JPH04502407A - 三重鎖の核酸とその利用法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称　二重鎖の核酸とその利用法本発明は１９８８年１２月２０日受理さ れた併出願中の米国出願第２８７、３５９号の継続出願である。

本発明は国立保健研究所（ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏ ｆＨｅａｌｔｈ）からの資金援助あるいは奨励金によって一部が行われた。

ｌ１り立互 この発明は二重鎖のＤＮＡの主要な分子溝に結合して、並行した直鎖的な二重鎖 体を形成する合成オリゴヌクレオチドを作るための方法に関している。それはま た、ＤＮＡ二重鎖のプリン鎖に結合する合成オリゴヌクレオチドにも関している 。

さらにこれはＤＮＡ二重鎖に結合して並行直鎖的な三重鎖体を作ることのできる 合成オリゴヌクレオチドをとり込むことによって細胞の増殖を制御、抑制する方 法にに関している。

ｌ旦り宜見 近年ポリヌクレオチドのポリｄＴがポリｄＡ−ポリｄＴ二重鎮体に結合し、並列 直鎖的な二重鎖体を作ることが知られている（Ａｒｎｏｔｔ、　Ｓ、　＆　Ｓｅ ｌｓｉｎｇ、　Ｅ、　（１９７４年）　ＪｏＭｏｌ、Ｂｉｏｌ、　８８゜５０９ ）。その二重鎖体の構造はＸ線回折分析で推定され、並列の直鎖的な二重鎖体で あることが示されている（ＡｒｎＯｔｔ。

Ｓ、＆　Ｓｅｌｓｉｎｇ、　Ｅ、　（１９７４年）　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ 、８８．５０９）　、ポリｄＴ鎖は二重鎖をしたポリｄＡに並行した向きで結合 している。

ポリｄＴ−ポリｄＡ−ポリｄＴの三重鎖体は二重鎖のＡとポリｄＴの第三の鎖の 間でのＴ−Ａホッグスタイン塩基対形成によって安定化している。その相互作用 は必ずリガンドと呼ばれている第三の鎖を二重鎖の主な溝の中に置く形をとって いる。主な溝にある結合部位は標的配列とも言われている。

同様にポリｄＧａは二重鎖形成によって二重鎖のポリｄＧａ−ポリｄＣに多分二 重鎖の主なヘリックス構造の溝にＧ−Ｇ対を作るようにして結合するだろう（Ｒ ｉｌａｙ　Ｍ、、　Ｍａｉｌｉｎｇ　Ｂ、　＆　ＣｈａｍｂｅｒｌｉｎＭ、　（ １９６６年）　Ｊ、　Ｍｏｌ、　Ｂｉｏｌ、　２０．３５９）　、この結合パタ ーンはｔＲＮＡ結晶体にみられるＧ−Ｇ−Ｃ三塩基体形成のパターンと似ている ように思われる（Ｃａｎｔｏｒ　Ｃ，＆　ＳｃｈｉＩＩＩｍｅｌ　Ｐ、、　（１ ９８０年）Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ第１巻、　＋９２−１ ９５頁）。

ポリｄＡ−ポリｄＡ−ポリｄＴとポリｄＣ−ポリｄＧａ−ポリｄＣの形の三重体 もみつかっている（Ｂｒｏｉｔｍｍａｎ　Ｓ、、　１ｍ　Ｄ、Ｄ、＆　Ｆｒｅｓ ｃｏ　Ｊ。

Ｒｏ（１９８７年）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８４．５ １２０及びＬｅｃ　Ｊ、　Ｓ、、　Ｊｏｈｎｓｏｎ　Ｄ、Ａ、＆　Ｍｏｒｇａｎ 　Ａ、　Ｒ，（１９７９年）　Ｎｕｃｌ。

Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、６−、３０７３）　、さらにポリｄＣＴ−ポリｄＧａＡ− ポリｄＣＴのような混合した三重体もみつけられている（Ｐａｒｓｅｕｔｈ　Ｄ 。

等（１９８８年）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８５． １８４９及びＭｏ５ｅｒ　ＨｏＥ、＆　Ｄｅｒｖａｎ　Ｐ、Ｂ、　（１９８７年 ）　５ｃｉｅｎｃｅ　２３８．６４５）。

これらの複合体は不安定かまたは酸性ｐＨでのみしか起こらないことが証されて いる。

並行した方向に結合する並行デオキシリボオリゴ核酸異性体が合成されている（ Ｍｏｓｅｒ　Ｈ，Ｅ、　＆　Ｄｅｒｖａｎ　Ｐ、　Ｅ、　（１９８７年）Ｓｃｉ ｅｎｃｅ　２３８．６４５−６５０及びＲａｊａｇｏｐｏｌ　Ｐ、　＆　Ｆｅｉ ｇｏｎ　Ｊ、（１９８９年）Ｎａｔｕｒｅ、　影坦、　６３７−６４０）。結合 部位が対称で並行でも逆並行でも三重鎖体を形成できるような例（オリゴｄＡ− オリゴｄＴ二重鎖標的に結合したオリゴｃｌＴ）ではポリｄＴ−ポリｄＡ−ポリ ｄＴ三重体のＸ線回析分析から推定されるように生ずる三重鎖体は並行の向きに 作られた（Ｍｏｓｅｒ　Ｈ，Ｅ、　＆　Ｄｅｒｖａｎ　Ｐ、　Ｅ、（１９８７年 ）　５ｃｉｅｎｃｅ　２３８．６４５−６５０及びＰｒａｓｅｕｔｈ　Ｄ、等（ １９８８年）ＰＮＡＳ　８５．１３４９−１３５３）　。

非天然型のα−アノマーのヌクレオチドサブユニットを含むオリゴヌクレオチド を用いた研究によって逆並行三重鎖体ができることが示されている（Ｐｒａｓｅ ｕｔｈ　Ｄｏ等（１９８８年）ＰＮＡＳ並、　１３４９−１３５３）　、　Ｌか し、ＤＮＡのα型のデオキシリボヌクレオチド単位は本質的に天然のβサブユニ ットに対して逆となっているので、α−オリゴヌクレオチドによって作られる逆 並行の三重鎖体は必ず天然のβ−オリゴヌクレオチドによる並行三重錯体形成に みられるものに従う。例えば、α−デオキシリボオリゴヌクレオチドはβ−ＤＮ Ａ異性体の相補鎖をもつ逆並行のワトソン・クリックへリツクスよりもむしろ並 行性の形となる。

ＤＮＡのオリゴヌクレオチドは遺伝子調節領域において二重鎖のＤＮＡ標的に二 重鎖を作ることによって結合でき、それによって転写の開始が抑えられることが 示されている（Ｃｏｏｎｅｙ間１等（１９８８年）　５ｃｉｅｎｃｅ　２４１． ４５６）　、このことは二重鎖のＤＮＡ標的が簡単なくり返し配列でないために 重要な観察であった・ 本発明はいかなる二重鎖ＤＮＡ標的にかたく、特異的に結合する合成オリゴヌク レオチドを考案する新しい方法を提供している。標的が調節蛋白として利用され るとき、この方法は個々の遺伝子の発現を選択的に操作する薬剤分子として利用 できる合成オリゴヌクレオチドを考案することができる。

且豆辺１笠 本発明の目的は二重鎖のＤＮＡに結合する合成オリゴヌクレオチドを考案する方 法である。

本発明のもう一つの目的はＤＮＡと三重鎖体を形成する合成オリゴヌクレオチド を作る方法である。

本発明のさらに付加的な目的は二重鎖体のＤＮＡの標的配列と並行直鎖的な三重 鎖体を作る合成オリゴヌクレオチドである。

本発明のもう一つの目的は細胞の成育を抑制する合成オリゴヌクレオチドを提供 することである。

本発明の別の目的は病原菌の生育を抑制する合成オリゴヌクレオチドを提供する ことである。

本発明のさらにもう一つの目的は老化や血液凝固の治療に上皮組織の構造的蛋白 含量を変える方法である。

本発明のもう一つの目的はＤＮＡ配列を永久に変えることによって遺伝子の発現 を阻害する方法である。

かくして、以上の目的に付随して、本発明の目的に従って二重鎖のＤＮＡの標的 配列に結合して主な溝に結合することによる並行直鎖的三重鎖体を形成する合成 のオリゴヌクレオチドを作る以下に示すようなステップを含む方法を提供してい る；すなわち、少くとも６５％程度のプリン塩基あるいは少くとも６５％のピリ ミジン塩基のいずれかをもつ約２０ヌクレオチドより大きなヌクレオチド標的配 列を染色体の二重鎖ＤＮＡの中から同定し、その同定された標的配列に相補的な 合成オリゴヌクレオチドを合成し、そのＤＮＡ二重鎖にある相補部分がＧＣ塩基 であればＧを、ＡＴ塩基対ならばＴをもつような合成オリゴヌクレオチドとする 。特定の実施例では合成のオリゴヌクレオチドは５′から３′に向いており、少 くとも６５％程度のプリン鎖に並行して結合する。あるいは３′から５′に向け て少くとも６５％のプリン鎖に逆並行に結合するオリゴヌクレオチドの中から選 ばれる。

本発明のもう一つの目的はある標的配列が少くとも６５％ぐらいのプリン塩基ま たはピリミジン塩基のとき二重鎖ＤＮＡ中のその標的配列をもった並行直鎖的二 重鎖を形成する合成オリゴヌクレオチドでその配列が少くとも２０ヌクレオチド 程度はあるものである。そのＧ及びＴを含みその二重鎖ＤＮＡ中の相補的部位が ＧＣ塩基対をもつ場合にＧが利用され、また二重鎖のＤＮＡ中の相補部位がＡＴ 塩基対のときにＴが利用される。

そして、その配列は５′から３′へ向いていて二重鎖ＤＮＡ標的配列の少くとも ６５％程度のプリン鎖に並行に結合するか、３′から５′へ向いていて二重鎖Ｄ ＮＡの標的配列中の少くとも約６５％のプリン鎖に逆並行に結合するようなグル ープから選択される。

好ましい実施例において、合成ヌクレオチドはＸ、Ｉ及びＸと１のハロゲン誘導 体で置換された少くとも一つのＴをもつことができる。さらに少くとも一つのＧ がＧのハロゲン化誘導体に置換されつる。

別の実施例では合成オリゴヌクレオチドでの置換が含まれている。例えば、塩基 がその２′−フラノース位を荷電のないバルキーな基で置換されうるし、合成ヌ クレオチドの背骨が細胞内のヌクレアーゼでは簡単に分解されないホスホジエス テル類縁体でありうる。さらに、合成オリゴヌクレオチドの３′または５′末端 にリンカ−をつけることができる。このリンカ−はオリゴヌクレオチドに修飾す る基をつけることのできる方法を提供する。修飾基はインターカレータ、溝に結 合する分子、陽荷電のアミン、陽荷電のポリペプチド等である。

本発明の別の目的は、以下のステップを含む細胞増殖を阻害する方法である。す なわち、合成オリゴヌクレオチドを十分な量細胞へとり込ませる量を加え、標的 となる配列としてＲＮＡ転写起点に隣接するＤＮＡ断片の中に位置しているよう な配列に結合させる。望ましい実施例として、この方法は合成オリゴヌクレオチ ドをウィルスのＬＴＲ領域に結合することによって、旧Ｖ−１ウィルスを抑制す るのに使われている。

本発明のもう一つの目的は合成オリゴヌクレオチドを十分な量細胞にとり込ませ るように加え、コラーゲン遺伝子の標的配列に結合させることによって上皮組織 の構成的蛋白量の相対量を変化させる方法である。

その他の目的や特徴、利点等は添付した図面とともにこの開示の目的のために以 下に示す発明の実施例の記載から明らかである。

１１０医級岸ｊ」１更 第１Ａ図は並行直鎖的な三重鎖体の表面の形態を示している。二重鎖のＤＮＡの 標的部位の構造をコンピュータで表現させたもので正規のＢ型とＡ型のへリック ス構造を示している。

オリゴヌクレオチドリガンドの結合のときは標的はＢからＡ型に遷移し、主要へ リックス溝（Ｍ）の深さを増加させる。

並行直鎖の二重鎖では、オリゴヌクレオチドはＡ型へリックスを包込み主要溝を 占拠する。溝への結合はリボン様の描写として結合したオリゴヌクレオチドを示 すことによって強調されている。

第１Ｂ図は並行直鎖状の二重鎖体の鎖の向きを示している。

オリゴヌクレオチドリガンドは二重鎖標的に結合し、指向している鎖（プリンに より富んだ＃）に対して並行した方向で結合する。

第２図は二重鎖の標的に水素結合しているオリゴヌクレオチドのパターンを示し ている。ＧＣ部位へのＧ及びＡＴ部位のＴである。第２Ａ図は二重鎖標的に向い た鎖の中の相応する部位でリガンドのＧとＧＣ塩基対でのＧの間の水素結合のと りうべきパターンをコンピュータでシミュレートしたものである。

第２Ｂ図は二重鎖の標的に指向した鎖の中の相応する部位でのＡＴ塩基対のＡに 結合しているＴの相対的なシミュレーションである。Ｔ−ＡＴ結合は古典的な「 ホッグステーン塩基対形成」と同一であるが、一方、Ｇ−ＧＣ結合はそれからの グアニンのカウンターパートであり、Ｎ３の０６との結合を含んでいる。

黒くぬったくさび印は二重鎖体を通した断面がそれに相当する断面にくっついて いる場所を示している。白いくさび印は、二重鎖体を通る断面が下部の相応する 断面とくっついている場所を示している。みられるように、二つの結合スキーム で示される結合性は殆ど同じである。ＧとＧＣあるいはＴとＡＴ（矢印）の間の 結合形成の起こりやすいパターンは中性ｐＨ域での塩基−塩基結合のパターンと 似てはいない（Ｃは、酸性域ではＧに似せることができる）。

２０図と２Ｄ図は標的二重鎖の指向性鎖から交叉してＧＣ塩基対のＧまたはＡＴ 対のＡが起こるとき生じる相応する結合パターンである。その例ではオリゴヌク レオチドの配列選択性は同じであるが（すなわち、ＧＣ対のＧ、ＡＴ対のＴ）、 Ｇの結合Ｎ３がＮ９におこり、Ｔは「逆ホッグステーンノ様式で結合する。それ によって相方は結合したリガンドと標的の指向性鎖と並行した方向を保っている 。

第３図は、二重鎖の標的に水素結合しているオリゴヌクレオチドすなわちＡＴ部 位に結合しているキサンチンのパターンを改良する方法を示している。第３図で のコンピュータで描いたシミュレーションはＴに対してキサンチン（Ｘ）に置換 した効果が示されている以外は第２図と同じである。みられるように、「ホッグ ステーン」結合（３Ａと３Ｂ）と［逆ホッグステーン」結合（３Ｃと３Ｄ）の両 方においてＸとＴはＡＴの塩基対に当量的に結合する。二つの間の主な差はＸが 塩基の大きさ形の点で、またオリゴヌクレオチド結合部位の中でのホスホジエス テル部分の方向性に関して、オリゴヌクレオチドリガンドの脇にあるＧ残基と殆 ど同一であることである。モデリングによってそのようなオリゴヌクレオチドの つながりの高まりがＴをＸに置換したオリゴヌクレオチド全ての結合親和性と部 位特異性を高めるということを推定させている。

第４図は並行直鎖の二重鎖形成に適するように変えられたホスホジエステル結合 の一群を示している。オリゴヌクレオチドの骨格の中の燐酸基の類似のいくつか が示されている。

それぞれの例で標準のコンピュータ支援の固相法を少し修正した方法で作られる 例を出している。Ａ−Ｃの例はチオフォスフェート結合であり、Ｅはメチルフォ スフォネート、Ｆはフオスフオアミダイド、Ｇはフォスフオトリエステルである 。

第５図は５′アミノ結合で結合したハイブリッドオリゴヌクレオチドの形成を示 している。この例ではヘキシルアミン結合が示されている。この結合はＤＮＡ塩 基をポリメライズするために使われる同じホスホアミダイド化学を使うことによ ってオリゴヌクレオチドの最後の残基として付けることができる。リンカ−で修 飾したオリゴヌクレオチドを精製した後−級アルキルアミンと選択的に反応する 基が加えられる。これらの基はエオシンのイソチオシアネート誘導体（ＥＩＴＣ ）または９−アミノアクリジン（ＡＩＴ）　、あるいはその他多くの小分子化合 物を含んでいる。本質的に同一の化学が５′末端にチオール基を付けるために利 用される。

第６図はオリゴヌクレオチドをもったＤＮＡの二重鎖体によ６ＨＩＶ−１（７） ｍＲＮＡ（７）量依存の阻害を示しテイル。Ｌ７９３７／）ＩＩＶ−１細胞（Ａ ＴＣＣＣＲＬ　１５９３．アメリカ標準株集積所（メリーランド州ロックビル市 ））がＨＩＶ〜１のＨＴＬＶ−ＩＩＩ　Ｂプロトタイプ株で感染され、そして９ ０％以上の細胞が生存していて旧Ｖ−１のＬＴＲに対する０Ｓ−ラベルしたプロ ーブ（ＮＥＰ２００．プラウエア州つィルミントン市のＤｕＰｏｎｔ社製）でｉ ｎ　５ｉｔｕハイブリダイゼーシヨンによって示されるようにＨＩＶ−１ｍＲＮ Ａを含むような条件で培養し、各オリゴヌクレオチドと０．２，６．ｔｏ。

２０μＭ濃度でインキュベートした。オリゴヌクレオチドをインキュベートのは じめと、２時間後に培養上清に加えた。培養４時間後に細胞を集め、ＲＮＡｚｏ Ｑ　（Ｃｉｎｎａ／Ｂｉｏｔｅｃｘ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＩｎｔｅｒｎａ ｔｉｏｎａｌ、　Ｉｎｃ、、テキサス州フレンズウッド市）を用いて全細胞ＲＮ Ａを集める前にＰＢＳで洗滌した。２倍ずつ段階希釈を各ＲＮＡ試料で行い（２ ，５μｇ　ＲＮＡ量をスタートとして）、そしてスロットプロット装置（Ｂｉｏ ｒａｄ）を使って同じ量を二つのナイロン膜にアプライした。一つのプロットは プラスミドｐＡＲＶ−７／　２を含むＨＩＶ−１からの放射性ラベルしたＥｃｏ Ｒ１−Ｈｈａ　１　ｅｎｖ断片で検索したが、一方はβ−アクチンに対する放射 性ラベルしたｃＤＮＡで検定した。得られたオートラジオグラフをデンシトメー ターで分析した。縦軸に表わした濃度単位は（ｅｎｖ−プローブ濃度）／（アク チン−プローブ濃度）の比を表わしている。△はＨＩＶ２９ｐａｒを、口は旧Ｖ ３１アンチを、口はランダム旧Ｖ　２９アイソマーを表わしている。

第７図は旧Ｖを感染したＨ９Ｔ細胞へのオリゴヌクレオチドの効果の持続を示し ている。ＨＩＶ−１感染のＵ９３７細胞を旧■３１アンチを最後に加えてから１ ２から７２時間まで培養した。オリゴヌクレオチドを培養のはじめと２時間後に 加え、その後は１０μｍの最終濃度を維持した。細胞をその後示された時点で集 めた。細胞の全ＲＮＡを回収し、二枚のナイロン膜にスロットプロット装置を用 いて段階希釈してアプライした。一つのレプリカは旧Ｖ−１ｅｎｖ　ｃ　ＤＮＡ で検索し、他はβ〜アクチンのｃ　ＤＮＡで行った。濃度単位（縦軸）はｅｎｖ 対β−アクチンのデンシトメーターの読みの比で表わしている。口はＨＩＶ３１ アンチを表わし、Ｏはコントロールを示している。

第８図は感染したＨ９細胞におけるＨＴＶ２９ｐａｒによるウィルスのｍＲＮＡ の阻害を示している。濃度計による分析によって、特定のウィルス性の発現が減 少していることが示されている。

ＨＴＬＶＩＩＩ　Ｂで感染したＨ９細胞を２時間毎にオリゴマー（５μＭ）で処 理した。４時間目と１２時間目に細胞を採取し、ＰＢＳで洗って細胞の全ＲＮＡ を抽出した。斜線の棒はオリゴマーで処理したものを表わし、斜線のない棒はコ ントロールを表わしている。

図面は必ずしも正しい尺度になっていない。発明の特徴が尺度において誇張され ていたり、明快簡潔のために模式的な形で示されている。

１１じｄ１遷 ここに開示された発明に対して、この発明の目的と精神からはなれることなく、 いろいろな置き換えや修正ができることはこの技術的分野に精通する者にとって 容易に明白である。

ここに使われる合成オリゴヌクレオチドの言葉は２つ以上のデオキシリボヌクレ オチドあるいはりボヌクレオチド、望ましくは１０以上のものとして定義される 。その正確な大きさはその特異性や結合の親和性を含む多くの要因に左右される 。

ここで塩基に関するとき、その言葉はデオキシリボ核酸とリボ核酸の相方を含ん でいる。以下の略号が使われれる。

ｒＡＪはそのデオキシリボース誘導体と同じくアデニンを示し、ＩＴＪはそのデ オキシリボース誘導体と同様チミンを示し、「Ｇ」はそのデオキシリボース誘導 体とともにグアニンを示し、「Ｃ」はそのデオキシリボース誘導体とともにシト シンを示し、ｒＸＪはそのデオキシリボース誘導体とともにキサンチンについて であり、ｒＩＪはイソシンに関する。

主要な溝とは糖−リン酸基の骨格が塩基よりも軸からさらに拡がるので作られる ＤＮＡへリツクスの外表面に沿ってできる溝の一つをいう。主要な溝は特異的な りＮＡ配列に対して制御分子を結合させるのに重要である。

並行直鎖的な二重鎖を形成することによってＤＮＡ標的に特異的に結合するＤＮ ＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドを考案するために一連の方法ができている。

本発明の一実施例では、主要な溝に結合することによって並行直鎖状の二重鎖を 形成する二重鎖ＤＮＡにある標的配列に結合する合成オリゴヌクレオチドを作る 方法であるが、その方法は染色体の二重鎖ＤＮＡを探して２０ヌクレオチドより も大きなヌクレオチドの標的配列を同定し、その標的配列が少くとも約６５％の プリン塩基または少くとも約６５％のピリミジン塩基のいずれかをもち、そして 上記の同定した標的配列に相補的な合成オリゴヌクレオチドを合成して、その合 成オリゴヌクレオチドがＤＮＡ二重鎖の相補部位にＧＣ塩基対があればＧを含み 、そのＤＮＡ二重鎖の相補部位がＡＴ塩基対をもてばＴを含んでいるようなステ ップを包含している方法である。特定の実施例では合成オリゴヌクレオチドが３ ′から５′へ向いたオリゴヌクレオチドで少くとも６５％のプリン鎖に逆並行に 結合するか５′から３′に向いたオリゴヌクレオチドで少くとも６５％プリン鎖 に並行して結合するオリゴヌクレオチドから成る群から選択される。得られるオ リゴヌクレオチドは固相のオリゴヌクレオチド合成標準法によってダラム単位の 量合成できる。

部位特異的のオリゴヌクレオチド法は次の３つの部分に分けられる。

■　オリゴヌクレオチドの塩基配列のデザイン■　二重鎖の標的の解析 ■　オリゴヌクレオチドの二次的な化学修飾■　オリゴヌクレオチドの塩基配列 のデザイン目的とする生物学的機能をもったＤＮＡ標的を同定した後、オリゴヌ クレオチドの長さが選ばれる。オリゴヌクレオチドの長さと標的の長さの間に１ ：１の対応がある。例えば、２７塩基の長さのオリゴヌクレオチドは２７塩基対 の長さの二重鎖ＤＮＡ標的に結合するのに必要である。最適の条件下ではオリゴ ヌクレオチド−二重鎖ＤＮＡの相互作用の安定性は一般にオリゴヌクレオチドの 長さと共に連続的に増加する。

望ましい実施例では、大孔２０から４０塩基の範囲のＤＮＡオリゴヌクレオチド が使われる。この範囲のオリゴヌクレオチドは通常その特定のＤＮＡ標的に対す る有用な解離定数をもっている。この解離定数は大孔１０″″１から１０″″″ モルの範囲にある。２０塩基以下のオリゴヌクレオチドは標的配列に対しては結 合が弱く、特異性も低くなり従って有用性が低い。

二重鎖のＤＮＡに結合するオリゴヌクレオチドは、そこにある二重鎖のプリンに 結合することによって安定化される。

一旦ＤＮＡ標的が同定されると標的領域のプリンのより豊富な鎖が結合部位の「 向きを示す」鎖として決められれる。

オリゴヌクレオチドリガンドが、その向きを示している鎖に並行か逆並行のいず れかに結合するようデザインさ、れる。結合の安定性はオリゴヌクレオチドの大 きさと染色体における位置に左右される。時には、並行が逆並行より安定である が、一方その逆が真であったり、等しく安定であったりする。好ましい実施例に おいて、オリゴヌクレオチドリガンドの詳細な配列をデザインする方法に二重鎖 の標的にＡＴ塩基対があればオリゴヌクレオチドにＴを入れ、二重鎖標的にＧＣ 塩基対があればオリゴヌクレオチドにＧを入れることがある。

このオリゴヌクレオチド構造にもとづく結合の供与体と受容体の方向性の例が第 ２図と第３図に示されている。

本発明のもう一つの実施例には少くとも約２０ヌクレオチドの配列をもち、その ヌクレオチド配列に二重鎖ＤＮＡの相補的な部位がＧＣ塩基であればＧが使われ 、二重鎖ＤＮＡの相補部位がＡＴ塩基対であればＴが使われ、そしてその配列が ３′から５′へ向けたオリゴヌクレオチドで二重鎖ＤＮＡ標的配列に少（とも６ ５％のプリン配列に逆並行に結合するか５′から３′へ向けたオリゴヌクレオチ ドで二重鎖ＤＮＡ標的配列に少くとも６５％はプリン鎖に並行して結合するオリ ゴヌクレオチドからなる群から選ばれるということを含む標的配列が少くとも６ ５％のプリン塩基または少くとも６５％のピリミジン塩基であるような二重鎖の ＤＮＡ中の標的′配列と結合して並行直鎖状の三重鎖体を作る合成オリゴヌクレ オチドが含まれている。この関係に関わらない一つまたはそれ以上の塩基を含む 分子を作ることができるけれど、これらの変更したオリゴヌクレオチドの結合親 和力と部位特異性が減少するだろう。従ってこれらの分子の生物活性はＧ／ＧＣ 及びＴ　／ＡＴ関係をもつオリゴヌクレオチドより劣るであろう。

下には標的配列と上記のデザイン方法によって考えられたオリゴヌクレオチドリ ガンドを模式化している。

標的配列（３５ｂｐ）は次のとおりである。

５’　−ＧＧＧＡＡＴＴＧＧＧＣＧＧＧＴＡＡＴＴＴＣＧＧＧＡＴＡＧＧＣＧＧ ＴＡＡ−３’　。

３’　−ＣＣＣＴＴＡＡＣＣＣＧＣＣＣＡＴＴＡＡＡＧＣＣＣＴＡＴＣＣＧＣＣ ＡＴＴ−５’並行の合成オリゴヌクレオチドは次のとおりである。

５’−ＧＧＧＴＴＴＴＧＧＧＧＧＧＧＴＴＴＴＴＴＧＧＧＧＴＴＴＧＧＧＧＧＴ ＴＴ−３’　（ｐａｒ）逆並付合成オリゴヌクレオチドは次のとおりである。

３’−ＧＧＧＴＴＴＴＧＧＧＧＧＧＧＴＴＴＴＴＴＧＧＧＧＴＴＴＧＧＧＧＧＴ ＴＴ−５’　（ａｎｔｉ）もし、合成オリゴヌクレオチドが標準的なホスホジエ ステル結合で構成されれば、その標的に対する結合親和性は生理学的な塩、二価 イオンの濃度、温度の下ではほぼ１０−”Ｍであろう。ランダムなりＮＡ配列に 対するオリゴヌクレオチドの結合に対する解離定数は３５塩基のオリゴヌクレオ チドに対してほぼＩＯ−”　Ｍであり標的に対する合成オリゴヌクレオチドの親 和性は同じ条件下でランダムな配列ＤＮＡに対するより約１０４倍大きい。

■　二重鎖の標的の解析 これらの方法が合成オリゴヌクレオチドを作るために行われれば、少くとも６５ ％程度のプリン体の二重鎖ＤＮＡ配列は安定な三重鎖体が形成されつる。ＤＮＡ 領域内ではＡ＋Ｔ含量が主要な意味をもたないけれど鋳型の領土でプリン体しか もたない二重鎖ＤＮＡ配列は一般に安定性が高められることによって特徴づけら れる複合体を形成する。もしもプリンである鋳型の中の塩基の数をｎとし、鋳型 の中のピリミジン塩基の数を（１−ｎ　）と定義すれば大兄の解離定数は次の半 経験的な公式から予測できよう。

Ｋ＝ｅｘｐ−［０，４ｎ＋　（０，２（１−ｎ）　／ＲＴ）　］この式はｉｎ　 ｖｉｔｒｏにおける遅生理学的条件、すなわち０．０５Ｍ　トリス塩酸、５ｍＭ 　Ｆ４ｇＣＱ、、３ｍＭスペルミン、ｐＨ７，８。

３７℃を考えている。この条件はこのデザイン過程において用いられる操作の標 準となっている。

この関係はその鋳型となる鎖においてプリン塩基しか含まない３５塩基の長さの 標的配列を結合するようにデザインされたオリゴヌクレオチドが約１×ｌＯ″″ ゛°Ｍの標準的解離定数をもって結合するような二重鎖を形成するであろうこと を予測させる。しかし、この解離定数は鋳型となる配列の中にピリミジンがある ときは変化するだろう。鋳型がピリミジンを含む場合の上記の模式では解離定数 は３ＸＩＯ”−’Ｍである。

この関係は三重鎖体形成の自由エネルギーが標的−オリゴヌクレオチド間の相互 作用のスパンに比例して増加するようだという観察とＧＣ塩基対に対するＧの、 あるいはＡＴ塩基対に対するＴの結合エネルギーが鋳型となる鎖に関係して塩基 対の指向性に左右されているという観察と一致している。

この効果の分子的な根源は第２図にみることができる。

方向性のある鎖が一連のプリンを含むときは相補的な第三の鎖中の塩基は隣り合 ってくっついた列を形成することは明らかである。他方、方向性をもった鎖にピ リミジンをおけば塩基対は逆さになる。かくして、第三の鎖の水素結合がその反 対の部位で“逆ホーグステーン”結合を作るとき並行の鎖指向性をもつことがで きてもこの主要な溝における第三の鎖でさえぎられる小路の転位が起こることと 関連している。ＡＴあるいはＧＣの塩基対にとって鋳型中プリン部位での第三の 鎖によって約０．４ｋｃａｌの結合自由エネルギーが生まれるが、もし第三の鎖 がプリンがピリミジンへ転換のおこった部位に結合すれば約０．２ｋｃａｌ　Ｌ 、か生まれない。

■　オリゴヌクレオチドの二次化学修飾Ａ、この技術に通じた者はいろいろな合 成法が利用できることを認識するだろう。望ましい実施例においてはオリゴヌク レオチドはホスホアミダイド法で合成され、それによって標準的にデオキシリボ 核酸オリゴマーが生産される。

分子設計法によってオリゴヌクレオチドの加水分解されないホスホジエステル骨 格あるいは選択された場所での置換はある例において生じる三重鎖体の安定性を 高めるだろうと考えられる。ホスホジエステル類縁体は細胞のヌクレアーゼによ る攻撃に対してより抵抗性である。

加水分解されないホスホジエステル骨格の例はホスホロチオエート、ホスホロセ レノエート、メチルホスフェート、ホスホトリエステル、自然に存在するホスホ ジエステルのα−エナンチオマーなどである。トリホスフェートやメチルホスホ ネート結合は第４図に示されている。

これらの加水分解されないオリゴヌクレオチド配列の誘導体がＤＮＡ標的特異性 を殆んど変えることなく生産されうる。

骨格の修飾は生きた細胞の中でオリゴヌクレオチドリガンドの安定性を微調整す るための実際的な道具を提供する。例えば、天然のホスホジエステル結合を含む オリゴヌクレオチドは真核細胞において１〜２時間程度で分解されるが、一方、 非加水分解性の誘導体は永久的に安定のようである。

Ｂ、オリゴヌクレオチド複合体は合成オリゴヌクレオチドの特徴を変えるもう一 つの方法となる。合成オリゴヌクレオチドの５′または３′末端にリンカ−がつ けられる。

５′末端につけられるリンカ−は通常アルキル結合を通して塩基平面につけられ た一級アミンをもつ塩基類縁体、アルキル結合を通じて塩基平面につけられたス ルフヒドリル基をもつ塩基類縁体、オリゴヌクレオチドの５′−水酸基に直接結 合した長鎖のアミン及びオリゴヌクレオチドの５′−水酸基に直接結合した長鎖 のチオールからなる群から選ばれる。３′末端上のリンカ−は通常アルキル結合 を通して塩基平面に付けられた一級アミンをもつ塩基類縁体またはアルキル結合 を通して塩基平面に付けられたスルフヒドリル基をもつ塩基類縁体である。その 末端に対する一級アミン結合の付着は二重鎖ＤＮＡ標的へのオリゴヌクレオチド 結合を変えることはない。

一つの結合が合成オリゴヌクレオチドに付けられると多くの修飾基を合成オリゴ ヌクレオチドに付けることができる。インターカレーター、溝の結合分子、陽荷 電のアミン、あるいは陽荷電のポリペプチドが付着できる分子として含まれる。

修飾基はＤＮＡを損傷する力に対して選択できる。例えば、修飾基は鉄−ＥＤＴ Ａキレート、カイトロジェン・マスタード、アルキレータ及びプソラリンのよう な光化学的なりロスリンカ−、エオシンのような一重項酸素の光化学的感作剤、 メチレンブルー、アクリジンオレンジ、９−アミノアクリジン及びエチジウムや いろいろなピレン誘導体のような直接光化学的損傷を与える試薬が含まれる。

例えばＭｉｌｌｉｇａｎによって供給されているような「アミノリンク」　（第 ５図をみよ）はうまく作用する。しかしながらいかなる種類の末端結合法でも同 じであるようである。アミノリンクで合成されると修飾されたオリゴヌクレオチ ドは第一級アミン、例えばサクシミデートやあるいはイソチオシアネート部分に 特異的な試薬と結合することができる（第５図）。

実施例の中では「アミノリンク」結合が三重鎖体を形成するオリゴヌクレオチド にインターカレートする色素の９−アクリジン・イソチオシアネートを付けるた めに使われている。オリゴヌクレオチド−色素の複合体の二重鎖結合親和性はオ リゴヌクレオチド結合親和性よりも約１００倍大きい、他の実施例にもエオシン ・イソチオシアネートをオリゴヌクレオチドに付けることが示されている。エオ シン・イソチオシアネートは光照射するとＤＮＡへリックスを破壊するので、こ の複合オリゴヌクレオチドは光照射の際、その結合部位でヘリックスを切断する 。この複合体オリゴヌクレオチドはｉｎ　ｖｉｔｒｏでも（ｉｎ　ｖｉｖｏでも ）オリゴヌクレオチドの結合部位を同定するのに有用で、選択的な遺伝子の標的 破壊のための治療法として使える力がある。

光化学反応性も５′結合を通してオリゴヌクレオチドへのブソラリン誘導体を付 けることによって達せられる。

プソラリンは光照射の後ＤＮＡに共有結合的に結合し、その結果として細胞障害 力をもつ薬剤となる。かくしてオリゴヌクレオチド感受性をもった光化学反応は オリゴヌクレオチド標的部位に対して毒性のプソラリン傷害をおこさせる道具と なる。

同様なオリゴヌクレオチド結合が特定のＤＮＡ配列に対する標的障害性化学反応 として使われる。いくつかの例が遷移金属のキレート化合物のような触媒性酸化 剤やヌクレアーゼを含んでいる。

光化学反応や障害性の化学剤が遺伝子の発現を永遠に阻害するために使われる。

化学反応に加えて、オリゴヌクレオチドの修飾はオリゴヌクレオチド複合体分子 の細胞とり込み速度を変える。

とり込み過程は迅速であるがあまり理解されていない。

末端の修飾はそのオリゴヌクレオチドリガンドの細胞のタイプによる特異性、薬 物動態、核への浸透性、細胞への絶対的とり込み速度等を修飾する有力な方法を 提供している。

Ｃ６合成オリゴヌクレオチドの特徴を改変するもう一つの方法は修飾した塩基類 縁体である。ピリミジンよりもむしろプリンではあるがＸは水素結合を作る能力 に関してＴと同一である。分子設計法により、上記のオリゴヌクレオチドのデザ イン法においてＴについてＸの置換はより安定な修飾三重鎖体となる。この安定 性の増加は原理的にリガンド内のかたまり方が強まり、またホスホジエステル骨 格の対称性が高まることに左右される。Ｔに対する塩基置換の例はＸ、Ｉやハロ ゲン化したＸやＩである。Ｇはハロゲン化したＧで置き換えられる。さらに、塩 基の２′−フラノース位は電荷をもたないかさの大きい基での置換をすることが できる。かさの高い非電荷の基の例は分枝したアルキル、糖、枝分かれした糖が 含まれる。選ばれた実施例においては少くとも一つの塩基が置換されている。

分子モデル法によりオリゴヌクレオチドのデザインは最も特異的な抗原−モノク ロナール抗体の相互作用のそれさえも超える標的親和力と特異性をもつリガンド を生産するだろう。

合成のオリゴヌクレオチドはヒトのＣ−ｍｙｃプロトオンコジーンの転写調節領 域、コラーゲンＩαの調節配列に対して設計され、またトリのα−アクチン遺伝 子のＴＡＴＡボックス断片に結合するように設計され、さらにまたヒトのＨｒＶ −１の初期遺伝子債域の中にあるエンハンサ−配列に結合するように設計されて いる。

本発明の別の実施例は合成オリゴヌクレオチドを細胞にとり込ませるために十分 な量を投与し、ＲＮＡ翻記翻意起点接するＤＮＡのドメインに位置するような標 的配列に結合させるステップを含む細胞の増殖を抑制する方法である。この合成 オリゴヌクレオチドはデザインの方法についての記載で上記したようなものであ る。細胞へのとり込みはこれら合成オリゴヌクレオチドにとって迅速で、適当な 置換と修飾によって変えることができる。同様に合成オリゴヌクレオチドに対す る適当な変更によって結合力を変えることができる。細胞の増殖抑制はガン性の 細胞の処理に使われる。特異的なオリゴヌクレオチドを添加すると選択的に細胞 増殖を抑制するだろう。例えば、Ｃ−ｍｙｃ遺伝子に対する合成オリゴヌクレオ チドはいくつかのガン性の細胞の増殖を抑制するのに使われる。Ｃ−ｍｙｃ発現 を抑制する合成オリゴヌクレオチドの例は：３’　−ＴＧＧＴＧＴＧＴＧＧＧＴ ＴＴＴＧＴＧＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧＧＧＧＴＴＴＴＴＴＴＴＧＧＧＴＧＧＧ−５ ’　。

３’　−ＴＧＴＧＧＴＧＧＧＧＴＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＧＧＴＧＧＧ ＴＧＧＧ−５’　。

５’　−ＴＴＴＧＧＴＧＴＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧＧＴＴＴＴＧＴＴＴＴＴＴＧＴ −３’　。

３’　−ＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＧＧＴ−５’　。

５’　−ＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＧＧＴ−３’等、 及びこれらの断片及び類似体が挙げられる。

もう一つの実施例には合成オリゴヌクレオチドを細胞のとり込みに十分な量投与 し、ＲＮＡの転写起点に隣接する核酸ドメインの中で結合するように標的配列に 結合させるステップを含む病原菌の生育を抑制する方法がある。

例えばＨＩＶ−１ウイルスはウィルスのＬＴＲ領域に選択的に結合する合成オリ ゴヌクレオチドで抑制されるだろう。

この合成オリゴヌクレオチドの特定の例には３’　−ＧＴＴＴＴＴＧＧＧＴＧＴ ＴＧＴＧＧＧＴＧＴＧＴＧＴＧＧＴＴ−５’　。

５’　−ＴＧＧＧＴＧＧＧＧＴＧＧＧＧＴＧＧＧＧＧＧＧＴＧＴＧＧＧＧＴＧＴ ＧＧＧＧＴＧ−３’及びこれらの断片や類似体が含まれる。

さらにもう一つの実施例では細胞のとり込みに十分な量の合成オリゴヌクレオチ ドを与え、それを標的配列に結合させるステップを含む上皮組織の構成的蛋白含 量を操作する方法が挙げられている。これには皮膚においているいろな酵素を阻 害したり、蛋白を調節したりすることが含まれている。例えばコラーゲンＩα遺 伝子合成速度は ３’　−ＴＧＧＧＴＴＧＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＧＧＧＴＧＴＧＧＴＴＴＧＧＴ ＴＧＴＧＧＧＴＴＴＴＴ−５’　。

３’　−ＧＴＧＧＧＴＴＧＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＧＧＧＴＧＴＧＧＴＴＴＧＧ −５’及びその断片またはその類似体を合成オリゴヌクレオチドとして用いるこ とによって変えることができる。同様にコラ−ゲナーゼ遺伝子は ５’　ＧＧＴＴＧＧＧＧＴＴＧＧＴＧＴＧＴＴＴＴＴＴＴＴＧＴＧＴＧＧＧＴＧ −３’　。

５′−丁丁ＧＴＧＧ丁ＴＧ丁Ｔ丁丁ＴＴＴＧＧＴＴＧＴＧＴＧＴＧＴ−３’及び その断片またはその類似体を用いることによって抑制される。

以下に示す例は説明のために提供されるものであり、いかなる方法によってもこ の発明を限定するものではない、この例に示される合成オリゴヌクレオチドは先 に述べた置換を全て包含している。その骨格、塩基、リンカ−１修飾基も加えら れる。これらの置換は特定のオリゴヌクレオチド治療における親和性、化学的安 定性、細胞とり込み特性等を高めることができよう。

実施例Ｉ Ａ、ヒトにおけるガン性組織の増殖をＣ−ｍｙｃ遺伝子の発現のプログラムを邪 魔することによって止める方法。

バーキットリンパ腫などの一群の腫瘍は共通の遺伝的障害をもっていることを示 唆する証拠があるが、それはＣ−ｌｌ１ｙｃの＋ａＲＮＡとそれに対応するＣ− ｍｙｃ蛋白の構成的な過剰生産という証拠である。Ｃ−ｍｙｃ蛋白は細胞増殖の 制御に律速的な要素であることが示されているので、Ｃ−ｍｙｃ蛋白の過剰生産 とそのような細胞の無制御なガン性増殖の間に直接的な関係があると考えられる 。

ガン性でも正常でも細胞ではＣ−ｍｙｃ遺伝子は合成オリゴヌクレオチドをデザ インする基準を満足させる５′−フランキング配列にあるいくつかの標的配列を もっている。薬剤開発のプログラムにおいてこの標的配列などは直接のオリゴヌ クレオチドデザインに対する鋳型として使われる。

これらのオリゴヌクレオチドの目的はＣ−ｍｙｃ転写を選択的に阻止して、Ｃ− ｍｙｃ障害をもって腫瘍の無制御の成育を阻止することにある。

ヒトＣ−ｍｙｃ遺伝子の転写調節部位にある３つの代表的な標的配列を以下に示 す。

Ａ、　標的：　Ｃ−ＭＹＣ遺伝子のＴＡＴＡボックスＤＮＡ標的二重鎖 ５’　−ＴＣＣＴＣＴＣＴＣＧＣＴＡＡＴＣ丁Ｃ：ＣＧＣＣ：ＣＡＣＣＧＧＣＣ ：ＣＴＴＴＡＴＡＡＴＧＣＧＡＧＧＧ−３’３’　−ＡＧＧＡＧＡＧＡＧＣＧＡ ＴＴＡＧＡＧＧＣＧＧＧＴＧＧＣＣＧＧＧＡＡＡＴＡＴＴＡＣＧＣＴＣＣＣ−５ ’並行合成オリゴヌクレオチド配列 ３’　−ＴＧＧＴＧＴＧＴＧＧＧＴＴＴＴＧＴＧＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧＧＧＧＴ ＴＴＴＴＴＴＴＧＧＧＴＧＧＧ−５’逆並行合成オリゴヌクレオチド配列 ５’　−ＴＧＧＴＧＴＧＴＧＧＧＴＴＴＴＧＴＧＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧＧＧＧＴ ＴＴＴＴＴＴＴＧＧＧＴＧＧＧ−３’Ｂ、　標的：転写活性化物結合部位−Ｃ− ＭＹＣ遺伝子プロモータの主要な活性化蛋白の結合部位 ｃ−ｍｙｃ遺伝子の異常に高いレベルの発現は多くのヒト腫瘍と強く関係してい る。ここに記載された二重鎖のオリゴヌクレオチドがそのような腫瘍中のｃ−ｍ ｙｃ遺伝子の発現を選択的に抑えるためにデザインされた。

（１）　ＤＮＡ標準二重鎮体 −１５３、−１１６ ５’　−ＴＣＴＣＣＴＣＣＣＣＡＣＣＴＴＣＣＣＣＡＣＣＣＴＣＣＣＣＡＣＣＣ ＴＣＣＣＣＡ−３’３’　−ＡＧＡＧＧＡＧＧＧＧＴＧＧＡＡＧＧＧＧＴＧＧＧ ＡＧＧＧＧＴＧＧＧＡＧＧＧＧＴ−５’逆並行合成オリゴヌクレオチド ５’　−ＧＴＧＧＴＧＧＧＧＴＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴ ＧＧＧＧＴ−３（２）　ＤＮＡ標的二重鎖 ５’　−ＴＣＴＣＣＴＣＣＣＣＡＣＣＴＴＣＣＣＣＡＣＣＣＴＣＣＣＣＡＣＣＣ ＴＣＣＣＣＡ−３’３’　−ＡＧＡＧＧＡＧＧＧＧＴＧＧＡＡＧＧＧＧＴＧＧＧ ＡＧＧＧＧＴＧＧＧＡＧＧＧＧＴ−５’並行合成オリゴヌクレオチド配列 ３’　−ＧＴＧＧＴＧＧＧＧＴＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴ ＧＧＧＴ−５’（３）　ＤＮＡ標的二重鎖（２７ｂｐ）３’　−ＧＧＡＡＧＧＧ ＧＴＧＧＧＡＧＧＧＧＴＧＧＧＡＧＧＧＧＴ−５’並行合成オリゴヌクレオチド 配列 ３’−ＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＧＧＴ−５’　（ｐ ａｒ）逆並行合成オリゴヌクレオチド ５’−ＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＧＧＴ−３’　（ａ ｎｔｉ）２７ｂｐ標的二重鎖は７４％のＧＣ塩基対と８９％のプリンをその鎖に もっている。逆並行結合に対する解離定数には６Ｘ］Ｏ−”Ｍである。

Ｃ０標的：を推動物のＣ−ｍｙｃ遺伝子ファミリーの中の高度に保存された配列 にあるＴＡＴＡボックスと活性化因子部位の間の配列 ＤＮＡ標的二重鎖 −８７、−５８ ５’　−ＡＡＡＧＣＡＧＡＧＧＧＣＧＴＧＧＧＧＧＡＡＡＡＧＡＡＡＡＡＡＧＡ −３’３’　−ＴＴＴＣＧＴＣＴＣＣＣＧＣＡＣＣＣＣＣＴＴＴＴＣＴＴＴＴＴ ＴＣＴ−５’並行合成オリゴヌクレオチド配列 ５’　−ＴＴＴＧＧＴＧＴＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧＧＴＴＴＴＧＴＴＴＴＴＴＧＴ −３’逆並行合成オリゴヌクレオチド配列 ３’　−ＴＴＴＧＧＴＧＴＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧＧＴＴＴＴＧＴＴＴＴＴＴＧＴ −５’この部位の考えられる機能、ＲＮＡ転写起点に関連する場所、ｃ−ｒｓ、 ｙｃに特異的な治療に使われるオリゴヌクレオチド配列が示されている。この技 術分野に通じた者はｃ−ｍｙｃ遺伝子の分子遺伝学が詳細に研究されているので ５′−フランキング領域の中の標的配列のリストが上記のデザイン基準を適用す ることによって広げられることを容易に認識するだろう。

合成オリゴヌクレオチドのＡもＢもｃ−ｍｙｃ転写を特異的に抑制することによ って腫瘍の増殖を阻害するために標的の二重鎖に特異的に作用する。このオリゴ ヌクレオチドＣの特定の阻害法はわかっていない。

この技術分野に通じる者はヒトの腫瘍に関わる他の遺伝子に対するオリゴヌクレ オチドが同じようにデザインされることができることを容易に認識するだろう。

実施例２ 組織の外観を改変し、傷を治す目的のために、上皮組織の構成蛋白含量を操作す る方法。

皮膚の物理的な特性を規定する構成蛋白はよく知られている。コラーゲンやエラ スチン蛋白及びそれらに対応するプロテアーゼのコラゲナーゼやエラスターゼの 分子構造は熱心に研究されてきた。これら蛋白は手のこんだ制御のプログラムの コントロール下にありそれが傷の治癒過程の間や老化過程の結果として変わって くるようである。分子の構造は構成蛋白合成や酵素分解のパターンへの遺伝子特 異的な働きかけに基づく治療を考慮するよう十分に決められている。

老化（しわのできることなど）に伴う皮膚の物理的特性の変化は一部はコラーゲ ンやその他の構成蛋白が相対的に豊富にあることに老化に特異な変化に左右され ていることをデータが示唆している。薬剤による治療によってこれら蛋白の合成 や選択的な分解を妨害することで若い組織のそれに近づける分布を再構築するこ とができ、従って老化の影響を部分的に抑えることができる。

ヒトの皮膚でのコラーゲンＩ合成を操作することにもとづく合成オリゴヌクレオ チドのデザインプログラムを以下に示す。相対的な蛋白濃度をかえることによっ て皮膚の構造や機械的特性を変えることができる。かくして、合成オリゴヌクレ オチドは皮膚の老化過程をかえる、あるいは傷の治癒過程をかえるための治療剤 として使われる。この技術分野に通じた者は他のコラーゲン、他の皮膚蛋白、及 びそれらに相補的なプロテアーゼについても必要な遺伝的データを利用できるこ とにもとづいてこの概念を拡げることができることを容易に認識するだろう。

ヒトのαｌ　（１）コラーゲン遺伝子の転写制御領域にある代表的な標的配列、 その部位の考えられる機能、コラーゲン特異的な治療に対してデザインされた合 成オリゴヌクレオチド配列を以下に示す。コラーゲン遺伝子の分子遺伝学が発展 しているので５１−フランキング領域にある標的配列のリストが広げられよう。

Ａ、　標的：コラーゲン遺伝子に対するＣＡＴボツクスＤＮＡ標的二重鎖 ３’　−ＡＧＧＧＡＡＧＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＧＧＧＡＧＡＧＧＴＡＡＧＧＴ ＴＧＡＧＧＧＴＴＴＡＡ−５’合成オリゴヌクレオチド配列 ３’　−ＴＧＧＧＴＴＧＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＧＧＧＴＧＴＧＧＴＴＴＧＧＴ ＴＧＴＧＧＧＴＴＴＴＴ−５’Ｂ、　標的：コラーゲン遺伝子に対するエンハン サ−ＤＮＡ標的二重鎖 ３’　−ＧＧＧＡＴＧＧＧＴＧＡＣＣＡＡＴＣＧＧＧＴＧＣＧＧＴＡＡＧＡ−５ ’合成オリゴヌクレオチド配列 ３’　−ＧＧＧＴＴＧＧＧＴＧＴＧＧＴＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＧＴＴＴＧＧ−５ ’Ｃ０標的：全てのコラーゲンの−２００近くにある高度に保持されたポリプリ ン断片 ＤＮＡ標的二重鎖 ３’　−ＧＡＧＧＧＡＡＧＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＧＧＧＡＧＡＧＧＴＡＡＧＧ −５’合成オリゴヌクレオチド配列 ３’　−ＧＴＧＧＧＴＴＧＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＧＧＧＴＧＴＧＧＴＴＴＧＧ −５’合成オリゴヌクレオチドＡとＢはタイプＩコラーゲン蛋白の合成を阻害す る。その過程にはコラーゲンＲＮＡの翻訳の特異的な抑制が含まれている。Ｃの 合成オリゴヌクレオチドの阻害法は分っていない、皮膚の蛋白の蛋白合成に対す る影響は培養したヒトの繊維芽細胞に取り込まれるために十分な量の合成オリゴ ヌクレオチドを加えることによってみることができる。

次に、二つの代表的な標的配列がヒトコラ−ゲナーゼ遺伝子の転写制御領域、そ れらの部位の機能、そのＲＮＡ転写起点に関わる部位、及びコラーゲンに特異的 な治療としてデザインされたオリゴヌクレオチド配列について記載される。

Ｄ、　標的：コラ−ゲナーゼ遺伝子に対するＴＡＴＡボックスＤＮＡ標的二重鎖 ３’　−ＣＣＴＴＣＣＣＧＴＴＣＣＴＧＡＧＡＴＡＴＡＴＡＴＧＴＣＴＣＣＣ丁 Ｃ−５′合成オリゴヌクレオチド配列 ５’　−ＧＧＴＴＧＧＧＧＴＴＧＧＴＧＴＧＴＴＴＴＴＴＴＴＧＴＧＴＧＧＧＴ Ｇ−３’Ｅ、　標的：コラ−ゲナーゼ遺伝子に対する誘導性エンハンサ−ＴＰＡ 腫瘍のプロモータ応答性を授けているＤＮＡ標的二重鎖 ３’　−ＴＴＣＴＣＣＴＡＣＡＡＴＡＴＴＴＣＧＴＡＣＴＣＡＧＴＣＴ−５’合 成オリゴヌクレオチド配列 ５’　−ＴＴＧＴＧＧＴＴＧＴＴＴＴＴＴＴＧＧＴＴＧＴＧＴＧＴＧＴ−３’Ｄ 合成オリゴヌクレオチドはコラ−ゲナーゼ蛋白合成を阻害する。この過程にはコ ラ−ゲナーゼＲＮＡの翻訳の特異的な抑制が含まれる。Ｅ合成オリゴヌクレオチ ドはＴＰＡ感受性の欠失をもたらし、ＴＰＡのようなプロモータの存在でのコラ −ゲナーゼ合成のその後の抑制をもたらす。この過程はコラ−ゲナーゼＲＮＡ翻 訳の特異的な抑制を含んでいる。合成オリゴヌクレオチドの相互作用は細胞内で コラ−ゲナーゼ量の減少につれてコラーゲン蛋白レベルの上昇をもたらす。この 上昇の臨床的効果は皮膚の物理的特性の有力な変更をもたらす。

この効果は培養ヒト繊維芽細胞への取り込みに十分な量のオリゴヌクレオチドを 加えることによってみることができる。

この技術に通じた者はこれらの概念が皮膚の発達、修復、老化に関わると知られ ている他の遺伝子へも拡大でき、また利用できる分子遺伝学のデータに限られる ことを容易に評価できよう。

実施例３ ＨＩＶ〜Ｉ　ＬＴＲにある標的部位に結合するオリゴヌクレオチドによってヒト 旧Ｖ−１ウィルスの増殖を抑制する方法。

ＨＩＶ−１ウイルスはヒトの後天性免疫欠損症候群（エイズ）の原因であると知 られている。１（ＩＶ−１ウイルスの長い末端くり返しはヒトのＴ細胞宿主にお いて転写開始に必要なＬＴＲ領域にあるいくつかのＤＮＡ断片をもっていること が知られている。合成オリゴヌクレオチドはウィルスのＬＴＲにおいて標的配列 に三重鎖体を形成することによってヒトの宿主細胞でＨＩＶ−１ｍＲＮＡ合成を 選択的に抑制する。ＲＮＡ合成の抑制はウィルスの増殖速度の減少をもたらす。

このことは感染の遅延あるいはウィルスの増殖に対して潜伏期からの転移の抑制 を引きおこす。ＬＴＲにある殆どの部位は薬剤（オリゴヌクレオチド）の作用す る標的部位を含んでいる。小さな高度に保存されたＬＴＲ領域にむだなりＮＡは ない。

ヒトのＨＩＶ−Ｉ　ＬＴＲの転写制御領域における代表的な標的配列、これらの 部位の機能、ＲＮＡ転写起点に関するその場所ＨＩＶ−１に特異的な治療にデザ インされたオリゴヌクレオチド配列が下に示されている。旧Ｖ−１の分子遺伝学 が進んでいるのでＬＴＲやその他の場所にある標的配列のリストは広げられるだ ろう。

いずれの例でも、並行及び逆並行の同位体が示されている。

その理由は１つあるいは別のもののいずれかがｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいてよい結 合親和力を示すけれど各々の効果は最終決定するためにはｉｎ　ｖｉｖｏでのテ ストをすべきであるからである。

Ａ、　標的：ＨＩＶ−Ｉ　ＬＴＲ領域の５７−末端ＤＮＡ標的二重鎖（２５ｂｐ 、　９２％プリン）３’　−ＴＴＴＴＣＴＴＴＴＣＣＣＣＣＣＴＧＡＣＣＴＴＣ ＣＣ−５’並行合成オリゴヌクレオチド配列 ５’　−ＴＴＴＴＧＴＴＴＴＧＧＧＧＧＧＴＧＴＧＧＴＴＧＧＧ−５’　（１− ＩＩＶ　１　ｐａｒ）逆並付合成オリゴヌクレオチド配列 ３’　−ＴＴＴＴＧＴＴＴＴＧＧＧＧＧＧＴＧＴＧＧＴＴＧＧＧ−５’　（ＨＩ Ｖ　１　ａｎｔｉ　）Ｂ、　標的部位二インターロイキン２遺伝子と同質領域に 類似性をもった陰性ＨＩＶ　１調節領域の断片ＤＮＡ標的二重鎖（３３ｂｐ、　 ８．８％プリン）３’　−ＴＣＴＣＴＴＣＣＡＴＣＴＴＣＴＣＣＧＧＴＴＡＣＴ ＴＣＣＴＣＴＣＴＴ−５’並行合成オリゴヌクレオチド配列 ５’　−ＴＧ’ｒＧＴＴＧＧＴＴＧＴＴＧＴＧＧＧＧＴＴＴＧＴＴＧＧＴＧＴＧ ＴＴ−３’　（）ＩＩＶ　２　ｐａｒ）逆並行の合成オリゴヌクレオチド配列 ３’−ＴＧＴＧＴＴＧＧＴＴＧＴＴＧＴＧＧＧＧＴＴＴＧＴＴＧＧＴＧＴＧＴＴ −５’　（旧Ｖ２ａｎｔｉ）Ｃ０標的部位：　ＬＴＲの中心近辺の部位ＤＮＡ標 的二重鎖（２５ｂｐ、　８８％プリン）３’　−ＣＣＣＴＡＣＣＴＣＣＴＧＣＧ ＣＣＴＣＴＴＴＣＴＴＣ−５’並行合成オリゴヌクレオチド配列 ５’−ＧＧＧＴＴＧＧＴＧＧＴＧＧＧＧＧＴＧＴＴＴＧＴＴＧ−３’　（旧Ｖ　 ３　ｐａｒ）逆並行の合成オリゴヌクレオチド配列 ３’−ＧＧＧＴＴＧＧＴＧＧＴＧＧＧＧＧＴＧＴＴＴＧＴＴＧ−５’　（ＨＩＶ ３ａｎｔｉ）Ｄ、　標的部位：　ｓｐ　１−ライン転写の活性化因子に対する結 合部位 （１）　ＤＮＡ標的二重鎖（３６ｂｐ、　７８％プリン）３’　−ＴＣＣＣＴＣ ＣＧＣＡＣＣＧＧＡＣＣＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＣＣＴＣＡＣＣＧＣ−５’並行合 成オリゴヌクレオチド配列 ５’−ＴＧＧＧＴＧＧＧＧＴＧＧＧＧＴＧＧＧＧＧＧＧＴＧＴＧＧＧＧＴＧＴＧ ＧＧＧ−３’　（）ＩＩＶ４ｐａｒ）または（ＨＩＶ３６ｐａｒ）。

逆並性合成オリゴヌクレオチド配列 ３’　−ＴＧＧＧＴＧＧＧＧＴＧＧＧＧＴＧＧＧＧＧＧＧＴＧＴＧＣ（：ＣＴＣ ＴＧＧＧＧ−５’　（ＨＩＶ　４　ａｎｔｉ　）または（ＨＩＶ３６ａｎｔｉ） 　。

ＨＩＶ　４　ｐａｒまはたその３′末端にＴＧを付加して旧Ｖ３８ｐａｒにする こともできる。

Ｅ、　標的：転写活性化因子領域（ｔａｒ）に対する結合部位；シ■部位の下流 半分。

ＤＮＡ標的二重鎖（２９−３１ｂｐ、　７２％プリン）３’　−ＧＡＡＡＡＡＣ ＧＧＡＣＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＡＧＡＣＣＡＡＴＣ−５’並行の合成オリゴヌ クレオチド配列 ３’−ＧＴＴＴＴ丁ＧＧＧＴＧＴＴＧＴＧＧＧＴＧＴＧＴＧＴＧＧＴＴ−５’　 （ＨＩＶ２９ｐａｒ）逆並性の合成オリゴヌクレオチド配列 ５’　−ＧＴ丁ＴＴＴＧＧＧＴＧＴＴＧＴＧ（ｉＧＴＧＴＧＴＧＴＧＧＴＴＴＧ −３’　（ＨＩＶ３１ａｎｔｉ、）オリゴヌクレオチドの旧Ｖ２９ｐａｒと旧Ｖ ３１ａｎｔｉはここで前記したようにしてデザインされた。ＨＩＶ３１ａｎｔｉ は３′末端から塩基２個ＴＧを除いても作用する。両方のオリゴヌクレオチドの 相対移動度やＤＮＡフットプリント分析によりｉｎ　ｖｉｔｒｏで標的のプロウ ィルス性配列に対して親和力の高い結合が示されている。

旧Ｖ−１を感染した単細胞性の細胞株である０９３７株を旧Ｖ２９ｐａｒまたは ）ＩＩＶ３１ａｎｔｉのいずれががｉｎ　ｖｉｔｒｏで標的配列には）　親和性 をもたない旧Ｖ２９のランダム同位体で２０μＮまでの濃度において処理した。

β−アクチンのｍＲＮＡと比較して匣の相対濃度の減少が示されたようにウィル ス性のｍＲＮＡ生産の重大な阻害がｌＯμ阿のオリゴヌクレオチドの添加でみら れた（ｐ＜０、０１、一対も一検定、第６図）。２０μＭでもそれ以上の抑制は みられなかった。　ＨＩＶ２９のランダム同位体は２０μ阿でさえもウィルス性 のｍＲＮＡ合成を阻害せず、ＨＩＶ２９で得られた抑制の特異性が確かめられた 。

Ｕ３９７／ＨＩＶ−１細胞を０．６μＭのＩｍｐ−標識のＨＩＶ２９ｐａｒを含 む培地で培養すると、その細胞はそれを超える濃度でそのオリゴマーを迅速に取 りこむことができることをみつけた。３５０ｆＬの平均細胞量を考えると、その 細胞内濃度は１０分後の２，４μＭから２時間後約６μＭの定値に増加すること が示された。

オリゴヌクレオチドはその２つの処理において）ＩＩＶ−１転写に継続した効果 、すなわち、２時間後にはなしても７２時間までの間ウィルス性ｍＲＮＡの合成 を阻害した（第７図）。さらに研究を進めることによって感染したＴ細胞でｔａ ｒ配列に特異的なオリゴヌクレオチドの効果が示された。ＨＩＶ２９ｐａｒが旧 ■−感染のＨ９Ｔ細胞の処理に用いられた。５μ門で２時間毎に処理すると２及 び１２時間で旧Ｖ−１に感染したＨ９Ｔ細胞においてｍＲＮＡ合成を効果的に抑 制した。

かくして、ＤＮＡへリックスの主要な溝に結合してＨＴＶ−１プロウイルスの、 堕工領域の特定の遺伝子配列をもつ三重鎖体を作るようにデザインされたオリゴ ヌクレオチドはＨＩＶ−１に感染した細胞によって容易に取り込まれ、これらの 細胞では構成的に′ｌ＠現しているβ−アクチンのｍＲＮＡを同時に抑制するこ となく旧Ｖ−１のｍＲＮＡの合成を選択的に抑制することが証明された。ウィル スのｍＲＮＡ合成の阻害とともにウィルスがコードしている蛋白の翻訳も抑制さ れる。ウィルスのｍＲＮＡの阻害は加えたオリゴヌクレオチドの量に左右された 。最大の阻害は１０μＮ以上の濃度で見られた。ＤＮＡ二重鎖の特定の配列に結 合し、その標的配列をもつ並行直鎖状の二重鎖を形成するようにデザインされた オリゴヌクレオチドは遺伝子発現を調節する効果的で非常に特異性の高い薬剤と なるがそのような薬剤はウィルスの復製や新しいｍＲＮＡ生産を左右するその他 の反応を調節するために合理的にデザインされた新しい種類の化学療法剤を提供 している。

ＡからＥまでの合成オリゴヌクレオチドはＨＩＶ−１のｍＲＮＡ合成、つまりウ ィルスの増殖を阻害するだろう。この方法にはウィルスのＬＴＲからのＲＮＡ転 写の特異的抑制が含まれている。

この技術分野に通じた人はこの概念がＨＩＶ−１やその他のウィルスが働くよう な感染過程に関与していることが知られている他の遺伝子に拡大されることを容 易に認識するだろう。

実施例４ トリの骨格筋アクチンの転写を変える方法。

トリの骨格筋のα−アクチン遺伝子の転写調節領域の代表的な標的配列、その部 位の機能、ＲＮＡ転写起点に関係する場所、アクチンに特異的な処理をするよう デザインされたオリゴヌクレオチド配列を下に示す。アクチン遺伝子の分子遺伝 学の発達につれてアクチンをコントロールする領域にある標的配列のリストが拡 げられよう。

Ａ、　標的ニトリの骨格筋の゛α−アクチン遺伝子のＴＡＴＡボックス ＤＮＡ標的二重鎖 ３’　−ＣＴＡＴＴＴＴＣＣＧＡＧＧＣＣＣＣＧＧＣＣＧＣＣＧＣＣ−５’合成 オリゴヌクレオチド配列 ５’　−ＧＴＴＴＴＴＴＧＧＧＴＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ−３’この 合成オリゴヌクレオチド分子はＲＮＡ転写を特異的に抑制することによってアク チン蛋白合成を阻害する。この阻害は培養トリ筋肉芽細胞で評価できる。実際の トリではアクチンやその合成がアクチンの発現に強く関係しているその他の筋肉 蛋白の品質に変化を示すだろう。この変化の実用上の結果はトリ肉の特性の変化 である。

この技術分野に通じた者はこの概念が筋肉の成長や発達に関与することが知られ ている他の遺伝子に拡大できることを容易に評価するだろうがそれは分子遺伝学 のデータが利用できるものに限られる。

実施例５ ン　−ロ　ン２α　内 標的ニドランスプロモータ領域 ＤＮＡ標的二重＃　（２８ｂｐ） ３’　−ＴＴＧＣＣＧＴＣＣＣＣＴＴＡＧＡＧＧＧＡＧＡＧＧＡＡＡＡ−５’並 行の合成オリゴヌクレオチド ５’−ＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＧＴＴＴＧＴＧＧＧＴＧＴＧＧＴＴＴＴ−３’　（ ＩＬ２８ｐａｒ）逆並行の合成オリゴヌクレオチド ３’ＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＧＴＴＴＧＴＧＧＧＴＧＴＧＧＴＴＴＴ−５’　（Ｉ Ｌ２８ａｎｔｉ）２８ｂｐの標的はＧ＋Ｃ塩基対が５４％でその指向する鎖にお いてプリン６１％を含んでいる。並行する鎖に対する解離定数Ｋｄｉｓｓは１， ５　Ｘ　１０−’である。逆並行に対するＫｄｉｓｓは８Ｘ１０−’である。

実施例６ アルツハイマー病の分散プラーク形成に対する配列ＡＰＰ７７０遺伝子はアルツ ハイマー病におけるプラーク形成に関与する前駆蛋白である。

Ａ、標的部位：　ＴＡＴＡボックス下流部位ＤＮＡ二重鎖標的 ３’　−ＴＴＴＴＴＧＴＴＴＧＴＴＴＴＴＡＴＡＴＴＣＴＴＴＣＴＴＴＧＴＴＴ Ｔ−５’並行の合成オリゴヌクレオチド配列 ５’　−ＴＴＴＴＴＧＴＴＴＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴＴＣＴＴＴＣＴＴＴ Ｔ−３’　（ＡＰＰ　１　ｐａｒ）逆並行の合成オリゴヌクレオチド配列 ３’　−ＴＴＴＴＴＧＴＴＴＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴＴＣＴＴＴＣＴＴＴ Ｔ−５’　（ＡＰＰ　１　ａｎｔｉ　）Ｂ、標的コわかっていない ＤＮＡ二重鎖標的 ３’　−ＡＧＧＡＣＧＣＧＧＡＡＣ：ＧＡＧＧＡＡＡＣＣＡＡＧＣＡＡＧＡ−５ ’並行の合成オリゴヌクレオチド配列 ３’　−ＴＧＧＴＧＧＧＧＧＴＴＧＧＴＧＧＴＴＴＧＧＴＴＧＧＴＴＧＴ−５’ 　（ＡＰＰ　２　ｐａｒ）逆並行の合成オリゴヌクレオチド配列 ５′−丁ＧＧＴＧＧＧＧＧＴＴＧＧＴＧＧＴＴＴＧＧＴＴＧＧＴＴＧＴ−３’　 （ＡＰＰ　２　ａｎｔｉ　）Ｃ６標的：わかっていない ＤＮＡ二重鎖標的 ３’　−ＡＡＧＡＧＴＡＡＧＡＧＡＡＧＧＴＣＴＴＴＧＣＧＧＡＣＧＧＧＧＴＧ ＧＡＴＡＧＧ−５’並行の合成オリゴヌクレオチド配列 ３’　−ＴＴＧＴＧＴＴＴＧＴＧＴＴＧＧＴＧＴＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＧＧＴＧ ＧＴＧＴＧＧ−５’　（ＡＰＰ　３　ｐａｒ）逆並行の合成オリゴヌクレオチド 配列 ５’　−ＴＴＧＴＧＴＴＴＧＴＧＴＴＧＧＴＧＴＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＧＧＴＧ ＧＴＧＴＧＧ−３’　（ＡＰＰ　３　ａｎｔｉ　）Ｄ、標的：わかっていない ＤＮＡ二重鎖標的 ３’　−ＣＴ（１：ＴＣＴＴＴＴＴＴＧＣＴＴＴＡＣＧＣＣＴＡＴＴＴＴＴ−５ ’並行の合成オリゴヌクレオチド配列 ５’　−ＧＴＧＴＧＴＴＴＴＴＴＧＧＴＴＴＴＧＧＧＧＴＴＴＴＴＴＴ−３’　 （ＡＰＰ　４　ｐａｒ）逆並行の合成オリゴヌクレオチド配列 ３’　−ＧＴＧＴＧＴＴＴＴＴＴＧＧＴＴＴＴＧＧＧＧＴＴＴＴＴＴＴ−５’　 （ＡＰＰ　４　ａｎｔｉ　）Ｅ、標的：わかっていない ＤＮＡ二重鎖標的 ３’　−ＧＡＧＴＧＧＡＡＡＧＧＧＡＣＴＡＧＧＡＣＧＴＧＧＣＡＧＧＧＡＧＡ ＧＧＡ−５’並行の合成オリゴヌクレオチド配列 ３’　−ＧＴＧＴＧＧＴＴＴＧＧＧＴＧＴＴＧＧＴＧＧＴＧＧＧＴＧＧＧＴＧＴ ＧＧＴ−５’　（ＡＰＰ　５　ｐａｒ）逆並行の合成オリゴヌクレオチド配列 ５’　−ＧＴＧＴＧＧＴＴＴＧＧＧＴＧＴＴＧＧＴＧＧＴＧＧＧＴＧＧＧＴＧＴ ＧＧＴ−３’　（ＡＰＰ　５　ａｎｔｉ　）Ｆ、標的：わかっていない ＤＮＡ二重鎖標的 ３’　−ＧＧＣＡＧＧＧＡＧＡＧＧＡＣＣＧＧＧＧＴＣＴＧＡＧＡＧＧＧＡＧＧ Ｇ−５’並行の合成オリゴヌクレオチド配列 ３’　−ＧＧＧＴＧＧＧＴＧＴＧＧＴＧＧＧＧＧＧＴＧＴＧＴＧＴＧＧＧＴＧＧ Ｇ−５’　（ＡＰＰ　６　ｐａｒ）逆並行の合成オリゴヌクレオチド配列 ５’　−ＧＧＧＴＧＧＧＴＧＴＧＧＴＧＧＧＧＧＧＴＧＴＧＴＧＴＧＧＧＴＧＧ Ｇ−３’　（ＡＰＰ　６　ａｎｔｉ　）Ｇ、標的：わかつていない ＤＮＡ二重鎖標的 ３’　−ＣＣＣＣＴＣＧＣＣ丁ＣＣＣＣＣＧＣＧＣＡＣＣＣＣ−５’並行の合成 オリゴヌクレオチド配列 ５’　−ＧＧＧＧＴＧＧＧＧＴＧＧＧＧＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧ−３’　（ＡＰＰ 　？　ｐａｒ）逆並行の合成オリゴヌクレオチド配列 ３’　−ＧＧＧＧＴＧＧＧＧＴＧＧＧＧＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧ−５’　（ＡＰＰ 　７　ａｎｔｉ　）Ｈ０標的：わかっていない ＤＮＡ二重鎖標的 ３’　−ＧＡＧＣＧＧＡＣＣＧＡＧＡＣＴＣＧＧＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＣＧＡＧ −５’並行の合成オリゴヌクレオチド配列 ３’　−ＧＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＴＧＴＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＴＧ −５’　（ＡＰＰ　８　ｐａｒ）逆並行の合成オリゴヌクレオチド配列 ５’　−ＧＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＴＧＴＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＴＧ −３’　（ＡＰＰ　８　ａｎｔｉ　）実施例７ ＥＧＦＲプロモータ領域 異常に高度な発現をした上皮細胞増殖因子遺伝子（ＥＧＦＲ）はガンやいくつか の皮膚病（乾せん）などの発生と関連している。以下に示す合成オリゴヌクレオ チドはそのような病気のＥＧＦＲ遺伝子の発現を選択的に抑制するようデザイン された。

Ａ、標的：　ＳＰ　１結合部位 ＤＮＡ二重鎖標的 ３’　−ＡＧＧＣＧＧＣＴＣＡＧＧＧＧＣＧＧＡＧＣＧＧＣＧＧ−５’並行の合 成オリゴヌクレオチド配列 ３’　−ＴＧＧＧＧＧＧＴＧＴＧＧＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧＧＧＧ−５’　（ＥＧ ＦＲ１ｐａｒ）逆並行の合成オリゴヌクレオチド配列 ５’　−ＴＧＧＧＧＧＧＴＧＴＧＧＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧＧＧＧ−３’　（ＥＧ ＦＲ１ａｎｔｉ　）Ｂ、標的：　ＳＰ　１結合部位 ＤＮＡ二重鎖標的 ３’　−ＡＧＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＧＣＧＧＧＡＣＧＧＡＧＧＧ−５’並行の 合成オリゴヌクレオチド配列 ３’　−ＴＧＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＧＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＧ−５’　（Ｅ ＧＦＲ２ｐａｒ）逆並性合成オリゴヌクレオチド配列 ５’　−ＴＧＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＧＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＧ−３’　（Ｅ ＧＦＲ２ａｎｔｔ　）Ｃ１標的：　ＳＰ　１結合部位 ＤＮＡ二重鎖標的 ３’　−ＡＡＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＡＣＧＡＧＧＡＧＧＧＣＴＡＧＧＧＡＧ ＧＡＧＧ−５’並行の合成オリゴヌクレオチド配列 ３’　−ＴＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＧＧＴＴＧＧＧＴＧ ＧＴＧＧ−５’　（ＥＧＦＲ３ｐａｒ）逆並行の合成オリゴヌクレオチド配列 ５’　−ＴＴ（ＪＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＧＧＴＴＧＧＧＴＧ ＧＴＧＧ−３’　（ＥＧＦＲ３ａｎｔｉ）Ｄ、標的：　ＥＧＦＲ発現に必要なヌ クレアーゼ感受性領域ＤＮＡ二重鎖標的 ３’　−ＡＡＧＡＧＧＡＧＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＣＧＴＡＡＧＡＧＧＡＧＧＡＧ ＧＡＧＡ−５’並行の合成オリゴヌクレオチド配列 ３’　−ＴＴＧＴＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧ ＧＴＧＴ−５’（ＥＧＦＲ４ｐａｒ　） 逆並行の合成オリゴヌクレオチド配列 ５’　−ＴＴＧＴＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧ ＧＴＧＴ−３’（ＥＧＦＲ４ａｎｔｉ） 実施例８ ＧＳＴｐｉ遺伝子 酵素の発現過剰 グルタチオン−ｓ−トランスフェラーゼｐｉはいろいろなガンで生じる広範囲な 薬剤耐性に働いていると考えられている。

以下に記す合成オリゴヌクレオチドはＧＳＴ−ｐｉ発現を抑制しそれによって伝 統的な薬剤化学療法に対してガン組織を感受性にするようデザインされている。

Ａ、標的部位：標的領域は転写を活性化する因子ＡＰＩ及びＳｐｌに一致して結 合する配列に関している。これに対して標的とする合成オリゴヌクレオチドはＡ ＰＩ及びＳｐｌと競合することによってＧＳＴｐｉ転写を抑制するだろう。

ＤＮＡ二重鎖標的 ３’　−ＣＴＧＡＧＴＣＧＴＧＡＣＣＣＣＧＣＣＴＣＧＣＣＣＣＧ（１：ＣＣＴ −５’並行の合成オリゴヌクレオチド配列 ５’　−ＧＴＧＴＧＴＧＧＴＧＴＧＧＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＴ−３ ’　（ＧＳＴ　１　ｐａｒ）逆並行の合成オリゴヌクレオチド配列 ３’　−ＧＴＧＴＧＴＧＧＴＧＴＧＧＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＴ−５ ’　（ＧＳＴ　１　ａｎｔｉ　）Ｂ、標的部位：エンハンサ一様のポリプリン配 列。この部位に対して標的とした合成オリゴヌクレオチドはエンハンサ−と競合 することによってＧＳＴｐｉ転写を抑制するだろう。

３’　−ＣＣＣＣＴＧＧＡＣＣＣＴＴＴＣＴＣＣＣＴＴＴＣＣ−５’並行の合成 オリゴヌクレオチド配列 ５’　−ＧＧＧＧＴＧＧＴＧＧＧＴＴＴＧＴＧＧＧＴＴＴＧＧ−３’　（ＧＳＴ 　２　ｐａｒ）逆並行の合成オリゴヌクレオチド配列 ３’　−ＧＧＧＧＴＧＧＴＧＧＧＴＴＴＧＴＧＧＧＴＴＴＧＧ−５’　（ＧＳＴ 　２　ａｎｔｉ　）異常に反復したＤＮＡ断片、この断片についてはまだ機能が 明らかにされていない。しかしそれはコントロール領域の中にあり、転写の開始 に働いているようである。

ＤＮＡ二重鎖標的 ５’　−ＡＡＡＡＴＡＡＡＡＴＡＡＡＡＴＡＡＡＡＴＡＡＡＡＴＡＡＡＡＴ−３ ’３’　−ＴＴＴＴＡＴＴＴＴＡＴＴＴＴＡＴＴＴＴＡＴＴＴＴＡＴＴＴＴＡ− ５’並行の合成オリゴヌクレオチド配列 ５’　−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３ ’　（ＧＳＴ　３　ｐａｒ）逆並行の合成オリゴヌクレオチド配列 ３’　−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−５ ’　（ＧＳＴ　３　ａｎｔｉ　）実施例９ ）ＩＭＧＣｏＡリダクターゼ遺伝子 ＨＭＧＣｏＡリダクターゼはコレステロールの生合成の律速段階をきめる酵素で ある。その分子遺伝子はコレステロールの合成の調節を理解するために研究され てきた。示した合成オリゴヌクレオチドはＨＭＧＣｏＡの転写を調整することに よってコレステロール合成のプログラムに影響する。

Ａ、標的部位：この標的はコレステロールによる転写の最終産物阻害を仲介する と思われる抑制蛋白の結合部位である。

合成オリゴヌクレオチドは細胞のもつ抑制因子のアゴニストのようなＨＭＧＣｏ Ａ発現の合成抑制剤である。

ＤＮＡ二重鎖標的 ３’　−ＣＣＡＣＴＣＴＣＴＡＣＣＡＣＧＣＣＡＣＧＧＧＣＡＡＧＡＧＧＣＧＧ Ｇ−５並行の合成オリゴヌクレオチド配列 ３’　−ＧＧＴＧＴＧＴＧＴＴＧＧＴＧＧＧＧＴＧＧＧＧＧＴＴＧＴＧＧＧＧＧ Ｇ−５’　（ＨＭＧＣＯＡ　１　ｐａｒ）逆並行の合成オリゴヌクレオチド配列 ５’　−ＧＧＴＧＴＧＴＧＴＴＧＧＴＧＧＧＧＴＧＧＧＧＧＴＴＧＴＧＧＧＧＧ Ｇ−３’　（ｌ（ＭＧＣＯＡ　１　ａｎｔｉ　）Ｂ、標的部位二二の標的はｌ（ ＭＧＣｏＡの転写を活性化すると思われる蛋白の結合部位である。この部位に対 する合成オリゴヌトとしてＨＭＧＣｏＡ発現の合成抑制剤である。

ＤＮＡ二重鎖標的 ３’　−ＣＣＣＡＣＧＣＴＣＧＴＣＡＣＣＣＧＣＣＡＡＣＡＡＴ丁ＣＣＧＣＴ− ５’並行の合成オリゴヌクレオチド配列 ５’　−ＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴＧＴＧＧＧＧＧＧＴＴＧＴＴＴＴＧＧＧＧＴ− ３’　（ＨＭＧＣＯＡ　２　ｐａｒ）逆並行の合成オリゴヌクレオチド配列 ３’　−ＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴＧＴＧＧＧＧＧＧＴＴＧＴＴＴＴＧＧＧＧＴ− ５’　（ＨＭＧＣＯＡ　２　ａｎｔｉ　）Ｃ０標的部位二二の標的はｒ丁ＡＴＡ ボックスノ領域に結合することによってＨＭＧＣｏＡの転写を活性化すると思わ れる蛋白に対する結合部位である。この部位に対するＴＰＯはＴＡＴＡボックス 標的に結合する細胞性蛋白のアンタゴニストとしてＨＭＧＣｏＡ発現の合成抑制 剤であるようにデザインされている。

ＤＮＡ二重鎖標的 ３’　−ＴＣＣＧＣＴＡＧＣＣＴＧＣＴＡＧＧＡＡＡＧＡＡＴＡＡＣＣＧＣＣＧ ＧＧＡ−５’並行の合成オリゴヌクレオチド配列 ３’　−ＴＧＧＧＧＴＴＧＧＧＴＧＧＴＴＧＧＴＴＴＧＴＴＴＴＴＧＧＧＧＧＧ ＧＧＴ−５’（ＨＭＧＣＯＡ　３　ｐａｒ） 逆並行の合成オリゴヌクレオチド配列 ５’　−ＴＧＧＧＧＴＴＧＧＧＴＧＧＴＴＧＧＴＴＴＧＴＴＴＴＴＧＧＧＧＧＧ ＧＧＴ−３’（ＨＭＧＣＯＡ　３　ａｎｔ　ｉ　） 実施例１Ｏ 神経成長因子受容体（ＮＧＦＲ） ＮＧＦＲ遺伝子は神経細胞の増殖に必要な細胞表相受容体をコードしている。神 経芽細胞腫やメラノーマで過剰発現される。

二重鎖のオリゴヌクレオチドはそのようなガン性の組織の増殖を抑制するように デザインされている。この遺伝子の活性化は神経細胞の再生を活性化する予備条 件である。ｍＲＮＡの出発点はこの番号づけで−１２２にある。

Ａ、標的部位：コンセンサスＳｐｌ結合部位ＤＮＡ二重鎖標的 ３’　−ＣＣＣＴＴＧＡＣＣＣＡＴＧＧＴＣＣＣＧＣＣＣＴＡＣＣＣＡＣＴＣＴ ＣＣ〜５′並行の合成オリゴヌクレオチド配列 ５’　−ＧＧＧＴＴＧＴＧＧＧＴＴＧＧＴＧＧＧＧＧＧＧＴＴＧＧＧＴＧＴＧＴ ＧＧ−３’　（ＮＧＦＲｌ　ｐａｒ）逆並行の合成オリゴヌクレオチド配列 ３’　−ＧＧＧＴＴＧＴＧＧＧＴＴＧＧＴＧＧＧＧＧＧＧＴＴＧＧＧＴＧＴＧＴ ＧＧ−５’　（ＮＧＦＲｌ　ａｐ）Ｂ、標的部位：コンセンサスＳＰＩ結合部位 ＤＮＡ二重鎖標的 ３’　−ＴＣＣＣＧＣＣＣＴＡＣＣＣＡＣＴＣＴＣＣＧＡＧＡＴＴＣＣＣＴＧＴ ＴＣＣ−５’並行の合成オリゴヌクレオチド配列 ５’　−ＴＧＧＧＧＧＧＧＴＴＧＧＧＴＧＴＧＴＧＧＧＴＧＴＴＴＧＧＧＴＧＴ ＴＧＧ−３’（ＮＧＦＲ２ｐａｒ） 逆並行の合成オリゴヌクレオチド配列 ３’　−ＴＧＧＧＧＧＧＧＴＴＧＧＧＴＧＴＧＴＧＧＧＴＧＴＴＴＧＧＧＴＧＴ ＴＧＧ−５’（ＮＧＦＲ２ａｎｔｉ） Ｃ０標的部位：コンセンサスＳＰＩ結合部位に隣接した領域ＤＮＡ二重鎖標的 ３’　−ＴＴＣＣＣＴＧＴＴＣＣＧＴＣＣＣＴＣＴＴＣＧＣＧＴＧＣＣＣＡＣＧ ＣＣＣＴＴ−５’並行の合成オリゴヌクレオチド配列 ５’　−ＴＴＧＧＧＴＧＴＴＧＧＧＴＧＧＧＴＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＧＴＧＧ ＧＧＧＴＴ−３’（ＮＧＦＲ３ｐａｒ） 逆並行の合成オリゴヌクレオチド配列 ３’　−ＴＴＧＧＧＴＧＴＴＧＧＧＴＧＧＧＴＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＧＴＧＧ ＧＧＧＧＴＴ−５’（ＮＧＦＲ３ａｎｔｉ） Ｄ、標的部位：コンセンサスＳＰＩ結合部位に隣接した領域ＤＮＡ二重鎖標的 ３’　−ＧＧＧＡＧＧＧＡＡＡＣＧＧＡＧＡＣＧＡＡＧＧＧＴＧＧＧＧ−５’並 行の合成オリゴヌクレオチド配列 ５’　−ＧＧＧＴＧＧＧＴＴＴＧＧＧＴＧＴＧＧＴＴＧＧＧＴＧＧＧＧ−３’　 （ＮＧＦＲ４ｐａｒ）逆並行の合成オリゴヌクレオチド配列 ３’　−ＧＧＧＴＧＧＧＴＴＴＧＧＧＴＧＴＧＧＴＴＧＧＧＴＧＧＧＧ−５’　 （ＮＧＦＲ４ａｎｔｉ　）標的部位：コンセンサスＳＰＩ結合部位ＤＮＡ二重鎖 標的 ３’　−ＣＣＣＣＣＡＣＣＣＧＣＣＣＧＡＣＣＧＣＣＣＣＧＣＣＴＣＣＧＣＣＣ Ｃ（１ニ一５’並行の合成オリゴヌクレオチド配列 ５’　−ＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧＧＧ ＧＧ−３’（ＮＧＦＲ５ｐａｒ） 逆並行の合成オリゴヌクレオチド配列 ３’　−ＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧＧＧＧ ＧＧ−５’（ＮＧＦＲ５ａｎｔ　ｉ　） 実施例１１ ヘルペス・シンプレックスウィルス１：ＤＮＡポリメラーゼとＤＮＡ結合蛋白 ＨＳＶ−１はいろいろな皮膚障害やその他の感染に関係している。その二重鎖オ リゴヌクレオチドはウィルスのＤＮＡポリメラーゼやＤＮＡ結合蛋白をコードし ている遺伝子のプロモータ領域に直接結合し、それによってウィルスの復製を抑 制するようにデザインされている。両方の遺伝子は地図上０．４単位号づけは各 遺伝子に対するポリペプチドの開始部位によっている。

Ａ、標的部位：　ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の５′側隣接配列である。アンジェ ロッテイ鎖は鎖１７に関して３つの塩基変化がある。

（１）鎖１７ ＤＮＡ二重鎖標的 ３’　−ＡＡＡＡＡＧＡＧＡＡＧＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＴＧＴＡＡＧＧＧＧＡＧ ＡＡＡ−５’並行の合成オリゴヌクレオチド配列 ３’　−ＴＴＴ丁丁ＧＴＧＴＴＧＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧＴＧＴＧＧＧＧＧＧＴＧ ＴＴＴ−５’（Ｈ５ＶＰＯＬ１７ｐａｒ） 逆並行の合成オリゴヌクレオチド配列 ５’　−ＴＴＴＴＴＧＴＧＴＴＧＧＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧＴＧＴＧＧＧＧＧＧＴ ＧＴＴＴ−３’（Ｈ５ＶＰＯＬ１７ａｎｔｉ　） （２）アンジェロッティ鎖 ３’　−ＡＡＡＡＡＧＡＧＡＡＧＧＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＴＧＴＡＧＧＧＧＧＧ ＡＧＡＡＡ−５’並行の合成オリゴヌクレオチド配列 ３′−Ｔ丁ＴＴＴＧＴＧＴＴＧＧＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧＴＧＴＴＧＧＧＧＧＧＴ ＧＴＴＴ−５’（Ｈ５ＶＰＯＬ　１　ｐａｒ） 逆並行の合成オリゴヌクレオチド配列 ５−ＴＴＴＴＴ　ＧＴＧＴＴＧＧＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧＴＧＴＴＧＧＧＧＧＧＴ 　ＧＴＴＴ−３’（Ｈ５ＶＰＯＬ　１　ａｎｔｉ　） Ａ、標的部位二二の部位は鎖１７に対するＤＮＡ結合蛋白遺伝子の５′側隣接配 列にある。

３’　−ＴＴ丁ＴＡＧＧＣＣＣＣＣＣＣＣＣＧＣＣＧＣＴＧ（１：ＣＡＧＴＴＣ ＣＣＣＴＣＣ（１ニ一５’並行の合成オリゴヌクレオチド配列 ５’　−ＴＴＴＴＴＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＴＴＧＧＧ ＧＴＧＧＧ−３’（）ＩｓＶＰＯＬ　２　ｐａｒ） 逆並行の合成オリゴヌクレオチド配列 ３′−丁子Ｔ丁ＴＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＴＴＧＧＧＧ ＴＧＧＧ−５’（Ｈ５ＶＰＯＬ　２　ａｎｔｉ　） 実施例１２ ヘルペス・シンプレックスウィルス１：複製起点Ｈ５Ｖ−１はいろいろな皮膚損 傷やその他の感染に関与している。三重鎖オリゴヌクレオチドは二種のＨＳＶ− Ｉ　ＤＮＡの複製起点に直接結合し、それによってウィルスの複製が抑えられる ようにデザインされている。第一の起点（ｏｒｉＬ）は遺伝子地図上０．４単位 にあり、ＨＳＶ−Ｉ　ＤＮＡポリメラーゼとＤＮＡ結合蛋白遺伝子の間にすぐ隣 接して存在している。第二のタイプの２つの同じ起点（ｏｒｉｓ）は０．８２と ０．９２地図単位のところにある６以下の番号は各起点の２つの折りたたまれた 対称軸に関してつけられた位置を表わす。

Ａ、標的部位：　ｏｒｉＬ起点 １、ＤＮＡ二重鎖標的 ３’　−ＴＴＴＴＴＴＴＣＡＣＴＣＴＴＧＣＧＣＴＴＣＧＣＡＡＧＣＧＴＧＡＡ ＡＣＡＧＧＡ−５’並行の合成オリゴヌクレオチド配列 ５’　−ＴＴＴＴＴＴＴＧＴＧＴＧＴＴＧＧＧＧＴＴＧＧＧＴＴＧＧＧＴＧＴＴ ＴＧＴＧＧＴ−３’（）ＩＳＶＯＲＬ　１　ｐａｒ） 逆並行の合成オリゴヌクレオチド配列 ３’　−ＴＴＴＴＴＴＴＧＴＧＴＧＴＴＧＧＧＧＴＴＧＧＧＴＴＧＧＧＴＧＴＴ ＴＧＴＧＧＴ−５’（ＨＳＶＯＲＬ　１　ａｎｔｉ　） ２、　ＤＮＡ二重鎖標的 ３’　−ＴＣＣＴＣＴＴＴＣＴＣＧＣＴＴＧＣＧＡＡＧＣＧＣＡＡＧＡＧＴＧＡ ＡＡＡＡＡＡ−５’並行の合成オリゴヌクレオチド配列 ３’　−ＴＧＧＴＧＴＴＴＧＴＧＧＧＴＴＧＧＧＴＴＧＧＧＧＴＴＧＴＧＴＧＴ ＴＴＴＴＴＴ−５’（ＨＳＶＯＲＬ　２　ｐａｒ） 逆並行の合成オリゴヌクレオチド配列 ５’　−ＴＧＧＴＧＴＴＴＧＴＧＧＧＴＴＧＧＧＴＴＧＧＧＧＴＴＧＴＧＴＧＴ ＴＴＴＴＴＴ−３’（ＨＳＶＯＲＬ　２　ａｎｔｉ　） これら二つの標的部位は□ｒｉＬ起点の中にある。ｏｒｉＬはまたＨＳＶ−Ｉ　 ＤＮＡポリメラーゼの５′側の隣接した領域とＨＳＶ−１の主要なりＮＡ結合蛋 白に関係しているからこれらの三重鎖オリゴヌクレオチドはそれら２つの遺伝子 の転写を妨害するだろう。

Ｂ、標的部位　ｏｒｉｓ起点 ＤＮＡ二重鎖標的 ３’　−ＴＴＣＣＣＣＣＧＣＣＣＣＧＧＣＧＧＣＣＣＡＴＴＴＴＣＴＴＣＡＣＴ ＣＴＴ−５’並行の合成オリゴヌクレオチド配列 ５’　−ＴＴＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＴＴＴＴＴＧＴＴＧＴＧＴ ＧＴＴ−３’（Ｈ５ＶＯＲ５１ｐａｒ） 逆並行の合成オリゴヌクレオチド配列 ３′−丁ＴＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＴＴＴＴＴＧＴＴＧＴＧＴＧ ＴＴ−５’（Ｈ５ＶＯＲ５１ａｎｔｉ　） 実施例１３ ヒトのβ−グロビン β−グロビン遺伝子は成熟したヘモグロビンに関する蛋白の一つをコードしてい る。この遺伝子における変異はβ−サラセミア症や鎌状赤血球貧血症に関与して いる。この遺伝子に向けられる三重鎖のオリゴヌクレオチドはサラセミア症患者 や鎌状赤血球貧血患者のβ−グロビン遺伝子を阻害し自然に存在するデルタ蛋白 で置きかえられるようにデザインされている。２種の三重鎖オリゴヌクレオチド ＴＰＯが記されているがそれらは５′エンハンサ−あるいはプロモータをコード している領域に向けられている。番号づけは主要のｍＲＮＡの出発部位に関して いる。

Ａ、ＤＮＡ二重鎖標的 ３’　−ＧＧＡＡＡＡＧＧＧＧＡＧＧＡＴＧＧＧＧＡ丁ＧＡＡＡＧＡ−５’並行 の合成オリゴヌクレオチド配列 ３’　−ＧＧＴＴＴＴＧＧＧＧＴＧＧＴＴＧＧＧＧＴＴＧＴＴＴＧＴ−５’　（ ＧＬ　１　ｐａｒ）逆並行の合成オリゴヌクレオチド配列 ５’　−ＧＧＴＴＴＴＧＧＧＧＴＧＧＴＴＧＧＧＧＴＴＧＴＴＴＧＴ−３’　（ ＧＬ　１　ａｎｔｉ）Ｂ、ＤＮＡ二重鎖標的 ３’　−ＴＣＣＴＣＧＴＣＣＣＴＣＣＣＧＴＣＣ：ＴＣＧＧＴＣＣＣＣＡＣＣ（ ：ＧＴＡＴＴＴＴＣ−５’並行の合成オリゴヌクレオチド配列 ５’　−ＴＧＧＴＧＧＴＧＧＧＴＧＧＧＧＴＧＧＴＧＧＧＴＧＧＧＧＴＧＧＧＧ ＴＴＴＴＴＴＧ−３’（ＧＬ　２　ｐａｒ） 逆並行の合成オリゴヌクレオチド配列 ３’　−ＴＧＧＴＧＧＴＧＧＧＴＧＧＧＧＴＧＧＴＧＧＧＴＧＧＧＧＴＧＧＧＧ ＴＴＴＴＴＴＧ−５’（ＧＬ　：２　ａｎｔｉ） Ｃ，ＤＮＡ二重ＩＲ標的 ３’　−ＴＣＣＣＧＡＣＣＣＧＴＡＴＴＴＴＣＡＧＴＣＣＣＧＴＣＴＣ−５’並 行の合成オリゴヌクレオチド配列 ５’　−ＴＧＧＧＧＴＧＧＧＧＴＴＴＴＴＴＧＴＧＴＧＧＧＧＴＧＴＧ−３’　 （ＧＬ　３　ｐａｒ）逆並行の合成オリゴヌクレオチド配列 ３’　−ＴＧＧＧＧＴＧＧＧＧＴＴＴＴＴＴＧＴＧＴＧＧＧＧＴＧＴＧ−５’　 （ＧＬ　３　ａｎｔｉ）Ｄ、ＤＮＡ二重鎖標的 ３’　−ＧＧＧＡＡＣＴＡＣＡＡＡＡＧＡＡＡＧＧＧＧＡＡＧＡＡＡＡＧＡ−５ ’並行の合成オリゴヌクレオチド配列 ３’　−ＧＧＧＴＴＧＴＴＧＴＴＴＴＧＴＴＴＧＧＧＧＴＴＧＴＴＴＴＧＴ−５ ’　（ＧＬ　４　ｐａｒ）逆並行の合成オリゴヌクレオチド配列 ５’　−ＧＧＧＴＴＧＴＴＧＴＴＴＴＧＴＴＴＧＧＧＧＴＴＧＴＴＴＴＧＴ−３ ’　（ＧＬ　４　ａｎｔｉ）Ｅ、ＤＮＡ二重鎖標的 ３’　−ＡＡＧＡＡＣＧＡＡＡＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＧ−５’並行 の合成オリゴヌクレオチド配列 ３’　−ＴＴＧＴＴＧＧＴＴＴＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＴＴＧＴＧＧ−５’　（ ＧＬ　５　ｐａｒ）逆並行の合成オリゴヌクレオチド配列 ５’　−ＴＴＧＴＴＧＧＴＴＴＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＴＴＧＴＧＧ−３’　（ ＧＬ　５　ａｎｔｉ）Ｆ、ＤＮＡ二重鎖標的 ３’　−ＧＡＧＧＧＡＴＧＡＡＡＴＡＡＡＡＧＡＡＡＡＴＡＡＡＡＡ−５’並行 の合成オリゴヌクレオチド配列 ３’　−ＧＴＧＧＧＴＴＧＴＴＴＴＴＴＴＴＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−５’　（ ＧＬ　５　ｐａｒ）逆並行の合成オリゴヌクレオチド配列 ５’　−ＧＴＧＧＧＴＴＧＴＴＴＴＴＴＴＴＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’　（ ＧＬ　６　ａｎｔｉ）実施例１４ 細胞においてオリゴヌクレオチドの結合の効果をテストする。三重鎖を形成する オリゴヌクレオチドの効果は細胞培養で研究されている。オリゴヌクレオチドが 培養ヒト細胞株に投与され、それからＤＮＡ標的に関係したオリゴヌクレオチド 取り込みとメツセンジャーＲＮＡの定常状態の量における変化を分析される。− 例としてＣ−＋ｎｙｃ遺伝子についての方法が示されている。この技術分野に通 じた者には培養細胞にあるどの遺伝子にも容易に一般化できるであろう。

固相支持体に成育したＨｅ１ａ細胞（全量がｔｏｏ／ｌＱ）を°“Ｐ標識したオ リゴヌクレオチドで処理し、時間と濃度の函数としてインキュベートした。遠心 分離で血清から細胞を分離し、完全に洗い、脱蛋白により細胞をこわし、そらか ら８％のシーフェンシング・ゲルで定量的に分析される。この分析法により次の ような特徴が出される。

ａ、ＨｅＬａ細胞に取り込まれたオリゴヌクレオチドの見かけの分配係数。

ｂ、　取り込み速度、すなわち、オリゴヌクレオチド取り込みに間して定常状態 に達するまでの時間。

Ｃ０血清中とＨｅＬａ細胞中とでのオリゴヌクレオチド分解に対する半値時間。

これらのデータから細胞のオリゴヌクレオチド処理に対する最適時間経過と滴定 範囲が決められる。

リボヌクレアーゼ防御法の変法によって転写の阻害を分析するがこれは哺乳動物 の細胞の定常状態にあるｍＲＮＡ量を定量する標準的な方法である。細胞の全Ｒ ＮＡがオリゴヌクレオチドで処理したＨｅＬａ細胞から抽出され、均一に標識さ れたアンチセンスＲＮＡ転写に対してハイブリダイズされる。これはｐＳＰＴ１ ９に入れたヒトのＣ−ｍｙｃのＳｍａ　Ｉ　−Ｐｖｕ　ＩＩ断片でＴ７ボリメラ ーゼの作用で行われる。

このＳｍａ　Ｉ　−Ｐｖｕ　ＩＩプローブははじめのｍｙｃエクソンとｍｙｃの Ｐｌ及びＰ２転写開始部位両方を含む配列に相補的である。

このプローブをｍｙｃ転写体に過剰にハイブリダイズすると、ＲＮａｓｅ　Ｉに よる限界消化で０．６ｋｂの二重鎖（ＰＬからの転写体で、ＨｅＬａ細胞では望 ましい起点である）がまたは０．４ｋｂの二重鎖（転写がＰ２から起こっており 、これは血清のなくなった状態でＨｅＬａ細胞に使われる）の何れかを生産する 。

生じるＲＮａｓｅに抵抗性のある複合体の大きさと量を５％アクリルアミドゲル 担体での定量的オートラジオグラフィーで測定される。この分析系は２０％以内 の精度で定常状態のＲＮＡ量を定量でき、それはこの分析の目的に十分である。

これらの細胞における滴定の結果は２つのコントロール実験の関係で分析される 。第一は標的の遺伝子に選択的に結合するオリゴヌクレオチドと無関係のオリゴ ヌクレオチドで添加量に対する応答を比較することである。もしＣ−ａｙｅ転写 のオリゴヌクレオチドによる抑制が細胞において部位特異的な三重鎖の形成によ るとすれば関係のないオリゴヌクレオチドは相応する濃度範囲において影響を示 さないだろう。

第二のコントロールはその効果が遺伝子特異性をもつかということである。ＲＮ アーゼ保護分析法ではデータは常に細胞内の全ＲＮＡ濃度に対して正常化されて いる。そのようにｍｙｃ転写における定常状態のレベルの変化はその生のままの 状態において意味をもっている。しかしオリゴヌクレオチドの結合効果がＣ−ｍ ｙｃ遺伝子に特異的であることを確かめるために、我々はｍｙｃ配列に対するよ うにＲＮＡ発現ベクターにクローン化した構築物から生じるＨ２Ａアンチセンス ＲＮＡに相補的なＲＮＡをプローブとしてＨｅＬａ細胞におけるヒストン２Ａ　 （Ｈ２Ａ）メツセージの定常状態量に及ぼすＣ−ｍｙｃ特異性オリゴヌクレオチ ド処理の影響も測定している。オリゴヌクレオチドの作用による抑制がｍｙｃ遺 伝子に特異的なときはＨｅＬａ細胞におけるＨ２Ａ転写は相当する濃度範囲にお いて影響を受けないだろう。

１から５０マイクロモルの濃度範囲でヒトのＣ−ｍｙｃ遺伝子の調節領域に結合 するオリゴヌクレオチドはＨｅＬａ細胞においてＣ−ｍｙｃ転写を選択的に抑制 する。実施例において記載した他のオリゴヌクレオチドを用いた予備的な研究に より同様な選択性が示されはじめている。

この技術分野に通じた者はこれらの方法を適用することがいかなる細胞株のいか なる遺伝子にも容易に普遍化され、りローン化された遺伝子構築物、ＤＮＡ配列 のデータ、当該の遺伝子の分子遺伝学の不完全な理解によってのみ限定されるこ とを認識するだろう。現在では、数百のヒトの遺伝子と数千の他の種の遺伝子に ついてその情報が利用できている。

大きな修正をすることなく３′及び５′末端に化学分子団を付加したものや改変 されたホスホジエステル骨格をもつオリゴヌクレオチドあるいはＧやＴ以外の塩 基（例えばヨード化したＧあるいはＸ）をもったオリゴヌクレオチドのような化 学的に改変されたオリゴヌクレオチド変異物を使うことにもこの方法が適用でき る。

結局、これらの例の重要性はあらゆる種類の一重鎖オリゴヌクレオチド分子がい かなる種類の外からの操作をすることなく容易に真核細胞によって取り込まれる ことを示すことである。この取込み機構は現在知られていないが、大抵の細胞で は効率よく、そして明らかにオリゴヌクレオチド配列に依存しない（Ｅｐｐｓｔ ｅｉｎ　Ｄ、Ａ、、　５ｃｈｒｙｖｅｒ　Ｂ、Ｂ、＆　Ｍａｒｓｈ　Ｙ、Ｖ。

（１９８６）　Ｊ、Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅＩｎ、２６１．５９９９）、それ故、最 も普遍的な意味においてそのようなオリゴヌクレオチドの全取り込み特性は他の 薬剤と大きくは変わっていない。この基準によって遺伝子の発現の過程に選択的 に挿入されるようにデザインされたオリゴヌクレオチド　リガンドは生きている 細胞で薬理的な効果を示すであろうことは確かである。

過去においてこれらの細胞の取り込み概念はインターフェロンによる治療の効果 （Ｅｐｐｓｔｅｉｎ　Ｄ、Ａ、、　５ｃｈｒｙｖｅｒ　Ｂ、Ｂ、＆Ｍａｒｓｈ　 Ｙ、Ｖ、（１９８６）　Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２６１．５９９９）や細 胞でのｍＲＮＡの加工を選択的に阻害する「アンチセンス」あるいは「アンチス プライス結合」オリゴヌクレオチドの能力の効果（Ｈｅｉｋｋｉｌｅ　Ｒ，ｅｔ 　ａｌ、（１９８７）　Ｎａｔｕｒｅ　３２８．４４５やＥｐｐｓｔｅｉｎＤ、 Ａ、５ｃｈｒｙｖｅｒ　Ｂ、Ｂ、＆　Ｍａｒｓｈ　Ｙ、Ｖ、（１９８６）　Ｊ、 Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、２６１゜５９９９）を高める薬剤としてのＲＮＡオリゴ ヌクレオチドの効果を説明するために使われてきた。同じ取り込み過程が転写の 開始を選択的に制御し、あるいは標的の遺伝子を選択的に破壊するための薬剤と しての三重鎖を作るオリゴヌクレオチドを使うことの基盤となっているようであ る。

ここにのべられたデザインの方法は目的とする二重鎖ＤＮＡ標的に選択的に結合 するであろう合成りＮＡオリゴヌクレオチドをデザインするのにも使われる。得 られるオリゴヌクレオチド−二重鎖複合体は並行直鎖の三重鎖として最もよく言 い表わされている。三重鎖においてはそのオリゴヌクレオチド分子は二重鎖の主 要溝を占拠している。この複合体は主要溝の表面にワトソン・クリック対形成を 残した塩基−塩基の水素結合によって安定化している。結果として合成オリゴヌ クレオチドの安定性と部位特異性はホスホジエステル結合の修飾あるいはオリゴ ヌクレオチド末端の化学的修飾によって大きくは影響されない。従って、これら オリゴヌクレオチドは化学的に修飾することができ全体としての結合の安定性を 高め、オリゴヌクレオチドの細胞に取り込まれる速度を高め、分子に対して化学 的反応性を賦与することができる。

二二に示したデザイン法に基づいて、真核細胞に容易に取り込まれ、−皮細胞に 入れば染色体の中にある特定の部位を標的にしうるオリゴヌクレオチドをデザイ ンすることができる。現在のところ、部位特異性や合成オリゴヌクレオチド−標 的部位間の相互作用の安定性は現行のモノクローナル抗体−抗原結合の相互作用 と同等によいものである。

この新しい種類の部位特異分子は遺伝子に特異的になるようにして転写の作用を 調節する能力をもった遺伝子特異的試薬として使うことができる。この調整は体 細胞性の遺伝子でも宿主細胞を感染させるウィルスの遺伝子でも効果がある。

合成オリゴヌクレオチドが反応性の化学分子団に適当に結合するどき当該の標的 遺伝子を選択的に破壊することのできる能力をもった複合分子を創出することが できる。

この技術に通じる者は本発明がその目的を実行させ、ここに述べられた目的と利 点を達せしめるために適用されることを容易に認めるであろう。ここに述べたオ リゴヌクレオチド、化合物、方法、手段、技法等は選んだ実施例の代表的なもの として示したもので例示したつもりであり、この目的とするところを限定するつ もりではない。この発明の精神の中に包含され、あるいは添付した特許請求項の 目指すところによって規定されるような変更や他の用途はこの技術分野に精通し た者にとって行うことができよう。

並行 ３’４−−−−−−−＋＋−＋＋−５“逆並行 ３“φ−−−−−−−−−−−−　５゜ＩＧ　ｌＢ Ｆ／Ｇ４Ａ　Ｆ２Ｏ，４８Ｆ／Ｇ４ＣＦ／Ｇ４ＤＦ／６６ Ｆ／６７ ５．０　２．５　＋、２５　５．０　２．５・　１．２５マイクログラム／スロ ツト　マイクログラム／スロット４時間　４時間 ＦＩＧ８Ａ　ＦＩ６８Ｂ 国際調査報告 一＋−−峙＾−””　Ｈ４ＫＴ八ＪＳ８９１０５７６９−射峙−ｍ−＾−―ｕ− １軸訂Ａ＋＊Ｑ１０５７６９ＫＴ／ＵＳ８９１０５７６９ Ｖｌ、０ＢＳＥＲＶＡ”ｒ’ｍＳ　Ｗ）ｅ：　ＩＪＮｒｒＹ　ＯＦ　ＩＮＶＥＮ ｎＯＮ　Ｉｓ　ＬＡ（ＸＩＮＧｌ）　Ｃｌａｉｍｓ　１−２０　ｅｎｔａｉｌ　 ａ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ｍａｋｉｎｇ　ａｎ　ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄ ｅ。

ａｎ　ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ、　ａｎｄ　ａ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　 ｔｒａａｔｉｎｇ　ｃａｎｃｅｒ、　ｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ@１ｎ ５１４／８０．５１４／４４．　ａｒｘｉ　５３６／２７　ａｎｏｎｇ　０ｔｈ ｅｒｓ。

２）　Ｃ１ａｉ＋ｕ　２１−２４：　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ　ｔｒａａｔｍｅｎ ｔ、　ｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ　ｉｎ　５３６／２７゜９３５／３３．５１４／４ ４．　ａｎｄ　４２４／４０５゜３）　Ｃｌａｉｍｓ　２５−２７：ｅｐｉｄｅ ＋ｗｉｌ　ｔｉｓｓｕｅ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ、　ｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ　１ｎ ５１４／４４　ａｎｄ　５１４／９５０゜４）　Ｃ１ａｉ＋ｕｓ　２８−２９： 　ｇｅｎｅ　ｔｒａａｔ＋ｒｉａｎｔ、　ｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ　ｉｎ　９３５ ／３３　ａｎｄ５１４７４４゜ ５）　ＣＬａ１ｍ５３０−３１；　ｍｅａｔ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ａｉｄｓ、 　ｃｌａｓｓｉｆｉａｉ　ｉｎ　１７／２５゜９３５／３３　ａｒｘｌ　５１４ ／４４゜６）　ＣＬａ１ｒｎｓ　３２−３３：　１ｎｔａｒｌｕｋａｎ　ｒｅｃ ＋ａｐｔｏｒ　ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ、　ｃｌａｓｓｉｆｉｅｄｉｎ　９３ ５／３３　ａｎｄ　５１４／４４゜７）　Ｃｌａｉｍｓ　３４−３５：　＋ｎｅ ｔｈｃｘｌ　ｏｆ　ｔｒａａｔｉｎｇ　Ａｌｚｈｅｉ＋ｒｉｅｒｓ　ｄｉｓａａ ｓｅ。

ｃｈｉｓｓｉｆｉｅｄ　ｉｎ　９３５／３３　ａｒｘｌ　５１４／４４゜８）　 Ｃｌａｉｍｓ　３６−３７：　ｍｅｔｈｘｌ　ｏｆ　ａｆｆｅｃｔｉｎｇ　ｔｈ ｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆｅｐｉｄｅｒ＋ｒａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃ ｔｏｒ、　ｃｌａｓｓｉｆｉｅｄｉｎ　９３５／３３　ａｒｗｉ５１４Ａ４゜９ ）　Ｃ１ａｉｃｎｓ　３８−３９：　ｒｒｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ｒｅｐｒｅｓｓｉ ｎｇ　ｔｈｅ　ｆｕｒｃｔｉｏｎ　ｏｆＧｓＴｐｉ　ｇｅｎｅ、　ｅｌＡｓｓｉ ｆｉｅｄ　ｉｎ　９３５／３３　ａｒｘｉ　５１４／４４．１０）　Ｃｌａｉｍ ｓ　４Ｑ−４１：　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ａｆｆｅｃｔｉｎｇ　ｃｈｏｌｅｓｔ ｅｒｏｌ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ。

ｃＬａｓｓｉｆｉａｄ　ｉｎ　９３５／３３　ａｎｄ　５１４／４４゜１１）　 Ｃｌａｉｍｓ　４２−４３＋　ｍａｔｈｒｙｄ　ｏｆ　ａｆｆｅｃｔｉｎｇ　ｎ ｅｒｖｅ　ｇｒｃｗｔｈ、　ｃｌａｓｓｉｆｉａｉｉｎ　９３５／３３　ａｎｄ 　５１４／４４゜１２）　Ｃ１ａｉｒｒｖｓ　ｕ−４５：　ａｎｔｉｖｉｒａｌ 　ａｇｅｎｕ、　ｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ　ｉｎ　９３５／３３ルー５１４７４４ ゜ １３）　ＣＬａ１ＩＴＩｓ　４６−４７；　ｇＬｏｂｉｎ　ａｆｆｅｃｔｉｎｇ 　ａｇｅｎｔｓ、　ｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ　１ｎ５１４／８１５．９３５／３３ 　ａｎｄ　５１４／４４゜Ａｌｌ　ｏｆ　ｔｈａｓｅ　１ｎｖｅｎｔｉｏｎｓ　 ｐａｒｔａｉｎ　ｔｏ　ａ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　１ｎｖｅｎｔｉｏｎ。

Ｅａｃｈ　ｏｆ　ｔｈａ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｉｒ＋ｖｅｎｔｉｏｎｓ　ｆｏ ｒｍｓ　ａ　５ｅｐａｒａｔｅ　ｉｒ＋ｖｅｎｔｉｖｅｉｄｅｎｔｉｔｙ　ａｎ ｄ　ｒｅｑｕｉｒａｓ　ａ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　５ａａｘｈ　ｏｆ　ｔｂｅ　 ｐａｔｅｎｔ　ｃｌａｓｓｅｓａｓ　ｗａｌｌ　ａｓ　ａ　５ｅｐａｒａｔｅ　 ５ｅａｒｃｈ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｇｅｎｂａｎｋ　ａｎｄ　ＤＩ３Ｌ　ｄａｔａｂ ａｓｅｓ。

Claims (47)

【特許請求の範囲】
1. １．１）染色体の二重鎖ＤＮＡを探索し、少くとも約６５％のプリン塩基または 少くとも約６５％のピリミジン塩基をもつ約２０ヌクレオチド以上の配列をもっ たヌクレオチド標的配列を同定し、 ２）その同定された標的配列に相補的でＤＮＡ二重鎖において相補する場所がＧ Ｃ塩基対であるときはＧを、ＤＮＡ二重鎖において相補する場所がＡＴ塩基対で あるときはＴを含むような合成オリゴヌクレオチドを合成する；というステップ を含む二重鎖ＤＮＡの標的配列に結合して、その主要溝に結合することによって 並行直鎖状の三重鎖を形成する合成オリゴヌクレオチドを製造する方法。
2. ２．合成オリゴヌクレオチドが少くとも約６５％のプリン鎖に対して３′から５ ′へ向けて逆並行に結合するオリゴヌクレオチド及び少くとも約６５％のプリン 鎖に対して５′から３′へ向けて並行に結合するオリゴヌクレオチドからなる群 から選ばれた請求項１の方法。
3. ３．標的配列が少くとも約６５％はプリン塩基であるかまたは少くとも約６５％ がピリミジン塩基であるとき二重鎖ＤＮＡにある標的配列と並行直鎖状の三重鎖 を形成し、少くとも約２０オリゴヌクレオチドの配列をもち、そのヌクレオチド 配列がＧ及びＴを含み、その場合Ｇは二重鎖ＤＮＡにある相補部位がＧＣ塩基対 であるときに使われ、また二重鎖ＤＮＡにある相補部位がＡＴ塩基対であるとき はＴが使われるようなヌクレオチド配列であり、また、その配列が二重鎖ＤＮＡ 標的配列にある少くとも約６５％のプリン鎖に対して３′から５′に向けて逆並 行に結合するオリゴヌクレオチド及び二重鎖ＤＮＡ標的配列にある少くとも約６ ５％のプリン鎖に対して５′から３′に向けて並行に結合するオリゴヌクレオチ ドから選択される；ような合成オリゴヌクレオチド。
4. ４．少くとも１つのＴがＸ，Ｘのハロゲン誘導体、Ｉ及びＩのハロゲン誘導体か ら成る群から選ばれた化合物で置き換えられている請求項３の合成オリゴヌクレ オチド。
5. ５．少くとも１つのＧがＧのハロゲン誘導体で置き換えた請求項３の合成オリゴ ヌクレオチド。
6. ６．少くとも１つの塩基が電荷をもたないバルキーな基で２′−フラノース位が 置換されている請求項３の合成オリゴヌクレオチド。
7. ７．非荷電のバルキーな基が分岐アルキル、糖及び分岐糖の中から選ばれる請求 項６の合成オリゴヌクレオチド。
8. ８．骨格が細胞性のヌクレアーゼで容易には分解されないホスホジエステル類縁 体であるような請求項３の合成オリゴヌクレオチド。
9. ９．ホスホジエステル類縁体がホスホロチオエート、ホスホロセレノエート、メ チルホスフェート、ホスホラミダイト、ホスホトリエステル及び天然に存在する ホスホジエステルのα−エナンチオマーの群の中から選ばれる請求項８の合成オ リゴヌクレオチド。
10. １０．末端にリンカーを付けた請求項３の合成オリゴヌクレオオチド。
11. １１．リンカーが３′末端に付けられ、アルキル結合で塩基平面に結合した一級 アミンをもった塩基アナログ及びアルキル結合で塩基平面に結合したスルフヒド リル基をもった塩基アナログの中から選ばれる請求項１０の合成オリゴヌクレオ チド。
12. １２．リンカーが５′末端に付けられそれがアルキル結合で塩基平面に結合した 一級アミン基をもつ塩基アナログ及びアルキル結合で塩基平面に結合したスルフ ヒドリル基をもった塩基アナログ、オリゴヌクレオチドの５′−水酸基に直接結 合した長鎖アミン及びオリゴヌクレオチドの５′−水酸基に直接結合した長鎖の チオールから成る群の中から選ばれる請求項１０の合成オリゴヌクレオチド。
13. １３．修飾される基が二重鎖ＤＮＡに結合し、インターカレー、分子溝結合分子 、カチオン性アミン、カチオン性ポリペプチドからなる群から選ばれ、リンカー に結合できる装飾基をもった請求項１０，１１，１２の合成オリゴヌクレオチド 。
14. １４．修飾基がリンカーに結合しており、その修飾基が触媒性の酸化物、ナイト ロジェン・マスタード、アルキル化剤、光化学架橋剤、一重項酸素の光化学感作 剤及び直接光化学的損傷をおこす試薬から成る群の中から選ばれる請求項１０， １１，１２の合成オリゴヌクレオチド。
15. １５．一重項酸素の光化学感作剤がエオシン、メチレンブルー、アクリジンオレ ンジまたは９−アミノアクリジンである請求項１４の合成オリゴヌクレオチド。
16. １６．請求項１４の試薬がエチジウムあるいはピレン誘導体である請求項１４の 合成オリゴヌクレオチド。
17. １７．細胞の取り込みに対して十分量の請求項３の合成オリゴヌクレオチドを投 与し、標的の配列に結合させるステップを含み、その標的配列がＲＮＡ転写起点 に隣接したＤＮＡ領域の中に位置しているような細胞の増殖を抑制する方法。
18. １８．細胞がガン性の細胞で合成オリゴヌクレオチドがＣ−ｎｙｃ遺伝子に特異 的である請求項１７の方法。
19. １９． 【配列があります】 及びこれらの断片と類縁体からなる群の中から選ばれる合成オリゴヌクレオチド による請求項１８の方法。
20. ２０．オリゴヌクレオチドがリンカーや修飾基を含んでいる請求項１９の方法。
21. ２１．請求項３の合成オリゴヌクレオチドを細胞の取り込みにとって十分な量投 与し、ＲＮＡ転写起点に隣接する核酸領域にある配列を標的として結合させるよ うなステップを含む病原体の増殖を抑制する方法。
22. ２２．病原体がＨＩＶ−１ウイルスであり、合成オリゴヌクレオチドがウイルス のＬＴＲ領域にあるような請求項２１の方法。
23. ２３． 【配列があります】 及びこれらの断片、類縁体の中から合成オリゴヌクレオチドが選ばれる請求項２ ２の方法。
24. ２４．オリゴヌクレオチドがリンカーと修飾基を含んでいる請求項２３の方法。
25. ２５．請求項３の合成オリゴヌクレオチドを細胞の取り込みに十分な量を投与し 、標的配列に結合させるステップを含む上皮組織における構造蛋白含量を操作す る方法。
26. ２６．合成オリゴヌクレオチドが 【配列があります】 及びこれらの断片または類縁体から成る群から選ばれるコラーゲン遺伝子を抑制 するための請求項２５の方法。
27. ２７．合成オリゴヌクレオチドが 【配列があります】 及びこれらの断片または類縁体から成る群から選ばれるコラーゲン遺伝子を抑制 するための請求項２５の方法。
28. ２８．請求項１４の合成オリゴヌクリレオチドを細胞の取り込みに十分な量を投 与し、標的とする配列に結合させるステップを含む遺伝子の発現を永久に抑制す る方法。
29. ２９．合成オリゴヌクレオチドがエオシンイソチオシアネート、ブソラリン誘導 体、金属キレート、エチジウム及びピレン誘導体から成る群の中から選ばれる請 求項２８の方法。
30. ３０．請求項３の合成オリゴヌクレオチドを細胞の取り込みに十分な量を投与し 、標的とする配列に結合させるステップを含む食用動物の筋肉蛋白の性質を改良 する方法。
31. ３１．合成オリゴヌクレレオチドが 【配列があります】 及びその断片及び類線体から成る群から選ばれる請求項３０の方法。
32. ３２．請求項３の合成オリゴヌクレオチドを細胞の取り込みに十分な量を投与し 、標的の配列に結合させるステップを含むインターロイキン２アルファ鎖受容体 を抑制する方法。
33. ３３．合成オリゴヌクレオチドが 【配列があります】 及びそれらからの断片及び類縁体からなる群から選ばれるインターロイキン２ア ルファ鎖を抑制するための請求項３２の方法。
34. ３４．請求項３の合成オリゴヌクレオチドを細胞の取り込みに十分な量を投与し 、標的の配列に結合させるステップを含むアルツハイマー症のプラーク形成を抑 える方法。
35. ３５．合成オリゴヌクレオチドが 【配列があります】 及びそれらからの断片及び類線体から成る群から選ばれるアルツハイマー症にお けるプラーク形成を抑制するための請求項３４の方法。
36. ３６．請求項３の合成オリゴヌクレオチドを細胞の取り込みに十分な量投与し、 標的配列に結合させるステップを含む上皮細胞増殖因子遺伝子の発現を抑制する 方法。
37. ３７．合成ペプチドが 【配列があります】 及びこれらからの断片及び類線体から成る群から選ばれる上皮細胞増殖因子遺伝 子の発現を抑える請求項３６の方法。
38. ３８．請求項３の合成オリゴヌクレオチドを細胞の取り込みに十分な量投与し、 標的配列に結合させるステップを含むＧＳＴｐｉ遺伝子を抑制する方法。
39. ３９．合成オリゴヌクレオチドが 【配列があります】 及びこれらからの断片及び類縁体からなる群から選ばれるＧＳＴｐｉ遺伝子を抑 制するための請求項３８の方法。
40. ４０．請求項３の合成オリゴヌクレオチドを細胞の取り込みに十分な量を投与し 、標的配列に結合させるステップを含むＨＭＧＣｏＡの転写を調節することによ ってコレステロール合成のプログラムに干渉する方法。
41. ４１．合成オリゴヌクレオチドが 【配列があります】 及びこれらからの断片及び類縁体からなる群から選ばれるＨＭＧＣｏＡの転写を 調節するための請求項４０の方法。
42. ４２．請求項３の合成オリゴヌクレオチドを細胞の取り込みに十分な量を投与し 、標的配列に結合させるステップを含む神経成長因子受容体の発現を抑制する方 法。
43. ４３．合成オリゴヌクレオチドが 【配列があります】 及びこれらからの断片及び類縁体から選ばれる神経成長因子受容体をコードして いる遺伝子を抑制するための請求項４２の方法。
44. ４４．請求項３の合成オリゴヌクレオチドを細胞の取り込みに十分な量を投与し 、標的配列に結合させるステップを含むヘルベスシンプレックスウイルスＩの最 終複製をとめる方法。
45. ４５．合成オリゴヌクレオチドが 【配列があります】 【配列があります】 及びこれらからの断片及び類縁体からなる群から選ばれるウイルスの複製を阻止 する請求項４４の方法。
46. ４６．請求項３の合成オリゴヌクレオチドを細胞の取り込みに十分な量を投与し 、標的配列に結合させるステップを含むサラセミア症及び鎌型細胞性貧血でのベ ータグロビン遺伝子の合成を抑制する方法。
47. ４７．合成オリゴヌクレオチドが 【配列があります】 及びこれらからの断片及び類縁体からなる群から選択されるベータグロビン遺伝 子の合成を抑制するための請求項４６の方法。