JPH04502325A

JPH04502325A - Ｈｉｖ−１又はｈｉｖ−２抗体の存在又は量の確定方法、免疫特異的試薬、合成ペプチド、診断用キット、ｈｉｖ−１又はｈｉｖ−２抗体の調製方法、免疫原及び抗体

Info

Publication number: JPH04502325A
Application number: JP2501588A
Authority: JP
Inventors: フォルモソ，カール; オルセン，デュアン　エイ．
Original assignee: クラリティ　テクノロジーズ　インコーポレイテッド
Priority date: 1988-12-20
Filing date: 1989-12-15
Publication date: 1992-04-23
Anticipated expiration: 2014-12-27
Also published as: EP0449955B1; CA2005955A1; CA2005955C; AU641375B2; JP2994031B2; DE68925909D1; AU4816690A; EP0449955A1; DE68925909T2; WO1990007119A1; ATE135113T1; EP0449955A4

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】合成ＨＩＶ様ペジペプチドの組成及び使用発明の分野本発明は、ヒト免疫不全ウィルス（“ＨＩＶ”）抗原の抗体結合特異性を有する合成ペプチドに関するものであり、より詳細に言うならば、本発明は天然ＨＩＶペプチドの成る配列異型（ｖａｒｉａｎｔ）は、単独で又は担体蛋白質に化学的に結合した形で使用され、ＨＩＶ抗体を検出するためのイムノアッセイに用いられるとき、天然配列ペプチドと同等の又はそれよりすぐれた試薬を提供するという発見に関する。

本発明はさらに、機器を使用することなくＨＩＶに対する抗体を迅速に目で検出し得る診断法に合成ペプチド及び／又はペプチド蛋白質結合物を使用するという方法にも関する。

発明の背景ヒト免疫不全ウィルス１型（“ＨＩＶ”）が後天性免疫不全症候群（“ＡＩＤＳ “）の病原物質であることが１９８３年［バレーシヌッシ（Ｂａｒｒｅ−３ｉｎｏｕｓｓｉ　）ら、サイエンス２２０巻８６８−８７１ページ、１９８３］及び１９８４年［ガｏ　（Ｇａｒｏ）ら、サイエンス２２４巻５００−５０３ページ、１９８４年］に確認された。ヒト免疫不全ウィルス２型（“ＨＩＶ−２”）は１９８６年に確認され、中央及び西アフリカのＡＩＤＳの重要な原因であり［クラベル（Ｃ１ａｖｅｌ）ら、サイエンス２２３巻、３４３−３４６ページコ、ヨーロッパ［ブルックチー（Ｂｒｕｃｋｎｅｒ）ら、ランセット（Ｌａｎｃｅｔ　）　ｉ　：　２２３ページ、１９８７；サイセット（Ｓａｉｍｔ）ら、ランセットＩ：６８８．１９８８］及び米国　にュージ＋−シ　ＭＭＷＲ８７巻３３−３５ページ、１９８８）でも若干の報告症例がある。

２種類のレトロウィルスは速い突然変異［バーン（Ｈａｈｎ）ら、サイエンス２３２巻１５４８−１５５３ページ、１９８６；ウエンーサイウング（ｔｅｎ−Ｈｓｉｕｎｇ）ら、多型を示し、ＤＮＡ配列決定によってＨＩＶ−１の１３以上の菌株とＨＩＶ−２の４菌株が特徴づけられた［マイヤース（Ｍｙｃｒｓ）ら、ヒトレトロウィルスとＡＩＤＳ（Ｈｕｍａｎ　Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ　ａｎｄ　ＡＩＤＳ）　１９８８　；核酸及びアミノ酸配列の編集（Ａ　Ｃｎ＋ｏｐｉ　Ｉａｔｉｎｎ　ｎｒ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ　ａｎｄ　ａ＋ｎ１ｎｏ　ａｃｉｄ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ）　、ｏスアラモス国立研究所、ロスアラモス、ニューメキシコ８７５４５、米国］。

米国食品薬品庁（“ＵＳＦＤＡ”）が現在米国での使用を許可しているＨＩＶ感染のテストは、抗原として粉砕ＨＴＶ−１ウィルスを用いＣペトリッシアニ（Ｐｅｔｒｉｃｃｉａｎｉ）ら、Ａｎｎｒｎｔ　Ｍｅｄ　１０３巻７２６−７２９ページ、１９８５　；オスチルホルム（Ｏｓｔｃｒｈｏｌｍ）ら、Ｎｅｗ　Ｅｎｇ　Ｊ　３１２巻１１８５−１１８８ページ、１９８５）これらの抗原製剤中のＨＩＶ−１蛋白質が感染症の間接的測定単位としての抗体をは有用であるが、単一のＨＩＶ分離物を抗原ソースとして用いる場合は（例えばＢＨ８分離物、米国特許第４５２０１１３号）感度の点で制限がある、というのはＨＩＶは上記のように速い突然変異並びに多数の遺伝的異型を生じ、抗原性異型が存在するからである［ルーニー　（Ｌｏｎｎｅｙ）ら、サイエンス　２４１巻、３５７−３５９ページ、１９８８：パルカー（Ｐａｌｋｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔ’　Ｉ　Ａｃａｄ　Ｓｅｔ　ＵＳＡ　８５巻１９３２−１９３６ページ、１９８８］。感度が悪いのは、抗原ソースとしてウィルス溶解物を使用する現在許可されているアッセイキットでは、ＨｒＶｇｐ４１エンベロープ蛋白質の免疫優性領域の保存が悪いことにも起因するらしい［ステラケルベルブ（Ｓｔｅｃｋｅｌｂｅｒｇ）＆ニア−７ケリル（Ｃｏｃｋｅｒｉｌｌ）　、Ｍａｙｏ　Ｃ１１ｎｉｃ　Ｐｒｏｃ　６３巻３７７−３８０ページ、１９８８］。その上、現在のキットはＨＩＶ−１蛋白質マーカーを用いているから、ＨＩ　Ｖ−２の７５％以上は検出されない［クラベル（Ｃ１ａｖｅｌ）ら、Ｎｅｗ　Ｅｎｇ　Ｊ　Ｉｃｅｄ　３１６巻、１１８０−１１８５ページ、１９８７］。

抗原ソースとして全ウィルスの溶解物を使用するＨＩＶ感染テストは、特異性ののテストで繰り返し陽性である１０人のうち実際にＨＩＶに感染しているのは１ Å以下である［オスチルホルム（Ｏｓｔｅｒｈｏｌｍ）ら、Ｎｅｗ　Ｅｎｇ　Ｊ　Ｗｅｄ　３１２巻、１１８５−１１８８ページ、１９８５］。

現在ある多数のテストの不十分な感度及び特異性に関連して、成るテストは陽性サンプルと陰性サンプルとを識別する能力をもっている。ワード（ｌａｒｄ）ら、ＪＡＭＡ２５６巻、３５７−３６１ページ、１９８６、は、一つのテストで得られた陽性結果の半数以上が陽性／陰性境界値のほんの少し上にあることを見いだした。最適のテストはほとんど全てのサンプルで陽性と陰性との間に大きい差を示し、それによって間違った陽性の試験結果の可能性を減らす。

その後改良されたＨｒＶ試験法は一米国内での使用はまだＵＳＦＤＡによって許ら、Ａｎｎ　ｒｎｔ　Ｍｅｄ　１０６巻、６７１−６７６ページ、１９８７；ドーソン（Ｄａ　ｗｓｎｎ　）ら、Ｊ　Ｉｎｒｅｃｔ　Ｄｉｓ　１５７巻、１４９ −１５７ページ、１９８８；ベル′ン（Ｂｅｌｔｚ）ら、米国特許第４７５３８７３号］、ＨＩＶ蛋白質に関連した合成ペプチド［ローゼン（Ｒｎｓｅｎ）ら、ＰＣＴ出願第ＷＯ３７１０８００５号：ワンプ（ｆａｎｇ）ら、Ｐｒｃｘ：　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　［ＩＳＡ　８６巻、６１５９−６１６３．１９８６；米国特許第４７３５８９６号：コサンド（Ｃｏｓａｎｄ）、米国特許第４６２９７８３号、スミス（Ｓｗｉｔｈ）ら、ＪＣＩｉｎ　ＩＪｉ（ｒｎｂｉｎｌ　２５巻１４９８−１５０４ページ、１９８７；グナン（Ｇｎａｎｎ）ら、Ｊ　Ｉｎｆｅｃｔ　Ｄｉｓ　１５６巻、２６１−２６７ページ、１９８７フ、又は因子の組み合わせ［レスリー（Ｌｅｓｌｉｅ）ら、Ｖｎｘ　Ｓａｎｇ　５４巻８４−９１ページ、１９８８コを用いてきた。抗原ソースとして組換え蛋白質又は合成ペプチドを用いる場合は組織培養汚染物による非特異性は軽減される、そしてどちらの抗原ソースも製造プロセスにおいてＨＩＶにさらす必要がない。その上合成ペプチドは、純粋に化学的手段によって標準化される抗原の製造を可能とし、遺伝子工学によって生成するＨｒＶる。これらの改良倍型はＨＩＶ−１に対する抗体のテストを改善したが、感度及び特異性のより一層の改善、Ｉ（ＩＶ−２感染の発見、及び“陽性及び陰性サンプルを識別する迅速且つ簡単な分析試験にこれらの試薬を適用すること”に関してはかなりの困難が残っている。

の困難を克服し、テストサンプル中のＨｒＶ−１又はＨＩＶ−２に対する抗体の存在又はその量を確認する改善された分析試験結果が得られることが明らかになった。

免疫特異的試薬に使われる合成ペプチドは、ＨＩ　Ｖ−１のｐ２４又はｇｐ４１又はＨＴＶ−２のｇｐ３２蛋白質の免疫反応特異性を有する天然又は非天然のペプチドである。本発明の免疫特異的試薬は、例えば血液又は血清などの液体サンプルを本発明の免疫特異的試薬と接触させ、それからその試薬に結合した抗体の存在又は量を測定するという方法で使用される。

よって１本発明の一面において、担体蛋白質に化学的に結合したペプチドは゛遊離”ペプチドより大きい陽性／陰性テスト比をもたらし、陽性サンプルと陰性サンプルとをよりよく識別することが明らかになった。本発明のこの面の代表的実施態様において、ペプチドはそのカルボキシル末ＭＪ（Ｃ−ｔｅｎａ開）に付加したシスティンを介してその担体蛋白質に結合し、ＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２に対する抗体を検出するための免疫特異的試薬として用いられる。

好都合に正常血清に対しては低レベルの反応性を示す反応性ペプチドのいくつかの天然配列異型は、不十分な感度を有し、陽性血清の５−１０％で低い反応性を与えることも明らかになった。同じ領域からのその他の天然異型ペプチドは陽性サンプルとの高い反応性を示すが、正常血清とでも許容し得ない程高い反応性を示し、その結果低い陽性／陰性比を与え、ＨＩＶ抗体を含むサンプルと含まないサンプルとの識別が十分でない。ＨＩＶ−１抗体を検出するためのあらゆる所望クリテリアを満足する天然ペプチドは見つかっていない。

本発明の他の面よりみれば、陽性サンプルとは高レベルの反応性を維持し、陰性サンプルとは低い反応性を示す天然ＨＩＶ−１及びＨＩ　Ｖ−２の非天然配列異型がつくられる。好適な非天然ペプチドの担体蛋白質との化学的結合物はこれまでに試験された天然ペプチドより高い陽性／陰性テスト比を与える、そして遊離ペプチドでなく、それらペプチドと担体蛋白質との化学的結合物のみが小さい粒状の固体支持体に結合するのに適していることが、ＨＩＶ−１抗体の検出のための迅速且つ簡単な分析試験法の開発中にわかった。天然及び非天然ＨＩＶ−２ペプチドの同様な結合物は両方共、ＨＩＶ−２の検出のために適している。

本発明のまた別の面よりみれば、担体蛋白質に結合した本発明の合成ペプチド、例えばＢＳＡ又はＫＬＨ，を含む免疫特異的試薬は単独で又はキットの形で提供され、ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２に対する抗体のイムノアッセイに使用される。

完了までの時間が１５分以下で、ＨＩＶ−１及び／又はＨＩＶ−２抗体を検出する単純な視覚的終点を与える特に好適な新しい迅速分析試験法が提供される。

恵鶏免疫化学及びペプチド化学において一般に用いられるいくつかの用語及び略語が下記の説明及びフレイム中に出てくる。下記の定義は説明のためのものである。

ここに用いられる用語“ペプチド”はアミノ酸から成る蛋白質の線状配列部分である。本発明のペプチドは典型的にはアミノ酸約５ないし約２２の長さを有する。

“天然”ペプチド又は−配列異型とは、天然ソースから分離され、前に文献に報告されているペプチド配列異型の１つを意味する一現在ＨＩＶ−１の配列異型は１３種類報告されている。“非天然”ペプチド又は−配列異型とは、報告された、現在公知のあらゆる天然配列と異なるアミノ酸配列を意味する。

用語゛坑卯性ドメイン”又は“エピトープ”は概してアミノ酸約６−約１１の長さをもつ蛋白質又はペプチド内の領域で、抗体と特異的に相互作用してそれに結合することができる領域を意味する。

ここで用いられる下記の頭字語は以下に示す意味を有する：ＥＩＡ＝酵素免疫測定法ＥＬＩＳＡ＝エライザ法ＨＴＶ＝ヒト免疫不全ウィルスＨＩ　Ｖ−１又ハＨＩ　Ｖ−２（ＨＩ　Ｖ）１ｆｆト２型）ｓｒｖ＝サル免疫不全ウィルスＫＬＨ＝スカシガイのヘモシアニンＢＳＡ＝ウシ血清アルブミン（Ｓ）ＭＢＳ＝　（スルホ）マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｓｕｌｆａ）ＳＭＣＣ＝　（スルホ）スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート５ＰＤＰ＝Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネ−トル２４蛋白質＝ＨＩＶ−１のＧＡＧ遺伝子の蛋白質生成物の中央部蛋白溶解断片ｇｐ４１及びｇｐ３２＝それぞれＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２のＥＮＶ遺伝子（７）Ｗ白質生成物の経膜的部分蛋白溶解断片ＡＡ±アミノ酸下記の１文字のアミノ酸コードを用いて特異的アミノ酸をあられす。

アラニン＝Ａ　ロイシンミＬアルギニン＝Ｒリジン＝にアスパラギン＝Ｎ　メチオニン＝Ｍアスパラギン酸＝Ｄ　フェニルアラニン二Ｆシステイン二〇　プロリン＝Ｐグルタミン酸＝Ｅ　セリン冨Ｓグルタミン＝Ｑ　スレオニン二Ｔグリシン＝Ｇ　トリプトファン＝Ｔヒスチジン＝Ｈチロシンミニイソロイシン＝■　バリン＝Ｖ特に記さない限り、すべてのアミノ酸は天然り型アミノ酸である。

図の簡単な説明図１は、ＨＩＶ−１のｇｐ４１蛋白質、分離物ＨＸＢ２、オーバーラツプするペプチドのアミノ酸配列、及びこれらペプチドををペプチド−蛋白質結合物としてＨｉｖ−１に対する抗体を含む（ＨＩ　Ｖ＋）又は含まない（ＨＩＶ−）ヒト血清プールに対して試験した場合のこれらペプチドの免疫反応性を示す。

図２は、ペプチド２３０９の非天然異型のアミノ酸反応性を示す：このペプチドは図１において蛋白質と結合した場合には高い免疫反応性を有することが示された。

各非天然ペプチドの抗原性は、遊離ペプチドとして、ペプチド２Ｓ０９のＢＳＡ結合結合対ＨＩＶ−１抗体の結合を阻止する能力によってあられされる。非天然アミノ酸は、各ペプチドのカルボキシル末端に付加した非天然グリシン（Ｇ）及びシスティン（Ｃ）を除いて、担体蛋白質への結合を容易にする点で目立っている二　図３は、ペプチド２Ｓ０９のその他の天然及び非天然異型のアミノ酸配列を示す。各ペプチドの抗原性は遊離ペプチドとして、ザイールのＨＩＶ−１分離物で報告される天然配列異型である２Ｓ０９かペプチド５８６７かどちらかのＢＳＡ結合結合対するＨＩＶ−１抗体の結合を阻止する能力によってあられされる（グアノら、サイエンス　２３７巻１３４６−１３４９ページ、１９８７；アリシン（Ａｌｉｚｏｎ）ら、Ａｌ１１胞４６９．３６ページ、１９８６）。各ペプチドは非天然のカルボキシル末端ＧＣを含み、ペプチド２Ｓ０９から得られるアミノ酸配列のその他の異型が強調される。

図４は、図２及び３において遊離ペプチドとして大部分が抗原性をもっことがわかったペプチドの各々について、それをＢＳＡ結合結合対て用いてＨＩＶ−１抗体に直接結合させたときの免疫反応性を示す。ペプチド２Ｓ０９のＡＡ（アミノ酸）異型が目立っており、各ペプチドはＢＳＡへのその結合を容易にするためにカルボキシル末端ＧＣを含んでいる：図５は、ＨｒＶ−２のｇｐ３２蛋白質、分離物ＲＯＤ、のオーバーラツプするペプチドのＡＡ配列を示す。これらはこの領域の５ＩＶＡＡ配列とほぼ一致する。

これらのペプチドの抗原性を試験するために、ペプチド−蛋白質結合物を用い、Ｓｒ　Ｖ／Ｈｒ　ｖ−２ｔ：対スル抗体を含む（Ｓ　Ｉ　Ｖ＋）又は含まナイ（Ｓ　Ｔ　Ｖ−）　マカークザル血清のプールに対して試験した；図６は、図５において高い免疫反応性をもっことがわかったペプチドであるペプチド２Ｓ２７の天然及び非天然異型のＡＡ配列を示す。各ペプチドの抗原性は、遊離ペプチドとしてペプチド２Ｓ２７のＢＳＡ結合結合対　ＩＶ／ＨＩＶ−２抗体との結合を阻止するｆ肋によってあられされる。非天然性ＡＡが目立っており、各ペプチドはＢＳＡへの結合を容易にするためにカルボキシル末端ＧＣを含む；図７は、図６において遊離ペプチドとして最も大きい抗原性を示したペプチドの各々について、ＢＳＡ結合結合対て用いてＳ　Ｔ　Ｖ／ＨＩ　Ｖ−２抗体に直接結合させる場合の免疫反応性を示す。ペプチド２Ｓ２７のＡＡ異型が目立っている。各ペプチドはＢＳＡへの化学的結合を容易にするためにカルボキシル末端Ｃを含む、そして大部分は終わりから２番目のＧスペーサーを含む：図８は、ＨＩＶ−１ｐ２４蛋白質のオーバーラツプするペプチドのＡＡ配列と、これらのペプチドをプールし、ペプチド／蛋白質結合物として、ＨｒＶ−１抗体を含む（ＨＩ　Ｖ十）又は含まない（ＨＩＶ−）ヒト血清に対して試験したときのこれらペプチドの免疫反応性を示す。先ず異なるペプチド群を上記のようにＢＳＡに結合させ、各プールの結合物を最初に試験した。個々のペプチド−ＢＳＡ結合結合対プール中の反応性を示したペプチドからのみつくられた。

図９は、非天然ペプチド４８３６を遊離ペプチドとして又はＢＳＡに化学的に結合した同金のペプチドとして３種類のポリスチレンＥＩＡミクロタイタープレートにコーティングした場合の非天然ペプチド４８３６の免疫反応性を示す。最高の陽性／陰性比（≧２０）、及び陽性及び陰性サンプル間の最大の識別度はＢＳＡ−ペプチド結合物でのみ、そして正常ヒト血清に対して低い反応性をもったプラスチック（プラスチック１型）でのみ得られることに注目すべきである：図１０Ａは、９４のヒト血清（内４２がＨｒＶ−１抗体を含み、５２は含んでいない）を用いてＥＩＡによって試験したときの、天然ペプチド２Ｓ０６及び２Ｓ０９のペプチド−ＫＬＨ結合物の免疫反応性を示す。

図１０Ｂは、１８４のヒト血清（内９８がＨＩＶ−１抗体を含み、８６は含んでいなかった）を用いてＥＩＡによって試験したときの、天然ペプチド２ＳＯ９のペプチド−ＢＳＡ結合結合対疫反応性を示す：図１０Ｃは、１８５のヒト血清（内９８はＨＩＶ−１抗体を含み、８７は含んでいなかった）を用いてＥＩＡによって試験したときの、天然ペプチド５３６７のペプチド−ＢＳＡ結合結合対疫反応性を示す：図１１Ａは、１８３のヒト血清（内９８はＨＩＶ抗体を含み、８５は含んでいなかった）を用いてＥＩＡによって試験したときの、非天然ペプチド４８３６のペプチド−ＢＳＡ結合結合対疫反応性を示す：図１１Ｂは、１８５のヒト血清（内９８はＨＩＶ−１抗体を含み、８７は含んでいなかった）を用いてＥＴＡによって試験したときの、非天然ペプチド５３７６のペプチド−ＢＳＡ結合結合対疫反応性を示す：図１１０は、１８３ヒト血清（内９８はＨＩＶ−１抗体を含み、８５は含んでいなかった）を用いてＥＩＡによって試験したときの、非天然ペプチド４８３６の結合ペプチド−ＢＳＡ結合結合対疫反応性を示す：図１２は、マカークザルの血清（その内７血清はＨＩＶ−２抗体を含み、１３血清は含んでいなかった）を用いてＥＴＡによって試験したときの、天然ペプチド２Ｓ２４．２Ｓ２５．２Ｓ２７．５Ｓ８４．５Ｓ８５．５Ｓ８６、及び非天然ペプチド５Ｓ８８．５Ｓ９０．５Ｓ９１、及び５Ｓ９２のペプチド−ＢＳＡ結合結合対疫反応性を示す：図１３は、ＨＩＶ−１（図１３Ａ）、ＨＩＶ−２（図１３Ｂ）及び複合ＨＩＶ− １プラスＨＩＶ−２ＥＩＡ（図１３０）試験の個々の免疫反応性を示す：３０がＨＩ　Ｖ−１抗体陽性、２３がＨＩＶ−２／ＳＩＶ抗体陽性、ＨｒＶ−１抗体のないヒト血清　１５、Ｓ■Ｖ／ＨＩＶ−２抗体のないマカークザル血清　１５であった。すべてのペプチドはＣ末端でＢＳＡに結合したものを用いた。ＨＩＶ− １プレートに非天然ペプチド４Ｓ３６及び５Ｓ７６の結合物をコーティングした。ＨＩＶ−２プレートにはペプチド２Ｓ２４及び５Ｓ８６をコーティングし、複合ＨＩＶ−１プラスＨＩＶ−２プＬ／−ト１：ｌ；ｔ４ｓ３６　（ＨＩｖ−１）及び２Ｓ２４プラス５Ｓ８６　（ＨＩ　Ｖ−２）　ヲ：７−−ｒインクＩ、ｆ：　；図１４は本発明の迅速試験装置の平面図である；図１５は図１４の迅速試験装置の分解側面図である。

特殊な実施例の説明本発明の一面によって、例えば血液又は血清サンプルなどの液体サンプル中のＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２抗体の存在又は量が下記のように測定される：Ｃ末端を介して担体蛋白質に結合した少なくとも１つの合成ペプチドを含み、ＨＩＶ−１のｐ２４又はｇｐ４１蛋白質、又はＨＩＶ−２のｇｐ３２蛋白質の抗原性ドメインに特異的な免疫反応特異性を有する免疫特異的試薬と上記液体サンプルとを接触させ、その後その免疫特異的試薬に結合した抗体の存在又は量を調べる。

本発明の実施において担体蛋白質に対するＣ−末端結合のために用いられる代表的ペプチドは好適には天然に発生するＨＩＶ−１及びＨＩ　Ｖ−２蛋白質の抗原性ドメインを代表するアミノ酸配列を有する合成ペプチドである（天然に発生するＨｌｖ−１及びＨＩＶ−２蛋白質の配列については、マイヤーズ（ＩＪｙｅｒｓ）らの°ヒトレトロウィルス及びＡ　Ｉ　Ｄ　Ｓ　（Ｈｕ＋＋ａｎ　Ｒｃｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ　ａｎｄ　ＡＩＤＳ）”　１９８８、”核酸及びアミノ酸配列の概要″ロスアラモス国立研究所、ロスアラモス、ニューメキシコ、８７５４５、ＵＳＡ、参照）。本発明ノソノ他ジペプチドは、ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２の抗原性ドメインに特徴的な免疫反応特異性を有する非天然合成ペプチドを含める、これについては以下で詳述する。これらのペプチドは例えば下記のような方法によって、化学的に合成される：同時性多ペプチド合成（ＳＭＰＳ）として知られる標準メリフィールド（Ｍｅｒｒｉ　ｒ　１ｅｌｄ）固相合成法の変法を用いる−この方法では約７０−１００のペプチドを同時に合成することができる（米国特許第４１６３１２１１号参照）。この方法を用いて、１１のペプチド又は少数のアミノ酸に含まれる一次及び二次構造エピトープ又は抗原性ドメインすべてを表現し、ＨＩＶ−１のｇａｇ遺伝子によって規定されるｐ２４蛋白質のすべてとＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２のｅｎｖ遺伝子によって規定される経膜的糖蛋白質の部分を表現するペプチドが合成された。

ＨＩＶ−１について用いられた最初の配列はＨＩＶＨＸＢ２クローンのそれであり、ＨＩＶ−２ではＨＩＶＲＯＤクローンのそれであった（マイヤーズら、同上）、シかしｅｎｖ経膜的糖蛋白質の免疫優性領域が確認された場合は、その免疫反応性領域の公知の一般的天然配列異型のすべて並びにこの領域の多くの非天然配列異型の多くはここに記載の方法で合成された。本発明の代表的ペプチドは約５ないし約２２のアミノ酸、好適には約１１ないし約２０のアミノ酸、より好適には約１５ないし約１７のアミノ酸を含む。ペプチドは２０以下のアミノ酸の長さを有し、より長い分子によって生ずる硬い二次構造を避けるのが好適である。

このような硬い二次構造は、ペプチドの形が感染患者に見いだされるＨＩＶｇｐ４１．ｇｐ３２．又はｐ２４抗体の８結合部位に適応するのを妨げる。この技術において一般的に記されるが、図１に示されるようなＧＣＣ末端テールをもたないいくつかのペプチド、例えばペプチド４Ｓ２４　（１９ＡＡ’　ｓ、コサンド参照）は、部分的にオーバーラツプするより短いペプチド２ＳＯ１（１４ＡＡ’ 　ｓ）又はペプチド４Ｓ２５　（２６ＡＡ’　ｓ、　コサンド及びワンプら、上記）に比較して、また部分的にオーバーラツプするペプチド２ＳＯ４（１７ＡＡ ’　ｓ）又は３Ｓ３６　（１７ＡＡ’　ｓ）に比較しても、免疫反応性が低いのは、このような二次構造の考察を反映するものかも知れない。組換えＤＮＡ法［ベルブ（Ｂｅｌｔｚ）らの米国特許第４７５３８７３号参照］によって作成される非常に大きい蛋白質のペプチドのようなペプチドは強い二次及び三次構造的硬さをもつと考えられる。これは成るエピトープのアクセスし易さを制限し、ベルブらが認めたようにいくつかの抗体陽性サンプルの免疫反応性の低下に寄与する。本発明に用いるよりｉｐさいペプチドサイズは、ペプチドそのものだけを（担体蛋白質と結合せずに）用いる場合にはイムノアッセイには不都合であると考えられる。このように小さい遊離ペプチドは結合プロセス中に傷つけられ、低い免疫反応性に通ずる。結合中のエピトープ妨害は、例えばダナンらの考察（Ｊ　ＩｎｒｅｃｔＤｉｓ１５６巻２６１−２６７ページ巻合６１するかも知れない：その考察では、ポリスチレンに直接結合した小さい免疫反応性ペプチドと反応する陽性サンプルの６５％は、１：１２８希釈で試験したとき、１，０以下のＡ４９２値を与えた。非結合ペプチドの結合中におこるこのようなエピトープ妨害はローゼン（Ｒｏｓｅｎ）ら（ＰＣＴ出願　ＷＯ３７１０６０６５）が好適ペプチドとして、より長いペプチドを使用したこと並びにその中に開示されている複数（ｍｕｌｔｉｐｌｅ）ペプチドの使用も説明するかも知れない。

」１記とは対照的に、本発明の免疫試薬は、ここに記載するように小さい合成ペプチドを免疫試薬として使用する前に、担体蛋白質に化学的にカップリングすることによって形成される。したがって典型的アッセイ装置のポリスチレン表面に結合していない短いペプチドのために、又はその短いペプチドとプラスチック表面との相互作用によっておこるエピトープの遮蔽又は立体障害のために抗原性ペプチドが見逃されるということはない。本発明の合成ペプチドに結合する適切な担体蛋白質は、分子量約５０００ダルトン以上の天然に発生する又は合成のペプチド又は蛋白質分子で、分析すべきテストサンプルとは免疫反応性を示さず、合成ペプチドの反応性に大きく寄与したりそれを減じたりしないものである。代表的担体蛋白質としてはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）　、スカシガイのヘモシアニンＣＫＬＨ）　、ヒト血清アルブミン、ポリーＬ−リジン、ウシ　ガンマグロブリン、その他の類似のポリペプチド分子がある。現在好適担体蛋白質はＢＳＡ及びＫＬＨであり、ＢＳＡは最適アッセイ感度及び特異性を得るために現在特に好適である。本発明の合成ペプチドは、それらのカルボキシル末端を介して担体蛋白質に化学的に結合したとき高度の免疫反応性を保有することが明らかにされた。これらペプチドと担体蛋白質との結合は、適した結合剤、例えばマレイミド安息香酸、ｐ−メチルジチオ安息香酸、無水マレイン酸、無水琥珀酸、グルタルアルデヒド、又はその他の類似の結合剤などを用い、一般的ペプチド結合手段によって実現される。とくに適した結合剤は、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、スルフォマレイミドベンゾイルーＮ− ヒドロキシスクシンイミド（ＳＭＢＳ）　、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、スルフォスフシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ｓｕｌｒｏｓ　ＭＣＣ）及びＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）である。

担体蛋白質への結合を容易にするために、本発明の合成ペプチドは、抗原性ドメインをあられすペプチド部分のカルボキシル末端に位置するアミノ酸スペーサーテールをもっているのが好ましい。適切なスペーサーテールは、ペプチドと担体蛋白質との結合の際に抗原性ドメインの免疫反応性を保獲し、所望のアミノ酸を結合にあずかるようにする機能をもつ。適切なスペーサーテールは、０ないし４個のグリシンＡＡスペーサーを有し、担体蛋白質に結合するためのシスティン基に終わるペプチドセグメントである。ここに詳細に説明され、図に示される特に好適な実施例において、アミノ酸スペーサーテールはペプチド中でＣ末端−ＧＣ基によってあられされる、但しその他のスペーサーテールもこの目的のために用いられる。約５０のＨＩＶ−１抗体陽性血清のプールに対する免疫反応性、又は約６のＨＩＶ−２抗体陽性血清のプールに対する並びにＨＩＶ−１又はＨＩ　Ｖ −２抗体のないことがわかっている血清のプールに対する免疫反応性について、本発明の好適ペプチドがＥｒＡ法によってスクリーニングされた。血清プールを用いてＥＩＡスクリーニングすることによって、ＨＩＶ感染中の霊長類において最大の抗体反応をおこすペプチドを確認し、個々の人に見られるエピトープの配列決定（Ｍａｐｐｉｎｇ）は避けた。ひとたび有望なペプチド領域が確認されたならば（図１．５．８）その後の合成によって最適免疫反応性ペプチドが解明され（図２−４．６．７）、それから最適ペプチドを多数の個々のｄａ清に対してスクリーニングしたＣ以下参照、図１Ｏ−１３）。

これらの最適ペプチド−Ｃ末端がＢＳＡに結合したちの−のなかで最もよいものを、機器を必要としない目で見る迅速試験の開発のために用いた（図１４）。

これらの研究は、配列ｒＷＧｃｓＧＫＬＩｃＴＴＡＶＰＧｃ　（２Ｓ０９）（下線ＩＶ−２抗体の検出のために最大に免疫反応性であることが明らかになった（図５）。

ｐ２４蛋白質でも、ンステインを介して担体蛋白質に化学的に結合したときに顕著な免疫反応性を示す配列ＡＬＧＰＡＡＴＬＥＥＭＭＴＡＣＧＣ（５Ｓ９４）をもつペプチドが確認された（図８）。

本発明のペプチドによってあられれるＨＩＶ−１に対する免疫反応性領域は、ワンプ（Ｗａｎｄ）らの米国特許第４７３５８９６号及びコサンド（Ｃｎｓａｎｄ）の米国特許第４６７９７８３号によって確認された領域のＣ末端に位置する。

配列ＲＩ　ＬＡＶＥＲＹＬＫＤＱＱＬＬＧＩＷＧＣ３をもつワンプの免疫反応性ペプチド及び配列ＩＫは、本発明の目的であるペプチドとは下記の点で異なる。

ワンプのペプチド全体のＹＬＫＤＱＱＬＬＧＩＷＧＣ３ＧＣ（２ＳＯ３）は、Ｃ末端を介してＢＳＡに化学的に結合した担体蛋白質結合物として用いたときの本発明の免疫反応性ペプチドよＳ２５コサンド、参照、上記）は、ＧＣスペーサーを介してＢＳＡに結合したＣ末ＬＩＣＴＴＧＣ（２５０６）及びＬ（’ｄＷＧｃｓＧＫＩｊｃＴＴＡＧｃ　（２ＳＯ７）を含む本発明のいくつかの比較的短いペプチドより低い又は同等の免疫反応性を示す（図１）。しかしながらワンプら、又はコサンドの特許いずれにも見いだされなかった重要な配列を含む本発明の新しいペプチドを用いて最良の免疫反応性が得られる。これらの配列はワンプ及びコサンドのペプチドについたＣ末端であり、例えばＢＳＡなどの担体蛋白質にカルボキシル末端ＧＣを介して結合するときペプチドない、ＨＩＶ抗体のための高い免疫反応性を保持する配列を決定するために、免疫優性ＨＩＶ−１ｇｐ４１エピトープの５０以上の非天然配列異型を合成した。本発明の重要な点は、Ｆ（ＩＶ抗体には高度の免疫反応性を保持し、ＨＪＶ抗体のない正常なヒト血清とは不都合に反応しない、図２−４．６．７．１１に示されるＨＩＶ−１及びＨＩＶ− ２両方の非天然配列異型の発見である（図１１）。これらの高度に免疫反応性の非天然配列異型は技術的に開示されたペプチドとは著しく異なる。

これらのペプチドのうち２つ、４Ｓ３６と４Ｓ７６、はそれらのカルボキシル末端によるＢＳＡとの結合物として用いたとき、優れたアッセイ性能を与え、高レベルの感度及び特異性、非常に高レベルの陽性及び陰性サンプル間の識別（図１１Ｃ）、そして２つの商業的に承認されたＥＩＡ試験で間違った陽性反応を与えることが判明した血清サンプルに対しては非常に低い反応性（実施例８、表１）を示した。この種のアッセイ性能−陽性は４９２ｎｍの吸光度が１．２５以下でなく、陽性の最低と陰性の最高との間のＡ４９□値の間隔は１．０吸光単位以上であるーは、ペプチド−ＢＳＡ結合物として用いられるここに記載の結合非天然ペプチドによって可能となる。この種のアッセイ性能は最適であり、ベル７（Ｂｅｌｔｚ）らの米国特許第４７５３８７３号に記載されている組換えＤＮＡ法によってつくられる非常に大きいポリペプチド−それはここに記載の領域を含めたＨＩＶのｇｐ１２０及びｇｐ４１の大部分を含む−の性能とよい対照となる。ベル７らの特許に記載されているＡ４．。単位における陽性及び陰性サンプル間の間隔はたった０、１で、陽性サンプルの１１％が１．２以下のＡ４，２値を有する。本発明の合成ペプチド法は、ベル７らの特許の場合のように単一のＨＩＶ分離物に依存するよりもむしろ、ＨＩｖエンベロープの臨界的免疫優性領域に対する抗原性変異の全範囲をあられすいくつかの異なるペプチドを挿入することができる。また、ペプチド合成によって、免疫優性領域のみが使用抗原に含まれ、Ｈｒｖｅｎｖ遺伝子生成物のあり得る交差反応部分を含むことによって導入されるｌ目ν異性、又は組換えＤＮＡによって表現される蛋白質をつくるために用いる細菌性宿主に由来する汚染蛋白質に起因する非特異性を避けることができる。

本発明の免疫特異的試薬は、液体サンプル、例えば血液又は血清サンプル中のＨＩＶ蛋白質に対する抗体を検出する、又はＨＩＶ蛋白質捉原を検出するためのイムノアッセイに用いられる。その試薬は、熟練せる当業者には公知の種々のアッセイフォーマット、例えばエライヤ法（ＥＬＩＳＡアッセイ）、その他の酵素免疫測定法（ＥＩＡアッセイ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡアッセイ）、及び免疫特異的結合パートナ−を必要とするその他のアッセイフォーマットに広く用いられる。

その試薬は好適にはＨＩＶ蛋白質に対する抗体の検出のためのアッセイに用いられ、分析すべき解体サンプルを本発明の試薬と接触させ、試薬に結合した抗体の存在又は量をサンプル中に存在するＨｒＶ抗体の存在又は量のインディケーションとして測定する。好適には、試薬／抗体複合物をサンプル混合物から分離し、形成された試薬／抗体コンプレックスの検出のために検出可能の標識を用いる。

分離は、試薬を固相に固定するか、形成されたコンプレックスを反応混合物から濾別するか、又は当業者には一般的なその他の方法によって行われる。適切な固相としてはミクロタイタープレート、ガラスピーズ、ポリスチレンビーズ、ラテックスビーズ、微粒子、セルロースマトリックス、ニトロセルロースマトリックス、シリカゲル、及びその他類似の固相表面があるが、これに制限されるものではない。当業者には公知のように、試薬／抗体コンプレックスの検出に役立つ種々の標識が用いられる。例えば適切な標識として酵素、放射性核種、発光部分、蛍光標識、化学発光標識、磁性粒子及び直接目に見える例えばコロイド金のような標識があるが、これに制限されるものではない。

現在、ＨＴＶ抗体の検出のために合衆国でＵＳＦＤＡによって承認されている試験法はＥＴＡ法である。これは高価な機器を必要とし、完了までの時間が２ないし４時間かかり、多数の血清を一度に試験するように設計されている。多くの場合には、ｍ、器に頼らない、簡単なフォーマットと目で見える終点をもち、少数のサンプルで行うことができ、１５分以内で終了する信頼できる試験法があれば、ＨＩＶ抗体の検出の改善が可能となる。よって、５個より少ないサンプルと対照とを用い、目による試験を行うように設計された方法及び簡単な装置による迅速試験フォーマットがここに提供される。この装置を使用するための２種類のフォーマットは以下の実施例１５及び１６に記載されている。各場合に本発明のペプチド／蛋白質結合物を用いて、１５分以内に終わる簡単な目による試験を実施する。実施例に説明されるように、これらの目的のためには遊離のペプチドは無効であるか比較的効果が小さい、一方ペプチド／ＢＳＡ結合物はよく機能する。

概して、ＥＩＡ試験で最もよい性能を与える同じペプチド／蛋白質結合物も、簡単に実施できる目による迅速試験においてすぐれた性能を発揮する。

上述の発見は、熟糺せる当業者には明らかないくつかの変更を含むものである。

例えば、本発明は、Ｇ（グリシン）スペーサー及びＣ（システィン）Ｃ末端アミノ酸を経てＢＳＡに結合したとき、ＨＩＶ抗体の検出のためにこれまでに報告されたペプチドのどれよりもすぐれた天然及び非天然両方のペプチドを明白にしている。

しかしながら、このようなペプチド／蛋白質結合物ですぐれたアッセイ性能が得られるという発見は、下記のような類似の結合物にもあてはまるかも知れない：１）結合するＣ末端アミノ酸が異なる、システィンでなく例えばメチオニン、チロシン、リジン、アルギニン、グルタミン酸又はアスパラギン酸など：２）結合のために用いる蛋白質が異なる、例えばウシ　ガンマグロブリン、ＫＬＨ，ポリーＬ−リジン、又はＨＩＶ抗体を含まない正常ヒト血清との結合物のイムノアッセイ反応性には貢献しない分子量５０００以上のその他の純粋ポリペプチド又は蛋白質：３）ここに詳細に示されるもの以外のリンカ−を用いて、ペプチド上のチオール、カルボキシル、又はその他の基と、結合のために用いるポリペプチド又は蛋白質上の類似の反応性基との間に共有結合を形成せしめる；４）Ｏ−４グリシンを用いて反応性ペプチドとＣ末端アミノ酸との間を架橋する；５）ペプチドのＣ末端の１−３アミノ酸を変化させる。しかしながら、これらの変更のいくつかは、ここに記載される好適ペプチド／蛋白質結合物に比較してアッセイ性能が劣ることがわかった。例えば、本発明のペプチドは、システィン及びそれらのＣ末端を介して蛋白質担体に結合すドの方向づけが重要であるというこの原理を証明したのはドライベルブ（Ｄｒｙｂｅｒｇ）及びオルトストン（Ｏｌｄｓｔｎｎｅ）（Ｊ　Ｅｓｐ　Ｍｅｄ　１６４巻、１３４４−１３４９ページ、１９８６）であった。実際、最適免疫反応性をもったペプチド４８３６及び５Ｓ７０（図２−４）がそれらのアミノ基を介して、カルボジイミドを用いてカルボキシル化ラテックスに共有結合した場合、すべての免疫反応性は失われる（実施例１６参照）。

下記の実施例は、本発明に定義された天然及び非天然ペプチド／蛋白質結合物をした抗原としての結合物の使用、迅速試験フォーマットに使用するためのコロイド金で標識した抗原としての結合物、そして迅速ＥＴＡフォーマットではラテックスに結合した抗原としての結合物の使用を含める。しかしながら、熟練せる当業者にはその他の応用も容易に理解でき、本発明の範囲はペプチド−蛋白質結合物のこのような他の可能な同等の使用を含むことを意味する。例えば、用いられる固体表面はポリスチレン表面又はラテックスビーズに限られることなく、ガラス、ポリプロピレン、デキストラン、ナイロン、ニトロセルロース、ゼラチン、紙、シリカゲル、赤血球、リポソームなどを含める。同様に、ペプチド／蛋白質結合物と、ペプチド／ペプチドポリマーとは同様によく機能し、またこのような結合物の標識化はコロイド金に限る必要はない。ペプチド含有ポリマーを標識化する別の方法は、放射性５識、酵素ｅ！識、蛍光標識、抗体標識、リポソーム標識、遊離基標識又はバクテリオファージ標識を含める。診断試薬としての有用性に加えて、ここに記載されるペプチド／蛋白質結合物は、免疫原として用いられ、例えば動物を免疫して診断用ペプチドエピトームに対するポリクローナル抗体を高め、ハイブリドーマ　チクノロ載されるＨＩＶペプチド−蛋白質結合物のこれらのおよびその他の利用は熟練せる当業者には明らかである。

る抗体を含むか又は含まないと特徴づけた。

（サンジエゴ、カリフォルニア、米国）から入手した［他のソースのアミノ酸、例えばアプライド　バイオシステム社（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｎｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ）、フォスターシティ−、カリフォルニア、米国、ペニンスラ　ラボラドリース（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ　Ｌａｂｎｒａｒｏｒｉｅｓ）ベルモント、カリフォルニア、米国、及びバチエム（Ｂａｃｈｅｍ）、　トレンス、カリフォルニア、米国、のアミノ酸も使うことができる］、そしてＮ−アルファーアミノをｔｃｒｔブチルオキシカルボニル（Ｌ−Ｂｏｃ）基で保護した。このようなアミノ酸はその他に側鎖保ｔｆ１基を含んでいた、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸、セリン及びスレオニンのためにはベンジル：システィンのためにはｐ−メチルベンジル：ヒスチジンのためにはジニトロフェニル：リジンのためにはオルト −クロロ−ベンジルオキシカルボニル、：アルギニンのためにはトシル：チロシンのためにはオルト−プロモーベンジルオキシカルボニルなど。Ｌ−Ｂｏｃで保護されたアミノ酸アラニン、フェニルアラニン、トリプトファン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、アスパラギン、グルタミン、プロリン、及びバリンは、側鎖を保護せずに用いられた。

ＳＭＰＳ合成の各段階において、溶媒及び反応体と、樹脂及び成長するペプチド鎖との接触を完全にするために、機械的振とう機上で烈しく撹拌し、前の段階からの溶媒のすべては、その次の段階のための溶媒を添加する前に除去された。樹脂を含むパックを塩化メチレン中で１分間洗い、それから５％ジイソプロピルエチルアミン（Ｄ　Ｉ　ＥＡ）−塩化メチレン溶液で２分間づつ３回、それから塩化メチレン中で１８分間づつ２回洗った。樹脂のパックを分類し、カルポギシル末端アミノ酸として所望の、個々のアミノ酸のためＩこ適した容器に入れた。９６のこの群のすべてのペプチドはＣ末端システィン、その次にグリシンスペーサーを含んでいたから、こに、０．２Ｍ濃度に溶解し、樹脂の８倍モル過剰の容量をもつ適当な反応びんに入だアミノ酸の各樹脂バックへの添加は振とう機上で１時間かけて行われた。モしてたアミノ酸をその後脱保護し、５５％三フッ化酢酸（ＴＦＡ）　、４５％塩化メチレンで３０分処理することによってＮ−アルファーＬ−Ｂｏａ基を除去し、塩化メチレンで１分間、イソプロパツールで１分間づつ２回洗って樹脂を収縮させ、残っているＴＦＡを全部除去し、塩化メチレンで１分間づつ２回洗った。アルファーアミノ塩を、氷冷した５％ＤＩＥＡ−ＣＨ２Ｃ１２Ｘ３で中和し、それから塩化メチレンで２回洗った。保護アミノ酸の結合、洗浄、脱保護などは、すべての所望アミノ酸がペプチド鎖に付加するまで繰り返された。この時点でＮ−アルファーＬ−Ｂｏｃ基は、５５％ＴＦＡ／４５％ＣＨ２Ｃｌ２で３０分間処理することによって各ペプチドから除去され、その後ＣＨ２Ｃｌ２で１分間洗い、イソプロパツールで１分間づつ２回、ＣＨ２Ｃｌ２で１分間づつ２回洗い、凍結乾燥した。完全に乾燥した樹脂バックを秤量し、重量増加を理論値と比較することによって結合完了を予想した。ヒスチジンを含むペプチドはさらに０．５Ｍチオフェノールで処理することによってジニトロフェニル側鎖保護基を除去した。チオフェノールの個々の量を３回、各々１時間かけて加え、その後ＤＭＦで１０回洗い、イソプロパツールか塩化メチレンのどちらかで１０回洗った。そのチオフェノール処理樹脂を凍結乾燥機で完全に乾燥させた。ＨＦ分解、抽出及び凍結乾燥後にＨＰＬＣによって検査したときに高純度を示さなかったペプチドでは、再合成を行い、ピクリン酸で結合完了をモニターした。結合段階後、樹脂バックを０．０５Ｍピクリン酸−塩化メチレン溶液で処理した。目で黄色が認められれば定性的に結合完了とし、そのピクリン酸を５％ＤＩＲ八−塩化ノー塩化メチレン溶液、３５８ｎｍで測定することＪこよって定量した。この方法は樹脂上の未反応のアミンをたった０、５％に至るまで検出した。

２４の個々のペプチドを同時処理することのできるＨＦ分解装置（マルチプルペプチド　システムズ、ラジョラ、カリフォルニア、米国）中で、それらペプチドをその樹脂から分離し、同時に側鎖保護基を除去した。標準筒ＨＦ法を用いた結乾燥ペプチドは逆相クロマトグラフィーによって分析した、この場合、シン、クロバック（Ｓｙｎｃｈｒｏｐａｋ）　Ｃ−４カラム［スペル：ｙ　（Ｓｕｐｅｌｃｏ）、ベレフォンテ、ペンシルバニア、米国］を用い、０−３０％アセトニトリルの直線勾配で０．３３％／ｍｉｎの流速で、及び０６１％三フッ化酢酸で１ｍｌ／ｍｉｎの流速で溶出した。

ベックマンＨＰＬＣ４２１型（ベックマン　インスツルメント、バロアルト、カリフォルニア、米国）及びヒユーレット　バラカード社製ダイオードーアレー　ディテクター１０４０Ａ型（ヒユーレット　パラカード、パロアルト、カリフォルニア、返し、図１−８に示される合成ペプチドの各々を合成した。

図１−８の合成ペプチドを、ペプチドの溶解度に応じて１０ｍＭボレート又はその他の緩衝液中で、４℃、、ｐＨ８で、ゆるやかに撹拌しながら、１０ｒｎＭ　ＤＴＴ、又は固定ｒ）ＴＴ（レダクタクリル、カルビオヘム、サンジエゴ、カリフォルニア、米国）で−晩還元した。ＫＬＨはｌＱｍＭ燐酸緩衝液−ｐＨ７，２〜中に１０−３０ドエステル）、５ＰＤＰ［Ｎ−スクシンイミジル−３−（２ピリジルジチオ）プロピオネート］、又はスルフオーＳＭＣＣ［スルフオースクシンイミジル　４（Ｎ−マレ−１’ミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルポキンレートコで処理した。ヘテンカー混合物を室温で１５分ないし１時間反応させ、それからセファデックスＧ２ラフイーによって還元ペプチドをＤＴＴから分離し、レダクタクリルを用いた場合は遠心分離してから０．２２ミクロンフィルターを通して濾過した。還元ペプチドとリンカ−処理Ｋ　Ｌ　Ｈ又はＢＳＡとを、１００−１０００　ペプチド／ＫＬＨ−Ｍ質に加え、Ｎ２で覆い、それから１時間室温でおだやかに撹拌し、−晩４℃で静置した。ＳＭＣＣ−ＢＳＡ結合物をさらに、最終濃度ＩｍＭのメルカプトエチルアミンで４時間処理し、それから４℃ で１００容量の緩衝液（２０ｍＭ燐酸塩、１ｍＭＥＤＴＡ、０．０５％アジ化ナトリウｔ１、ｐＨ６，５）に対して一晩透析した。その他のすべての結合物はアジ化ナトリウムの最終濃度０．０５％に調節された。結合物のペプチド／蛋白質の最適モル比は溶解度及び抗原性（ＥＴＡによって評価した）によって決定した。例えば最もよい比は、約１　：　ｌ　（ＳＰＤＰ−ＢＳＡ）、１０・１　（ＳＭＣＣ−ＢＳＡ）　、及び１００．１　ＣＭＢＳ−ＫＬＨ）であることがわがった。

てスクリーニングした、そのためにはポリスチレン　ミクロタイターＥＩＡプレート（コスタ−、ケンブリッジ、マサッチュセッツ、米国）の各ウェルに、トリス緩衝液、ｌＱｍＭ、ｐＨ８、中の５−５０マイクログラム／ｍ１５度のペプチドを０．２ｍ！ｉコーティングし、４℃で一晩盾いた。ＥＩＡによって免疫反応性を示すペプチド又はペプチド−蛋白質結合物をさらに希釈して、コーティングし、Ｈ１９６トウウイーン２０、ｐＨ７，４（ＰＢＳＴ）で、３７℃で３０分間ふさいだ。それからウェルをミクロタイタープレート　ウオッシャ−で吸引して乾燥させ、５０ｍＭ燐酸塩、１００ｍＭＮａＣ１，０，０５％トウウィーン２０、ｐＨ７，４（ＰＢＳＴ）の溶液で３回洗った。試験すべき霊長類血清の１　：　１０１希釈液（１％ＢＳＡ、１％ＮＲ３を含むＰＢＳＴで）を０．２ｍｌとして、洗浄した各ウェルに加え、そのプレートを３７℃で３０分間インキュベートした。その後プレートをＰＢＳＴア、米国）の１゜２０００希釈液を０．２ｍＩｆａ各ウェルに加え、プレートを３７℃で３０分間インキュベートした。プレー！・をＰＢＳＴで３回洗い、０．１Ｍクエン　プレートリーダーでＡ４ｇ□で測定した。各実験系列にはポジティブ−及びネガにたいしてスクリーニングされ、同じ血清プールを用いて種々の遊離ペプチド又はペプチド−蛋白質結合物の免疫反応性を定量的に比較することができた。上の条件は最適試験性能を与えることがわかった、そして以下のＥＩＡ実施例に用いられた。

１０マイクログラム　ペプチド／ｍ＋の濃度でポリスチレンミクロタイター　プレびにＨＩＶ−１抗体又はＨＩＶ−２抗体を含まないプール血清（それぞれＨＩＶ−／Ｓ　Ｉ　Ｖ−）の１　：　１０１希釈液を用いて免疫反応性を評価した。

ペプチド２Ｓ０４．４Ｓ２５，３Ｓ３６，２ＳＯ６，２ＳＯ７，２３０９，２３１１，３Ｓ５１．２Ｓ１３，３Ｓ５５．２Ｓ１５のＢＳＡ−ＳＭＣＣ結合物（図１）ではＨＩＶ抗体に対して顕著な免疫反応性が認められ、配列ＩＷＧＣ３ＧＫＬＩＣＴＴＡＶＰＧＣをもつペプチド２Ｓ０９の結合物ではわずかによりすぐれた免疫反応性が認められた。ＨＩＶ−２感染患者からの血清は米国では比較的平に入らないから、ＨＩＶ−２合成ペプチドの免疫反応性は、ワシントン大学霊長類センター、ワシントン、米国、から入手したＳＩＶ感染感染−カークザル清を用いて評価した。ＳＩｖのＡＡ配列は合成したペプチド領域においてＨＩＶ−２のそれとほぼ同じである（参照、マイヤーズら、ヒト　レトロウィルスとＡＩＤＳ、１９８８．　“核酸及びアミノ酸配列の編集”ロスアラモス国立研究所、ロスアラモス、ニューメキシコ、８７５４５、米国）。ペプチド２Ｓ２３．２Ｓ２４．２Ｓ２５．２Ｓ２７、及び２Ｓ２８のＢＳＡ−ＳＭＣＣ結合物では、Ｓ　ＩＶ／ＨＩＶ−２抗体で顕著な免疫反応性が認められた、最高の免疫反応性が認められたのは、図５に示されるように２３２４　（配列　ＤＱＡＲＬＮＳＷＧＣＡＦＲＱＶＣをもつ）　、２Ｓ２５　（ＩＥ列　ＡＲＬＮＳＷＧＣＡＦＲＱＶＣＨＧＣをもつ）及び２Ｓ２７　（配列　５ＷＧＣＡＦＲＱＣＨＴＴＶＰＧＣをもつ）であった。概して、ＫＬＨ結合物よりもＢＳＡで、よりよい免疫反応性が認められた。

してＫＬＨに結合したときの合成天然ペプチド２８０６及び２ＳＯ９（図１）の免疫反応性を示す。血清サンプルを提供してくれたシアトル　キング　カランティ保健部がゲネティック　システムズ　ＥＩＡ法によって評価した場合、血清標本の４２がＨＩＶ−１抗体を含み、５２が含んでいなかった。陽性サンプルすべてを陰性サンプルと区別した。しかしながら陽性サンプルの多くの免疫反応性は低く　（Ａ４．２は１．０以下）、陰性サンプルの若干は０．２０より少し高いＡ４，２値を有し、その結果陽性と陰性との識別はよ（なかった。この不十分な識別のため、改良された担体蛋白質及び／又はリンカ−を探すことになった。

に結合した場合の、合成提供ペプチドＩＷＧＣ３ＧＫＬｒＣＴＴＡＶＰＧＣ（２Ｓ０９）の反応性を示す。サンプルを提供したシアトル　キング　カランティ保健部がゲネティック　システムズ　ＥＩＡ法によって評価した全部で１８４のヒト血清のうち９８がＨＩＶ−１抗体を含み、８６が含んでいなかった。陰性サンプルは低いＡ４，２値を示し、大部分の陽性サンプルはより高いＡ４，２値を示したという点で、図５Ａに比較してアッセイ性能の改良が認められる。これは、ＳＭＣＣリンカ−を用いたペプチド−ＢＳＡ結合結合用ンカ−としてＭＢＳを用いたペプチド−Ｋ　Ｌ　Ｈ結合物よりすぐれたＥＩＡ試験性能を与えることを示している。しかしながら、いくつかの陽性サンプルはこの結合物では非常に低い −これらを陰性サンプルから確実に区Ｕｌｌするにはあまりに低い一免疫反応性をもっていた。低い反応性の若干は、ザイールからのＨＩＶ分離物で報告されたように（ダナンら、サイエンス　２３７巻、１３４６−１３４９ページ、１９８７）このエピドーム領域における遺伝的異型の抗原的差異によるかも知れないので、天然？ＥＦ＋１異型ブチド５Ｓ６７　（図３）を合成し、ＳＭＣＣによってＢＳＡに化学的に結合せしめ、同じ血清に対して、それに加えてもう一つの陰性血清サンプル（図１００）に対して試験した。天然２Ｓ０９−ＢＳＡ結合結合用い免疫反応性を示した患者血清の多くは、５Ｓ６７−ＢＳＡではより高い反応性を与えた。しかしながらペプチド５ＳはＨＩＶ−１抗体を含まない血清と許容し得ない高い反応性を示した（図１００）。このため、ＨＩＶ−１抗体を含む大部分の血清との高い免疫反応性を保持し、ＨＩＶ抗体のない血清とは低い反応性を示すペプチド２Ｓ０９の非天然配列異型を探索することになった。

図２及び図３は、実施例１の方法を用いて合成したペプチド２Ｓ０９及び５Ｓ６７の４７の配列異型を示す。目立つアミノ酸はこれらペプチドの天然配列からの異型である。遊離ペプチドとして、ヒトＨＩＶ−１抗体と、ポリスチレン　ミクロタイター　プレートに結合した天然ペプチド２Ｓ０９及び５Ｓ６７のＢＳＡ− ＳＭＣＣ結合物との結合を阻止する能力によって、ヒトＨＩＶ−１抗体に対する免疫反応性を保持するこれらを確認した。図４は、図２及び図３で最大の免疫反応性を示した７天然配列異型及び２１非天然配列異型の直接的抗体結合活性を示す。陽性血清プールに対するＡ４，２免疫反応性／陰性血清プールに対するＡ４，２免疫反応性の比が最もよい結合物を、さらに評価した。非天然ペプチドのいくつかの結合物は、図１０Ｂの最小免疫反応性血清で試験したとき、ペプチド２Ｓ０９よりも高い免疫反応性を与えたが、これらの若干は、ペプチド５３６７で見られたように（図１００）、陰性血清に対して高い非特異的反応性を示した。

その他のペプチドは大部分の陽性血清では免疫反応性を保持し、陰性血清では免疫反応性の変化はなかった。２つの特に好適な非天然配列ペプチド、４Ｓ３６及び５Ｓ７６をさらに評価した。

化学的に結谷させ、ポリスチレン　ミクロタイター　プレートにコーティングし、１８３のヒト血清に対してＥＩＡ法で試験したときの、非天然ペプチド４Ｓ３６（ＶＱＧＣ３ＧＫＬＩＣＴＴＡＶＰＧＣ）（Ｄ免疫反応性ヲ示ス。同シ９８　）陽性血ｍ、並びに図１０Ｂの８６の陰性血清のうちの８５を用いた。ペプチドのＮ−末端のイソロイシンの代わりにバリンを置換したものを除いて、低陽性の免疫反応性が、同じ配列をもつ天然配列ペプチドに比較して著しく増加した。９８の陽性サンプルのうち、Ａ４，２が１．０以下であったものは１つもなかった。一方陰性血清のＡ４９□値は比較的低いままであった。図１１Ｂは、ポリスチレン　ミクロタイター　プレートにコーティングし、図１０Ｂと同じ陽性及び陰性血清に対し、またもう１つの陰性血清に対してＥＩＡ法で試験したときの、非天然ペプチド５Ｓ７６　（ＩＷＧＣ３ＧＫＭＩＣＴＴＡＶＰＧＣ）　の類似（７）Ｃ末端　ＢＳＡ−ＳＭＣＣ結合物の免疫反応性を示す。５陽性サンプルが１．０以下のＡ　４６２を与えたが、残りの数値は高く、図１０Ｂでは弱く反応した幾つかの血清に対して強い免疫反応性をもつものも含まれた。図１１Ｃは、ポリスチレン　ミクロタイター　プレートにコーティングし、図１１Ａと同じ血清に対してＥＩＡ法で試験したときの、結合非天然ペプチド４Ｓ３６及び５Ｓ６７の、ＢＳＡ−ＳＭＣＣ結合物との免疫反応性を示す。陰性血清との反応性は低いままであるが、陽性血清と結合非天然ペプチドとの免疫反応性はどちらのペプチドでもペプチド単独よりは大きかった、その結果１．２５以下のＡ４，２値をもつ陽性サンプルはなく、最低陽性と最高陰性とのＡ４，２値の開きは１．０以上の吸収単位となった。これらのＥＩＡ試験性能結果は、同じ試験血清で試験した他のいかなるＥｒＡ試薬の性能よりも優れており、今までに文献に記載された結果よりも優れている。

の合成非天然ｇｐ４１ペプチドを組み合わせて結合させることによって、すぐれたアッセイ性能及び特に良い感度が得られることを示している。このようなアッセイ国）又はデュポン（ウィルミントン、プラウエア、米国）のどちらか又は両方の市販のＥＩＡアッセイで間違った陽性結果を与えた１２のヒト血清を、キング　カランティ保健部（シアトル）から入手した。これら市販のＥＩＡシステムでは陽性であったにもかかわらず、これらの各々の血清でのウェスターン　プロット　確認試験は完全に陰性であった。

１２ヒト血清群を実施例３の方法にしたがい、合成ペプチド４Ｓ３６及び５Ｓ７６の組み合わせを用いて試験し、市販のゲネティック　システムズ及びデュポンＥＩＡアッセイで得た結果と比較した。結果を下表に示す：１１　＋　＋　０．７０（陽性）１２　＋　−０，１８゛間違った陽性”の合計零１１　７　１“間違った陽性′の　％　９２　５８　８京ウェスターン　プロットにより陰性。

１表は、非天然合成ペプチド４Ｓ３６及び５Ｓ７６のＢＳＡ結合結合用いてポリスチレンプレートをコーティングするＥＩＡ法の免疫反応性を示す。ペプチド４Ｓ３６及び５Ｓ７６を用いるアッセイでは１２サンプル中たった１個だけが（８％）陽性であったのに対し、デュポン及びゲネテイツクシステムズの商売上許可されたアッセイではそれぞれ１２中７（５８％）及び１２中１１（９２％）が陽性であった。これらの結果は、市販の２アツセイに比較して、実施例８及び図１１０において構成されたＥＩＡ試験の特異性がすぐれていることを示している。

去麹倒旦４Ｓ３６及び５Ｓ７６のＢＳＡ結合結合用いるＨＩＶ−１抗体に関する血清変換本発明の２つの非天然合成ペプチドの免疫反応性とを直接比較することができる。

結果は下記の２表に示される： °（神全く度を示した。

実施例１２結果は下の３表に示す。

１嚢実験的にＳＩＶに感染した７マカークザルのＨＩＶ−２抗体発現（血清変換）の検拝跡ペプチド−ＢＳＡ結合結合用る反応性０週＊　Ｏ／７　０／７　０／７３週　２／７　３／７　３／７４週　４７１　４／７　３／７６週　６／７　６／７　６／７８週　７７１　７／７　６／７１６週　７／７　７／７　７／’１み合わせを用いたものである。

実施例１３２ペプチド結合物のＨｒＶ−１血清に対する反応性〕ＨｒＶ−１ｇｐ４１ペプチドに対応するペプチド４ｓ３６　（ＶＷＧＣ３ＧＫＬＩＣＴＴＡＶＰＧＣ）　及び５Ｓ７６　（ＩＷＧＣＳＧＫＭＩＣＴＴＡＶＰＧＣ）　を実施例２の方法によりそれらのＣ末端を介して結合させ、これを実施例３のＥＩＡ法に用い、ＨＩＶ −１抗体陽性血清　３０、ＨＩＶ−２／ＳＩＶ抗体陽性血清　２３、ＨＩＶ−１抗体陰性血清　１５、ＨＩＶ−２／Ｓ　ＩＶ抗体陰性血ｍ　１５ｔ−試験した。

図１３Ａに示されるように、結合ペプチド４Ｓ３６及び５Ｓ７６はＨＩＶ−１抗体陽性サンプルのみを検出し、ＨＩＶ−２抗体陽性サンプル２３すべてを検出しなかった。ＨＩ　Ｖ−２／Ｓ　ｒ　Ｖ天然ペプチドに対応するペプチド２Ｓ２４　（ＤＱＡＲＬＮＳＷＧＣＡＦＲＱＶＣ）及び５Ｓ８６　（ＳＷＧＣＡＦＲＱＶＣＨＴＳＶＰＧＣ）を、実施例２の方法によりそれらのＣ末端を介してＢＳＡに結合させ、実施例３の方法によるＥＩＡ法に用い、上記の血清パネルを試験した。図１３Ｂに示されるように、結合ペプチド２Ｓ２４及び５Ｓ８６はＨＩＶ−２抗体陽性サンプル２３すべてを検出し、ＨＩＶ−１抗体陽性サンプル３０のうち４つは０．４以上のＡｎ□を与えた。検出ペプチド４Ｓ３６及び５Ｓ７６をそれから結合ペプチド２Ｓ２４及び５Ｓ８６と結合させ、ＥＩＡに用いて同じ血清パネルを試験した。図１３Ｃに示されるように、ＨｒＶ−１プラスＨＩＶ−２結合抗原プレートはＨＩＶ−１及びＨｒｖ−２抗体陽性をすべて検出した。ＨＩＶ− １又はＨＩＶ−２抗体陰性血？＞ｒすべ実施例１４図８は、ＳＭＣＣを用いてＣ末端を介してＢＳＡに結合し、ＨＩＶ−１抗体を含む人からの約５０の血清のプール、又はＨＩＶ−１抗体のない人からの約３０の血清のプールと反応させたときの、ＨＩＶ−１ｐ２４の合成ペプチドの免疫反応性及びＡＡ配列を示す。図かられかるように、ペプチド５Ｓ９３−５８９６を含むプールのみが明らかな免疫反応性を示し、そのプールのなかで特に、配列ＡＬＧＰＡＡＴＬＥＥＭＭＴＡＣＧＣをもつペプチド５Ｓ９４が免疫反応性ペプチドであることがわかった。リンカ−としてＳＭＣＣを用いてそのＣ末端を介してＢＳＡに結合したこのペプチドを、ＨＩＶ−１抗体を含む９８の個々の血清に対し、またこれを含まない８５の個々の血清に対して試験した。陰性血清は１つも反応しなかった（０／８５．０％）、１７の陽性血清（１７／９８．１７％）が免疫反応性であった。

無症候性感染から臨床的疾患及びＡＩＤＳへと進行する間に、ヒトにはｐ２４に対する抗体が失われることが報告されたし７ランチニ（Ｆｒａｎｃｈｉｎｉ）ら、憔液（Ｂｌｃｙｘｌ）”６９巻、（２）、４３７−４４１ページ、１９８７、及びウェーバ−（Ｗｅｂｅｒ）ら、ランセット（Ｌａｎｃｅｔ）　１巻１１９− １２２ページ、１９８７］、これは、被験血清ではこのペプチドに対する抗体の発生頻度が低いことを説明するものかも知れない。

実施例１５ＨＩＶ抗体を検出する迅速試験迅速試験を１５分以内に行うための試験装置を図１４及び１５のように作成した。

図１４及び図１５に関して言えば、装置は、複数のじょうご状のウェル（１２）をもつ（各ウェルは約２００マイクロリツターの容積をもつ）プラスチックスライド（１０）と、直径約９ｍｍの上方流入管へり（１４）と、直径約２ｍｍの底部流出管（１６）から成る。流出管（１６）の下面は、装置内のこれに続いて配貨されている膜フイルタ−（１８）と滑らかに均質に接触できるよう設計されている。膜フィルターは、そこを通過する反応体をその大きさによって分離し、あらかじめ定められた大きざ以上−例えば０．２２ミクロン以上−の粒子、又は０．４５　ミクロン以上の粒子を保持する（逆捩した特殊フィルターによって）、但しその装置にｆ６かれたその他のフィルターは、結合又は親和性によって分離することができる（すなわちニトロセルロース、ガラス）。フィルター膜の下には、ウェルに置かれた液体をすべて吸収する十分の厚さ及び吸収容量をもった吸収パッド（２０）がある。これら３成分は、頂部プレート（２２）と底部支持体（２４）とから成るプラスチックホールダー（２１）のなかにすっぽり入れられる。その入れ物の２部分は摩擦によってぴったり付き、スライド、フィルター膜及び吸収パッドを試験実施のために適したように支持するのに役立つ。

遊離ペプチド２ＳＯ９（ＩＷＧＣ３ＧＫＬＴＣＴＴＡＶＰＧＣ）及びリンカ−としてＳ　Ｍ　ＣＣを用いてＣ末端を介してＢＳＡに結合した（実施例２の方法による）ペプチド２Ｓ０９をコロイド金（粒度２０ナノメーター、ヤンセン　ライフ　サイエンシズ、ビス力タウエイ、ニューシャーシー、米国）と反応させた。

多大の努力にもかかわらず、遊離ペプチドはコロイド金とでは使用できなかった。それは電解質のように作用し、コロイド金を直ちに溶液から沈殿させた。数種類の遊離ペプチドを粒度２０のコロイド金に加えたが、結果は同じであった。２０ｎｍ金粒子は直ちに溶液から沈殿し、この効果がペプチド特異的ではないことがわかった。２Ｓ０９ペプチド−ＢＳＡ結合結合力はこれよりもずっとＢＳＡ単独の場合のように振る舞い、下記のようにペプチド−ＢＳＡ−Ａｕ結合物を作ることができた：Ｃ末端及びＳＭＣＣを介り、てＢｓＡｌ：結合サセタベブチド　ｒＷＧｃｓＧＫＬＩＣＴＴＡＶＰＧＣ８ｍＩｆｒｋ（Ａ２＋＋ｏ＝０．５０）を −晩４℃で蒸留水２Ｌに対して透析した。

直径２０ｍ１のコロイド金ゾル（Ｇ２０、ヤンセン　ライフ　サイエンシズ）２ｍｌｆＡを、０．２Ｎ　Ｋ２Ｃｏ、及び０．２Ｎ　Ｈ，ＰＯ４を用いてｐＨ５，０，５，２，５，５，５，８，６，０，６，１，６，４に調節した。凝集を防ぐために、ミクロタイター　プレートにおいて各ｐＨに調節した金ゾル溶液２００マイクロリッター量であらかじめチェックした。透析したペプチド結合物２０マイクロリッターを撹拌しながら各ｐＨ１，：調節した金ゾル溶液に加え（このとき色は変化しない）、２分間放置する。２絹のミクロタイター　ウェルに同じ金ゾル溶液を用意して対照とし、ペプチド−蛋白質結合物の代わりに緩衝液を加えた。１０％ＮａＣ！　５０マイクロリツターを各ウェルに加えた。ペプチド−ＢＳＡを含まないものは、金ゾルの凝集の結果、灰色になった。各ウェルのＡ　ｓｇｏを測定した。最低値（最良の保護を意味する）はｐＨ６，１＞ｐＨ６゜０）その他のｐＨであった。ｐＨ６，１でより多量の金ゾルを用いると、保護蛋白質の最小爪は透析ペプチド−ＢＳＡ　７０マイクロリツター（Ａ２ｇｏ＝０．４５）であることが確認された。ｐＨ６，１の透析ペプチド−ＢＳＡを１５０．０００　Ｘ　ｇで７０分間超遠心機にかけ、凝集物を除去し、超遠心物の上澄液で最小保護蛋白質研究を繰り返し同じ結果を得た。Ｇ２０金ゾル１ｍｌあたりペプチド−ＢＳＡの８５マイクロリツター量を保護のために選び、超遠心上澄液１５ｍ１を烈しく撹拌しながら２分間で金ゾル１７６ｍ１に加え、その後０．２ＮＫ２Ｃｏ、でｐＨを９．０に調節し、ｐＦ（９の１０％ＢＳＡを加えてＢＳＡの最終濃度を］％とした。その後溶液を４℃で３０分間　１２０００Ｘｇ　（平均）で遠心分離した。上澄液を吸引して捨てた３１０％のものは捨てずに、ベレットを懸濁させるために用いた。洗浄緩衝液トリス２０ｍＭ、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、］％ＢＳＡ、０．０５％ＮａＮ１、ｐＨ８，２を最初の量に加え、遠心分離を繰り返した。

上澄液除去、再懸濁、反復洗浄及び遠心を２度繰り返した、ｐＨ９，０に調節した同じ洗浄緩衝液を用いた。最終的再懸濁溶液のＡ５□。は６．６８で、色は深紅色であった。上と全く同じプロトコールで、ただしＨＩＶとは無関係のペプチド及びマイコバクテリウム属蛋白質配列を用いて対照ペプチド−ＢＳＡ結合結合力った。

ペプチド−ＢＳＡ−金納合物の免疫反応性を試験するために、未希釈の結合物１０マイクロリッターを、１％ＮＲＳ、１％ＢＳＡ、５０ｍＭ燐酸塩、１００ｍＭＮａＣ１，ｐＨ７，４，０，０５％ＮａＮ、で１　：　１００に希釈したヒト血清　２０マイクロリツターと混合し、室温で５分間インキュベートした。１％加熱滅菌５ｔａｐ。

ｈｙｌｏｃｎｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　Ｃｎｗａｎ株１２０マイクロリツターを各血清に加え、さらに５分間室温でインキュベートした。０．２２ミクロン　サイズの膜フィルターを有する上述の装置のウェル（１２）に各サンプル４５マイクロリツターを入れた。２０はＨＩＶ−１抗体を含み、２０はそれを含まない全部で４０の血清サンプルを試験した。各サンプルの液がその膜を通過し、吸収パッドに入った後、陽性血清サンプル２０のうち１９並びに陽性血清と共に用いたマイコバクテリウム属ペプチドーＢＳへ−金納合物においては赤紫色の点が残った。この試験は、この装置及びペプチドＢＳＡ−コロイド金結合物を用いてＨＩＶ抗体を検出する迅速試験が実行可能であることを示した。さらに、このような結合物をつくるためには遊離ペプチドは適さないこともわかった。

記のようにして証明された：非天然ペプチド４Ｓ３６　ｆＶＷＧｃｓＧＫＬＩｃＴＴＡＶＰＧＣ）　及び５Ｓ７０　（ｒＷＧｃｓＧＫＱＩＣＴＴＡＶＰＧＣ）’ ｃ、遊離ペプチドとして及び実施例２に記載の方法でシスティン結合−ＢＳＡ結合結合力て、下記のプロトコールによりカルボキシル化ラテックスに化学的に結合させた。１０％ラテックス　１２５マイクロリツター量を脱イオン水３７５マイクロリツター量に加え、等Ｑ（０，５ｍ１）の１Ｍカルボジイミド、ｐＨ４，５、と混合した。混合物を室温で１時間おだやかに振とうした。それから９０００Ｘｇで１０分間遠心分離し、上澄液を除去し、ペレットを脱イオン水、ｐＨ４，５、に再懸濁するという方法で３回洗った。遊離ペプチド　１ｍｇ／ｍｌ濃度（４Ｓ　３６及び５Ｓ７０の各ペプチド１ｍｌあたり５００マイクログラム）、又はペプチド４Ｓ３６及び５Ｓ７０のペプチド−ＢＳＡ結合結合力００マイクログラム／ｍ＋を最終的に洗浄した活性化ラテックスペレットに加えた（最初のラテックス容量１２５マイクロリツターあたりペプチド含有溶液１ｍｌ量）。ラテックス　ペプチド混合物を一晩４℃でおだやかに振とうした、それから９０００Ｘｇで１０分間遠心分離し、上澄液を除去した。活性化ラテックスと合一する前と後に、遊離ペプチド溶液の及びペプチド−ＢＳＡ結合物のＡ２１Ｉ０を測定したところ、結合物の６０％、及び遊離ペプチドの４５％がラテックスに結合していることがわかった。ラテックスと付着した遊離ペプチド又は結合物のベレットを、０．０３Ｍトリス、ｐＨ８，０，０，８％ＮａＣ１，１％ＢＳＡ及び０．０５％ＮａＮ、、から成る洗浄緩衝液と共に遠心分離することにより各３回洗った。最終的に洗浄したベレットは、ＮａＮ、濃度を０．１％に調節した同じ洗浄緩衝液（ラテックス希釈緩衝液）を用いてラテックス濃度０．６２５％になるように再悪濁させた。ペプチド−ＢＳＡ結合物をコーティングしたラテックスのこの保存溶液はラテックス希釈緩衝液で１：１０〜１：３０に希釈され、下記の迅速ＥＩＡ法に用い得ることが確認された。これに対して、遊離ペプチドをコーティングしたラテックスの保存溶液は、希釈しなくても、迅速ＥＴＡフォーマットにおいてＨＩＶ抗体を含むサンプルと含まないサンプルとを区別することができなかった。迅速ＥＩＡ法のために、血清標本を、０．８％ＮａＣｌ、０．０５％ＮａＮ３．０．０５％トライトンｘ−１００を含む０．０３Ｍ　トリス、ｐＨ８、から成る血清希釈緩衝液で希釈した。アッセイのために、希釈血清１滴（２０マイクロリツター）を１．１０希釈保存ラテックス１滴（２０マイクロリツター）に加え、混合し、試験管中で室温で１−２分間インキュベートした。この混合物１滴（２０マイクロリツター）を、０．４５ミクロン　サイズの膜フィルターを備えた実施例１５の迅速試験装ｒδに加えた。混合物はほとんど直ぐに装置内に流入し、それに続いて洗浄液（血清希釈緩衝液）各１滴（２０マイクロリツター）　、４ｍＭ　ＭｇＣｌ２を加えたラテックス希釈緩衝液で１・２０に希釈したヤギ抗ヒト免疫グロブリン（ガンマ鎖特異的、キャラペルーオルガノン　テクニカ、ＰＡ）に結合したアルカリホスファターゼから成るアルカリホスファターゼ結合物１滴、洗浄液１滴、基質１滴を次々に加えた。基質は、ＮＢＴ　にトロブルーテトラゾリウム、シグマ　ケミカル社、セントルイス、ミズリー、米国）及びＢＣＩＰ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルホスクェート、シグマ）の各々１００マイクログラム／ｍｌを含む１００ｍＭ１−リス緩衝液から成っていた。陽性は、図１４の２６に見られるように、概して２分以内にＩＩＱＩに青紫色の沈殿をあられした。陰性は、図１４の２８に見られるように、最低５分間は青色を発現しなかった。３−４分後に４　Ｎ　Ｈ２Ｓ　Ｏ４１滴を落とすことによって反応を止め、その試験装置は陽性（青紫色）又は陰性（白い膜）の永久的証拠として、その結果を記録するまで取っておくことができる。全部で２００のヒト血清（そのうち９８はＨＩＶ−１抗体を含み、１０２はそれを含んでいなかった）をこの迅速ＥＩＡで試験した。ＨＩＶを含むもの９７が迅速ＥＩＡフォーマットで紫色を与え、それを含まないものは一つも紫色を与えなかった。これは、上記のプロトコール及び試験装置を用いる迅速ＥＩＡを用いてＨＩＶ抗体を１５分以内に検出できることを証明した。さらに、非天然ペプチド４Ｓ３６及び５Ｓ７０のペプチド−ＢＳＡ結合物は迅速ＥＩＡに適しているが、同じペプチドでもそのアミン基を介してラテックスに共有結合した遊離ペプチドとしてこの試験に用いる場合はこれらのペプチドは許容できないことも明らかになった。ラテックスに受動的に吸着した遊離ペプチド４８３６は免疫反応性試薬を生成した、しかしその反応動態及び陽性及び陰性サンプル間の識別は、この試薬ではペプチド−ＢＳＡ結合物でつくったラテックス試薬よりもよくなかった。

実廊倒↓ヱＥ（ｒＶ−２抗体を検出する迅速ＥＩＡ試験実施例１６のカルボジイミド　カップリング法を用いて、ペプチド２Ｓ２４．５Ｓ８６、及び５Ｓ９２の共有結合したベブ升ドーＢＳＡ結合物を含むラテックスをつくった。その他に、２Ｓ２５はカルボキシル化ラテックスに受動的に吸着させた。

共有結合及び受動的吸着の前及び後に行ったＡ２８゜測定で、ペプチド−ＢＳＡ結合物３００マイクログラムが及び受動的吸着ペプチド２Ｓ２５の２３０マイクログラムが１０％ラテックス１２５マイクロリツターに結合することかわかった。実施例１６に示したように処理し使用した後、両試料共、ＨＩＶ−２抗体を含む血清サンプル（ＨＩＶ−２＋）とこれを含まない血清サンプル（ＨＩＶ−２− ）とを区別できることがわかった。しかしながらシスティン結合　ペプチド−ＢＳＡ結合物から６及び５Ｓ７０、図４）及びＨＩＶ−２（２Ｓ２４．５Ｓ８６．５Ｓ９２、図７）の両方をあられすペプチド−ＢＳＡ　ラテックス試薬の組み合わせを含めることによって、同じ試薬で）（ＴＶ−１又はＨＩＶ−２に対する抗体を検出することが可能になった。ＨＩＶ−１のみをあられすラテックス試薬は迅速試験でＨＩＶ−２抗体を確認することができなかったし、その反対も言える。

実施何上旦非結合ペプチドとの反応の阻止による、迅速ＥＩＡ試験において認められた陽性いて、競合又は阻害非結合ペプチドの存在する場合と存在しない場合で、ＨＩＶ −１ラテツクス試薬、ＨＩＶ−２ラテツクス試薬、及びＨＩＶ−１プラスＨＩ　Ｖ−２ラテツク又試薬で試験したときに得られた結果を示す。予想どうり、ＨＩＶ−１ペプチドのペプチド−ＢＳＡ結合物を含むラテックス試薬はＨＩＶ−１抗体を検出し、ＨＩＶ−２抗体を検出しなかった、そしてＨｒＶ−２ペプチドのペプチド−ＢＳＡ結合物を含むラテックス試薬はＨＩＶ−２抗体を検出したが、ＨＩＶ−１抗体を検出しなかった。それに対して、両ラテックス試薬の組み合わせは両方の抗体を検出した。ペプチド−ＢＳＡ結合物に使用されたものと同じＨＩＶ−１ｇｐ４１の遊離ペプチドは抗体のＨＩＶ−１結合を阻止したが、ＨＩ　Ｖ −２ラテツクス試薬を阻止しなかった、この反対も言える。これは、検出された抗体がＨｒＶ経膜的糖蛋白質に向けられることを確認し、さらにその抗体がＨＩＶ−１、又はＨＩＶ−２に、又は両方に向けられるのかどうかを明確にした。

土嚢迅速ＥＩＡ試験の免疫反応特異性非結合ペプチドに対する免疫反応性の阻害による確認ペプチド−ＢＳＡ　ラテックスの反応性１０　ＨＩｖｌｌプラス］００１１ｇ／ｉ＋Ｉ　Ｏ／　１０　０／　１０　０／　１０４Ｓ３６＆５Ｓ７６１０　ＨＩＶ士プラス１００４ｇ／＋ｎｌ　１０／１０　０／１０　１０／１０２Ｓ２５＆５Ｓ８６４　）（ｊＶ−２＋のみ　０／４　４／４　４／４４　ＨＩＶ　２７’ラスｌＯｈｇ／＋ｎｌ　Ｏ／４　０／４　０／４２Ｓ２５＆５Ｓ８６４　）ＩＴＶ２プラスｌＯｈｇ／ｍｌ　Ｏ／４　４／４　４／４４Ｓ３６＆５Ｓ７６本ペプチド４Ｓ３６＆及び５Ｓ７０がシスティンを介してＢＳＡに共有結合しているペプチド−ＢＳＡ結合物でコーティング木本ペプチド２Ｓ２４及び５Ｓ８６がシスティンを介してＢＳＡに共有結合しているペプチド−ＢＳＡでコーティングプチド濃度５００ｕｒ／ｍｌになるようにフロイント不完全アジュバントの乳濁液をつくる。この乳濁液の５０ｊｇｆｆｉをマウスにＩＰ注射するか、１００μ ｇ量を家兎に肩甲骨下に１Ｍ注射した。１力月後、同じ用量レベルでブースター免疫を再び行い、各動物の血清について、遊離ペプチドか、又はＫ　Ｌ　Ｈ結合物をつくるのに用いたもの（ＭＢＳ）とは異なるヘテロ三官能性リンカ−（ＳＭＣＣ）によってＢＳＡに結合したペプチドを使用して、ＥＩＡ法によってペプチドに対する抗体反応をテストした。多価血清が直接又はその後にブースター免疫を行った後に使用され、または、モノクローナル抗体が所望の場合はその後標準ハイブリドーマ法が行われる［ギリス（Ｇｉｌｌｉｓ）　＆ブチャナン（Ｂｕｃｌ＋ａｎａｎ）　、Ｉｎｆｅｃｔ　Ｉｍｍｕ　４９巻３７１　３７７ページ、１９８２コ。

Ｏ＜＜＜　ａ＜＜＜＜＜＜＜天然（Ｎ）または　Ａ４９２ペプチド番号　配列　非天然（Ｕ）、ＨＩＶ＋／ＨＩＶ・サンプル数サンプル数一一陣一一−ムムＱｏ、、　０１．ａ　０　ＬＡｏいＯｕ口サンプル数サンプル数アノフル奴サンプル数サンプル数

Claims

【特許請求の範囲】

１．液体サンプル中のＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２抗体の存在又は量を確認する方法であって、ＨＩＶ−１のｇｐ４１蛋白質又はＨＩＶ−２のｇｐ３２蛋白質の抗原ドメインに特異的な免疫特異性を有する少なくとも１つの合成ペプチドをもつ免疫特異的試薬と液体サンプルとを接触させ、その合成ペプチドはそのＣ末端を介して担体蛋白質に結合しており、免疫特異的試薬に結合した抗体の存在又は量を確認することから成る方法。
２．免疫特異的試薬が、【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；及びこれらのマルチマー、ポリマー、免疫反応性断片及びそれらの混合物から成る群から選択されたＨＩＶ−１のｇｐ４１蛋白質に特徴的な免疫反応特異性を有する少なくとも１つの合成ペプチド、又は【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；及びこれらのマルチマー、ポリマー、免疫反応性断片及びそれらの混合物から成る群から選択されたＨＩＶｇｐ３２蛋白質に特徴的な免疫反応特異性を有する少なくとも１つの合成ペプチドを含む請求項１記載の方法。
３．免疫特異的試薬がＣ末端を介して担体蛋白質に結合した少なくとも２つの合成ペプチドを含む請求項２記載の方法。
４．免疫特異的試薬がＨＩＶ−１のｇｐ４１の抗原ドメインに特徴的な免疫反応特異性を有する少なくとも２つの合成ペプチドを含む請求項３記載の方法。
５．免疫特異的試薬が４Ｓ３６、５Ｓ７６，ＡＢ１４，２Ｓ０４，２Ｓ０９及びこれらのマルチマー、ポリマー、及び免疫反応性断片から成る少なくとも２つのペプチドを含む請求項４記載の方法。
６．免疫特異的試薬がＨＩＶ−２のｇｐ３２の抗原ドメインに特徴的な免疫反応特異性を有する少なくとも２つのペプチドを含む請求項３記載の方法。
７．免疫特異的試薬がＡＢ１８，２Ｓ２４，２Ｓ２５，２Ｓ２７、５Ｓ８５，５Ｓ８６，５Ｓ９２，及びこれらのマルチマー、ポリマー、及び免疫反応性断片から選択される少なくとも２つのペプチドを含む請求項６記載の方法。
８．免疫特異的試薬が、ＨＩＶ−１のｇｐ４１蛋白質に特徴的な免疫反応特異性を有する少なくとも１つの合成ペプチドと、ＨＩＶ−２のｇｐ３２に特徴的な免疫反応特異性を有する少なくとも１つの合成ペプチドとを含む請求項３記載の方法。
９．免疫特異的試薬が４Ｓ３６、５Ｓ７６，ＡＢ１４，２Ｓ０４，２Ｓ０９、及ひこれらのマルチマー、ポリマー、及び免疫反応性断片から成る群から選択された少なくとも１つのペプチドと、ＡＢ１８、２Ｓ２４，２Ｓ２５、２Ｓ２７、５Ｓ８５、５Ｓ８６，５Ｓ９２及びこれらのマルチマー、ポリマー、及び免疫反応性断片から成る群から選択された少なくとも１つのペプチドとを含む請求項８記載の方法。
１０．免疫特異的試薬が固相に結合している請求項１記載の方法。
１１．ＨＩＶ−１のｇｐ４１に特徴的な免疫反応特異性を有し、そのＣ末端を介して担体蛋白質に結合し、【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；及びこれらのマルチマー、ポリマー、免疫反応性断片及びそれらの混合物から成る群から選択される少なくとも１つの合成ペプチド、又は【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；及びこれらのマルチマー、ポリマー、免疫反応性断片及びそれらの混合物から成る群から選択されるＨＩＶ−２のｇｐ３２蛋白質に特徴的な免疫反応特異性を有する少なくとも１つの合成ペプチドを含んで成る免疫特異的試薬。
１２．ＨＩＶ−１のｇｐ４１に特徴的な免疫反応特異性を有する少なくとも２つの合成ペプチドを含んで成る請求項１１記載の免疫特異的試薬。
１３．４Ｓ３６、５Ｓ７６，ＡＢ１４，２Ｓ０４，２Ｓ０９，及びこれらのマルチマー、ポリマー、及び免疫反応性断片から成る群から選択される少なくとも２つのペプチドを含んで成る請求項１２記載の免疫特異的試薬。
１４．ＨＩＶ−２のｇｐ３２に特徴的な免疫反応特異性を有する少なくとも２つの合成ペプチドを含んで成る請求項１１記載の免疫特異的試薬。
１５．ＡＢ１８，２Ｓ２４，２Ｓ２５，２Ｓ２７、５Ｓ８５，５Ｓ８６，５Ｓ９２，及びこれらのマルチマー、ポリマー、及び免疫反応性断片から成る群から選択される少なくとも２つのペプチドを含んで成る請求項１４記載の方法。
１６．ｇｐ４１の免疫反応特異性を有する少なくとも１つのペプチドとｇｐ３２の免疫反応特異性を有する少なくとも１つのペプチドとを含む請求項１１記載の免疫特異的試薬。
１７．ペプチド４Ｓ３６、５Ｓ７６，２Ｓ２４，５Ｓ８６、ＡＢ１４、ＡＢ１８から成る請求項１０記載の免疫特異的試薬。
１８．【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；及びこれらのマルチマー、ポリマー、免疫反応性断片及びそれらの混合物から成る群から選択される合成ペプチド。
１９．請求項１１記載の少なくとも１つの免疫特異的試薬を含んで成る診断用キット。
２０．動物を請求項１１記載の免疫特異的試薬で免疫し、その動物によって生成された抗体又は抗体産生リンパ球を回収することから成るＨＩＶ−１又はＨＩＶ −２抗体の製法。
２１．その（ペプチドの）Ｃ末端を介して担体蛋白質に結合した請求項１８記載のペプチドを少なくとも１つは含む免疫原。
２２．請求項２１記載の免疫原に対して生じた抗体。