ES2965461T3 - Inhibidor de CXCR4 para el tratamiento del cáncer - Google Patents

Inhibidor de CXCR4 para el tratamiento del cáncer Download PDF

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Abstract

Se divulga un método para tratar el cáncer en un sujeto. El método comprende administrar al sujeto: (i) una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente inhibidor que regula negativamente una cantidad de un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en BCL-2, MCL-1 y ciclina D1; y (ii) una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente de unión a CXCR4 que aumenta la expresión de mi R-15a y/o 16-1, tratando así el cáncer. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Inhibidor de CXCR4 para el tratamiento del cáncer
Campo y antecedentes de la invención
La presente invención, en algunas realizaciones de la misma, se refiere a agentes de unión a CXCR4 que regulan por aumento miR-15a y miR-16-1, y a usos de los mismos, tal como se expresa en las reivindicaciones.
CXCR4 es un receptor acoplado a proteína G que participa en la actividad de las quimiocinas CXC. Hasta ahora, su único ligando afín identificado es CXCL12, también conocido como factor 1 derivado de células estromales (SDF-1). CXCR4 desempeña un papel importante en el desarrollo de los mamíferos, participando en la migración y motilidad de tejidos y células madre y progenitoras hematopoyéticas. Los ratones defectivos tanto en CXCR4 como en SDF-1 muestran letalidad embrionaria con fenotipos esencialmente idénticos que implican malformaciones tisulares y vasculares, lo que avala la hipótesis de que CXCR4 es el receptor clave para la actividad de SDF-1 (CXCR7 es un segundo receptor conocido de SDF-1). CXCR4 continúa expresándose ampliamente en el adulto, con niveles elevados detectados en células madre y progenitoras de la médula ósea, varios linfocitos circulantes (linfocitos B, linfocitos T activados), así como células precursoras endoteliales y macrófagos y fibroblastos tisulares.
Es probable que CXCR4 desempeñe un papel pleiotrópico en el cáncer humano. Su expresión está regulada por aumento en muchos tipos de tumores, incluidos cánceres de mama, de pulmón, de colon, de páncreas, de cerebro, de próstata, de ovarios, así como cánceres hematopoyéticos. Algunos informes bibliográficos sugieren que SDF-1 puede actuar a través de CXCR4 como factor de crecimiento y/o supervivencia para algunos tumores. En modelos de cáncer metastásico, se demostró que los tumores positivos para CXCR4 metastatizan a sitios distantes y esta actividad fue inhibida por agentes que silencian el gen CXCR4 o anticuerpos que bloquean CXCR4 o SDF-1. De acuerdo con esta visión, muchos sitios comunes de metástasis en el cáncer humano, tal como de médula ósea, pulmón, ganglios linfáticos e hígado, expresan niveles altos de SDF-1. CXCR4 se expresa en subpoblaciones de muchos tumores similares a células madre o que inician tumores y puede participar en la capacidad de estas células para apoyar la recurrencia y la diseminación metastásica de los cánceres. Asimismo, CXCR4 se expresa en células precursoras endoteliales (CPE) y su actividad es necesaria para la incorporación de CPE en vasos funcionales durante la angiogénesis. Esto puede hacer una contribución significativa a la vascularización y supervivencia de los tumores. La señalización de CXCR4 también puede conducir a la inducción de citocinas proangiogénicas (por ejemplo, VEGF), así como integrinas, moléculas de adhesión y enzimas que degradan la matriz que pueden participar en la invasión de células tumorales. Por último, la expresión de CXCR4 se detecta en linfocitos y fibroblastos que se infiltran en tumores, así como macrófagos asociados a tumores. Estas células tienden a suprimir el reconocimiento inmunológico y el ataque al tumor, y remodelan el microambiente del tumor para estimular el crecimiento y la metástasis del tumor.
Las múltiples funciones de CXCR4 en el crecimiento, vascularización y metástasis tumoral, y su amplia expresión en muchos tipos de tumores comunes, hacen de este receptor un objetivo atractivo para la intervención terapéutica utilizando agentes inhibidores.
4F-benzoil-TN 14003 (también conocido como BKT140, en adelante BL-8040), es un péptido sintético bioestable de 14 restos de SEQ ID NO:14 desarrollado como un antagonista específico de CXCR4. Se ha demostrado que BL-8040 se une al receptor CXCR4 con alta afinidad y una ocupación prolongada del receptor. Se descubrió que BL-8040 es tóxico contra varios tumores, tales como la leucemia mieloide, tumores hematopoyéticos y cáncer de pulmón no microcítico (solicitud de patente internacional n.° IL2014/050939 y publicación de solicitud de patente internacional n.° WO2013/16089556053 y documento WO2008/075370).
La solicitud de patente de Estados Unidos n.° 20070238115 enseña el uso de CXCL12 para el tratamiento del carcinoma.
La solicitud de patente de Estados Unidos n.° 20130281423 enseña el uso de inhibidores de CXCL12 para reducir la resistencia de una célula tumoral a un agente quimioterapéutico.
Singhet al.,Mol Cancer Ther January 20098; 178-184 enseña gp120-IIIB para el tratamiento del cáncer de próstata.
Danilov, A. V.,et al.,(2013). Expert Review of Anticancer Therapy, 13(9), 1009-1012 enseña el uso de plerixafor en combinación con inhibidores de BC1-2 para el tratamiento de la leucemia linfocítica crónica (LLC).
Sumario de la invención
Según un aspecto de algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona una cantidad terapéuticamente eficaz de SEQ ID NO: 14 para su uso a la hora de hacer que un sujeto resistente al antagonista de BC1-2 sea más susceptible al tratamiento con un antagonista de BC1-2, en donde dicho sujeto padece cáncer y en donde la SEQ ID NO: 14 aumenta la expresión de miR-15a en las células de dicho cáncer y en donde dicho antagonista de BCL-2 se selecciona del grupo que consiste en Oblimersen, SPC-2996, RTA-402, Gossypol, AT-101, mesilato de Obatoclax, A371191, A-385358, A-438744, ABT-737, ABT-199, AT-101, BL-11, BL-193, GX-15-003, 2-metoxiantimicina A3, HA-14-1, KF-67544, purpurogalina, TP-TW-37, YC-137 y Z-24.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, el antagonista de BCl-2 es ABT-199.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, el cáncer se selecciona entre el grupo que consiste en un cáncer de mama, neuroblastoma, retinoblastoma, cáncer de vejiga, carcinoma esofágico, sarcomas, cáncer colorrectal, melanoma, adenoma de paratiroides y cáncer de mama.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, el cáncer hematológico se selecciona entre el grupo que consiste en neoplasias malignas hematológicas, se selecciona entre el grupo que consiste en leucemia mielógena crónica (LMC), fase acelerada de la LMC, o crisis de blastos, mieloma múltiple, síndrome hipereosinofílico (SHE)), síndrome mielodisplásico (SMD), leucemia linfocítica aguda (LLA), leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia promielocítica aguda (LPA), leucemia linfocítica crónica (LLC), leucemia neutrófila crónica (LNC), leucemia indiferenciada aguda (AUL), linfoma de células grandes anaplásicas (ALCL), leucemia prolinfocítica (PML), leucemia mielomonocítica juvenil (LMMJ), LLA de linfocitos T en el adulto, AML con mielodisplasia de tres linajes (AML/TMDS), leucemia de linaje mixto (LLM), trastornos mieloproliferativos (TMP), mieloma múltiple, (MM) y sarcoma mieloide.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, el cáncer es un cáncer hematológico.
Breve descripción de las diversas vistas de los dibujos
En el presente documento se describen algunas realizaciones de la invención, solo a modo de ejemplo, con referencia a los dibujos adjuntos. Con referencia específica ahora a los dibujos con detalle, se enfatiza que los detalles mostrados son a modo de ejemplo y con fines de análisis ilustrativo de las realizaciones de la invención. En este sentido, la descripción tomada junto con los dibujos hace evidente para los expertos en la materia cómo pueden ponerse en práctica realizaciones de la invención.
En los dibujos:
la figura 1A ilustra que la sobreexpresión de CXCR4 aumenta el nivel de pERK. Las células (células SKNBE, RPMI y PC3) se tiñeron con el clon 12G5 anti-CXCR4 humano conjugado con PE. La expresión de CXCR4 se midió en células SKNBE, RPMI y PC3 (gris oscuro) y en células modificadas genéticamente para sobreexpresar CXCR4 (línea gris claro) mediante análisis FACS. La sobreexpresión de CXCR4 indujo una elevación en el nivel de pERK en células SKNBE, PC3 y RPMI como se demuestra mediante transferencia Western. Las células se cultivaron con medio FCS RPMI al 1 % durante 24 horas. Los lisados de células completas se analizaron mediante transferencias Western y los niveles de pERK se detectaron y normalizaron con respecto a p-actina para garantizar una carga de proteína igual.
La figura 1B ilustra que la sobreexpresión de CXCR4 regula por aumento la expresión de miR-15a y miR-16-1. La expresión de miR-15a y miR-16-1 se evaluó mediante Rt -PCR en células SKNBE, RPMI y PC3 tras la sobreexpresión de CXCR4.
La figura 1C ilustra que la sobreexpresión de CXCR4 regula por disminución la expresión de ARNm del gen diana BCL-2 de miR-15a y miR-16-1 según se analiza mediante RT-PCR. En las células SKNBE, la sobreexpresión de CXCR4 reguló por disminución la expresión del ARNm de BCL-2. La sobreexpresión de CXCR4 reguló por disminución la expresión del ARNm de BCL-2 en células PC3. En células RPMI, la sobreexpresión de CXCR4 no reguló por disminución la expresión de BCL-2.
La figura 1D ilustra que la sobreexpresión de CXCR4 regula por disminución de la expresión de la proteína BCL-2 en células SKNBE, según se analiza mediante transferencia Western (WB) y por análisis FACS. Los lisados de células completas se analizaron mediante transferencias Western y se detectaron niveles de BCL-2 y se normalizaron con respecto a la detección de p-actina para confirmar una carga de proteína igual. La intensidad de fluorescencia media (IFM) de BCL-2 se evaluó mediante FACS después de la tinción intracelular de BCL-2 anti humano. La proteína BCL-2 se reguló por disminución después de la sobreexpresión de CXCR4 en células PC3, pero no cambió en células RPMI-8226 como se demostró mediante transferencia Western.
La figura 2D ilustra ese tratamiento de SKNBE con el agente de unión a CXCR4, BL8040, inhibe la señalización ERK, induciendo la expresión de miR-15a y reduciendo los niveles de expresión de BCL-2. El análisis de la expresión de pERK se realizó mediante transferencia Western (WB). Las células SKNBE se cultivaron con medio FCS RPMI al 1 % durante 24 horas, después de lo cual se añadió BL-8040 (20 uM) a las células durante 30 minutos o 2 horas. Los lisados de células completas se analizaron mediante WB y los niveles de pERK se detectaron y normalizaron con respecto a la p-actina para confirmar una carga proteica igual. El nivel de miR-15a y BCL-2 se evaluó mediante RT-PCR en células SKNBE después de una incubación de 24 horas en presencia de BL-8040 (20 uM) con medio FCS al 10 %. La figura 2E ilustra que la regulación por aumento de miR-15a mediante la transfección de células SKNBE con miR-15a o miR-16-1 indujo la muerte celular. El efecto directo de miR-15a y mir-16-1 sobre la supervivencia y viabilidad de las células se analizó después de la transfección con miR-15a y mirR-16-1 en células SKNBE. 48 horas después de la transfección, la viabilidad de las células se evaluó mediante FACS después de la tinción con PI.
La figura 3A ilustra que las células MV-V4-11 dependen de BCL-2 para su supervivenciain vitroy se puede inducir a sufrir apoptosis utilizando ABT-199. Las células MV4-11, RPMI y K562 se incubaron durante 24 horas en medio FCS R<p>M<i>al 1 % en presencia del inhibidor de BCL-2 ABT-199 (0,01, 0,1, 1 y 10 uM). La viabilidad de las células se evaluó mediante análisis FACS después de la tinción con PI.
La figura 3C ilustra que el agente de unión a CXCR4, BL8040, induce una apoptosis rápida y dependiente de la dosis de las células MV4-11, inhibe la señalización de ERK e induce la expresión de miR-15a y reduce significativamente los niveles de expresión de BCL2. Las células MV4-11 se cultivaron con medio FCS RPMI al 1 % durante 24 horas. 24 horas después de la incubación, se añadió BL-8040 (8 uM) a las células durante 30 minutos o 2 horas. Los lisados de células completas se analizaron mediante WB y los niveles de pERK se detectaron y normalizaron con respecto a la p-actina para confirmar una carga proteica igual. Las células MV4-11 se incubaron durante 24 horas en presencia de BL-8040 (8 uM) con medio FCS al 1 %. Los niveles de miR-15a, ARNm de BCL-2 se evaluaron mediante RT-PCR y el nivel de proteína BCL-2 se evaluó mediante WB.
La figura 3D ilustra que la transfección de células MV4-11 con miR-15a o miR-16-1 induce la muerte celular. El análisis del efecto directo de miR-15a y mir-16-1 sobre la supervivencia y la viabilidad de las células MV4-11 se realizó después de la transfección de miR-15a y miR-16-1 en las células. 48 horas después de la transfección, la viabilidad de las células se evaluó mediante FACS después de la tinción con PI. El nivel de miR-15a y miR-16-1-1 se midió mediante RT-PCR 24 horas después de la transfección. La figura 3E ilustra que BL8040 no pudo inducir la muerte celular en células de LLC que no expresan miR-15a/16-1. El nivel de miR-15a se evaluó en células de pacientes con LLC mediante RT-PCR. La capacidad de BL-8040 para destruir células de pacientes con LLC se midió después de la incubación de las células durante 24 horas en medio FCS al 1 % en presencia de BL-8040 (0,1, 1, 10 y 20 uM). La viabilidad de las células se evaluó mediante FACS después de la tinción con PI.
La figura 4a ilustra que el tratamientoin vivode BL8040 aumenta significativamente miR-15a y reguló por disminución BCL2 en un modelo de ratones con neuroblastoma. A ratones NSG se les inyectaron células SKNBE en la glándula suprarrenal izquierda. Una semana más tarde, se inyectó por vía subcutánea BL-8040 diariamente durante 14 días a una concentración de 400 pg/ratón. 24 horas después de la última inyección de BL-8040, se sacrificó a los animales; se extrajeron los tumores, se midieron y se pesaron. Se extrajeron el ARN y la proteína total del tumor y se evaluó el nivel de miR-15a mediante qRT-PCR. El nivel de proteína BCL-2 se evaluó mediante transferencia Western.
La figura 4B ilustra que en el modelo de LMAin vivode células MV4-11, la reducción de las células de LMA en el bazo se asocia con un aumento significativo de miR-15a/16-1 y una regulación por disminución de BCL2 en las células humanas. A ratones NOD SCID gamma (NSG) se les injertaron células MV4-11. Se permitió el injerto de células de LMA durante 3 semanas después del transplante. El día 21, se inyectó por vía subcutánea BL-8040 en ratones A 400 pg/ratón una vez al día durante uno o dos días (BL8040 x1, BL8040x2, respectivamente). 24 horas después de la última inyección, se sacrificó a los ratones y mediante FACS se evaluó el nivel de células de LMA CD45+ humanas en el bazo. Se extrajo ARN del bazo y se midió el nivel de miR-15a, El nivel de Mir-16-1 se evaluó mediante qRT-PCR. El nivel de proteína BCL-2 se evaluó mediante transferencia Western.
Descripción de realizaciones específicas de la invención
CXCR4 está sobreexpresado en la mayoría de las células tumorales y su expresión normalmente se correlaciona con un mal pronóstico. Los presentes inventores han descubierto ahora que la sobreexpresión de CXCR4 en células tumorales y la estimulación de células con CXCL12 conduce a una regulación por aumento de miR-15a/16-1 y, en consecuencia, a una regulación por disminución de su gen diana BCL-2. Asimismo, la sobreexpresión de CXCR4 en estas células aumenta la tumorigénesis y cambia su dependencia oncogénica de BCL2 a CXCR4. Los presentes inventores demostraron además que el agente de unión a CXCR4 BL8040 tiene un efecto similar en miR-15a/16-1. Por otra parte, BL8040 inhibe la señalización de ERK (véanse las Figuras 2D y 3C).
Por lo tanto, BL8040 indujo la apoptosis de células tumorales al inhibir las señales de supervivencia mientras mantenía baja la expresión del gen apoptóticoin vitroein vivo.Los presentes resultados sugieren que la sobreexpresión de CXCR4 puede anular la dependencia de supervivencia de las células tumorales de BCL-2, lo que lleva a la resistencia de las células tumorales a la inhibición de estas vías.
Por lo tanto, según un primer aspecto de la presente invención, se proporciona una cantidad terapéuticamente eficaz de SEQ ID NO: 14 para su uso en hacer que un sujeto resistente al antagonista de BC1-2 sea más susceptible al tratamiento con un antagonista de BC1-2, en donde dicho sujeto padece cáncer y en donde la SEQ ID NO: 14 aumenta la expresión de miR-15a en las células de dicho cáncer y en donde dicho antagonista de BCL-2 se selecciona del grupo que consiste en Oblimersen, SPC-2996, RTA-402, Gossypol, AT-101, mesilato de Obatoclax, A-371191, A-385358, A-438744, ABT-737, ABT-199, AT-101, BL-11, BL-193, GX-15-003, 2-metoxiantimicina A3, HA-14-1, KF-67544, purpurogalina, TP-TW-37, YC-137 y Z-24.
Como se usa en el presente documento, el término cáncer se refiere a enfermedades proliferativas, incluidos carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. El cáncer puede ser, por ejemplo, un tumor sólido, un meningioma benigno, tumores mixtos de la glándula salival, adenomas de colon; adenocarcinomas, tal como el cáncer de pulmón microcítico, de riñón, de útero, de próstata, de vejiga, de ovarios, de colon, sarcomas, liposarcoma, mixoide, sarcoma sinovial, rabdomiosarcoma (alveolar), condrosarcoma mixoide extraesquelético, tumor de Ewing; otros incluyen disgerminoma testicular y ovárico, retinoblastoma, tumor de Wilms, neuroblastoma, melanoma maligno, mesotelioma, de mama, de piel, de próstata y de ovario.
De acuerdo con una realización particular, el cáncer es neuroblastoma, cáncer de vejiga retinoblastoma, carcinoma esofágico, sarcomas, cáncer colorrectal, melanoma, adenoma de paratiroides y cáncer de mama.
De acuerdo con otra realización, el cáncer es un tumor sólido.
De acuerdo con otra realización más, el cáncer es una neoplasia hematológica.
La expresión "malignidad hematológica" en el presente documento incluye un linfoma, leucemia, mieloma o una malignidad linfoide, así como un cáncer de bazo y de ganglios linfáticos. Los linfomas de ejemplo que son susceptibles de tratamiento con los agentes divulgados incluyen tanto linfomas de linfocitos B como linfomas de linfocitos T. Los linfomas de linfocitos B incluyen tanto linfomas de Hodgkin como la mayoría de los linfomas no hodgkinianos. Como ejemplos no limitativos de linfomas de linfocitos B se incluyen linfoma difuso de linfocitos B grandes (LDLBG), linfoma folicular (LF), linfoma de tejido linfático asociado a mucosas (MALT), linfoma linfocítico microcítico (se solapa con la leucemia linfocítica crónica), linfoma de células del manto (LCM), linfoma de Burkitt, linfoma mediastínico de linfocitos B grandes, macroglobulinemia de Waldenstrom, linfoma nodal de la zona marginal de linfocitos B (NMZL), linfoma esplénico de la zona marginal (SMZL), linfoma intravascular de linfocitos B grandes, linfoma de efusión primaria, granulomatosis linfomatoide. Como ejemplos no limitativos de linfomas de linfocitos T se incluyen linfoma extraganglionar de linfocitos T, linfoma cutáneo de linfocitos T, linfoma anaplásico de células grandes y linfoma angioinmunoblástico de linfocitos T. La neoplasias malignas hematológicas también incluyen leucemia, tales como, pero sin limitación, leucemia secundaria, leucemia mielógena aguda (LMA; también llamada leucemia linfoide aguda), leucemia mielógena crónica (LMC), leucemia prolinfocítica de linfocitos B (LLP), leucemia linfoblástica aguda (LLA) y mielodisplasia (MDS). Las neoplasias malignas hematológicas también incluyen mielomas, tales como, pero sin limitación, mieloma múltiple (MM), mieloma múltiple latente (MML) y leucemia linfocítica crónica (LLC) de linfocitos B.
De acuerdo con una realización particular, la neoplasia maligna hematológica es la leucemia mielógena crónica (LMC). El término LMC incluye LMC resistente a imatinib, LMC tolerante a TKI Bcr-Abl de segunda y tercera generación (por ejemplo, dasatinib y nilotinib), LMC intolerante a imatinib, LMC acelerada y LMC en fase blástica linfoide.
Otros cánceres hematológicos y/o asociados a linfocitos B o a linfocitos T se incluyen en la expresión neoplasia maligna hematológica. Por ejemplo, las neoplasias malignas hematológicas también incluyen cánceres de células hematopoyéticas adicionales, incluidas células dendríticas, plaquetas, eritrocitos, células asesinas naturales y leucocitos polimorfonucleares, por ejemplo, basófilos, eosinófilos, neutrófilos y monocitos. Debe quedar claro para los expertos en la técnica que estas neoplasias premalignas y malignas a menudo tendrán nombres diferentes debido a sistemas de clasificación cambiantes, y que los pacientes que tienen linfomas clasificados con nombres diferentes también pueden beneficiarse de los regímenes terapéuticos de la presente invención.
Los sujetos tratados según este aspecto de la presente invención son típicamente sujetos mamíferos, por ejemplo, seres humanos.
El término "Bcl-2", tal como se usa en el presente documento, se refiere a la proteína Bcl-2 (Swiss Prot ID No. P10415), un miembro de la familia de proteínas Bcl-2 (Cory, S. y Adams, J. M., Nature Reviews Cancer 2 (2002) 647-656; Adams, Genes and Development 17 (2003) 2481-2495; Danial, N. N. y Korsmeyer, S. J., Cell 116 (2004) 205-219; Petros, A. M., Biochim Biophys Acta 1644 (2004) 83-94).
La expresión "inhibidores de Bcl-2" como se usa en el presente documento se refiere a agentes que inhiben la actividad de interacción de la proteína Bcl-2 ya sea mediante la inhibición de la fosforilación de Bcl-2 ("inhibidores de la fosforilación de la proteína Bcl-2") tales como, por ejemplo, RTA-402 o mediante unión a la proteína Bcl-2 y, por tanto, alteración del complejo Bad/Bcl-2 (estos se denominan "inhibidores de unión a la proteína Bcl-2"). Preferentemente, dichos inhibidores de Bcl-2 son inhibidores de unión a la proteína Bcl-2. La actividad inhibidora de Bcl-2 mediante la unión directa de dichos inhibidores de unión a la proteína Bcl-2 se puede medir mediante un ensayo de unión competitiva. Por lo tanto, la CI50 de la inhibición de la actividad de la proteína Bcl-2 se puede determinar en un ensayo de fluorescencia homogénea resuelta en el tiempo (HTRF). Preferentemente, la CI50 de la actividad inhibidora anti-Bcl-2 es 5 |<j>M o menos, más preferentemente 1<j>M o menos. Dichos inhibidores de unión a la proteína Bcl-2 incluyen compuestos tales como gosipol, AT-101, ABT-199 (también conocido como Venetoclax), mesilato de Obatoclax, A-371191, A-385358, A-438744, ABT-737, ABT-263, AT-101, BL-11, BL-193, GX-15-003, 2-metoxiantimicina A3, HA-14-1, KF-67544, purpurogalina, TP-TW-37, YC-137 y Z-24.
"RTA-402", tal como se usa en el presente documento, significa CDDO-Me, el éster metílico del triterpenoide C28: ácido oleanano triterpenoide 2-ciano-3,12-dioxooleano-1,9-dien-28-oico (CDDO) (véase, por ejemplo, Honda, T., Rounds B V Bore, L.,et al.J Med Chem. 43 (2000) 4233-4246), que bloquea la fosforilación de la proteína Bcl-2 (Konopleva, M.,et al.,Blood 99 (2002) 326-35).
Venetoclax (CAS Reg. No. 1257044-40-8; ABT-199; GDC-0199; RG-7601, AbbVie Inc., Genentech Inc.) es un fármaco mimético de BH3 diseñado para bloquear la función de la proteína Bcl 2 y se encuentra en ensayos clínicos de fase 3 para el tratamiento del mieloma múltiple, leucemia linfocítica crónica, lupus eritematoso sistémico, linfoma difuso de linfocitos B grandes, leucemia mielógena aguda y linterna no Hodgkin (Souers et al Nat Med. 2013 Jan. 6. doi: 10.1038/nm.3048). Venetoclax tiene el nombre IUPAC: 4-(4-{[2-(4-clorofenil)-4,4-dimetilciclohex-1-en-1-il]metil}piperazin-1-il)-N-({3-nitro-4-[(tetrahidro-2H-piran-4-ilmetil)amino]fenil}sulfonil-1)-2-(1H-pirrolo[2,3-b]piridin-5-iloxi)benzamida.
ABT-737, como se usa en el presente documento, significa N-[4-[4-(4-clorobifenil-2-ilmetil)piperazin-1-il]benzoil]-3-[3-(dimetil-amino)-1(R)- (fenilsulfanilmetil)propilamino]-4-nitrobencenosulfonamida; 4-[4-(4'-Clorobifenil-2-ilmetil)piperazin-1-il]-N-[3-[3-(dimetilamino)-1(R)-(fenilsulfanilmetil)propilamino]-4-nitrofenilsulfonil]benzamida, un inhibidor de Bcl-2 de fórmula I, que se describe en el documento WO 2006/099667 o Corey, S.,et al.,Cancer Cell 8 (2005) 5-6.
fórmula I
ABT-263 como se usa en el presente documento significa un inhibidor de Bcl-2 de fórmula II, tal como se describe en el documento US 2007/027135,
fórmula II
A-371191, como se usa en el presente documento, significa un inhibidor de Bcl-2 de fórmula III,
fórmula III
A-385358, como se usa en el presente documento, significa [(R)-4-(3-dimetilamino-1-fenilsulfanilmetil-propilamino)-N-[4-(4,4-dimetil-piperidin-1-il)-benzoil]-3- nitrobencenosulfonamida (como, por ejemplo, se divulga en Shoemaker, A. R.,et al.,Cancer Research 66 (2006) 8731-8739) un inhibidor de Bcl-2 de fórmula IV,
fórmula IV
Gosipol, tal como se usa en el presente documento, significa una mezcla racémica de (+)-gosipol o (-)-gosipol (un inhibidor de Bcl-2 de fórmula V) o (+)-gosipol o (-)-gosipol puro, preferentemente gosipol se refiere a (-)-gosipol puro.
fórmula V
AT-101, como se usa en el presente documento, significa el compuesto líder clínico de Ascenta Therapeutics AT-101, un inhibidor de Bcl-2 y derivado de R(-)-gossipol.
Mesilato de obatoclax (u otros sinónimos: GX-015-070; o GX15-070) como se usa en el presente documento significa 2-[2-(3,5-Dimetil-1H-pirrol-2-ilmetilen)-3-metoxi-2H-pirrol-5-il]-1H-indolmetanosulfonato, un inhibidor de Bcl-2, que se describe, por ejemplo, en los documentos WO 2004/106328, WO 2006/089397 y Walensky, L. D., Cell Death and Differentiation, 13 (2006) 1339-1350. TW-37 como se usa en el presente documento significa un inhibidor de Bcl-2 de fórmula VI,
fórmula VI
BL-193 como se usa en el presente documento significa un inhibidor de Bcl-2 de fórmula VII,
fórmula VII
NSC-719664, como se usa en el presente documento, significa 2-metoxi-antimicina A3, un inhibidor de Bcl-2 derivado de antimicina A3.
YC-137 se describe, por ejemplo, en Walensky, L. D., Cell Death and Differentiation 13 (2006) 1339-1350.
La purpurogalina se describe, por ejemplo, en Walensky, L. D., Cell Death and Differentiation 13 (2006) 1339-1350. HA-14-1 se describe, por ejemplo, en Walensky, L. D., Cell Death and Differentiation 13 (2006) 1339-1350.
Z-24, como se usa en el presente documento, significa 3Z-3-[(1H-pirrol-2-il)-metiliden]-1-(1-piperidinilmetil)-1,3-2H-indol-2-ona, un inhibidor de Bcl-2 de fórmula VIII,
fórmula VIII
Como se ha mencionado, una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente de unión a CXCR4 aumenta la expresión de miR-15a, tratando así el cáncer. Los agentes de unión a CXCR4 según la presente invención son compuestos de SEQ ID NO: 14, tal como BL8040.
Los métodos para analizar el nivel de expresión de miR-15a o miR-16-1 se conocen en la técnica e incluyen el análisis directo del nivel de expresión de estos miARN o el análisis de la expresión de sus genes diana, incluyendo, por ejemplo, Bcl-2, como se ha descrito anteriormente en el presente documento.
El agente inhibidor se puede administrar inmediatamente antes (o después) del agente de unión a CXCR4, el mismo día que, un día antes (o después), una semana antes (o después), un mes antes (o después) o dos meses antes (o después) de los compuestos descritos, y similares.
Los agentes inhibidores (como se han descrito anteriormente en el presente documento) y los agentes de unión a CXCR4 se pueden administrar de forma concomitante, esto es, donde la administración de cada uno de estos reactivos puede ocurrir en intervalos de tiempo que se superponen parcial o totalmente entre sí. Los agentes inhibidores descritos en el presente documento y los agentes de unión a CXCR4 se pueden administrar durante intervalos de tiempo que no se superponen entre sí. Por ejemplo, el agente inhibidor se puede administrar dentro del período de tiempo de t=0 a 1 horas, mientras que el agente de unión a CXCR4 se puede administrar en el plazo de t=1 a 2 horas. Igualmente, el agente inhibidor se puede administrar dentro del período de tiempo de t=0 a 1 horas, mientras que los agentes de unión a CXCR4 se pueden administrar en algún momento dentro del marco de tiempo de t=2-3 horas, t=3-4 horas, t=4-5 horas, t=5-6 horas, t=6-7 horas, t=7-8 horas, t=8-9 horas, t=9-10 horas y similares. Por otra parte, los agentes de unión a CXCR4 se pueden administrar en algún momento en el plazo de t = menos 2-3 horas, t=menos 3 4 horas, t=menos 4-5 horas, t=5-6 menos horas, t=menos 6-7 horas, t=menos 7-8 horas, t=menos 8-9 horas, t=menos 9-10 horas.
Los agentes de unión a CXCR4 y los agentes inhibidores normalmente se proporcionan en cantidades combinadas para lograr eficacia terapéutica. Esta cantidad evidentemente dependerá del compuesto particular seleccionado para su uso, la naturaleza y el número de la otra modalidad de tratamiento, la dolencia(s) que se va(n) a tratar, prevenir y/o paliar, la especie, la edad, el sexo, el peso, la salud y el pronóstico del sujeto, el modo de administración, la efectividad de la focalización al objetivo, el tiempo de permanencia, el modo de eliminación, el tipo y la gravedad de los efectos secundarios de la composición farmacéutica y de muchos otros factores que serán evidentes para los expertos en la técnica.
En una realización de ejemplo, la cantidad de agente de unión a CXCR4 se usa en una cantidad por debajo de la dosis mínima requerida para la efectividad terapéutica cuando se usa como terapia única (por ejemplo, 10-99%, preferentemente del 25 al 75 % de esa dosis mínima). Esto permite la reducción de los efectos secundarios causados por el agente de unión a CXCR4, pero la terapia se vuelve eficaz porque, en combinación con los agentes inhibidores descritos en el presente documento, las combinaciones son efectivas en general.
En otra realización ilustrativa, la cantidad del agente inhibidor se usa en una cantidad por debajo de la dosis mínima requerida para la efectividad terapéutica cuando se usa como terapia única (por ejemplo, 10-99 %, preferentemente del 25 al 75 % de esa dosis mínima). Esto permite la reducción de los efectos secundarios causados por el agente inhibidor, pero la terapia se vuelve efectiva porque, en combinación con los agentes de unión a CXCR4 desvelados en el presente documento, las combinaciones son efectivas en general.
En una realización, los agentes inhibidores y los agentes de unión a CXCR4 son sinérgicos con respecto a sus dosis. Es decir, el efecto proporcionado por la combinación es mayor de lo que se esperaría de los efectos aditivos de los dos agentes cuando se usan por separado. En una realización alternativa pero igualmente preferida, los agentes inhibidores y los agentes de unión a CXCR4 son sinérgicos con respecto a sus efectos secundarios. Es decir, los efectos secundarios causados por la combinación de los dos agentes son menores de lo que se esperaría cuando cualquiera de los agentes proporciona el efecto terapéutico equivalente cuando se usan por separado.
Un sujeto resistente al antagonista de BCl-2 es aquel que es menos sensible a los efectos antitumorales del antagonista de BCl-2 que un sujeto no resistente.
De acuerdo con una realización, el sujeto resistente al antagonista de BCl-2 es insensible a los efectos antitumorales del antagonista de BCl-2.
De acuerdo con una realización, el efecto terapéutico del antagonista de BCl-2 se reduce al menos en un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o más en el sujeto resistente al antagonista de BCl-2 en comparación con el efecto en un sujeto que no tiene resistencia (por ejemplo, un sujeto que recién comienza la terapia con antagonista de BCl-2).
Se apreciará que el sujeto resistente al antagonista de BCl-2 puede ser más resistente a los efectos de un antagonista de BCl-2 particular (por ejemplo, ABT199) que otros antagonistas de BCl-2.
Como se ha mencionado anteriormente en el presente documento, los presentes inventores han demostrado que los agentes de unión a CXCR4 aumentan miR-15a y 16-1, reduciendo así el gen diana de Bcl-2.
De acuerdo con una realización particular, los cánceres son neuroblastoma, cáncer de vejiga retinoblastoma, carcinoma esofágico, sarcomas, cáncer colorrectal, melanoma, adenoma de paratiroides y cáncer de mama.
De acuerdo con otra realización, el cáncer es un tumor sólido.
Como se usa en el presente documento, el término "aproximadamente" se refiere a ±10 %.
Las expresiones "comprende", "que comprende", "incluye", "que incluye", "que tiene" y sus conjugaciones significan "que incluye, pero sin limitación".
La expresión "que consiste en" significa "que incluye y se limita a".
La expresión "que consiste esencialmente en" significa que la composición, el método o la estructura puede incluir ingredientes adicionales, etapas y/o partes, pero solo si los ingredientes, las etapas y/o las partes adicionales no alteran materialmente las características básicas y novedosas de la composición reivindicada, el método o la estructura reivindicados.
Como se usa en el presente documento, las formas en singular "un", "uno/a" y "el/la" incluyen referencias en plural, salvo que el contexto indique claramente otra cosa. Por ejemplo, la expresión "un compuesto" o "al menos un compuesto" puede incluir una pluralidad de compuestos, incluyendo mezclas de los mismos.
A lo largo de la presente solicitud, pueden presentarse diversas realizaciones de la presente invención en un formato de intervalo. Debe entenderse que la descripción en formato de intervalo es únicamente por conveniencia y brevedad y no debería interpretarse como una limitación inflexible sobre el alcance de la invención. En consecuencia, debe considerarse que la descripción de un intervalo ha divulgado específicamente todos los posibles subintervalos, así como valores numéricos individuales en ese intervalo. Por ejemplo, debe considerarse que la descripción de un intervalo tal como de 1 a 6 ha divulgado específicamente subintervalos tales como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6, etc., así como números individuales dentro de ese intervalo, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 y 6. Esto es aplicable independientemente de la amplitud del intervalo.
Siempre que se indique un intervalo numérico en el presente documento, se pretende incluir cualquier número citado (fraccionario o entero) dentro del intervalo indicado. Las expresiones "que varía/varía entre" un primer número indicador y un segundo número indicador y "que varía/varía de" un primer número indicador "a" un segundo número indicador se usan indistintamente en el presente documento y se entiende que incluyen los números indicadores primero y segundo, y todos los números fraccionarios y enteros entre ellos.
Como se usa en el presente documento, el término "método" se refiere a formas, medios, técnicas y procedimientos para llevar a cabo una tarea dada incluyendo, pero sin limitación, las formas, medios, técnicas y procedimientos tanto conocidos como desarrollados a partir de maneras, medios, técnicas y procedimientos conocidos por los especialistas de las técnicas químicas, farmacológicas, biológicas, bioquímicas y médicas.
Como se usa en el presente documento, el término "tratar" incluye anular, inhibir sustancialmente, ralentizar o invertir la progresión de una afección, aliviar sustancialmente síntomas clínicos o estéticos de una afección o prevenir sustancialmente la aparición de síntomas clínicos o estéticos de una afección.
Diversas realizaciones y aspectos de la presente invención como se han delineado anteriormente en el presente documento y como se reivindica más adelante en la sección de reivindicaciones encuentran apoyo experimental en los siguientes ejemplos.
Ejemplos
A continuación se hace referencia a los siguientes ejemplos, que junto con las descripciones anteriores ilustran algunas realizaciones de la invención de una manera no limitante.
En general, la nomenclatura usada en el presente documento y los procedimientos de laboratorio utilizados en la presente invención incluyen técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas y de ADN recombinante. Dichas técnicas se explican exhaustivamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrooket al.,(1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volúmenes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubelet al.,"Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, Nueva York (1988); Watsonet al.,"Recombinant DNA", Scientific American Books, Nueva York; Birrenet al.(eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vol. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (1998); las metodologías según se exponen en las patentes de EE.UU. N.° 4.666.828; 4.683.202; 4.801.531; 5.192.659 y 5.272.057; "Cell Biology: ALaboratory Handbook", volúmenes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique" de Freshney, Wiley-Liss, N. Y. (1994), tercera edición; "Current Protocols in Immunology" volúmenes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stiteset al.(eds), "Basic and Clinical Immunology" (8a Edición), Appleton y Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell y Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., Nueva York (1980); los inmunoensayos disponibles se describen ampliamente en la bibliografía de patentes y científica, véase, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos N.° 3.791.932; 3.839.153; 3.850.752; 3.850.578; 3.853.987; 3.867.517; 3.879.262; 3.901.654; 3.935.074; 3.984.533; 3.996.345; 4.034.074; 4.098.876; 4.879.219; 5.011.771 y 5.281.521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D. y Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D. y Higgins S. J., eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) y "Methods in Enzymology" vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshaket al.,"Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996).
Se proporcionan otras referencias generales a lo largo del presente documento.
EJEMPLO 1
La sobreexpresión de CXCR4 conduce a una regulación por aumento de mir15a y mir16-1
CXCR4 está sobreexpresado en la mayoría de los tumores y su expresión a menudo se correlaciona con un mal pronóstico. Sin embargo, en la mayoría de las líneas celulares tumorales cultivadas, CXCR4 se expresa en la superficie celular en niveles bajos. Se descubrió que la sobreexpresión de CXCR4 en varias células tumorales aumenta su tumorigenicidadin vitroein vivoaumentando sus señales de supervivencia a través de las vías de señalización ERK (Figura 1A). Este hallazgo está respaldado por numerosas publicaciones que informan que el eje CXCL12/CXCR4 y sus señales posteriores PI3K/AKT PErk1/2 desempeñan un papel importante en la progresión tumoral y la metástasis.
De manera inesperada, ahora se ha descubierto que la sobreexpresión de CXCR4 en células tumorales conduce a una regulación por aumento de mir15 y 16 (Figura 1B). Los microARN codificados por el locus mir-15a/16-1 (mir-15a y mir-16-1-1) funcionan como supresores de tumores. La expresión de estos miARN está regulada por disminución en LLC, melanoma, cáncer colorrectal, cáncer de vejiga y otros tumores sólidos. El grupo mir-15a/16 se dirige a múltiples oncogenes, incluidos BCL2 y otros. En efecto, la regulación por aumento de CXCR4 y mir15/16 conduce a una regulación por disminución del ARNm de los oncogenes diana mir15/16; BCL-2, de una manera específica de la célula (Figura 1c ).
En las células del neuroblastoma SKNBE, la sobreexpresión de CXCR4 incrementó fuertemente mir15/16 y los niveles de expresión de ARNm de BCL2 disminuyeron significativamente. La regulación por disminución de los niveles de proteína BCL2 también fue evidente mediante transferencia Western y mediante análisis FACS interno (Figura 1D). En correlación con los niveles de ARNm, se observaron niveles reducidos de BCL2 en las células PC3 pero no en las células RPMI-8226 (Figura 1D).
El tratamiento de SKNBE con el agente de unión a CXCR4 BL8040 inhibió la señalización de ERK así como también indujo la expresión de mir-15a y redujo los niveles de expresión de BCL-2 en estas células (Figura 2D). La inhibición de estas señales de supervivencia por BL8040 induce la muerte de las células SKNBE. De hecho, la regulación por aumento de mir-15a mediante la transfección de células con mir-15a o mir-16-1-1 indujo la muerte celular de SKNBE (Figura 2E).
Para estudiar la diafonía entre el eje mir-15a/BCL2, se analizó la línea celular de LMA MV4-11. Se descubrió que estas células dependen de BCL-2 para su supervivenciain vitroy se puede inducir la apoptosis usando el ABT-199 a una CI50 de 10 nM (Figura 3A). El agente de unión a CXCR4 BL8040 indujo una apoptosis rápida y dependiente de la dosis de células MV4-11, inhibió la señalización de ERK así como indujo la expresión de mir-15a y redujo significativamente los niveles de expresión de BCL2 (Figura 3C). Asimismo, la transfección de estas células con mir-15a o mir-16-1-1 también induce su muerte celular (Figura 3D).
Estos resultados sugieren que el agente de unión a CXCR4 BL8040 inhibe la señalización de ERK a través del receptor CXCR4, regulan por aumento mir-15a/16-1, lo que a su vez privó aún más a las células de señales de supervivencia al regular por disminución los oncogenes BCL2.
La leucemia linfocítica crónica (LLC) de linfocitos B es la leucemia más común en adultos. Las anomalías cromosómicas más comunes detectables por citogenética incluyen la deleción en 13q. En 2002, se descubrió que un grupo de microARN mir-15a/mir-16-1-1 (mir-15a/16) es el objetivo de las deleciones de 13q en la LLC. El grupo mir-15a/16 se dirige a múltiples oncogenes, incluido BCL2 y otros. Podría decirse que el objetivo más importante de mir-15a/16 en la LLC es BCL2, ya que BCL2 está sobreexpresado en casi todas las LLC. Se descubrió que en las células de LLC que se eliminan de mir-15a/16 (paciente con LLC 1), BL8040 no pudo inducir la muerte celular (Figura 3D). Esto sugiere un papel crítico para esta vía en la inducción de la muerte de células tumorales por este antagonista anti CXCR4 BL8040 (Figura 3E).
Para evaluar más a fondo el efecto de BL8040 sobre el crecimiento tumoral de mir-15a/16-1 y la expresiónin vivode BCL2, se establecieron modelos de ratón con neuroblastoma y leucemia en ratones NSG utilizando las células SKNBE y MV4-11. En el modelo vivo de neuroblastoma ortotópico (NB) en ratones NSG se inyectaron 0,5x 106 células SKNBE en las glándulas suprarrenales de los ratones. Una semana más tarde, se inyectó BL-8040 diariamente durante 3 semanas a 400 ug/ratón. El tratamiento con BL-8040 indujo la muerte de las células tumorales e inhibió significativamente el crecimiento del tumor (Figura 4A). En asociación, el tratamiento con BL8040 aumenta significativamente mir15 y reguló por disminución BCL2in vivo(Figura 4A).
En el modelo de LMAin vivocon células MV4-11, se inyectaron 1x106 células por vía intravenosa en ratones NSG. Tres semanas después, se inyectó por vía subcutánea BL-8040 diariamente una vez (BL-8040x1) o dos veces (BL-8040x2) a 400 ug/ratón. 24 horas después de la última inyección se sacrificó a los ratones. Se descubrió que BL8040 induce la apoptosis de la LMA y reduce drásticamente la cantidad de células de LML en el bazo, como lo demuestra el análisis FACS después de la tinción con el anticuerpo fluorescente CD45 humano. La reducción de las células de LMA en el bazo se asoció con un aumento significativo en miR15/16 y una regulación por disminución de BCL2 en células humanas (Figura 4B).

Claims (6)

REIVINDICACIONES
1. Una cantidad terapéuticamente eficaz de SEQ ID NO: 14 para su uso en hacer que un sujeto resistente al antagonista de BCl-2 sea más susceptible al tratamiento con un antagonista de BCl-2, en donde dicho sujeto padece cáncer y en donde la SEQ ID NO: 14 aumenta la expresión de miR-15a en las células de dicho cáncer y en donde dicho antagonista de BCL-2 se selecciona del grupo que consiste en Oblimersen, SPC-2996, RTA-402, Gossypol, AT-101, mesilato de Obatoclax, A-371191, A-385358, A-438744, ABT-737, ABT-199, AT-101, BL-11, BL-193, GX-15-003, 2-metoxiantimicina A3, HA-14-1, KF-67544, purpurogalina, TP-TW-37, YC-137 y Z-24.
2. La cantidad terapéuticamente eficaz de SEQ ID NO: 14 para su uso de la reivindicación 1, en donde dicho antagonista de BCl-2 es ABT-199.
3. La cantidad terapéuticamente eficaz de SEQ ID NO: 14 para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en donde el cáncer se selecciona entre el grupo que consiste en un cáncer hematológico, neuroblastoma, retinoblastoma, cáncer de vejiga, carcinoma esofágico, sarcomas, cáncer colorrectal, melanoma, adenoma de paratiroides y cáncer de mama.
4. La cantidad terapéuticamente eficaz de SEQ ID NO: 14 para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde dicho cáncer es un cáncer hematológico.
5. La cantidad terapéuticamente eficaz de SEQ ID NO: 14 para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde dicho cáncer es leucemia linfocítica crónica (LLC).
6. La cantidad terapéuticamente eficaz de SEQ ID NO: 14 para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde dicho cáncer es neuroblastoma.
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