JPH04503301A - 合成インターロイキン―６ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

５１、細菌たる請求項５０の単細胞宿主。 ５２、（ａ）ＩＬ−６活性を有する第１ペプチド部分と、第１ペプチド部分と単 細胞宿主によって発現され得る第３タンパク質部分との間の化学的に開裂可能な ペプチドリンクを有する第２ペプチド部分と、を有する合成工性雑種タンパク質 をコードするヌクレオチド配列を有する組換え遺伝子であって、宿主内で複製、 転写、および翻訳をされることができるものを含有している単細胞宿主微生物を 培養し、（ｂ）上記宿主によって生成された三つに分かれたタンパク質を特定し 、 （ｃ）第２ペプチド部分を化学的に又は酵素的に開裂させ、そして （ｄ）　ＩＬ−６活性を有する第１ペプチド部分を取り出す、という工程を特徴 とするＩ　Ｌ−６活性を持つペプチドを生成する方法。 ５３、第２ペプチド部分が、タンパク分解酵素に反応するペプチドリンクを有す る請求項５２に記載の方法。 ５４、第２ペプチド部分がコラーゲナーゼ惑応部位を有する請求項５３に記載の 方法。 ５５、第２ペプチド部分がエンテロキナーゼ感応部位を有する請求項５３に記載 の方法。 ５６、第２ペプチド部分が因子Ｘａ感応部位を有する請求項５３に記載の方法。 ５７、第３タンパク質部分が、β−ガラクトシダーゼ配列又はその部分を有する 請求項５３に記載の方法。 ５８、第３タンパク質部分が、ＴｒｐＥ遺伝子生成物を有する請求項５３に記載 の方法。 ５９、第１ペプチド部分は、スルフヒドリル結合を形成できなく、第２ペプチド 部分はコラ−ゲナーゼ感応部位を有するペプチドから成り、第３タンパク質部分 は、β−ガラクトシダーゼ酵素活性を持つタンパク質から成ることを特徴とする 請求項５３に記載の方法。 ａｏ、第１ペプチド部分は、スルフヒドリル結合を形成できなく、第２ペプチド 部分はエンテロキナーゼ感応部位を有するペプチドを有し、第３タンパク質部分 はＴｒｐＥ遺伝子生成物またはその部分であるタンパク質を有する請求項５９に 記載の方法。 ６１、第１ペプチド部分は、スルフヒドリル結合を形成できなく、・第２ペプチ ド部分は因子Ｘａ感応部位を有するペプチドを有し、第３タンパク質部分はＴｒ ｐＥ遺伝子生成物またはその部分であるタンパク質を有する請求項５９に記載の 方法。 ５２、ｉｌｌペプチド部分はスルフヒドリル結合を形成できなく、第２ペプチド 部分はエンテロキナーゼ感応部位を有するペプチドを有し、第３タンパク質部分 はβ−ガラクトシダーゼ配列またはその部分を持つ請求項５９に記載の方法。 ６３、第１ペプチド部分はスルフヒドリル結合を形成できなく、第２ペプチド部 分は因子Ｘａ感応部位を有するペプチドを有し、第３タンパク質部分は、β−ガ ラクトシダーゼ配列またはその部分を有する請求項５９に記載の方法。 ６４、第１ペプチド部分が第２ペプチド部分からの開裂後に、その第２ペプチド 部分からの残基アミノ酸を保持しないものである請求項５９に記載の方法。 ６５、上記工性雑種タンパク質が上記宿主生物によって生成された全タンパク質 の少なくとも約２０％を有するものである請求項５２〜６４のいずれか１つに記 載の方法。 ６６、上記宿主生物が原核生物である請求項５２〜６４のいずれか１つに記載の 方法。 ６７、上記宿主生物が細菌である請求項６６に記載の方法。 ６８、上記宿主が細菌である請求項６５に記載の方法。 ６９、上記第１ペプチド部分がスルフヒドリル結合を持たないものである請求項 ５２〜６４のいずれか１つに記載の方法。 ７０、上記第１ペプチド部分が、第５図に示されたＩ　Ｌ−６アミノ酸配列を有 する請求項５２〜６４のいずれか１つに記載の方法。 ７１、上記工性雑種タンパク質が、上記宿主生物によって生成された全タンパク 質の少なくとも約２０％を有する請求項７０に記載の方法。 ７２、アクセツションナンバーＡＴＣＣ４０５１６（ｐ３４０）を有する組換え プラスミド。 ７３、アクセツションナンバーＡＴＣＣ４０５１７（ｐ３６７）を有する組換え プラスミド。 ７４、ＩＬ−６活性を有する第１ペプチド部分と、開裂可能なペプチドを有する 第２ペプチド部分と、及び選ばれた宿主生物によって発現され得る第３タンパク 質部分と、を有する実質的に純粋な組換えタンパク質。 ７５、請求項１の遺伝子によってコードされた組換えタンパク質。 ７６、請求項２の遺伝子によってコードされた組換えタンパク質。 ７７、請求項３の遺伝子によってコードされた組換えタンパク質。 ７８、請求項４の遺伝子によってコードされた組換えタンパク質。 ７９、請求項５の遺伝子によってコードされた組換えタンパク質。 ８０、請求項６の遺伝子によってコードされた組換えタンパク質。 ８１、請求項７の遺伝子によってコードされた組換えタンパク質。 ８２、Ｍ３項８の遺伝子によってコードされた組換えタンパク質。 ８３、請求項９の遺伝子によってコードされた組換えタンパク質。 ８４、請求項１０の遺伝子によってコードされた組換えタンパク質。 ８５、請求項１１の遺伝子によってコードされた組換えタンパク質。 ８６、請求項１２の遺伝子によってコードされた組換えタンパク質。 ８７、請求項１３の遺伝子によってコードされた組換えタンパク質。 ８８、請求項１４の遺伝子によってコードされた組換えタンパク質。 ８９、第８ｂ図に示すｒＬ−６８よびコラーゲンアミノ酸配列を有する組換えタ ンパク質。 ９０、請求項７５〜８８のいずれか１つのタンパク質の化学的または酵素的な開 裂生成物である所のＩ　Ｌ−６活性を有する組換えタンパク質。 ９１、システィンを含有せず、請求項７５〜７８のいずれか１つに記載のタンパ ク質の化学的又は酵素的な開裂の生成物であって、開裂後に第２ペプチド部分か ら導出される残基アミノ酸を保有しないことを特徴とするＩ　Ｌ−６活性を有す る組換えタンパク質。 ９２、ＩＬ−６活性を有し、かつ実質的に不溶性である合成ペプチド。 ９３、スルフヒドリル結合を形成し得ない請求項５９項に記載のペプチド。 ９４、第５！のＩＬ−６アミノ酸配列を有し、該配列はシスティン、あるいはそ の同族体、類似体、又はそれらの活性部分を含有していないものである合成ペプ チド。 ９５、配列がシスティンを含有していない第５図のＩ　Ｌ−６アミノ酸配列を有 する合成ペプチドであって、コラーゲンリンカ−のアミノ酸が、部分的に又は全 体的に削陳されていることを特徴とする合成ペプチド。 ９６、配列がシスティンを含有していない第５図のＩ　Ｌ−６アミノ酸配列を有 する合成ペプチドであって、コラーゲンリンカ−のアミノ酸とそのコラーゲンを ＩＬ−６タンパク質にブリッジするセリン残基の全部が削陳されている合成ペプ チド。 ９７、請求項９４乃至９６のいずれか１つに記載の合成ペプチドであって、Ｎ− 末端配列の第２アミノ酸としてグリシンの代わりにプロリンを有している合成ペ プチド。 ９８１？求項９４乃至９７のいずれか１つに記載の合成ペプチドであって、Ｎ− 末端配列に最初のメチオニンを欠いている合成ペプチド。 ９９．アミノ酸の削腺、置換、挿入、逆位、付加又は交換により請求項９４乃至 ９８のいずれか１つに記載のペプチドの誘導体である合成ペプチド。 １００、アミノ酸２９からアミノ酸２１２までの天然Ｉ　Ｌ−６のアミノ酸配列 の部分から成る合成ペプチドであって、上記配列はシスティンを含むが、上記ア ミノ酸２９はグロリンの代わりにグリシンであることを特徴とする合成ペプチド 。 １０１、最初のメチオニン残基を有する請求項１００に記載の合成ペプチド。 １０２、請求項９２乃至１０１の合成ペプチドをコードするヌクレオチド配列を 有する組換え遺伝子。 １０３、請求項１０２の組換え遺伝子を有するベクター。 １０４、請求項１０２の組換え遺伝子を有する単細胞宿主。 １０５、ｆｆ請求項１０のベクターを有する単細胞宿主。 １０６、宿主中に抗体生成を刺激する方法であって、該宿主に請求項９０〜１０ １のいずれか１つのペプチドの有効量を、有効な抗原と共に投与する方法。 １０７、請求積項９０〜１０１いずれか１つに記載のペプチドの有効量を、宿主 に投与することを含む、宿主におけるウィルス感染を予防または処置する方法。 １０８、請求項９０〜１０１のいずれか１つに記載のペプチドの有効量を、宿主 に投与することを含む、宿主における肝性タンパク質の生成を刺激する方法。 １０９．請求項９０〜］、　Ｏｌのいずれか１つに記載のペプチドの肴効量を、 宿主に投与することを含む、宿主における天端Ｂ細胞の分化を刺激する方法。 １１０８請求項９０〜１０１のいずれか１つに記載のペプチドの有効量を、宿主 に投与することを含む、宿主における造血幹細胞を刺激する方法。 １１１、請求項９０〜１０１のいずれか１つに記載のペプチドの有効量を、宿主 に投与することを含む、免疫抑制宿主を処置する方法。 １１２、請求項９０〜１０１のいずれか１つに記載のペプチドと反応する単一ク ローン性抗体の有効量を、宿主に投与することを含む免疫グロブリン生成におけ る機能障害を含む病気状態を処置する方法。 １１３、薬学的に受容可能な担体と組合せた請求項９０〜１０１のいずれか１つ に記載のペプチドの有効量を含有する薬学的製剤。 １１４、請求項１１３に記載の製剤において、上記ペプチドが、少なくとも１つ の他のシトカイン［ｃｙｔｏｋｉｎｅ］又は造血成長因子と結合されていること を特徴とする製剤。 １１５．請求項１１４に記載の製剤において、上記シトカイン又は造血成長因子 が、エリスロボエチン、インターロイキン及びコロニー刺激因子から選ばれてい る製剤。 １１６、請求項１１４に記載の製剤において、上記インターロイキンが、ＩＬ− １，ＩＬ−２又ハｒ　Ｌ　−３テあッテ、上記コロニー刺激因子が、Ｇ−Ｃ３Ｆ 、ＧＭ−Ｃ５Ｆ、又はＭ−Ｃ５Ｆであることを特徴とする製剤。 １１７、　請求積項１１４〜１１６記載のシトカイン又は造血成長因子と開時的 又は連続的に共同投与して治療に使用する請求項９０〜１０１１項のいずれか１ つに記載の合成ペプチド。 １１８、請求項１１３に記載の製剤において、上記ペプチドが感染防御抗原の有 効量と組合わされて、アジュバントとして存在していることを特徴とする製剤。 １１９、誘導可能なプロモータである第１部分と、ミニシストロン配列である第 ２部分と、停止コドンを欠くタンパク質を有するＤＮＡ７ラグメントを挿入する ためのクローニング部位である第３部分と、開裂可能なペプチドのヌクレオチド 配列である第４部分と、該第４部分の開裂可能なペプチドに関してフレーム内に あるβ−ガラクトシダーゼのヌクレオチド配列である第５部分と、をコードして いる核酸配列を有する組換え核酸ベクターであって、上記核酸配列の＠３部分ク ローニング部位が、β−ガラクトシダーゼの第５部分に翻訳読取り相外にあるこ とを特徴とする組換え核酸ベクター。 １２０、第８ｂ図に示されたＤＮＡ配列を有する請求項１１９に記載のベクター 。 １２１、ｍ３項９２〜１０１のいずれか１つに記載のペプチドをコードしている ＤＮＡ配列を有する請求項１〜１４のいずれか１つに記載の組換え遺伝子。 １２２、ｆｆ墓項１２１に記載の遺伝子を有する組換えベクター。 １２３、請求項１２２に記載のベクターを含んでいる単細胞宿主。 １２４、ｐ３４０プラスミドを有する組換えベクター。 １２５、突然変異体ＩＡＢ　ＤＮＡ配列を有する組換え請求項１２５のベクター によって生成されたペプチド。 １２７．１Ｌ−５活注を有するペプチドをコードしているＤＮＡ配列であって、 上記ペプチドは突然変異体ＩＡＢによって形成された配列を有することを特徴と するＤＮＡ配列。 １２８、請求項１２７のＤＮＡ配列によってコードされたペプチド。 １２９．１Ｌ−６活性を有するペプチドであって、上記ペプチドは含有アミノ酸 残基４−２３が除去された天然ＩＬ−６配列を有することを特徴とするペプチド 。 １３０、請求項１２９のペプチドをコードするＤＮＡ配列。 明細書 合成インターロイキン−６ １、はじめに 本発明は、遺伝子及び組換え成熟インターロイキン−６（以下ＩＬ−６）である それら遺伝子のコードされたタンパク質、並びにＴ　Ｌ−６活性を保持する合成 システィンフリータンパク質に関する。これらのタンパク質は、開裂部位及び担 体ＤＮＡの部分と共に、インターロイキン−６又はその修飾された合成態のいず れかから成るトリハイブリッド融合タンパク質のアミノ酸又はカルボキシ末端ペ プチド部分として、単細胞宿主内に発現される。この組換え融合タンパク質は、 開裂部位に対して特異的なタンパク分解酵素で、生体外で精製され消化されるも ので、Ｉ　Ｌ−６の働きを持つペプチドを雇主させる。そのペプチドは、担体Ｄ ＮＡによって発現された大きなβ−ガラクトシダーゼタンパク質から容易に分離 される。精製されたペプチドは、免疫グロブリン及び肝性タンパク質を含むタン パク質の生成を刺激するため使用することができ、また、ウィルス感染を防止す るためにも使用され得る。そのタンパク質は、また、アジュバントとしてワクチ ン調剤に添加することもできる。 ２、発明の背景 ２．１．ペプチド　レギュレータ 遠隔細胞の代謝活性を調節する生理的作用物は、１９０９年、英国の科学者Ｂａ ｙｌｉｓｓとＳｔａｒｌｉｎｇｅｒによって、ホルモンと命名された。これらの 作用物は、アミノ酸誘導体、ステロイド及びペプチドから成る。さらに最近では 、細胞の増殖を活発にし及び／又は抑制する種々のペプチドが特定され、刺激因 子又は成長因子と名付けられている。そのような細胞因子に対する別の一般名称 は、シトカイン［ｃｙｔｏｋｉｎｅｌであるが、さらに正確な名称は、リンパ球 によって生成されるリンフ才力インという起源細胞である。りンフオカインは、 また、免疫系における細胞の増殖を調節する分子のインターロイキンに属する。 免疫系によって生成される他のペプチドは、特別な抗ウイルス性の作用をもたら す。そのようなペプチドはインターフェロンと呼ばれる。 インターフェロンと見なすためには、因子は、ＲＮＡ及びタンパク質の両方の合 成を含んでいる細胞代謝性プロセスを介して抗ウイルス性活動に作用するタンパ ク質でなければならない。 （インターフェロン命名法委員会、　１９８０．Ｎａｔｕｒｅ　８６（２）：１ １０）２．２　インターロイキン−６ インターロイキン−６（ＩＬ−６）は、多くの研究者によって、ＩＦＮβ２Ａ、 ＢＳＦ−２，Ｈ３Ｐ、Ｇ−Ｃ５Ｆ、Ｃ５−３０９、ＨＰＧＦ、あるいは２６ＫＤ ａタンパク質として選択的に述べられたペプチドに対して与えられた用語である 。今日ＩＬ−６として知られているこれらのオリジナル因子には、ｌ）インター ７　ｚ　Ｏ７−β２　（Ｚｉ１ｂｅｒｓｔｅｉｎ他、１９８６．ＥＭＢＯＪ、５ ：２５２９）又はポリ（ｒ　Ｉ）ポリ（ｒＣ）刺激繊維芽細胞において初めて検 出された２６ｋＤａタンパク質（Ｈａｅｇｅｍａｎ他、　１９８６．Ｅｕｒ、Ｊ 、Ｂｉｏｃｈｅ＋＊、１５９：６２５）　、　２）　Ｂ細胞刺激因子−２（ＢＳ Ｆ−２）と名付けられた強力なＴ細胞誘導リン７オカイン（Ｈｉｒａｎｏ他、１ ９８６、Ｎａｔｕｒｅ　３２４ニア３）　、　３）　Ｂ細胞ハイブリドーマ／プ ラスマ細胞腫成長因子（ＨＰＧＦ又はＨＧＦ）と呼ばれる繊維芽細胞生１６８： ５４３；Ｔｏｓａｔｏ他、１９８８．５ｃｉｅｎｃｅ　２３９：５０２）　、及 び４）肝細胞刺激因子（Ｈ３Ｐ）と呼ばれるペリ７工ラルブラ７ド単球タンパク 質（Ｇａｕｌｄｉｅ他、　１９８７．Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、 ８４ニア２５１）がある。 ！Ｌ−６ペプチドの機能は、基本的には、人類病理学における炎症及び免疫応答 の両方に対するものである。これらの機能は、多様であり、試験される細胞の型 に依存する。ｒ　Ｌ−８は、白血球、上皮細胞、繊維芽細胞を処理したＩＬ−１ 、肝細胞、血管内皮細胞、噴門粘液腫組織、ある種の膀胱癌、ある種のけい部癌 細胞及びダリア細胞において、発現される。Ｉ　Ｌ−６は、抗体生成細胞の増殖 及び分化をもｔ；らすよう、Ｂ細胞とＴ細胞の相互作用において含まれるペプチ ドの一種である。Ｉ　Ｌ−６は、活性化されたＢ細胞における免疫グロブリンの 分泌を非常インターフェロンとしてＩ　Ｌ−６の初期特定に対して応答し得る抗 ウイルス性活動に関して、Ｉ　Ｌ−６の本質的発現を与えた組換えＴ　Ｌ−６プ ラスミドでの中国ハムスター卵巣細胞の変化は、媒体内のペプチドの検出におい てだけでなく、抗ウイルス性活動の検出においても生じた（Ｚｉ　１ｂｅｒｓｔ ｅｉｎ他、１９８６．ＥＭＢＯＪ、５：２５２９） 天然Ｉ　Ｌ−６が抗ウイルス性活動を有すか否かについて、科学誌で討論された 。抗ウイルス性の特別な活動はＷｅｉｓｓｅｎｂａｃｈ等によって初めて報告さ れた（１９８０．Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、７７：７１５２）； また、この科学者グループのメンバーは、彼らの標本ニおける抗ウイルス性活動 について報告を続けた（Ｃｏｎｔｅｎｔ他、１９８５、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈ ｅｍ、１５２：２５３；Ｍａｙ他、１９８８．Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｎ、２６３ ニア７６０を参照）。抗ウイルス性活動に対して報告された値は、５−１０　Ｘ 　１０　’Ｕ／ｍｇタンパク質から１−３　Ｘ　１０　”Ｕ／ｍｇと同程度の低 い値までの範囲である。反対に、多数の他の研究者は、彼等の精製された組換え Ｉ　Ｌ−６標本に関連して、大きな抗ウィルＩ　Ｌ−６は、ＩＮＦの活動を抑制 させることが明らかとなり？＝（Ｋｏｈａｓｅ等、］９８７．Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ 　Ｂｉｏｌ、ｚ：２７３）。しかし、ＥＢＶで影響を受けた人のＢ−リンパ芽球 細胞の成長を刺激する（ＴｏｓａｔＯ等、１９８８．５ｃｉｅｎｃｅ　２３９： ５０２）。また、人の脚線細胞及び１９７８球の成長をも刺激する（Ｌｏｔｓ等 、１９８８．Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、１６７（ｓ）：１２５３）する成長因子とし て特定された。ＩＬ−３と結合して、ｒＬ−６は、造血剤始原細胞の増殖を支え （Ｖａｎ　Ｄａｍｍｅ等、　１９８７．Ｐｒｏｃ。 Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、８４：９０３５）、さらに、傷や感染に応答して 、肝細胞タンパク質のサブセットの合成を調節する（Ｇａｕｌｄｉｅ等、１９８ ７゜Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、８４ニア２５１　；Ａｎｄｕｓ等 、１９８７．ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、２２］：］８）。それ自体の作用の増大、及 びＩＬ−１，ＴＮＦ、ＴＦＮＢ。 及びＰＤＧＦのような他のペプチドレギュレータとの相互作用が、生体恒常性調 節に必要な複合シトカイン網において中心的役割を演するという示唆があった（ Ｋｏｈａｓｅ等、１９８７．Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏ＋、７：２７３；Ｓａｈ ｇａｌ等、１９８７．５ｃｉｅｎｃｅ　２３５ニア３１；Ｂ１１１ｉａｕ、ｌ９ ８７．ｆｕｎｕｎｏｌ、Ｔｏｄａｙ　８：８４；　５ｐｏｒｎ　ａｎｄ　Ｒｏｂ ｅｒｔｓ、１９８８．Ｎａｔｕｒｅ　３３２：２１７）２．３．インターロイキ ン−６タンパク質のＤＮＡ配列異なる生物的活動に基づいて、多くの研究者によ って初めて特徴づけられた因子の基本構造を比較することによって、それらのア ミノ酸配列の同一性が明らかにされ、それらのペプチドをインターロイキン−６ （ＩＬ−６）として再命名することになった。ポリ（ｒｌ）（ｒＣ）又はシクロ へキシミド及びアクチノマイシンＤのいずれか一方で処理した繊維細胞は、ＩＦ Ｎβ２と呼ばれる抗ウイルス性活性を導くことのできるタンパク質に対してコー ドされた１　４５ｍＲＮＡ分子を生成した（Ｗｅｉｓｓｅｎｂａｃｈ等、　１９ ８０．Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ　、７７：７１５２；英国特許第 ２．０６３゜８８２号）。この導かれたｍＲＮＡ７ラクシタンのｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ コピーから生成されｔ；クローンは、ＩＦＮβｌ、ＩＦＮ７σＡ、ＩＦＮ７σ、 及びＴ　Ｆ　Ｎ　ａ　Ｄとは明らかに異なったＩＦＮβ２部分配列を与えた（Ｃ ｈｅｒｎａｊｏｖｓｋｙ等、１９８４．ＤＮＡ　３：２９７；Ｒｓｖｅｌ等、１ ９８３゜Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　５：２０５１．Ｇｒｅｓｓｅｒ　ｅｄｌＡｃａ ｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎ、Ｙ、）。多くのｃＤＮＡクローンから誘導された 完全なＩＦＮβ２配列は、Ｓｌヌクレアーゼマツピングによって明らかにされた ｍ　ＲＮ　Ａ）　開始部位、ＴＡＴＡボックス、ポリアゾニレ−シコン部位、Ａ ＴＧ開始配列に加えて、２１２アミノ酸長タンパク質を形成した（Ｚｉｌｂｅｒ ｓｔｓｉｎ等、ｌ９８６．ＥＭＢＯＪ、５：２５２９；ローヨッパ特許０２２０ ５７４Ａｌ、公開日１９８７年５月６日）。ＩＦＮβ２配列の別の解析において 、Ｍａｙ等、　１９８６．Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、８３：８９ ５７もまた、Ｚｉｌｂｅｒｓｔｅｉｎ等、１９８６．ＥＭＢＯＪ、５：２５２９ 　；の部分ｃＤＮＡクローンではなく、全長ｃ　Ｄ　Ｎ　スクリーンを用いて、 その２１２アミノ酸タンパク質配列を形成した。これらの研究者達は、ＩＦＮβ ２がＴＮＦによって導かれたことについても留意した。 それらの２６ｋＤａタンパク質は、検出可能な抗ウイルス性活性を有しなかった が、Ｆｌａｅｇｅｍａｎｎ等、　１９８６．Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１５ ９：６２５は、シクロへキシミド又はインターロイキン−１での処理によって繊 維芽細胞内に導かれたそれらの２６ｋＤａタンパク質の配列が、Ｚｉ　１ｂｅｒ ｓｔｅｉｎ等、１９８６．ＥＭＢＯＪ、５：２５２９；のＩＦＮβ２と同一であ うたことを認めた。そのタンパク質の５′末端は、ｃＤＮＡクローンコレクシ１ ンにおいて失われていたので、２６　ｋＤａペプチドの内部ｃＤＮＡ配列との相 補性を試験する人遺伝子ライブラリィのスクリーンは、人遺伝子の５′末端領域 内の１６２ｂｐイントロンのＤＮＡ配列と同様に、完全な２１２アミノ酸配列を 与えたゲノミッククローンを生み出しｔ；。３３０９個別ペプチド配列を含んで いるタンパク質データベース内のタンパク質との大きな類似性を見い出せなかっ た。 別の研究（Ｈｉｒａｎｏ等、１９８６．Ｎａｔｕｒｅ　３２４ニア３）において 、ＢＳＦ−２タンパク質が、その因子を構造的に生成しｆ＝人のＴ細胞株から精 製され、かつＨＴＬＶ−１ウイルスを用いて確立された。 ９個のペプチドフラグメントからのアミノ酸配列データが、ｃＤＮＡライブラリ ィを探すために使用された合成オリゴマーを精製するために必要な情報を与えｔ ；。ｃＤＮＡクローンは、精製Ｉ　Ｌ−６タンパク質のアミノ末端のごとく配列 された。成熟タンパク質配列の端部は、核酸配列から予測された２１２アミノ酸 プレペプチドが、天然成熟ＢＳＦ−２（ＴＬ−６）タンパク質を精製するために 開裂される２８アミノ酸長信号ペプチドを含んだことを示すｐｒｏ−ｖａ　１− ｐｒｏ−ｐｒｏであった。 完全ＢＳＦ−２（ＩＬ−６）ゲノミックＤＮＡの続いての配列解析は、染色体セ グメントが、５個のエクソン及び４個のイントロンを含んでいることを証明した （Ｙａｓｕｋａｗａ等、１９８７．ＥＭＢＯＪ−６：２９３９）。ＢＳＦ−２（ ＩＬ−６）遺伝子の組織は、２つの遺伝子が比較されると、Ｇ−Ｃ５Ｆの組織と まさに類似していた。 ＨＧ　Ｆ　（Ｂｒａｋｅｎｈｏｆｆ等、１９８７．Ｊ、Ｉ＋＋＋ｍｕｎｏ１．１ ３９＝４１１６）の配列の完成後、ＨＧＦとＴ　Ｌ−６の同一性が確認された。 さらに、（ＨＧＦ、ＩＦＮβ２．２６ＫＤａタンパク質すなわちＢＳＦ−２など の）ＩＬ−６遺伝子の全ての報告された解析における配列差の検討によって、僅 かな単塩基変化が明らかにされた。ペプチド読取りフレーム内で生ずる２つ変化 のいずれもアミノ酸変化を生じない、まＩ；、Ｖａｎ　Ｄａｍｍｅ等、１９８８ ．Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４０：１５３１４は、ＨＧＦのアミノ末端配列が、Ｉ ＦＮβ２．２６ＫＤａタンパク質及びＢＳＦ−２と同一であったことに注目した 。 Ｃ１ａｒｋ他（国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ８７１０１６１１　、公開番号ＷＯ３ ８１００２０６゜１９８８年１月１４日公開）もまた、Ｔ　Ｌ−６のｃＤＮＡ配 列を報告している。 ２．４．ＩＬ−６におけるシスティン残基の保存会てのシスティン残基位置は、 ２つのタンパク質、すなわちＢＳＦ−２（ＩＬ−６）及びＧ−Ｃ９Ｆ間に保存さ れる。この類似性に注目して、Ｈｉｒａｎｏ等、１９８６．Ｎａｔｕｒｅ　３２ ４ニア３は、分子内のジスルヒド結合がＢＳＦ−２（ＩＬ−６）及びＧ−Ｃ５Ｆ の構造に重要だろうことを示唆した。それらの示唆は、多くの成長因子すなわち 、ＢＳＦ−２（ＩＬ−６）がＧ−Ｃ５Ｆと遠く関連することを明らかにしたイン ターロイキンとインターフェロンの個人のデータベースにおけるＢＳＦ−２（Ｔ Ｌ−６）配列と他の配列との比較に基づいていた。しかし、ナシ羅ナル・バイオ メディカル・リサーチ基礎データベース又は遺伝子配列データバンクとの比較で は、それらのデータバンクにおける他のタンパク質との大きな類似性が明らかに されなかつｔ；。 システィンの保存は、また、Ｖａｎ　５ｎｉｃｋ等、１９８Ｂ、Ｎａｔ１．Ａｃ ａｄ、Ｓｃｉ、８３：９６７９によって示唆された。彼らはマウスのＨＰ−１を 配列し、人Ｉ　Ｌ−６に関して保存された相同体を見出した。彼らは、まｔ二、 ＨＰ−１，１Ｌ−６及びＧ−Ｃ５Ｆのシスティンの位置を調べ、システィン位置 が３つのペプチド内で保存されたことに注目しｔ二。 Ｙａｓｕｋａｖａ等によって上述されたように、ＢＳＦ−２（ＴＬ−６）遺伝子 内のエキソン及びイントロンの組織は、２つの遺伝子が比較されたとき、Ｇ−Ｃ ＳＦの組織とまさに類似したものであった。この発見は、２つのタンパク質のそ れぞれ改革的歴史である（ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ、　１９８７．　Ｊ、ＣＩ　ｉｎ 、　Ｉ＋ｎｍｕｎｏ１．７（５）：３４３参照）。 タンパク質内のシスティンの存在は、タンパク質が細菌宿主において組換え生成 されるとき、プロセス上の問題を引き起こす。微生物的に生成されたシスティン 含有タンパク質は、タンパク質生成物の精製を非常に複雑にする多量体を形成す る傾向がある。組換えタンパク質の還元や再酸化など、競りかの付加的精製ステ ップが、適切な構造状態のタンパク質を得るために必要である。化学的に等価な 中性アミノ酸によって同時置換して、１以上のシスティンを除去することが、Ｉ 　Ｌ−６分子の単離及び精製を簡単にするために好ましい。しかし、微生物的に 活発な分子からシスティンを連続的に除去することは、通常形成されたジスルヒ ド結合の存在しない三次元構造が実質的に変えられ得るという点で、予測できな い。１以上のこれらの残基が、所望の活動を保持するために必要不可欠であるこ とが度々ある。 ！　Ｌ−６のシスティ〉が保存されているので（上記参照）、天然システィン残 基は、Ｉ　Ｌ−６などのシトカインに対して特に臨界的であることが期待される 。さらに、他のシトカインの生物的活動が、システィンが除去される場合に影響 を受けるであろうと報告されている。例えば、３つの内の１つのシスティン残基 のみが、ＩＦＮ−βの生物的活動に影響を与えることなく除去され得る。（米国 特許第４．７３７．４６２号　参照）。同様に、Ｉ　ＦＮＩｌｌの４個のシステ ィンの内の１個のみが、活動を完全に喪失することなく除去され得る（Ｍａｒｋ 等＋　１９８４．Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、ｓｃｉ、８１：５６６２）。 ２．５１組換えタンパク質としての 天然インターロイキン−６の生成 ２．５．１．組換えＤＮＡ技術ならびに遺伝子発現組換えＤＮＡ技術は、ＤＮＡ ビークル（ベクター）内に特別なりＮＡ配列を挿入し、宿主細胞内で複製できる 組換えＤＮＡ分子を形成することを含む。一般に挿入されたＤＮＡ配列は、受容 株ＤＮＡビークルに対して異物である。すなわち、挿入されたＤＮＡ配列及びＤ ＮＡベクターは、全く遺伝情報を交換しない生態から導かれる。または挿入され たＤＮＡ配列は、全体的に又は部分的に合成的に作られ得る。燈つかの組換えＤ ＮＡ分子の構成を可能にする一般的方法が開発された。 構成に対して使用された方法に関係無く、組換えＤＮＡ分子は、宿主細胞と両立 可能であらねばならない。すなわち、それは、宿主細胞内で自律複製できるか、 又は１または２以上の宿主細胞染色体中に安定的に一体化されうるものでなけれ ばならない。組換えＤＮＡ分子は、また、所望の組換えＤＮＡ分子を選択できる 識別機能も有していることが好ましい。さらに、もし全ての適切な複製、転写、 及び翻訳の信号が、組換えベクター上に正確に配列されるなら、異物遺伝子は、 例えば微生物発現プラスミドの場合には変形微生物細胞において、あるいは、複 製の適切なオリジンを有する組換えプラスミドを有するか又は組換えウィルスで 感染された自由細胞株若しくは宿主において、正しく発現される。 異なる遺伝子信号及び処理結果は、ＤＮＡ転写やメツセンジャーＲＮＡ　（ｍＲ ＮＡ）翻訳などの遺伝子発現レベルを制御する。 ＤＮＡの転写は、ＲＮＡポリメラーゼの結合を指示し、それによってｍ　ＲＮ　 Ａ合成を促進させるＤＮＡ配列であるプロモータの存在に依存する。真核性プロ モータのＤＮＡ配列は、原核性プロモータのＤＮＡ配列とは異なっている。さら に、真核性プロモータ及び付随する遺伝子信号は、認められないか、又は原核性 系では機能しない。また、さらに、原核性プロモータは認められず、真核性細胞 において機能しない。 同様に、ｙＫ楼性内のｍＲＮＡの翻訳は、真核性の信号とは異なる適切な原核性 信号の存在に依存する。原核性内のｍＲＮＡの十分な翻訳は、ｍＲＮＡ上のＳｈ ｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎ。 （Ｓ−Ｄ）配列と呼ばれるリポソーム結合部位を必要とする（Ｓｈｉｎｅ、Ｊ、 及びＤａｌｇａｒｎｏ、Ｌ、、１９７５．Ｎａｔｕｒｅ　２５４：３４）。この 配列は、タンパク質のアミノ末端メチオニンをコードする、通常ＡＵＧである開 始コドンの前に配置されているｍＲＮＡの短ヌクレオチド配列である。Ｓ／Ｄ配 列は、１６５ｒＲＮＡ（リポソーマルＲＮＡ）の３′末端に対して相補的であり 、リポソームの正しい位置付けを与えるように、ｒ　ＲＮ　Ａと二重化すること によって、ｍＲＮＡのリポソームへの結合をおそらく促進させるものである。 １６５リポソームＲＮＡ及びｍＲＮＡ間の相補性の数少ないヌクレオチドから成 る５ｈｉｎｅ／Ｄａ１ｇａｒｎｏ配列は、リポソーム結合部位の重要な特徴とし て特定されたが（Ｓｈｉｎｅ及びＤａｌｇａｒｎｏ、１９７５．Ｎａｔｕｒｅ　 ２５４：３４；５ｔｅｉｔｚ、１９８０．リポソームにおける構造、機能、及び 遺伝学、　ｅｄ、ｃｈａｍｂｌｉｓｓ等、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍｄ、。 Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐａｒｋ　Ｐｒｅｓｓ　ｐｐ、４７９−４９５）、コン ピュータ解析によって、ＡＵＧ開始コドンを取囲んでいる約百個のヌクレオチド が、翻訳開始信号の適切な予測によって支持されるように、リポソーム／　ｍ　 ＲＮ　Ａ相互作用に含まれることが示された（Ｓｔｏｍｅｒ等。 １９８２、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１０：２９７１；Ｇｏｌｄ等、　１ ９８４．Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、８１ニア０６１）。特定のタ ンパク質の最大翻訳に対して、何が現実に最良かつ完全なリポソーム結合部位を 与えるのかの予測は、なされ得なイ（Ｊｏｙｃｅ等、　１９８３．Ｐｒｏｃ、Ｎ ａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、８０：　１８３０　参２ｂｐ配列のそれらの特徴化 に８いて組換え発現ベクターの発展中に、完全なリポソーム／　ｍ　ＲＮ　Ａ相 互作用領域の重要性を認識した（スコナー等の第１図、１９８６．Ｐｒｏｃ、Ｎ ａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ８３：８５０６）。「ミニシストロン」配列 の第１のシストロンにおける１つの塩基欠失は、全細胞タンパク質の０．４％か ら２４％まで下流組換えタンパク質Ｍｅｔ　−［Ａｌａ）ｂＧＨの生成を増大さ せるに十分であっ！；（図４．ｐｃＺ１４５と比較しｌ；ｐＣＺ　ｌ　４３　、 ５ｃｈｏｎｅｒ等、　ｉｄ、を参照）。 代替として、２つの塩基挿入もまた、第２シストロンによってコードされたコー ドするペプチドの大きな発現をもたらした。 制御実験は、発現の差が翻訳の差によることを示した。これは、これらの構成の ｍＲＮＡレベルが、（約５０７オールドであった）発現しｔ；タンパク質差と比 較して（３７オールド違い以下の）必然的に同一であったためである。結論は、 ミニシストロン配列の第１シストロンの翻訳を終わらせる停止コドンの位置が、 組換えタンパク質のコードされた配列を含んでいる、第２シストロンの翻訳効率 に影響を与えたいということであった。 それらの働きの最も重要なものは、組換えタンパク質のコードされた配列にすぐ 先行する配列の１つ又は２つの塩基変化が、下流発現に非常に大きな効果を持ち 得ることを示した。 クローン化遺伝子の好結果の発現は、ＤＮＡの充分な転写、ｍＲＮＡの翻訳そし である場合には、タンパク質の翻訳後の修飾を要する。発現ベクターが、適切な 宿主における活性プロモータの制御下で遺伝子を発現するため、及びタンパク質 生成を増大させるため、使用された。 ２．５．２　組換えインターロイキン−６の非細菌的生成 Ｗｅｉｓｓｅｎｂａｃｈ等、　１９８０．Ｐｒｏｃ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、７７： ７１５２は、卵母細胞内のｃＤＮＡを翻訳し、生体外において組換えＴＦＮβ２ を作ったが、Ｚｉ　１ｂｅｒｓｔｅｉｎ等、１９８６．ＥＭＢＯＪ、、ｑ：２５ ２９は、生体内のＩＦＮβ２Ａ　（Ｉ　Ｌ−６）ｃＤＮＡ発現の第１例を報告し ている。異なる一次クローンの融合したｃＤＮＡを含有している抑制フラグメン トは、ｐｓＶｃＩＦＢ２プラスミドを生成するために、ＳＶ４０初期プロモータ の下流に置かれｔ；。このプラスミドにおいて、完全ＩＦＮβ２　Ａ　ｃ　Ｄ　 Ｎ　Ａ配列及びオリジナルクローニングベクターの幾つかの隣り合うヌクレオチ ドは、５Ｖ４Ｑ初期プロモータ及びＴアンチダンＲＮＡのヌクレオチドに続いた 。ＩＦＮβ２Ａ配列は、Ｔアンチゲン分割領域及びポリアゾニレ−シコン部位を 導いた。中国ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）組織培養細胞及びメトトレキセート 増幅選択へのステップ終了後、〔Ｓ″Ｓ〕とラベルされたＣＨＯ細胞クローンが 、非飽和量の抗体を用いて、イムノプレシテーシａンによる放射性ＩＦＮβ２タ ンパク質生成のためにスクリーンされた。同じ研究において、全ＩＦＮβ２Ａｃ ＤＮＡ配列がＴ７　ＲＮＡポリメラーゼプロモータに融合された所のプラスミド 構成が、生体外で転写され、続いてラビットの網状赤血球溶解産物内で転写され たｍＲＮＡを生成した。溶解産物のイムノプレシビテーションに続いて適切な大 きさのＩＦＮβ２（ＩＬ−６）タンパク質が、５ＤＳ−ポリアクリルアミド　ゲ ル上に検出され得る。 ＢＳＦ−２（Ｉ　Ｌ−６）　は、ＳＶ４０初期プロ％　−タニ隣り合うＢＳＦ− ２の完全コード領域を含んでいるグラスミドの形質移入の後、ＣＯ３７細胞内で 機能的に発現された（Ｈｉｒａｎｏ等。 １９８６、Ｎａｔｕｒｅ　３２４ニア３）、　Ｂ　Ｓ　Ｆ　−２活性は、イムノ アフイニティゲル方法を用いて、転写した細胞からの媒体の精製及び濃縮の後、 検出され得る。この方法を用いて生成された組換えＩＬ−６は、ＦＡＯ細胞内の フィブリノーゲン及びアルブミンｍＲＮＡの調節を解析するために使用された（ Ａｎｄｕｓ等、１９８７．ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｓ、ｚ２ｉ：１８）。 Ｃ１ａｒｋ等（国際出願番号ｗｏ８８１００２０６　、１９８８年１月１４日公 開）は、ＴＬ−６ＣＤＮＡ配列が、ＳＶ４０エンハンサ−１主要アデノイド遅れ プロモータ、ＤＨＦＲコード配列、ＳＶ４０遅れメツセージポリ−Ａ付加部位及 びＶＡ　ｒ遺伝子を含むｐ９１０２３Ｂプラスミド中に結合されたところのｐＣ ５Ｆ３０９の構造を述べている。ＣｏＳ細胞がこのプラスミドを用いて形質転換 されるとき、ＩＬ−６造血刺激活動がｌＯ〜４希釈の調節された組織培養細胞媒 体で回復され得る。この型の組換え標本は、Ｆ２３．Ｉ　ＴｇＧ２ａ抗−〔マウ スＴ細胞しセプターＢチェーン可変領域セグメント８．１．８．２及び８．３〕 −マウス抗体と結合したＣｏｎＡ又はアガロースビードのいずれかの存在下Ｉ； 、Ｔ細胞増殖へのＩ　Ｌ−６の効果の解析に使用された（Ｇａｒｍａｎ等。 １９８７、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ　８４ニア６２９）。組換え Ｘ　Ｌ−６の標本は、またインターロイキン−２を存在させて、マウスの胸腺細 胞からＬｙ−２１細胞溶解性のリンパ球の分化へのＩ　Ｌ−６の効果を研究する のに使用された（Ｔａｋａｉ等、１９８８．Ｊ、Ｉｍｍｕｎａｌ、１４０：５０ Ｂ）。 組換えＴ　Ｌ−６のより高い細胞生成の代替方法は、ラビットの網状赤血Ｂｔ二 おけるＩＬ−６ｍＲＮＡの翻訳による（Ｐｏｕｐａｒｔ等。 １９８７、ＥＭ１３０　Ｊ、６：１２１９）、又は酵母におけるｃＤＮＡ発現に よる（Ｌａ　Ｐｉｅｒｒｅ等、ｌ９８８．Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、Ｉ６７：７９４ ）　ｒ　Ｌ　−６ｍ　ＲＮ　Ａのカエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞への注入後 の生体外合成を含む（ＷｅｉｓｓｅｎｂａｃｈｌＦ　、　１９８０　、　Ｐｒｏ ｃ、Ｎａｔ　１．　Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、７７：　７１５２　；Ｃｏｕ　ｌ　ｉ ｅ等、１９８V．Ｅ ｕｒ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１７：　１４５３：Ｐｏｕｐａｒｔ等、１９８７． ＥＭＢＯＪ、６：１２１９）。　２゜５．３９組換えインターロイキン−６の細 菌的生成りラーク等（＠際出願番号ＷＯ３８１００２０６、１９８８年１月１４ 日公開）は、ｐｃｓＦ３０９を使用してＥ、ｃｏｌｉにおける組換え■Ｌ−６の 発現及び生成を報告した（受入れ番号ＡＴＣＣ６７１５３として１９８６年７月 ］りＥＩ寄託）。しかし、そこで報告された好適な実施例は、ｐｃｓＦ３０９の 配列を選択的に調整し、ａ）その信号ペプチドリーダ配列及びその３′　ノンコ ード配列を削除し、そしてｂ）温度感応Ｃ＋抑制因子との関連で、タンパク質コ ード配列を温度誘導ＰＬプロモータに結合させている。プラスミドｐＡＬ３０９ ｃｍ７８１を含むこの菌株はＡＴＣＣに寄託されなかった。この菌株では、細菌 的に発現されたタンパク質が、初めに可溶化され、その後再びフォールドされな ければならなかった不溶化形態で生成された（彼らの特許出願の実施例Ｖ参照） 。代替的には、ｐＡＬ−５ｅｃ−ＩＬ−６−１８１と呼ばれるプラスミドがｓＰ Ｌプロモータ制御下で、ＩＬ−６のｃＤＮＡ配列を合成信号ペプチドリーダ配列 に結合することによってＩＬ−６を生成するように構成された。温度感応Ｃ１抑 制因子菌株におけるＰＬプロモータの高温誘導の後、Ｔ　Ｌ−６が、信号ペプチ ドが途去される等質タンパク質として変形細胞の周縁質から隔離された。純粋タ ンパク質の産出は、報告されなかった。 Ｂｒａｋｅｎｈｏｆ　ｆ等、１９８７．Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ１．１３９：４１１６ は、７個の特別なＩＬ−６ｃＤＮＡクローンのいずれか１個を含有している異な るＥ、ｃｏｌｉ菌株において、ＨＧＦすなわちハイブリドーマ成長因子（ＩＬ− ６）の発現を報告した。媒体は、Ｉ　Ｌ−６を生成するクローンを特定するため に、！　Ｌ−６活性に対しスクリーンされた。その活動は、クローン間で少なく ともｓ、ｏｏ。 ７オールド変化した。最も活性な構成（クローン７）は、ペプチドの第１の４３ アミノ酸を失っていたが、その構成は、次に活性なりローンの２０倍以上の活性 を生成した。ＨＧＦ（ＩＬ−６）の完全なアミノ酸コード領域を含有する構成は 、最も小さな活性を示した（例えば、ＡＴＧスタート部位からポジション−６２ で始まるクローン■５は、ｌ　０．０００ｋＵ／ｍｌを持ったクローン７に比べ て１　、７　ｋＵ／ｍｌの活性を示した）。活性を検出するために、組換えＩＬ −６は、初めにクローン７及び１５のシトソリツクタンパク質から分離された。 活性は、個々の５ＤＳ−ＰＡＧＥ切片の溶離後にのみ分析された。活性が検出さ れてさえも、Ｔ　Ｌ−６タンパク質は何も、ゲルタンパク質プロフィールにおい て明らかにされなかった。 Ｔｏｓａｔｏ等、ｌ９８８．５ｃｉｅｎｃｅ　２３９：５０２は、Ｅ、ｃｏｌｉ において生成された組換えＩ　Ｌ−６を用いて、免疫悠置後に抗血清の生成を報 告している。しかし、抗血清生成方法並びに組換えＩＬ＝６タンパク質合成及び 生成は公表されなかった（調整原稿中に文献ｌＯとされているものを参照のこと ）。 組換えＢＳＦ−２（ＩＬ−６）は、ｐＴＢＣＤ−１２を用いてＥ、ｃｏｌｉにお いて生成された（旧ｒａｎｏ等、１９８８．１ｍｍｕｎｏｌ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　 １７：４１）。このプラスミドの誘導は、組換えＩ　Ｌ−６ペプチドがＩ　Ｌ− ２ペプチドに融合されている融合タンパク質の生成をもたらした。カリクレイン 及びアミノペプチダーゼ−Ｐを用いてのプロテアーゼ消化は、成熟！Ｌ−６タン パク質を得るために必要であった。しかし、説明を可能にさせるこれ以外の手順 の詳細はどこにも公表されていない（上記調整原稿参照）。 Ｍａｙ等、　１９８９．　Ｊ、Ｂｉｏｌ　、ｃｈｅｍ、２６３ニア７６０では、 １８２アミノ酸の！Ｌ−６ペプチド部分に融合された原核性リーダペプチドの３ ４アミノ酸を含んでいる生成物を生成するために、ＲＥＶ発現ベクター（Ｒｅｐ ｌｉｇｅｎ　ｃｏｒｐ、ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）におけるＩＬ−６ｃＤＮＡ の融合の後に、細菌内にＩ　Ｌ−６の不溶化形態を生成することが報告されてい る。発現タンパク質は、Ｔｒｉｓ塩基化バッファにおける８Ｍ尿素、５ｍＭ　Ｄ ＴＴ及び１０ｍＭβ−メルカプトエタノールで溶解された不溶化ペレット内に取 り出された。融合生成物は、溶解バッファを持つ塩の勾配を用いているＤＥＡＥ −セファローズ　コラムのクロマトグラフィによって続いて、原核性リーダペプ チドに対するモノクローン抗体を持つイムノアフイニティ・久ロマトグラフイ、 又はモノＱコラム（Ｐｈａｒｍａｃ　ｉａ）を持つＦＰＬＣのいずれかによって 、多数の他のＥ、ｃｏｌｉペレットタンパク質から部分的に精製された。精製タ ンパク質の産出は報告されていない。ＤＥＡＥ−セファローズピーク７ラクシ羅 ンは、ＦＳ−４細胞培養及び水胞性０炎ウィルスにおいて、サイト７アテイツク 効果低減分析を用いて、０−５　１１０／ｍｌの抗ウイルス性活動を示した。組 換え融合されたＩ　Ｌ−６タンパク質は、ポリクローン抗血清を精製するために 、ラビットに注射された。そのポリクローン抗血清は、人の単核細胞において、 ＴＮＦ及び又はＩ　Ｌ−６のシクロへキシミド誘導後の繊維芽細胞ＦＳ４細胞に おいて、天然Ｔ　Ｌ−６タンパク質を特徴づけるために使用された。ＦＳ４細胞 媒体を持つ抗血清のインキュベージコンは、ＣＥＳＳ細胞内の免疫グロブリンの 誘導を妨げた。 多くの研究者は、Ｅ、ｃｏｌｉ内に作られｔ；組換えＩ　Ｌ−６タンパク質を報 告したが、組換えＩ　Ｌ−６精製の方法論については開示がなかった（Ｔａｇａ 等、　１９８７．Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、１６６（４）：９６７；Ｇａｕｌｄｉｅ 等、１９８８．Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、８４ニア２５１；Ｌｏ ｔｇ等、１９８８．Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、　１６７（３）　：　１２５３　；Ｍ ｕｒａｇｕｃｈ　ｉ等、１９８８．Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、１６７（２）：３３２ ：Ｒｅ１ｓ等、　１９８８　、　Ｊ　、　Ｉｍｍｕｎｏ　ｌ　、　１４０（５） 　：１５６６）。 ２．５．４．組換えインターロイキン−６の高生産困難性 細菌内に天然Ｉ　Ｌ−６の生成を可能にする報告は見当たらないが（セクション ２．５．３を参照）、細菌内の天然タンパク質の高生産は、組換えＤＮＡ生物工 学法を用いても成功しなかった（Ａｓａｇｏｅ等、１９８８．Ｂｉｏｔｅｃｈｎ ｏｌｏｇｙ　６：８０６）　（本願の５．１．も参照）。Ａｓａｇｏｅの研究は 、上述の２．５．３　、に報告された構成に近いプラスミド構成を用いて誘導細 胞エキス内で検出可能なタンパク質として天然Ｉ　Ｌ−６を生成することはでき ないことを報告している。不成功のＡｓａｇｏｅの発現プラスミドは、Ｐ　ＴＡ Ｃプロモータ及びＡＴＧスタート配列を持つフレーム内で、かつそれに隣接する 成熟旭理ＢＳＦ−２（ＩＬ−６）タンパク質コード配列を含んでいた。そのプラ スミドは、種々の菌株背景において解析されたが、Ｉ　Ｌ−６タンパク質は融合 後に検出されなかった。多量の不溶化組換えＩ　Ｌ−６活性が、次の１）〜３） の状態にある多雑種融合タンパク質を含有しているプラスミドの誘導後にのみ、 Ａｓａｇｏｅによって生成された。すなわち、１）Ｐ７１．プロモータ及びＡＴ Ｇスタート部位が大成長ホルモンコード配列に融合された、２）大成長ホルモン 配列がＸａ因子ペプチド認識部位（ｉ　ｌｅ−ｇｌｕ−ｇｌｙ−ａｒｇ）を生成 するオリゴヌクレオチド配列に融合された、モして３）Ｘａ因子認識部位が、そ の後、ｇｌｕ−ｐｈｅ−ｍｅｔ−ＢＳＦ−２配列又はａｌａ−ＢＳＦ−２コ一ド 配列のいずれかに融合された。 したがって、この組換えＩＬ−６（すなわちＢＳＦ−２）ペプチドは、この構造 における大成長ホルモン／Ｘａ因子配列／ＢＳＦ−２ハイブリッド融合生成物の カルボキシ末端部分であった。一方のペプチド構造内にｇｌｕ−ｐｈｅ−ｍｅｔ −ＢＳＦ−２として、又は他方にａｌａ−ＢＳＦ−２ペプチドとして存在してい る組換えＩ　Ｌ−６活動は、８Ｍ尿素までの融合タンノ（り質の溶解化後にのみ 精製され得た。Ｘａ因子を持つ融合タンパク質の開裂は、粗放透析による精製融 合タンパク質を再フォールドすることを要した。融合タンパク質標本がＸａ因子 によって不完全に消化されただけであったので、再７オールドされたプロセスは 、不完全であった。 Ｘａ因子開裂は、他の部分開裂生成物に加えて、無傷融合タンパク質、組換えＩ 　Ｌ−６ペプチド、及び大成長ホルモンペプチドを含んでいる異種起源混合物を 生成した。精製生成物内にＴ　Ｌ−６活性を得るために、Ｘａ因子／開裂混合物 が、６Ｍグアニジニウム塩酸基で変性されなければならなかった。組換えＩＬ− ６ペプチドのクロマトグラフィ精製後に、それは、再７オールドされた活性ペプ チドを回収するために、さらに組数透析を受ける。ｇｌｕ−ｐｈｅ−ｍｅｔ−Ｂ ＳＦ−２又はａｌａ−ＢＳＦ−２のいずれかである結果としての組換えペプチド は、Ｂ細胞刺激因子分析におけるそれらの活動に対してのみ試験される。その生 成プロセスに対して報告された生産高は、約５％であった（精製活動の３＋ｎｇ が、最初の１００ｍｇの融合タンパク質から回収されたが、そのうち５８ｍｇは Ｉ　Ｌ−６ペプチドである。したがって、３１５８−５．１７％）。 従って、今なお、Ｉ　Ｌ−６の高生産を与える便利で、比較的安価な方法が必要 とされている。哺乳類細胞を用いる組換え方法は、かなり高価となる傾向がある 。細菌精製は低コストではあるが、変換細菌においてＩ　Ｌ−６を生成するため の従前の試みは、商業的に好適な生産法をもたらさなかった。 本発明は、高いタンパク質生産すなわち、代替的には全部の細胞質ゾルタンパク 質の約２０％を与える、細菌におけるＩＬ−６を生成する方法、及びＤＮＡ構成 を提供する。本発明は、また、天然ｒ　Ｌ−６分子の生物的活動を保持するシス ティン７リー形態のＩ　Ｌ−６を提供するものである。 ３、発明の概要 本発明は、タンパク質のそれぞれの活性ペプチドフラグメントと罰様に、細菌に よって生成された組換え合成システィン７リーＴ　Ｌ−６タンパク質の経済的生 成に関するものである。生成されるタンパク質は、システィン含有又はシスティ ンフリーのいずれかであり、Ｉ　Ｌ−６生物的活動を保持する。細菌培養は、高 百分率すなわち一般に全可溶性細胞質ゾルタンパク質の少なくとも２０％はどの 組換えタンパク質を発現する。組換えＩ　Ｌ　−６タンパク質は、ペレットから タンパク質を溶解させるために、８Ｍ尿素又はβ−メルカプトエタノールのよう な粗い変性剤での処置を必要としない。本明細書及び特許請求の範囲を通して使 用されているように、「実質的に水に可溶である」という句は、この特性を示す 。 本発明では、Ｉ　Ｌ−６は、３部分の融合タンパク質を発現させることによって 、単細胞宿主内に組換え生成される。その融合タンパク質は、第１、第２及び第 ３ペプチド部分から構成され、第１ペプチド部分は、Ｔ　Ｌ−６活性を有し、第 ２ペプチド部分は、化学的にあるいは酵素的に開裂可能な配列を有し、その配列 は第１ペプチド部分を第３ペプチド部分に結び付は七いる。また、第３ペプチド 部分は、単細胞宿主によって発現され得、かつ好ましくは検出可能な機能を有す るタンパク質又はその部分である。それらの３つのペプチド部分は、便宜上「第 １」「第２」又は「第３」と呼ばれるが、タンパク質のプロモータ制御発現に関 して、特定の順序になっているものとして読まれるべきではない。第１及び第３ ペプチド部分の位置は交換可能である。 第３ペプチド部分は、タンパク質または胤細胞宿主細胞が作ることができるタン パク質の部分を与える。第３ペプチドを発現する担体ＤＮＡの存在は、真核性Ｔ 　Ｌ−６タンパク質の生成を容易にする。その検出可能な機能において、（例え ば、酵棄的活性）、＠３ペプチドが容易に特定されかつ隔離される手段を与える 。所望の生物的活性を持つ第１ペプチ）′部分は、第２ペプチド部分の開裂によ って融合タンパク質の残部から分離される。その後、組換えＩ　Ｌ−６ペプチＶ は、高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰ　Ｌ　Ｃ）などによる公知の方法によっ てタンパク質混合物から分＊＝ａ、そして精製され、ｒ　Ｌ−６アツセイにおい て活性である純粋なタンパク質を産出する。本発明は、後述のベクターで交換さ れた単細胞宿主に加えて、融合タンパク質をコードしているヌクレオチド配列、 これらのヌクレオチド配列から成る組換えベクターをも考慮している。 特別な実施例では、Ｔ　Ｌ−６活性を有する合成ペプチＶが、セリン残基によっ て置き換えられた未変性Ｉ　Ｌ−６配列の全４個のシスティンで精製される。特 にことわっていない場合には、合成システィンフリーＩ　Ｌ−６又は組換えシス ティンフリー丁Ｌ−６という用語が、セリン残基によって置き換えられた未変成 Ｉ　Ｌ−６配列の全４個のシスティンを持つＴ　Ｌ−６活性の合成ペプチドを指 すものとして本明細書及び特許請求の範囲において使用される。そのようにして 精製されたペプチドは、驚くほどにその生物的活性を保持する。例えば、Ｉ　Ｌ −６のシスティンシリ−形態は、肝細胞活動化及びＢ細胞刺激を示すことがわか った。本発明のタンパク質は、抗ウィルス活性を有し、細胞のウィルス感染を防 止し得る。システィンフリー合成タンパク質は非発熱性であり、あるいは少なく とも未変性Ｉ　Ｌ−６タンパク質よりも非常に小さな発熱性のものである。 本発明のタンパク質は、また、ＩＬ−６７ミノ末端から２７個のアミノ酸残基ま でを削除し、及び／又はアミノ末端に５０個までアミノ酸襞基を加え、及び／ま たはＩ　Ｌ−６配列のカルボキシ末端に３５０個までアミノ酸を加え、かつ、適 切な生物的活性を保持している異なるシスティン７り−及びシスティン含有ＩＬ −６ベプチＶをも含んでいる。従って、驚くことには、また多くの他の生物的挙 動のペプチドとは違って、塩基ＩＬ−６配列が、実質的な活動を大きく失うこと なしに修飾することがでさる。従って、本発明は、Ｉ　Ｌ−６活性を保持する、 トランケートされ伸びた、システィン７り−又はシスティン含有ペプチドに加え て、そのシスティンフリーペプチドをコードする遺伝子配列を包含している。 本発明の方法は、Ｉ　Ｌ−６を調製するための公知の組換え法の改良であり、本 発明では、組換え／ベクターシステムにおいて商業酌量のＴ　Ｌ−６を調製する 手段を提供するものである。 Ａｓａｇｏｅによって述べられたものなど、前述のＩＬ−６融合タンパク質構成 は、大量のタンパク質の発現を得るのに成功してい　、ないし、それらは機能的 タンパク質を得るために、膨大な粗放精製工程及び再フォールド工程を必要とす る。しかし、この粗雑な変性剤での処理は本方法では必要なく、また、融合タン パク質又は開裂タンパク質のいずれかの再７オールドも必要としない。 これらの組換え宿主を培養することによって精製されたペプチドは、免疫系治療 細胞活性へのそれらの刺激効果において特徴的Ｉ　Ｌ−６活性を保持する。本発 明は、また、請求の範囲に記載された合成Ｉ　Ｌ−６ペプチドの投与によって、 免疫応答の全体的モジュレータ１ンに加えて、ウィルス性疾患、免疫不全、及び 肝性疾患の治療法についても考慮している。 ３．１．定義 Ａ　Ｔ　ＣＣ：　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃ ｔｉｏｎｂｐ　：　塩基対 ＢＳＦ−２：　Ｂ細胞刺激因子 ｃＤＮＡ　：　相補的ＤＮＡ ＣＨＯ：　中国ハムスター卵巣 Ｃ５Ｆ　：　コロニー刺激因子 ＤＨＦＲ：　ジヒドロ葉酸レダクターゼＤＮａｓｅ　：　デオキシリポ核酸分解 酵素ＥＬＩＳＡ　：　酵素結合イミューノソーベント　アッセイＧ−Ｃ５Ｆ　： 　顆粒球コロニー刺激因子ＨＧＦ　：　肝細胞成長因子 ＨＰＧＦ：　ハイブリドーマ　プラマサイトーマｒＰｌａｍａｃｙｔｏｍａコ成 長因子 ＨＰＬＣ：　高速液体クロマトグラフィＨ５Ｆ　：　肝細胞刺激因子 ＩＧＦ　：　インシュリン類似成長因子ＩｇＧ、ＩｇＭ　：　免疫グロブリンＧ 、免疫グロブリフＭＩＬ−１，ＩＬ−３又はＩＬ−６：　インターロイキン−１ ，インターロイキン−３又はインターロイキン−６１ＰＴＧ　：　イソプロピル チオガラクトシドＩＮＦ　：　インターフェロン ｋＤａ　：　キロダルトン ｋｂ　：　キロベース ＬＢ　：　ルリア　ブロスｊＬｕｒｉａ　Ｂｒｏｔｈ］ｍ　ＲＮ　Ａ　：　メッ センジＪＦ−ＲＮＡＰＡＧＥ　：　ポリアクリルアミド　ゲル　電気泳動ＰＢＳ 　：　リン酸塩緩衝生理食塩水 ＰＤＧＦ　：　血小板誘導成長因子 Ｐｏ　ｌ　ｙ　（ｒ　ＩＸｒＣ）：リポシトシン鎖で２重化されたりポイノシン 鎖を持つＲＮＡ ＰＬ　：　ラムダの左のプロモータ ＰＲ：　ラムダの右のプロモータ ＰｔＡｃ’Ｐｔｖｃ　：　）リプトファンと乳との結合の合成プロモータ ＲＮａｓｅ　：　リボ槙酸分解酵素 ’３ＤＳ　：　硫酸ドデシル基ナトリウムＳ−Ｄ配列　：　シャインーダルガー ノｒ、ｓｈ　１ｎｅ−Ｄａ　Ｉｇａｎｏ］配列ＳＨ：　スルフヒドリル ＴＮＦ　：　１１１１壊死因子 Ｘ−ｇａｌ：　ブロモ−クロロ−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド ＹＴ　：　酵母−トリプトン成長因子 ４、

【図面の簡単な説明】

＠１図は、ｐ３６０の構成図である。プラスミドｐ３６０は、Ｅ、ｃｏｌｉにお けるほぼ２２〜２３ＫＤａのタンパク質として、システィン７り一合成Ｔ　Ｌ− ６類似のペプチドを発現するように構成されたプラスミド発現ベクターである。 オリゴヌクレオチド７３７　ＦＡＧＣＴＧＡ　ＴＴＡ　ＡＡＴ　ＡＡＧ　ＧＡＧ 　ＧＡＡ　ＴＡＡ　ＣＣＡ　ＴＧＧ　ＣＴＧ　Ｃ＾３′］及び７３８　［Ｇｃｃ 　ＡＴＧ　ＧＴＴ　ＡＴＴ　ＣＣＴ　ＣＣＴ　ＴＡＴ　ＴＴＡ　ＡＴＣ３′］が 融合され、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　５ｙｓｔｅｒａｓから購入した７アジミドで あるｐＢＳ（＋）のＴ（ｉｎｄ　ＩＩＩ−Ｐｓｔ　Ｔフラグメントで置き換えら れ、ｐＢＳ０を形成した。ペプチド終止コドンを含有するプラスミドｐ３３７− １から合成システィン７リーＩＬ−６類似ペプチドに対する配列が、ｐＢＳ０の Ｎｃｏ　Ｔ−Ｅｃ。 Ｒ１７ラグメントを置き換え、プラスミドｐ３６０を生成した。ｐ３６０におい て、ミニシストロン配列を介して及び合成システィンフリーＴ　Ｌ−６類似配列 を介しての誘導性乳プロモータからの発現は、Ｅ、ｃｏｌｉのエキスにＩＬ−６ の大きさのペプチドを生成できない（発現したタンパク質のゲルにつき第３図を 参照） ＩＦ５図は、ｐ３６９の構造図である。ペプチド終止コドンを含有していない、 プラスミドｐ３６５の合成システィン７リーＩ　Ｌ−６類似ペプチドの配列を含 有している７ラグメントは、プラスミドｐ３６９を形成するために、（第１図に 記載された）ｐＢＳ０のＮｃｏ　Ｉ−Ｂａｍ　Ｈｌフラグメントを置換したこの 構造である。ここで、合成システィンフリーｒＬ−６１１似ペプチド配列は、β −ガラクトシダーゼのα−補体フラグメントに対するフレーム中で融合された。 ｐ３６９の乳プロモータの誘導は、合成Ｉ　Ｌ−６類似ペプチドと、β−ガラク トシダーゼのσ−補体部分との間の融合生成物である検出可能なペプチドを生産 できない（発現したタンパク質のゲルにつき第３図を見よ）。 第３図は、合成システィン７リーＩ　Ｌ−６ペプチドの配列を含んでいるプラス ミド構成の発現及び非発現である。異なるプラスミドを持っているＥ、ｃｏｌｉ 細胞の培養液がＩ　ＰＴＧで誘導された。細胞培養液のサンプルが溶解され、５ Ｄｓ−ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動された。このゲルは、タンパク質を 目に見えるようにするために、コオマジーブルーで染められた。列ａ及びｂは、 同一培養液の異なる管からの複製分別部分である。列１ａ及びｂは、プラスミド ｐ３６９を有する細胞からのものである。予想されている誘導タンパク質は、β −ガラクトシダーゼのσ−補体部分及び合成Ｉ　Ｌ−６類似ペプチドの融合タン パク質である。その融合を表している大きな分子重量タンパク質は存在しない。 列２ａ及びｂは、プラスミドｐ３６７すなわち、合成Ｉ　Ｌ−６類似ペプチド／ コラーゲン／β−ガラクトシダーゼの融合生成物に対する好結果の発現ベクター を有する細胞からのものである。ゲルのおよそ！　３０　ｋＤＡ位置における多 量の高分子重量融合タンパク質に留意されたい。 ２２〜２３μＤａすなわち非グリコジル化Ｉ　Ｌ−６の大きさのペプチドを生家 すると予想された列３ａ及びｂは、プラスミド２３６０を有する細胞からのもの である。矢印は予想される小さなペプチドの位置を示す。 ＄４図は、ｐ３４０−１の構成図である。ｐ３４０−１構成の工程については、 ５．２で述べる。オリゴヌクレチド２３７は、［ＡＡＴ　ＴＣＴ　ＡＡＴ　ＡＣ Ｇ　ＡＣＴ　ＣＡＣＴＡＴ　ＡＧＧ　ＧＴＡ　ＡＧＧ　ＡＧＧ　ＴＴＴ　ＡＡＣ ＣＡＴ　ＴＡＴ　ＧＧＡ　ＧＡＴ　ＣＴＧ　３′］であった。オリゴヌクレチド ２３８は、　ＦＧＡＴ　ＣＣＡ　ＣＡＴ　ＣＴＣＣＡＴ　ＧＧＴ　ＴＡＡ　ＡＣ ＣＴＣＣＴＴＡ　ＣＣＣＴＡＴ　ＡＧＴＧＡＧ丁ＣＧ　ＴＡＴ　ＴＡＧ　３’］ であっに。オリゴヌクレオチド７０３は［Ｃ＾丁ＧＴＡ　ＴＣＧ　ＡＴＴ　ＡＡ Ａ　ＴＡＡ　ＧＧＡ　ＧＧＡ　ＡＴＡ　ＡＣＣ３’ｌであっｔ；。オリゴヌクレ チド７０４は、ＥＣＡＴ　ＧＧＧ　ＴＴＡ　ＴＴＣＣＴＣＣＴＴ　ＡＴＴ　ＴＡ ＡＴＣＧ　ＡＴＡ　３すであった。Ｐ　ＴＲＣは、ハイブリッドプロモータトリ プトファン／乳である。ｒＴｅ　ｒｍＪは、先行する開始メチニオニンフドンと 同一の読取り枠内にある終止コドンを表す。 ＡＰ、は、バクテリオ７アージ　ラムダからの右方向グロモータを表す。Ａｍｐ ’は、ｐＢＲ３２２からのアンピリジン抵抗標識を表す。Ｏｒｉは、ｐＢＲ３２ ２からのＤＮＡ複製のプラスミドオリジンを表す。β−ｇａｌは、Ｅ、ｃｏｌｉ のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子領域を表す。 第５図は、合成組換体Ｔ　Ｌ　−６遺伝子及びその予測されたアミノ酸配列の完 全ヌクレオチド配列（５’−３’）である。融合された遺伝子のコード配列は、 ヌクレオチド３（Ｍｅｔ）で始まる。組換体Ｔ　Ｌ−６タンパク質のアミノ酸配 列は、ヌクレオチド５５７（Ｍｅｔ）まで延び、そこで、それはセリン残基を介 して融合タンパク質のコラーゲンリンカ−に融合される。＊印は、天然ｃ　Ｄ　 Ｎ　Ａ配列において見いだされる。ＴＧＡ停止コドンの位置を示す。修飾アミノ 酸残基は、その配列よりも下方箇所に示されている。 第６図は、合成システィン７リーＩ　Ｌ−６類似ペプチドの遺伝子の集合である 。合成オリゴヌクレチドは、アニーリングされ、連結されて合成遺伝子の４つの 合成二重鎖サブフラグメントを形成する。ｐ３３３に含まれる挿入物は、２対の 相補的オリゴヌクレチドを連結することによって形成された。ここで、それぞれ は、内向きの５塩基５′相補的オ一バハング部を有する（図５のヌクレオチド５ ９−６３）。４１１１成ｐ３３４は、残基１６２−１６７及び２２０−２２５で 結合された３対のアニーリングされたオリゴヌクレチドから構成された。ｐ３３ １の組立てられた相補的オーバハング部は、ヌクレオチド３１２−３１５及び３ ５ｇ−３６１に位置していた。構成ｐ３３２は、位置４５７−４６１及び５１２ −５１７で連結された。 合成７ラグメントは（斜線を引かれたボックスで示される）合成４−６塩基オ一 バハング部経由で、環状ベクターの多重クローニング部位に挿入することによっ て、修飾されたｐＢＳＭ　ｌ　３　＋Ｓｔｒａｔｏｇｅｎｅベクター中にクロー ンされた。合成システィン７リーｒｔ−−６１１１似遺伝子のコード配列は黒で 示されている。空白のボックスは、修ｆｌｐＢｓ　Ｍ１３＋配列を表す。７ラグ メントは適当な酵素で消化し、アガロースゲルから電気溶出によって所望の結合 を精製し、そして再び連結することによって、組み立てられた。ｐ３３７の終止 コドンの除去は、セリン残基及び両立性Ｅｃｏ　ＲＩオーバハング部（Ｒｒ）を 含有している第２合成７ラグメントを置き換えることによって行われた。構成ｐ ３６５を得るためのこのフラグメントの連結は、他のＢｇ１１１部位の付加及び Ｅｃｏ　ＲＩ部位の喪失をもたらした。ヌクレオチド５６４は、ｐ３６５の挿入 物を発現ベクターのコラーゲンりン力−と融合させるために必要なりｇ１１１部 位に含まれた最終塩基の位置を特定する。制限部位は次のようにして特定される 。すなわちＢ、Ｂａｍ　ＨＩ；Ｂｇ、Ｂａｌ　ＩＩ；ＲＩ、Ｅｃｏ　ＲＴ　；Ｒ Ｖ、Ｅｃｏ　ＲＶ；Ｈ，ＨｉｎＤ　ＩＩＩ：Ｎ、Ｎｅｏ　Ｉｔｓ、Ｓｔｕ　Ｉ； Ｘ、Ｘｂａ　Ｉ。 第７図は、プラスミドｐ３６７の構成、すなわち合成システィン７リーＩ　Ｌ− ６ペグチドを調製するために好都合な発現ベクターを示す図である。ｐ３６７を 構成する工程は、本文の５゜２、〜５．５．に説明されている。 第８ａ図は、Ｔ　Ｌ−６配列（指定されたＨＳＦ）の位置を示す組換体プラスミ ドｐ３６７のプラスミドマツプである。 （Ｎｃｏ　Ｉ−Ｂｇｌ　ＩＩ）挿入物に含有された組立て合成システイン７リー 組換体ｒ　Ｌ−６遺伝子が、ベクターのＮｃｏ　ＩとＢａｍ　ＩＩ制限部位との 間に導入された。空白のボックス（Ｃ）は、組換体Ｔ　Ｌ−６がβガラクトシダ ーゼに融合される所の６０アミノ酸コラーゲンリンカ−の配置を示す。完全融合 遺伝子ノ発現は、１３０ｋＤａハイブリツドタンパク質を調製する。 第８ｂ図は、合成システィン７リーＩ　Ｌ−６類似ペプチド（指定されたＨＳＦ ）の配列位置を示している組換体プラスミドｐ３６７のプラスミドマツプである 。示されたベクターは、本文５、で説明されているようにｐＪＧ２００の多大に 修飾された変形例である。（Ｎｃｏ　Ｉ−ＢＧＩ　ＩＩ）挿入物に含有された組 立て合成Ｉ　Ｌ−６類似遺伝子は、ベクターのＮｃｏ　ＩとＢａｍ　ＨＩ制限部 位との間に導入された。空白のボックス（Ｃ）は、６０アミノ酸コラーゲンリン カ−の配置を示す。そのりンカーを介して合成Ｉ　Ｌ−６類似ペプチドがβ−ガ ラクトシダーゼに融合される。完全な融合遺伝子の発現は、およそ１３０ｋＤａ のハイブリッドタンパク質を調製する（誘導されたＥ、ｃ。 １１におけるプラスミドの発現につき第３図を見よ）。第９図は、合成システィ ン７リーＴ　Ｌ−６タンパク質精製のＮａＤ。 ｄｓＯ，−ＰＡＧＥ分析である。精製の様々な段階で集められたサンプルは、図 示の如く還元条件下で１０％ポリアクリルアミド−ＮａＤｏｄＳＯ，ゲルで電気 泳動化された。タンパク質分子重量標識は、列Ｍに示されている。ＩＯＬバッチ 培養液で成育されたＥ、ｃｏｌｉ細胞は、リゾチームを加えて溶解され、その後 、簡単に音波処理された（列１）。普通でない疏水性融合タンパク質は、ＰＢＳ −５ａｒｋｏｓｙｌでの可溶化後に、硫酸アンモニウム沈降反応を繰り返すこと によって精製された（列２）。その後、部分的に精製されｔ；融合タンパク質が コラ−ゲナーゼで消化され、２３ｋＤａ組換体ＴＬ−６成分を放出した（列３） 。開裂した、可溶性β−ガラクトシダーゼの多くを４０％硫酸アンモニウムにお ける沈降反応によって取り腺いた後、合成Ｔ　Ｌ−６が、硫酸アンモニウム濃度 を７０％飽和まで増した上で、薄嗅としてほぼ均質の状態で回収された（列４） 。 逆相ＨＰＬＣが、精製の最終段階で使用された。タンパク質が、５４％アセトニ リルで溶出されている単一ピークフラクションにおいて回収された（列５）。 １１０図は、本文５．２．から５．８．に記載された方法によって作られた合成 システィンフリー組換体！Ｌ−６によるフィブリノーゲン合成の刺激作用である 。集密的ＦＡＺＡ細胞の単層が１０−’Ｍデキサメタシンの存在下で、精製され た組換体システィン７リーＴ　Ｌ−６の濃度を！えて処理された。刺激作用の５ 時間後、細胞媒体が取り出され、ドツト・プロット装置を用いてニトロセルロー ス膜でフィルタにかけた。分泌フィブリノーゲンレベルは、−次抗体として多ク ローン性フィブリノーゲン抗血清を、そして二次抗体としてアルカリリン酸塩共 役抗−ＩｇＧ抗血清を、それぞれ用いて、固相イムノアッセイによって判別され た。墳界抗体は、色素基質（ＢＣＩ　Ｐ及びＮＢＴ）をプロットに加えることに よって、目で観察された。分泌したタンパク質の濃度は、レーザデンジトメトリ を走査し、精製ラットフィブリノーゲン基準の希釈度に対する信号強度の比較で 決定されｔ二。 第１１図は、Ｂ細胞鑑別定量法である。ＣＨ１２，ＬＸ細胞（２ＸＩＯ’細胞／ ウエル）は、本文５．２．から５．８．に述べられる方法によって作られる、組 換体合成システィン７リーＩＬ−８の種々の濃度での処理前に、抗ｊｌ［（ＳＲ ＢＣ）の存在下または不存在下で共に培養された。４８時間後に処理されたＣＨ １２，ＬＸ分別部分が、モルモット補体を含む５ＲＢＣの新たに洗浄された懸濁 液と混合され、３７℃でインキュページ田ンするためにカニンガム室に移された 。３０分後に、細胞は、室温に戻され、溶血ブレークが作れるようにされた。ア ッセイの結果は、（ｙ軸にＰｆｃとして示された）百万個の生きた細胞ごとにブ レーク形成コロニーとして表される。正の刺激制御としてアッセイに含まれた細 菌リポ多糖体は、ＩＯ，７２６ｐｆｃ／細胞百万個の応答をした。示された結果 は、二重アッセイの平均値を表す。 第１２ａ図及び第１２ｂ図は、ｐＴｒｐＥ／ＥＫ／ｃｆＩＬ−６の構成の概念図 である。その構成の詳細は本文の５．１０゜１、で述べられている。 第１３図は、様々な成長因子及びそれらの組合せによる前駆細胞の刺激作用につ いての時間−コロニーアッセイをグラフで示すものである。 第１４図は、液体培養７日間経過後の非粘着性細胞の数である。このアッセイは 、実施例１１に述べられている。 第１５図は、？　ｔ　ｄ、１におけるイムクｏ　−７［ｔｍｃｌｏｎｅｌ対工ン ドーゲン［Ｅｎｄｏｇｅｎｉ　Ｉ　Ｌ　−６である。 第１６図は、７　ｔ　ｄ、１におけるイムクローン対ｂｍＴＬ−６である。 第１７図は、７ｔｄ、１を用いているイムクローン対ゲンザイム’、Ｇｅｎｚｙ ｒｎｅ３　Ｔ　Ｌ　−６である。 第１８図は、エンテロキナーゼ部位から、システィン７リーＩＬ−６のアミノ末 端配列を介して、３つの停止コドンが続くＩＬ−６の天然カルボキシ末端までの ｐＴｒｐＥ／ＥＫ／ｃｆＩ　Ｌ−６における配列である。 ５、発明の詳細な説明 ５．１．最初の発現構成 細菌細胞内でインターロイキン−６の高レベルを発現させる最初の試みは、検出 不可能か、または商業的に無効な量のタンパク質を製造する二とに終わった。商 業的にも有用な量のタンパク質を製造する試みは、プラスミドｐ３６０の合成と なった。 この発現ベクターにおいては、ｐ３３７−１からの合成システィン７リーＴＬ− ６配列が、オリゴ７３７　［ＡＧＣＴＧＡＴＴＡＡＡＴＡＡＧＧＡｃｃＡＡｒＡ ＡｃｃＡＴｃｃｃｔｃｃ人−３゛３とオリゴ７３８　ＥＧＣＣＡＴＧＧＴＴＡＴ ＴＣＣＴＣＣＴＴ＾ＴＴＴＡＡＴＣ−３’　Ｅとの融合によって製造されたミニ シストロン配列からのすぐ下流に挿入された。この構造では、合成ＩＬ−６ペプ チドは１つの終止コドンを有しており、β−ガラクトシダーゼタンパク質には融 合されていなかった。誘導は、非グリフシル化の合成Ｉ　Ｌ−６ペクチドを２２ ＫＤａより僅かに多量に生成することが期待されていた。プラスミドｐ３６０の 構造は図解的に第１図に示されているが、しかしながら、測長することは出来な い。ｐ３６０を有する細胞にＩ　ＰＴＧを加えることにより合成Ｉ　Ｌ−６ペプ チｒの発現を誘導することは、検出可能なペプチドを何等生じなかった（第３図 において、矢印箇所ではタンパク質が列３ａ、３ｂに欠落している）。 同様に、第２図に示された構成のプラスミドｐ３６９を有する株の誘導は、ここ では合成Ｉ　１．−６に類似のペプチドがβ−ガラクトシダーゼのアルファー相 補７ラグメントと共にフレーム内で融合されているが、何等の検出可能なタンパ ク質も生じなかった（＊３図の列１ａとｂを参照）。 合成！Ｌ−６を製造しようとしたこれらの不成功であった試みは、以下に述べら れる成功した合成システィン７リーＩＬ−６／コラーゲン／β−ガラクトシダー ゼ融合タンパク質（第３図の列２ａと２ｂにおける大量の１３０ＫＤａのタンパ ク質を参照）の製造と比較することができる。 ５．２．ＩＬ−６発現ベクターの構造 ５．２．１．最初のベクターｐＪＧ２００プラスミドｐＪＧ２００は、成功した Ｉ　Ｌ−６発現ベクターを製造するために修飾された出発物質であった。最初の プラスミドのｐＪＧ２００は、ターゲットのシストロンを含有しており、このシ ストロンが、正しい読み取りフレーム内で、タンパク分解酵素感応リンカ−ペプ チドをフードするＤＮＡの一片を介して検出可能な活性を持つ標識ペプチドに融 合された（Ｇｅｒｍｉｎｏ　ａｎｄ　Ｂａ５ｔｉａ、　１９８４．　Ｐｒｏｃ、 　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８１：４６９２：　Ｇｅｒｍｉ ｎｏ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８３．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓ ｅｔ、　［］ＳＡ　８０：６８４８）。オリジナルのベクターｐＪＧ２００にお けるプロモータはファージラムダのＰ、プロモータでありｌ＝。このプロモータ に隣合ってｃ＋８５７不耐熱性抑制因子があり、リポソーム結合部位と７アージ ラムダのｃｒｏ遺伝子のＡＵＧイニシエータの二部連鎖とがこれに統いている。 Ｇｅｒｍｉｎｏ　ａｎｄ　Ｂａ５ｔｉａはチキンｐｒｏ−２コラーゲン遺伝子の 三重螺旋領域を含む７ラグメントを、正しい翻訳相においてコラーゲン配列が乳 Ｚβ−ガラクトシダーゼ遺伝子配列に融合されたベクターを製造するために、Ａ ＴＧイニシエータの次のＢａｍ　Ｈ１抑制部位中に挿入した。１個のＢａｍ　Ｈ １抑制部位が再生され、そしてプラスミドＲ６に複製イニシエータタンパク質コ ード配列を挿入するｔ二めに使われｔ二。 プラスミドｐＪＧ２００は、Ｒ６に複製イニシエータタンパク質を、ハイプリン ト融合生成物として発現し、続いてＣｌ８５７抑制因子を不活性にしてＰ、プロ モータからの転写を始めることを可能にする温度変化が起こった。隣接してＡＴ Ｇイニシエータを備えかつ７レームにおいてコラーゲン／β−ガラクトシダーゼ 融合体（非挿入ベクター）を備えた親ベクター、と、Ｒ６に複製イニシエータタ ンパク質を含むｐＪＧ２００の双方力、フレームに８いてＡＴＧイニシエータコ ドン（５’　）、！：コラーゲン／β−ガラクトシダーゼ融合物（３’）（挿入 ベクター）とに連鎖し、プラスミドによって変形された細菌細胞内でβ−ガラク トシダーゼ活性を生じる。その結果、挿入物と共にプラスミドを有する株は、挿 入物を含まない親ベクターを有する株から区別することが出来ない。 ５．２．２．Ｐ、Ｃｌ８５７抑制因子とｃｒｏアミノ末端の除去 本発明における最初のｐＪＧ２００の改造は、Ｐ、プロモータと、Ｃｌ８５７抑 制因子と、融合タンパク質のＡＴＧ開始部位を提供するｅｒａタンパク質のアミ ノ末端とを有するＥｃ。 ＲＩ−ＢａｍＨＩ７ラグメントを除去して置き換えることであった。オリゴヌク レオチドリンカーがｐ２５８プラスミドを製造するために挿入された。これは、 Ｅｃｏ　ＲＩ部位を保持し、また、Ｎｃｏｌ、ＢｇｌｌｌそしてＢａｍ　ＨＴ抑 制エンドヌクレアーゼによって認識される追加のＤＮＡ配列をもコードする。こ の変形により、コラーゲン／β−ガラクトシダーゼ融合を持つフレームから外れ る新規なＡＴＧ開始コドンを提供した。結果として、ｐ２５８プラスミドで変形 した細胞内では、β−ガラクトシダーゼ活性はない。加えるに、この変形により ｃｒｏタンパク質ア二アミノ末端去され、それ故、ＡＴＧ開始コドンに隣接して 挿入されｔ；結果的に生成の如何なる組換え融合物も、それらのアミノ末端にｃ ｒｏをコードするアミノ酸を持たないようになる。反対に、オリジナルなｐＪＧ ２００ベクターから発現された組換えタンパク質は、全てがｃｒｏをコードする アミノ酸をそれらのアミノ末端に持つことになる。 ５−　２−　３−　ｐｔＡｃプロモータ、５ｈｉｎｅ　Ｄａ１ｇａｒｎｏ配列及 びＡＴＧコドンの追加Ｉ　Ｌ−６発現ベクターを構成する第２工程においては、 プラスミドｐ２７７を製造するために、抑制７ラグメント、すなわちｐＫＫ２３ ３−２のＥｃｏ　Ｒ１−Ｎｃｏ　＋７ラグメント（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、　Ｍｉｌｖａｕｋｅｅ、　Ｗｌ）がプラスミドｐ２５８の Ｅｃｏ　ＲＩ−Ｎｃｏ　Ｉ抑制部位に挿入された。その結果ｐ２７７プラスミド はｐＫＫ２３３−２のＰ　ｙＡｃ　（Ｐ　ｔｉｃとしても知られている）プロモ ータと、１ａｃＺリポソ一ム結合部位と、そしてＡＴＧ開始コドンとを備えた。 このｐ２７７プラスミドにおいて、ターゲットのタンパク質配列の挿入は、ＩＰ ＴＧを誘導することができるプロモータから適切な株を背景にその転写をするこ とを可能にする。この適切な株の背景が、誘導されていないＰ　ＴｋＣプロモー タからの転写を禁止するに十分な乳抑制因子タンパク質を提供している。細胞は 小量の化学物質ＩＰＴＧの添加によって誘導され得ることから、ｐ２７７プラス ミドは、例えばｐＪＧ２００のＰ、プロモータのように誘導するのに温度変化を 要求するプロモータに比べて十分商業的な利点を有する。温度誘導可能なプロモ ータを含む商業量の細胞培養の誘導は、さもなくば、誘導のために必要な熱変化 を発生するため大量の細胞や媒体の加熱を要求する。例えば、Ｐ、プロモータに よる誘導は、ｐＪＧ２００プロモータを禁止するＣｌ８５７抑制因子を不活発に するために、温度の変化を要求する。 プロモータを変換することによる付加的な利益は、細胞が高温あるいは温度変化 に１されないということである。高温あるいは温度変化は、熱シヨツク反応と、 宿主タンパク質と同様に組換えタンパク質を低下させる能力のある熱ショック反 応タンパク質分解酵素を生じる（Ｇｒｏｓｓｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、　１９８４． 　Ｃｅ１ｌ　３８：３８３；Ｂａｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８４．　Ｐｒｏ ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　８１：６７７９を参照）。 ５．２．４．リポソーム結合部位の改良ｐ２７７発現ベクターは、２９の塩基対 を挿入することによってさらに変形された。すなわち、５゛ＣＡＴＧ丁ＡＴＣＧ ＡＴＴＡＡＡＴＡＡＧＧＡＧＧＡＡＴＡＡＣ３’をプラスミドｐ３４０を製造す るためにｐ２７７のＮｃｏ　丁部位に挿入した。この配列は、ショックナーの「 ミニシストロン」配列（本文２．５．１．に記載）の一部に関連している。もっ ともそれとは異なる。それらの２９の塩基対を含むことにより、リポソマル／　 ｍ　ＲＮ　Ａ相互反応のための最適な５ｈｉｎｅ／Ｄａ１ｇａｒｎｏ部位を提供 する。最後のｐ３４０ベクターは、商業的調製に必要とされる高生産性に適した 、高度に誘導可能なプロモータを含み、そして、翻訳改良のための改良された合 成リポソーム結合部位領域を有しており、そして、フラグメントを挿入するため の可視的インジケータを提供することを意味していることから、ｐＪＧ２００と は十分に異なるものである。 ベクターｐ３４０−１の構成における工程は＠４図に示す。 ５．３．インターロイキン−６の配列の変形合成システィン７リー組換えＴ　Ｌ −６の発現に使用されるコードの配列はヒトＩ　Ｌ−６のｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ配列に 基づいている。このコード配列は、１１対の相補的合成オリゴヌクレオチド対を 用いて構成された。一方で、遺伝子のサブ７ラグメントの適当な組立を可能にし 、他方で、その組立られｔ：遺伝子の効果的な発現を確保するために、幾らかの 突然変異がオリゴヌクレオチド合成中に組換えＩ　Ｌ−６コ一ド配列中に誘導さ れた。ヌクレオチド配列の修飾は、遺伝子のサブフラグメントを連鎖するために 使用する新規な抑制部位を誘導するように設計されており、コード配列内に、天 然のＩ　Ｌ−６タンパク質配列に関して合成遺伝子のアミノ酸組成を変えないよ うに組み込まれた。この修飾は：ｉ）天然のＩ　Ｌ−６遺伝子内に通常見られる ２８アミノ酸信号配列をコードする５゛末端１１８ヌクレオチドをメチオニンコ ドン（ヌクレオチド３−５）で置き換えること、ｉｉ）天然Ｉ　Ｌ　−，６タン パク質配列中の［Ｐｒｏ３残基を合成ＩＬ−６配列中の［Ｇ１ｙ！（ヌクレオチ ド６−８）で置き換えること、１ｉｉ）合成Ｉ　Ｌ　−６タンパク質のコラーゲ ンリンカ−との融合を行うため、通常ＴＡＧ停止コドンをセリンコドン（ヌクレ オチド５５８−５６０）で置き換えること；そして、ｉｖ）ジスル７アイド結合 を形成することができない合成Ｉ　Ｌ−６タンパク質を製造するために、４つの 内向システィン残基をセリン（ヌクレオチド１３５−１３７，１５３−１５５． ２２２−２２４．２５２−２５４）で置き換えることを含んでいる。修飾された 合成システィンフリータンパク質の配列を第５図に示す。当業者であれば、合成 ペプチドの配列における他の変形も本発明において有用であるということを認識 するであろう。企図された発明は、ペプチド配列の他のアミノ酸、あるいは、Ｄ ＮＡ配列の他のヌクレオチドの変形を含むものである。 ５．４．オリゴヌクレオチドの合成と組立合成オリゴマーの組立は３つの工程に よって行われた。最初に、相補的オーバーハング部を持つオリゴヌクレオチドが アニーリングされ、そして、４つの別々の２重鎖７ラグメントを生成するために 連結され、その１つは４つのオリゴヌクレオチド（ｌ鎖に２個）、他の３つは６ 個のオリゴヌクレオチド（ｌ鎖に３個）からそれぞれ構成された。組立前に、合 成オリゴマーはＴ４ポリヌクレオチドキナーゼのｌＯ単位でキナーゼ化された。 連結反応中の連結を防止するため、いずれかの鎖の５°末端オリゴマーはリン酸 化されなかった。これらの２重鎖オリゴヌクレオチドのサブセットは、４つのサ ブフラグメントを調製する！こめに個別のアニーリングと連結反応において組み 立てられ、それぞれは、組換え合成システィン７リーＩＬ−６のコード配列の約 １／４を成した。 修飾されたプラスミドは、ＤＮＡの増幅を可能にし各オリゴマーの配列を蘭単に するように構成された。ｐＢＳ　Ｍ１３＋クローンベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅ ｎｅ社）は２８塩基オリゴヌクレオチドアダプター（５°ＡＧＣＴＴＣＣＡＴＧ ＧＴＣＧＣＧＡＣ丁ＣＧＡＧＣＴＧＣＡ−３’　）をその複合クローニング領域 のＨｉ　ｎ　ｄ　Ｉ１１部位とＰｓｔ１部位との間に挿入することによって修飾 された。その結果、企図されたｐ２８７である修飾プラスミドは、もはやその最 初の５ｐｈ１抑制部位は含まず、Ｎｃｏ　Ｉ、　Ｎｒｕ　Ｉ、モしてＸｈｏ　Ｉ の追加部位をコードする。合成オリゴマーは、ＤＮＡ増幅とジデオキシヌクレオ チド配列化による配列照合１ｓａｑｕｅｎｃｅ　ｖｅｒｉｆｉｃａｆ−１Ｏｎ’ ４を可能にするため、変形されたｐＢＳ　Ｍ１３＋ベクターｐ２８７に個別にク ローンされた。組立てられたフラグメントを変形されたベクターに挿入すること によって、組換えプラスミドｐ３３３、ｐＢＳ４、ｐ３３１．モしてｐＢＳ２を 製造し、それぞれは、それぞれアミノからカルボキシ末端に進化する合成システ ィン７リーＩ　Ｌ−６タンパク質フード領域の部分を含んでいた。連結反応に続 いて、それぞれのプラスミドＤＮＡは、個別に、的確なＥ、ｃｏｌｉ　ＪＭＩＯ Ｉに変形された。 組立の第２のステップは、アミノとカルボキシルを合成システィン７リーＩ　Ｌ −６の半分にコードする２つのベクターを構成することである。これらは、Ｎ− 末端コードベクターｐ３３６を製造するｐＢＳ３とｐＢＳ４の挿入を連結反応さ せることによって、そして、Ｃ末端コードベクターｐ３３５を形成するｐＢＳ２ とｐ３３１の挿入物を結合することによって行われた。 この構成の第３及び最終のステップにおいては、挿入物が次いで結合され、組換 え合成システィン７リーＴ　Ｌ−６遺伝子の配列を完全にコードする。プラスミ ドｐ３３５から分離された挿入物は、ｐＢＳ６に連結反応させられる。結果とし て生じたプラスミドｐ３６５は、変形されたｐＢＳ　Ｍ１３＋ベクターｐ２８７ のＮｃｏ１部位とＥｃｏ　Ｒ１部位との間に挿入された合成Ｔ　Ｌ−６の完全な コード配列を含んでいた。この構成は第６図に示されている。 ５．５９合成ＴＬ−６／コラーゲン／ β−ガラクトシダーゼ融合生成物を 発現するｐ３６７ベクターの構成 組立てられたシスティンフリー組換えＩ　Ｌ−６遺伝子は、ｐ３６５によって励 起され、開始メチオニンを取り囲むＮｅｏ　１部位と、図７に示されたコラーゲ ンリンカ−に隣接するＢａｍＨ１部位との間でプラスミドル３４０中に挿入され る。第８図に測長なしに概略図示されている結果として生じたベクターｐ３６７ が、Ｅ、Ｃｏ１１　ＪＭＩＯＩを変形するために使用された。組換えコロニーは 抗生物質の抵抗に基づき、Ｘ−Ｇａ１の存在下における青色着色現象によって選 択された。挿入Ｄ　Ｎ　Ａのサイズは、ミニライゼート抽出によって確認され、 次いでポリアクリルアミドゲルの電気泳動が行われた。 合成システィン７リーＩ　Ｌ−６と、６０アミノ酸コラーゲンリンカ−と、モし てβ−ガラクトシダーゼとから構成される３部分から成る融合タンパク質が、形 質転換された細菌内で製造された（第３図、第９図参照）。遺伝子配列から予測 されたように、修飾ＩＬ−６発現プラスミドを有するアンピシリン耐性形質転換 細胞が、誘導剤Ｉ　ＰＴＧと発色性β−ガラクトシダーゼ基質Ｘ−Ｇａ１との添 加によって、青色コロニーを生じた。 Ｉ　ＰＴＧ誘導形質転換細胞による融合タンパク質の合成は、Ｐｒｏｍｅｇａ　 Ｂｉｏｔｅｃ社から得られるモノクロナール抗β−ガラクトシダーゼ抗体を使用 してＥ、ｃｏｌｉライゼート全体のウェスタンプロット分析を行うことにより独 立に確認された。ウェスタンプロットで使用されたこのモノクロナール抗β−ガ ラクトシダーゼ抗体は、見かけの分子重量１３，０００ｋＤａのバンドを認めた 。 ５．６．修飾インターロイキン−６の 融合タンパク質の大量誘導 プラスミドｐ３６７を含む形質転換ＪＭＩＯＩが、Ｍａｇｎａｆｅｒｍ　ｆｅｒ ｍｅｎｔｏｒ（Ｎｅｗ　Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用し てＩＯＬバ７チ培養器内で膚冑された。細胞は、１００　ｕｇ／ｍｌのアンピシ リンを含んだ２ｘＹＴにおいて成育され、５ｍＭのイソプロピルチオ−Ｂ−Ｄ− ガラクトピラノサイド（Ｉ　ＰＴＧ％Ｓ　ｉ　ｇｍａ）の添加によってＡ３５５ −１．５で誘導された。接種後８〜１２時間で、細胞数とβ−ガラクトシダーゼ 活動が最大レベルに達し、細胞は５０００　ｘｇの遠心力でペレット化され、マ イナス２０℃で冷凍され、必要となるまで保存された。 ５．７．融合タンパク質の精製 冷凍されたＥ、ｃｏｌｉ細胞ベレットは、１００ｇ（含水重量）の分別部分に、 ＴＮＳＮＳパー７７−　（３０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、ＣＩ、ｐＨ７，４：３０ｍＭ　 ＮａＣ１，０，０５％ラウロイルサルコシンナトリウム）で洗浄することにより 処理された。洗浄された細胞は、１．５ｍＭのＥＤＴＡと０　、５　ｍｇ／ｍｌ のリゾチームを含む４５０＋ｎ＋のＴＮＳ中で分離された。浮遊物を氷上で３０ 分インキユベーシゴンした後、完全な分離が、細胞を３サイクルの冷凍−溶解と 短い音波処理とにさらすことによって確保された。β−ガラクトシダーゼ活性を 剥奪された溶解性タンパク質は、ＴＮＳ中で３回繰り返して洗浄し、次いで２０ 分間の１０，０００　ｘｇの遠心分離にかけることで取り除かれた。約４０ｇ重 量の最終ベレットは、１０％サルコシルの６０ｍ１中で再懸濁され、リン酸でバ ッファされたサリーン（ＰＢＳ）で２．４リツトルに希釈された。非溶融性物質 は、遠心分離で取り除かれ、上澄みはリン酸アンモニウムの飽和溶剤に対して４ ０％に希釈された。抽出物を氷上で３０分培養しｔ；後、沈降したタンパク質は 、再び遠心分離によって回収され、付加的な２度のリン酸アンモニウム沈降にさ らされｔ；。最終抽出物は、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、ＣＩ、　ｐＨ７，４と１５０ ｍＭ　ＮａＣＩの２０ｍＭ中で再懸濁され、４ｍｌの分別部分に分けられ、マイ ナス２０℃で、次の処理の準備をするまで保存された。 ５．８．融合タンパク質の開裂と合成システィンフリーインターロイキンＩ　Ｌ −６の精製 組み換え合成システィンフリーＩ　Ｌ−６タンパク質が、逆相のＨＰＬＣを使用 して相同体へと精製された。溶解された抽出物（４ｍｌ）が、集合物を分散する ために短く音波処理され、前処理されたコラゲナーゼに付加され、そして室温で ４５５分間インキュページンされた。開裂されたβ−ガラクトシダーゼの大部分 は、飽和したリン酸アンモニウムの０．５ボリユームを付加することによって取 り除かれ、氷上で３０分間インキュベーションして非溶融性物質をペレット化し た。開裂されｔ；組換えシスティンフリーＩＬ−６は、上澄みの全量を飽和した リン酸アンモニウムで１３ｍ１ｓにすることによって濃縮され、氷上で３０分間 インキュベーションし、そして非溶融性タンパク質を浮遊薄膜に詰めるために遠 心分離した。液体はチューブを破裂させることによって排水し、そして残った薄 膜はＴｒｉｓバッフアサリーン０．５ｍ１ｓ中で再懸濁された。 再懸濁されｔ；組換えシスティンフリーＩ　Ｌ−６が、６０％のアセトニトリル と、０．１％のトリフルオロ酢酸の等量を加えることによって、逆相ＨＰＬＣ用 に準備された。非溶融性物質はペレット化され、澄んだ上澄みが２５０ｍｍ、４ ．６闘のＴＤ逆相コラム（Ｖｙｄａｃ、　２１８Ｔｐ、　ｃｌｇ、１０μｍ−Ａ １１ｔｅｃｈ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ）上に、０．５から１ｍｌの注入体積で載 せられた。移動相は、溶剤Ａ（０゜１トリフルオロ酢酸）に対して溶剤Ｂ（６０ ％のアセトニトリルと０．１％のトリフルオロ酢酸）の変化する濃度で構成され た。流速は０−５ｍ１−’分で、５分間に２５％から８０％のＢへ、そして５４ 分で８０％から１００％のＢへ、２つの連続的な直線勾配をプリバーするように システムがプログラムされｔ；。５４％のアセトニトリルでコラムから溶解され 単一のビーク留分に集められ！＝タンパク質は、精製された合成システィン７り −インターロイキンー６ペプチドであり、これは５ＤＳ−ＰＡＧＥに続いて２３ ｋＤａで移動した。精製工程は第９図に示し、それぞれの工程で得られた生産物 は表１に示す。 ・ト ２３ｋＤａタンパク質の同一性を確認するため、ＨＰＬＣで精製された物質が、 Ｎ−末端自動タンパク質配列を指示するようにされた。７凹の逐次分解［５ｅｑ ｕｅｎｔｉａｌ　ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ３後に特定されたアミノ酸残基（ＭＧ ＶＰＰＧＥＤ）は、合成組換えンステインフリ−Ｉ　Ｌ−６遺伝子から誘導され た組換えタンパク質の予測されたＮ−末端アミノ酸成分と一致した。タンパク質 配列の確認によって、その製品は末端メチオニン残基を持つ組換えシスティン７ リーＩ　Ｌ−６タンパク質の小さなフラクシヨンを含有することが明らかにされ た。 ある実施例では、単離された活性７ラクシヨンが、アミノ末端メチオニン含有と アミノ末端メチオニン弗素をの合成システィン７リーＩＬ−６タンパク質の混合 物から構成された。アミノ酸配列解析は、その混合物の１つの製品において、そ の混合物の９０％がアミノ末端でメチオニン非含有であり、１０％がアミノ末端 メチオニンを含んでいることを示した。この実施例では、システィンフリータン パク質の活性標本は、次の点で天然ＩＬ−６とは異なる。ｌ）分子内ジスルヒド 結合が発生せず、２）生物工学タンパク質において位置ｌにあるメチオニンアミ ノ酸が天然の処理されていないタンパク質の信号配列アミノ酸１−２８を置換し 、３）生物工学タンパク質、すなわちグリシン内のアミノ酸２が天然のＩ　Ｌ− ６タンパク質内にあるプロリンアミノ酸を置換し、４）カルボキシ末端が、付加 アミノ酸を含むことである。 コラゲナーゼは一般的に配列Ｐ−Ｙ−Ｇ−Ｐ内のＹの後で開裂する。ここでＹは 中性アミノ酸である。Ｋｅｉｌ等、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　５６：２９２− ２９６（１９７５）を見よ。ＩＬ−６配列を持つ融合タンパク質の本例では、Ｙ によって表わされた中性アミノ酸は、バリンである。従って、コラゲナーゼを持 つ融合タンパク質の消化後にｐ３６７ベクターによってコードされた融合タンパ ク質によって生成されたタンパク質のカルボキシ末端は、主に１９．。 Ｐ−Ｇ−Ｐ−Ｖ−Ｇ−Ｐ−Ｖ及び／又は、、、Ｐ−Ｇ−Ｐ−Ｖであると思われる 。もし充分なコラゲナーゼが充分に論理的条件下で存在する場合には、カルボキ シ末端は１．、、Ｐ−Ｇ−Ｐ−■に違いない。もし、第５図における第３アミノ 酸（すなわちＶ）で始まり、端部（すなわちＭ）から１４番目のアミノ酸で終わ るアミノ酸配列がペプ（ｐｅｐ）と呼ばれるとすれば次のペプチドが本発明によ って考えられる。 Ｇ−ｐｅｐ−５ＤＰＧＰＶＧＰＶ　Ｃ９ンパク質工）Ｇ−ｐｅｐ−３ＤＰＧＰＶ 　、　（タンパク質Ｉｆ）ＭＧ−ｐｅｐ−５ＤＰＧＰＶＧＰＶ　（タンパク質■ ）ＭＧ−ｐ　ｅ　ｐ−５ＤＰＧＰＶ　（タンパク質■）この標本は、本文の７． ８及び９において述べられた実施例で使用されている。 アミノ末端におけるメチオニンの有無、及びカルボキシ末端におけるＧ−Ｐ−Ｖ の有無は、Ｉ　Ｌ−６の活性に影響しない。 ５．９９合合成システィン７リーＩＬ−６の代替製法前述した所は、本発明の合 成システィンフリーＩ　Ｌ−６ペプチドが製造される有用な方法の唯一の特別な 例である。しかし、当業者であれば、他の単細胞宿主と同様に他のベクター構造 もまた本発明の方法で有効であることを認識する。一般的に言えば、例えば、専 門家は、挿入した遺伝子の転写及び翻訳を得るために、その遺伝子は、選択され た宿主細胞と両立し得るプロモータの制御下に置かれなければならないと認識す るであろう。 プロモータは、ＲＮＡポリメラーゼが付加されて転写を開始するＤＮＡの領域で ある。選択されたプロモータは、宿主細胞生物から単離されたもののいずれの１ つでもよい。例えば、通常使用される宿主系であるＥ、ｃｏｌｉは、それと関連 したり、そのバクテリオファージと関連したり、あるいはそのプラスミドと関連 する上ａＣ又はｒｅｃＡプロモータのような多数のプロモータを持っている。ま た、λ７アージＰＬ及びＰ８プロモータなどの合成又は組換え的に生成されたプ ロモータは、それに隣接するＤＮＡのセグメントの高レベル生成を指示するため に使用することができる。また、類似のプロモータも、他の細菌及び真楼性細胞 に特定された。 遺伝子の充分な転写及び翻訳を達成するには信号もまた必要である。例えば、Ｅ 、ｃｏｌｉ　ｍＲＮＡでは、リボンーム結合部位は、翻訳開始コドン（ＡＵＧ又 はＧＵＧ）及び１６ＳリポソームＲＮＡの３°末端の塩基に相補的な他の配列も 含む。 これら後者の配列（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏすなわち５−Ｄ）の蜆ツかは 、Ｅ、ｃｏｌｉ及び他の適切な宿主細胞型において特定された。宿主細胞系と両 立し得るいかなる５Ｄ−ＡＴＧ配列も採用り旦遺伝子又はＮ遺伝子の５Ｄ−ＡＴ Ｇ配列、又はＥ、ｃｏ＋±トリプトファンＥ、Ｄ、Ｃ，Ｂ又はＡ遺伝子を含むが 、それらに制限されるわけではない。 ＤＮＡフラグメントを生体外でクローンベクターに挿入する方法は数多く存在す る。ＤＮＡリガーゼは、二重ＤＮＡチェーンにおける隣り合うヌクレオチド間に 単一鎖ニックを封する酵素である。この酵素は、従って、ある抑制酵素によって 生成されたアニーリングした相補末端をしっかり継ぐために使用される。代替案 として、ＤＮＡリガーゼが、プラントエンド７ラグメント間のホスホジェスタ結 合の形成を触媒反応させるために使用され得る。最後に、酵素末端デオキシヌク レオチディル・トランスファラーゼが、７ラグメントの末端にホモポリメリック ３′−単一鎖テールを形成するために採用され得る。オリゴ（ｄＡ）配列を１個 体群の３′末端にそして複数のオリゴ（ｄＴ）ブロックを第２個体群の３′末端 に加えることによって、２つの型の分子がアニーリングされ、ジメリックサーク ルを形成する。これらの方法のいずれも、レギュレータをベクターの特定部位に 結び付けるために使用され得る。従って、システィン７り−又はシスティン含有 のＩ　Ｌ−６融合タンパク質に対する配列コードは、ベクタープロモータ及びレ ギュレータに対して特別な関係で選択ベクターに結び付けられる。従つて、その 配列は、ベクターＡＴＧ配列に関して正しい読み取りフレーム内にある。採用さ れるベクターは、典型的には、アンピシリン抵抗性又はテトラサイクリン抵抗性 などの標識機能を有するもので、その結果、形質転換細胞を特定することができ る。採用された方法では、公知の発現ベクター又はその誘導体のいずれかが用い られ、最も頻繁に使用されるものは、ｐＢＲ３２２゜ｐＡＣ１０５，ｐＶＡ　５ ．ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＫＨ４７゜ｐＡＣＹＣ１８４，ｐＵＢ　ｉｌｏ、ｐｍＢ ９．ｐＢＲ３２５゜ｃｏｔ　Ｅｌ、ｐＳＣｌｏｌ、ｐＢＲ３１３，ｐＭＬ２１． Ｒ５Ｆ２１２４．ｐＣＲＩ又はＲｐ４などのプラスミドベクターか、あるいはラ ムダｇｔ１１．ラムダｇｔ−ＷＥＳ−ラムダＢ、チェーン２８．チェーン４．ラ ムダｇｔ−Ｉ−ラムダ　ＢＣ，ラムダ−ｇｔ−１ラムダ　Ｂ、Ｍ１３ｍｐ７．Ｍ 　１３ｍｐ８．Ｍ１３ｍｐ９　；ＳＶ４０及びアデノウィルスベクター；そして 酵母ベクターである。そのベクターは、選択した宿主細胞系との両立性で選択さ れる。細菌、特にＥ、ｃｏｌｉは、合成Ｉ　Ｌ　−６ペプチドの高生産生成に非 常に有効であり、好ましい宿主であることがわかったが、本発明はそのようなも のに制限されるものではない。本発明では、宿主として、培養可能ないかなる単 細胞生物も考慮している。例えば、酵母やインセクトなどの真核性宿主である。 また、哺乳類細胞もＩ　Ｌ−６生成に対して有能な宿主である。宿主細胞の選択 に基づいて、適切な発現系の選択が専門家の知識内で行われる。 当業者であれば、ここに述べられた融合タンパク質の変形もまた可能であること がわかる。例えば、第１及び第３ペプチドの順序を逆にしても良い。その結果、 第３ペプチドセグメントはアミノ末端に配置され、Ｉ　Ｌ−６活動を持つペプチ ドに対する配列コードは、カルボキシ末端にある。第２の開裂可能なペプチド部 分は、それら２つのセグメントのリンクとして残されている。 これらのセグメントのそれぞれの特定もまた変えられ得る。 例えば、実質的な変形は、基本的なＴ　Ｌ−６ペプチド配列内部及びその周囲で 可能である。特に興味ある観察は、アミノ末端の実質的部分が、活性を失うこと なく、システィン含有及びシスティンフリーのＩ　Ｌ−６配列の両方の活性を結 果として２−３７オールド増加した状態で、削除され得るということである。 しかし、その配列における最終の２０残基の除去は、システィン７り−及びシス ティン含有形とともに、活性の完全な喪失をもたらす。またＩ　Ｌ−６のカルボ キシ末端上の付加アミノ酸残基の存在は、分子の生物的活動に影響を与えない、 　ＩＬ−６の公知の配列のアミノ酸が、化学的に等価なアミノ酸で置き換えられ 得ることは、当業者によって容易に理解され得る。換言すれば、全体として分子 の活動に影響を与えることなく、「沈黙の変更」がアミノ酸配列になされ得る。 例えば、示されたように、全てのシスティン残基セリン残基で置換することは、 精製したＩ　Ｌ−６分子に生物的活動を保持させ得る。システィンに対する置換 などの代替選択は、バリン、プロリン、インロイシン及びグリシン、セリン又は チロリンなどの他の中性アミノ酸である。例えばアスパラギン酸及びグルタミン 酸などの負に荷電した残基は、リシンやアルギニンなどの正に荷電した残基と同 じように、相互交換可能である。トリプトファン、フェニルアラニン、ロイシン 、イソロイシン、バリン及びアラニンを含んでいる疎水性残基もまた交換可能で ある。生物的活動が保持されるかどうかを決めるための結果としての分子の試験 及びアミノ酸置換、削除、又は付加は、余計な実験を必要とせず、当業者の能力 の範囲内で実施可能である。 開裂リンカ−ペプチド配列の特定もまた、単なる設計事項であり、化学的、酵素 的手段を用いて実行され得る。採用された配列は、化学的に開裂され得るところ のものであり、Ｉ　Ｌ−６の生物活性を持つペプチドは、融合タンパク質の残部 から解放され得る。好適な実施例では、開裂可能な配列は酵素的に分解可能［ｄ ｅｇｒａｄａｂｌｅ］なものである。コラ−ゲナーゼ感受配列は、はんの−例で ある。他の部位は、エンテロキナーゼ−又は因子Ｘａ−開裂可能部位を含んでい るものである。例えば、エンテロキナーゼは、配列Ａｓ　ｐ−Ａｓ　ｐ−Ａｓ　 ｐ−Ｌｙ　ｓにおけるリシンの後を開裂する。因子Ｘａは、配列１１ｅ−Ｇｌｕ −ＧＩｙ−Ａｒｇを有する部位、および、アルギニンの後の開裂に特異的である 。その他の有効な開裂部位は、配列Ｌｅｕ−Ｖａ］−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ− ５ｅｒ−Ｐｒｏを認識するトロンビンの部位である。トロンビンは、ＡｒｇとＧ ｌｙの残基を開裂する。べつな酵素開裂可能部位もまた、臭化シアンによって開 裂可能な部位を含むように選択され得る。臭化シアンは、ペプチド配列内のメチ オニン残基をアタックする。 不可欠ではない好ましいことは、開裂されるとき、Ｉ　Ｌ−６配列に付いている 最小数の残基を残すリンカ−配列を選択することである。従って、解放されたＩ 　Ｌ−６活性ペプチドの末端は、できるだけ未変性の配列に近い。ある実施例に おいては、ＩＬ−６活性部分が、融合タンパク質のカルボキシ末端の位置にある 。また、開裂部位は、天然ｐｒｏ−ｖａｌ−ｐｒｏアミノ末端ペプチド配列を残 し得るタンパク質分解酵素に対して特別効果がある。そのような開裂部位の例は 、エンテロキナーゼによって開裂されるものである。 第３ペプチド配列の特定法もまた種々ある。３部分構成のこの部分は、次ぎの２ つの目的を果たす。（１）選ばれた宿主内に発現され得る正しく選択したタンパ ク質用途は、Ｉ　Ｌ−６活性を有するペプチドの生成を強いプロモータの制御下 に置き、それらのペプチドの精製を容易にすること、及び（２）それは融合タン パク質を精製する変換クローンを特定するために便利な手段を提供し得る。例え ば、上述の検討においては、β−ガラクトシダーゼをコードしている完全配列が 使用された。このタンパク質は適当な基質を加えることによって、視覚検出でき る手段を与える。 代替案として、残っている部分が宿主細胞によって容易に発現される場合には、 第３ペプチド部分は、そのようなタンパク質の７ラクシヨンであり得る。この部 分は、また、必ずしも視覚的に検出可能である必要のないペプチドであり得る。 しかし、その存在は、例えば、融合タンパク質の期待分子重量の計算又は検出可 能なマーカをベクター内に挿入するなどの別の手段で検出され得る。原核性宿主 内の使用に対する他の有用な代替配列は、ｔｒｐＥ遺伝子生成物、又はその部分 である（Ｋｌｅｉｄ　ａｔａｌ、５ｃｉｅｎｃｅ　２１４：１１２５（１２９， １９８１）。付加選択は、ヒト細菌ウィルスのｃｒｏ遺伝子に対してコードする 配列又はβ−ガラクトシダーゼに対してコードする１ａｃＺ配列よりはＩａｃ遺 伝子の他の部分を含む。当業者であれば、請求の範囲に記載された融合タンパク 質の第３ペプチド部分に対して基本を与える付加的選択を認識することができる 。 ５、ｌＯ代替ＤＮＡ構成 次の例は、３部分融合タンパク質の第１及び第３ペプチド部分の位置が逆転され ているＤＮＡ構成の標本を示している。また、代替リンカ−及び第３ペプチド部 分が表されている。この構成を用いているＩ　Ｌ−６タンバク質の生成量もまた 大きなものであり、全可溶性細胞タンパク質の約１−２０％の範囲にある。 ５．１０．ｌ　ＴｒｐＥ−エンテロキナーゼ開裂部位−ＩＬ−６突然変異タンパ ク質融合タンパク質（ａ）酵素的開裂部位を従え、天然Ｉ　Ｌ−６ペプチドのＣ 末端及びＮ末端部及びセリンによって置換された全４個のシスティンを有する合 成Ｉ　Ｌ−６ペプチド配列を直後に従えた、ＴｒｐＥ遺伝子、アントラニレート シンターゼの生成をコードする融合タンパク質は、新しい組換えプラスミドｐＴ ｒｐＥ／ＥＫ／ｃｆＩＬ６によって発現される。ｐＴｒ　ｐＥ／ＥＫ／ｃ　ｆ　 Ｉ　Ｌ６を製造するために、（本文５．５及び第６図に述べられた）プラスミド ｐ３６５は、（５’Ｎｃｏ１部位から１４塩基を配置されているＥｃｏＲＩＩ部 位を切るために）酵素ＥｃｏＲＩＩで、また（ＢｇｌＩＩ’　として第１３図に 示されているＢｇｌｌｌを切るために）Ｂｇｌｌｌで消化される。プラスミドは 、３７℃で２時間、１０＋ｕｇプラスミドについて５ユニツトの各酵素で消化さ れる。０．４９２Ｋｂ　ＥｃｏＲＩＩ／Ｂｇｌ　１１７ラグメントは電子溶出な どの標準手順によって隔離される。この０゜４９２Ｋｂ７ラグメントは配列Ａと 呼ばれる。この配列Ａ及びこのセクションの次ぎのテキストに記される次の配列 は、第１２図の説明を参照する。 （ｂ）プラスミドｐ３６５の付加部分標本（約１０μｇ）は、２５ｍＭ　Ｔｒｉ ｓ　ＨＣｌ、１００ｍＭ　ＭｇＣ１ｘ、１０ｍｇ／　ｍ　Ｉ　Ｂ　Ｓ　Ａ及び２ ｍＭ　ＢＭＥのバッファにおいてｐＨ７゜５で、上述の如＜　Ｈｉｎｄ　Ｉｌｌ 及びＢｇｌｌｌで消化される。ＢｇＩ　１１’として第１３図において参照され たＢｇ１１１部位及び新規なＨｉｎｄｌ１１部位を切ることから生ずる大きな（ ３，０Ｋｂ）７ラグメントは、配列Ｂと呼ばれる。 （Ｃ）合成二重−鎖オリゴヌクレオチド（配列Ｃ）が作られ、配列Ａ及び配列Ｂ に結ばれる。オリゴヌクレオチドは、重なり合っているＨｉｎｄ　Ｉｌｌ及びＢ ｅ１１部位で開始し、天然Ｉｎ、−６の第１の３アミノ酸、Ｐｒｏ−Ｖａ　Ｉ− Ｐｒｏ　（ＰＶＰ）をすぐ後に従えたエンテロキナーゼ開裂部位を含んでいるア ミノ酸の配列をコードし、ＥｃｏＲ１１部位で終わる。オリゴヌクレオチドの配 列は、 Ｂｅ１Ｉ　ＤＣ５ｉｔｓ ５’ＡＧ　ＣＴＴ　ＣＡＴ　ＣＡに　ＧＣＧ　ＧＡ、Ｔ　ＣＣＧ　ＧＡＡ　ＧＧ Ｔ　にＧ’ｌ’　ＡＧＣＱＣＣＡＣ（：ＡＣＱＣＡＡＡｓｌＡ　Ｃｕ　ｃｘｃ　 ｃｃｃ　ＧＴＡ　ＧにＣｃｒｒ　ｃｃａ　ｃｃａ　ｘｃｃ　ｃｒｃ　ｃｒｃ　ｃ ｒｃ　ｃｔｃ　１ｒｎＰＶＰ３’ ＣＣＧ　Ｇｒｒ　ＣＣＧ ｃｃｃ　ＣＡＡ　ＧＯＣｃｃ’ｒ　ｃｃ　ｓ”Ｅｃｏ尺１１ オリゴヌクレオチドの各鎖は、分離して作られ、３７〜Ｃで３０分間適切な反応 バッファにおいて１ｍ　Ｍ　ｒ　Ａ　Ｔ　Ｐの存在でポリヌクレオチドキナーゼ で処理され、８５〜Ｃまで５分間加熱してアニーりングされ、続いて２５〜Ｃま でゆっくり冷却される。 配列Ｃを配列Ａ及びＢに結合させるため、およそ１Ｉｇの合成システィン７リー Ｉ　Ｌ−６ＥｃｏＲＴ　Ｉ／Ｂｇ　Ｉ　Ｉ　７ラグメント（配列Ａ）が、２００ ｎｇの合成オリゴヌクレオチド（配列Ｃ）と共潤沈降反応させられ、そして、ｐ ３６５のＨｉｎｄｌｌｌ／ＢｇｌｌＩベクター成分（配列Ｂ）に結合させられる 。結合は、２０ｍＭ　Ｔｈ１ｓ　Ｈｃｌ、ｐＨ７，６，０，５ｍＭ　ｒＡＴＰ、 ｌｏｍＭ　Ｍｇｃ１２．５ｍＭ　ＤＴＴを含有する２０μ１反応体積において、 １６℃で夜通し実行される。新プラスミドはｐＡＢＣである。ｐＡＢＣは、反応 混合物の５μｍ部分部分管応答能のあるＨＢ　Ｉ　Ｏ１細菌に加えることによっ てクローン化される。アンピシリン抵抗コロニーが、３７℃での夜通しのインキ ュベーション後に選択される。 （ｄ）ｐ３６５において発現された組換え合成システィン７リーＩＬ−６遺伝子 の３′端部は、メチオニンで終わるＩ　ｎ、−６カルボキシ末端をコードするた めに、再構成される。 これを実行するため、次のオリゴヌクレオチドが上述の如く合成される。 ５’　ＧＡ　ＴＣＴ　ＴＴＣＡＡＡ　ＧＡＡ　ＴＴＣＣＴＧ　ＣＡＧ　ＴＣＣＴ Ｃ（：　ＣＴＧ　ＣＧＴ　ＧＣＴ　ＣＴＧ　Ｃ０丁３１　入　入入ＧＴＴτ　Ｃ ＴＴ　λＡＧ　ＣＡＣＧＴＣ入ＧＧ　入ＧＧＧ入ＣＧＴλＣＧ入　ＣＡＣＧＣＡ ｃＡＧ　ＡＴＧ　ＴＡＡ　ＴＧλ、τ入Ｇ　ＧＴＡ　Ｃ３’ＧＴＣτＡＣ入ＴＴ 　λＣＴ　入ＴＣ５’左から右へ読み比す、このヌクレオチドは、Ｂｇ１１１部 位で始まり、３６５のＢｇｌｌｌ’に従うＩ　Ｌ−６の天然アミノ酸をコードし 、そして３個の停止コドン及びＫｐｎＩ部位（配列Ｄ）をすぐ後に従えるメチオ ニン残基で終わる。 （ｅ）　ｐＡＢＣ（ステップＣ）は、Ｈｉｎｄｌｌｌ及びＢｇｌｌｌ（配列Ｅ） で消化される。 （ｆ）　（Ａ、　Ｔｚａｊａｌｏｆｆ、コロンビア大学、ニューヨーク市から出 されている）ＰＴＨ２３は、Ｈｔｎｄｌ１１部位を含むポリアンカーに隣接しか つそれに関するその３°端部における読み出しフレームにある（アントラニレー トシンターゼ成分）ＴｒｐＥのアミノ天端３３７アミノ酸をコードする遺伝子を 含むアンピシリン抵抗プラスミドである。ＴｒｐＥオペロンは、Ｍｉｌｌｅｒ及 びＲｅｚｎｉｋｏｆｆ、ｅｄｓ、Ｔｈｅ　０ｐｅｒｏｎ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎ ｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ。 ｐｐ、２６３−３０２（１９７８）に見出される。ｔｒｐＥ及び１ａｃＺの全て 又は一部をコードする他のＤ　Ｎ　Ａ源は、容易に利用可能である。 そのような他のＤ　Ｎ　Ａ源は、例えばＰｏｕｖｅｓ等、　Ｃｌｏｎｏｎｇ　Ｖ ｅｃｔｏｒｓ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｅｌｓｅｖｉｅ ｒ、　１９８５に見出せる。例えば、ｔ　ｒｐＥ配列は、Ｐｒｏｖｅｌｓ等のマ ニュアル内の次の特定コードを有すプラスミドから分離され得る。 二〇／１ｇＰＡＴＨ２３は、３７℃で２時間、それぞれ５ユニツトのＢｉｎｄｌ ｌ＋及びＫｐｎ　ｌで消化される。大きな７ラグメントは、ゲルクロマトグラフ ィ、次に電子溶出及びエタノール沈降反応によって分離される（配列Ｆ）。 （ｇ）およそ２００ｎｇの配列りは、およそ１μｇの配列Ｅと混合される。その 結果の混合物は、配列Ｆを存在させて、エタノールで共同沈降反応させられ、上 述の如く結合される。その結果の７ラグメントは、ｐＴｒｐＥ／ＥＫ／Ｃｆ　Ｉ Ｌ−６と呼ばれる。 （ｈ）応能力のあるＥ、ｃｏｌｉ宿主細胞は、ｐＴｒｐＥ／ＥＫ／ｃｆＩＬ−６ で変換される。例えば、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｈ８１０１菌株が、一実施例において変 換用宿主細胞として使用される。アンピシリン抵抗コロニーが集められる。これ らのコロニーは、ＴｒｐＥセグメント、エンテロキナーゼによって認識されかつ 開裂されるアミノ酸セグメント、及びＰＶＰで始まりＭで終わっている、天然Ｉ 　Ｌ−６のカルビキシ及びアミノ酸末端の双方にターミニ：ｔｅｒｍｉｎｉ３を 有する合成システィンフリーＩ　Ｌ−６アミノ酸配列から成る融合タンパク質を 発現する。 ５．１０．２　ベーターガラクトシダーゼ−エンテロキナーゼ開裂部位−合成シ スティン７り−Ｉ　Ｌ−６突然変異タンパク質融合タンパク質ＴｒｐＥエンテロ キナーゼ−開裂部位合成システィン７り−ＩＬ−６融合タン融合タンパ酸質るた めの、５．１０．１に述べられたプロトコルは、ｐＥｘ−１ベクターがステップ ｆでＰＡＴＨ２３と置換されることを途いて、次の通りである。ｐＥｘ−１はＢ ａｍＨＩ及びＫｐｎＩで消化される。ＢａｍＨＩ及びＢｃｌＩは、両立し得る抑 制部位を有する。結果としての構成は、クローニングポリアンカーを従えた熱誘 導性β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含む。切り取った遺伝子は、およそ４８Ｋｄ のベータガラクトシダーゼタンパク質であるペプチドを生成する（Ｓｔａｎｌｅ ｙＪ、に、及びＬｕｚｉｏ、Ｊ、Ｐ、、１９８４．ＥＭＢＯＪ、Ｖｏｌ、３．ｐ ｐ１４２９−１４３４）。結果としての構成は、ｐβｇａ　Ｉ／ＥＫ／ｃ　ｆ　 Ｉ　Ｌ−６と呼ばれる。他のベータガラクトーゼＤＮＡ源は、５．２．１．で述 べられたｐＨｇ２０００を含む。融合タンパク質は、ｐβｇａｌ／ＥＫ／ｃｆｌ Ｌ　６及び熱誘導によって、Ｅ、ｃｏｌｉ薗株Ｎ９９において複製される。Ｎ９ ９及びＮ４８３０は、Ｐｈａｒｍａｃｉａから利用可能である。融合タンパク質 は、公知の方法を用いてエンテロキナーゼによって開裂される。 エンテロキナーゼで、エンテロキナーゼ認識部位を有するタンパク質を開裂する ことは、慣例的なやり方である。例えば、Ｈｏｐｐ等、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ｏｇｙ　６：１２ｌ２Ｏ４−１２１０（１９８を参照。 ５．１０．３．因子Ｘａ開裂部位を持つ融合タンパク質因子Ｘａ部位は５．２０ ．１．及び２．のステップＣを調整することによってエンテロキナーゼ部位を置 換される。５．１０．１゜のステップＣで示された合成オリゴヌクレオチド（配 列Ｃ）は、Ａｓｐ、Ａｓｐ−Ａｓｐ、Ａｓｐ、ＬｙｓをコードするＤＮＡ配列か ら成る。このＤＮＡ配列は、因子Ｘａ開裂認識部位ＩＩｅ、Ｇｉｕ、Ｇｌｙ、Ａ ｒｇをコードするように調整される。 その結果である構成は、ｐβｇａ　ｌ／Ｘａ／ｃ　ｆ　Ｉ　Ｌ−６と呼ばれる。 プラスミドｐＴｒｐＥ／ＥＫ／ｃｆ　ＩＬ−６及びｐβｇａ　ｌ／Ｘａ／ｃ　ｆ 　Ｉ　Ｌ−６は、５−１０−１−及び５．１０．２゜に述べられた如くに発現さ れる。その結果である融合タンパク質は、因子Ｘａで開裂される。その因子は、 公知の方法によってその認識部位内のａｒｇの後を開裂する。例えば、Ｎａｇａ ｌ＆Ｔｈｏｇｅｒｓｏｎ　、〜ａｔｕｒｅ　３０９：８１０−８１２（１９８４ ）。 ５．１ｔ、合成システィンフリータンパク質の活動分析５、ｉ　１．１．　肝細 胞刺激分析 ＦＡＺＡ　９６７ラツト肝細胞が、１０％ＮｕＳｅｒｕｍ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａ ｔｉｖｅ　Ｒｓｅａｒｃｈ）、ペニシリン、及びストレプトマイシンで補足され たＤＭＥＭ／Ｆ　ｉ　２で成長された。分析は、４８ウエルグレート内で成熟さ れた一日おいｔ；合流性単層上で実行された。 ５．２から５．８に述べられた方法によって作られるように、システィン７り一 組換えＩ　Ｌ−６、及び他の調整媒体を用いて処理する前に、細胞が１０７Ｍデ キサメタシンを含むセラムフリー媒体で洗浄された。処理された細胞は、次に分 析の間甲セラムフリー／デキサメタシン媒体内に維持された。細胞は、細胞培養 インキュベータ内で３７℃で５時間システィン７り一組換えｒ　Ｌ−６及び他の 調整媒体を存在させて、インキュベートされた。処理後、細胞の上澄みが取り途 かれ、−２０℃に保管された、すなわち次のごとくフィブリノーゲンに対して直 接分析された。細胞上澄みの２倍の連続希釈液が、分割９６−ウニルマイクロタ イタプレート内に準備され、ドツト−プロット装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて 、０．４５γｍニトロセルロースフィルタ上に点滴された。フィブリノーゲンの レベルは、固相酵素結合免疫学的検定によって決定された。フィブリノーゲンは 、（スタッフォード大学、Ｃｒａｂｔｒｅｅ　Ｄｒ、Ｇｅｒａｌｄ　Ｒから入手 した）ラビット抗−ラントフイブリノーゲンボリクローン抗血清の１：１０００ 希釈液を用いて検出された。第二次抗体は、親和精製アルカリ　リン酸塩−共役 のやぎ抗−ラビット抗血清であった（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ）。バウン ド抗体は、基質二にローブルーテトラゾリウム（Ｎ　Ｂ　Ｔ）及び５−ブロモ− ４−クロロ−３−インドリル−リン酸塩、ｐ−）ルイジン塩（ＢＣＴＰ；Ｓｉ　 ｇｍａ）を加えて、目に見えるようにされた。ＰＭＡから得られた上澄みで処理 された細胞からなる正の制御は、ＭＲＣ−５繊維芽細胞を刺激した。分析の定量 化は、レーザデンジトメトリを走査することによって実行された。ＣＶａｎ　５ ｎｉｃｋ　像、Ｐｒｏｃ。 Ｎａｔ’１．Ａｎｄ、Ｓｃｉ、ｔｌＳＡ　８３：９６７９−９６８３．１９８６ ）において、ＩＬ−６配列からのアミノ酸残基の種々の欠失が試験された。表３ は、組換えシスティン含有Ｉ　Ｌ−６（ｍｇｅ　ｎ）の等量と比較した百分率活 動として表されたこれらの結果を示している。試験されたＩ　Ｌ−６配列は、全 てシスティン含有のものである。プラスミドｐ４７８は、ｐ４７８においては、 ＩＬ−６配列内のシスティンが置換されなかったということを途いて、プラスミ ドｐ３６７と同一のプラスミド構成である。Ｉ　Ｌ−６活性タンパク質７ラクシ 望ンは、コラゲナーゼを有する融合タンパク質から切り取られたＩＬ−６ペプチ ド（表２におけるｒｐ４７８Ｊ分断）である。従って、試験された各欠失突然変 異（ｍｕ　ｔ　ａ　ｔｉｏｎ）に対するこのペプチドフリクシコンは、ＩＬ−６ ペプチド配列のカルボキシ端子に加えられた分離アミノ酸を有するシスティン含 有Ｉ　Ｌ−６ペプチドの混合物である。さらに、試験されたタンパク質は、融合 タンパク質自体（’ｐ４７８未分断」）である。ｐ４７８によって生成された野 性型システィン含有天然Ｉ　Ｌ−６配列融合タンパク質は、コロニー（ｐ　ｆ　 ｃ）を形成している鷹接溶血ブラックが決定された。 ５、１１．３　生体外骨髄分析 ５．２〜５．８で述べられた方法に従って作られた合成システィン７リーＩ　Ｌ −６もまた、技術的に認められた生体外の試験において、治療に対して有用性を 持つことがわかった。骨髄細胞を取り扱ったフルオロウラシルに関するＩ　Ｌ− ６の効果に関するデルタ（Δ）分析では、合成システィンフリーＩ　Ｌ−６が、 始原細胞に関して良好な刺激活動を有することが認められた。これらの分析に対 するプロトコルは、第１ｍに見出せる。 合成システィンフリーＩ　Ｌ−６が、ＩＬ−１と結合されるとき、さらにまた、 これらの２つのシトカインがＭ−ＣＳＦ又はＩＬ−３のいずれか一方と結合され るときにも、特に効果的な刺激が観察された。Δ値を表に示したものが、表２で ある。時間−コロニー分析のグラフ表示が第１３図に示されている。 ５．１１．４　欠失突然変異の７７Ｄ１分析生物活動を定量化するためにＩ　Ｌ −６依存マウス雑種細胞株の増殖を用いている７ＴＤ１分析 ５．１１．２Ｂ細胞分化分析 マウスのＢ−細胞り０−７ＣＨ１２，ＬＸ　（Ｎ”、ｄ”ＬＹ−１０）が成育さ れ、５％の熱不活性の胎治性つシセウム、３０ＯＮｇ／ｍｌグルタミン、００４ ｍＭ　２−メルカプトエタノール及びひつじの赤血球のホス７アチジルコリン成 分（ＳＲＢＣ）に対して効果的な抗生物質ＣＨ１２，ＬＸ細胞ベアサーフイスＩ ｇＭを含有しているＲＰＭ１１６４０内に維持された。 分化分析は、Ｃｏ５ｔａｒ　２４−ウェルプレート内の２ｍ１Ｂ−細胞媒体中で 、５．２から５．８で述べた方法によって作られるように、種々の濃度の合成シ スティンフリーＩＬ−６の有無で２×ｌＯ″　Ｂ−細胞を培養することによって 実行された。５ＲＢＣＣＡＳＡ　生物生成物、Ｅｉｎｓｔｏｒ−５ａｌｅｍ、Ｎ Ｃは、使用前にＲＰＭ１１６４０で３回洗浄された。ｌＸｌ０’赤血球が、各試 験培養中に含まれた。５ＯＮｇ　／　ｍ　ｌのりポポリサッカリド（Ｄｉｒｃｏ ）を用いている分裂促進因子−刺激されたＢ−細胞から成る正の制御が、５％Ｃ Ｏ８の雰囲気中で３７℃でインキュベートされた。ＣＨｉ　２　。 ＬＸ培養内でそれから生成される正常されたシスティン含宵■Ｌ−６ペプチド（ ｒ４７８４７８分断比較して、ＩＬ−６（３％活動）の生物活動を保持する。そ の４７８分断エプチド［ｅｐｔｉｄｅ］は、それに対して９個の欠失突然変異が 試験され、それだけでも試験において１００％活性である。従って、表３では、 ４７８分断が、コラゲナーゼを有する融合タンパク質から開裂されたｒ　Ｌ−６ をもった野性型プラスミド発現システィン含有Ｉ　Ｌ−６融合タンパク質を参照 し、表３の４７８未分断は、未分断融合タンパク質を参照する。突然変異ＩＡＢ は、ｍｅｔが第８ｂ図にある類似Ｉ　Ｌ−６システインフリーペプチドに対する ペプチド配列のアミノ酸番号１であるシスティン含有ＩＬ−６ペプチド内で、ア ミノ酸４〜２３を欠失させることによって生成される欠失突然変異である。突然 変異２ＡＢ、３ＡＢ他全てのものは、欠失されたアミノ酸残基と名付けられた第 ２欄で表３に特定されているように、その配列内の適切な位置にある対応する２ ０個のアミノ酸欠失を参照する。 表２ 液体培養における　液体培養における相東作用コロニー刺激活動 媒　体　ＩＬ−Ｉ　ＩＬ−６１Ｌ−１＋ＬＩ−６読出し値　読出し値　読出し値 　読出し値Ｃ５Ａ　Ｃ５Ａ　Ｃ３Ａ　Ｃ５Ａ Ｇ　Ｉ　Ｇ　５Ｇ　７Ｇ　１４９ 媒体　Ｍ　ｓＭ７Ｍ２Ｍ２７ ＧＭ　Ｉ　ＧＭ　１５　ＣＭ　４　ＧＭ　３７ＩＬ−３１１Ｌ−３５ＩＬ−３１ １Ｌ−３１５ｃｓｃ１９Ｇ１７Ｇ３４４ Ｇ−Ｃ５ＦＭＩＭ７ＭＭ３Ｍ６５ （Ｇ）　ＧＭ　Ｉ　ＧＭ　２５　ＧＭ　７　ＧＭ　５８ＩＬ−３１１Ｌ−３１１ １Ｌ−３４１Ｌ−３２２ＧＩＣ１４０Ｇ３２Ｇ５１８ Ｃ５Ｆ−Ｉ　Ｍ　Ｉ　Ｍ　２９Ｍ　２Ｍ　９７ＧＭ）ＧＭＩＧＭ４３ＧＭ９ＧＭ ９９ ＩＬ−３１ＩＬ−３２８ＩＬ−３３１Ｌ−３３７Ｇ　Ｉ　Ｇ　１２２Ｇ　３６２ Ｇ　７０４ＧＭ−Ｃ３Ｆ　Ｍ　Ｉ　Ｍ　５５　Ｍ　１９　Ｍ　２３６（ＧＭ）　 ＧＭ　Ｉ　ＧＭ　５４　ＧＭ　５３　ＧＭ　１５７ＩＬ−３１１Ｌ−３３４１Ｌ −３３７１Ｌ−３８５Ｇ　１４　Ｇ　５０９　Ｇ　１８６　Ｇ　１７８１Ｇ−Ｃ ５Ｆ　Ｍ　１５Ｍ　２０８Ｍ　１３６Ｍ　６７５ＧＭ　１９　ｃＭ　１２９　Ｇ Ｍ　１３２　ＧＭ　４１５ＩＬ−３２４ＩＬ−３１０２ＩＬ−３６２ＩＬ−３１ ３１表３ 除去された　７ＴＤ１定量における 突然変異名　アミノ酸残基　活動 ＩＡＢ　４−２３　２８０％ ２ＡＢ　２４−４３　０．００１ ３ＡＢ　４４−６３　０．０００ ４ＡＢ　６４−８３　０．０００３ ５ＡＢ　８４−１０３　０．０００３ ６ＡＢ　ｌ　０４−１２３　０．００６７ＡＢ　１２４−１４３　（０，０００ ０）８ＡＢ　１４４−１６３　（０，００００）９ＡＢ　ｌ　６４−１８３　（ ０，００００）４７８　切断　１００％ ４７８　非切断　３％ ６、実施例：材料と方法 ６．１　抑制酵素消化の条件 酵素は、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓの市販品から入手し、製造元 により指定された方法で、消化処理をおこなう。 ６．２　バクテリアの遺伝的傾向およびプラスミドＥ、　ｃｏｌｉ　ＪＭＩＯＩ 　（Ｐ−Ｌ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ）は、論文（Ｈａｎｎａｎ　、　１９８３　、 　Ｊ。 ｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　Ｖｏｌ、　１６６ 、　Ｐ、５５７）に記載された方法で変換した。プラスミドｐＫＫ２３３−２は 、Ｐ−Ｌ　Ｐｈａｒｍａｃｉａから得られる。プラスミドｐＢＳｔは、ストラド ジーン（Ｓｔｒａｔｏｇｅｎｅ）から得られる。他のプラスミドの構成は、上記 の論文に記載された通りである。 ６．３　オリゴヌクレオチド集合 オリゴヌクレオチドは、ＣＨＤリン酸アミドとＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｂｉ。 ｎｅｔｉｃｓ社のテトラシルとから合成した。オリゴヌクレオチドは、製造元（ Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）により指定された方法で、Ｔ４ポリ ヌクレオチド移転酵素Ｉこより移転された。移転は、６５℃に加熱することによ り、止められた。オリゴヌクレオチドの混成物は、１５分間８５℃でアニーリン グ処理したのち、温度を室温にまで下げられた。アニーリング処理されたオリゴ ヌクレオチドは、＋０　Ｕ　Ｔ４リガーゼにより結合され、結合物は、６％のポ リアクリラミドゲル中で分離され、分離後は、電気溶離によって回復された。 ６．４ＤＮＡ配列 挿入されたフラグメントとオリゴヌクレオチドのＤＮＡ配列は、Ｓａｎｇｅｒ他 （１９７７、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｖｏｌ、７４　 ｐ、５４６３記載）によるチェインターミネーション法（Ｃｈａｉｎ　丁ｅｒｍ ｉｎａｔｉ。 ｎ　Ｍｅｔｈｏｄ）に、Ｂｉｇｇｅｎ他（１９８３，Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　 Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｖａｔ。 ８０、　Ｐ、３９６３記１１りとＨａｔｔｏｒｉ、　５ａｋａｋａｊ（１９８６ ，Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ。 Ｖｏｌ、］５２．　ｐ、２３２記載）およびＢａｎｋｅｒ他（１９８８年出版、 　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｌｏｇｙ）の方法を改良して取り込むことにより めた。 ６．５　タンパク質プロット分析 ５０．１７Ｌ（７）細胞培養に等価なサンプルを、Ｌａｅｍｌｌｉ（１９７０， Ｎａｔｕｒｅ　Ｖｏｌ、２２７．　ｐ、６８０記載）の方法による条件を緩和し たもののもとで、８％ＮａＤｏｄＳＯ４−ポリアクルラミドゲルに溶かしこんだ 。ゲルのプロットを複製するために、ゲルは、クーマシーブルー（Ｃｏｏｍａｓ ｉｅ　Ｂｌｕｅ）で着色、あるいは、ニトロセルロースの２つの層の上での電気 プロット法により処理された。あらかじめ１色された分子量マーカ（Ｂ　ＲＬ） を用いて、変換を観測した。ブロンドは、０．２５％のゼラチンで保護したのち 、市販のβ−ガラクトシダーゼに対するＰｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃｂ社製造 の抗体全製造て、インキュベート培養した。クロスリ　アクティングバンド（ｃ ｒｏｓｓ　ｒｅａｃｔｉｎｇ　ｂａｎｄ）は、ホスフェターゼを結合し、化学親 和力を増した、７．５００倍希釈のＰｒｏｍｅｇａ　ＢｉｏｔｅｃＭ社製造のひ つじ一抗マウスＩｇＧ抗血清により、可視化しＩ；。 ６．６　細胞の溶解と工性雑種アッセイ細胞の溶解は、Ｇｅｒｍｉｎｏ他（Ｐｒ ｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　１９８３゜Ｖｏｌ、８０．　ｐ− ６８４８記１り）方法ニ基づキ実行シタ。Ｅ、ｃｏｌｉは、遠心分離により抽出 し、セルベレットは、濃度０．０５ｍｏ１／Ｌ％ｐＨ８のトリ塩化水素と濃度０ ．０５ｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡと１ｍｇ／ｍ＋の比でリゾザイムを溶解した１５％ サッカロースとを合わせた溶液甲に、溶液の１１５容積を占めるように浸した。 室温で１５分間おいたのち、溶解物を一７０℃で凍結させ、急激に３７℃に温度 上昇させた後、超音波を加えてＤＮＡ連鎖を切断した。三性雑種融合タンパク質 をクロマトリックアッセイにより定量し、基盤に０−ニトロフェニール−β−Ｄ −ガラクトピラノサイドを用い、β−ガラクトシダーゼ活性をめた。 ６．７　融合タンパク質のコラゲナーゼ消化融合タンパク質の消化に先立ち、コ ラゲナーゼ調合試薬中のタンパク質加水分解活動を抑制するため、Ｌｅｃｒｏｉ ｓｅｙ他（１９７５゜ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、　Ｖｏｌ、５９．　ｐ、１６７記載 ）の方法に従い、β　−ヒドロキシ−マークリベンゾエイトを加えた。Ａｃｈｒ ｏｍｏｂａｃｔｅｒ　Ｉｏｐｈａｇｕｓ　（ＥＣ３，４−２４，８；　Ｂｏｅｈ ｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）のコラゲナーゼ一単位を、ｐＨ７，４、濃 度１００ｍＭのトリ塩化水素、濃度２５０ｍＭの塩化ナトリウム、濃度１ｍＭの 塩化カルシウムおよび濃度４０μｇ／ｍｌのβ　−ヒドロキシ−マークリベンゾ エイトに、緩衝剤ともに溶解した。溶解したコラゲナーゼは、容積１５ｍ１のシ リコン塗布したポリプロピレン製チューブに移し、室温で３０分間培養した。溶 解した細胞抽出液（４ｍｌ）に超音波を加え、一つ一つの細胞に分離し、溶解し たコラゲナーゼに加え、室温でさらに４５分間培養した。開裂したβ−ガラクト シダーゼの大部分は、飽和硫化アンモニウムを容積の５０％加え、氷温で３０分 間培養し、非溶解物質を凝集させることにより、途去された。開裂した組替え合 成システィン７リーｒ　Ｌ−６は、うわずみ液に飽和硫化アンモニウム溶液１３ ｍ１Ｓを加え、氷温で３０分間培養後、遠心分離により非溶解性のタンパク質を 液表面に薄膜として浮遊させた。チューブ内の液体は、吸引して衆去し、残され た薄膜を［Ｔｒｉｓ　ｂｕｆｆｅｒｅｄ］塩０゜５ｍｌに浸した。 ７、実施例：肝細胞の刺激 システィン７り一合成Ｉ　Ｌ−６は、パラグラフ５．２および５．８に記載され た方法に従って調合すれば、図１１に示すように、肝細胞を刺激する。肝細胞に 対する刺激力は、上述のパラグラフ５．９．２に記載された分析法に従って定量 した。システィンフリー合成ＩＬ−６のもつ、肝細胞に対する刺激力は、その濃 度が１０−８Ｍの時に起こり、その量は、１０４Ｕ／ｍｇである。この刺激量は 、Ｍａｙ他（１９８８，Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　Ｖｏｌ、２６３゜ｐ、７ ７６０記載）による測定結果の１００倍である。我々のＦＡＺＡ細胞で観測され た、フィブリノーゲン合成のレベルは、ＰＭＡ誘導の繊維芽細胞から得られた培 養を用いた実験結果と同様である。１．ｕＭ以下の濃度では、ペプチドは、肝細 胞数を減らす効果を与え、結果として、測定可能なフィブリノーゲンの量を減少 させる作用をおよぼす。 ８、実施例：Ｂ細胞分化 パラグラフ５．２および５．８に記載された方法に従って合成されたシスティン ７リーＩＬ−６タンパク質の機能性を評価するための最も感度の高い方法は、Ｂ −細胞分化分析法である。 溶血プラーク分析法は、合成Ｉ　Ｌ−６がＢ−細胞の甲でＩｇ分泌を誘発する力 を評価するものである。溶血プラーク分析法は、細胞レベルで分化、増殖を調べ る方法としては、優れたものである。（Ｇｒｏｎｏｗｉｃｚ他、　１９７６、　 ＥＵＲ，Ｊ、　Ｔｍｍｕｎｏｌ、　Ｖｏｌ、６．　ｐ、５８８記載）。我々のタ ンパク質（合成ＩＬ−６）は、濃度的０゜ｌｏｇ／ｍ＋で、最大の刺激能力をも つことが、図１２に示されるように、判明した。この値は、自然の！Ｌ−６を用 いた他の実験結果と同様な値である。他の実験結果は、以下文献に記載されてい る。（Ｖａｎ　５ｎｉｃｋ他、　１９８６．　Ｐｒｏｃ、　Ｍａｔｌ、　Ａｃａ ｄ、　Ｓｃｉ。 Ｖｏｌ、　８３．　ｐ、９６７９；　Ｂｒａｋｅｎｈｏｆｆ他＋　１９８７．　 Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｖｏｌ、　１３９、　ｐ、４１１６；　Ｐｏｕｐａｒ ｔ他、１９８７．　ＥＭＢＯＪ、　Ｖｏｌ、　６．　ｐ、１２１９；　Ｋｉｓｈ ｉｍｏｔｏ、　１９８５．Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｉｍ＋ｏｕｎｏ１．　Ｖｏｌ、 ３．　ｐ、１３３）　４３　ｐ　Ｍ以下の濃度では、合成されたシスティンフリ ーＩ　Ｌ−６は、分化するＢ−細胞の数を減少させる作用を及ぼす。 ９、実施例ニジスティンフリーＩ　Ｌ−６のもつ生物学的活性 自然のシスティン７リーＩ　Ｌ−６タンパク質の３種類の異なった活性力をもつ アッセイにより、システィン７リーＩ　Ｌ−６は生物学的活性力をもつことが判 明した。本発明によると、ペプチド連鎖を活性形態にするために必要なのは、ペ プチドの基本配列であることが示される。　ワクチンは、しばしば、各種のアジ ュバントの組合せの中で形成、増殖される。アジュバントは、免疫原を単独で用 いた場合に比べ、より少量の抗原を用いてより高く長期間に及ぶ免疫効果を与え ることを促す作用がある。アジュバントの作用機構は、複雑である。アジュバン トの作用機構には、シトカインＩ　Ｌ−６のような細胞シトカインや、７アゴシ トーシス（ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓ　ｉｓ）の生成を促進する機構、その他線網内 細胞の活動をはじめ、抗原の遅発や減成などが含まれる。アジュバントの例とし ては、Ｆｒｅｕｄアジュバント、Ａｄｊｕｖａｎｔ　６５　（ピーナツ油、マン ニードモノオリエート［ｍａｎｎｉｄｅ　ｍ。 ｎｏｏｌｅａｔｅ３とモノステアリン酸アルミを含む）や、リゾレシチン、プル ロニツクボリオルスｊｐｌｕｒｏｎｉｃ　ｐｏｌｙｏｌｓ］、ポリアニオン、ペ プチド、油エマルジ２ンおよび水酸化アルミやリン酸アルミなどの金属ゲル等の 表面活性物質がある。Ｆｒａｕｄアジュバントは、非代謝性鉱油を含み発癌性が あるため、入用のワクチン材料としては今は用いられていない。 本発明によるペプチドのような精製合成されたＩ　Ｌ−６は、免疫反応を変化さ せるため、すなわちアジュバントとして作用させるため、ワクチン原料に加える ことができる。この免疫装置に用いられる生体は、マウス、ギニアビッグ、ウサ ギ、鶏、ウマ、羊、山羊、ウシ、チンパンジーやその他の霊長類やひとなとであ る。Ｔ　Ｌ−６などのペプチンを用いたアジュバントとしてのワクチンの生体内 への注入は、経口、皮膚注射、筋肉注射、腹膜注射、静脈注射、皮下注射、鼻嗅 やその他の免疫経路を通じて行なわれる。精製されたＩ　Ｌ−６活性ペプチドは 、主免疫のための抗原として用いられ、ＩＬ−６単一クーロン性抗体を作る。こ のような抗体は、更に、Ｉ　Ｌ−６保有体として用いられ、免疫グロブリン生成 における機能障害が起こっているような場合の装置に有効である。この機能障害 には、多重性骨髄障害や自己免疫障害がある。−例として、上記の単一クーロン 性抗体を関節注射して、リューマチ性の関節炎の治療に使用することが可能であ る。 システィンフリーあるいは、システィン含有のペプチドのような精製された合成 Ｉ　Ｌ−６は、適当な濃度に調整し、ほかの適切はシトカインペプチドやワクチ ンを加えて、一体化した薬剤として用いることが可能である。Ｉ　Ｌ−６活性を もつペプチドは、また、ワクチン材料のアジュバントやそれ自体を薬剤として用 い、リポゾームの中に組み入れることも可能である。また、Ｉ　Ｌ−６活性をも つペプチドは、免疫治療に用いられる抗体に加えることも可能である。 更に、他の実施例として、Ｉ　Ｌ−６活性をもつペプチドは、免疫刺激薬剤とし ても用いることが可能である。−例として、Ｉ　Ｌ−６活性をもつペプチドは、 造血細胞の刺激や、特に、病気や薬あるいは放射線被爆による免疫不全の場合の 細胞の抗体生成機能の活性化に有効である。また、これらのペプチドは、免疫機 能不全状態にあるエイズ患者の治療にも有効である。また、肝機能の不全の場合 の、肝性タンパク質の生成を促す効果もある。また、これらのペプチドは、体外 で抗体を誘導するための試薬としても用いられたり、培養体の成長因子の特性を 調整するためにも用いることが可能である。更に、他の実施例としては、これら のペプチドは、他の抗ビールス剤と組み合わせることにより、ＨＩＶやＨＢＶな どのウィルス性疾患の予防や治療に役立てることができる。更に、他の実施例と して、ＩＬ−６活性をもつペプチドは、単独あるいはほかの精製されたシトカイ ンと組み合わせて、白血病などの病気でＢ−細胞の分化を中断させるのに有効で ある。また、システィンフリーあるいは、システィン含有のペプチドのような精 製された合成ＩＬ−６は、ペプチドの任意の部分に有効に作用する抗体を誘導す る際にも、用いることが可能である。 １０、実施例ニジスティンフリーＩ　Ｌ−６及び他の成長因子の生体内骨髄茎部 細胞の増殖と分化に与える効果（デルタ分析）デルタ分析は、種々の成長因子に より引き起こされる骨髄茎部細胞中の高増殖性固体群の発生の有無を確かめるた めに行なわれる。マウスには、増殖性ポテンシャルの低い細胞を消滅させるため に、５７フ化ウラシルを投与する。 高増殖性固体群の細胞は、成長因子のもとで、１２日間、第一の半固形アガロー ス培養体の中で培養される。成長因子は、インターロイキン−１（ｒＬ−１）、 インターロイキン−６（ＩＬ−６）及び、ＩＬ−１とｒ　Ｌ−６のｌ：１混合体 である。ＢＭ茎部細胞は、他の成長因子が存在しない状態で、これらの成長因子 のそれぞれのもとで成長し、さらに、白血球コロニー刺激因子（Ｇ−Ｃ５Ｆ）、 マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−Ｃ３Ｆ）　、出血Ｍマクロファージコロ ニー刺激因子（ＧＭ−Ｃ３Ｆ）８よびインターロイキン−３（ＩＬ−３）の成長 因子の存在のもとでも成長する。これらの成長因子により増殖するコロニーの数 は、二重層アガロースクローン定量分析法により定量測定され、第１６図では、 “初期コロニー分析”のデータで示されている。第１６図のグラフの縦軸は、マ ウスへの５７フ化ウラシル投与後２４時間後の、マウス骨髄細胞数２．３Ｘ１０ ５を１本位として、形成された全コ　ロニー数を示している。 最初の４本の棒グラフデータは、他の成長因子が存在しない状態での、システィ ンフリーのＩＬ−１、Ｉ　Ｌ−６およびＩＬ−１とＩ　Ｌ−６のｌ：ｌ混合体の 、コロニー増殖への効果を示している。次の、４本の棒グラフデータは、Ｇ−Ｃ ５Ｆ単独、Ｇ−Ｃ５ＦとシスティンフリーのＩＬ−１、Ｉ　Ｌ−６８よびＩＬ＝ １とＩ　Ｌ−６の１：１混合体との組合せの、４通りのコロニー増殖への効果を 示している。更に、次の、３組の４本の棒グラフデータは、Ｍ−Ｃ９Ｆ％ＧＭ− Ｃ５ＦおよびＩ　Ｌ−６単独、Ｍ−Ｃ５Ｆ、ＧＭ−Ｃ５ＦおよびＩ　Ｌ−６とシ スティンフリーのＩＬ−１、ＩＬ−６８よびＩＬ−１とＩＬ−６の１：１混合体 との組合せの、１２通りのコロニー増殖への効果を示している。分析の結果、シ スティンフリーのＩＬ−ｉ、ＩＬ−６８よびＩＬ−１とＩ　Ｌ−６の１＝１混合 体が、Ｍ−Ｃ３Ｆと組み合わされた時に、ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−Ｃ ３Ｆとの組合せ以上に、コロニー形成を促進することがわかる。 分離分析では、高増殖性固体群細胞は、上記と同様の成長因子のもとでさらに液 体培養体の中で、培養される。着性しなかった細胞の数を７日後に計数した結果 を、第１５図に示す。第１５図では、′７＝間液体培養後の非着性細胞数”のデ ータで示されている。第′ｉ６ｍのグラフの縦−は、培養液１ｍｌあｔ；りの、 全非着性細胞数を示している。最初の５組の４Ｘの棒グラフデータは、第１６図 に示した“コロニー分析”の対応する棒グラフデータと点種の傾向を示している 。全非着性細胞数の最大値は、ＩＬ−１とｒ　Ｌ−６の１：１混合体が、Ｉ　Ｌ −３、ＧＭ　−ＣＳ　Ｆ　８よびＭ−Ｃ５Ｆと組合せられた時に現われる。 液体培養甲の細胞は、取り出し、洗浄され、再び、各成長因子のもとでＷｌ形ア ガロース培養体の中で培養され、二重層アガロースクローン定量分析法により定 量測定される。この、第２回＝のアガロースクローン定量分析は、′読出分析“ と呼ばれる。デルタ値は、“読出分析”により計数された骨髄細胞コロニー数を 、“初期コロニー分析“により計数された骨髄細胞コロニー数で割った値である 。デルタ値の計算結果を、表２に示す。」　デルタ分析の結果は、“読出分析” に適用された各々の成長因子のうち、どの成長因子が液体培養の際に相乗効果を もたらすかを表している。液体培養を用いた場合には、コロニー形成を促進する ために加えられたシトカインの効果は、ＩＬ−１またはｒＬ−６を単独に与えた 場合よりも、ＩＬ、−１とＩ　Ｌ−６の１：１混合体を与えた場合に顕著に現わ れる。ＩＬ−１またはＩ　Ｌ−６を凰独に与えた場合よりも、ＩＬ−１とＩＬ− ６の１：１混合体を与えた場合に、シトカインの効果が顕著に現われることは、 さらに、液体培養にＧ−Ｃ５ＦＳＧＭ−Ｃ５Ｆ、Ｍ−Ｃ５Ｆ８よびＩＬ−３を加 えた場合に、相乗効果をもたらす。この相乗効果は、“読出分析”にＧ−Ｃ３Ｆ を用いた際に、最も顕著に現われる。また、ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−３を液体培養 口で、ＩＬ−１またはＩ　Ｌ−６と組み合わせて使用した場合には、Ｉ　Ｌ−６ の方が、Ｉｒ−−１ｉ＝ｈべてより高いデルタ値をもたらす。しかし、Ｃ３Ｆ− １を液体培養甲で、■ＬｌまたはＩ　Ｌ−６と組み合わせて使用した場合には、 ＩＬ−１の方が、Ｉ　Ｌ−６に比べてより高いデルタ値をもたらす。 これらの分析結果より、ＩＬ−１とＩ　Ｌ−６の混合体を分離分析で液体培養口 で、ＩＬ−３と組み合わせて使用し、読出分析では、Ｇ−Ｃ５Ｆを用いるのが最 も最良の分析方法であると思われる。　以上の分析結果は、システィンフリーの Ｉ　Ｌ−６を他の成長因子と組み合わせて使用することが、骨髄移植やガン治療 の際の、重要な手段となることを示している。高いデルタ値は、種々の成長因子 のある組合せが、茎部細胞の増殖と消滅に結びつく可能住を示唆している。この ような、成長因子の特徴は、生体口での骨髄の増殖と分化を制御するうえで必須 な要件である。 デルタ分析の手順 １）ＢＤＦＩマウスに、体重ｉＫｇあたり１５０　ｍ　ｇの５７フ化ウラシルを 投与する。 ２）５フツ化ウラシルを投与した２４時間後に、マウスを殺し、骨髄を取り出す 。 ３）骨髄細胞を、２０％胎子ウシ血清（Ｆ　Ｂ　Ｓ）と抗生物質（ｇｅｎｔａｎ ｉｃｉｎ）を含むＩＭＤＭ溶液で洗浄する。 ４）骨髄細胞を、二重層アガロースクローン法で培養する。２０％ＦＢＳを含む ＩＭＤＭ溶液の成長因子を、０．５％アガロース中の３５ｍｍ径のベトリ皿の上 に、付着させる。骨髄細胞は、−皿あたり、Ｏ−５ｍＩｃｐに２．５Ｘ１０４か ら２Ｘ１０５の細胞数になるよう、層を重ねる。この方法が、“初期クーロン分 析”である。細胞は、１２日間、約７％以下の酸素濃度中に、３７℃で保存する 。 ５）骨髄細胞を、２４個の穴の開いたプレート上で、１ｍｌの液体培養（２０％ 胎子ウシ血清（Ｆ　Ｂ　Ｓ’）と抗生物質（ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ）を含むＩＭ ＤＭ溶液）中で増殖する。細胞を、１ｍｌあたり細胞数２．５Ｘ１０５を初期値 として、７日間培養する。 ６）７日間培養後、非着性骨髄細胞のみを取り出す。細胞数を計数した後、：５ ｙｔｏｓｐｉｎ］　１ａｉｒ置を施し、冷やしたＦＢＳ溶液５１で、不要な細胞 を洗い流し、全ての成長因子を途去する。 ７）非着性骨髄細胞を希釈し、クローンアガロース培養に付着させる。培養体を 、約７％以下の酸素濃度の十分湿った雰囲気中に、７日から１２日間、３７℃で 保存する。この培養方法が、“読出分析”である。 ８）デルタ値を、“読出分析”により計数された骨髄細胞コロニー数を、“初期 コロニー分析”により計数された骨髄細胞コロニー数で割った値としてめる。 １１、例ニアｔｄ、１成育アッセイにおけるＩ　Ｌ−６の市販品との比較 ｐ３６７を含む細胞から誘導された融合体を精製して得られたシスティンフリー Ｉ　Ｌ−６ペプチドの生物学的挙動は、７ｔｄ、１分析法を用いた市販品（流通 試薬）のシスティン含有ＩＬ−６と比較されている。（Ｖａｎ　５ｔｉｃｋ他、 　１９８６．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’ｌ。 Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　Ｖｏｌ、８３．　ｐ、９６７９−９６８３）こ れらの市販品は、Ｅ。 ｃｏｌ誘導型Ｉ　Ｌ−６を生み出す、ボーリンゲル　マンハイム、非岨換え生成 物である工ンドーゲン及び、イースト誘導型Ｉ　Ｌ−６を生み出すゲンサイムで ある。細胞を含む誘導ｐ３６７から精製した、リンを緩衝剤として加えた塩中の システィンフリー合成ペプチドを、ボーリンゲル　マンハイムのＩＬ−６，！− 比峻すると、ボーリンゲル　マンハイムのＩＬ−６は、ＩＩＥｌ　７１３Ｈに示 すように、低濃度では、高い活性力を示し、一方、高濃度では、低い活性力を示 す。最も高い活性力は、システイン７リー合ＩＲｒ　Ｌ−６が示す。 システィン７り一合成Ｉ　Ｌ−６ペプチドとエンドーゲンのＩＬ−６とを比較す ると、第１６図に示すように、システィンフリー合成ｒＬ−６ペプチドのほうが 、分析されたＯ、ｌｎｇから５０ｎｇまでの全ての濃度にわたって、より高い活 性力をもつことがわかった。同様に、システィン７り一合成ＩＬ−６ペプチドと ゲンサイムのＩ　Ｌ−６とを比較すると、第１８図に示すように、システィンフ リー合成Ｉ　Ｌ−６ペプチドのほうが、分析された０、１ｎｇから５０ｎｇまで の全ての濃度にわたって、より高い活性力をもつことがわかった。 ７ｔｄ、ｌ成長分析法の説明 ３．５０分析法は、９６個の穴をもつ培養プレートで行なわれる。ｒ　Ｌ−６の 活性度をもつペプチドは、ＨＧＦ単位で計数される。１００ＧＦＨは、約Ｉ　Ｐ ＣＴ−ＧＦ単位に相尚する。 ７ｔｄ、１特性をもつ約２０００の細胞を、５％−酸化炭素の高湿度雰囲気中で 、Ｉ　Ｌ−６活注をもつペプチドの希釈液を含む培養液２００μｍの甲で培養す る。８４時間経過後、４時間にわたり、テトラゾリウム塩（ｔｅｔｒａｚｏｒｉ ｕｍ　５ａｌｔ）３−　（４。 ５　ジメ　チルチアシル（ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ）−２ｙ　）　２　 。 ５−ジメチル７オルマザン（ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｚａｎ）プロミド（ｂ ｒ。 ｍ１ｄｅ）　（Ｍ　Ｔ　Ｔ　）を注入し、５分間遠心分離後うわずみ液を取り出 す。７オルマザン結晶をＤＭＳＯＩＯｏ　１μに溶解し、培養プレートを波長５ ７０ｎｍの光に投影する。反射光の強さは、生きている細胞の数に比例する。Ｈ ＧＦ単位で測定されるＩＬ−６の量は、反射光の最大強度の５０％を与えるのに 必要な希釈液の量の逆数の関係にある。 ７ｔｄ、１成長分析法の試薬 希釈液は、１０％胎児性ウシセラムを含む、ＲＰＭＩ１６４０である。補助希釈 液は、１０％胎児性ウシセラムを含む、ＲＰＭ１１６４０．０．１ｍＭの２−メ ルカト　エタノールｊｍｅｒｃａｔｏｅｔｎａｎｏｉ］と抗生物質を含む溶液で ある。ラベル試薬は、ＰＢＳｌｍＬにＭＴＴ　５　ｍ　ｇを溶解したものである 。 ＦＩＧ、　２ 特徴： ｔ？Ｃプロモータ　１〜２７５ ミニシストロン　２７Ｇ〜：（０６ 組換えＩ＋、−Ｇ　：（ＯＧ〜１１６１コラーゲン　８Ｇ３〜１０４１ １ＩＱ：：：ではｐ３６７配列の一部のみが示されている。 ＦＩＧ、９ Ｍｌ　２３４５Ｍ ＦＩＧ、　１０ ゜工し−ら　櫃（力【　（ルＬン ＆ｃＦＬ４−ｃ／２．うＸ１０”　＋１ｔｊｉ、＝ｒｎｐ１．　＞＜ｌｅｔ／ｂ ’）ｆｔ夕Ｆ々ｘ　ｉｏ−／４入フロ〜ン　ン償 ＦＩＧ、　）５ ７　ｆｄ、　７　ｔ＝１．＋ｔａ　Ｂｈ　ｕ−ＩＦＩＧ、＋６ 国際調査報告 ｔｘｔ＋ｍ＋ｍ＋＋＋＋＋　ａｓｓ工１ｈ６１、にゴ用郭９１０ξ２１

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．合成三性雑種タンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する組換え遺伝 子であって、上記三性雑種タンパク質は、第１ペプチド部分、第２ペプチド部分 、及び第３タンパク質部分とを有し、上記第１ペプチド部分は、ＩＬ−６活性を 持ち、上記第２ペプチド部分は、第１ペプチド部分及び第３タンパク質部分間に 化学的又は酵素的に開裂可能なペプチドリンクを有し、さらに、上記第３タンパ ク質すなわちその部分は宿主細胞によって発現されることができることを特徴と する組換え遺伝子。 ２．請求項１記載の組換え遺伝子において、ＩＬ−６活性を持つ第１ペプチド部 分が、スルフヒドリル結合を形成できないものであることを特徴とする組換え遺 伝子。 ３．請求項１又は２に記載の組換え遺伝子において、第２ペプチド部分が、タン パク分解酵素に反応するペプチドリンクを有することを特徴とする組換え遺伝子 。 ４．請求項３に記載の組換え遺伝子において、第２ペプチド部分がコラーゲナー ゼ感応部位を有することを特徴とする組換え遺伝子。 ５．請求項３に記載の組換え遺伝子において、第２ペプチド部分がエンテロキナ ーゼ感応部位を有することを特徴とする組換え遺伝子。 ６．請求項３に記載の組換え遺伝子において、第２ペプチド部分が因子Ｘａ感応 部位を有することを特徴とする組換え遺伝子。 ７．請求項１又は２に記載の組換え遺伝子において、第３タンパク質部分が、β −ガラクトシダーゼ配列又はその一部を有することを特徴とする組換え遺伝子。 ８．請求項１又は２に記載の組換え遺伝子において、第３タンパク質部分が、Ｔ ｒｐＥ遺伝子生成物を有することを特徴とする組換え遺伝子。 ９．請求項１に記載の組換え遺伝子において、第１ペプチド部分はスルフヒドリ ル結合を形成できなく、第２ペプチド部分はコラーゲナーゼ感応部位を有するペ プチドを持ち、第３タンパク質部分は、β−ガラクトシダーゼ酵素活性を持つタ ンパク質を有することを特徴とする組換え遺伝子。 １０．請求項１に記載の組換え遺伝子において、第１ペプチド部分は、スルフヒ ドリル結合を形成でさなく、第２ペプチド部分はエンテロキナーゼ感応部位を有 するペプチドを有し、第３タンパク質部分は、ＴｒｐＥ遺伝子生成物またはその 一部分であるタンパク質を有することを特徴とする組換え遺伝子。 １１．請求項１に記載の組換え遺伝子において、第１ペプチド部分はスルフヒド リル結合を形成できなく、第２ペプチド部分は因子Ｘａ感応部位を有するペプチ ドを有し、第３タンパク質部分は、ＴｒｐＥ遺伝子生成物またはその一部分であ るタンパク質を有することを特徴とする組換え遺伝子、１２．請求項１に記載の 組換え遺伝子において、第１ペプチド部分はスルフヒドリル結合を形成できなく 、第２ペプチド部分はエンテロキナーゼ感応部位を有するペプチドから成り、第 ３タンパク質部分はβ−ガラクトシダーゼ配列またはその一部分を有することを 特徴とする組換え遺伝子。 １３．請求項１に記載の組換え遺伝子において、第１ペプチド部分はスルフヒド リル結合を形成できなく、第２ペプチド部分は因子Ｘａ感応部位を有するペプチ ドから成り、第３タンパク質部分はβ−ガラクトシダーゼ配列またはその一部分 から成ることを特徴とする組換え遺伝子。 １４．請求項９乃至１３のいずれか１項に記載の組換え遺伝子において、第１ペ プチド部分が、第２ペプチド部分からの開裂後に、その第２ペプチド部分からの 残基アミノ酸を保持しないことを特徴とする組換え遺伝子。 １５．第５図に示すＩＬ−６アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する請求 項２の組換え遺伝子。 １６．第５図に示すＩＬ−６アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する請求 項３の組換え遺伝子。 １７．第５図に示すＩＬ−６アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する請求 項４の組換え遺伝子。 １８．第５図に示すＩＬ−６アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する請求 項５の組換え遺伝子。 １９．請求項１の遺伝子を有する組換えベクター。 ２０．請求項２の遺伝子を有する組換えベクター。 ２１．請求項３の遺伝子を有する組換えベクター。 ２２．請求項４の遺伝子を有する組換えベクター。 ２３．請求項５の遺伝子を有する組換えベクター。 ２４．請求項６の遺伝子を有する組換えベクター。 ２５．請求項７の遺伝子を有する組換えベクター。 ２６．請求項８の遺伝子を有する組換えベクター。 ２７．請求項９の遺伝子を有する組換えベクター。 ２８．請求項１０の遺伝子を有する組換えベクター。 ２９．請求項１１の遺伝子を有する組換えベクター。 ３０．請求項１２の遺伝子を有する組換えベクター。 ３１．請求項１３の遺伝子を有する組換えベクター。 ３２．請求項１４の遺伝子を有する組換えベクター。 ３３．請求項１９から請求項３２の組換えベクターのいずれか１つがプラスミド であることを特徴とするもの。 ３４．ｐＴｒｐＥ／ＥＫ／ｃｆＩＬ−６；ｐβＧａｌ／ＥＫ／ｃｆＩＬ−６；ｐ ＴｒｐＥ／Ｘａ／ｃｆＩＬ−６；またはｐβＧａ１／Ｘａ／ｃｆＩＬ−６から成 る群から形成されるプラスミド。 ３５．請求項１９のベクターを有する単細胞宿主。 ３６．請求項２０のベクターを有する単細胞宿主。 ３７．請求項２１のベクターを有する単細胞宿主。 ３８．請求項２２のベクターを有する単細胞宿主。 ３９．請求項２３のベクターを有する単細胞宿主。 ４０．請求項２４のベクターを有する単細胞宿主。 ４１．請求項２５のベクターを有する単細胞宿主。 ４２．請求項２６のベクターを有する単細胞宿主。 ４３．請求項２７のベクターを有する単細胞宿主。 ４４．請求項２８のベクターを有する単細胞宿主。 ４５．請求項２９のベクターを有する単細胞宿主。 ４６．請求項３０のベクターを有する単細胞宿主。 ４７．請求項３１のベクターを有する単細胞宿主。 ４８．請求項３２のベクターを有する単細胞宿主。 ４９．請求項３３のベクターを有する単細胞宿主。 ５０．原核生物たる請求項３５〜４９のいずれか１つを有する単細胞宿主。 ５１．細菌たる請求項５０の単細胞宿主。 ５２．（ａ）ＩＬ−６活性を有する第１ペプチド部分と、第１ペプチド部分と増 細胞宿主によって発現され得る第３タンパク質部分との間の化学的に開裂可能な ペプチドリンクを有する第２ペプチド部分と、を有する合成三性雑種タンパク質 をコードするヌクレオチド配列を有する組換え遺伝子であって、宿主内で複製、 転写、および翻訳をされることができるものを含有している単細胞宿主微生物を 培養し、（ｂ）上記宿主によって生成された三つに分かれたタンパク質を特定し 、 （ｃ）第２ペプチド部分を化学的に又は酵素的に開裂させ、そして （ｄ）ＩＬ−６活性を有する第１ペプチド部分を取り出す、という工程を特徴と するＩＬ−６活性を持つペプチドを生成する方法。 ５３．第２ペプチド部分が、タンパク分解酵素に反応するペプチドリンクを有す る請求項５２に記載の方法。 ５４．第２ペプチド部分がコラーゲナーゼ感応部位を有する請求項５３に記載の 方法。 ５５．第２ペプチド部分がエンテロキナーゼ感応部位を有する請求項５３に記載 の方法。 ５６．第２ペプチド部分が因子Ｘａ感応部位を有する請求項５３に記載の方法。 ５７．第３タンパク質部分が、β−ガラクトシダーゼ配列又はその部分を有する 請求項５３に記載の方法。 ５８．第３タンパク質部分が、ＴｒｐＥ遺伝子生成物を有する請求項５３に記載 の方法。 ５９．第１ペプチド部分は、スルフヒドリル結合を形成できなく、第２ペプチド 部分はコラーゲナーゼ感応部位を有するペプチドから成り、第３タンパク質部分 は、β−ガラクトシダーゼ酵素活性を持つタンパク質から成ることを特徴とする 請求項５３に記載の方法。 ６０．第１ペプチド部分は、スルフヒドリル結合を形成でさなく、第２ペプチド 部分はエンテロキナーゼ感応部位を有するペプチドを有し、第３タンパク質部分 はＴｒｐＥ遺伝子生成物またはその部分であるタンパク質を有する請求項５９に 記載の方法。 ６１．第１ペプチド部分は、スルフヒドリル結合を形成できなく、第２ペプチド 部分は因子Ｘａ感応部位を有するペプチドを有し、第３タンパク質部分はＴｒｐ Ｅ遺伝子生成物またはその部分であるタンパク質を有する請求項５９に記載の方 法。 ６２．第１ペプチド部分はスルフヒドリル結合を形成できなく、第２ペプチド部 分はエンテロキナーゼ感応部位を有するペプチドを有し、第３タンパク質部分は β−ガラクトシダーゼ配列またはその部分を持つ請求項５９に記載の方法。 ６３．第１ペプチド部分はスルフヒドリル結合を形成できなく、第２ペプチド部 分は因子Ｘａ感応部位を有するペプチドを有し、第３タンパク質部分は、β−ガ ラクトシダーゼ配列またはその部分を有する請求項５９に記載の方法。 ６４．第１ペプチド部分が第２ペプチド部分からの開裂後に、その第２ペプチド 部分からの残基アミノ酸を保持しないものである請求項５９に記載の方法。 ６５．上記三性雑種タンパク質が上記宿主生物によって生成された全タンパク質 の少なくとも約２０％を有するものである請求項５２〜６４のいずれか１つに記 載の方法。 ６６．上記宿主生物が原核生物である請求項５２〜６４のいずれか１つに記載の 方法。 ６７．上記宿主生物が細菌である請求項６６に記載の方法。 ６８．上記宿主が細菌である請求項６５に記載の方法。 ６９．上記第１ペプチド部分がスルフヒドリル結合を持たないものである請求項 ５２〜６４のいずれか１つに記載の方法。 ７０．上記第１ペプチド部分が、第５図に示されたＩＬ−６アミノ酸配列を有す る請求項５２〜６４のいずれか１つに記載の方法。 ７１．上記三性雑種タンパク質が、上記宿主生物によって生成された全タンパク 質の少なくとも約２０％を有する請求項７０に記載の方法。 ７２．アクセッションナンバーＡＴＣＣ４０５１６（ｐ３４０）を有する組換え プラスミド。 ７３．アクセッションナンバーＡＴＣＣ４０５１７（ｐ３６７）を有する組換え プラスミド。 ７４．ＩＬ−６活性を有する第１ペプチド部分と、開裂可能なペプチドを有する 第２ペプチド部分と、及び選ばれた宿主生物によって発現され得る第３タンパク 質部分と、を有する実質的に純粋な組換えタンパク質。 ７５．請求項１の遺伝子によってコードされた組換えタンパク質。 ７６．請求項２の遺伝子によってコードされた組換えタンパク質。 ７７．請求項３の遺伝子によってコードされた組換えタンパク質。 ７８．請求項４の遺伝子によってコードされた組換えタンパク質。 ７９．請求項５の遺伝子によってコードされた組換えタンパク質。 ８０．請求項６の遺伝子によってコードされた組換えタンパク質。 ８１．請求項７の遺伝子によってコードされた組換えタンパク質。 ８２．請求項８の遺伝子によってコードされた組換えタンパク質。 ８３．請求項９の遺伝子によってコードされた組換えタンパク質。 ８４．請求項１０の遺伝子によってコードされた組換えタンパク質。 ８５．請求項１１の遺伝子によってコードされた組換えタンパク質。 ８６．請求項１２の遺伝子によってコードされた組換えタンパク質。 ８７．請求項１３の遺伝子によってコードされた組換えタンパク質。 ８８．請求項１４の遺伝子によってコードされた組換えタンパク質。 ８９．第８ｂ図に示すＩＬ−６およびコラーゲンアミノ酸配列を有する組換えタ ンパク質。 ９０．請求項７５〜８８のいずれか１つのタンパク質の化学的または酵素的な開 裂生成物である所のＩＬ−６活性を有する組換えタンパク質。 ９１．システインを含有せず、請求項７５〜７８のいずれか１つに記載のタンパ ク質の化学的又は酵素的な開裂の生成物であって、開裂後に第２ペプチド部分か ら導出される残基アミノ酸を保有しないことを特徴とするＩＬ−６活性を有する 組換えタンパク質。 ９２．ＩＬ−６活性を有し、かつ実質的に水溶性である合成ペプチド。 ９３．スルフヒドリル結合を形成し得ない請求項５９項に記載のペプチド。 ９４．第５図のＩＬ−６アミノ酸配列を有し、該配列はシステイン、あるいはそ の同族体、類似体、又はそれらの活性部分を含有していないものである合成ペプ チド。 ９５．配列がシステインを含有していない第５図のＩＬ−６アミノ酸配列を有す る合成ペプチドであって、コラーゲンリンカーのアミノ酸が、部分的に又は全体 的に削除されていることを特徴とする合成ペプチド。 ９６．配列がシステインを含有していない第５図のＩＬ−６アミノ酸配列を有す る合成ペプチドであって、コラーゲンリンカーのアミノ酸とそのコラーゲンをＩ Ｌ−６タンパク質にブリツジするセリン残基の全部が削除されている合成ペプチ ド。 ９７．請求項９４乃至９６のいずれか１つに記載の合成ペプチドであって、Ｎ− 末端配列の第２アミノ酸としてグリシンの代わりにプロリンを有している合成ペ プチド。 ９８．請求項９４乃至９７のいずれか１つに記載の合成ペプチドであって、Ｎ− 末端配列に最初のメチオニンを欠いている合成ペプチド。 ９９．アミノ酸の削除、置換、挿入、逆位、付加又は交換により請求項９４乃至 ９８のいずれか１つに記載のペプチドの誘導体である合成ペプチド。 １００．アミノ酸２９からアミノ酸２１２までの天然ＩＬ−６のアミノ酸配列の 部分から成る合成ペプチドであって、上記配列はシステインを含むが、上記アミ ノ酸２９はプロリンの代わりにグリシンであることを特徴とする合成ペプチド。 １０１．最初のメチオニン残基を有する請求項１００に記載の合成ペプチド。 １０２．請求項９２乃至１０１の合成ペプチドをコードするヌクレオチド配列を 有する組換え遺伝子。 １０３．請求項１０２の組換え遺伝子を有するベクター。 １０４．請求項１０２の組換え遺伝子を有する単細胞宿主。 １０５．請求項１０３のベクターを有する単細胞宿主。 １０６．宿主中に抗体生成を刺激する方法であって、該宿主に請求項９０〜１０ １のいずれか１つのペプチドの有効量を、有効な抗原と共に投与する方法。 １０７．請求項９０〜１０１のいずれか１つに記載のペプチドの有効量を、宿主 に投与することを含む、宿主におけるウィルス感染を予防または処置する方法。 １０８．請求項９０〜１０１のいずれか１つに記載のペプチドの有効量を、宿主 に投与することを含む、宿主における肝性タンパク質の生成を刺激する方法。 １０９．請求項９０〜１０１のいずれか１つに記載のペプチドの有効量を、宿主 に投与することを含む、宿主における末端Ｂ細胞の分化を刺激する方法。 １１０．請求項９０〜１０１のいずれか１つに記載のペプチドの有効量を、宿主 に投与することを含む、宿主における造血幹細胞を刺激する方法。 １１１．請求項９０〜１０１のいずれか１つに記載のペプチドの有効量を、宿主 に投与することを含む、免疫抑制宿主を処置する方法。 １１２．請求項９０〜１０１のいずれか１つに記載のペプチドと反応する単一ク ローン性抗体の有効量を、宿主に投与することを含む免疫グロブリン生成におけ る機能障害を含む病気状態を処置する方法。 １１３．薬学的に受容可能な担体と組合せた請求項９０〜１０１のいずれか１つ に記載のペプチドの有効量を含有する薬学的製剤。 １１４．請求項１１３に記載の製剤において、上記ペプチドが、少なくとも１つ の他のシトカイン［ｃｙｔｏｋｉｎｅ］又は造血成長因子と緒合されていること を特徴とする製剤。 １１５．請求項１１４に記載の製剤において、上記シトカイン又は造血成長因子 が、エリスロポエチン、インターロイキン及びコロニー刺激因子から選はれてい る製剤。 １１６．請求項１１４に記載の製剤において、上記インターロイキンが、ＩＬ− １，ＩＬ−２又はＩＬ−３であって、上記コロニー刺激因子が、Ｇ−ＣＳＦ，Ｇ Ｍ−ＣＳＦ，又はＭ−ＣＳＦであることを特徴とする製剤。 １１７．請求項１１４〜１１６に記載のシトカイン又は造血成長因子と同時的又 は連続的に共同投与して治療に使用する請求項９０〜１０１１項のいずれか１つ に記載の合成ペプチド。 １１８．請求項１１３に記載の製剤において、上記ペプチドが感染防御抗原の有 効量と組合わされて、アジュバントとして存在していることを特徴とする製剤。 １１９．誘導可能なプロモータである第１部分と、ミニシストロン配列である第 ２部分と、停止コドンを欠くタンパク質を有するＤＮＡフラグメントを挿入する ためのクローニング部位である第３部分と、開裂可能なペプチドのヌクレオチド 配列である第４部分と、該第４部分の開裂可能なペプチドに関してフレーム内に あるβ−ガラクトシダーゼのヌクレオチド配列である第５部分と、をコードして いる核酸配列を有する組換え核酸ベクターであって、上記核酸配列の第３部分ク ローニング部位が、β−ガラクトシダーゼの第５部分に翻訳読取り相外にあるこ とを特徴とする組換え核酸ベクター。 １２０．第８ｂ図に示されたＤＮＡ配列を有する請求項１１９に記載のベクター 。 １２１．請求項９２〜１０１のいずれか１つに記載のペプチドをコードしている ＤＮＡ配列を有する請求項１〜１４のいずれか１つに記載の組換え遺伝子。 １２２．請求項１２１に記載の遺伝子を有する組換えベクター。 １２３．請求項１２２に記載のベクターを含んでいる単細胞宿主。 １２４．ｐ３４０プラスミドを有する組換えベクター。 １２５．突然変異体１ＡＢＤＮＡ配列を有する組換えベクター。 １２６．請求項１２５のベクターによって生成されたペプチド。 １２７．ＩＬ−６活性を有するペプチドをコードしているＤＮＡ配列であって、 上記ペプチドは突然変異体１ＡＢによって形成された配列を有することを特徴と するＤＮＡ配列。 １２８．請求項１２７のＤＮＡ配列によってコードされたペプチド。 １２９．ＩＬ−６活性を有するペプチドであって、上記ペプチドは含有アミノ酸 残基４−２３が除去された天然ＩＬ−６配列を有することを特徴とするペプチド 。 １３０．請求項１２９のペプチドをコードするＤＮＡ配列。