JPH04503003A - 水銀により励起されて生物発光を高める微生物を利用して水銀を検出する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 水銀により励起されて生物発光を高める微生物を利用して水銀を検出する方法 ここに述べる発明の内容は微生物をバイオセンサとして利用して水銀化合物を検 出する方法である。さまざまな水銀濃度の選択検出を時間遅延なしに可能とする 被測定パラメータは、生物から放出される生物発光信号の強さである。

本発明の基礎は水銀イオンにより誘発可能な遺伝子複合体を、分子クローニング 技術により、ビブリオ・ハルベイ（Ｖｉｂｒｉｏ　Ｈａｒｖｅｙｉ）からなるル シフェラーゼ遺伝子と組合せることである。得られるプラスミドベクターｐＧＬ ４は、それでもって形質転換した微生物が成長媒質中の高い水銀濃度に、より高 い生物発光で反応するよう構成しである。ここに述べるプラスミド系ｐＧＬ４で もって各種の微生物を、水銀イオンに特異性を有し且つそれに敏感なバイオセン サに変多くの重金属は微量元素として、即ち低濃度でも、生きた生物中での生理 学的に重要な諸反応の成果ある経過にとって重要である。しかし濃度が高くなる とこれらの元素の多くで毒作用が優勢となる。水銀イオンの顕著な毒性は、ポリ ペプチド鎖中のシスティンのスルフヒドリル基とでいわゆるメルカプチドを形成 するその傾向から生じる。この作用は、前記反応によって酵素の活性中心が不可 逆的に変化し、これにより酵素が無効となるとき、生物にとって格別不利である 。

水銀等の重金属は、従来、ｉ）電位差分析、ｉｉ）質量分析、ｉｉ）原子吸光分 析等の方法により検出されてきた。これらの確立された検出法では一般に精度の 高さ、即ち検出限界の低さが、装置及び時間支出の多さと結び付いている。

そこで本発明では、微生物をバイオセンサとして利用して水銀イオンを特異的に 、選択して僅かな支出で迅速に検出することのできる測定法を記載する。

生物発光可能な微生物をバイオセンサとして用いる場合の技術水準 科学文献に一特許文献にも−、例えば水様液中の毒性物質の測定時（米国特許明 細書第３９８１７７７号）、そして抗生物質の濃度測定時（欧州特許第０２００ ０２２６号）における微生物の使用が記載しである。これらの応用には、比濁法 、平均１８時間を超える時間後のコロニー数、コロニー寸法の評価等の代表的方 法により被検生物の成長を検出することが基礎となっている。

最近、きわめて敏感で迅速な生物発光方法が加わった。

この方法では当然、生物発光を放出する微生物（ＰＣＴ／ＵＳ　８４１０１２１ ７）又は実験室では分子生物学的方法の適用により生物発光可能な微生物（Ｐ　 ３８３３６２８．６−４１　：優先権８８年ＩＯ月３日）が用いられる。最後に 指摘した２つの方法は、生物発光を介し感受性若しくは抵抗性の異なる微生物の 比死滅率を比較することにより一般的毒性の検出が簡単に可能である点で共通し ている。更に、その生物発光信号が被検物質の存在下に減少しない特異的抵抗性 生物の特殊事例では、いかなる物質に対し抵抗性があるかを同定する可能性があ る。対照測定を行うことなく、検出した測定信号と当該毒素の濃度上昇との正の 相関関係を基にするだけで特定物質を同定することは前記測定系では可能でない 。

発明の説明 以下に述べる本発明の内容は、適宜に用意した微生物がその環境媒質中の上昇し た水銀濃度に対し、−技術水準の場合のように耐性事例では一定し若しくはゆっ くりと弱まるのでなく−より高まった生物発光信号で反応するようになった方法 である。

その際開発の核心は分子クローニング法で作製したプラスミドベクターであり、 そのなかで水銀により誘発可能なオペロンの一部がビブリオ・ハルベイからなる ルシフェラーゼ（ＬＵＸ）遺伝子複合体と結合してあり、微生物の生物発光に責 任のあるＬＵＸ遺伝子も水銀イオンにより正の制御が行われる。水銀により誘発 可能なこの遺伝子系とはプラスミドＲ１００からなるいわゆるｍｅｒ−オペロン であり（Ｗ、　Ｊ、　Ｊａｃｋｓｏｎ　、　Ａ、０．　Ｓｕｍｍｅｒｓ（１９８ ２）　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１４９．４７９−４８７）、これはその担 体生物に、濃度５０μｍｏｌ／ｌまでの水銀化合物に対する耐性を付与する。

この耐性現象はポリジストロニックメツセンジャーＲＮＡにより記号化される３ つのポリペプチドの協動に基づいている。水銀によるｍｅｒ−オペロンの誘発後 、メツセンジャーＲＮＡが一層強い規模で形成され、細胞質内に輸送され、そこ で、それにより記号化された３つのポリペプチド、即ちｉ　）　ｍｅｒ−Ｒ：ｍ ｅｒ−オペロンの転写に全体として肯定的に作用する調節タンパク質と、ｉｉ） 　ｍａｒ−ＴＰＣ：水銀イオンを錯化し且つ細胞内部へのその輸送を遂行するポ リペプチドと、ｎｉ）ｍａｒ−Ａ：　（２つの電子の伝達により）Ｈｇ−イオン を揮発性の、危険のない酸化形状Ｈｇ”に移行させる還元酵素とに翻訳される。

結局、水銀イオンの機能性解毒にとって決定的役割を演伝子中に突然変異を有す る微生物は水銀（Ｈｇ　”　）に対し長くは耐性でなく、水銀に対する過敏性表 現型が顕著である（）Ｉｇ”″）。この現象の原因は、完全な運搬体タンパク質 （ｍａｒ−ＴＰＣ）によりＨｇ−イオンが一耐性ブラスミドを担持していない微 生物（Ｈｇ“表現型）に比べて−４率的な仕方で細胞内部に転位されるが、そこ で還元して解毒されないことに根拠がある。

水銀に対し過敏に反応する菌株ではビブリオ・ハルベイかららなるルシフェラー ゼ遺伝子複合体が分子クローニングによるｍａｒ−Ａ還元酵素遺伝子の代わりと なるが、結局この菌株の配座が以下述べる方法の基礎となる。

水銀イオンにより誘発されてルシフェラーゼ遺伝子複合体の転写を高める遺伝的 調節系の構造ニブラス、ミドベクタ−ｐＧＬ４ 水銀イオンにより転写刺激されるＬＵＸ遺伝子複合体を含有したｐＧＬ４と呼ぶ プラスミドのクローニング時の出発プラスミドはプラスミドｐＤＧ１０６であっ た（Ｂ、Ｄ、　Ｇａｍｂｉｌｌ、　Ａ、Ｏ。

Ｓｕｍｍｅｒｓ　（１９８５）　ＧＥＮＥ、　３９．２９３−２９７）。これは 完全な、即ち水銀に対する耐性を付与するｍａｒ−オペロンの他、付加的にカナ マイシン耐性遺伝子を有する。確立された分子生物学的技術によりｐＤＧ１０６ から２．１キロ塩基対（ＫＢ）長の制限断片（Ｅｃｏ　Ｒ１−ＢａｍＨｌ）が取 り除かれ、５．７ＫＢ大のベクタープラスミドか得られた。この操作（Ｅｃｏ　 Ｒ１制限）によりｍｅｒ−Ａ遺伝子が部分的に欠失し、それから−機能性水銀還 元酵素の欠落に起因して一敏感なｆ（ｇ’″表現型が得られる。他方、カナマイ シン耐性は完全に残り、従って引き続くクローニングにおいて選択に利用するこ とができる。

−配列を含まない３．ＩＫＢ長のＳａｌ　ｌ−Ｂａ＋ｎＨＩ制限断片として一般 的ＬＵＸプラスミドから単離された。ＬＵＸ遺伝子の５゛末端−即ち「冒頭」　 −に置かれたＳａｔ　Ｉ切断部位と準備したＥｃｏ　Ｒ１切断部位との適合性を 実現するため付加的クローニングが中間工程として考えられた。この目的のため ４５塩基対（ＢＰ）長のＳａｌ　Ｉ−Ｂａｍｔ（Ｉ制限断片が市販のクローニン グベクター”ｐブルースクリプト［Ｂｌｕｅｓｃｒｉ　ｐｔ］（ＳＴＲＡＴＡＧ ＥＮＥ、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、　ＵＳＡ）のポリリンカーレギオンから標 本として単離され、アダプター・オリゴヌクレオチドとしてＬＵＸ断片に連結さ れた。最後にこの連結反応混合物は制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨ１で再分解 され、最後にｐＢＲ科（ｐＵｃ１８）のプラスミドベクターにクローニングされ る。Ｓａｌ　Ｉ−Ｂａｍ旧アダプター・オリゴヌクレオチド中にＥｃｏ　Ｒ１切 断部位が存在するので、中間段階としてクローニングしたプラスミドからＥｃｏ 　Ｒ１−ＢａｍＨ１断片としてＬＵＸ遺伝子複合体を単離することができる。Ｌ ＵＸ遺伝子の内部に置かれた第２８ｃｏ　Ｒ１制限部位の分割を避けるため、こ の場合酵素Ｅｃｏ　Ｒ１でもって部分的制限分割を行う一方、それに続＜　Ｂａ ｍＨ１制限は完全になるまで培養した。こうして生成した３、　１５ＫＢ長のＥ ｃｏ　Ｒ１−Ｂａｍ旧断片を最後に単離し、上述の５．７ＫＢ大のベクター誘導 体にクローニングした。受容能力のある細菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ、　Ｃ６００）に 形質転換した後、カナマイシン耐性コロニーは全て希望する８、　８５ＫＢ大の 目標プラスミドｐＧＬ４を安定した形で含有することが判明した。

水銀指標プラスミドｐＧＬ４の主要な構成特徴及び部分的制限酵素地図が図１に まとめである。プラスミドは直線化した形（Ｐｓｔｌ）で示してあり、８．８５ ＫＢ大である。それはｍａｒ−オペロンの３つの遺伝子Ｒ，ＴＰＣ、Ａを担持し ており、ｍａｒ−Ａ還元酵素遺伝子の部分欠失が“（Δ）Ａ″として考慮しであ る。Ｈｇイオンにより誘発されたｍｅｒ−レギユロンのブロモーターカ月ＫＢ標 識の高さに斜線範囲として示しである。ＬＵＸ−Ａ又はＬＬＩＸ−Ｂは２つのル シフェラーゼサブユニットを記号化する遺伝子分節を代表しており、該分節は独 自のブロモたものである。

この構成様式により、プラスミドｐＧＬＪ中にＬＵＸ遺伝子の転写、従ってルシ フェラーゼ酵素複合体の合成がｍａｒ−オペロンの制御下に置かれる。ｐＧＬ４ を備えた微生物の成長媒質中に水銀イオンが存在すると高い生物発光率が測定さ れ、これが結局かの重金属の同定及び濃度推定に利用できる。

ｐＧＬ４を備えた微生物の実験による特性表示と使用例以下に述べる全ての測定 を実施するため、ベルトルト［ＢεＲＴＨＯＬＤ］社の測定装置Ｂｉｏｌｕｍａ ｔＬＢ　９５００Ｃを以下の設定で利用したニ ー測定方式：ビーク、−測定時間：１０秒、一温度：２５°Ｃ１−設定２乎動。

１、　水銀用バイオセンサの検出感度 プラスミドｐＧＬ４で形質転換した水銀用微生物の検出感度を考慮して最初の実 験系列ではＣ６００（ｐＧＬ４）における生物発光誘導を環境媒質中のＨｇイオ ンの関数として調べた。カナマイシン３０μｇ／ｍｌを添加して標準ルリア・ブ ロス（ＬＢ）完全媒質中で単一コロニーを移植した１ｍｌ越晩培養を、得られる 細菌懸濁液各０．５ｍｌをさまざまなＨｇＣＬ２濃度で誘発するため、無菌ＬＢ 媒質と１：１０の割合で希釈した。１００μｍｏｌ／Ｉから出発して培養は１０ 倍希釈工程で１　ｐｍｏｌ／Ｉに低下する至るまでＨｇＣＬｚと混合し、バック グラウンド生物発光信号を確認するため負の制御も含め３５分間３０°Ｃで震盪 しながら培養した。培養終了後、各希釈段から各０．１ｍｌを生物発光測定容器 内に移し、ルシフェラーゼ基質の１０％溶液１μｌをイソプロパツール中のデカ ナールと混合し、直ちに生物発光測定装置（上記参照）により分析した。結果− ３つの独立した個別測定の平均値−が図２にヒストグラムの形で示しである。選 定した条件の下でバックグラウンド生物発光（成長媒質に水銀無添加の指標細菌 ）に対し相対的に１０ｎｍｏｌ／ｌの８ｇＣ１ｔ濃度が既に測定信号を著しく高 める。

ＨｇＣＩｘ　１００１００ｎ／ｌでは非誘発対照培養を基準に約１５倍、１μｍ ｏｌ／ｌでは３０倍超の生物発光率の上昇が達成される。重金属の濃度を１０μ ｍｏｌ／１以上に高めると、水銀陽イオンに対し過敏な表現型が劇的に顕在化す る。誘発されて水銀レギユロンの最大転写、従って最大生物発光を行う生物はＨ ｇｃｌｚの毒性の急性作用により死滅する。

ここに述べる方法の検出感度を正確に特定するため、バックグラウンドを基準に バイオセンサの生物発光信号をｍ−上で示したように−著しく高める水銀濃度１ ０ｎｍｏｌ／ｌより下で、より詳細な測定を行った。

３０°Ｃで６時間成長させた新鮮なＣ６００（ｐＧＬ４）細菌懸濁液各０．２ｍ ｌを濃度０．１〜ＩＯｎｍｏｌ／ｌのＨｇｃｌ、で誘発させた。３７℃で６０分 培養した後（Ｚで示すように理想的条件）、生物発光測定を実施し、その結果が 図３にグラフで示しである。

測点はやはり複数回の独立した測定の平均値であり、その最大偏差はここに示し た平均値から１０％を超えない。ゼロ値、即ちＨｇｃｌ＊イオンで誘発していな い対照培養の生物発光率（３５００００測定光信号）から出発すると、既に０． ４　ｎｍｏｌ／Ｉで測定した値４０００００が標準偏差外にあり、つまりゼロ値 と著しく相違する結果となる。このことは、濃度１　ｎｍｏｌ／１前後のＨｇｃ ｌ＊を作用させた場合光信号３５００００から５００゛０００へと１５００００ 　一つまり負の制御値の５０％−だけ高まった生物発光にそれだけ一層あてはま る。

要約するならこれらの結果は既に１　ｎｍｏｌ／１　（これは水様液０．２μｇ ／ｌ＝０．２ｐｐｂ中の分子質量２００．５９に相当する）以下の水銀陽イオン 濃度も顕著に検出できることを示す。従ってここに述べる方法は、絶対的検出限 界に比較し理想的条件の下、その検出下限が約２μｇ／ｌである最も利用される ことの多い原子吸光分析法を凌駕している（表Ｉ参照）。

２　生物発光信号の誘発動力学 ここに述べる水銀バイオセンサを測定技術で応用するための重要な前提条件は、 生物発光の誘発後長い測定期間にわたって測定信号のｉ）時間的経過、ｉｉ）最 高信号強度、ｉｉ）信号対雑音比及び汁）安定性を承知することである。

図４には測定した生物発光率の強度が、ＨｇＣ１ｇ　０．２μｍｏｌ／１を添加 した時点以降の時間の関数として一つまりｍｅｒ−オペロンの最適誘発条件（図 ２参照）の下で一記載しである。約１０分の潜伏期間後、信号の急上昇を確認す ることができ、達成可能な最高生物発光率の９０％が３５分後、１００％が５０ 分後に達成される。最高値は４時間の測定時間の間一定である。１．　（図２参 照）に記載した実験におけると同様、最終的に達成された最高生物発光率と基準 値としての非誘発微生物の信号との比は約３５である。

有効ＨｇＣ１＊イオン濃度と測定した生物発光率との間に直接的直線性が存在せ ず、従って絶対的水銀濃度を直接読み取ることができないのではあるが、生物発 光誘発の動力学と達成可能な最大測定信号及び出発値の商とを総合的に判断すれ ばバイオセンサの環境媒質中のＨｇＣ１を濃度を推定するうえで重要な情報が得 られる。それ故生物発光を例えば「オンライン」で永久的に記録する場合適宜な 測定技術とコンピュータ支援評価とで正確な濃度測定が可能となるはずである。

３、バイオセンサの水銀陽イオン選択性ｐＧＬ４を備えた微生物を水銀陽イオン 同定用バイオセンサとして使用する上で重要な判定基準は、それがＨｇイオンを 特異的に検知する点である。経験的、化学・物理的研究等の理論的検討を基にす ると、特にその他の重金属が多くの点で水銀と類似しており、それ故ここに記載 した方法を適用する場合測定結果への影響に関しそれらが問題になる。

ｐＧＬ４を備えた微生物の水銀陽イオンに対する特異性を実験で点検するため、 Ｃ６００（ＰＣｌ３）細菌各０．５ｍｌを以下の化合物０．２　μｍｏｌ／ｌと 一緒に４０分間攪拌培養した：　ＨｇＣ１８；ＭｇＣＩＢ；ＣａＣＩＢ；Ｐｂ（ ＣＨｃＣＯＯ）１１；ＺｎＣＩＢ；ＣｄＣＩＢ；前記全ての化合物の混合物；Ｈ ｇＢ（ＮＯｃ）Ｂ、生物発光測定の評価が図５に示しである。

結果として以下を確認することができる：　１．　ＨｇＣ１ｔもＨｇ８（ＮＯｃ ）、も、つまり酸化段＋１１＋２の水銀化合物もＣ６００（ｐＧＬ４）の生物発 光信号を同じ高さで誘発する。

２　その他の被検化合物はいずれも、測定した生物発光率をバックグラウンドに 対し相対的に高めない。

＆　個々には１個（ＨｇＣＩＢ）だけがバイオセンサを誘発させることのできる 諸化合物の混合物は、特異的に検知された化合物が単独で引き起こすのと同じ高 さで生物発光信号を生じる。

ｐＧＬ４を備えた微生物は、この実験が示すように水銀化合物用バイオセンサと して高度に特異化してあり、それ故、未知組成の溶液中でも信頼性ある結果をも たらす。

ｐＧＬ４を備えた微生物の応用可能性 ここに述べたバイオセンサの主要な特性として、ｉ）水銀陽イオン検出感度がき わめて高いこと、ｉｉ）バイオセンサの水銀選択性が混合物中に存在するその他 のイオン、例えば重金属イオンによっても損なわれないこと、ｉｉ）バイオセン サと信号検出ユニット若しくは増幅ユニットとの間の物理的接触なしに、つまり 測定技術的に制約された中断なしに水銀陽イオンの臨界濃度を検出することがで きること、が明らかとなる。ｐＧＬ４を備えた微生物を特徴表示するため実施し た上記実験は本方法の考えられる応用の１例である。一方で、確立された分析法 の場合に存在する検出限界以下で水銀濃度の検出が＜　０．５ｐｐｂの範囲まで 可能である。

これに関連し、例えば、飲料水中の水銀イオンに関し国際的に許容された限界値 が２　ｐｐｂに確定してあり、つまり原子吸光分析における絶対的検出限界と一 致している点を考慮しなければならない。ここに述べた方法でもって、例えば飲 料水の分析において大きな装置支出なしに、つまり分、数的にも既存水銀負荷の 再評価が可能である。第２の重要な応用分野は測定信号、つまり生物発光を非接 触式に伝送する方式から容易に推測される。工業用又は市町村の浄化設備の流通 槽内に集落化させることのできる微生物にプラスミドｐＧＬ４を備えることも可 能である。こうして廃水の水銀負荷を持続的に監視することがごく簡単となり、 測定結果から臨界変化を直ちに検知することができるので、廃水の品質について 「オンライン」で情報を提供することのできる早期警戒システムを構成すること ができる。

数値表 （測定３回のそれぞれ丸めた平均値） 図２について：　ＨｇＣ１を濃度　生物発光率１９Ｍ　１０４００ １０９Ｍ　１２１００ １００９Ｍ　１１８００ １　ｎＭ　１１０００ １０　ｎＭ　１６０００ １００　ｎＭ　１５００００ １μＭ　３３５０００ １０μＭ　３３００ １００μＭ　５０ 図３について：　［ＨｇＣｌｌ３］濃度　生物発光率０．０　３５０２００ ０．１　３５０１００ ０．２　３８６７００ ０．４　３９９９００ ０．８　４９０６００ １．０　５００１００ １．５　５７００００ ２．０　６３００００ ３．０　６３５０００ ４．０　６７００００ ５．０　６５００００ 図４について：ＨｇＣ１ｆｌ　０．２μＭ　生物発光率添加後の時間Ｃ分〕 図５について：　生物発光率 無添加　１７００ ０．２μＭ　ＨｇＣＬｔ　６９０００ ０．２μＭ　ＭｇＣＬｚ　１　５００ ０．２μＭ　ＣａＣＬｔ　８００ ０．２μＭ　Ｐｂ（ＣＨｃＣＯＯ）ｔ　１４０００．２μＭ　ＺｎＣＬｚ　１０ ００ ０．２μＭ　ＣｄＣＬ２１　ｔｏ。

上記化合物各０．２μＭか らなる混合物　６６５００ ０．２μＭ　ＨｇＢ（ＮＯ９）ｔ　６８０００表工 （各個別元素を弱鉱酸性溶液中で測定）分析方式：　測定限界： ＩＣＰ−ＡＥＳ：　１０〜２０　ａ　ｇ／ｌ［ＣＰ−ＭＳ：　＝　０．１μｇ／ ｌ 黒鉛管ＡＡＳ：　＝　２　μｇ／ｌ ハイブリッドＡＡＳ：　＝　０．５μｇ／ｌ冷蒸気ＡＡＳ　＝　０．００１μｇ ／ｌ　ｐＧＬ４バイオセンサ：　＝０．２μｇ／ｌ （Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｃ６００） （［ＣＰ＝誘導結合高周波プラズマ ＡＥＳ　＝オージェ電子分光 ＡＡＳ　＝原子吸光分析 ＭＳ　−質量分析〕 第　１　図 第２図 第　５　図 ０，２μＭＨｇ（ＮＯ） χ 菌　０，２μＭＭｇ喝　■ 負の制御　口 補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８の規定による補正書）平成３年７月２９日

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. １．水銀に対して一定の特異性を有する微生物により液状又はガス状環境中の水 銀化合物を検出する方法において、指標菌株に、ベクターを媒介とした遺伝子接 合伝達により、（Ｉ）水銀イオンにより特異的に誘発可能な遺伝子系（ｍｅｒ− オペロン）と （ＩＩ）生物発光能を付与する細菌性ルシフェラーゼ（ＬＵＸ−）遺伝子複合体 とを付与することを特徴とする方法。
2. ２．ｐＧＬ４と標示したプラスミドが （Ｉ）水銀耐性プラスミドｐＤＧ１０６からなる水銀レギュロン、（ＩＩ）ビブ リオ・ハルベイからなるＬＵＸ−遺伝子複合体、および （ＩＩＩ）抗生物質カナマイシンに対する耐性を媒介する遺伝子 以上の構成特徴を兼備していることを特徴とする請求項１記載の方法。
3. ３．起源と毒性物質に対する感受性とを異にする微生物を、プラスミドｐＧＬ４ の導入により、生物発光を基に動作する水銀特異的バイオセンサに変換させるこ とを特徴とする請求項２記載の方法。
4. ４．一定の臨界濃度を超える水銀イオンが存在すると、プラスミドｐＤＧ１０６ からなる水銀レギュロンの、水銀イオンにより誘発可能なプロモーターが刺激さ れ、オペロンの遺伝子転写が高まり、そして結局タンパク質平面での発現が強ま ることを特徴とする請求項２記載の方法。
5. ５．ビブリオ・ハルベイからなるＬＵＸ−遺伝子複合体がクローニングにより水 銀リギュロン中に、両遺伝子系が共に単一のポリシストロニックメッセンジャー ＲＮＡ上に記号化される程度に導入され、その合成率がｍｅｒ−オペロンの、水 銀陽イオンにより誘発可能なプロモーターの活性に直接依存していることを特徴 とする請求項３記載の方法。
6. ６．一定濃度を超える水銀陽イオンの存在に促進されて合成されたＲＮＡがそれ により符号化されたタンパク質に定量的に翻訳され、そのことから、酵素ルシフ ェラーゼがより多量に存在することに起因して、使用した微生物の生物発光が強 まることを特徴とする請求項４記載の方法。 ７　バイオセンサが水銀陽イオンに対し絶対的選択性を有しており、その明確な 同定が組成の異なる（重金属）混合物からでも容易に可能であることを特徴とす る請求項２記載の方法。 ８　水銀陽イオン検出下限がｐｐ６以下の範囲内であり、従ってプラスミドｐＧ Ｌ４を付与されたバイオセンサの水銀に対する検出感度が、例えば原子吸収スペ クトル分析法のような、確立された高感度重金属検出法よりも優れていることを 特徴とする請求項２記載の方法。 ９　この方法は感度が高く又バイオセンサと信号検出ユニットとを直接接触させ ることなく測定値を検出するために、水銀負荷の永続的記録に必要な（オン・ラ イン）応用に提供することを特徴とする請求項２記載の方法。