１，０゜２５ｍｍｏｌのバッチ量に相当）をＡｌｂにより、それぞれ １ｍｍｏｌ Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨＦｍ０Ｃ−ＬｙＳ（ＢｏＯ−ＯＨＦｍｏｃ−４ｉａ−Ｏ ＨＦｍｏｃ−ρｈｅ−ＯＨＦｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨＦｍｏｃ−Ｇ　ｌ　ｕ　（Ｏ ｔＢｕ　ｌ−ＯＨＦｍＯＣ−Ａｓｐ（１−０ＨＦ’−ＯＨＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ｏ ＨＦｍｏｃ−＾１ａ−ＯＨＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨＦｍｏｃ−＾５ｎ−ＯＨＦｍ ｏｃ−５＠ｒ（ｔＢｕｌ−ＯｈＦｍｏｃ−丁ｙｒ（ｔＢｕｌ−０）１ と反応させた。

合成が完了した後、Ｎ−末端をアセチル化した（ＡＩｂによる工程２〜４および ８〜９の実施）、得られたペプチド樹脂を真空中で乾燥し、この収率は０．７ｇ であった。

ＡＩＩＩによるＴＦＡ分離により得られた粗製ペプチド（２６８ｍｇ）を、ゲル 濾過（ＳＥＰＨＡｔｌＥＸＯＧ−１０）および中圧クロマトグラフィー（ＡＩＶ 参照、４０〜６０％、Ｏ，’２５％ｍ１ｎ−’）”Ｃ’精製した。純粋生成物１ ４７ｍｇが得られた。

例】および２と同様に次のものを製造することができた： ３、　Ｈ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−１１ｅ−ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ −Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−３ｅｒ−Ｇｌ凵|Ｇｌｎ− Ｖａｌ−Ｔｙｒ−ＯＨ ｈ、Ａｃ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−１１ｅ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ −Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−５ｅｒ−Ｇｌ凵|Ｇｌｎ− ｖａ　ｌ　−Ｔｙｒ−ＮＨ２ ５、Ｈ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ− Ｐｒｏ−Ａｓｐ−丁ｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ａｌａ|Ｇｌｕ− ８、Ａｃ−［１ｅ−＾ｓｎ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−＾５ｐ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ −０８例１９ Ａｅ−Ｈｃｙ−ＡＳｎ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−＾５ｐ−Ｔｙｒ−ＨＣｙ−ＮＨ２Ｂｏ ｃ−Ｈｙｓ　（ｐＭＢ）−ＭＢＨＡ樹脂０．４０ｇ　（置換約１．２４ｍｍｏ　 ｌ／ｇ、０．５ｍｍｏ　ｌのバッチ量に相当）をＡＩａによりそれぞれ２ｍｍｏ ＋の Ｂｏｃ−Ｔｙｒ　（Ｂｒ−Ｚ　１−ＯＨＳａｃ−Ａｒｇ　（Ｔｏｓ　ｌ−０ＨＢ ｏｃ−Ａｓｐ（ＯＣｈｘ）−０Ｈ８ｏｃ−Ａｓｎ−ＯＨＢｏＣ−Ｐｒｏ−ＯＨｓ ａｃ−Ｈｃｙ（ｐＭａｌ−Ｏｓと反応させた１合成の終了後、Ｎ−末端をアセチ ル化した（Ａｌａによる工程１〜６および１４〜１６の実施）。

得られたペプチド樹脂を真空中で乾燥させた：収量は１，１ｇであった。

こうして得られた樹脂を、ＡＩＩによりＨＦ分離を行った。凍結乾燥した粗製生 成物を、１モル尿素水溶液ｌｌ中に取り、引き続きアンモニア水を用いてｐ）Ｉ を８．４に調節した。１！温で４日間撹拌した後、氷酢酸でｐ）（４，５に酸性 にし、このペプチドをＲＰ−Ｃ，、材料上に吸着させ、引き続きメタノールで溶 離し、この溶離液を回転蒸発器で濃縮し、その後凍結乾燥させた。

使用した全ての溶剤は、あらかじめ窒素で飽和して、場合により起こる遊離シス ティン基の酸化を回避した。

この比較的著しく不純物を含んだ粗製生成物を中圧クロマトグラフィー（ＡＩＶ 参照；３０〜６０％Ａ；０．２５％ｍ１ｎ−’）で精製した。純粋生成樹６１ｍ ｇが得られた６ 例１９と同様に、次のものを製造することができた（ペプチド酸の製造のために ＰＡＭ樹脂を使用した）：２０、　Ｈ−Ｃｙｓ−１１＠−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｐｒ ｏ−＾３ｐ−Ｔｙｒ−ＣｙＳ−ＯＨ２】、＾ｃ−Ｃｙｓ−１１ｅ−＾ｓｎ−＾ｒ ９−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−ＣＹＳ−ＮＨ２２２、Ｈ−Ｈｃｙ−１１ｅ−＾ｓ ｎ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−リｒ−Ｈｃｙ−ＯＨ２３、Ａｃ−Ｈｃｙ−Ｉ】ｅ −＾ｓｎ−＾ｒ９−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔ７ｒ−ＨＣｙ−ＮＨ２２４、Ｈ−Ｈｃｙ −Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−＾５ｐ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｈｃｙ−ＯＨ２５、＾ｃ −Ｈｃｙ−＾ｓｎ−Ａｒｇ−ｐｒｏ−＾ｓｐ−↑ｙｒ−ＬＵＪ−ＨＣｙ−ＮＨ２ ２９、Ａｃ−Ｈｃｙ−Ｔｈｒ−ＡＳｐ−Ｇｌｙ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｈｌｓ−Ｌｅ ｕ−Ｈｃｙ−ＮＨ２３０、Ｈ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｈｃｙ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｐｒ ｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｈｃｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−＾１ａ−ＯＨ３＋、Ａｅ−＾１ ａ−Ｇｌｕ−Ｈｃｙ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−＾５ｐ−ｒｙｒ−Ｈｃｙ−＾ｓ ｐ−ＰＭ−ＡＩＪ−ＮＨ２４８、　Ａｃ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−５ｅｒ−Ｇ ｌｙ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−聞２４９、Ｈ−ＣｙＳ−Ａｌａ−Ｇｉｌｄ−５＠ｒ−Ｇ ｌｙ−Ｇｉｎ−ＣｙＳ−ＮＨ２ｉ５０ ＾Ｃ−Ａｓｐ−ＡＳｎ−＾ｒ９−Ｐｒｏ−ＡＳｐ−Ｔｙｒ−Ｏｒｎ−ＮＨ２プラ イポール（Ｂｒｅｉｐｏｈｌ　ｅｔ　ａｌ、、　ＢＡＣＨＥＭ社）による樹脂１ 　ｇ　（０，５ｍｍｏ　ｌのバッチ量に相当）をＡＩｂにより、それぞれ２ｍｍ ｏｌの Ｆｍｏｃ−Ｏｒｎ［Ｂｏｃｌ−ＯＨＦｍＯＣ−Ａｒ９（Ｍｔｒ）−０ＨＦｍｏｃ −’ｒｙｒ　［ｔＢｕｌ−ＯＨＦｍｏｃ−Ａｓｎ−ＯＨＦｍｏｃ−Ａｓｐ［０Ｂ ｚｌ　１−ＯＨＦｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕｌ−ＯＨと反応させた０合成の終了 後、Ｎ末端をアセチル化した（ＡＩｂによる工程２〜４および８〜９を実施）。

このペプチド樹脂を真空中で乾燥した。収量１．５ｇ。

ＡＩＩＩによるＴＦＡ分離（こより得られた粗製生成物（３２１ｍｇ）を精製し 、脱ガスＤ　Ｍ　Ｆ　５００　ｍ　ｌ中に溶かした。トリエチルアミン０．２ｍ ｌおよび一２５℃でジフェニルホスホリルアジド０．２ｍｌを添加した後、−２ ５℃で２時間撹拌した。引き続き、−２０℃で２日間、４℃で２日問および室温 で２日間放置した０次いで蒸発乾固させ、この粗製ペプチドをゲルクロマトグラ フィ−（ＳＥＰＨＡＤＥＸＯＬＨ２０）により精製した。単離した単量体（１２ ８ｍ　ｇ　）をＡＩＩによるＨＦで脱保護し、中圧クロ７トグラフイー（ＡＩＶ 参照、２５〜４５％Ａ；０．２５％ｍ１ｎ−’）で精製した。純粋生成物７７　 ｍ　ｇが得られた。

例５１ ＡＣ−５ｅｒ−＃１ａ−Ｇｆｕ−Ａｓｐ−ＡＳｎ−Ａｒ９−Ｐｒｏ−＾ｓｐ−Ｔ ｙｒ−Ｏｒｎ−Ａｓｐ−ＰＭ−Ａ　ｌ　ａ−ＯＨＢｏｃ−Ａｌａ−メリフィール ド樹脂２．２２ｇ（置換約０゜２７ｍｍ０１／ｇ、バッチ量の０．６ｍｍｏｌに 相当）をＡＩａおよびＡＩｂにより、それぞれ２．４ｍｍ。

ｌの と反応させた。Ｎ末端をアセチル化した（Ａｌｂによる工程２〜４および８〜９ を実施）。

引き続き、ｔ−ブチル−およびＢｏｃ保護基を分離した（ＡＩａによる工程１〜 ６の実施）、Ｆｌｔ脂での環化は、ＮＭＰ中で、ＢＯＰｌ、０６ｇおよｔＦジイ ソニア’０ビルエチルアミン１．０５ｍ１を添加しながら行った（２４時間）、 収量は１９７ｇであった。ＡＩ　ＩによるＨＦ分離することにより得られた粗製 生成物を、ゲル瀘Ｍ　（ＳＥＰＩ（ＡＤＥＸ［Ｆ］　Ｇ−２５）および中圧クロ マトグラフィー（ＡＩＶ参照；４０〜６０　；０．２５ｍ１ｎ＝１）で精製した 。純粋生成物１２ｍｇが得られた。

例５０および５１と同様に、次のものを製造することができた： ５２、　ｘｃ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−＾ｒ９−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−ＬｙＳ−Ｎ Ｈ２５３、Ｈ−Ｇｌｕ−＾５ｎ−Ａｒ９−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−リｒ−ＬｙＳ−ＯＨ ５４、Ａｃ−０ｒｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−＋１ｅ−Ｐｒｏ−Ｈｌｓ−Ｇｌｕ−ＮＨ ２５５、Ａｃ−０ｒｎ−Ａｓｐ−Ｇ１ｙ４１ｅ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−ＯＨ ５６、＾Ｃ−Ａｓｐ−＾１ｎ−Ａｒ９−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｏａ ｐ−Ｎ１４２５７、ＡＣ−＾ａｄ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−＾５ｐ−Ｔｙｒ−Ｈｌｙ− ＮＨ２５８、＾Ｃ−５ｅｒ−＾１ａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−＾ｓｎ−＾ｒｇ−Ｐｒｏ −＾５ｐ−Ｔｙｒ−Ｏｒｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ａ　ｌ　ａ−ＮＨ２５９、ＡＣ− ＾Ｓρ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−０−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｏａｐ−ＮＨ ２Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ　（ＯＢｚ　Ｉ）−１）−アルコキシベンジルアルコール樹 脂１．２２ｇ（置換約０．４１ｍｍｏ　ｌ／ｇ、バッチ量の０．５ｍｍｏｌに相 当）をＡＩｂにより、それぞれ２ｍｍｏｌの Ｆｍｏｃ−＾ｒｇ（Ｍｔｒｌ−ＯＨＦｍｏｃ−Ａｈｘ−ＯＨＦｍｏｃ−＾５ｎ− ＯＨＦｍｏｃ−０−Ｔｙｒ（ｔＢｕｌ−ＯＨと反応させた０合成の終了後、ペプ チド樹脂をＮ−末端脱保護しく人１ｂによる実施）、引き続き真空中で乾燥した 。収量は１．５ｇであった。

ＡＩＩＩによるＴＦＡ分離により得られた粗製ペプチドを、脱ガスしたＤ　Ｍ　 Ｆ　５００　ｍ　ｌに溶かした。　ＮａＨＣｏ、２１０ｍｇおよび一２５℃でジ フェニルホスホリルアジド０．２ｍｌ添加した後、−２５℃で２時間および室温 で２日間撹拌した０次いで、蒸発乾固させ、粗製ペプチドを、ゲルクロマトグラ フィー（ＳＥＰ）ＩＡＤＨＸ■　Ｌｌ（２０）により精製した。この単離した単 量体く１２７　ｍ　ｇ　）を、ＡＩＩによるＨＦ分離で脱保護し、中圧クロマト グラフィー（ＡＩＶ参照；５５〜７５％、０゜２５％ｍｉｎ”−’）で精製した 。７８ｍｇ（７）粗製生成Ｓが得られた。

例６５と同様に、次のものを製造することができた。

７１、　■１ｅ−＾ｓｎ−＾ｒｇ−Ｐｒｏ−ＡＳｐ−丁ｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ− Ｐｈｅ−＾１ａ−Ｇｌｕ−５ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｖａｔ|Ｔｙｒ−＾ｈｐ 第１第１ボ：ポリマー担使ったＢｏｃ保護基法Ｂｏｃ＝ｔ−ブチロキシカルボニ ル保護基ＳＧ＝側鎖保護基 Ｒ；アミノ酸側鎮 第２図：ポリマー担体を使ったＦｍｏｃ−保護基法Ｆｍｏｃ＝９−フルオレニル メチロキシカルボニル保護基ＳＧ＝側鎖保護基 Ｒ＝二アミノ側鎖 国際調査ｍ告 −一−−−−＾帥−―−１１ａ、’ＧＣ’ｒ／Ｆ’Ｅ　８９１０Ｍ７２国際調査 報告 訂／ＥＰ　８９１０１４７２

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. １．式Ｉ： ｘ−Ａ−ＹＩ 「式中、Ａは 【配列があります】または【配列があります】を表し、 Ｘは、基：【配列があります】またば【配列があります】を表し、および Ｙは、基：−Ｚ、−ＮＨ−ＣＨＱ−ＣＯ−Ｚ、−Ｖ−ＮＨ−ＣＨＱ−ＣＯ−Ｚ、 −ＮＨ−ＣＨＱ−ＣＯ−Ｕ−Ｚまたは−Ｖ−ＮＨ−ＣＨＱ−ＣＯ−Ｕ−Ｚを表し 、その際、Ｘお上びＹにおいて、 Ｇは、水素原子またはアミノ保護基を表し、Ｚは、ＯＨ−またはＮＨ２基または カルボキシル保護基を表し、または ＧおよびＺは一緒になって、共有結合または基：−ＣＯ−（ＣＨ２）■−ＮＨ− を表し、その際ａは１〜１２の数を表し、 Ｒ、ＵおよびＷは、１〜４の天然由来のα−アミノ酸を表し、 Ｖは、１〜１０の天然由来のａ−アミノ酸からのべブチド鎖を表し、 ＭおよびＱは、水素原子または基： −ＣＨ（ＣＨ３）２，−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｃ２Ｈ５，−Ｃ６Ｈ５，−ＣＨ（ＯＨ ）−ＣＨ３，▲数式、化学式、表等があります▼，▲数式、化学式、表等があり ます▼または▲数式、化学式、表等があります▼（ただし、ｂは１〜６の数を表 し、Ｔは水素原子またはＯＨ−、ＣＨ３Ｏ−、ＣＨ３Ｓ−、（ＣＨ３）２ＣＨ− 、Ｃ６Ｈ５−、ｐ−ＨＯ−Ｃ６Ｈ４−、ＨＳ−、Ｈ２Ｎ−、ＨＯ−ＣＯ−、Ｈ２ Ｎ−ＣＯ−、Ｈ２Ｎ−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ−基を表す）を表すか、または ＭおよびＱは一緒になって−（ＣＨ２）ｃ−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ２）ｄ−、−（ＣＨ ２）ｅ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｆ−または−（ＣＨ２）■−ＮＨ−ＣＯ−（Ｃ Ｈ２）■−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｆ−架橋基（ただし、ｃおよびｄは１〜４の 数を表し、ｅおよびｆは１〜６の数を表し、ｇは１〜１２の数を表す）を表す］ のペプチド、ならびに生理学的に認容性の酸とのその塩。
2. ２．Ｇは水素原子またはアミノ保護基を表し、Ｚはヒドロキシ−またはアミノ基 またはカルボキシル保護基を表し、ＭおよびＱは相互に結合していない請求項１ 記載のペプチド。
3. ３．Ｇは水素原子またはアミノ保護基を表し、Ｚはヒドロキシ−またはアミノ基 またはカルボキシル保護基を表し、ＭおよびＱは一緒になって、−（ＣＨ２）ｃ −Ｓ−Ｓ−（ＣＨ２）４−架橋基を表す請求項１記載のペプチド。
4. ４．Ｇは水素原子またはアミノ保護基を表し、Ｚはヒドロキシ−またはアミノ基 またはカルボキシル保護基を表し、ＭおよびＱは一緒になって、基−（ＣＨ２） ■−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｆ−または−（ＣＨ２）■ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２） ６−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｆ−を表す請求項１記載のペプチド。
5. ５．ＧおよびＺは一緒になって共有結合または−ＣＯ−（ＣＨ２）■−ＮＨ−を 表す請求項１記載のペプチド。
6. ６．疾患の治療に使用する請求項１から５までのいずれか１項記載のペプチド。
7. ７．新生物性疾患および自己免疫疾患の治療ならびに感染、炎症および移植の際 の拒否反応の治療および予防のための請求項１から５までのいずれか１項記載の ペプチドの用途。
8. ８．ペプチド化学で公知の方法によよ製造する請求項１から５までのいずれか１ 項記載のペプチドの製法。