JPH04502402A - 組み換えフラジエリンのワクチン - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 組み換えＤＮＡ技術は、特定のＤＮＡ配列をＤＮＡベヒクル（ベクター）中に挿 入して、宿主細胞中で複製することができる組み換えＤＮＡ分子を形成すること を包含する。一般に、挿入されたＤＮＡ配列は、受容体ＤＮＡベヒクル、すなわ ち、挿入されたＤＮＡ配列に対して外来であり、そしてＤＮＡベクターは遺伝子 情報を交換性質をもたない有機体から誘導されるか、あるいは挿入されたＤＮＡ 配列は完全にまたは部分的に合成的に作ることができる。組み換えＤＮＡ分子を 構成できる、いくつかの一般の方法は開発された。

構成に使用される方法に無関係に、組み換えＤＮＡ分子は宿主細胞と適合性でな くてはならない、すなわち、１または２以上の宿主細胞の染色体またはプラスミ ド中に安定に組み込まれることができなくてはならない。組み換えＤＮＡ分子は 、好ましくは、また、所望の組み換えＤＮＡ分子の選択を可能とするマーカー機 能を有するべきである。さらに、適切な複製、転写、および翻訳のシグナルのす べてが組み換えベクター上に正しく配置されており、外来遺伝子は、例えば、形 質転換されたバクテリア細胞中で、バクテリア発現プラスミドの場合において、 あるいは組み換えウィルスで感染されているかまたは適当な複製の由来を有する 組み換えプラスミドをもつ、許容性細胞系または宿主において、適切に発現され るであろう。

異なる遺伝子シグナルおよびプロセシングの事象は、遺伝子の発現、例えば、Ｄ ＮＡの転写およびメツセンジャーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）の翻訳のレベルをコント ロールする。ＤＮＡの転写はプロモーターの存在に依存し、このプロモーターは ＲＮＡポリメラーゼの結合を指令し、これによりｍＲＮＡの合成を促進する。真 核生物のプロモーターのＤＮＡ配列は、原核生物のプロモーターのそれらと異な る。さらに、真核生物のプロモーターおよび付随する遺伝子シグナルは原核生物 の系において認識されることができないか、あるいは機能することができず、そ してさらに、原核生物のプロモーターは真核生物の細胞において認識されず、そ して機能しない。

同様に、原核生物におけるｍＲＮＡの翻訳は、適切な原核生物のシグナルの存在 に依存し、これらのシグナルは真核生物のそれらと異なる。

原核生物におけるｍＲＮＡの効率よい翻訳は、ｍＲＮＡ上のシャインーダルガル ノ（Ｓ／Ｄ）配列とよぶリポソーム結合部位を必要とする（ＳｈｉｎｅＳＪ、お よびＤａｌｇａｒｎｏ、Ｌ、　、１９７５、Ｎａｔｕｒｅ、２５４　：　３４− ３８）。この配列はｍＲＮＡの短いヌクレオチド配列であり、開始コドン、通常 ＡＵＧの前に位置し、こえはタンパク質のアミノ末端の（ホルミル−）メチオニ ンをエンコードする。Ｓ／Ｄ配列（シ１６Ｓ　ｒＲＮＡ（リポソームのＲＮＡ） の３°末端に対して相補的であり、そして多分リポソームへのｍＲＮＡの結合を ｒＲＮＡとの二重らせん化により促進して、リポソームの正しい位置決定を可能 とする（Ｓｈｉｎｅ％Ｊ、およびＤａｌｇａｒｎｏ、Ｌ、　、１９７５、Ｎａｔ ｕｒｅ、２５４　：　３４−３８）。

クローニングした遺伝子の首尾よい発現は、十分なりＮＡの転写、ｍＲＮＡの翻 訳、およびある場合において、タンパク質の翻訳後の修飾を必要とする。ベクタ ーの発現を使用して、適当な宿主中で活性なプロモーターの制御下に遺伝子を発 現し、そしてタンパク質の産生を増加することができる。

ワクチン ウィルス、バクテリア、菌類または寄生体の病気の予防のためのワクチンの開発 が、非常に多（の研究の努力が集中されている。

ワクチンを調製する伝統的方法は、不活性化または減衰された病原体の使用を包 含する。病原性微生物の適当な不活性化は生物学的因子としてそれを無害とする が、その免疫原性を破壊しない。次いで、これらの「殺した」粒子を宿主中に注 入すると、将来の微生物よる感染を防止することができる免疫応答を引き出すで あろう。しかしながら、殺したワクチン（不活性化した病原体を使用する）の使 用において主要な関心は、すべての微生物粒子を不活性化することに失敗した。

これが達成されたときでさえ、殺した病原体はそれらの宿主中で増殖しないので 、あるいは他の未知の理由のために、達成される免疫性はしばしば不完全であり 、寿命が短く、そして多数の免疫化を必要とする。最後に、不活性化方法は微生 物の抗原を変更し、それらを免疫原としての有効性を低下する。

減衰は、病気発生能力を本質的に失なった、病原性微生物の菌株の産生を呼ぶ。

これを達成する１つの方法は、微生物を異常な増殖条件および／または細胞培養 における頻繁な継代培養に暴露することである。次いで、ビルレンスを損失した が、まだ免疫応答を引き出すことができる突然変異原を選択する。減衰した病原 体は、宿主細胞中で実際に増殖するので、すぐれた免疫原をしばしば作り、そし て長く持続する免疫性を引き出す。しかしながら、生ワクチンの使用のときいく つかの問題に直面し、最も面倒なことは不十分な減衰化およびビルレンスへの復 帰の危険である。

上の方法に対する別法はサブユニットのワクチンの使用である。これは関連する 免疫学的物質を含有する成分のみを使用する免疫化を包含する。

ワクチンは、しばしば、種々のアジュバントを使用して配合され、そして接種さ れる。アジュバントは、免疫原を単独で投与する場合より、より少ない量の抗原 またはより少ない回数の投与を使用して、より耐久性のより高いレベルの免疫性 の達成を促進する。アジュバントの作用の機構は複雑であり、そして完全には理 解されていない。しかしながら、それはシトキン（ｃｙｔｏｋｆｎｅ）の産生、 ファゴサイトーシスおよび網内皮細胞系の他の活性の刺激ならびに抗原の解放の 遅延および劣化を包含する。アジュバントの例は、フロインドアジュバント（完 全または不完全）、アジュバント６５（ビーナツツ油、マンニドモノオレエート およびアルミニウムモノステアレートを含有する）、プルロニックポリオールＬ −１２１、アブリジン、および鉱物ゲル、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸 アルンミニウムなどを包含する。フロインドアジュバントは、代謝不可能な鉱油 を含有しそして潜在的に発癌物質であるので、ヒトのためのワクチン配合物にお いてもはや使用されない。

生きている、減衰されたサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）は、同族体のビル レントな菌株による対抗に対する保護的免疫応答を刺激することができることが 実証された（ゲルマニア−１Ｒ３およびフレル、Ｅ。

１９７５、Ｊ、Ｉｎｆｅｃ、Ｄｊｓ、　、１８１：５５３；ゲルマニア−１Ｒ， ，１９８４、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｖａｃｃｉｎｅｓ、アカデミツク・プレス、 ニューヨーク、ｐｐ、１３７−１６５；レビン、Ｍ、　Ｍ。

ら、１９８３、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｒｅｖ、　、４７：５１０；ワーデン、Ｍ 、Ｈ，ら、１９８２、Ｊ、Ｉｎｆｅｃ、Ｄｉｓ、、１４５：２９２；ホイセス、 Ｓ、　Ｋ、およびストッカー、Ｂ、Ａ、Ｄ、　、１９８１、Ｎａｔｕｒｅ　２９ １：２３８；ストッカー、Ｂ、Ａ、Ｄ、　、ら、１９８２、Ｄｅｖ、Ｂｉｏｌ、 Ｓｔｄ、５３：４７；リンドバーグ、Ａ、　Ａ。

およびロパートソン、Ｊ、Ａ、　、１９８３、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ。

４１ニア５１；ロバートソン、Ｊ、Ａ、ら、１９８３、Ｉｎｆｅｃｔ。

Ｉｍｍｕｎ、４１　：　７４２　；スミス、Ｂ、Ｐ、ら、１９８４、Ａｍ、Ｊ。

Ｖｅｔ、Ｒｅｓ、４５：２２３１；スミス、Ｂ、Ｐ、ら、１９８４、Ａｍ、Ｊ、 Ｖｅｔ、Ｒｅｓ、４５：５９；モウサー、■、ら、１９８０、Ｍｅｄ、Ｍｊｃｒ ｏｂｉｏｌ、１ｍｍ、１６８：１１９）、さらに、投入かの研究者らは、外来抗 原をエンコードするプラスミドを収容する、減衰したサルモネラ（Ｓａ　１ｍｏ ｎｅ　１１　ａ）を利用して、免疫系にこれらの外来抗原を供給した（フォルマ ル、Ｓ、Ｂ、ら、１９８１、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、３４　：　７４６　； 米国特許第４，６３２，８３０号（フォルマルら）；クレメンツ、Ｊ、Ｄ、ら、 １９８６、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、５３：６８５；ｖスケル、Ｄ、Ｊ、ら、 １９８７、Ｍｉｃｒｏｂ、Ｐａｔｈ、２＋２１１；ブラウン、Ａ、ら、Ｊ、Ｉｎ ｆｅｃ、Ｄｉｓ、、１５５：８６；　ドウガン、Ｇ、ら、１９８７．Ｐａｒａｓ ｉｔｅ　Ｉｍｍｕ、：１５１）。

プラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）種のサーカムスボロゾイト（ｃｉｒｃ ｕｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ）タンパク質に関連する反復免疫優生エピトープは、保 護的体液のための標的（および可能な細胞仲介された）マラリアのスポロゾイト と考えられる（ミラー、Ｌ、　Ｈ，ら、１９８６．５ｃｉｅｎｃｅ　２３４：１ ３４９）；これらの分子を認識し、そしてナイーブな受容体動物を受動的に保護 することができるモノクローナル抗体が記載された。これらの反復するエピトー プに基づく２種類のワクチンが七トにおいて試験され、そしである個体において 保護的免疫応答を誘発することが示された（バロウ、Ｗ、　Ｒ，ら、１９８７、 Ｌａｎｃｅｔ　ｉ：１２７７；ヘリングトン、Ｄ、ら、１９８７、Ｎａｔｕｒｅ 　３２８　：　２５７）。

コレラの毒素は、下痢の病気を仲介し、そして構造、機能および免疫原性におい て関係する、バクテリアのエンテロトキシンの１族のプロトタイプである。この 族の他の構成員は、ヒトから（ヤマモト、Ｔ、およびヨコタ、Ｔ、　、１９８３ 、Ｊ、Ｂａｃｔｒｉｏｌｏｇｙ　１５５ニア２８）およびブタから（レオング、 Ｊ、ら、１９８５、Ｉｎｆｅｃｔ。

Ｉｍｍｕｎ、４８　：　７３）分離されたＥ、ｃｏｌｉの熱不安定性毒素、およ びサルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕ ｍ）から（フィンケルスティン、Ｒ，Ａ、ら、１９８３、ＦＥＮＳ　Ｍｉｃｒｏ ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　１７：２３９）およびカンプロバクチル・ジ ェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉ）から（ワルカー、Ｒ，１ ，ら、１９８６、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ｒｅｖ、５０：８１）の毒素を包 含する。ＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ活性を仲介し、アデニレートサイ クラーゼを活性化させ、究極的に標的細胞を死亡させるＡサブユニットは、これ らの毒素のすべてに対して共通する。さらに、これらの毒素のすべては、標的細 胞へのホロトキシンの結合を仲介する、免疫学的に優生なりサブユニットを含有 する。Ｂサブユニットそれ自体は無毒であり、そしてこの分子を使用する免疫化 は毒素中和性抗体の形成を誘発する。−バクテリアのエキソトキシン（コレラの 毒素、Ｅ、ｃｏｌｉの熱不安定性毒素）の無毒の結合性サブユニットを使用する 免疫化による、毒素中和性抗体の形成に基づくワクチンの応答は提案された（ジ ャコブ、Ｃ００、，１９８３、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ 、Ａ。

８０ニア６１１；ジャコブ、Ｃ，Ｏ，，１９８４、ＥＭＢＯＪ、３：２８９９） 。

Ｂ型肝炎のヴイリオンは、小さいＤＮＡゲノムを含有する４２ｎｍのエンヴエロ ープ構造である。エンヴエロープタンパク質はＳ遺伝子（ｐｒｅＳ、ｐｒｅｓｓ およびＳ）　、ＨＢＶゲノムの４つのオーブンリーディングフレームの１、によ りエンコードされる（チオライス、Ｐ、ら、Ｎａｔｕｒｅ　３１４：４８９）。

これらのポリペプチドはＢ型肝炎の表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を含有する。ヒトの 血漿から誘導された粒子または組み換えＤＮＡ方法により産生された同様なＨＢ ＳＡｇ粒子（それらのあるものはｐｒｅＳエピトープを欠く）は、保護的免疫応 答を引き出すことが示され、そして精製された粒子はＨＢＶのための現在のワク チンを表す（クルグマン、Ｓ、　、１９８２、Ｊ、Ａｍ、Ｍｅｄ、Ａｓｓ。

ｃ、２４７：２０１２）。

フラジェリン フラジェリンは、バクテリア細胞の運動に含まれるオルガネラである。

構造タンパク質の合成およびアセンブリングされた鞭毛の実際の機能は、多数の 遺伝子および遺伝子産生物の相互作用を包含する複雑なプロセスである（イイノ 、Ｔ、による外観、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｇｅｎｅｔ、１１：１６１）。Ｅ、ｃｏｌ ｉ中の鞭毛の役割を演する３５より多い遺伝子が定められ、そしてこれらののう ちの少なくとも１７についての遺伝子産生物が同定された。実際の鞭毛のオルガ ネラは、３つの主要な構造要素から構成され、そして細胞の細胞質から、細胞膜 を横切って広がり、そして大きい細胞外ドメインにおいて最高潮に達する。フィ ラメントは単一のサブユニットのタンパク質、フラジェリンから構成され、そし て合計の質量の９５％以上に及ぶ、オルガネラの主要な構造成分である。

フラジェリンについての構造遺伝子はサルモネラ（Ｓａ　Ｉｍｏｎｅ　Ｉ　］ａ ）においてＨｌおよびＨ２（イイノ、Ｔ、、１９６９、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、Ｒ ｅｖ、３３：４５４−４７５Ｌバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕ ｂｔｉｌｉｓ）においてＨ（ジョイス、Ｔ、　Ｍ。

およびフランケル、Ｒ，Ｗ、　、１９６７、Ｊ、ＢａｃｔｒｉｏｌｏｇＶ９４　 ：　３２−３７）および緑１１１菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎ ｏｓａ）においてＨ（イイノ、Ｔ、、１９６９、Ａｎｎ、　Ｒｅｐ。

Ｎａｔｌ、ｒｎｓｔ、Ｇｅｎｔ、Ｊｐｎ、２０＋９４）およびＥ、ｃ。

１ｉにおいてｈａｇ　（アームストロング、Ｊ、Ｂ、およびアドラー、Ｊ。

１９６９、Ｊ、Ｂａｃｔｒｉｏｌ、９７＋１５６−１６１）と名付けられた。基 礎の本体はオルガネラの最も複雑な部分であり、そしてオルガネラを細胞に定着 しそしてフィラメントを回転するモータ一様装置の部分として働く。最後に、フ ックはフィラメントを基礎の本体に取り付ける働きをする。

フィラメントの回転は鞭毛が仲介する運動の原因である。各フィラメントは、典 型的には長さが５〜１０μのらせん構造を生ずる、フラジェリンサブユニットの 数千のコピーから成る（大部分のＥ、ｃｏｌｉおよびサルモネラ（Ｓａ　Ｉｍｏ ｎｅ　ｌ　Ｉ　ａ）種について；マクナブ、Ｐｌ、１９８７、大腸菌およびサル モネラ・チフィムリウム（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ａｎｄ　Ｓａｌ ｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍＬプントハート、Ｆ、Ｃ，編、アメリ カ微生物学学会、ワシントンＤＣ，ｐｐ、７Ｏ−８３）。フラジェリンの構造遺 伝子における突然変異は、フィラントの形成の効率、フィラントの形状、フラジ ェロトロービック（ｆｌａｇｅｌｌｏｔｒｏｐｉｃ）ファージに対する感受性、 および／または鞭毛の抗原特異性を変化させることが観察された（ヤマグチ、Ｓ 、およびイイノ、Ｔ、１９６９、Ｊ、Ｇｅｎ、ＭｉｃｒｏｂｉｏＬ　５５：５９ −７４；イイノ、Ｔ、ら、１９７４、Ｊ、Ｇｅｎ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、８１：３７−４５；ホリグチ、Ｔ５　ら、１９７５、Ｊ、 Ｇｅｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、９１：１３９−１４９）ｏフィラントは、成長す るフィラントの末端にフラジェリンのモノマーを順次に付加することによって細 胞外でアセンブリングされ、そして伸長速度は成長が停止するまでフィラントの 長さと逆に減少し、こうしてフィラントの長さを調節する。

鞭毛は、棒状およびらせん状のバクテリアの表面上に、主として見いだされるが 、表面のみに存在するわかではなく、このようなバクテリアは次のものを包含す る：エシエリヒア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎ ｅｌｌａ）、プロテウス属（ＰｒＯｔｅｕＳ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄ ｏｍｏｎａｓ）　、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、カンピロバクチル属（Ｃ ａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）、トレポネマ属（Ｔ ｒｅｐｏｎｅｍａ）、レギオネラ属（Ｌｇｉｏｎｅｌｌａ）、クロストリシア属 （Ｃ１ｏｓｔｒｆｄｉａ）、カウロバクテル（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ）など。

これらの鞭毛は、同−機能を果すが、属を通じて２８〜６６ｋＣＩの範囲の分子 量の多形体である。高い程度の抗原の多形性は、単一の属、例えば、サルモネラ （Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）内でさえ見られ、そして単一の種内の個々の血清型の 同定に有用である（エドワーズ、Ｐ、　Ｒ，およびエウィング、Ｗ、Ｈ，，１９ ７２、腸内細菌科の同定（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｅｎｔｅｒｏ ｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、第３版、バーガス・パブリッシング・カンパニー 、ミネソタ州ミネアポリス）。いくつかのバクテリアの鞭毛の構造の分析は、異 なるバクテリアから分離されたフィラメントのうちで共通の構成を明らかにした （ウェイ、Ｌ、−Ｎ、およびジョイス、Ｔ、Ｍ、　、１９８５、Ｊ、　Ｍｏ１． 　Ｂｉｏｌ、１８６：７９１；プランジ、Ｒ，Ｊ、ら、１９７６、Ｊ、Ｂｉｏ　 １．Ｃｈｅｍ、２５１　：　７０５　；ギル、Ｐ、　Ｒ，およびアガビアン、Ｊ 、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５８ニア３９５）、これらの分子のアミノ末端および カルボキシ末端に高度のタンパク質配列の相同性、および異なる鞭毛の間の抗原 の多様性の原因である多形性中心領域の存在は、最も衝撃的である。

バクテリアの表面上の抗原に対する宿主の免疫応答は、よく文献に記載されてい る（ホロウィッツ、Ｓ、　Ａ、ら、１９８７、Ｉｎｆｅｃｔ。

Ｉｍｍｕｎ、５５　：１３１４　；カイトウ、Ｙ、ら、１９８７、ＩｎｆｅＣｔ 、Ｉｍｍｕｎ、５５：８３２；ザング、Ｙ、Ｘ、ら、１９８７、Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３８：５７５；ノルガルド、Ｍ、Ｖ、　、１９８６、Ｉｎｆ ｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、　、５４：５００；ナギイ、Ｌ、　Ｋ、　、１９８５、Ｙ ｅｔ、Ｒｅｃ、１１７：４０８；レビン、Ｍ、　Ｍ、ら、１９８４、Ｉｎｆｅｃ ｔ、Ｉｍｍｕｎ、４４：４０９；ザク、Ｋ、ら、１９８４、Ｊ、Ｉｎｆｅｃ、Ｄ ｉｓ、１４９：１６６）６鞭毛、およびことに鞭毛のフィラメントは、自然の感 染および人工的免疫化の条件下に効力のある免疫原であることが示され、そしで ある場合において、鞭毛上に　。

存在する抗原決定基に対する応答は保護的であることが示された：ヤング、Ｒ， Ｊ、ら、１９７９、Ｊｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、２５：２２０；エウバンクス、 Ｅ、Ｒ，ら、１９７６、ＩｎｆｅＣｔ、Ｉｍｍｕｎ。

１５　：　５３３　；スミス、Ｈ，Ｌ、Ｊｒ、　、１９７４、Ａｐｐ、Ｍｉｃｒ ｏ、２７：３７５；ドウアー、Ｊ、Ｍ、およびマツカイ、１．　Ｒ，，１９７２ 、ｆｎｔ、Ａｒｃｈ、Ａｌｌｅｒｇｙ　Ａｐｐｌ、１ｍｍ、４３：　４３４　； エベルソール、Ｊ、Ｌ、およびモリナリ、Ｊ、　Ａ、　、１９７６、Ｉｎｆｅｃ ｔ、Ｉｍｍｕｎ、１３：５３：！ベルソール、Ｊ、　Ｌ。

ら、１９７５、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、１２：３５３；ステベンソン、Ｊ、 　Ｒ，およびストロンガー、Ｋ、Ａ、　、１９８０、Ａｍ、Ｊ、Ｖｅｔ、Ｒｅｓ 、４１：６５０；タムラ、Ｙ、ら、１９８４、Ｍｉｃｒｏ。

Ｉｍｍ、２８　：１３２５）、クワジ？（１９８８、Ｊ、Ｂａｃｔ、１７０：４ ８５）は、フラジェリン構造遺伝子の中央領域中に欠失を導入することによって 、変更した鞭毛の抗原性をもつＥ、ｃｏｌｉの突然変異を産生ずることを記載し た。

米国特許第４．７０２．９１１号は、ワクチン配合物における、外側のバクテリ ア表面に取り付けられた、バクテリアの線毛、髪の毛様のオルガネラの精製され たサブユニットの使用を開示している。

国際ＰＣＴ公開Ｎ、ＷＯ３７１０２３８５，１９８７年４月２３日発行、は、Ｂ 、５ｕｂｔｉｌｉｓフラジエリ）ｈａｇ遺伝子との融合タンパク質として、プロ インスリン配列およびベーターラクタマーゼの発現を開示している。

発明の要約 本発明は、組み換え遺伝子および組み換えフラジェリン融合タンパク質である、 それらのエンコードされたタンパク質に関する。このようなタンパク質は、機能 的フラジェリン構造遺伝子によりエンコードされたエピトープおよび異種有機体 の少なくとも１つのエピトープからなり、前記エピトープは融合タンパク質をを 椎動物の宿主中に導入するとき免疫原性である。これらのエピトープはＢ細胞お よび／またはＴ細胞のエピトープにより認識される。異種有機体のエピトープは 、エンコードされたフラジェリンの機能に対して非必須であり、しかもその機能 を破壊しない、例えば、フラジェリン構造遺伝子の超可変性（ｈｙｐｅｒｖａｒ ｉａｂｌｅ）領域に、挿入することができる。と（に好ましい実施態様において 、異種有機体のエピトープは、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）Ｈｌ−ｄ遺 伝子の自然ＥｃｏＲＶ部位の間に挿入される。本発明の組み換えフラジェリンタ ンパク質を細胞表面に輸送され、ここで、好ましい実施態様において、それらは 異種エピトープを含有する機能的フラジェリンにアセンブリングする。他の実施 態様において、本発明の組み換えフラジェリン融合タンパク質は細胞、粘膜また は体液の応答を誘発することができる。

組み換えフラジェリン遺伝子およびタンパク質は、異種有機体により感染に対す る保護のためのワクチンとして使用するために配合することができる。それらは 、また、異種有機体の抗原により引き起こされる状態または疾患に対する保護を 提供することができる。本発明による組み換えフラジェリン融合タンパク質とし ての発現は、体液、粘膜および／または細胞仲介免疫応答を包含する、免疫応答 を刺激するための、免疫原の形態で任意の所望のエピトープを発現する方法を提 供する。特定の実施態様において、本発明の組み換えフラジェリン遺伝子は、経 口的生ワクチン配合物中で、減衰した侵入性バクテリアにより発現することがで きる。他の特定の実施態様において、組み換えフラジェリン融合タンパク質はサ ブユニットのワクチンにおいて使用するために配合することができる。

実施例の節において詳細に脱去する本発明の特定の実施態様において、コレラ（ Ｃｈｏｌｅｒａ）毒素のＢサブユニット、Ｂ型肝炎の表面抗原およびｐｒｅ表面 抗原、ロタウィルスのＶＰ７ポリペプチド、）（ＩＶのエンヴエローブ糖タンパ ク賀、および連鎖法菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃ。

ｃｃｕｓ）のＭタンパク質は、組み換えフラジェリン融合タンパク賃上で発現さ れ、これらのタンパク質は機能的フラジェリン中にアセンブリングされ、そして を椎動物の宿主中で、異種エピトープに対して向けられた免疫応答を誘発する。

定義 ｂｐ　＝塩基対 ＣＲＭ１９７　＝突然変異のジフテリアの毒素の分子ＣＳ　＝サーカムスボロゾ イト ＣＴ−Ｂ　＝コレラ毒素ＢサブユニットＣＴＰ３　＝コレラ毒素のＢサブユニッ トのアミノ酸残基番号５０〜６４を表すペプチド（ジャコブ、ＣＯＯ０ら、Ｐｒ ｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、８１　：　７８９３）ＤＰＡ ＰＰＮＡＮ　＝ペプチド（ａｓｐ−ｐｒｏ−ａｌａ−ｐｒｏ−ｐｒｏ−ａｓｎ− ａｌａ−ａｓｎ）プラスモジウム・ベルブヘイ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｂｅｒ ｇｈｅｉ）のサーカムスポロゾイトのタンパク質の免疫優生コンセンサス反復エ ピトープを表す ＤＴＴ　＝ジチオスレイトール ＥＬＩＳＡ　＝酵素連鎖免疫収着アッセイＨＢｓＡｇ　＝Ｂ型肝炎の表面抗原 ＨＩＶ　＝ヒトの免疫欠損ウィルス ｋｄ　ミキロダルトン ＫＬＨ＝キーホールリンペットヘモシアニンＭａｂ　＝モノクローナル抗体 ＮＡＮＰ　＝ペプチド（ａ　ｓ　ｎ−ａ　ｌ　ａ−ａ　ｓ　ｎ−ｐ　ｒ　ｏ）プ ラスモジウム・ファルシパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ）のサーカムスポロゾイトのタンパク質の免疫優生の反復エピトープを表す ＰＡＧＥ　＝ポリアクリルアミドゲルの電気泳動ＰＢＳ　＝リン酸塩緩衝液 ＲＶＳ　＝ＲＳウィルス ＶＰ７　＝ロタウィルスの主要な外殻ポリペプチド第１図。Ｈｌ−ｄフラジェリ ン構造遺伝子をエンコードする、プラスミ）”ｐＬｓ４０２、ｐＰＸ１６５１、 およびｐＬｓ４０８（７）線図的表示。

プラスミドｐＬｓ４０２は、ｐＢＲ３２２中で構成したサルモネラ・ムエンチｚ ン（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｍｕｅｎｃｈｅｎ）ＤＮＡのゲノムライブラリーか ら分離した（ウェイ、Ｌ、−Ｎ、およびジョイス、Ｔ。

Ｍ、、１９８５、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、１８６：７９１）、）Ｉｆ−ｄフラジ ェリン遺伝子のための解読領域（暗くした区域）は、３．　８ｋｂのＥｃｏＲＩ ゲノム断片中に存在し、そして２つのＥｃｏＲＶ制限部位を含有する。追加のＥ ｃｏＲＶ部位はベクター上に存在する。２つのサブクローン、プラスミドｐＰＸ １６５１およびｐＬｓ４０８は、まずｐＬＳ４０２の３．８ｋｂのゲノム断片を 、それぞれ、ｐＵｃ１８およびｐＵｃ１９のＥｃｏＲ１部位中に挿入し、それぞ れ、構成体ｐＰＸ１６５０およびｐＬｓ４０５を生ずることによって構成した。

次いで、５１ｂｐのＥｃｏＲＶ断片をこれらのプラスミドの各々から欠失して、 プラスミドｐＰＸ１６５１およびｐＬｓ４０８を産生し、それらの各々はここで 外来エピトープを特定するオリゴヌクレオチドの挿入のために利用できる独特Ｅ ｃｏＲＶ制限部位を有した。

第２Ａ図。Ｈｌ−ｄフラジェリンタンパク質の概略的表示。超可変領域ＩＶは交 差ハツチングにより表されている。対応する遺伝子配列中のＥｃｏＲＶ制限部位 の位置が示されている。

第２Ｂ図。Ｈｌ−ｄフラジェリン遺伝子のヌクレオチドおよび推定したアミノ酸 配列（ウェイ、Ｌ、−Ｎ、およびジョイス、Ｔ、Ｍ、、１９８５、Ｊ、Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、　、１８６：７９１から）。ＥｃｏＲＶの制限部位は下線を引かれて いる。

第３Ａ図。プラスモジウム・ファルシパルム（Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）のサ ーカムスポロゾイトの反復エピトープ（ＮＡＮＰ）の３つの完全なコピーおよび ２つの半分のコピーをエンコードする、合成オリゴヌクレオチドのヌクレオチド および推定されたアミノ酸配列。

第３Ｂ図。プラスモジウム・ベルブヘイ（Ｐ、ｂｅｒｇｈｅｉ）ののサーカムス ポロゾイトの反復エピトープ（ＮＡＮＰ）の３つの完全なコピーおよび２つの半 分のコピーをエンコードする、合成オリゴヌクレオチドのヌクレオチドおよび推 定されたアミノ酸配列。

第４Ａ図。ＣＴＰ３エピトープの位置を例示するコレラ毒素Ｂサブユニットのタ ンパク質の概略的表示。

第４Ｂ図。コレラ毒素ＢサブユニットのＣＴＰ３エピトープをエンコードする、 合成オリゴヌクレオチドのヌクレオチドおよび推定されたアミノ酸配列。アニー リングしたオリゴヌクレオチドをクレノー酵素で処理して、実施例１に記載する ように、プラスミドベクター中への結合の前に、平滑末端をつくった。

第５図。実施例１に記載されているように構成した、組み換えフラジェリン融合 タンパク質の概略的表示。交差ハツチングした区域は、示すように、プラスモジ ウム・ファルシパルム（Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）またはプラスモジウム・ベ ルブヘイ（Ｐ、ｂｅｒｇｈｅｉ）のＣＳタンパク質から、またはコレラ毒素（Ｃ Ｔ−Ｂ）のＢサブユニットからの異種配列を表す。

第６図。減衰したサルモネラ（Ｓａ　Ｉｍｏｎｅ　Ｉ　ｌａ）中で発現された組 み換えフラジェリンのウェスタン・プロット分析。細胞抽出物を、実施例１に記 載するように、電気泳動し、そしてニトロセルロースのフィルターに移した。組 み換えフラジェリン分子を検出するために使用した抗体プローブは、次の通りで あった：部分Ａ：ウサギ抗Ｈ１−ｄ抗血清；部分Ｂ：抗プラスモジウム・ベルブ ヘイ（Ｐ、ｂｅｒｇｈｅｉ）サーカムスボロゾイトＭａｂ３．２８；部分Ｃ：ニ ブラスモジラムファルシパルム（Ｐ、ｆａｌｃｔｐａｒｕｍ）サーカムスボロゾ イトＭａｂ４Ｄ９；部分Ｄ：ウサギ抗コレラ毒素アミノ酸残基５０−６４　（Ｃ ＴＰ３ペプチド）ペプチド血清。プラスミド構成体および宿主菌株を各レーンの 上に示す。

第７図。組み換えフラジェリンタンパク質で免疫化したマウス中のマラリアサー カムスポロゾイト（ＣＳ）エピトープに対する抗体の検出。

部分的に精製した野生型Ｈ１−ｄ鞭毛（プラスミドｐＰＸ１６５０によりエンコ ードされた）または２コピーのプラスモジウム・ベルブヘイ（Ｐ、ｂｅｒｇｈｅ ｉ）Ｃ８免疫優生反復（プラスミドｐＰＸ１６６１によりエンコードされた）で 、マウスを免疫化しそして促進した。−次免疫化後０．４および６週でこれらの 動物から得られた血清の系統的希釈物を、キーホールリンペットヘモシアニン（ ＫＩ、Ｈ）へカップリングした２コピーのプラスモジウム・ベルブヘイ（Ｐ、ｂ ｅｒｇｈｅｉ）Ｃ８反復から成る合成ペプチドへの結合について、ＥＬＩＳＡに よりアッセイした。表すデータは、５つの個々の動物／群から計算した平均値で ある。ａニブラスミドｐＰＸ１６５０、週０；ｂ＝プラスミドｐＰＸ１６５０、 週４：Ｃ：プラｘミ）’ｐＰＸ１６５０、週６；ｄニブラスミドｐＰＸ１６６１ 、週０；ｅニブラスミドｐＰＸ１６６１、週４；ｆニブラスミドｐＰＸ１６６１ 、週６゜ 第８図。組み換えフラジェリン融合タンパク質を発現する生きている減衰したサ ルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅ　１１　ａ）で免疫化したマウス中のマラリアサーカ ムスポロゾイト（Ｃ３）エピトープに対する抗体の検出。

マウスを実施例１に記載するように免疫化し、そして促進した。−次免疫化後０ ．４および６週でこれらの動物から得られた血清の系統的希釈物を、ＫＬＨヘカ ップリングした２コピーのプラスモジウム・ベルブヘイ（Ｐ、ｂｅｒｇｈｅｉ） Ｃ３反復から成る合成ペプチドへの結合について、ＥＬＩＳＡによりアッセイし た。表すデータは、群島たり１匹の動物のみが残る、週６を除外して、５つの個 々の動物／群から計算した平均値である。ａニブラスミドｐＰＸ１６５０、週０ ：ｂニブラスミドｐＰＸ１６５０、週４　；　ｃ　ニブラスミドｐＰＸ１６５０ ．　週６　；ｄ　ニブラスミドｐＰＸ１６６２、週０；ｅニブラスミドｐＰＸ１ ６６２、週４；ｆニブラスミドｐＰＸ１６６２、週６゜第９図。５Ｌ５９２９． 　コレラ毒素ＢサブユニットのＣＴＰ３エピトープを発現する、ホルマリンで殺 したサルモネラ・デュブリン（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｄｕｂｌｉｎ）ワクチン で免疫化した５匹のマウスの抗体の発現のヒストグラムを示す。

第１０図は、ＨＢｓＡｇ　（ａｙｗ）Ｓ１２２−１３７およびｐｒｅｓｓ１２° ０−１４５のアミノ酸および合成オリゴヌクレオチド配列、およびフラジェリン 遺伝子の地図を示す。黒くした領域は超可変領域を表す。

ＨはＨｉｎｄｌｌＩである：ＲはＥｃｏＲＶである；ＰはＰｓ　ｔ　Ｉｔ’あり 、モしてＫはＫｐｎＩである。

第１１図は、クローニングしたプラスミドｐＬ３４０５組み換え体の特性を示す 。

第１２図は、Ｓ１６またはｐｓ２１で形質転換した生きているサルモネラ・デュ ブリン（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｄｕｂｌｉｎ）ＳＬ５９２８で筋肉内免疫化し たウサギの抗体の応答を示す。

第１３図は、ＨＢｓＡｇエピトープを発現する生きている５Ｌ５９２８で経口的 に免疫化したマウス中の抗体の応答を示す。各ｒＸＪは個々のマウスの抗体の力 価を表す。

第１４図は、ＳＪＬマウスを組み換え鞭毛、野生型鞭毛またはＣＲＭ１９７タン パク質でブライミングし、そしてリンパ節細胞をＣＲＭ１９７タンパク質のアミ ノ酸３６６−３８３をエンコードする、精製した合成ペプチドで生体外で再刺激 したとき発生したデータを示す。

第１５図は、精製したＣＲＭ１９７タンパク質で刺激した、第１４図におけるよ うなリンパ節細胞のプライミングホルマリン発生したデータを示す。

発明の詳細な説明 本発明は、組み換えフラジェリン融合タンパク質として発現される、組み換えフ ラジェリン構造遺伝子に関する。このような組み換え遺伝子は、フラジェリン構 造遺伝子により特定されるエピトープをエンコードする配列および異種有機体の をエンコードするをエンコードする配列からなり、前記エピトープは融合タンパ ク質をを椎動物の宿主中に導入するとき免疫原である。異種有機体のエピトープ は、エンコードされたフラジェリンの機能に対して非必須である領域中に挿入す ることができる。

しかしながら、このようなインサートはフラジェリンの機能を破壊すべきではな い。好ましい実施態様において、異種有機体のエピトープはフラジェリン構造遺 伝子の超可変領域（例えば、サルモネラ（Ｓａｌｍ。

ｎｅｌｌａ）Ｈｌ−ｄ遺伝子の自然ＥｃｏＲＶ部位の間に）中に挿入することか できる。

本発明は、また、このような遺伝子によりエンコードされるフラジェリン融合タ ンパク質、異種有機体による感染に対する保護のための、あるいは前記有機体の 抗原により引き起こされる状態または疾患に対する保護のための、ワクチン配合 物中のこれらの遺伝子およびタンパク質の使用に関する。本発明による組み換え フラジェリン融合タンパク質としての発現は、免疫応答（体液、粘膜および／ま たは細胞仲介免疫応答を包含する）を刺激する、任意の所望のエピトープを免疫 原の形態で表す方法を提供する。特定の実施態様において、本発明の組み換えフ ラジェリン遺伝子は、生ワクチン配合物中で、減衰した侵入性バクテリアにより 発現することができる。他の特定の実施態様において、組み換えフラジェリン融 合タンパク質はサブユニットのワクチン中の使用のために配合することができる 。

下の実施例の節において詳細に説明する本発明の特定の実施態様において、マラ リアのサーカムスボロゾイト抗原、コレラ毒素Ｂサブユニット、Ｂ型肝炎の表面 およびｐｒｅ表面抗原、ロタウィルスのＶＰ７ポリペプチド抗原、ＨＩＶのエン ヴエロープ糖タンパク質、および化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　 ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＭタンパク質は、機能的鞭毛にアセンブリングし、そして を椎動物の宿主中で、異種エピトープに対する向けられた免疫応答を誘発する組 み換えフラジェリン融合タンパク質上で発現される。

本発明の詳細な説明の目的でのみ次の一般的段階に分割することができる： ａ、フラジェリン遺伝子の分離； ５１組み換えフラジェリンとして発現するために免疫原性エピトープをエンコー ドする表面抗原の分離： ０１組み換えフラジェリン遺伝子の構成：ｄ１バクテリア宿主中の発現； ０１組み換えフラジェリンとして発現された異種エピトープの免疫効力の決定： および ｆ１ワクチンの配合。

本発明は、さらに、を椎動物の宿主に、生理学的許容されつる担体中の本発明の 組み換えフラジェリン融合タンパク質を発現するようにトランスフェクションさ れたバクテリアを投与することによって、免疫応答（体液、粘膜および／または 細胞仲介免疫応答を包含する）を引き出す方法に関する。好ましくは、バクテリ アは生きておりかつ感染性であるが、を椎動物の宿主中で有意の病気を引き起こ すことができない。あるいは、組み換え鞭毛融合タンパク質それ自体を宿主に投 与して免疫応答を引き出すことができる。

抗菌類ワクチンを使用して、真菌症を予防することができ、これらは表Ｉに記載 するものを包含するが、これらに限定されない。（ブラウデら、（１９８６）、 感染症および医学的方法（ＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＤｉｓｅａｓｅｓ　ａｎｄ　Ｍ ｅｄｉｃａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）；フェインら、（１９８７）、小児 科学の感染症のテキストブック（Ｔｅｘｔｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ 　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ）３５；マンデルら、（１９８５） 、感染症の原理および実際（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ 　。

ｆ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ）、節Ｆ、）ワクチンのための他 の使用は、避妊の増強、供給物の転化の増強およびホルモンの不均衡ような目的 のための、抗ホルモン応答を引き出すことを包含する。

それ以上の使用は、抗癌治療および予防、抗アレルギー治療および免疫予防因子 および免疫治療因子を包含する。

フラジェリン遺伝子の分離 任意のフラジェリン構造遺伝子を使用して、異種エピトープを含有するフラジェ リン融合タンバグ質をエンコードする組み換え遺伝子を構成することができる。

このようなフラジェリン遺伝子は、次のものを包含するが、これらに限定されな い：サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）のＨｌおよびＨ２、バクテリウム・ス ブチリス（Ｂａｃｔｒｉｕｍ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）および緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏ ｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のＨｌおよびＥ、ｃｏｌｉのｈａｇ。

フラジェリン遺伝子のいくつかはクローニングおよび配列決定された（参照、例 えば、クワシマ、Ｇ、ら、１９８６、Ｊ、Ｂａｃｔ、１６８：１４７９；（ウェ イ、Ｌ、−Ｎ、およびジョイス、Ｔ、　Ｍ、　、１９８５、Ｊ、Ｍｏ　１．Ｂｔ ｏ　１．．１８６　：　７９１−８０３　；およびギル、Ｐ、　Ｒ，およびアガ ビアン、Ｎ、　、１９８３、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。

２５８　：　７３９５−７４０１　；ここに引用によって加える）。

クローニングしたフラジェリン遺伝子が容易には入手可能でない場合、それはこ の分野において知られている標準の手順（参照、例えば、マニアチス、Ｔ、ら、 １９８２、分子クローニング、研究所のマニアル（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏ ｎｉｎｇ、Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａ　り　、コールド・スプリン グ・ハーバ−・ラボラトリ−、コールド・スプリング・ハーバ−、ニューヨーク ）により、分子クローニングのための核酸源として潜在的に働くフラジェリン化 バクテリア細胞を使用してクローニングすることができる。このようなバクテリ アは、次のものを包含するが、これらに限定されない：エシェリヒア属（Ｅｓｃ ｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、プロテウス属（ Ｐｒｏｔｅｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バチルス属 （Ｂａｃ　ｉ　１１ｕｓ）　、カンピロバクチル属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅ ｒ）、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）、トレボネマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）　、 レギオネラ属（Ｌｇｉｏｎｅｌｌａ）、クロストリシア属（Ｃ１ｏｓｔｒｉｄｉ ａ）、およびカウロバクテル（Ｃａｕｌ。

ｂａｃｔｅｒ）。

クローニングした遺伝子のヌクレオチド配列の分析は、種々のこの分野において 知られている手順、例えば、マクサムおよびギルバートの方法（１９８０、Ｍｅ ｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　６５：４９９−５６０）、サンンガーのジデオキシ 方法（サンンガー、Ｆ、ら、１９７７、Ｐｒ。

ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　７４：５４６３ ）、または自動化ＤＮＡ配列決定装置の使用（例えば、アプライド・バイオシス テムス（Ａｐｐｌ　ｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、カリ７オルニア州フオス ター・シティ−）により実施することができる。

組み換えフラジェリンとして発現のための免疫原エピトープをエンコードする配 列の分離 フラジェリン融合タンパク質として発現されたとき、異種有機体に対するまたは 抗原により引き起こされる状態または疾患に対する保護的免疫性を生成する、異 種有機体のエピトープをエンコードするＤＮＡ配列は、本発明のワクチン配合物 における使用のために分離することができる。好ましい実施態様において、この ような有機体は病原性微生物である。例えば、このような異種エピトープは、病 気または疾患の原因となる因子である、バクテリア、寄生体、ウィルスまたは菌 類上に見いだすことができる。さらに、アレルゲンおよび癌細胞のエピトープを 使用することができる。このようなバクテリア、寄生体、ウィルスまたは菌類は 表■のものを包含するが、これらに限定されない：表１ フラジェリン融合タンパク質をエンコードする遺伝子の構成のためにＤＮＡを分 離できる異種有機体寄生体： Ｐ１ａｓ＊ｏｄｉｕｓ種 Ｅｉｍｅｒｉａ種 ５ｃｈｉｓｔｏｓｏｓａ種 Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ種 Ｂａｂｅｓ釉種 Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ種 Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｅａ種 Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ種 Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ種 バクテリア： Ｖｉｂｒｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａｅ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｗｅｎｉ ｇｉｔｉｄｉｓＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅＣｏｒｙｎｅｂａ ｃｔｅｒｉａ　ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｔｅｔａｎｉ Ｂｒａｎｈａｓｅｌｌａ　ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｐｅ ｒｔｕｓｓｉｓＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ種（例えば、ｉｎｆｌｕｅｎｚａｓ）Ｃ ｈｌａｍｙｄｉａ種 腸毒素発生 ヒトの免疫欠損ウィルス、Ｉ型 ヒトの免疫欠損ウィルス、ＩＩ型 サルの免疫欠損ウィルス ヒトの１９７８球ウィルス、Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩＩＩ型ウィルス Ａ型肝炎ウィルス Ｂ型肝炎ウィルス Ｃ型肝炎ウィルス 単純ヘルペスウィルス、Ｉ型 単純ヘルペスウィルス、ＩＩ型 サイトメガロウィルス インフルエンザウィルス パラインフルエンザウィルス ポリオウィルス ロタウィルス コロナウイルス ルベラウィルス ミースレス（Ｍｅａｓｌｅｓ）ウィルス流行性耳下腺炎ウィルス 水痘 エプスタインバーウィルス アデノウィルス 乳頭腫ウィルス 黄熱病ウィルス 菌類： Ｃａｎｄｉｄａ種（ことにａｌｂｉｃａｎｓ）Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種（こ とに新生物）Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ種（皮膚炎） ＩＴｉｓｔｏｐｌａｓｍａ種（ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ　ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ） Ｃｏｃｃｉｄｒｏｉｄｅｓ種（ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ　１ｍｍ１ｔｉｓ）Ｐａｒ ａｃｏｃｃｉｄｒｏｉｄｅｓ種（ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ　ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓ ｉｓ）＾ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種 他の実施態様において、線虫の抗原のエピトープを融合タンパク質として発現さ せて、このような線虫により引き起こされる疾患に対して保護することができる 。

ワクチン配合物のために潜在的に有用な抗原は、種々の基準、例えば、病原体の 感染せいの中和における抗原の参加（ノルビイ、Ｅ、、１９８５、ワクチンにお ける要約（Ｓｕｍｍａｒｙ、ｉｎ　Ｖａｃｃｉｎｅｓ）８５、レルナー、Ｒ，Ａ 、　、Ｒ，Ｍ、チャノック、およびＦ、ブラウン（編）、コールド・スプリング ・ハーバ−・ラボラトリ−、コールド・スプリング・ハーバ−、ニューヨーク、 ｐｐ、３８８−３８９）　、型または群の特異性、患者の抗血清または免疫細胞 による認識、および／または抗原に対して特異的な抗血清または免疫細胞の保護 作用の実証により同定することができる。さらに、抗原のエンコードされたエピ トープは、好ましくは、時間の抗原の変動または同一病原体の異なる分離物の間 の抗原の変動が小さくあるか、あるいはそれら変動を示すべきである。

好ましい実施態様において、異種配列は病原体の免疫効力のある優生エピトープ をエンコードする。さらに、ハプテン（すなわち、抗原性であるが、免疫原性で はない）である分子は、また、組み換えフラジェリンとして発現されることがで きる。なぜなら、フラジェリンはハブテンを免疫性を付与するとき担体分子とし て機能することができるからである。抗体に対する反応性であるが、免疫応答を 引き出すことができないエピトープを含有する組み換えフラジェリンは、なお、 イムノアッセイにおける潜在的使用を有する。

抗原決定基を含有することが知られているペプチドまたはタンパク質は、組み換 えフラジェリン中に組み込むことができる。特定の抗原が知られていない場合、 免疫反応性配列の同定および特性決定を実施すべきである。これを達成する１つ の方法は、病原体の表面または他の分子に対して発生したモノクローナル抗体の 使用による。抗体により認識されことができるペプチド配列は規定されたエピト ープである。あるいは、担体分子に対して接合された小さい合成ペプチドは、不 活性分子上で、ペプチド対応する部位に結合するモノクローナル抗体の発生につ いて試験することができる（参照、例えば、ウィルソン、１．Ａ、ら、１９８４ 、Ｃｅ１ｌ　３４ニア６７）。抗原決定基の同定および特性決定のために使用で きる、この分野において知られている他の方法は、また、本発明の範囲内に入る 。

特定の実施態様において、フラジェリン融合タンパク質として発現されるとき、 を椎動物の宿主中で免疫原性である、プラスモジウム（ＰＩａｓｍｏｄｉｕｍ） エピトープをエンコードするＤＮＡ配列は、本発明による使用のために分離する ことができる。ＤＮＡ源として働くことができるプラスモジウム（Ｐ　ｌ　ａ　 ｓｍｏｄ　ｉ　ｕｍ）種は、次のものを包含するが、これらに限定されない：ヒ トのマラリア寄生体、プラスモジウム会ファルシパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ 　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、プラスモジウム−？ラリアエ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕ ｍ　ｍａｌａｒｉａｅ）、プラスモジウム・オバレ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｏ ｖａｌｅ）、プラスモジウム・ビバックス（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｖｆｖａｘ ）、および動物のマラリア寄生体、プラスモジウム・ベルブヘイ（Ｐｌａｓｍｏ ｄｉｕｍ　ｂｅｒｇｈｅｉ）、プラスモジウム・ヨエリイ（Ｐ　Ｉ　ａｓｍｏｄ ｉｕｍ　ｙｏｅｌｉｉ）、プラスモジウム・ノウレジ（Ｐ　ｌ　ａｓｍｏｄｉｕ ｍ　ｋｎｏｗｌｅｓｉ）、およびプラスモジウム・シノモルギ（Ｐｌａｓｍｏｄ ｉｕｍ　ｃｙｎ＊ｍｏ１ｇｉ）。フラジェリン融合タンパク質として発現するこ とができる抗原またはその断片は、ライフサイクルの種々の段階、例えば、スポ ロゾイト、エキソエリスロサイト（肝炎の実買細胞中の発生）、無性赤血球、ま たは性的（例えば、配偶子、接合体、オーキネート）段階のいずれにおいてもマ ラリア寄生体により発現される抗原である。特定の実施態様において、発現すべ き異種エピトープはプラスモジウム（Ｐ　Ｉ　ａ　ｓｍｏｄ　ｉ　ｕｍ）の種の サーカムスポロゾイト（Ｃ３）タンパク質のエピトープである。類似のＣＳタン パク質は、試験したプラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｃｆｊｕｍ）のすべての種の スポロゾイトの表面上で同一された。減衰したサルモネラ（Ｓａ　１ｍｏｎｅ　 Ｉ　ｌａ）種牛で発現されたサーカムスボロゾイトは、スポロゾイト、雌のアノ フェレス（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ）力により移されるマラリア寄生体の侵入性の形 態、に対する向けられた生ワクチンとして使用することができる。保護的体液ま たは細胞仲介免疫応答の誘発において重要なＣＳタンパク質の領域のエピトープ は、本発明のワクチン配合物において使用することができる。（参照、例えば、 デイム（Ｄａｍｅ）、Ｊ、Ｂ、ら、１９８４．５ｃｉｅｎｃｅ　２２５：５９３ ；アルノット、Ｄ、　Ｄ、ら、１９８５．５ｃｉｅｎｃｅ　２３０：８１５；つ ニーパーら、１９８７、Ｅｘｐ、Ｐａｒａｓｉｔｏｌ、６３：２９５；ｚネア、 ■、ら、１９８４．５ｃｉｅｎｃｅ　２２５：６２８；エネア、■、ら、１９８ ４、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ。

Ａ、８１ニア５２０：ゴッドソン、Ｇ、Ｎ、ら、１９８３、Ｎａｔｕｒｅ　３０ ５：２９；およびマクカッチオン、Ｔ、Ｆ、ら、１９８５．５ｃｉｅｎｃｅ　２ ３０：１３８１、これらの参考文献の開示をここに引用によって加える）。例え ば、１つの実施態様において、プラスモジウム・ファルシパルム（Ｐ、ｆａｌｃ ｉｐａｒｕｍ）Ｃ３免疫優生反復エピトープを表すペプチドａｓｎ−ａｌａ−ａ ｓｎ−ｐｒｏは、本発明の組み換えバクテリアにより発現することができる。他 の実施態様において、プラスモジウム・ベルブヘイＣＰ、ｂｅｒｇｈｅｉ）ＣＳ タンパク質免疫優生反復エピトープを表す、ペプチドａｓｐ−ｐｒｏ−ａｌａ− ｐｒｏ−ｐｒｏ−ａｓｎ−ａｌａ−ａｓｎを発現することができる。

他の特定の実施態様において、プラスモジウム・ファルシパルム（Ｐ。

ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）ＣＳタンパク質のＴｈ２Ｒ１ビトーブ（グツド、Ｍ、Ｆ 、ら、１９８７．５ｃｉｅｎｃｅ　２３５：１０５９）は、本発明のワクチン配 合物において組み換えフラジェリンタンパク質として発現することができる。

しかも他の実施態様において、組み換えフラジェリン融合タンパク質として発現 すべき異種エピトープは、コレラ毒素Ｂサブユニットのペプチドからなる。適当 なペプチドはジャコブらにより記載されている。ジャコブら（１９８３、Ｐｒｏ ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ。

Ａ、８０ニア６１１）が記載するように、コレラ毒素Ｂサブユニットのいくつか の領域に相当するペプチドは、合成され、そして中和性抗体を誘発するエピトー プを定める努力において、免疫原性担体にカップリングされた。これらの接合体 を使用してウサギ中で抗体をレイズ（ｒａｉｓｅ）したとき、エンコードするア ミノ酸５０−６４　（ペプチドＣＴＰ３）は、自然毒素を認識し、そして完全な ホロトキシンの生化学的（シクラーゼ活性化をアデニル化する）および生物学的 （腸の流体の分泌）作用を中和する抗体を誘発することが示された（ジャコブ、 Ｃ，Ｏ，ら、１９８４、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　］、Ａｃａｄ、Ｓｅ　ｔ、Ｕ、Ｓ、 Ａ、８１　ニア８９４）。

フラジェリン融合タンパク質として発現することができる他のエピトープは、次 のものを包含するが、これらに限定されない：ＲＳウィルス（ＲＳ　Ｖ）のＧタ ンパク質のエピトープ（コリンスら、１９８４、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ 、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、８１ニア６８３）；ポリオウィルスＩ　ＶＰＩ上の中和 性エピトープ（エミニ、Ｅ、ら、１９８３、Ｎａｔｕｒｅ　３０４：６９９）； ＨＩＶ　Ｔのエンヴエローブ糖タンパク質上の中和性エピトープ（ブトネイ、Ｓ 、　Ｄ、ら、１９８６．５ｃｉｅｎｃｅ　２３４：１３９２−１３９５）：Ｂ型 肝炎表面抗原上に存在するエピトープ（イトウ、Ｙ、ら、Ｎａｔｕｒｅ　３０８ ：１９；ネウラス、Ａ、　Ｒ，ら、１９８６、Ｖａｃｃｉｎｅ　４：３４）；ジ フテリア毒素のエピトープ（アウジバート、Ｆ、ら、１９８１、Ｎａｔｕｒｅ　 ２８９：５４３）：連鎖球菌（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）２４Ｍエピトープ （ビーチエイ、Ｅ、Ｈ，，１９８５、Ａｄｖ、Ｅｘｐ。

Ｍｅｄ、Ｂｉｏｌ、１８５：１９３）；およびゴノコッカル・ビリン（ｇｏｎｏ ｃｏｃｃａｌ　ｐｉ　１ｉｎ）上のエピトープ（ロスバード、Ｊ、Ｂ、およびシ ュールニク、Ｇ、に、　、１９８５、Ａｄｖ、Ｅｘｐ。

Ｍｅｄ、Ｂｉｏｌ、１８５：２４７）。

本発明のワクチン配合物中のフラジェリン融合タンパク質は、また、異種有機体 のエピトープからなり、これは融合タンパク質をを推動物の宿主中に導入すると き、エピトープを含有する抗原により引き起こされる状態または疾患に対して保 護する免疫応答を誘発する。例えば、本発明のこの実施態様において、ヘビ毒素 、ミツバチ毒素、ホルモン、精子（避妊のために）、アレルギー誘発抗原または 免疫応答を望む他の抗原のエピトープをエンコードするフラジェリン融合タンパ ク質を使用することができる。１つの特定の実施態様において、脂肪細胞膜の抗 原のエピトープは、食物源として使用すうる動物において脂肪含量を減少するた めのワクチンの配合のために、組み換えフラジェリンタンパク質として発現する ことができる。他の実施態様において、腫瘍特異的抗原は、癌に対する保護的免 疫応答の誘発のために、組み換えフラジェリン融合タンパク質として発現するこ とができる。なお他の実施態様において、バクテリアのエンテロトキシンのエピ トープは、また、フラジェリン融合タンパク質として発現することができる。い くつかのバクテリアのエンテロトキシンのためのヌクレオチドおよび推定された アミノ酸配列は決定された（メカラノス、Ｊ、Ｊ、ら、１９８３、Ｎａｔｕｒｅ 　３０６　：　５５１　：レオング、Ｊ、ら、１９８５、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍ ｕｎ。

４８ニア３）。

本発明の他の実施態様において、い（つかのＢ細胞エピトープ（すなわち、体液 の免疫応答を誘発することができるエピトープ）およびＴ細胞エピトープ（すな わち、細胞仲介免疫応答を誘発することができるエピトープ）を含有するタンパ ク質の大きい領域をエンコードするＤＮＡ配列を、フラジェリン融合タンパク質 としての発現のためにフラジェリン遺伝子中に導入することができる。自然Ｔヘ ルパー細胞のエピトープならびに抗体を誘発するエピトープを提供することによ って、こうして病原性異種有機体との接触による促進のために受容体をプライミ ングすることができる。

本発明による組み換えフラジェリンとして発現すべき異種エピトープをエンコー ドする遺伝子配列は、この分野において知られている技術により分離することが でき、このような技術は次のものを包含するが、これらに限定されない：微生物 のゲノムのＤＮＡからの精製、微生物のＲＮＡからのｃＤＮＡの合成、組み換え ＤＮＡ分子（マニアチス、Ｔ、ら、１９８２、分子クローニング、研究所のマニ アル（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎ ｕａｌ）、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−、コールド・スプリ ング・ハーバ−、ニューヨーク）または化学的合成。

組み換えフラジェリン遺伝子の構成 本発明の組み換えフラジェリン遺伝子の構成において、フラジェリン遺伝子の配 列は、それらの中に挿入された配列を有するか、あるいは異種有機体のエピトー プをエンコードする配列により置換される。

まず、それらの中に挿入された配列を有するか、あるいは異種有機体のエピトー プをエンコードする配列により置換されるフラジェリン遺伝子のドメインを同定 すべきである。鞭毛（または新しい鞭毛断片の同定のためのフック）の末端への フラジェリンタンパク質の移送のために必要かつ十分であるフラジェリン配列を 保存されることを望む。この保存は、フラジェリンフィラメントとして、細胞の 表面上で発現する能力を保持し、こうしてサブユニットのワクチンの成分として 使用するこれらの組み換え分子の分離および精製を促進するか、あるいは生ワク チンの実施態様において、免疫系へのそれらの提供を促進する、組み換えフラジ ェリン分子が生ずる。

いくつかのバクテリアの鞭毛の構造の分析は、異なるバクテリアから分離された フィラメントの間の共通の構成を明らかにした（ウェイ、Ｌ。

−Ｎ、およびジョイス、Ｔ、Ｍ、　、１９８５、Ｊ、Ｍｏｌ、Ｂ　ｉ　ｏ　１． ．１８６　：　７９１−８０３　；デランゲ、Ｒ，Ｊ、ら、１９７６、Ｊ、Ｂｉ ｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５１ニア０５；ギル、Ｐ、　Ｒ，およびアガミアン、Ｎ、、 １９８３、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５８ニア３９５）、これらのフィラメン トのアミノおよびカルボキシ末端においてタンパク質配列の高い程度の相同性（ これらの領域は構造の一体性および／または機能のために要求されることを示唆 する）および異なる鞭毛の間の抗原の特異性の多様性の原因である多形性中央領 域の存在は、最も驚くべきことである（イド：参照、また、イノ、Ｔ、　、Ａｎ ｎ、Ｒｅｖ、Ｇｅｎｅｔ、１１：１６１−１８２、およびその中に参考文献）。

超可変性中央領域上の構造的拘束は目立たない。なぜなら、アミノ酸残基ならび に一次配列の両者の数が異なる分離物が同定されたからである。

好ましい実施態様において、異種エピトープをエンコードするＤＮＡ配列を、フ ラジェリンモノマーの中央の超可変領域中に挿入するか、あるいはそれを置換す る。この実施態様は、完全な鞭毛を形成する能力を保持する、組み換えフラジェ リンの七ツマ−の構成を可能とする。鞭毛にアセンブリングする能力は、生ワク チン配合物に関して、各フラジェリンモノマー上に存在する異種エピトープの高 い濃度を、生体内の宿主の免疫系に提示する。有機化したポリマー構造体として の提示は、七ツマ−と同一の材料より非常に強い抗原の刺激を提供するであろう 。また、バクテリアにより発現されることによって、バクテリアの外部表面上の 鞭毛の存在は異種エピトープのより有効な提示を可能とする。さらに、完全な鞭 毛へのアセンブリングは、組み換えフラジェリン分子の精製を促進する。なぜな ら、このような精製のための種々の手順はこの分野において知られており、そし て使用することができるからである。最も好ましい実施態様において、バクテリ アの親の非運動性の菌株により発現された組み換えフラジェリン分子は運動性バ クテリアを産生じ、こうしてこおのバクテリアは、バクテリアの外部表面上の外 来エピトープの存在、多分それの運動性により提供された比較的より大きい侵入 性により、非運動性菌株より、いっそう有効に異種エピトープを宿主免疫系に提 示することができる。

下の実施例の節に記載するように、われわれは、鞭毛の外部化およびアセンブリ ーに悪影響を及ぼさないで、サルモネラ・ムエンチェン（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ 　ｍｕｅｎｃｈｅｎ）のフラジェリン遺伝子の中央の超可変領域中に、異種有機 体のエピトープをエンコードするＤＮＡを導入することができた。

この分野において知られている多数の方法を、組み換えフラジェリン遺伝子の構 成において使用することができる。例えば、フラジェリン遺伝子および異種遺伝 子のフラジェリンの関連する配列は、この分野において知られている技術により 、制限エンドヌクレアーゼで適当な部位において切断し、分離し、そして結合す ることができる。粘着末端を制限エンドヌクレアーゼの消化により発生させる場 合、ＤＮＡのそれ以上の修飾は必要としないことができる。しかしながら、ＤＮ Ａの粘着末端が制限エンドヌクレアーゼの消化による発生に利用されることがで きないか、あるいは利用可能なもの以外の異なる部位が好ましい場合、この分野 において知られている多数の技術のいずれをも使用して、所望の部位において異 種ＤＮＡの結合を達成することができる。例えば、制限酵素を使用する切断に引 き続いて、修飾により逆消化または結合の前の一本鎖ＤＮＡの末端の充填により 平滑末端をつることができる。あるいは、フラジェリン遺伝子または異種ＤＮＡ の切断した末端は、ヌクレアーゼ、例えば、ヌクレアーゼＢａ１３１、エキソヌ クレアーゼＩＩＩ、ラムダエキソヌクレアーゼ、ヤエナリヌクレアーゼ、または Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼエキソヌクレアーゼの活性、これらに限定されない、 を使用して「チュウド・バック（ｃｈｅｗｅｄ　ｂａｃｋ）Ｊ　Ｌ／て、配列の 一部分を除去することができる。１または２以上の制限部位をエンコードするオ リゴヌクレオチド配列（リンカ−）は、フラジェリン遺伝子のある領域中に、Ｄ ＮＡ末端への結合により挿入することができる。両者の配列が翻訳停止コドンに より妨害されない正しい翻訳リーディングフレーム中に存在するように、クロー ニング制限部位中に異種遺伝子配列に引き続いて結合すると、フラジェリン融合 タンパク質の産生を指令する構成体が生ずるであろう。リンカ−を、また、使用 して異種遺伝子配列中に適当な制限部位を発生することができる。さらに、フラ ジェリンまたは異種遺伝子配列は、生体外または生体内で突然変異させて、新し い制限エンドヌクレアーゼ部位を形成するか、あるいは前に存在するものを破壌 して、生体外結合手順を促進することができる。この分野において知られている 任意の技術を使用することができ、これらの技術は次のものを包含するが、これ らに限定されない：生体外の部位特異的突然変異（ハンチンソン、Ｃ４ら、１９ ７８、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５３：６５５１）　、ＴＡＢ＠リンカ−（フ ァーマシア）など。

遺伝子の融合体を構成する特定の方法は、置換または挿入すべき特定のフラジェ リン配列、ならびに挿入すべき異種遺伝子に依存するであろう。

組み換えフラジェリン遺伝子は、バクテリアの宿主中で複製または発現すること ができるベクター中の構成するか、あるいはその中にトランスフェクションすべ きである。好ましい実施態様において、組み換えフラジェリン遺伝子は、また、 バクテリアの染色体のＤＮＡ中に挿入することができる。これを達成できる１つ の方法は、プラスミドを有する組み換えフラジェリン遺伝子との組み換え交換に よる。他の実施態様において、組み換えフラジェリン遺伝子はエビソーム的に存 在することができるクローニングベクター、例えば、プラスミドまたはバクテリ オファージ中に挿入することができ、次いでこれを使用して適当な宿主バクテリ ア細胞を形質転換または感染し、ここで組み換えＤＮＡは複製または発現される 。

組み換えフラジェリン遺伝子を組み込んだＤＮＡ分子を使用するバクテリア宿主 の形質転換は、フラジェリン配列の多数のコピーを発生することができる。種々 のベクター系をバクテリア宿主内の発現に利用することができ、ベクターは次の ものを包含するが、これらに限定されないニブラスミド、例えば、ｐＵＣプラス ミドおよび誘導体、ｐＢＲ３２２プラスミドおよび誘導体、バクテリオファージ 、例えば、ラムダおよびその誘導体、およびコスミド。特定の実施態様において 、使用できるプラスミドのクローニングベクターは、Ｃｏ１Ｅｌ型のレプリコン の誘導体を包含する（追加の情報のために、参照、才力ら、Ｍｏ　１．　Ｇｅｎ 、　Ｇｅｎｅｔ、１７２：１５１−１５９）。Ｃｏ１Ｅ１プラスミドは、Ｅ。

ｃｏｌｔおよびサルモネラ・チフイムリウム（Ｓａ　ｉｍｏｎｅ　１１　ａｔｙ ｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）菌株中で、約１５−２０コピー／細胞のコピー数をもつモ ノマーの分子として安定に維持することができる。

種々の調節発現要素を使用することができ、これらはバクテリア中で活性である 、ある数の適当な転写および翻訳要素のいずれかである。例えば、組み換えフラ ジェリン配列の発現を指令するために使用できるプロモーターは、次のものを包 含するが、これらに限定されない：Ｅ、ｃｏ１ｉのラクトースのオペロンプロモ ーター、ハイブリッドのｔｒｐ−１ａｃＵＶ−５プロモーター（ｔａｃ）（デポ エル、Ｈ３ら、プロモーターの構造および機能（Ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ａｎｄ　Ｆ ｕｎｃｔｉ。

ｎ）、ロドリグエズ、Ｒ，Ｌ、およびチャンベルライン、Ｍ、Ｊ、編、プレゲル ・パブリッシング、ニューヨーク）、バクテリオファージラムダの左側（ＰＬ） および右側（Ｐリプロモーター、バクテリオファージエフプロモーター、ｔｒｐ オペロンプロモーター、ｌｐｐプロモーター（Ｅ、ｃｏｌｉのリポタンパク質の 遺伝子プロモーター；ナカムラ、Ｋ。

およびイノウニ、１．．１９７９、Ｃｅ１ｌ　１８：１１０９−１１１７）など 。組み換えＤＮＡまたは合成技術により産生される他のプロモーターは、また、 挿入された配列の転写を提供するために使用できる。

あるいは、自然フラジェリンプロモーターを使用することができる。

特定の開始シグナルは、また、挿入された解読配列の効率よい転写に要求される 。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接する配列を包含する。それ 自体の開始コドンおよび隣接する配列をエンコードする自然フラジェリン遺伝子 配列を適当な発現ベクター中に挿入する場合、追加の翻訳コントロールシグナル を必要とすることがある。しかしながら、自然フラジェリン翻訳が存在しない場 合、ＡＴＧ開始コドンを包含する、外因性翻訳コントロールシグナルを準備しな くてはならない。

さらに、開始コドンはタンパク質解読配列のリーディングフレームと同調して全 体の挿入の翻訳を確実にしなくてはならない。これらの外因性翻訳コントロール シグナルおよび開始コドンは、自然および合成の両者の種々の由来であることが できる。

適当な発現ベクターを構成する方法は、生体外の組み換えＤＮＡ技術および合成 技術および生体内の組み換え体（遺伝子組み換え）を包含することができる。

遺伝子の発現を最大とすることについての概観については、参照、ロバーツおよ びラウエル、１９７９、Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、５８：４７３：およびレズ ニコフ、Ｗ、およびゴウルド、Ｍ、、１９８６、遺伝子の発現の最大化（Ｍａｘ ｉｍｉｚｉｎｇ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）、プレナム・プレス、ニュ ーヨーク。

米国特許第４．２３７．２２４号（コーヘンおよびボイエル）は、制限酵素によ る切断のプロセスを使用しそして結合の既知の方法によりＤＮＡリガーゼと接合 する、組み換えプラスミドの産生を記載している。

次いで、これらの組み換えプラスミドは、形質転換またはエレクトロフォレイシ ョンにより導入し、そして組織培養において増殖した原核生物の有機体および真 核生物の細胞を包含する単細胞の培養物中で複製する。

単細胞の有機体中に組み換えＤＮＡ分子を導入する他の方法は、米国特許第４． ３０４．８６３号（コリンスおよびホーン）に記載されている。この方法は、バ クテリオファージのベクター（コスミド）を使用するパッケージング／形質導入 を利用する。

バクテリアの宿主中の発現 次いで、組み換えフラジェリン配列からなる発現ベクターをバクテリアの宿主中 に移し、ここでそれを複製しかつ発現することができる。これはこの分野におい て知られている多数の方法のいずれにによっても達成することができ、これらの 方法は次のものを包含するが、これらに限定されない：形質転換（例えば、分離 したプラスミドＤＮＡの減衰したバクテリアの宿主中への形質転換）、ファージ の形質導入（シュメイガー、１９７２、Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、１１９ニ ア５Ｌバクテリアの宿主種間の接合、エレクトロポレイションなど。

特定の実施態様において、組み換えフラジェリンを発現する任意の減衰したバク テリアの宿主を生ワクチンとして配合することができる。このようなバクテリア は、次のものを包含するが、これらに限定されない：減衰した侵入性菌株および 減衰したカンプロバクチル（ＣａｍｐＹｌｏｂａｃｔｅｒ）、赤痢菌属（Ｓｈｉ ｇｅｌｌａ）または大腸菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）の種。

減衰した侵入性バクテリア中の発現 本発明の好ましい実施態様において、組み換えフラジェリン配列からなる発現ベ クターを減衰した侵入性バクテリア中に転移し、ここでそれを発現し、こうして 生ワクチンとして使用するために適当なバクテリアの菌株を産生ずる。

種々の減衰した侵入性バクテリアのいずれをもベヒクルとして使用して組み換え フラジェリンを発現することができるので、その異種エピトープは、本発明のワ クチン配合物において、宿主の免疫系へ有効に提供される。バクテリアはそれら の侵入性を保持するが、それらのビルレンス性質の大部分を損失し、こうして宿 主中で制限された程度に増殖することができるが、有意の病気または疾患を引き 起こすためには不十分である。減衰した形態で、本発明のワクチン配合物におい て使用できる侵入性バクテリアの例は、次のものを包含するが、これらに限定さ れない：サルモネラ（Ｓａ　］ｍｏｎｅ　１１ａ）種、侵入性Ｅ、ｃｏｌｔ　（ ＥＩＥＣ）、および赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）種。特定の実施態様において 、リンパ系の組織、例えば、肺臓中に存在する侵入性バクテリア（例えば、サル モネラ（Ｓａ　Ｉｍｏｎｅ　Ｉ　ｌａ）種）を使用する。このようなバクテリア は腸の上皮組織および／またはバイアー班に侵入し、細網内皮系を通して散在す るようになり、そして腸間膜のリンパ系の組織、肝臓、および肺臓に接近し、こ こでそれらは増殖するか、あるいは少なくともある時間生き残り、そして体液お よび細胞仲介免疫性を誘発する。

減衰した侵入性バクテリアは、多数の方法により得ることができ、これらの方法 は次のものを包含するが、これらに限定されない：化学的突然変異誘発、遺伝子 の挿入、欠失（ミラー、Ｊ、　、１９７２、分子遺伝学における実験（Ｅｘｐｅ ｒｅｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ）、コールド・ス プリング・ハーバ−・ラボラトリ−、コールド・スプリング・ハーバ−、ニュー ヨーク）または組み換えＤＮＡ方法を使用して組み換え（マニアチス、Ｔ、ら、 １９８２、分子クローニング、研究所のマニアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏ ｎｉｎｇ、Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）、コールド・スプリング ・ハーバ−・ラボラトリ−、コールド・スプリング・ハーバ−、ニューヨーク） 、自然突然変異の実験室の選択など。生ワクチンとして使用するために適当な非 復帰非ビルレント栄養要求性突然変異体である減衰したサルモネラ（Ｓａ　Ｉｍ ｏｎｅ　１１ａ）菌株を得る方法は、米国特許第４，７３５，８０１号、１９８ ８年４月５日発行および同時係属米国特許出願第７９８．０５２号、１９８５年 １１月１４日提出（ストッカー）、それらの開示をここに引用によって加える、 に記載されている。

サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の減衰を達成する信頼性のある方法は記載 されてきており（ホイセス、Ｓ、　Ｋ、およびストッカー、Ｂ。

Ａ、Ｄ、、Ｎａｔｕｒｅ　２９１：２３８；ストッカー、Ｂ、Ａ、Ｄ。

ら、Ｄｅｖｅｌｏｐ、Ｂｉｏｌ、５ｔａｎｄａｒｄ　５３：４７；および米国特 許第４．５５０，０８１号）そして本発明の特定の実施態様において使用するこ とができる。

本発明の生ワクチン配合物中に使用できる減衰したサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅ ｌｌａ）は、表ＩＩに記載されている種を包含するが、これらに限定されない。

表ＩＩ 減衰した形態で、本発明のワクチン配合物中に使用できるサルモネラ（Ｓａ　１ ｍｏｎｅ１１　ａ）種＊サルモネラ・チフィ（Ｓ、ｔｙｐｈｉ）サルモネラ・チ フィムリウム（Ｓ、ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）サルモネラ・パラチフィ（Ｓ、ｐ ａｒａｔｙｐｉ）Ａサルモネラ・バラチフィ（Ｓ、ｐａｒａｔｙｐｉ）Ｂサルモ ネラ・エンテリディチス（Ｓ、ｅｎｔｅｒｉｄｉｔｉｓ）（例えば、血清型ｄｕ ｂｌｉｎ） ＊サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）血清型の完全な記載については、参照、 エドワーズおよびエウィング、１９８６、腸内細菌科の分類（Ｃ１ａｓｓｉｆｉ ｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、第４ 版、エルセビーア、ニューヨーク。

特定の実施態様において、芳香族化合物の生物合成（ａｒｏ）のための遺伝子の 染色体欠失、またはｇａｌＥ遺伝子中の突然変異により減衰されたか、あるいは ｃｙａ−１ｃｒｐ−ｖｉｒ　プラスミドなどである、サルモネラ（Ｓａ　１ｍｏ ｎｅ　Ｉ　ｌａ）バクテリアを使用することができる。使用できるａｒｏ突然変 異体は次のものを包含するが、これらに限定されない：サルモネラ・チフィ（Ｓ 、ｔｙｐｈｉ）菌株５４３Ｔｙおよび５４１Ｔｙ、ヒトのワクチンにおいて使用 する、およびサルモネラ・チフィムリウム（Ｓ、ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）　５ Ｌ３２６１および５Ｌ１４７９、およびサルモネラ・エンテリディチス（Ｓ、ｅ ｎｔｅｒｉｄｉｔｉｓ）血清型ｄｕｂｌｉｎ　５Ｌ５９２８（また、サルモネラ ・デュブリン（Ｓ、ｄｕｂｌ　ｉｎ）と銘々される）動物において使用する。

（参照、米国特許第４．５５０，０８１号、サルモネラ・チフィ（Ｓ。

ｔｙｐｈｉ）菌株５Ｌ１４７９およびサルモネラ・デュブリン（Ｓ、ｄｕｂｌｉ ｎ）菌株５Ｌ５９２８の記載について）。サルモネラ・チフィ（Ｓ、ｔｙｐｈｉ ）菌株、例えば、５４３ＴＹおよび５４１ＴＹは、遺伝子ａｒｏＡおよび／また はｐｕｒＡに影響を及ぼす欠失による減衰のためにヒトにおいて無毒性である（ レビン、Ｍ、　Ｍ、ら、１９８７、Ｊ。

Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、７９：８８８）、サルモネラ・デュブリン（Ｓ、ｄｕ ｂｌｔｎ）、例えば、５Ｌ５９２８およびサルモネラ・チフィムリウム（Ｓ、ｔ ｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、例えば、５Ｌ３２６１の突然変異体は動物のモデル系 の発生において使用することができる。なぜなら、これらの種はチフス熱と同等 の動物の病気を引き起こすからである。使用できるｇａｌＥ突然変異体は次のも のを包含するが、これらに限定されない：サルモネラ・チフィ（Ｓａｌｍｏｎｅ ｌｌａ　ｔｙｐｈｉ）Ｔｙ２１ａ　（ゲルマニエル、１９８４、Ｂａｃｔｅｒｉ ａ　Ｖａｃｃｉｎｅｓ、アカデミツク・プレス、ニューヨーク、ｐｐ、、１３７ −１６５）サルモネラ・チフィムリウム（Ｓ、ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）Ｇ３０ Ｄなど。

好ましい実施態様において、組み換えフラジェリン遺伝子を含有するプラスミド の発現ベクターは、分離しモしてＥ、ｃｏＩｉ中で特性決定した後、例えば、フ ァージの形質導入（シュメイガー、１９７２、Ｍ。

１、Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、１１９ニア５）により減衰したサルモネラ（Ｓａｌｍ ｏｎｅｌｌａ）菌株に移すことができる。なぜなら、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎ ｅｌｌａ）、例えば、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓ、ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕ ｍ）のそれらに関してＥ、ｃｏＩｉ　Ｋ１２の形質転換の頻度は高いからである 。

組み換えフラジェリンとして発現された異種エピトープの免疫効力の決定 その生ワクチン中で組み換えフラジェリンとして発現された異種エピトープの免 疫効力は、組み換えフラジェリンを発現するバクテリアで免疫化した後、試験動 物の免疫応答を監視することによって決定することができる。サブユニットのワ クチン配合物において、試験動物の免疫応答は、機能的鞭毛またはモノマーとし て分離した組み換えフラジェリン分子で免疫化した後、監視することができ、こ れは適当なアジュバントと配合して免疫学的応答を増強することができる。適当 なアジュバントは次のものを包含するが、これらに限定されない：鉱物ゲル、例 えば、水酸化アルミニウム、表面活性物質、例えば、リンレシチン、プロニック ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油孔濁液、および潜在的に有用なヒトの アジュバント、例えば、ＢＧＧ（Ｂａｃｌｌｅ　Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉ ｎ）およびコリネバクテリウム・バルブム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　 ｐｒｖｕｍ）、試験動物は、マウス、モルモット、ウサギ、ニワトリ、チンパン ジーおよび他の霊長類、および究極的にヒトの被検体を包含することができる。

免疫原の導入の方法は、経口的、皮肉、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻内ま たは任意の他の免疫化の標準のルートを包含することができる。

試験被検体の免疫応答は、次のような種々のアプローチにより分析できる：　（ ａ）自然抗原または異種エピトープを含有するその断片、または天然に産出する 異種有機体の分離物に対する生ずる免疫血清の反応性、既知の技術、例えば、酵 素連鎖免疫収着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）　、イムノブロッティング、ラジオイム ノ沈澱などによりアッセイする、（ｂ）自然抗原またはその断片、または異種有 機体に対する、免疫化被検体から分離したリンパ球の反応性、既知の技術、例え ば、ブラストゲン応答アッセイ、細胞障害性アッセイ、遅延した型の過敏性など によりアッセイする、（Ｃ）生体外の有機体の感染性または自然抗原の生物学的 活性を中和する免疫血清の能力、および（ｄ）免疫化動物における病気および／ または感染系の緩和化からの保護。

ワクチンの配合 本発明のこの実施態様において、異種有機体のエピトープからなる組み換えフラ ジェリンをワクチンの使用のために配合する。このようなワクチン配合物は、生 ワクチンまたはサブユニットのワクチン配合物からなることができる。本発明の ワクチン配合物は動物およびヒトの両者において使用する。

ワクチンとしての生きているバクテリア本発明のこの実施態様の目的は、免疫原 が減衰した侵入性バクテリア菌株であるワクチンを配合することであり、このバ クテリア菌株は異種有機体のエピトープからなる組み換えフラジェリンを発現し て、有機体による感染あるいは有機体の抗原により引き起こされる状態または疾 患に対して保護する、異種エピトープに対する免疫（体液および／または細胞仲 介）応答を引き出す。ワクチンのバクテリアは、ワクチン接種すべき宿主に対す る感染性である菌株からなる。好ましい実施態様において、このような菌株は減 衰した侵入性バクテリア、例えば、サルモネラ（Ｓａ　Ｉｍｏｎｅ　１１　ａ） 種である。他の適当な種は次のものを包含するが、これらに限定されない：赤痢 菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）およびＥ。

ｃｏｌｉ０最も好ましい実施態様において、組み換えフラジェリン遺伝子は宿主 バクテリアにより機能的鞭毛にアセンブリングするフラジェリンモノマーとして 発現され、組み換え体の分子上の異種エピトープを多数のコピーにおいて宿主免 疫系に提供できるようにする。

生ワクチン配合物は一価または多価であることができる。多価ワクチンは、異な る有機体のものであることができる、１または２以上の異種エピトープを発現す る、単一のまたはわずかの組み換えバクテリアから調製する。単一のバクテリア は、同一または異なる抗原の１より多いエピトープを発現することができる。種 々のエピトープは同−組み換えフラジェリンタンパク質内で、同一または異なる 発現ベクターによりエンコードされる別々の組み換えフラジェリン分子上で、あ るいは異なるバクテリア中で発現されることができる。

多数の方法を使用して、本発明の生ワクチン配合物を導入することができる；こ れらは次のものを包含するが、これらに限定されない：経日的、皮肉、筋肉内、 腹腔内、静脈内、皮下、および鼻内、親の野生型バクテリア菌株の感染の自然の ルートを包含する。経口的ワクチン配合物を動物に使用する実施態様において、 飼料または飲料水への補充物質として生ワクチン配合物を使用することによって 達成するごとができる。

マラリアのサーカムスポロゾイトタンパク質のエピトープ、コレラ毒素Ｂサブユ ニット、Ｂ型肝炎の表面およびｐｒｅ表面抗原、ロタウィルスのＶＰ７ポリペプ チド、ＨＩＶのエンヴエローブ糖タンパク質、および連鎖球菌＠（Ｓｔｒｅｐｔ ｏｃｏｃｃｕｓ）のＭタンパク質からなる組み換えフラジェリンを発現する、減 衰したサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）をワクチンとして配合する二とがで きる。

本発明の好ましい実施態様は無毒性非病原性サルモネラ（Ｓａｌｍ。

ｎｅｌｌａ）の経口的ベクター供給系の使用である。この系の使用は、他の供給 ベヒクル、例えば、ワクシニアのウィルスおよびアデノウィルスに関連する潜在 的副作用のあるものを排除することができるばかりでなく、かつまたワクチンの 便利な経口的投与を提供することができ、ワクチン接種は粘膜ならびに前身の免 疫応答を誘発し、これによりワクチンの免疫原性効力を増加するであろう。

サブユニットのワクチン 組み換えフラジェリン融合タンパク質として発現された異種ペプチドは、多価で あることができる、サブユニットのワクチン配合物中の免疫原として使用するこ とができる。多価ワクチン配合物は、組み換え鞭毛、または異なる有機体のもの であることができる１より多い異種エピトープを含有する組み換えフラジェリン のモノマー、または各々が異なる異種エピトープをエンコードするい（つかのフ ラジェリン分子などからなる。

組み換えフラジェリン遺伝子産生物は、異種タンパク質を発現するベクター／宿 主系、例えば、形質導入または形質転換したバクテリアからのワクチン配合の目 的で、精製することができる。例えば、バクテリアの機能的鞭毛は、完全なバク テリアから、そうでなければ細胞を損傷せず、こうして苛酷な変性因子を導入し ないで、それらを容易に精製できるようにする機構手段により容易に除去される 。この分野において知られている標準の手順は、モノマーとしてまたは（アセン ブリングした）鞭毛として、組み換えフラジェリンの精製のために使用すること ができる（参照、例えば、ギル、Ｐ、　Ｒ，およびアガブラン、Ｎ、、１９８３ 、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５８ニア３９５−７４０１；ウニイスポーン、Ａ 、ら、１９８２、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５７＋２０６６−２０７４　；ギ ル、Ｐ、　Ｒ，およびアガブラン、Ｎ、　、１９８２、Ｊ、　Ｂａｃｔｒｉｏｌ 、１５０：９２５−９３３；ランゲナウル、Ｃ０およびアガブラン、Ｎ、、１９ ７６、Ｊ、Ｂａｃｔｒｉｏｌ、１２８：４３５−４４４：フクダ、Ａ、ら、１９ ７８、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、９５ニア０−７５；ステベンソン、Ｊ、Ｒ，および ストンガー、Ｋ、　Ａ、　、１９８０、Ａｍ、Ｊ、Ｖｅｔ、Ｒｅｓ、４１　（４ ）：６５０　６５３）。

さらに、分離した鞭毛試料を可溶化して（例えば、ｐＨ３または低いイオン強度 においてｐ［１へ暴露して溶解することによって；デランギ、Ｒ，Ｊ、ら、１９ ７６、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５１　（３）ニア０５−７１１）フラジェリ ンサブユニットにし、次いで既知の手順により鞭毛に再会合して（例えば、ウニ イスポーン、Ａ、ら、１９８２、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５７：２０６６− ２０７４）：　（ａ）望ましくない汚染物質の除去により組み換えフラジェリン の精製を促進し；および／または（ｂ）異なる異種エピトープをエンコードする 組み換えフラジェリンモノマーの会合により、多価ワクチン配合物のための免疫 原を産生ずる。

精製したタンパク質を適当な濃度に調節し、適当なワクチンアジュバントと配合 し、そして使用のために包装すべきである。適当なアジュバントは次のものを包 含するが、これらに限定されない：鉱物ゲル、例えば、水酸化アルミニウム；表 面活性物質、例えば、リンリシチン、プルロニックボリオール：ポリアニオン： ペプチド；油孔濁液；および潜在的に有用なヒトアジュバント、例えば、ＢＣＧ （Ｂａｃｉｌｌｅ　ＣａＩｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）およびコリネバクテリウ ム・バルブム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｒｖｕｍ）ｏ免疫原は、ま た、リポソーム中に組み込むことができるか、あるいはワクチン配合物中の使用 のために多糖類および／または他のポリマーに接合することができる。

組み換えフラジェリン遺伝子産生物がハブテン、すなわち、それが同種の抗体と 選択的に反応するが、免疫応答を引き出すことができないことにおいて抗原性で ある分子である場合において、ハブテンは担体または免疫原性分子に共有結合す ることができる：例えば、大きいタンパク質、例えば、血清アルブミンはそれに カップリングしたハブテンに免疫原性を付与する。ハブテン−担体はワクチンと して使用するために配合することができる。

多数の方法を使用して、前述の配合物を導入することができる；これらは次のも のを包含するが、これらに限定されない：経日的、皮肉、筋肉内、腹腔内、静脈 内、皮下、および鼻内。

組み換えフラジェリンに対して向けられた抗体の使用本発明の組み換えフラジェ リンで免疫化することによって異種有機体に対して発生した抗体は、また、診断 的イムノアッセイ、受動免疫治療、および抗イデイオタイプの抗体において潜在 的使用を有する。

発生した抗体は、この分野において知られている標準の技術（例えば、免疫親和 クロマトグラフィー、遠心、沈澱など）により分離し、そして診断イムノアッセ イにおいて使用して、ヒトまたは動物の組織、血液、血清などにおいて医学的お よび獣医学的に重要なウィルス、バクテリア、または寄生体の存在を検出するこ とができる。抗体は、また、処置および／または病気の進行を監視するために使 用できる。この分野において知られているイムノアッセイ系、例えば、ここに列 挙するものは、この目的に使用することができ、これらは次のものを包含するが 、これらに限定されないニラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素連鎖免疫収 着アッセイ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、プレシビチン反応、ゲル拡散 プレシビチン反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ。補体固定アッセイ、イム ノラジオメトリックアッセイ、蛍光イムノアッセイ、プロティンＡイムノアッセ イおよび免疫電気泳動アッセイ、これらに制限されない、ような技術を使用する 競合イムノアッセイおよび非競合イムノアッセイ。本発明のワクチン配合物は、 また、宿主の短時間の保護を異種有機体に対して向けられた予備形成した抗体の 投与により達成される、受動免疫治療において使用する抗体の産生に使用するこ とができる。

本発明のワクチン配合物により発生した抗体は、また、抗イデイオタイプの抗体 の産生において使用することができる。次いで、抗イデイオタイプの抗体を免疫 化に使用して、病原性有機体の最初の抗原を結合する抗体の下位集団を産生ずる ことができる（ジェルネ、Ｎ、に、、１９７４、Ａｎｎ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、（パ リ）１２５ｃ：３７３；ジエルネ、Ｎ、に、ら、１９８２、ＥＭＢＯ１：２３４ ）。

外来エピトープを発現する、本発明の組み換えフラジェリン遺伝子産生物または その断片は、エピトープに対して向けられた抗体を検出するイムノアッセイにお いて抗原として使用することができる。異種タンパク質またはその断片は、また 、競合アッセイによる同一または関係するエピトープの検出に使用できる。組み 換えフラジェリン産生物、またはそれらにより発現される外来エピトープは、こ の分野において知られているイムノアッセイ系において使用することができ、こ れらは次のものを包含するが、これらに限定されないニラジオイムノアッセイ、 ＥＬＩＳＡ（酵素連鎖免疫収着アッセイ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、 プレシビチン反応、ゲル拡散プレシピチン反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセ イ。補体固定アッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、蛍光イムノアッセイ 、プロティンＡイムノアッセイおよび免疫電気泳動アッセイ、これらに制限され ない、ような技術を使用する競合イムノアッセイおよび非競合イムノアッセイ。

実施例１ フラジェリンマイナスワクチン菌株の構成フラジェリン特定プラスミドの宿主と して使用した２つの生ワクチン菌株は、５Ｌ５９２７および５Ｌ１４７９である 。各々は芳香族依存性サルモネラ・デュブリン（Ｓ、ｄｕｂｌｉｎ）親菌株から 得た。この菌株は鞭毛特性に関して野生型であり、すなわち、移動性であり、そ して単一のフラジェリン遺伝子、Ｈｌ−ｇ、ｐをもち、相−１鞭毛抗原、ｇ。

ｐ、単−相の種、サルモネラ・デュブリン（Ｓ、ｄｕｂｌｉｎ）の特性を決定す る。

５Ｌ５９２７は５Ｌ１４３７、すなわち、その構成が米国特許第４゜７３５．８ ０１号および米国特許第４．５５０．０８１号、それらの教示を引用によってこ こに加える、に記載されている、芳香族依存性生ワクチンの菌株である、から得 た。

５Ｌ５９２８は、その構成を後述する、サルモネラ・デュブリン（Ｓ。

ｄｕｂｌｉｎ）ＳＬ５６３１の他の芳香族依存性生ワクチン菌株から得た。

各移動性菌株は、５Ｌ５６６９と形質導入における受容体として使用した。５Ｌ ５６６９はその相−１鞭毛抗原、ｉ、のために遺伝子Ｈ１−１中に挿入されたト ランスポゾンＴｎｌＯをもつサルモネラ・チフィムリウム（Ｓ、ｔｙｐｈｉｍｕ ｒｆｕｍ）菌株である。選択はテトラサイクリンに対して抵抗性であるクローン について行った。なぜなら、受容体の遺伝子Ｈ１−ｇ、ｐが供与体のＨｉ−ｉ　 ：　：ＴｎｌＯと置換されているからである。テトラサイクリン抵抗性クローン は、非移動性であることが発見され（野生型フラジェリン遺伝子がトランスポゾ ンにより不活性化された遺伝子により置換されているために）そして形質導入の 実施に使用したファージ、Ｐ２２　ＨＴ１０５／１を含まず、受容体として５Ｌ １４３８との交差からの５Ｌ５９２７、および受容体として５Ｌ５６３１との交 差からの５Ｌ５９２８を保持した。

５Ｌ５６３１はピルレントサルモネラ・デュブリン（Ｓ、ｄｕｂｌｉｎ）菌株、 ５ＶＡ４７の安定な芳香族依存性誘導体である。それは２段階の形質導入により 、サルモネラ・チフィ（Ｓ、ｔｙｐｈｉ）のａｒ。

Ａ（欠失）菌株の構成に使用した方法により得た（エドワーズ、Ｍ、Ｆ、、１９ ８５、Ｐｈ、Ｄ、　、Ｔｈｅｓｉｓ、　スタン７ｔ−７大学、カリ７ｔルニア） 。

組み換えフラジェリン融合タンパク質として異種エピトープの発現保護的免疫応 答の誘発および発現において重要な外来遺伝子をエンコードする、組み換えフラ ジェリン遺伝子の構成および発現を記載する。

組み換えフラジェリンとして発現した、異種寄生体およびバクテリアのエピトー プは、マラリアのＣＳタンパク質、およびコレラ毒素Ｂサブユニットのものであ った。組み換えフラジェリン分子を、減衰したサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌ ａ）菌株中に導入し、そしてそれにより発現させた。これは生ワクチン配合物中 に使用することができる。

材料および方法 プラスミドおよびバクテリアの菌株 使用したバクテリア菌株は、サルモネラ（Ｓａ　１ｍｏｎｅ　１１　ａ）菌株５ Ｌ１４３８　（ＡＴＣＣ受は入れ番号３９１８４）および５Ｌ５９２７　（ＡＴ ＣＣ受は入れ番号６７９４４４）　、およびＥ、ｃｏｌｉ菌株ＣＬ４４７であっ た。プラスミドｐＬｓ４０２は、プラスミドｐＢＲ３２２のＥｃｏＲ１部位中に 挿入されたサルモネラ・ムエンチェン（Ｓ、　ｍｕｅｎｃｈｅｎ）からの完全Ｈ １−ｄフラジェリン構造遺伝子をエンコードするゲノムのＤＮＡの３．８ｋｂの ＥｃｏＲＩ断片を含有する（（ウェイ、Ｌ、−Ｎ、およびジョイス、Ｔ、Ｍ、　 、１９８５、Ｊ、Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ。、１８６　：　７９１）。プラスミドｐＵｃ１８、ｐＵｃ１９および Ｅ、ｃｏｌｉ菌株ＪＭ１０３は、ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（ＢＲＬ ；ベセスダ、マリイランド州）。

制限酵素の消化のための条件 制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ、Ｃ１ａＩ、ＥｃｏＲＩおよびＥｃｏＲＶは 、ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（ＢＲＬ、ベセスダ、マリイランド州） から入手した。消化はＤＮＡを適当な制限緩衝液中に懸濁し、２〜３単位の酵素 ／１μｇのＤＮＡを添加し、そして３７℃において一夜インキユベーションする ことによって実施した。

ＢａｍＨＩの消化のために使用した制限緩衝液は、１０ミリモルのトリス−ＨＣ ｌ　（７，５）、１０ミリモルのＭｇＣ１，、および１００ミリモルのＮａＣ１ から成っていた。

ＥｃｏＲＩおよびＣ１ａＩの消化に使用した制限緩衝液は、１０ミリモルのトリ ス−ＨＣｌ　（７，５）　、１０ミリモルのＭｇＣｌ、、および５０ミリモルの ＮａＣ１から成っていた。

ＥｃｏＲＶの消化に使用した制限緩衝液は、１０ミリモルのトリス−ＨＣｌ　（ ７，５）、１０ミリモルのＭｇＣ１，、および１５０ミリモルのＮａＣ１から成 っていた。

ＤＮＡ断片中の平滑末端の発生 結合のための平滑末端をつくるために、５′オーバーハングをもつＤＮＡ末端を ＤＮＡポリメラーゼ■の大きい断片（クレノー断片）の作用によりフィリングア ウトした。クレノー断片を使用するフィリングアウトのために、１〜２５μｇの ＤＮＡを、６６ミリモルのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，５，６，６ミリモルのＭｇ Ｃ１，，１ミリモルのジチオスレイトール（ＤＴＴ）　、および２０ナノモルの すべての４つのデオキシヌクレオチド（ｄＡＴＰＳｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、および ＴＴＰ）を含有する緩衝液中で５０μｌの反応体積で１単位／１μｇのクレノー 断片（ＢＲＬ）のＤＮＡで室温において３０分間処理した。

ＤＮＡ断片のゲル精製 制限酵素の消化後、変化する大きさのＤＮＡ断片をポリアクリルアミドゲルの電 気泳動によりＴＢＥ緩衝液（０，０８９モルのトリス、０゜０８９モルのホウ酸 、０．００２モルのＥＤＴＡＳｐＨ７，５）を使用して１５ボルト／ｃｍにおい て分離した。アクリルアミドゲルは、アクリルアミド：ビスアクリルアミド（４ ０：１．１）の原溶液をＴＨＥ結合で、分離すべきＤＮＡ断片の大きさに依存し て６％または８％に希釈することによってキャストした。垂直の電気泳動後、バ ンドを臭化エチジウム蛍光により可視化し、そして適当なバンドを切除し、そし てのＴＢＥ緩衝液の１：１０希釈物を含有する透析管中に入れた。これを同一緩 衝液を含有するチャンバーに入れ、そして１００ミリアンペアで２時間電気溶離 した。電気溶離したＤＮＡ断片を液体内容物をバッグから取り出し、そしてＤＮ Ａを２体積の冷エタノールで３００ミリモルの酢酸ナトリウムの存在下に沈澱す ることによって回収した。

オリゴヌクレオチドの合成および精製 オリゴヌクレオチドは０．２μモルのスケールで、アプライド・バイオシステム スーインコーポレーテッド（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ、 ）の２８０型ＤＮＡ合成装置で、ベーターシアノエチル−ホスホルアミダイトの 化学を使用して合成した（シン／ｘ、　Ｎ、　Ｄ。

ら、１９８４、核酸の研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ） 　、１２　：　４５３９−４５４４）。

オリゴヌクレオチドは、電気泳動により、ＴＨＥ緩衝液（０，０１モルのトリス −ボレート、ｐＨ８，２，１ミリモルのＥＤＴＡ）中の０゜４ｍｍの厚さの８％ のポリアクリルアミドゲル中で精製し、これをほぼ１６００ボルトにおいて７５ ワツトの一定電力で実施した。オリゴヌクレオチドのバンドをネガティブシャド ウィングによりＰＥＩ（ポリエチレン−イミン）の薄層クロマトグラフィー平板 の上で紫外線下に可視化し、そして全長の産生物をゲルから切除した。合成オリ ゴヌクレオチドを０．３モルの酢酸ナトリウム、ｐ）Ｉｉ５．　５中で溶離し、 そして５体積の１００％のエタノールの添加により沈澱させ、−２０℃に冷却し 、そして１４．ＯＯＯＸｇで遠心した。沈澱物を真空下に乾燥し、モしてＴＥ緩 衝液（１０ミリモルのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，４，１ミリモルのＥＤＴＡ）中 に溶解した。

ホスフェート基を、合成オリゴヌクレオチドの５′末端に、Ｔ４ポリヌクレオチ ドキナーゼ（二ニー・イングランド・バイオラプス（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ　Ｂ ｉｏｌａｂｓ）、ｖサチュセッツ州ベベリイ）を使用して組み込んだ。１μｇの 精製したオリゴヌクレオチドを２５μｌの７０ミリモルのトリス−ＨＣｌ　（ｐ Ｈ７，６）　、１０ミリモルのＭｇＣ１！、５ミリモルのＤＴＴ、および１ミリ モルのアデノシントリホスフェート（ＡＴＰ）から成るキナーゼ緩衝液中に溶解 した。この溶液を２０単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼとともに３７℃にお いて３０分間インキュベージジンした。

相補的鎖のアニーリングは、キナーゼ処理した鎖を混合し、６０℃に１時間加熱 し、そして室温に冷却することによって達成した。

ＤＮＡの結合 すべての結合は、ＢＲＬ　（ベセスダ、マリイランド州）から購入したＴ４　Ｄ ＮＡリガーゼを使用して達成した。ベクターのＤＮＡおよび適当に処理した分離 した制限断片、または合成オリゴヌクレオチドを３０μｌのりガーゼ緩衝液（６ ６ミリモルのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，５，６，６ミリモルのＭ　ｇ　Ｃ＋　２ ．１０ミリモルのＤＴＴ、および１ミリモルのＡＴＰ）中に再懸濁し、そして２ ウニイス（Ｗｅｉｓｓ）単位のＴ４　ＤＮＡリガーゼ酵素を添加した。結合反応 を４℃において１８〜２４時間進行させた。通常、５０〜１１００ｎのベクター ＤＮＡをほぼ１０倍過剰のインサートＤＮＡに結合した。

プラスミドＤＮＡの形質転換 プラスミドｐＰＸ１６５１またはｐＬｓ４０８中の合成オリゴヌクレオチドの結 合から生ずるプラスミド構成体を、Ｅ、ｃｏｌｉの共通の菌株中に、形質転換の 技術（詳細について、参照、マニアチス、Ｔ、ら、１９８２、分子クローニング 、研究所のマニアル（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、Ａ　Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）、＝＋−ルド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−、 コールド・スプリング・ハーバ−、ニューヨーク）により挿入した。プラスミド 構成体を分離し、そしてまずＥ、ｃｏｌｉ中で特性決定した後、サルモネラ（Ｓ ａｌｍ。

ｎｅｌｌａ）種に転移した。なぜなら、サルモネラ・チフイムリウム（Ｓ、ｔｙ ｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）のそれらに関してＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２の形質転換の頻度 は高いからである。プラスミドをサルモネラ・チフイムリウム（Ｓ、ｔｙｐｈｉ ｍｕｒｉｕｍ）ＬＴ−２ＬＢ５０１０中に転移し、この菌株はサルモネラ・チフ イムリウム（Ｓ、ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）の３つの制限系について制限陰性で ある（が修飾効率がよい）、そしてより高い頻度で生ずるｇａｌＥ中の突然変異 を含有するまた含有する（サルモネラ・チフイムリウム（Ｓ、ｔｙｐｈｉｍｕｒ ｉｕｍ）の制限酵素の記載については、参照、プラスら、１９８０、Ｊ、Ｂａｃ ｔｒｔｏｌ、１４１：２７５） 次いで、プラスミドを減衰したサルモネラ（Ｓａ　１ｍｏｎｅ　１１　ａ）中に 形質導入技術により挿入した。所望のプラスミドを含有するＬＢ５０１０を、ル リア（Ｌｕ　ｒ　ｉ　ａ）ブロス中で３Ｘ１０”の密度に増殖し、この時点にお いてＤ−ガラクトース（１％の最終濃度に）を増殖培地に添加して、「円滑な」 リポ多糖（ＬＰＳ）の合成を誘発した。Ｄ−ガラクトースの存在下に１．５時間 増殖した後、バクテリオファージＰ２２ＨＴ　１０５／１　ｉｎｔを培養物に１ の感染の多重度に添加した。

ファージの吸着後、細胞を０．　７％の寒天を含有するＬＢ中で固定化した。フ ァージを収穫し、そして形質導入ファージＰ２２のための受容体として適当な減 衰したサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）を含有するＬＰＳ中にプラスミドを 形質導入するために使用した。

ＤＮＡの制限酵素の分析 組み換えプラスミドＤＮＡは、ＤＮＡを適当な制限エンドヌクレアーゼで消化し 、そして５μｇ／ｍ１の臭化エチジウムを含有するＴＢＥ緩衝液中で実施した１ ％のアガロースゲルを通す電気泳動により分析した。

バンドを臭化エチジウムの蛍光により検出した。

ポリアクリルアミドゲルの電気泳動 ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲルの電気泳動（ＰＡ ＧＥ）により組み換えフラジェリンタンパク質を分析するために、組み換えプラ スミドを含有するバクテリアの一夜の培養物の５００μｌを遠心し、そして沈澱 物を２００μｌのタンパク質の流れる混合物（’０．１２５ミリモルのトリス− ＨＣｌ、ｐＨ６，８，２，５％のＳＤＳ、５％の２−メルカプトエタノール、１ ０％のグリセロール、０゜００５％のブロモフェノールブルー）中に再懸濁し、 そして１００℃に１０分間加熱した。各試料の２０μｌをラエムリ（ラエムリ、 　Ｕ、　Ｋ、、１９７９、Ｎａｔｕｒｅ　２２７：６８０）により記載される条 件下に、４％のアクリルアミドの積み重ねゲルおよび１０％のアクリルアミドの 分離ゲルを通して電気泳動した。

ウェスタン・プロット分析 タンパク質試料の５ＤＳ−ＰＡＧＥ後、電気泳動したタンパク質をニトロセルロ ースのシート（シュライヘル・アンド・シュエル、ニューハンプシャイヤー州ケ ーン）にトウビンら（トウビン、Ｈｌら、１９７９、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃ ａｄ、Ｓｅｔ、Ｕ、Ｓ、Ａ、７６：４３５０）の方法により転移した。転移後、 フィルターをリン酸塩緩衝液（Ｐ　Ｂ　Ｓ）およびツイーン−２０中で室温にお いて１５分間インキュベーションすることによってブロッキングした。−次抗体 をＰＢＳおよび０．　１％のツイーン−２０（ＰＢＳ−ツイーン）中で適当な濃 度に希釈し、そしてフィルターに添加した。インキュベーションは室温において 少な（とも１時間および一夜程度に長かった。次いで、フィルターをＰＢＳ−ツ イーンを数回交換して洗浄し、セイヨウワサビペルオキシダーゼ接合した黄色ブ ドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）プロティンＡ（カー ケガード・アンド・ぺり−、マリイランド州）を１μｇ／ｍｌの濃度で添加し、 次いで室温において１時間インキュベーションした。次いで、フィルターをＰＢ Ｓ−ツイーンで数回洗浄し、そしてシグナルを０．０１％の過酸化水素、０．０ ６％の４−クロロ−１−ナフトール（シグマ・ケミカル・カンパニー、ミゾリー 州セントルイス）を含有するＰＢＳで室温において、適当なシグナルが検出され るまで、現像した。この反応をフィルターを蒸留水で数回洗浄することによって 停止した。

血清抗す−カムスボロゾイトタンパク質抗体についての酵素結合免疫収着アッセ イ 血清の抗体を測定するために、９６ウエル（ｗｅｌｌ）のポリスチレン平板（Ｎ ＵＮＣ）を５μｇ／ｍＲのＤＰＡＰＰＮＡＮＤＰ八ＰＰＮＡＮ　（ＫへＨ）　、 グルタルアルデヒドの架橋によりＫＬＨヘカップリングしたプラスモジウム・ベ ルブヘイ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｂｅｒｇｈｅｉ）ＣＳタンパク質の２反復単 位、で被覆した。各ウェルに０．　１ｍ／の０．１モルの炭酸塩／重炭酸塩緩衝 液（ｐＨ９，６）中の抗原を入れた。平板を３７℃において加湿したインキュベ ーター中で１８時間インキュベーションした後、０．０５％のツイーン２０　（ ＰＢＳ−Ｔ）を含有するＰＢＳで３回洗浄し、そしてＰＢＳ中の０．１％のゼラ チンで室温において６０分間ブロッキングした。平板をＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し 、そして血清ついての系統的希釈物を添加し、そして室温において９０分間イン キュベーションした。抗プラスモジウム・ベルブヘイ（Ｐ、ｂｅｒｇｈｅｉ）Ｃ ３Ｍａｂ３．２８を陽性の対照としてアッセイ使用した。

平板を前述したように洗浄し、そしてアルカリ性ホスファターゼ−接合ヤギ抗マ ウス免疫グロブリンの予備最適化濃度（１：　５０００血清希釈）を適当なウェ ルに添加し、そして室温において６０分間インキュベーションした。平板を再び 洗浄し、そして１００μＥの基質溶液（ｐ−ニトロフェニルホスフヱート、ジェ タノールアミン緩衝液中の１ｍｇ／ｍＣｐＨ９，６）を各ウェルに添加した。シ グナルを室温において６０分間発生させ、モしてＢｉｏ＝Ｔｅｋオートマチック ＥＬＩＳＡリーダーで空気をブランキングオン（ｂｌａｎｋｉｎｇ　ｏｎ）して 、４１０ｎｍおよび６９０ｎｍの二重の波長で読んだ。

組み換え鞭毛の部分的精製 組み換えプラスミドを収容するサルモネラ・デュブリン（Ｓ、ｄｕｂｌｉｎ）Ｓ Ｌ１４３８の一夜の培養物を使用して、１００ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを補充 したＬＢ培地中の１．５％（Ｗ／Ｖ）のディフコ寒天を含有する１５０ｍｍのペ トリ皿を接種し、そして平板を３７℃において４８時間インキュベーションした 。次いで、これらの平板を蒸留水でフラッディングし、そしてバクテリアを表面 からスクレイビングによりおだやかに除去した。この懸濁液を高い速度で標準の 食物ブレングー中でブレンドし、そしてバクテリアの破片を１０．００Ｏｒｐｍ でソーパル（Ｓｏｒｖａ　Ｉ　Ｉ）ＳＳ３４０−ター中で３０分間遠心すること によって除去した。上澄み液中に存在する鞭毛を、ベックマン７０゜ＩＴｉロー ター中で５０．０００において１時間超遠心することによって濃縮した。これら の鞭毛の調製物は５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルのクーマツシーブルーのタンパク質の染 色によりほぼ９０％の純度であると判定され、そしてタンパク質の濃度を同−ｇ 】上の既知量の標準タンパク質との比較により推定した。

実験動物の免疫化 雌のＣ５７ＢＬ／６マウス、生後はぼ６週（ジャクリン・ラボラトリーズ、メイ ン州パールハーバ−）を、完全フロインドアジュバント中に乳化した鞭毛の部分 的に精製したほぼ２５μｇで皮下的に免疫化した。

４週後、マウスを完全フロインドアジュバント中に乳化した鞭毛の同一調製物の ほぼ２５μｇで皮下的に促進した。すべての動物を、−次免疫化の前、促進の直 前、および促進の２週後に尾の静脈から採血した。

生きている、減衰したサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎａｌ　ｌａ）を使用する免疫化 のために、組み換えプラスミドを収容するサルモネラ・デュブリン（Ｓ、ｄｕｂ ｌｉｎ）ＳＬ１４３８の培養物を、１００μｇ／ｍＩ！のアンピシリンを補充し たＬＢ培地中で対数中期に増殖させ、遠心により収穫し、ＰＢＳで洗浄し、モし て１×１０８細胞／ｍｌの濃度に再懸濁した。この懸濁液のＱ、１ｍｌを６週齢 のＣ５７ＢＬ／６マウス（ジャクソン・ラボラトリーズ、メイン州パールハーバ −）に腹腔内投与した。

４週後、動物を調製したｌＸｌ０”細胞で促進し、そして同一方法において投与 した。動物を前述したように採血した。

バクテリアの移動性についてのアッセイサルモネラ・デュブリン（Ｓ、ｄｕｂｌ 　１ｎ）ＳＬ５９２７は、Ｈｌ−ｉ　：　：ＴｎｌＯによりその唯一のフラジェ リン遺伝子の形質導入の置換のために、非鞭毛化（そしてこうして非移動性）バ クテリア菌株である。５Ｌ５９２７の構成は、「フラジェリンマイナスワクチン の菌株の構成」と題する上の節に記載されている。

組み換えプラスミドを収容するサルモネラ・デュブリン（Ｓ、ｄｕｂｌ　１ｎ） ＳＬ５９２７の一夜の培養物を使用して、接種針の助けにより、移動性寒天の平 板（ＬＢ＋１００μｇ／ｍ１のアンピシリンおよび０゜３％のディフコ寒天）を 接種した。平板を一夜室温においてそして３７℃において６時間インキュベーシ ョンした。次いで、バクテリアの広がりのゾーンの直径を、バクテリアの移動性 の指示として、測定した。

墾 組み換えフラジェリン遺伝子の構成 プラスミドｐＬｓ４０２はゲノムＤＮＡの３．８ｋｂのＥｅｏＲＩ断片を含有し 、この断片は、プラスミドｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ部位に挿入された（第１図 ；ウェイ、Ｌ、−Ｎ、およびジョイス、Ｔ、　Ｍ、、１９８５、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂ ｉｏｌ、　、１８６：７９１）サルモネラ・ムエンチェン（Ｓ、ｍｕｅｎｃｈｅ ｎ）（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションの受け入れ番号８３８８ ）からの完全なＨｌ−ｄ（Ｈ１抗原ｄ）フラジェリン構造遺伝子（ウェイ、Ｌ、 −Ｎ、およびジョイス、ＴｏＭ、　、１９８５、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　、１ ８６：　７９１−８０３）を含む。この遺伝子についての解読領域の発表された 塩基配列（第２Ｂ図）を検査すると、位置６１９および６６７において４８塩基 対により分離された２つのＥｃｏＲＶ制限部位が明らかになった。他のＨ１遺伝 子から誘導された配列と比較することによって、これらの２つの制限部位を含有 する遺伝子は、−次アミノ酸配列および残基の数の両者が光度に変動しているこ とが実証された。こうして、われわれは、遺伝子のこの領域は鞭毛のアセンブリ ングおよび機能に必ずしも必要ではなく、こうして外来エピトープをエンコード するＤＮＡの挿入のために適当な位置であろうと結論した。この方法を利用する ために、ＥｃｏＲＶ制限部位をもたないプラスミドのベヒクル上にＨｌ−ｄ遺伝 子をサブクローニングすることが必要であった。したがって、ｐＬｓ４０２の３ ゜８ｋｂｃ７）ＥｃｏＲＶ断片ヲ分離し、そしｒｐＵｃ１８およびｐＵｃ１９の ＥｃｏＲＩ部位中にサブクローニングして、それぞれ、プラスミドｐＰＸ１６５ ０およびｐＬｓ４０５を構成した。次いで、これらの後者のベクターを使用して 、ヌクレオチド番号６１９および６６７の間の真性のＨｌ−ｄ　ＤＮＡ（第２Ｂ 図）を外来エピトープをエンコードするクローニングしたＤＮＡと置換すること ができた。組み換えプラスミドのスクリーニングをさらに促進するために、各プ ラスミド中のＥｃｏＲＶ部位の間の４８ｂｐの断片を、ｐＰＸ１６５０およびｐ Ｌｓ４０５をＥｃｏＲＶで消化し、そして消化したプラスミドの各々を再結合す ることによって欠失した。次いで、形質転換体を４８ｂｐの断片の損失について スクリーニングした；こうして、ｐＰＸ１６５１およびｐＬｓ４０８が得られた （第１図）。これらのプラスミドは、外来エピトープの挿入のためのただ１つの ＥｃｏＲＶ部位を保持した。さらに、ここで、外来ＤＮＡの４８ｂｐの片のイン サートをもつベクターを単にそれ自体に再結合したベクターと区別することがで きた。

フラジェリンとの遺伝子の融合として発現される外来エピトープの能力を試験す るために、後述するように、いくつかの遺伝子構成体を作った。

フラジェリン融合タンパク質としてマラリアの寄生体のエピトープをエンコード する組み換えフラジェリン遺伝子の構成フラジェリン融合タンパク質として、マ ラリアの寄生体（プラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）属）サーカムスボロ ゾイトのタン／＜り質のエピトープをエンコードする、組み換えフラジェリン遺 伝子を構成した。

最初に、プラスモジウム・ファルシパルム（Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）サーカ ムスポロゾイトタンパク質の４アミノ酸反復配列の４コピーをエンコードする、 ２つの相補的４８残基のオリゴヌクレオチドを合成した（第３Ａ図）。これらの 核酸断片の配列は、アニーリングしたとき、相補的な３塩基のオーバーハングが つくられるようなものであり、これらのオーバーハングはオリゴヌクレオチドを 頭尾の方式でのみそれら自体に結合させ、こうして同−向きで多数のオリゴヌク レオチドのすべてを挿入することを確実にした。断片をアニーリングした後、そ れらをＤＮＡポリメラーゼの大きい断片（クレノー酵素）で処理することによっ て平滑末端とし、モしてＥｃｏＲＶで前に消化したｐＰＸ１６５１に結合した。

Ｅ、ｃｏｌｉ菌株ＪＭ１０３の形質転換後、アンピシリン抵抗性コロニーをプラ スミドＤＮＡの制限部位の分析により組み換えプラスミドの存在についてスクリ ーニングした。２つの組み換え体が同定された：ｐＰＸ１６５３は挿入されたオ リゴヌクレオチドの単一のコピーを含有し、そしてｐＰＸ１６５２は３つの挿入 されたオリゴヌクレオチドを含有する。ＤＮＡ配列の分析により、ｐＰＸ１６５ １との結合前にＤＮＡポリメラーゼ■のクレノー断片で処理することによってフ ィルインされた、ｐＰＸ１６５２中に存在するオリゴヌクレオチドの３つの断片 は同−向きで挿入した。この手順により、オリゴヌクレオチドによりエンコード された１６アミノ酸のブロックの間に追加のアスパラギン残基が挿入された。プ ラスモジウム・ファルシパルム（Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）の反復領域に対し て特異的なモノクローナル抗体を利用して、細胞抽出物をウェスタン・ブロッテ ィングすると、これらのクローンは組み換えフラジェリンについて適当な分子量 の免疫活性のタンパク質を発現したことが実証された。

同様な方法を使用して、プラスモジウム・ベルブヘイ（Ｐ、ｂｅｒｇｈｅｉ）Ｃ Ｓタンパク質の反復した８アミノ酸配列を発現する組み換えフラジェリン分子を つ（うた。この実験の組において、オリゴヌクレオチドをクレノー酵素による処 理の前に一緒に結合して、すべて同−向きでかつＤＮＡ配列を介在させないで、 連続するオリゴヌクレオチドの挿入を確実にした。１．３または３コピーの特異 的オリゴヌクレオチドを含有するクローンが得られ、そして、それぞれ、ｐＰＸ １６６１、ｐＰＸ１６６２およびｐＰＸ１６６３と命名した。これらのクローン を収容するバクテリアは、プラスモジウム・ベルブヘイ（Ｐ、ｂｅｒｇｈｅｉ） Ｃ８特異的モノクローナル抗体を使用してウェスタン・プロット分析スるとき、 適当な分子量の免疫反応性タンパク質を発現することが発見された。

フラジェリン融合タンパク質としてコレラ毒素Ｂサブユニットのエピトープをエ ンコードする、組み換えフラジェリン遺伝子の構成同様な方法を使用して、フラ ジェリン融合タンパク質として、病原性バクテリアのビブリオ・コレラエ（Ｖｉ ｂｒｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａｅ）のエキソトキシンのエピトープを発現させた。こ の組み換え体の構成のために、コレラ毒素Ｂサブユニット（ジャコブ、Ｃ１０， ら、１９８３、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、８０ニア ６１１）のＣＴＰ３ペプチド（第４Ａ図）により発現されるエピトープをエンコ ードする相補的オリゴヌクレオチド（第４Ｂ図）を合成した。この合成オリゴヌ クレオチドによりエンコードされるアミノ酸配列は、次の通りであり： （Ｎ）Ｖａｔ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｉｎ−Ｓｅｒ−Ｇｌ　ｙ−Ｈｉｓ− １１ｅ−＾５ｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｌａ（Ｃ）モしてＢサブ ユニットの残基番号５０〜６４（第４Ｂ図）を表す。相補的オリゴヌクレオチド をアニーリングし、そしてクレノー酵素の処理により平滑末端とした。次いで、 これらの断片をｐＬＳ４０８のＥｃｏＲＶ部位中に挿入し、そしてＥ、ｃｏｌｔ 　ＣＬ４７７中に形質転換した。

単一のインサートを含有するプラスミドを制限分析により同定し、そしてｐＬｓ ４１１と命名した。ｐＬｓ４１１は、インサートのＤＮＡ配列決定およびウェス タン・プロット分析により、インサートを所望の向きで含有することが確証され た。なぜなら、それは抗Ｈ１−ｄ抗血清およびＣＴＰ３ペプチドに対してレイズ されたモノクローナルおよびウサギポリクローナル抗血清の両者を認識する、適 当な分子量の分子を発現したからである。

組み換えフラジェリン融合タンパク質の発現生ワクチンとして使用する減衰した バクテリアの宿主中でこれらの組み換えフラジェリン分子を発現するために、前 述の構成体のすべて（第５図）をサルモネラ・デュブリン（Ｓ、　ｄｕｂ　１　 ｉ　ｎ）の減衰した菌株（ＳＬ１４３８および５Ｌ５９２７）中にファージの形 質導入（シュメイガー、１９７２、Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、１１９、ニア ５）により導入した。これらの菌株の減衰に使用した方法は、ストッカーおよび 彼の共同研究者により記載された（ホイセス、Ｓ、　Ｋ、およびストッカー、Ｂ 、Ａ、Ｄ、　、１９８１、Ｎａｔｕｒｅ　２９１：２３８；ストッカー、Ｂ、Ａ 、Ｄ、ら、１９８２、Ｄｅｖｅｌｏｐ、Ｂｉｏｌ、５ｔａｎｄａｒｄ、５３　： 　４７　；　：米国特許第４，５５０．０８１号）。詳しくは、欠失を遺伝子ａ ｒｏＡ中に導入して、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、葉酸前駆 体ｐ−アミノ安息香酸、およびエンテロチェリン前駆体、ジヒドロキシ安息香酸 について多面的要求を生成した。

ｐ−アミノ安息香酸は動物組織に存在せずそして腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａ ｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）の構成員は動物組織から葉酸を同化することができず、 動物またはヒトの宿主内で減衰する。ウェスタン・プロット分析をこれらの菌株 の各々からの抽出物について実施し、そして組み換えフラジェリンの合成をフラ ジェリンのエピトープに対して向けられた両者の抗体を使用して実証し、これら の菌株はフラジェリン分子中に挿入された外来エピトープに対する免疫応答を誘 発するための生ワクチンとして価値がありうることが示された。

組み換えフラジェリンのイムノゴウルド（ｉｍｍｕｎｏｇｏ　Ｉｄ）標識つけ 鞭毛の表面における外来エピトープの暴露を、第１抗体としてＭａｂＴＥ３３を 使用して、ホルマリン固定したバクテリアの鞭毛の全免疫標識つけにより検出し た。完全なＣＴＰ３インサートまたはプラスミドｐＬｓ４０８をもち、生体外の 欠失をもつがインサートをもたない、いずれかのプラスミドｐＬｓ４１１を収容 する菌株５Ｌ５６７６を、Ｍａｂ　ＴＥ３３で処理し、そして電子顕微鏡の可視 化（Ｘ３０，０００）のために、全接合したマウスＩｇＧに対するヤギ抗体（ジ ャンセン）で処理した。標識の可視化により、ＣＴＰ３エピトープはバクテリア の表面上に存在することが示された。

組み換えフラジェリン融合タンパク質は機能的鞭毛にアセンブリングすることが できる 完全な鞭毛に重合し、したがってバクテリアの外部表面上に存在することができ る組み換えフラジエワンタンパク質の能力は、常態で非移動性（フラジェリン陰 性のために）宿主におけるそれらの移動性の回復により実証された（表ＩＩＩン 。

表ｌｌｌ ５．ｄｕｂｌｉｎ　５Ｌ５９２７中の移動性１プラスミド　異種抗原２　広がり の直径（關）１ｐＰＸ１６５０車　２０ ｐＰＸ１６５１車　２２ ｐＰＸ１６５２”　Ｐ、　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ　ＣＳタンパク質　１３，５ｐ ＰＸ１６５３＊　Ｐ、　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ　ＣＳタンパク質　１８ｐＰＸ１ ６６１＊　Ｐ、　ｂｅｒｇｈｅｉ　ＣＳタンパク質　２１ｐＰＸ１６６２＊　Ｐ 、　ｂｅｒｇｈｅｉ　ＣＳタンパク質　１３．５ｐＰＸ１６６３＊　Ｐ、　ｂｅ ｒｇｈｅｉ　ＣＤタンパク質　１２ＰＬＳ４１１　コレラ毒素Ｂサブユニット　 ４．５ｐｔｌｓ１８　。

１　（非移動性）Ｓ、ｄｕｂｌｉｎ　５Ｌ５９２７＝Ｓ、ｄｕｂｌｉｎＳＬ５９ ２８　Ｈｌ−ｉ：：ＴｎｌＯ ２自然抗原、左においてプラスミドによりエンコードされる組み換えフラジェリ ン融合タンパク質として発現される部分。

３−夜の培養物を、１００ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを補充したＬＢ培地中の０ ．３％の寒天を含有する６０ｍｍのベトリ皿中に突き刺した。平板を室温におい て１６時間および３７℃において６時間インキュベーションした。次いで、バク テリアの広がりのゾーンの直径（ｍｍ）を測定した。

＊フラジェリンＨ１−ｄ遺伝子の少なくとも１つの一部分をエンコードする。

５Ｌ５９２７は、移送可能な要素（ＴｎｌＯ）の挿入により、Ｈ１抗原（フラジ ェリン）をエンコードする構造遺伝子の染色体のコピーの中断により、構成され た５Ｌ１４３８の非移動性誘導体である：この菌株は、他のサルモネラ・デュブ リン（Ｓ、ｄｕｂｌｉｎ）のように、Ｈ２アレルをもたない。５Ｌ５９２７は、 「フラジェリンマイナスワクチン菌株の構成」において前述したように、構成す る。組み換えフラジェリンのプラスミドのいずれかを導入すると、この菌株に対 する移動性が少なくとも一部分回復し、これらの組み換えフラジェリンは機能的 鞭毛にアセンブリングすることができ、したがって外来エピトープは細胞の外部 表面上に存在することが示される。

組み換えフラジェリン融合タンパク賃上の異種エピトープの免疫原性外来エピト ープを宿主の免疫系供給する組み換えフラジェリンの能力を実証するために、Ｃ ５７Ｂ１／６マウスを、プラスモジウム・ベルブヘイ（Ｐ、ｂｅｒｇｈｅｉ）Ｃ ３免疫優生反復の２つのコピーを各フラジェリン分子中で発現するサルモネラ・ デュブリン（Ｓ、ｄｕｂ　ｌ　ｉ　ｎ）ＳＬ１４３８から分離し、部分的に精製 した鞭毛（プラスミドｐＰＸ１６６１によりエンコードされた）で免疫化するか 、あるいは野生型Ｈ１−ｄ鞭毛（プラスミドｐＰＸ１６５０によりエンコードさ れた）で免疫化した。マウスに完全フロインドアジュバント中に乳化したＦＥＢ ＳＬｅｔｔ、タンパク質のほぼ２５μｇを第０週に皮下注射し、そして不完全フ ロインドアジュバント中の同一調製物の２５μｇで週後に皮下的に促進した。動 物を第１および第２の免疫化前に採血し、そして再び促進後２週に採血した。血 清はＥＬＩＳＡによりプラスモジウム・ベルブヘイ（Ｐ、ｂｅｒｇｈｅｉ）Ｃ３ 反復（ＤＰＡＰＰＮＡＮ）の２つのコピーをエンコードする合成ペプチドに対し て特異的な抗体についてアッセイした。抗プラスモジウム・ベルブヘイ（Ｐ、ｂ ｅｒｇｈｅｉ）抗体（第７図）は−次免疫化後４週でバックグラウンドよりわず かに上にあり、そしてレベルは促進免疫化後に劇的に増加したが、これに対して 対照の野生型の鞭毛（プラスミドｐＰＸ１６５０によりエンコードされた）で免 疫化した動物におけるこれらの抗体のレベルは前に採血した値（第７図、週Ｏ） と有意に異ならなかった。

プラスモジウム・ベルブヘイＣＰ、ｂｅｒｇｈｅｉ）ＣＳペプチド（プラスミド ｐＰＸ１６６２によりエンコードされた）を有する組み換え鞭毛を発現する生き ているサルモネラ・デュブリン（Ｓ、ｄｕｂ　１１ｎ）ＳＬ１４３８によるＣ５ ７Ｂ１１５マウスの免疫化は、また、野生型Ｈ１−ｄ鞭毛（プラスミドｐＰＸ１ ６５０によりエンコードされた）（第８図）を発現する同一バクチリア菌株で免 疫化した対照動物に関して、このエピトープに対する血清抗体の有意のレベルを 誘発し、これらの有機体の表面上で発現されるフラジェリン融合タンパク質とし て外来エピトープを供給する、生きている減衰したバクテリアの能力を例示する 。

免疫原性の試験のために、われわれは、芳香族依存性生ワクチンサルモネラ・デ ュブリン（Ｓ、ｄｕｂ　Ｉ　ｉｎ）菌株５Ｌ１４３８の相１フラジェリン遺伝子 、Ｈｌ−ｇ、ｐ（クレメンツ、Ｊ、ら、１９８７、Ｉｎｆｅｃｔ、ｒｍｍｕｎ、 ５３：６８５；　ドウガン、Ｇ、ら、１９８７、Ｐａｒａｓｉｔｅ　Ｉｍｍｕｎ ｏｌ、９：１５１：およびポチェル、Ｔ。

Ｐ、ら、１９８８、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、６８　：　２５）をトランスポゾンＨ １−ｉ　：　：ＴｎｌＯにより不活性化されたフラジェリンのアレルと置換した ；サルモネラ・デュブリン（Ｓ、ｄｕｂ　Ｉ　ｉｎ）は単一の相である、生ずる 菌株、５Ｌ５９２８、は非移動性であるが、フラジェリン陰性ｓｙｐ宿主、５Ｌ ５６７６についてちょうど観測されるように、Ｈｌ−ｄの野生型、欠失、または キメラの形態を含有するプラスミドで形質転換したとき、移動性となった。ｐＵ Ｃ誘導プラスミドは、アンピシリンを含まないブロス中の２回の継代培養後のバ クテリア懸濁液からの１００より多いコロニーのアンピシリン抵抗性により、お よび剖検のときマウスの肝臓から回収されるすべてのコロニーのアンピシリン抵 抗性によりて示されるように、使用した生ワクチン中で安定である。われわれは 、ホルマリンで殺したまたは生きている、５×１０６バクテリアの３回の腹腔内 注射で、７日の間隔で、Ｃ５７Ｂ１／６マウスを免疫化した。最後の注射後、マ ウスを採血し、そしてそれらの血清を酵素連鎖免疫収着アッセイ（ＥＬＴＳＡ） によりＣＴＰ３ペプチドまたは全コレラ毒素との反応性について試験した（第９ 図）。われわれは、すべての血清中の挿入されたエピトープに対する抗体を検出 した；すべでのＳＳａはコレラ毒素とＣＴＰ３ペプチドと同程度に強（反応した 。

第９図は、５Ｌ５９２９、キメラフラジェリン遺伝子を発現するサルモネラ・デ ュブリン（Ｓ、ｄｕｂ　ｌ　ｉｎ）生ワクチン菌株で免疫化した５匹のマウスの 抗体の応答を示す、５Ｌ５９２９による、免疫化前、口、免疫化後、■。マウス の血清と全コレラ毒素との反応性は、マウスＩｇＧに対するペルオキシダーゼ接 合ヤギ抗体（ＴＡＧＯ）を使用して、固相のＥＬＩＳＡにより測定した（ジャコ ブ、Ｃ１０，ら、Ｐｒｏｃ、Ｎ’　ａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、８ ０ニア６１１　（１９８３））。

マウスを毎週の間隔で５Ｘ１０’のホルマリンで殺したバクテリアを腹腔内３回 注射した；血清を最後の注射後７日に集めた。棒は５匹のマウスからの血清につ いての平均の光学密度を表す（すべての希釈についてＳＥは１５％より大きい） 。

論考 われわれは、フラジェリン、バクテリアの鞭毛フィラメントのタンパク質、との 融合タンパク質として、病原性有機体に対する保護的免疫応答の誘発に対して重 要なエピトープの発現を実証する。通常、原核動物の寄生体によるか、あるいは バクテリアにより発現されるエピトープエンコードした、いくつかの組み換えフ ラジェリン遺伝子を構成した。プラスモジウム・ファルシパルム（Ｐ、ｆａｌｃ ｉｐａｒｕｍ）のサーカムスポロゾイト（ＣＳ）タンパク質の免疫優生反復エピ トープおよびプラスモジウム・ベルブヘイ（Ｐ、ｂｅｒｇｈｅｉ）に関連する類 似のエピトープを、サルモネラ・ムエンチェン（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｍｕｅ ｎｃｈｅｎ）のＨｌ−ｄ遺伝子のある領域中に挿入した。コレラ毒素（ＣＴ−Ｂ ）の結合性サブユニット上に存在する保護的エピトープをエンコードするオリゴ ヌクレオチドを、また、Ｈｌ−ｄフラジェリン遺伝子中に挿入した。これらの組 み換え構成体のすべては、それらの期待する分子量と一意する移動性で５ＤＳ− ＰＡＧＥを通して移動する分子を発現することが示された。さらに、これらの分 子は、ウェスタン・プロットで、Ｈｌ−ｄフラジェリン分子に対して特異的な抗 血清により、ならびに自然タンパク賃上の異種エピトープを認識する因子により 認識された。

これらのハイブリッドのタンパク質は組み換えバクテリアの表面上で発現する能 力を保持し、こうしてサブユニットのワクチンの成分として使用するための、こ れらの分子の分離および精製を促進する。さらに、これらの分子は組み換えプラ スミドを収容するＥ、ｃｏｌｉにより発現されるばかりでなく、かつまた生ワク チンとして有用であることができる、いくつかの減衰したサルモネラ（Ｓａ　１ ｍｏｎｅ　＋　ｌａ）菌株中に導入された。減衰した、侵入性のバクテリア中の 組み換えフラジェリン分子の発現は、重要な、免疫原性エピトープを同定できる 、本質的に任意の病原体に対する生ワクチンの配合を可能とする。

実施例２ 組み換えフラジェリン融合タンパク賃としてＢ型肝炎表面抗原のエピトープの発 現 この研究において、われわれは、それぞれ、アミノ酸配列５１２２−１３７およ びｐｒｅＳｚ１２０−１４５をエンコードする２つの特異的ＨＢＶ　Ｓ遺伝子配 列を、サルモネラ（Ｓａ　１ｍｏｎｅ　１１　ａ）フラジ；リン遺伝子Ｈ１−ｄ 中に挿入し、モしてＨＢｓＡｇエピトープは組み換えプラスミドにより形質転換 された、フラジェリン陰性減衰したサルモネラ・デュブリン（Ｓ、ｄｕｂｌｉｎ ）収量を発現されることが示された。生ワクチンを使用する動物の免疫化は、抗 ＨＢｓおよび抗フラジェリンの両者の応答に導いた。

合成オリゴヌクレオチド、合成ペプチドおよび組み換えＤＮＡ法特法的異的配列 つ一本鎖オリゴヌクレオチドを合成し、そしてポリアクリルアミドゲルの電気泳 動により精製した。使用した合成オリゴヌクレオチドに相当する配列をもつ合成 ペプチド５１２２−１３７およびｐｒｅｓ、１２０−１４５を、固相方法（エリ ックリン、Ｂ、Ｗ、およびメリフィールド、Ｒ，Ｂ、（１９７６Ｌタンパク質（ Ｔｈｅ　Ｐｒ。

ｔｅｉｎｓＬ編、Ｈ，ネウラスおよびＲ，Ｌ、ヒル（アカデミツク・プレス、ニ ューヨーク）Ｖｏｌ、２、Ｉ）り、２５５）により合成し、そしてセファデック ス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）ＬＨ−２０のゲル濾過により精製した。ペプチドの純度 を、分析用逆相ＨＰＬＣおよびアミノ酸分析により検査した。クローニング技術 は、マニアチス、Ｔ、ら、１９８２、分子クローニング、研究所のマニアル（Ｍ ｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ ）、＝ｙ−ルド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−、コールド・スプリング ・ハーバ−１に記載されているとおりであった。バクテリアのリゼイトは、１． ０ｍｌの一夜の培養物から、バクテリアを遠心し、そしてそれらをＯ，１ｍｌの 試料緩衝液（２％のＳＤＳ　（シグマ）、２％のＢ−メルカプトエタノール（シ グマ）、およびＰＭＳＦ　（フェニルメタンスルホニルフルオニ　ライド）　、 ＴＬＣＫ　（Ｎ−トシル−Ｌ−リジンクロロメチルケトン）、ＴＰＣＫ（Ｎ−ト シル−Ｌ−フェニルアラニンクロロメチルケトン）、ロイペプチン、ペプスタチ ン（プロテアーゼ阻害因子、ベーリンガー・マンヘイム）を製造業者が示唆する 濃度で含有する）中に再懸濁した。

抗血清 ポリクローナルウサギ抗Ｈ１−ｄ　（サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）相− １鞭毛抗体）血清（Ｐ、　Ｈ，マケラ博士から入手した、ナショナル・パブリッ ク・ヘルス・インスチチュート、フィンランド国ヘルシンキ）を抗フラジェリン 血清として使用した。ポリクローナルヤギ抗ＨＢｓ（ヒト血漿から精製した自然 ＨＢｓＡｇに対してレイズした）をダコ・カンパニーから購入した。ペプチド５ １２２−１３７およびｐｒｅＳｄ２０−１４５に対する抗血清を、それぞれのチ ログロブリンと接合した合成ペプチドでモルモットを免疫化することによってレ イズした。

滴定により確立された、これらの抗血清の最適な希釈物を使用して、イムノブロ ッティングによりバクテリアのリゼイト中のそれぞれのＨＢｓＡｇエピトープの 発現を検出した。

免疫化 免疫化のためのバクテリアのクローンを、５０ｍｇ／ｍＩ！のアンピシリンを含 有するルリア（Ｌｕｒｉａ）ブロス中で３７℃において一夜増殖させた。細胞を ２回洗浄し、そしてリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）中に再懸濁した。２羽のニューシ イランド白ウサギを、各バクテリアのクローンで、１ｍｌ１のほぼ１０９の生き ているバクテリアを含有する懸濁液の筋肉的注射により、第０，７．１４．２１ および２８日に免疫化し、そして血液の試料を第０１２８．５６および８４日に 採取した。

３匹のモルモットおよび１０匹のマウス（ｐｒｅｓｚ１２０−１４５クローンに ついてＢＩＯ，ＢＲマウスおよび５１２２−１３７クローンについてＢＡＬＢ／ ｃｊマウス）、２つのペプチドについて既知の応答体（Ｆ、チアサリ、個人的通 信およびオリゴ、Ｄ、　Ｒ，ら、１９８６、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、１６４：５３ ２）を、各クローンで、第０．７．１４および２８日に、ｌｒｌ！の懸濁中のほ ぼ１０９の生きているバクテリアを各モルモットの口の中に入れるか、あるいは ０．０５ｍｆ中のほぼ５Ｘ１０”の生きているバクテリアを各マウスの口の中に 入れることによって免疫化し、そして血液の試料を第０．２８．５６および８４ 日に集めた。

血清を、特異的抗体について、ベーリンガー・マンヘイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ ｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）から購入したアルカリ性ホスファターゼ接合抗ウサギ、 抗マウスまたは抗モルモットの抗血清を使用して、ＥＬＩＳＡ（ブラダ−ハム、 Ｋ、（１９８４）、ハンマング・プレス（Ｈｕｍｍａｎｇ　Ｐｒｅｓｓ）、ニュ ージャーシイ州りリフトン、Ｖｏ　］。

１：タンパク質（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、Ｅ）Ｉ）、１６５）によりアッセイした 。抗体の力価は、試験血清のＡ４０５および免疫前の血清のＡ４０５の比が２， ０を越えるときの試験血清の最高の希釈を呼ぶ。

組み換えプラスミドの構成 保護的または部分的に保護的のエピトープを含有すると思われる、ＨＢｓＡｇ　 （血清型ａｙｓ）アミノ酸配列を各々がエンコードする２つの合成オリゴヌクレ オチドを、この研究において使用した（Ｓ１２２−１３７およびｐｒｅｓｚ１２ ０−１４５）　。第１０図の上の線は、フラジェリン遺伝子のＥｃｏＲＶ中のイ ンフレームの挿入のために設計した対応する合成オリゴヌクレオチドのヌクレオ チド配列を表す（第１０図）。

選択したコドンはサルモネラ（Ｓａ　１ｍｏｎｅ　１１　ａ）のフラジェリン遺 伝子Ｈ１−ｄにおいて最も頻繁に使用された（ウェイ、Ｌ、−Ｎ、およびジョイ ス、Ｔ、Ｍ、、１９８５、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　、１８６：７９１）、Ｋｐ ｎｌおよびＢａｍＨＩの制限部位（それぞれ、５１２２−１３７およびｐｒｅｓ ｚ１２０−１４５の解読配列）を含めて、制限分析により組み換え体の同定を可 能とした。ＥｃｏＲＶの半分の部位をｐｒｅｓｓオリゴヌクレオチドの３″末端 に配置して、他のＨＢＶエピトープのためのオリゴヌクレオチドとの結合を促進 した。２つの停止コドン（下線を引いた）をｐｒｅｓ１オリゴヌクレオチドに対 して相補的に配置して、所望の向きのインサートをもつクローンの選択を容易に した。フラジェリン遺伝子は、プラスミドｐＵｃ１９のＥｃｏＲ１部位中にクロ ーニングされた１、５ｋｂのフラジェリン解読配列を含有する、３．８ｋＢのサ ルモネラ・ムエンチェン（Ｓ、ｍｕｅｎｃｈｅ’ｎ）ゲノム断片から成るプラス ミドｐＬｓ４０５中に含有された（参照、実施例１）。野生型フラジェリン遺伝 子の中央の超可変領域は、４８塩基対（ｂｐ）の間隔をもつ２つのインフレーム ＥｃｏＲＶ部位を含有する（第１０図）。プラスミドｐＬ３４０８を生成するた めのｐＬｓ４０５中のこのＥｃｏＲＶ断片の欠失は、バクテリアのフラジェリン 化を減少するが、壊滅させない（参照、実施例４）。オーバーラッピングする相 補的一本鎖の合成オリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーシ履ンし、リン酸化し 、Ｅ、ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼのクレノー断片で修復して、平滑末端の二 本鎖ＤＮＡ断片を作り、次いでｐＬＳ４０８のＥｃｏＲＶ部位中にＴ４　ＤＮＡ リガーゼで結合し、そして結合ｒｍｘを使用して、ＣＬ４４７、フラジェリン陰 性菌株Ｅ、ｃｏｌｔ　Ｃ６００ｈａｇ−ｎ。

変異型、を形質転換した。組み換えプラスミドをもつクローンを、コロニーのハ イブリダイゼーシヨンにより、プローブとして０ｐで標識したそれぞれの合成オ リゴヌクレオチド使用して、そして制限消化により同定した。インサートの数、 向き、リーディングフレームおよび信頼度をジデオキシヌ配列決定（サンガー、 Ｆ、ら、１９７７、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、７４ ：５４６３）により、ＥｃｏＲＶ部位から約３ｏｂｐ下流のフラジェリン遺伝子 配列に相当する１５ヌクレオチドの合成プライマーを使用して決定した。異なる 向きにそれぞれの合成オリゴヌクレオチド配列の１〜３コピーをもつ、いくつか の組み換えプラスミドを分離し、そしてさらに特性決定した。

組み換えクローンの特性決定 さらに分析すべき組み換えプラスミドを使用して、サルモネラ・チフィムリウム （Ｓ、ｔｙｐｈ　ｉｍｕｒ　ｉｕｍ）ＬＢ５００　（突然変異ｆｌａＡ６６をも つ制限陰性、修飾の効率的な、非フラジェリン化菌株）能力細胞を形質転換し、 次いで各場合においてアンピシリン抵抗性について選択して、Ｐ２２　ＨＴＩＯ ／１　ｉｎｔを使用する形質導入により、サルモネラ・デュブリン（Ｓ、ｄｕｂ ｌｉｎ）ＳＬ５９２８のフラジェリン陰性生ワクチン菌株に転移した。５Ｌ５９ ２８はサルモネラ・デュブリン（Ｓ、ｄｕｂｌ　１ｎ）ＳＬ１４３８から誘導さ れた芳香族依存性菌株である（スミス、Ｂ、Ｐ、ら、１９８４、Ａｍｅｒ、Ｊ、 Ｖｅｔｅｒｉｎ、Ｓｃｉ、４５：２２３１）：それは単一の相である、その単一 のフラジェリン遺伝子がトランスポゾン、Ｔｎｌｏ、により不活性化されている ので、非移動性である。

Ｅ、ｃｏｌｔ　Ｃ６００ｈａｇ−変異型菌株および５１２５８の両者中で発現し た抗原を、イムノブロッティングにより、ウサギ抗Ｈ１−ｄ（抗フラジェリンと して使用する）、またはヤギ抗ＨＢｓＡｇまたは抗合成ｐｒｅＳｔ１２０−１４ ５ペプチド抗血清のいずれかを使用して検査した。５１２２−１３７をエンコー ドする配列（Ｓ　１６　ｅおよび５２０ｅ）、配列ｐｒｅｓ＊１２０−１４５　 （ｐｓ８ｅ）またはｐｒｅＳ。

１２０−１４５のためのｐｒｅｓｚ１２１　１４５　（ｐｓ２１ｅ）を含有する 組み換えプラスミドで形質転換されたＥ、ｃｏｌｉ　Ｃ６Ｃ６００ｈａ変異型、 および同一プラスミド（それぞれ、５１６ｓＳＳ２０Ｓおよびｐｓ８ｓｐｓ２１ ｓ）サルモネラ・デュブリン（Ｓ、ｄｕｂｌｉｎ）ＳＬ５９２８および形質転換 しないＥ、ｃｏｌｉ　Ｃ６００ｈａｇ−菌株およびサルモネラ・デュプリン（Ｓ 、ｄｕｂｌ　１ｎ）ＳＬ５９２８から成る対照、ＥｃｏＲＶ断片の欠失をもつ親 プラスミドｐＬＳ４０５のみで形質転換された５Ｌ５９２８であるサルモネラ・ デュブリン（Ｓ、ｄｕｂ　１１ｎ）ＳＬ５９８５および患者の血清からのＨＢｓ Ａｇのバクテリアのリゼイトを、適用の前に１００℃に３分間加熱した。

タンパク質はドデシル硫酸ナトリウム−１２，５％のポリアクリルアミドゲルの 電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分離した（ラエミリ、Ｕ。

Ｋ、　、１９７０、Ｎａｔｕｒｅ　２２７：６８０）ｏタンパク質をニトロセル ロースのフィルターに移し、フィルターを抗Ｆとして示されているウサギ抗Ｈ１ −ｄ抗血清またはヤギ抗ＨＢｓＡｇまたはウサギ抗合成ペプチドｐｒｅｓｚ１２ ０−１４５で免疫染色した。アルカリ性ホスファターゼまたはペルオキシダーゼ と接合した適当な第２抗体とのインキュベーションを実施し、次いでＮＢＴ−Ｂ ＣＩＰ　（アルカリ性ホスファターゼについて）またはＤＡＢ　ＨｘＯｔ（ペル オキシダーゼについて）と反応させた。

期待するように、フラジェリン抗原は、完全なフラジェリン遺伝子を欠く、Ｅ、 ｃｏｌｔ　Ｃ６００ｈａｇ−変異型またはサルモネラ・デュブリン（Ｓ、ｄｕｂ 　Ｉ　ｔｎ）ＳＬ５９２８において検出されなかった。

フラジェリン抗原として反応する２つの電気泳動の成分はクローンＳ２０におい て検出され、そしてこの複雑なパターンの基準は明瞭ではない。

ヒトから精製したＨＢｓＡＧ（ａｙｗ）に対してレイズしたヤギ抗ＨＢｓは、ク ローンＳ１６およびＳ２０　（Ｓ１２２−１３７をエンコードする配列をもつ） およびクローンｐＳ８およびｐｓ２１　（それぞれ、ｐｒｅｓ＊１２０　１４５ およびｐｒｅｓｔ１２１−１４５をもつ）のハイブリッドの７ラジエリンタンパ ク賀と反応し、これらのハイブリッドのクローンがこの抗ＨＢｓを含有するｓａ ｍにより認識されるエピトープを含有することを示した。

ウサギ抗ペプチド−ｐｒｅｓｚ１２０−１４５は、ｐｒｅＳ、配列をもつクロー ンｐＳ８およびｐｓ２１のハイブリッド−フラジェリンタンパク質と反応したが 、Ｓ配列をもつクローンのいずれのタンパク質とも反応しなかった。

ＨＢｓＡｇを有する組み換えフラジェリンのアセンブリーを、ハイブリッドのフ ラジェリンを発現するバクテリアの電子顕微鏡検査により研究した。移動性クロ ーンにおいて、野生型鞭毛のそれと区別できない形態をもつ鞭毛は大部分のバク テリアについて見られた。３つの非移動性（半固体の寒天上で広がる能力により 判定して）フラジェリン陽性クローンＳ１６、ｐＳ８およびｐｓ２１を除外して 、非常にわずかの鞭毛が観測された（示さない）。

第１１図は、分析した７つの組み換えプラスミドの特性を要約する。

充実（Ｓ配列について）またはハツチングを施した（ｐｒｅＳ、配列について） の矢印は、ｐＬｓ４０５のフラジェリン遺伝子（点描した矢印により表す）の向 きに関して、フラジェリン遺伝子のＥｃｏＲＶ部位の間に挿入された合成オリゴ ヌクレオチド配列の向きおよび数を表す。バクテリアの移動性を半固体を使用し て試験した。ウサギを個々のプラスミドで形質転換したサルモネラ・デュブリン （Ｓ、ｄｕｂｌ　１ｎ）ＳＬ５９２８で免疫化し、そして抗体の応答をＥＬＩＳ Ａにより各合成ペプチドを被覆抗原としてを使用して測定した。ｒｎｄＪは「実 施せず」を表す。期待されるように、ＳまたはｐｒｅＳ、解読配列をフラジェリ ン遺伝子（Ｓ１６、Ｓ２０、ｐＳ８、およびｐｓ２１）と同−向きにもつプラス ミドのみは、検出可能なＳまたはｐｒｅｓｚ決定基をもつハイブリッドフラジェ リンタンパク質の発現に導いた。検査した小さい数のプラスミドのうちで、フラ ジェリン遺伝子のそれと反対の向きで挿入をもつ４つのうちで３つ（Ｓ２０、Ｓ ６および５２７）は移動性であった；第４のもの、ｐＳ２、をもつバクテリアの リゼイトは、期待するように、逆向きでｐｒｅＳ、オリゴヌクレオチドは２つの 停止コドンを含むので、抗ｄ抗体と結合しなかった（第１０図）。同−向きに１ または２以上のインサートをもちそして反対向きでインサートをもたないもの（ Ｓ１６、ｐＳ８およびｐｓ２１）は半固体の培地中で広がらないが、とぼしい鞭 毛は電子顕微鏡により検出され、そして鞭毛およびＨＢｓＡｇの両者のエピトー プはイムノブロッティングにより検出された。

ハイブリッドタンパク質を発現するバクテリアの免疫原性ハイブリッドのフラジ ェリンタンパク質におけるＨＢｓＡｇエピトープの免疫原性を、まずハイブリッ ドのフラジェリンを発現する生きているサルモネラ・デュブリン（Ｓ、ｄｕｂｌ 　１ｎ）ＳＬ５９２８でウサギの筋肉内免疫化により試験した（第１２図）。第 １２図は、Ｓ１６またはｐＳ２１で形質転換した生きているサルモネラ・デュブ リン（Ｓ、ｄｕｂｌ　１ｎ）ＳＬ５９２８で筋肉内で免疫化したウサギの抗体の 応答を示す。抗フラジェリンは、野生型フラジェリン遺伝子を含有するプラスミ ドで形質転換した５Ｌ５９２８から精製した自然フラジェリンタンパク質を使用 して、ＥＬＩＳＡにより検出した抗体を示し、抗ペプチドは合成ペプチド５１２ ２−１３７およびｐｒｅｓｘ１２０　１４５を使用して（それぞれ、Ｓ１６およ びｐＳ２１を有する５Ｌ５９２８で免疫化した動物）ＥＬＩＳＡにより検出した 抗体を示し、そして抗ＨＢｓはＣＨＯ細胞中で産生じたＨＢｓＡｇを使用してＥ ＬＩ　ＳＡにより検出した抗体を示す。

抗フラジェリン抗体の高い力価（１０４以上）を、プラスミド８１６（Ｓ１２２ −１３７をエンコードする配列をもつ）で形質転換した５Ｌ５９２８を与えられ た２匹の動物において、そしてプラスミドｐｓ２１（ｐｒｅＳ、１２０−１４５ をエンコードする配列をもつ）で形質転換した５Ｌ５９２８を与えられた２匹の 動物において引き出された。抗ペプチド抗体（対応するプラスミドを有する５Ｌ ５９２８で免疫化した、それぞれのウサギにおける抗５１２２−１３７または抗 ｐ　ｒ　ｅ　８１１２０−１４５）のＥＬＩＳＡは、１０８および２Ｘ１０’の 間で変化した。

これらの抗血清は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（パスツール研 究所のＰ、トイライス博士により提供された腎臓）（ミチェル、Ｍ、に、ら、１ ９８５、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　３：５６１）中で産生された組み換えＨ ＢｓＡｇ　（血清型ａｙｗおよびｐｒｅＳ、配列を含有する）と反応し、４羽の ウサギのうちで２羽においてピーク力価はほぼ６４００であった。これらのウサ ギから免疫血清は、また、アボット・ラボラトリ−のアラサブ（Ａｕｓａｂ）ア ッセイにより検出されたＨＢｖ感染したチンパンジーから精製した、自然ＨＢｓ Ａｇと強く反応した（データは示されていない）。それぞれ、プラスミドＳ２０ およびｐＳ８で形質転換した５Ｌ５９２８で免疫化したウサギは、Ｓ１６および ｐＳ２１を含有する５Ｌ５９２８で免疫化した動物と同様に応答した（データは 示されていない）。ＨＢＶ配列を挿入しない親プラスミドｐＬＳ４０５を含有す る５Ｌ５９２８で免疫化した２羽のウサギにおいて、高いレベルの抗フラジェリ ン抗体が、期待されるように、検出され、そして抗Ｓまたは抗ｐｒｅＳ、ペプチ ドまたは抗ＨＢｓＡＧ抗体は検出されなかった。この減衰したサルモネラ・デュ ブリン（Ｓ、ｄｕｂｌｉｎ）突然変異（ＳＬ５９２８）を接種した動物は、敗血 症または他の病気の徴候を表さなかった。これらの結果が示すように、組み換え プラスミドを有するサルモネラ・デュブリン（Ｓ、ｄｕｂｌ　１ｎ）ＳＬ５９２ ８により発現されたハイブリッドの鞭毛は免疫原性であるＨＢｓＡｇエピトープ を含有し、そしてそれらにより引き出された抗体は誘導されたプラスミドまたは 組み換えＨＢｓＡｇと反応する。

合成ペプチド５１２２−１３７およびｐｒｅｓ２１２０−１４５は、ＣＨＯ細胞 中で産生されたＨＢｓＡｇの結合を、それぞれ、Ｓまたはｐｒｅｓ１エピトープ を発現する５Ｌ５９２８クローンで免疫化したウサギの免疫血清中の抗体により 特異的にブロッキングされたが、免疫前の血清中の抗体によりブロッキングされ ず、これらの動物における抗ＨＢＳはフラジェリン遺伝子中に導入された配列に よりエンコードされるエンコードされるエピトープにおいて指令されることが確 証された。

抗ＨＢｓの応答がハイブリッドの鞭毛を発現する、生きている減衰したサルモネ ラ・デュブリン（Ｓ、ｄｕｂｌ　１ｎ）ＳＬ５９２８の経口的投与から生ずるか どうかを決定するために、ウサギ、マウスおよびモルモットにおいて実験を実施 した。第１３図は、組み換えプラスミドＳ１６．５２０．ｐＳ８およびｐｓ２１ の各で、および変更しないフラジェリン遺伝子ｐＬｓ４０５で形質転換した５Ｌ ５９２８を経口的ワクチン接種した後、マウスにおける抗ペプチドおよび抗ＨＢ ｓの力価を示す。

それぞれの抗ペプチドおよび抗ＨＢｓの有意な力価はすべての動物において検出 されたが、力価はウサギの筋肉内免疫化後観測されるものより低かった。ｐＬｓ ４０５で形質転換されたバクテリア５Ｌ５９２８お経口的投与は、期待されるよ うに、検出可能な抗ＨＢｓまたは抗ペプチド抗体を生じた。ウサギおよびモルモ ットにおける抗ペプチドおよび抗ＨＢｓの力価（データは示されていない）は、 生きているサルモネラ・デュブリン（Ｓ、ｄｕｂｌ　１ｎ）ＳＬ５９２８の経口 的投与後、マウスにおいてそれら（第１３図）と同様（８０〜６４０）であった 。下痢または他の病気の症候は、サルモネラ・デュブリン（Ｓ、ｄｕｂｌ　１ｎ ）ＳＬ５９２８を経口的に与えた動物において観察されなかった。これらの実験 が示すように、ＨＢｓＡｇのエピトープに対する免疫応答はハイブリッドの鞭毛 を発現する生きているサルモネラ・デュブリン（Ｓ、ｄｕｂｌｉｎ）ＳＬ５９２ ８を使用する経口的ワクチン接種により引き出された。

材 この実施例において、ＨＢｓＡｇポリペプチドの抗原性領域をエンコードするヌ クレオチド配列をサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌ　ｌａ）フラジェリン遺伝子の 超可変領域中に挿入することができ、そして減衰したサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎ ｅｌ　Ｉａ）突然変異体中のこれらの遺伝子は発現することができることを、わ れわれは示した。ある生ずるハイブリッドのフラジェリンタンパク質は、半固体 培地中で広がる能力により試験したとき、機能的鞭毛にアセンブリングすること ができる；多分少数のバクテリアを除外して、他のハイブリッドのフラジェリン はフィラメントにアセンブリングされなかった。ハイブリッドの鞭毛は、イムノ ブロッティングにより検出される、フラジェリンおよびＨＢＳＡｇの両者のエピ トープを含有する。ＨＢｓＡｇのエピトープは、特異的合成ペプチドおよび血清 誘導されたＨＢｓＡｇに対するレイズされた抗血清で検出された。明らかなよう に、フラジェリン遺伝子中に挿入されたＨＢｓＡｇ配列の数および向きは、機能 的鞭毛にアセンブリングされるタンパク質の能力に影響を与えた。興味あること には、フラジェリン遺伝子と同一（および反対ではない）向きで挿入されたＨＢ ｓＡｇ配列は、バクテリアの移動性を減少し、同一大きさの自然フラジェリン配 列を置換する、特異的ウィルスのエンヴエローブタンパク質配列（Ｓ１２２−１ ３７）は、ハイブリッドのフラジェリンのコンフオメーシコンを有意に変更した 。サラニ、２７アミノ酸のインサート（ｐｒｅｓ＊１２０−１４５）で１６アミ ノ酸のフラジェリンの欠失を置換することは、フラジェリンの発現を防止しない が、その機能に影響を与えた。両者において、自然ＨＢｓＡｇに対する抗血清に より認識されたＨＢｓＡｇエピトープはハイブリッドのフラジェリンのタンパク 質中で検出された。生きているバクテリアにより発現されたこれらの配列は、免 疫原性であり、そして自然ＨＢｓＡｇを認識する抗体を引き出した。こうして、 フラジェリンは、ウィルス抗原がサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の生きて いる菌株中で免疫原性である形態で発現されることができる、バクテリアのタン パク質を発現する。

実施例３ ０タウイルスＶＰ７のエピトープを発現する組み換えフラジェリンの構主要な外 殻ポリペプチド、ＶＦ６、は、その還元されない形態で３８゜０００　（３８， ２Ｋ）およびその還元された形態で４１，９００　（４１゜９Ｋ）の見掛けの分 子量を有する糖タンパク質である。それはウィルスに対する中和性抗体を誘発す る原因となる主要な抗原であることが示された。この糖タンパク質は、また、細 胞へのウィルスの取り付けの原因となる。

ロタウィルスの異なる血清型は発生し、モしてＶＦ６により刺激される中和活性 により定められる。今日まで、７つの血清型が同定された：これらのうちの４つ （血清型１〜４）はヒトにおいて発見され、そして５つ（血清型３〜７）は動物 において発見された。これらの血清型の差の重要性は不明瞭である。なぜなら、 最近の研究は動物および人間の両者において、異なる血清型に属する菌株の間で 交差保護が起こり得るからである。血清型に対して独立であるＶＦ６の共通の抗 原決定基が存在するので、この交差保護は起こり得る。あるいは、血清型の特異 性の原因となるＶＦ６　（エピトープ）内の特異的アミノ酸配列は、交差保護の 原因であるある交差反応性抗体を誘発することができる。

３８．２／４１．２にの分子量を有するので、ｖ７はほぼ３２５アミノ酸から構 成されている。いくつかの異なるロタウィルスの分離物のＶＦ６からなるアミノ 酸の配列は、決定され、そしてアミノ酸の相同性の程度が７５〜８６％であるこ とを示す。ＶＦ６の配列を比較すると、アミノ酸配列が変化する、いくつかの領 域が明らかになる。

中和性モノクローナル抗体を使用するＶＦ６のエピトープのマツピングは、中和 性吸収ドメインを１４．０００　（１４Ｋ）の見掛けの分子量をもつ成分ペプチ ドに局在化した。この１４にのペプチドは、精製すると、マウスにおいて中和性 抗体の形成を刺激した。さらに、このペプチドの二次構造は抗原性の維持に必要 であることが観察された。ネブラス力仔ウシの下痢のウィルス（ＮＣＤＶウシの ロタウィルス）のアミノ酸配列は、０４８６ウシのロタウィルスと高い核酸の相 同性を示し、そして同一の血清型をもち、アミノ酸１６５−２９５にわたる領域 に対する１４にポリペプチド断片をマツピングするために使用した。対応するＮ ＣＤＶ糖タンパク質の親水性のプロットは、この区域内でいくつかの親水性領域 を同定した。

１つのこのような領域は、ウシのロタウィルスのＶＰＴ上のアミノ酸残基２７５ −２９５に相当した。対応するペプチドは、メリフィールドの固相ペプチド合成 法により合成した。ペプチドの特異的アミノ酸配列は、次の通りであった： このペプチドの純度は、薄層クロマトグラフィーおよび逆相高性能液体クロマト グラフィーを使用してアッセイした。急速原子衝突質量分析を使用して、分子量 を確証した。

合成ペプチドの反応性および特異性をいくつかの方法により決定した。

１）　抗ＶＰ７単−特異的血清を使用するＥＬＩＳＡは、Ｖ　Ｐ　７１：ツｌｌ 、Ｎてのペプチドの特異性を示す。

２）　中和性糖タンパク質（ＶＦ６）に対して特異的でありそしてウィルスの取 り付けをブロッキングする能力を有するモノクローナル抗体を使用するＥＬＩＳ Ａは、ＶＦ６の特異的領域またはエピトープのためのペプチドの特異性を示す。

３）　吸着ブロッキングアッセイは、ペプチド２７５−２９５は、アフリカン・ グリーン・モンキー（Ａｆｒｉｃａｎ　ｇｒｅｅｎ　ｍｏｎｋｅｙ）の細胞（Ｍ Ａ−１０４）に対する生体外の取り付けをブロッキングしたことを示す。

フラジェリンの構成におけるエピトープの検出ロタウィルスＶＰ７のエピトープ （ＡＡ２７５−２９２）をエンコードするハイブリッドんフラジェリンを構成す るために、次の配列をもつロタウィルスＶＰ７のアミノ酸２７５−２９２を表す 合成オリゴヌクレオチドを、フラジェリンの発現ベクターｐＰＸ１６５１中に挿 入した（参照、実施例１）ニ ア５ 八　ＰＱＴＥＲＭＭＲ ５’　−ＧＣＴ　ＣＣＴ　ＣＡＧ　ＡＣＴ　ＧＡＡ　ＣＧＴ　ＡＴＧ　ＡＴＧ　 ＣＧＴ３’　−ＣＧＡ　ＧＧＡ　ＧＴＣＴＧＡ　ＣＴＴ　ＧＣＡ　ＴＡＣＴＡＣ ＧＣ＾ＩＮｆＫＫＷＷＱＶ ＡＴＣＡＡＣＴＧＧ＾＾＾ＡＡＡ　ＴＧＧ　ＴＧＧ　ＣＡＧ　ＧＴＴ−３’ＴＡ Ｇ　ＴＴＧ　ＡＣＣＴＴＴ　ＴＴＴ　ＡＣＣＡＣＣＧＴＣＣＡＡ−５’形質転換 後、組み換え体をエピトープの挿入について、制限酵素のマツピング、ウェスタ ン・プロッティングおよびヌクレオチドの配列決定によりスクリーニングした。

生ずる組み換えプラスミド、ｐＲＯＴＡ９２−１９をサルモネラ・デュブリン（ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｄｕｂｌｉｎ）ＳＬ５９２７中に導入し、そして組み換 え鞭毛を前述したように調製した。

フラジェリンの競合実験 フラジェリンおよびロタウィルス２７５−２９２エピトープ（前述したようにＶ Ｐ７ウシロタウイルスの配列から決定した）をもつフラジェリンが、感染性ロタ ウィルスとＭＡ−１０４細胞のレセプターについて競合する能力を決定した。競 合研究について使用したウィルスの素材はウシのロタウィルスの菌株０４８６で あり、これは５０μｇのトリブシン／ｍｌで活性化した。この素材の適当な希釈 物は、最終の数のプラーク形成単位が３０〜５０であるように、競合実験におい て使用した。対照として使用した、素材のフラジェリン調製物の最初の濃度は３ ．５５ｍｇ／ｍｉであったが、２７５−２９２エピトープを含有するフラジェリ ンの素材の調製物は２．０ｍｇ／ｍｌの濃度であった。これらの調製物の適当な 希釈物は、最終フラジェリン濃度が１．２５μｇ１２５μｇ１５０μｇまたは１ ００μｇ／ｌＸｌ０’細胞であるようにしてつくった。

競合は、適当な量のロタウィルスの素材を適当な量のフラジェリン調製物と混合 することによって実施した。この混合物をＭＡ−１０４細胞の単層に３７℃にお いて１時間吸着した。吸着後、細胞の単層をイーグル最小必須培地（ＭＥＭ）で ３回洗浄し、そしてＭＥＭ中で希釈した１％のアガロースビーズでオーバーレイ した。細胞を３７℃において３日間インキュベーションし、次いでプラークの検 出のため、８０％のメタノール中で希釈した１％のクリスタルバイオレットで染 色した。

各アッセイは３回の反復試験において実施し、そしてフラジェリンまたは２７５ −２９２エピトープ調製物を含有するフラジェリンを、また、単独であるいは細 胞の単層上で示した濃度において使用して、細胞の単層止めペプチドそれら自体 の悪影響についてコントロールした。

表ＩＶ ウィルスとのフラジェリン調製物の競合のためのプラークの減少（％）調製物　 フラジェリンの量（μｇ）　減少％１フラジェリン　１．２５　０ フラジェリンを含有する　１．２５　５０２７５−２９２　２５．０　８５ ５０、０　９９ １　プラーク形成単位の数／アッセイはほぼ４０であった。各アッセイは３回の 反復実験において実施し、そしてこれらの平均を使用して最終産生物の減少を計 算した。

実施例４ ＣＲＭ１９７のエピトープを発現するハイブリッドの鞭毛を使用する細胞の免疫 応答の誘発 ある種の免疫原性エピトープの供給は、特異的細胞の免疫応答、例えば、細胞の 増殖、サイトカインの二次加工およびそれらのエピトープを発現する標的細胞の 特異的溶菌を生ずることができる。細胞の免疫応答を誘発する組み換え鞭毛の畦 力を実証するために、予測しかつ実験的に確証したＴ細胞のエピトープを、これ らの実験のためのモデルとして、３６６−３８３から構成されている（突然変異 のジフテリア毒素の分子）。

引き続いて、前以てＣＲＭ１９７タンパク質でプライミングしたＳＪＬからのリ ンパ節の細胞は、ＣＲＭ１９７タンパク質のアミノ酸３６６−３８３を表す精製 した合成ペプチドで刺激したとき、トリチウム化チミジンの組み込みにより生体 外で応答すること（胚発生）が示された（参照、米国特許出願第０７／１５０． ６８８号、１９８９年２月１日提出）、その教示を引用によってここに加える） 。

ＣＲＭ１９７アミノ酸３６６−３８３をエンコードする、次のオリゴヌクレオチ ドを合成した： ＮＬＦＱＶＶＩＩＮＳＹＮＲ ５′−＾＾ＣＣＴＧ　ＴＴＣＣＡＧ　ＧＴＴ　ＧＴＴ　ＣＡＣ＾＾ＣＴＣＴ　Ｔ ＡＴ＾＾ＣＣＧＴ３’−ＴＴＧ　ＧＡＣ＾＾Ｇ　ＧＴＣＣＡＡ　ＣＡＡＧＴＧ　 ＴＴＧ　ＡＧ＾＾ＴＡ　ＴＴＧ　ＧＣＡＰ　Ａ　Ｙ　Ｓ　Ｐ　Ｇ　（Ｓ） ＣＣＧ　ＧＣＴ　ＴＡＴ　ＴＣＴ　ＣＣＧ　Ｇ　−３’ＧＧＣＣＧＡ　ＡＴＡ　 ＡＧＡ　ＧＧＣＣＣＴ　ＡＧ−５’これらのオリゴヌクレオチドを、プラスミド ｐＰＸ１６４７を発現するフラジェリン中にサブクローニングした。このプラス ミドはちとのベクターｐＰＸ１６５１の修飾物であり、ここで単一のＢａｍ）（ Ｉ制限部位を切断により破壊し、クレノー酵素で処理して平滑末端をつくり、そ して再結合し、そしてその中に次のオリゴヌクレオチドを独特ＥｃｏＲＶ中に挿 入した： 下線を引いたコドンは、３つの別々の制限部位、それぞれ、ＥｃＯＲＶＳＣ］ａ ＩおよびＢａｍＨＩを表す。この挿入により、外来エピトープをエンコードする 配列の引き続（挿入を促進する、３つの独特制限酵素認識部位が導入される。プ ラスミドｐＰＸ１６４７をＥｃｏＲＶおよびＢａｍＨＩで消化し、そしてＣＲＭ １９７エビトープをエンコードするオリゴヌクレオチド断片の過剰量の存在下に 再結合した。形質転換後、組み換え体を分離し、そして制限酵素の地図、ウェス タン・プロッティングおよびヌクレオチドの配列決定により特性決定した。生ず る組み換えプラスミド、ｐＣＲＭ７Ｆ、サルモネラ・デュブリン（Ｓ、ｄｕｂｌ ｉｎ）ＳＬ５９２７中に導入し、そして組み換え鞭毛を実施例１に記載するよう にして調製した。

免疫化 ５０μｇの精製した組み換えフラジェリン調製物を等しい体積の完全フロインド アジュバント中で乳化し、そしてＳＪＬマウスの尾の基部に皮下投与した。対照 として、他の群のＳＪＬマウスを非組み換え鞭毛（１６５０）で同様な方法で免 疫化し、そして、ＣＲＭ１９７タンパク質を精製した（米国特許出願第０７／１ ５０，６８８号、１９８９年２月１日提出に記載するように）。

Ｔ細胞の活性化 ネズミＴ細胞の増殖 ネズミ径部および大動脈周囲のリンパ節を、完全フロインドアジュバント中の乳 化した（１：１、Ｖ　／　Ｖ　）抗原の最適投与量で前以て免疫化したマウスか ら、無菌的に収穫した。単一の細胞の懸濁液、１０％の胎児ウシ血清アルブミン を含有するＲＰＭＩ中で調製した。単一の洗浄後、細胞を血清を含まないＲＰＭ Ｉ中で再懸濁し、そして位相差顕微鏡でトリパンブルーの排除により計数した。

細胞の数を２％の正常のマウス血清を含有するＲＰＭＩ中で３Ｘ１０’細胞／ｍ ｌの濃度に調節した。種々の濃度を抗原、ミトゲンまたは他の対照物質を血清を 含まないＲＰＭＩ中で調製し、そして３回の反復試験で９６ウエルの平らな底の 組織培養物処理した平板中にアリコート（０，１ｍ１）を入れた。非理範囲の投 与量をすべての抗原について日常的に使用した。これらの平板に、領１ｍｌの細 胞懸濁液を添加した。こうして、達成した最終細胞濃度は１％のマウス血清中の ３Ｘ１０５細胞／細胞であった。細胞の添加後、培養物を加湿した５％のＣＯ！ のインキュベーターに３７℃においテ入した。３日間のインキュベーション後、 培養物を１８時間１μＣｉ／ウエルの［３Ｈ］−チミジンでパルシングし、そし て液体シンチレーションにより計数した。チミジンの組み込みを、反復実験の値 の平均−非刺激（パックグラウンド）値の平均として表す。

懸 第１４図は、ＳＪＬマウスのリンパ節細胞を組み換え鞭毛でブライミングしたと き、発生したデータを示す。ＳＪＬマウスを完全フロインドアジュバント中の５ ０μｇの精製したＣＲＭ１９７タンパク質（△）、ＣＲＭ１９７　３６６−３８ ８エピトープをエンコードする組み換え鞭毛（◆）、または精製した野生型（１ ６５０）鞭毛（■）で尾の基部において皮下免疫化した。プライミング後７日に 、リンパ節を除去し、そして単一細胞の懸濁液を得た。３Ｘ１０’のリンパ節細 胞（ＬＮＣ）を、ＣＲＭ１９７タンパク質のアミノ酸３６６−３８８をエンコー ドする精製した合成ペプチドの系統的５倍の希釈物とともにインキュベーション した。細胞を１％の正常のマウスの血清を含有するＲＰＭＩ　１６４０中で３７ ℃において３日間培養し、１．０μＣｉ／ウエルのトリチウム化チミジンで１６ 時間パルシングし、そして液体シンチレーシタンヵウンイングのために収穫した 。データは刺激指数（Ｓ　Ｉ）対刺激抗原の濃度として表し、ここでＳＩ＝刺激 抗原の存在下にウェル中で測定したＣｐｍ／刺激抗原の不存在下のウェル中のｃ ｐｍ、各データの点は３回の反復実験の培養物の平均および標準偏差を表す。

第１５図は、同一リンパ節の細胞を精製したＣＲＭ１９７タンパク質で刺激した ときのデータを示す。ＳＪＬマウスを完全フロインドアジュバント中の５０μｇ の精製したＣＲＭ１９７タンパク質（△）、ＣＲＭ１９７　３６６−３８８エピ トープをエンコードする組み換え鞭毛（◆）、または精製した野生型（１６５０ ）鞭毛１１で尾の基部において皮下免疫化した；第１４図において得られたデー タについて記載されているような条件下を使用した。

実施例５ 次の表■およびＶＩは、種々の宿主において組み換えフラジェリン融合タンパク 質を使用する、移動性の研究、ウェスタン・プロット分析および免疫化の研究か ら得られた結果を要約する。下に要約した試験の各々についての方法を、前の実 施例に記載されている。

表Ｖ エピトープ特定インサートをもつフラジェリン−プラスミドＬＢ５０００　宿主 −プラスミドの組み合わせブタンバク質　ド１ ａ　５Ｌ５９２８および５Ｌ３２６１は、それぞれ、サルモネラ・デュブリン（ Ｓ、ｄｕｂ　Ｉ　ｉ　ｎ）およびサルモネラ・チフィムリウム（Ｓ、ｔｙｐｈｉ ｍｕｒｉｕｍ）であり、両者はａｒｏＡであるが移動性であるので、鞭毛の産生 を引き起こすプラスミドの能力はそれらにおいて試験することができなかった。

ｂ、これらの組み合わせについて、抗ペプチド抗体は不動化することが示された 。

ｃ　１３７’−１２２’は、アミノ酸１２２〜１３７のためのＤＮＡ配列により 特定される、部位１２２〜１３７におけるアミノ酸ｄ　ＨＩＶ　ｇｐ１６０　ｒ ケネディー」ペプチドの配列：ＤＲＰＥＧＩＥＥＥＧ ５’　−ＧＡＴ　ＣＧＴ　ＣＣＧ　ＧＡＡ　ＧＧＴ　ＡＴＣＧＡＡ　ＧＡＡ　Ｇ ＡＡ　ＧＧＴ３’　−ＣＴＡ　ＧＣＡ　ＧＧＣＣＴＴ　ＣＣＡ　ＴＡＧ　ＣＴＴ 　ＣＴＴ　ＣＴＴ　ＣＣＡＧＥＲＤＲＤＲ３Ｇ ＧＧＴ　ＧＡＡ　ＣＧＴ　ＧＡＴ　ＣＧＴ　ＧＡＴ　ＣＧＴ　ＴＣＴ　ＧＧＴ− ３’ＣＣＡ　ＣＴＴ　ＧＣＡ　ＣＴＡ　ＧＣＡ　ＣＴＡ　ＧＣ＾＾ＧＡ　ＣＣＡ −５’Ｋｅｎｎｅｄｙ　ｅｔ　ａｔ、、１９８６．５ｃｉｅｎｃｅ　２３１　＋ １５５６−５９゜Ｒａｔｎｅｒｅｔａｌ、、１９８５．　Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎ ｄｏｎ）　３１３　：　２７７−２８４゜表Ｖ１ 免疫化の試験 経口的投与量は免疫応答を引き出すためには低く過ぎた。

微生物の受託 列挙したプラスミドを有する、次のバクテリアの菌株は、アメリカン・タイプ・ カルチャー・コレクション（ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕ ｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、米国マリイランド州０ツクビレ）に１９８８年５ 月４日に受託され、そして示した受け入れ番号を割り当てられた。

バクテリアの菌株、プラスミドおよび受け入れ番号は、次の通りであるサルモネ ラ・デニブリン（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｄｕｂｌｉｎ）ＳＬ１４３８；ｐＰＸ １６５０：サルモネラ・ムエンチェン（Ｓ、ｍｕｅｎｃ　ｈ　ｅ　ｎ）の全長の Ｈｌ−ｄフラジェリン構造遺伝子をエンコードする；　６７６８５　； サルモネラ・デュブリン（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｄｕｂｌｉｎ）ＳＬ１４３８ ；ｐＰＸ１６５３：Ｈｌ−ｄフラジェリンとの組み換えフラジェリンタンパク質 としてプラスモジウム・ファルシパルム（Ｐ　１　ａ　ｓｍ。

ｄｉｕｍ　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）サーカムスポロゾイトのタンパク質の配列の ４アミノ酸の反復構造遺伝子の４コピーをエンコードする；６７６８８　： サルモネラ・デュブリン（Ｓａｌｍｏｎｅｌ　ｌａ　ｄｕｂｌ　１ｎ）ＳＬ１４ ３８　：　ｐＰＸ１６６２　：Ｈｌ−ｄフラジェリンをもつプラスモジウム・ベ ルブヘイ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｂｅｒｇｈｅｉ）サーカムスボロゾイトの９ アミノ酸反復配列の４コピーをエンコードする；６７６８７； サルモネラ・デュブリン（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｄｕｂｌｉｎ）ＳＬ１４３８ ；ｐＬｓ４１１：Ｈｌ−ｄフラジェリンとの組み換えフラジェリンタンパク質と してコレラ毒素ＢサブユニットのＣＴＰ３ペプチドをエンコードする；６７６８ ６； サルモネラ・デュブリン（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｄｕｂｌｉｎ）ＳＬ５９２７ 　；プラスミドをもたない（サルモネラ・デュブリン（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　 ｄｕｂｌｉｎ）ＳＬ５９２７のＨ１位１中に挿入されたＴｎｌＯ）ランスボゾン をもつワクチン菌株）；６７９４５゜本発明は受託された微生物による範囲に限 定されない。なぜなら、受託された微生物は本発明の１つの面の単一の例示とし て意図し、そして機能的に同等の任意の微生物は本発明の範囲内に入るからであ る。事実、ここに示しそして記載したものに加えて本発明の種々の変更は前の記 載および添付図面から当業者とって明らかであろう。このような変更は添付され た範囲内に入ることを意図する。

また、ヌクレオチドについて与えたすべての塩基対の大きさは近似であり、そし て説明の目的で使用し、そして線図的に描写されたＤＮＡ配列は必ずしも一定の 割合で描かれていない。

ｎ℃フＣ１ 口石団εハ フｔｈｃｃａｃ丁＾丁Ｃａ＾ａＣａτ　Ｃ丁ａｔｅテ　ｆｅｅ　６３丁　Ｃτａ ｃｅフ　ＡＴＣＡＡｅ　１！フエエ虐　関Ｃ□ＧＡＡＡ儲Ｃ儲τＧｅａ　Ｇ＋講 関τ口ｙａ　ａｃａ＾茸引テ赫ｅ　１１ｇ真ｒテ八ＮへＫＯＬｔＯｋＭ 工Ｉ？　ＣＣＴ　ＴＴＣＡＣＣＧＣＣＡＡＩ：　ＡＴＣＡＡＡ　ＧＣＴ　ｔＴ＊ 　ＡＣＴ　ＧＡＧ　ＧＣｒ　ＴＣＣ１１ＳズＨＱＡＡＧＣｅＣｅＯｅｌ：ＡＡｅ ＣｉＡＡＡ丁ＣｋｋｃＡＡｅＡＡＣＣ？Ｉ：ＩＪＩ：ｅｅＴコフ１２フ４０？０ ＣｃＴａＡＡＣＴｌ：ＧＣＱＯｆｆＧＡＧＴＣ’ＴＣｅ？ＭｅＣｃＴＡＣＴＭｅ ！！！ＩＱＩＤＵＤｇ！ＯＡ！！？ ２１３ｆｅｅｃＡｏＴＣＴＩＪｅｅＴＴＧＡＣＴＣＴＡｒｃζＡＧＧｅｔＣＭｋ ＴＣＡｃｅＩｌ１０１ＬＮＥ！ＤＩＹｊＣＯ丁 ｓｓ２　ζ＾ＯｅａＴ　ＣＴ＊　ＡＡｅ　ＧＡＡ　ＡＴＣａＡＣＣＧＴ　ＧＴＡ 　ＴＣＣＧＧＴ　ｅＡｌ：　Ａ（Ｔ　）Ｉｌ＋「■又［２Ｂ 畠ｓｔ　Ｇ丁入　ＡｅＡ　ＭＡ　ＧＡＧ　ＧｃＴ　Ｈ？Ｔ　ｕ？　Ａｅ；　Ａｃ ｅ　ＡｅＡ　ａｔ丁　Ｇ＋：Ｃｃｃ＝　ｍ５７１！＠Ｉ　ＧＡＴ　ＡｅＡ　ｃｒ ＴＣｃＴ　ｔｃ丁ｕｅ　ｅｍ　ＣＣＴ　ＧＣＧ　ＧＴＡ　ＩＪＯＭｅ　ｅｌ：Ｔ 　１３２１Ｆ＝１ｍΣ２Ｂ　（ｃｅｎｔ） １３２フ　ｉフｅ　ＡＡｃ　ＴＣｅ　ＣＣＴ　ＡＴｅ　Ａｃｅ　ＡＡＣｅｖｅ　 Ｃｅｅ　ＡＡＴ　Ａｅｅ　ＧＴＡ　＾＾丁　１】６５１３ｇ１　ＡＡｅ　ｅｔｃ 　？ｅ？　ｔｅｌ　ＧＣＣＣＯＴ　ＡＣｅ　ＣＧＴ　Ａｔｅ　ＣＡＡ　ＣＡＴ　 ＴＣＣｃｋＣ１４０４眉工四（ｃｃｎｔｌ ばコ Ｆｉｇ、　６Ｂ ＳＬ１４３Ｂ　ＳＬ５９２７ −一一一÷−−−→Ｔｐ−６１６−＋　十　＋　−＋　−１→−←−）　Ｓ２０ 　＋　＋　◆　＋　−＋−−→←−チ　Ｓ６＋−１−−−−ｎｄｎｃ！、嬌嬌− −シ　５２７　＝　＋　−−−ｒｉｄ　ｎｄ−１１，畑−一一一う−ｐＳ２１− 　＋　＋　−十　−今ｐＳ２−−　−　−　−　ｎｄ　ｎｄ ３１べ　：　＋拳！拳　木本！奉 ＃＠ｔｓヒー）ｏ−＞：　ｐε５２１　５１６誼−公２°÷ド ＦＩＧＵＲＥ　Ｌ３ 増り！　Ｎ５６６−３８３ ．００１　−０１　．１　１　１０　１００　１０００状Ｒ湧濃度　ｕｇ／創 ＦｒＧＵＰ、Ｅ　１４ 憎廷　鰐　ＣＲＭ ｊｉ！Ｌｌ、ノ１＊　ｕｇ／ｒｒ′１１Ｆ工ＧＵＲＥ　１５ 補正書の写しく翻訳文）提出書　（特許法第１８４条の８）平成２年１１月５日 ＰＣＴ１０５８９１０１９３２ ２、発明の名称 組み換えフラジェリンのワクチン ３、特許出願人 住　所　アメリカ合衆国ニューヨーク州１４６２３０チェスター・スィート３０ ０・コーポレートウツズ３０名　称　プラクシス・バイオロジクス・インフーポ レーテツド（ほか１名） ４、代理人　〒１０７ 電話　５８５−２２５６ ７、補正の説明 補正書翻訳文第１頁は請求の範囲第１〜６項の差し替えでありま請求の範囲 １、フラジェリン融合タンパク質をエンコードするヌクレオチド配列からなり、 前記タンパク質はサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）またはシゲラ（Ｓｈｉｇ ｅｌｌａ）フラジェリン構造遺伝子の第１エピトープおよび異種有機体の少なく とも１つのエピトープからなる、組み換え遺伝子。

２、フラジェリン融合タンパク質は機能的鞭毛にアセンブリングすることができ る、上記第１項記載の組み換え遺伝子。

３、フラジェリン融合タンパク質は、それが発現されるバクテリア宿主の外部の 環境へ移送されることができる、上記第１項記載の組み換え遺伝子。

４、フラジェリン構造遺伝子は、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）Ｈｌまた はＨ２遺伝子からのもの＋ある、上記第１項記載の組み換え遺伝子。

５、フラジェリン構造遺伝子は、サルモネラ（Ｓａ　Ｉｍｏｎｅ　１１　ａ）Ｈ ｌ−ｄ遺伝子からのものである、上記第４項記載の組み換え遺伝子。

６、異種エピトープは融合タンパク質をを椎動物宿主中に導入するとき免疫原性 である、上記第１項記載の組み換え遺伝子。

２４、菌類は表１に記載されている菌類から成る群より選択される、上記第２１ 項記載の組み換え遺伝子。

２５、ＡＴＣＣに受託されそして受け入れ番号、それぞれ、６７６８８．６７６ ８７．６７６８６および６７９４５を割り当てられた、ｐｐＸ１６５３、ｐＰＸ １６６２、ｐＬＳ４１１およびｐＲＯＴＡ９２−１９から成る群より選択される プラスミドである、上記第１項記載の組み換え遺伝子。

２６、その中に挿入された異種ＤＮＡ配列を有するサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅ ｌｌａ）のフラジェリン構造遺伝子からなる、組み換え遺伝子。

２７、異種ＤＮＡ配列は、フラジェリン構造遺伝子内の、エンコードされたフラ ジェリンの機能に対して非必須である領域に、挿入されている、上記第２６項記 載の組み換え遺伝子。

２８、異種ＤＮＡ配列は、フラジェリン構造遺伝子の超可変（ｈｙｐｅｒｖａｒ ｉａｂｌｅ）領域中に挿入されている、上記第２６項記載の組み換え遺伝子。

２９、フラジェリン構造遺伝子はサルモネラ（Ｓａ　Ｉｍｏｎｅ　１１ａ）Ｈｌ またはＨ２遺伝子からのものである、上記第２６項記載の組み換え遺伝子。

３０、フラジェリン構造遺伝子は、サルモネラ（Ｓａ　Ｉｍｏｎｅ　ｌ　１ａ） Ｈｌ−ｄ遺伝子からのものである、上記第２９項記載の組み換え遺伝子。

４６、サルモネラ・チフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉＬサルモネラ・ チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｌ　ｔ　ｕｍ）　、サ ルモネラ−エンテリディチス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｅｎｔｅｒｉｄｉｔｉｓ） 、サルモネラ・ムエンチヱン（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｍｕｅｎｃｈｅｎ）、サ ルモネラ・バラチフィ（Ｓａｌｍ。

ｎｅｌｌａ　ｐａｒａｔｙｐｉ）Ａ、サルモネラ・バラチフィ（Ｓａｌｍｏｎｅ ｌ　Ｉａ　ｐａｒａｔｙｐｉ）Ｂ、およびサルモネラ・デュブリン（Ｓａｌｍｏ ｎｅｌｌａ　ｄｕｂｌｉｎ）から成る群より選択される、上記第４５項記載の組 み換え微生物。

４７、フラジェリン分子の第１エピトープおよび異種有機体の少なくとも１つの エピトープからなる、組み換えタンパク質。

４８、異種エピトープはタンパク質をを椎動物宿主中に導入するとき免疫原性で ある、上記第４７項記載の組み換えタンパク質。

４９、免疫原性エピトープは、性質がＴ細胞、Ｂ細胞または細胞である、免疫反 応性を引き出す、上記第４８項記載の組み換えタンパク質。

５０、その中に挿入された異種アミノ酸配列を有するサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎ ｅｌｌａ）のフラジェリンタンパク質からなる、組み換えタンパク質。

５１、異種アミノ酸配列は、フラジェリンタンパク質的の、フラジェリンタンパ ク質の機能に対して非必須である領域に、挿入されている、上記第５０項記載の 組み換えタンパク質。

５２、異種アミノ酸配列は、フラジェリンタンパク質の超可変領域中に挿入され ている、上記第５０項記載の組み換えタンパク質。

５３、異種アミノ酸配列は、タンパク質をを椎動物宿主中に導入したとき免疫原 性である有機体のエピトープである、上記第５０項記載の組み換えタンパク質。

５４、免疫原性エピトープは、Ｂ細胞、Ｔ細胞または細胞の応答またはそれらの 組み合わせを引き出す、上記第５３項記載の組み換えタンパク質。

５５、免疫原性を引き出すは、Ｔ細胞のを引き出す、Ｂ細胞のを引き出す、また はそれらの組み合わせである、上記第５３項記載の組み換えタンパク質。

５６、を椎動物の宿主に、生理学的許容されうる担体中の、その表面上で組み換 えサルモネラ（Ｓａ　Ｉｍｏｎｅ　ｌ　Ｉ　ａ）フラジェリン融合タンパク質を 発現するようにトランスフェクションされたバクテリアを投与ことからなり、前 記組み換えフラジェリン融合タンパク質は、フラジエエビトープからなり、異種 有機体のエピトープは融合タンパク質をを椎動物の宿主中に導入したとき免疫原 性である、生体内で免疫応答を引き出す方法。

５７、バクテリアは生きておりかつ感染性であるが、ワクチン接種すべき宿主に おいて有意な病気を引き起こすことができない、上記第５６項記載の方法。

５８、引き出される免疫応答は、粘膜、体液および細胞仲介された免疫の応答か ら選択される、上記第５７項記載の方法。

５９、フラジェリン構造遺伝子はサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）Ｈｌまた はＨ２遺伝子からのものである、上記第５６項記載の方法。

６０、異種有機体は、寄生体、バクテリア、ウィルスまたは菌類である、上記第 ５９項記載の方法。

６１、バクテリアは、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シゲラ（Ｓｈｉｇ ｅｌｌａ）または大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）である、上記第 ５６項記載の方法。

６２、を椎動物の宿主に生理学的許容されうる担体中のサルモネラ（Ｓａｌｍｏ ｎｅｌｌａ）のフラジェリン融合タンパク質を投与することからなり、前記タン パク質はその中に挿入された異種アミノ酸配列を有する、生体内で免疫応答を引 き出す方法。

６３、異種アミノ酸配列は、融合タンパク質の機能に対して非必須である領域に おいてタンパク質的に挿入される、上記第６２項記載の方法。

７０、免疫原は生理学的許容されうる担体と混合された、有効量の上記第４７項 記載のタンパク質からなる、サブユニットのワクチン配合物。

７１、免疫原は生理学的許容されうる担体と混合された、有効量の上記第５０項 記載のタンパク質からなる、サブユニットのワクチン配合物。

７２、工程： ａ）フラジェリン構造遺伝子の第１エピトープおよび異種有機体の少なくとも１ つのエピトープからなるサルモネラ（Ｓａ　Ｉｍｏｎｅ　Ｉ　ｌ　ａ）のフラジ ェリン融合タンパク質をエンコードするヌクレオチド配列からなる組み換え遺伝 子を構成し、 ｂ）組み換え遺伝子を適当な発現ベクター中に挿入し、Ｃ）前記ベクターを適当 な宿主中に挿入し、そしてｄ）前記ベクターを含有するバクテリア宿主を、組み 換え遺伝子の発現を誘発する条件下に、再産生させる、からなる、組み換えフラ ジェリン融合タンパク質を発現する方法。

７３、異種エピトープは、融合タンパク質をを椎動物の宿主中に導入するとき、 免疫原性である、上記第７２項記載の方法。

国際調査報告 ＋ｍ−−−＋　Ａ＃ｅ’ｌ”−１ｉｅ、　ｐｃＴ　／υＳ　８９／（１１９３２ 阜Ａｌ１−門−１１１１Ｔｈ内−−（＾−ｍ−−−ｍ、ＰＣＴ／υ５８９１０１ ９３２国際調査報告 ＵＳ　８９０１９３２

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、フラジェリン融合タンパク質をエンコードするヌクレオチド配列からなり、 前記タンパク質はフラジェリン構造遺伝子の第１エピトープおよび異種有機体の 少なくとも１つのエピトープからなる、組み換え遺伝子。 ２、フラジェリン融合タンパク質は機能的鞭毛にアセンブリングすることができ る、上記第１項記載の組み換え遺伝子。 ３、フラジェリン融合タンパク質は、それが発現されるバクテリア宿主の外部の 環境へ移送されることができる、上記第１項記載の組み換え遺伝子。 ４、フラジェリン構造遺伝子は、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）Ｈ１また はＨ２遺伝子からのものである、上記第１項記載の組み換え遺伝子。 ５、フラジェリン構造遺伝子は、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）Ｈ１−ｄ 遺伝子からのものである、上記第４項記載の組み換え遺伝子。 ６、異種エピトープは融合タンパク質を脊椎動物宿主中に導入するとき免疫原性 である、上記第１項記載の和み換え遺伝子。 ７、免疫原性エピトープは、性質がＴ細胞、Ｂ細胞または細胞であるものまたは それらの組み合わせである、免疫反応性を引き出す、上記第６項記載の組み換え 遺伝子。 ８、異種有機体は寄生体である、上記第１項記載の組み換え遺伝子。 ９、寄生体は表１に記載されている寄生体から成る群より選択される、上記第８ 項記載の組み換え遺伝子。 １０、プラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）は、プラスモジウム・ファルシ パルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、プラスモジウム・マ ラリアエ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｍａｌａｒｉａｅ）、ブラスモジウム・オバ レ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｏｖａｌｅ）、プラスモジウム・ビパックス（ＰＩ ａｓｍｏｄｉｕｍ　ｖｉｖａｘ）、プラスモジウム・シノモルギ（Ｐｌａｓｍｏ ｄｉｕｍ　ｃｙｎｏｍｏｌｇｉ）、プラスモジウム・ノウレシ（Ｐｌａｓｍｏｄ ｉｕｍ　ｋｎｏｗｌｅｓｉ）、プラスモジウム・ベルグヘイ（Ｐｌａｓｍｏｄｉ ｕｍ　ｂｅｒｇｈｅｉ）、およびプラスモジウム・ヨエリイ（Ｐｌａｓｍｏｄｉ ｕｍ　ｙｏｅｌｉｉ）から成る群より選択される、上記第９項記載の組み換え遺 伝子。 １１、異種エピトープのエピトープは、サーカムスポロゾイト（ｃｉｒｃｕｓｐ ｏｒｏｚｏｉｔｅ）のタンパク質抗原のそれである、上記第１０項記載の組み換 え遺伝子。 １２、異種有機体はバクテリアである、上記第１項記載の組み換え遺伝子。 １３、バクテリアは表Ｉに記載されているバクテリアから成る群より選択される 、上記第１２項記載の組み換え遺伝子。 １４、異種有機体のエピトープは連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）Ｍの タンパク質のそれである、上記第１３項記載の組み換え遺伝子。 １５、異種有機体のエピトープはコレラ（Ｃｈｏｌｅｒａ）毒素Ｂのサブユニッ トのそれである、上記第１４項記載の組み換え遺伝子。 １６、異種有機体はウイルスである、上記第１項記載の組み換え遺伝子。 １７、ウイルスは表Ｉに記載されているウイルスから成る群より選択される、上 記第１６項記載の組み換え遺伝子。 １８、異種有機体のエピトープは、Ｂ型肝炎の表面抗原またはＢ型肝炎ｐｒｅ表 面（ｐｒｅｓｕｒｆａｃｅ）抗原のそれである、上記第１７項記載の組み換え遺 伝子。 １９、異種有機体のエピトープは、ＨＩＶエンヴェロープのタンパク質のそれで ある、上記第１８項記載の組み換え遺伝子。 ２０、異種有機体のエピトープは、ロタウイルスＶＰ７のタンパク質のそれであ る、上記第１９項記載の組み換え遺伝子。 ２１、エピトープはＴ細胞のエピトープのそれである、上記第７項記載の組み換 え遺伝子。 ２２、Ｔ細胞のエピトープのエピトープは、ジフテリアＣＲＭ１９７毒素３６６ −３８３から誘導される、上記第２１項記載の組み換え遺伝子。 ２３、異種有機体は菌類である、上記第１項記載の和み換え遺伝子。 ２４、菌類は表Ｉに記載されている菌類から成る群より選択される、上記第２１ 項記載の組み換え遺伝子。 ２５、ＡＴＣＣに受託されそして受け入れ番号、それぞれ、６７６８８、６７６ ８７、６７６８６および６７９４５を割り当てられた、ｐＰＸ１６５３、ｐＰＸ １６６２、ｐＬＳ４１１およびｐＲＯＴＡ９２−１９から成る群より選択される プラスミドである、上記第１項記載の組み換え遺伝子。 ２６、その中に挿入された異種ＤＮＡ配列を有するフラジェリン構造遺伝子から なる、和み換え遺伝子。 ２７、異種ＤＮＡ配列は、フラジェリン構造遺伝子内の、エンコードされたフラ ジェリンの機能に対して非必須である領域に、挿入されている、上記第２６項記 載の和み換え遺伝子。 ２８、異種ＤＮＡ配列は、フラジェリン構造遺伝子の超可変（ｈｙｐｅｒｖａｒ ｉａｂｌｅ）領域中に挿入されている、上記第２６項記載の組み換え遺伝子。 ２９、フラジェリン構造遺伝子はサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）Ｈ１また はＨ２遺伝子からのものである、上記第２６項記載の組み換え遺伝子。 ３０、フラジェリン構造遺伝子は、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）Ｈ１− ｄ遺伝子からのものである、上記第２９項記載の組み換え遺伝子。 ３１、異種ＤＮＡ配列は、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）Ｈ１−ｄ遺伝子 の自然ＥｃｏＲＶ部位の間に挿入される、上記第３０項記載の組み換え遺伝子。 ３２、異種ＤＮＡ配列は、脊椎動物に対して病原性である有機体のエピトープを エンコードする、上記第２６項記載の組み換え遺伝子。 ３３、病原性有機体は、バクテリア、ウイルス、寄生体または菌類である、上記 第３２項記載の組み換え遺伝子。 ３４、上記第１項記載の組み換え遺伝子を含有する組み換え核酸のクローン。 ３５、ＡＴＣＣに受託されそして受け入れ番号、それぞれ、６７６８８、６７６ ８７、６７６８６および６７９４５を割り当てられた、ｐＰＸ１６５３、ｐＰＸ １６６２、ｐＬＳ４１１およびｐＲＯＴＡ９２−１９から成る群より選択される プラスミドを含有する、上記第３４項記載の組み換えクローン。 ３６、上記第２６項記載の組み換え遺伝子からなる、組み換え核酸のクローン。 ３７、上記第１項記載の組み換え核酸のクローンからなる、組み換え微生物。 ３８、バクテリアからなる、上記第３７項記載の組み換え微生物。 ３９、バクテリアは減衰されておりそして侵入性である、上記第３８項記載の組 み換え微生物。 ４０、バクテリアは、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シゲラ（Ｓｈｉｇ ｅｌｌａ）および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）である、上記第 ３９項記載の組み換え遺伝子。 ４１、サルモネラ・チフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉ）、サルモネラ ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、サルモ ネラ・エンテリディチス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｅｎｔｅｒｉｄｉｔｉｓ）、サ ルモネラ・ムエンチェン（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｍｕｅｎｃｈｅｎ）、サルモ ネラ・パラチフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｐａｒａｔｙｐｉ）Ａ、サルモネラ ・パラチフィ（Ｓａｌｍｏｎｃｌｌａ　ｐａｒａｔｙｐｉ）Ｂ、およびサルモネ ラ・デュブリン（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｄｕｂｌｉｎ）から成る群より選択さ れる、上記第４０項記載の組み換え微生物。 ４２、上記第２６項記載の組み換え遺伝子からなる、組み換え微生物。 ４３、バクテリアからなる、上記第４２項記載の組み換え微生物。 ４４、バクテリアは減衰されておりそして侵入性である、上記第４３項記載の組 み換え微生物。 ４５、バクテリアは、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シゲラ（Ｓｈｉｇ ｅｌｌａ）および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）である、上記第 ４４項記載の組み換え微生物。 ４６、サルモネラ・チフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉ）、サルモネラ ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、サルモ ネラ・エンテリディチス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｅｎｔｅｒｉｄｉｔｉｓ）、サ ルモネラ・ムエンチェン（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｍｕｅｎｃｈｅｎ）、サルモ ネラ・バラチフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｐａｒａｔｙｐｉ）Ａ、サルモネラ ・パラチフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｐａｒａｔｙｐｉ）Ｂ、およびサルモネ ラ・デュブリン（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｄｕｂｌｉｎ）から成る群より選択さ れる、上記第４５項記載の組み換え微生物。 ４７、フラジェリン分子の第１エピトープおよび異種有機体の少なくとも１つの エピトープからなる、組み換えタンパク質。 ４８、異種エピトープはタンパク質を脊椎動物宿主中に導入するとき免疫原性で ある、上記第４７項記載の組み換えタンパク質。 ４９、免疫原性エピトープは、性質がＴ細胞、Ｂ細胞または細胞である、免疫反 応性を引き出す、上記第４８項記載の組み換えタンパク質。 ５０、その中に挿入された異種アミノ酸配列を有するフラジェリンタンパク質か らなる、組み換えタンパク質。 ５１、異種アミノ酸配列は、フラジェリンタンパク質内の、フラジェリンタンパ ク質の機能に対して非必須である領域に、挿しされている、上記第５０項記載の 組み換えタンパク質。 ５２、異種アミノ酸配列は、フラジェリンタンパク質の超可変領域中に挿入され ている、上記第５０項記載の組み換えタンパク質。 ５３、異種アミノ酸配列は、タンパク質を脊椎動物宿主中に導入したとき免疫原 性である有機体のエピトープである、上記第５０項記載の組み換えタンパク質。 ５４、免疫原性エピトープは、Ｂ細胞、Ｔ細胞または細胞の応答またはそれらの 組み合わせを引き出す、上記第５３項記載の組み換えタンパク質。 ５５、免疫原性を引き出すは、Ｔ細胞のを引き出す、Ｂ細胞のを引き出す、また はそれらの組み合わせである、上記第５３項記載の組み換えタンパク質。 ５６、脊椎動物の宿主に、生理学的許容されうる担体中の、その表面上で組み換 えフラジェリン融合タンパク質を発現するようにトランスフェクションされたバ クテリアを投与ことからなり、前記組み換えフラジェリン融合タンパク質は、フ ラジェリン構造遺伝子の第１エピトープおよび異種有機体の少なくとも１つのエ ピトープからなり、異種有機体のエピトープは融合タンパク質を脊椎動物の宿主 中に導入したとき免疫原性である、生体内で免疫応答を引き出す方法。 ５７、バクテリアは生きておりかつ感染性であるが、ワクチン接種すべき宿主に おいて有意な病気を引き起こすことができない、上記第５６項記載の方法。 ５８、引き出される免疫応答は、粘膜、体液および細胞仲介された免疫の応答か ら選択される、上記第５７項記載の方法。 ５９、フラジェリン構造遺伝子はサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）Ｈ１また はＨ２遺伝子からのものである、上記第５６項記載の方法。 ６０、異種有機体は、寄生体、バクテリア、ウイルスまたは菌類である、上記第 ５９項記載の方法。 ６１、バクテリアは、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シゲラ（Ｓｈｉｇ ｅｌｌａ）または大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）である、上記第 ５６項記載の方法。 ６２、脊椎動物の宿主に生理学的許容されうる担体中のフラジエリン融合タンパ ク質を投与することからなり、前記タンパク質はその中に挿入された異種アミノ 酸配列を有する、生体内で免疫応答を引き出す方法。 ６３、異種アミノ酸配列は、融合タンパク質の機能に対して非必須である領域に おいてタンパク質内に挿入される、上記第６２項記載の方法。 ６４、引き出される免疫応答は、粘膜、体液および細胞仲介された免疫の応答か ら選択される、上記第６２項記載の方法。 ６５、融合タンパク質はサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）Ｈ１またはＨ２遺 伝子によりエンコードされる、上記第６１項記載の方法。 ６６、異種アミノ酸配列は、脊椎動物に対して病原性である有機体の免疫原性エ ピトープからなる、上記第６１項記載の方法。 ６７、病原性有機体は、寄生体、バクテリア、ウイルスまたは菌類である、上記 第６６項記載の方法。 ６８、上記第１項記載の組み換え遺伝子を収容するバクテリアからなり、ここで バクテリアは感染性であるが、ワクチン接種すべき宿主中で有意な病気を引き起 こすことができない、ワクチン配合物。 ６９、上記第２４項記載の組み換え遺伝子を収容するバクテリアからなり、ここ でバクテリアは生きており、減衰されており、そして侵入性であるが、ワクチン 接種すべき宿主中で有意な病気を引き起こすことができない、ワクチン配合物。 ７０、免疫原は生理学的許容されうる担体と混合された、有効量の上記第４７項 記載のタンパク質からなる、サブユニットのワクチン配合物。 ７１、免疫原は生理学的許容されうる担体と混合された、有効量の上記第５０項 記載のタンパク質からなる、サブユニットのワクチン配合物。 ７２、工程： ａ）フラジェリン構造遺伝子の第１エピトープおよび異種有機体の少なくとも１ つのエピトープからなるフラジェリン融合タンパク質をエンコードするヌクレオ チド配列からなる組み換え遺伝子を構成し、ｂ）組み換え遺伝子を過当な発現ベ クター中に挿入し、ｃ）前記ベクターを適当な宿主中に挿入し、そしてｄ）前記 ベクターを含有するバクテリア宿主を、組み換え遺伝子の発現を誘発する条件下 に、再産生させる、からなる、組み換えフラジェリン融合タンパク質を発現する 方法。 ７３、異種エピトープは、融合タンパク質を脊椎動物の宿主中に導入するとき、 免疫原性である、上記第７２項記載の方法。 ７４、異種エピトープをフラジェリン構造遺伝子内に挿入する、上記第７２項記 載の方法。 ７５、異種エピトープを、フラジェリン構造遺伝子内に、エンコードされたフラ ジェリンの機能に対して非必須である領域に挿入する、上記第７７項記載の方法 。