JPH04503458A - 核酸の増殖方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 核酸の増殖方法 本発明の課題は、核酸の製造方法、核酸の検出方法におけるそれらの利用および この方法の利用のために適している試薬である。

最近、試料中の核酸の検出は、分子生物学および遺伝学的基礎研究、ならびに臨 床診断学および生物工学における使用の増大が見られる。この検出の目的は、例 えば、生物学的試料中での病原の発見またはゲノム中の特異的ヌクレオチド配列 の発見である。特に、それについて非常に低濃度を検出することができる場合で ある。このような利用について、前工程において検出されるべき核酸を増殖し、 次いで、慣用の方法に従って検出することだけが必要であるのが判明した。

このような方法は、欧州特許出願公開ＥＰ−Ａ−０２０１１８４号公報に示唆さ れている。増殖させるべき核酸を、それぞれが増殖させるべき核酸の異なる鎖と 相補的である２つの一本鎖オリゴヌクレオチドブライマーと混合する。該プライ マーを、各々、核酸の相補鎖に伸長させる。これによって形成された二本鎖の各 々は、個々の鎖に分離した後だけであるが、再度、増殖されるべき核酸として使 用され得る。２つの相補的な核酸の個々の鎖の各々は、以下のサイクルで新しい オリゴヌクレオチドブライマーと反応し、同様に増殖され得る。この方法は、多 量のオリゴヌクレオチドプライマーを使用しなければならないという欠点を有す る。さらにまた、形成された核酸二本鎖は、実際の増殖工程間の付加的反応工程 において、毎回、互いに物理学的に分離されなければならない。この目的のため 、昇温または試薬の添加が必要である。共に、該反応の実施の簡素化と矛盾する 。しかし、国際公開ＷＯ３８／１０３１５号公報には、記載された問題、特に、 得られる核酸の量と比べて、等モル量以上のプロモーターオリゴヌクレオチドが 必要であるということも解決していないこのような方法が開示されている。さら にまた、従来の方法は、互いに後に続く多数の反応工程によって比較的ゆっくり と作用するという欠点を有する。

したがって、いくつかの同一反応サイクル、特に温度サイクルを連続させずにほ んのわずかな反応工程において、できる限り簡単な試薬を用いて迅速に成し遂げ る核酸の増殖方法が必要とされた。

このような方法を利用可能にすることは本発明によって解決される。

本発明の課題は、核酸への少なくとも一部分と実質的に相補的であり、かつ複製 システムに対して特異的なヌクレオチド配列を有する少なくとも１つのアダプタ ーを含有する核酸が形成される条件下で、核酸Ａを、該核酸Ａの鎖の一部分とハ イブリダイズすることができ、かつその少なくとも１つが複製システムに対して 特異的なヌクレオチド配列を含有する少なくとも２つのアダプターと反応させ、 次いで、複製反応に適した条件下で、核酸Ａおよび前工程で形成された核酸の複 合体を、複製システムに対して特異的なヌクレオチド配列および核酸Ａのヌクレ オチド配列の少なくとも一部分と実質的に相同または実質的に相補的なヌクレオ チド配列を含有するアダプターの少なくともヌクレオチド配列を含有する核酸配 列の形成を単独でまたは一緒に触媒する複製システムの１つまたはそれ以上の蛋 白と反応させることを特徴とする核酸Ａの使用による核酸の製造方法である。さ らなる課題は、この方法を行うための試薬である。

以下、１個またはそれ以上のヌクレオチドにおける塩基対がワトソン（Ｗａｔｓ ｏｎ）およびクリック（Ｃｒｉｃｋ）による規則と一致しなくても（ミス対合） ヌクレオチド配列が他のヌクレオチド配列とハイブリダイズすることができる核 酸を、他の核酸と実質的に相補的な核酸と称する。

ヌクレオチド配列が１個またはそれ以上のヌクレオチドにおいて他の核酸のヌク レオチド配列とは異なるが、それにもかかわらず他の核酸と相補的なヌクレオチ ド配列とハイブリダイズすることができる核酸を、他の核酸と実質的に相同の核 酸と称する。

本発明の方法において、核酸Ａとして全ての種類の核酸を使用することができる 。ＲＮＡだけではなくＤＮＡも、共に天然および合成起源の一本鎖または二本鎖 の形態でこれらに属する。核酸が二本鎖形態で存在する場合、それらを−末鎖に 転換しなければならない。

これは、慣用の方法、例えば加熱によって、またはヘリカーゼのような二本鎖巻 戻し酵素が属する適切な試薬の助けで生起し得る。酵素的鎖分離は、ＡＴＰまた は類似の酵素の存在下、ｒｅｃＡのような酵素によって誘発され得る。鎖分離は Ｔ４遺伝子３２蛋白またはイー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）Ｓ　Ｓ　Ｂのような一本 鎖結合酵素によって増大され得る。核酸Ａは例えば制限酵素のような鎖短縮酵素 で前処理もされ得る。

核酸の起源は重要なことではない。好ましくは、核酸は、固相に固定されている が溶液、懸濁液中で、細胞含有培地、細胞スミア、固定細胞もしくは組織片中で 、または単離染色体上で増殖され得る。

溶解した核酸の増殖が特に好ましい。例えば、ウィロイド核酸、ウィルス核酸、 細菌核酸または細胞核酸が挙げられる。以下、−末鎖核酸が存在する培地を試料 培地と称する。この培地は、核酸Ａ以外に、他の成分、特に増殖されるべきでは ない核酸も含有し得る。

核酸の製造のために、試料培地を少なくとも２つのアダプターと混合する。核酸 鎖Ａにつき２つのアダプターの添加が好ましい。両アダプターは本質的にまたは 末端配列上で核酸Ａの鎖とハイブリダイズ可能でなければならない。これは、各 アダプターが核酸への１つの鎖のヌクレオチド配列と実質的に相補的であるヌク レオチド配列を含有する場合に満たされる。これらの領域は核酸Ａ上のどこにあ ってもよい。その領域の少なくとも１つが核酸の１つの末端にあるのが好ましい 。両領域が核酸Ａの両端にあるのが特に好ましい。

アダプターもしくは複数のアダプターの一本鎖と相補的であるヌクレオチドを核 酸の１つの末端または両端が有し、かつこれらとハイブリダイズされ得る場合が 好都合であることが判明した。該アダプターはりボヌクレオチドだけではなくデ オキシリボヌクレオチドも含有し得る。それらはデオキシリボヌクレオチドを含 有するのが好ましい。該アダプターの少なくとも２つは、互いに離れている領域 において、増殖されるべき核酸の同一の鎖とハイブリダイズする。

これらのハイブリダイゼーシシン領域は、互いに、好ましくは１〜約２０．００ ０．特に好ましくは１００〜８０００ヌクレオチド離れており、したがって互い に重複していない。アダプターが核酸とハイブリダイズすべきである領域中に一 本鎖で存在する場合が好都合であることが判明した。

アダプターの一本鎖ハイブリダイジング領域のヌクレオチド配列は、核酸とこれ らの一本鎖領域とのハイブリダイゼーションの後、これらの−末鎖領域の遊離末 端が互いに指向するように選択される。

したがって、−末鎖５′−末端を有する少なくとも１つのアダプターおよび一本 鎖３′−末端を有する１つのアダプターが関係する。

好ましくは、他のアダプターと対向している１つのアダプターの３′−末端がヒ ドロキシル末端であり、第１アダプターと対向している第２アダプターの５“− 末端がリン酸基（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｇｒｏｕｐ）を有する。他のアダプター の５°−末端はリン酸基を担持し得る。「ギャップ充填Ｊ　（ｇａｐ−ｆｉｌｌ ｉｎｇ）反応で関係しない他のアダプターの３°−末端は修飾され得、例えば３ ′−末端に２“、３°−ジブオキ／ヌクレオチドまたは他の化学的修飾を担持し 得る。核酸Ａとハイブリダイズするアダプターの一本鎖領域は、各々の場合、好 ましくは１５〜６０、特に好ましくは２０〜４０ヌクレオチド長さである。

さらにまた、該アダプターの少なくとも１つ、好ましくは２つは、増殖されるべ き核酸と実質的にハイブリダイズすることができない領域を有する。この領域は 好ましくは二本鎖である。この領域において、このアダプターまたはこれら２つ のアダプターは、複製システムに対して特異的なヌクレオチド配列を含有する。

二本鎖領域の場合、該領域は、例えば、二本鎖配列自体またはその二次構造によ って形成され得る。複製７ステムは核酸の複製のために必要な試料と解されるべ きである。特に複製酵素、好ましくはＤＮＡポリメラーゼがこれに属する。この ような複製システムは、例えば、ファージＰＲＤ　ｌ、０１５、Ｍ２９、Ｎｆ、 ＧＡ−１、Ｃｐｌおよびφ２９ならびにアゾ／ウィルスのような真核生物から知 られている。ファージφ２９の複製システムが好ましい。複製システムに対して 特異的であるヌクレオチド配列は、「複製起源Ｊ（ｏｒｉ）配列であるのが好ま しい［ビー・レヴイン（Ｂ、Ｌｅｖｉｎ）、遺伝子Ｉ［［（Ｇｅｎｅｓ　Ｉ［［ ）、ジョン・ウィリイ（Ｊ　ｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ）発行、１９８７］、φ２９フ ァージの場合、これらは、１２〜５９ヌクレオチド（ｎｔ）長さであるのが好ま しい。φ２９−ｏｒｉ−領域の各々は、６ヌクレオチド長さの二本鎖領域を含有 するのが好ましい。

好ましくは、アダプターの少なくとも１つは、好ましくは核酸とのハイブリダイ ゼーションのために準備された一本鎖領域ではない領域において１つまたは両方 のヌクレオチド鎖に結合した残基を有する。この残基は、蛋白または細胞抽出物 からの成分であるのが好ましい。該蛋白は多くの機能を有する。複製開始機能が 特に好都合であることが判明した。φ２９の複製システムの利用の場合、φ２９ ファージの蛋白ｐ３が特に好都合であることが判明した。該残基のアダプターへ の結合は共有結合であるのが好ましい。蛋白ｐ３の場合、φ２９蛋白ｐ２および ｄＡＴＰとの反応による結合が好適であるのが判明した。ｐ３の場合、アダプタ ーが、アダプターおよび核酸のハイブリダイゼーション反応の開始時に既にｐ３ と共有結合されているのが絶対に必要というわけではないが好ましい。該結合は 、ハイブリダイゼーション後に初めて生起することもできる。

ｏｒｉ特異的領域の５°−末端でその各々が蛋白ｐ３を結合した２つのアダプタ ーを使用する場合が特に好ましい。この場合、本発明の方法は特に有効である。

しかし、例えば、二本鎖特異的領域を有するアダプターおよび一本鎖領域を有す るアダプターを使用することも可能である。該アダプターは、特にハイブリダイ ジング領域および複製酵素特異的領域の間にさらなる配列を有することができる 。

核酸Ａを、アダプターが核酸Ａの鎖の対応する領域とノ〜イブリダイズする条件 下でアダプターと反応させる。本発明の方法は、少なくとも一部分が核酸Ａと実 質的に相補的であり、かつ複製システムに対して特異的な配列を含有する少なく とも１つのアダプターを含む核酸Ｂを形成させる。核酸Ｂの長さは、アダプター の長さおよびハイブリダイズしたアダプターの一本鎖末端間にある増殖されるべ き核酸Ａのヌクレオチド配列の長さによって決定される。核酸Ｂの形成は、いわ ゆる「ギャップ充填」反応において生起するのが好ましい。これに関する条件は 、例えばマニアテイス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら［モレキュラー・クローニング（ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）、１９８２、コールド・スプリング・ハ ーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌ　ａｂｏｒａ ｔｏｒｙ）発行］またはディビス（Ｄａｖｉｓ）らＳベース・メンラス゛・イン ・モレキュラー・バイオロジー（Ｂａｓｅ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＭｏｌｅｃｕ ｌａｒ　Ｂ　ｉｏｌｏｇｙ）、１９８６、エルスバイヤー（Ｅ　１ｓｅｖｉｅｒ ）発行］によって公知である。「ギヤツブ充填」反応において使用する酵素は、 二本鎖領域の３°−および５°−末端間の相補鎖を合成することができるポリメ ラーゼである。核酸Ａの性質に依存して、例えば逆トランスクリプターゼのよう なウィルス−暗号解読酵素（ｖｉｒｕｓ−ｃｏｄｅｄ　ｅｎｚｙｍｅｓ）の如き ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、例えばＴ７、Ｔ３もしくはＴ４　ＤＮＡポリ メラーゼ、フレノウ（Ｋ　１　ｅｎｏｗ）酵素またはＴａｑ−ＤＮＡポリメラー ゼのようなりＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの問題である。特に好ましくは、Ｔ ４　ＤＮＡポリメラーゼまたはフレノウポリメラーゼのような鎖分離化活性を有 しないＤＮＡポリメラーゼである。さらにまた、ＤＮＡリガーゼ、例えばイー・ フリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）またはＴ４　ＤＮＡリガーゼを使用するのが好ましい。該 反応が高温で行われるべきである場合、欧州特許出願公開ＥＰ−Ａ−０３７３９ ６２号公報によって公知であるような熱安定性Ｄ　Ｎ　Ａ　’）ガーゼを使用す るのが好ましい。

「ギヤ、プ充填Ｊ反応の結果、アダプター間にある核酸への領域と実質的に相補 的であり、かつ複製システムに対して特異的なヌクレオチド配列を含有する少な （とも１つのアダプターの一本鎖末端に共有結合する核酸鎖が形成される。この 新しく形成された核酸を、以下、核酸Ｂと称する。

２つのアダプターのヌクレオチド配列が新しく形成された核酸Ｂに取込まれる場 合が好ましい。これは、例えばＤＮＡリガーゼのさらなる使用によって達成され 得る。

本発明方法の重要な工程は、核酸Ａおよび核酸Ｂから形成された複合体と複製シ ステムの１つまたはそれ以上の蛋白との反応であり、これは、適切な条件下、酵 素的鎖分離からなるｉｎ　ｖｉｔｒｏ複製反応を介して、適切なコファクターお よび／または細胞抽出物の使用によって核酸Ｂと相補的な核酸ＣもしくはＤまた はそれと少な（とも一部分が相補的な核酸を形成し得る。好ましい蛋白は、ＤＮ Ａポリメラーゼ活性を有するものである。特に好ましくは、アダプターをさらに 添加せずにこれが可能である蛋白である。φ２９−ｏｒｉ配列の使用の場合、こ のような酵素は、例えばファージφ２９の蛋白ｐ２ならびにｐ３およびｄＡＴＰ である。

復製システムの成分は、例えば、別々に、混合物として、または抽出物の形態で 添加され得る。精製された成分の添加が好ましい。

この目的のため、該酵素はアダプターの認識領域に結合し、ヌクレオラド三リン 酸（ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ　ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ）の協力で相補的核酸 ＣまたはＤを形成する。複製システムの蛋白は鎖置換を行う性質を有する。φ２ ９の場合、ｐ２はＤＮＡポリメラーゼだけでなく鎖置換活性も有する。増殖反応 の間の酵素的鎖分離のため、個々の増殖工程間の個別の変性工程は省略し得る。

かくして、本発明の方法は連続的かつ迅速に生起するという長所を有する。その 各々が酵素に対する認識部位を有する２つのアダプターを使用する場合について 、原則的には核酸ＣまたはＤの形成が両アダプターで始まり得るので、該方法は 特に優れている。したがって、増殖反応は非常に促進される。

複合体からの核酸ＣまたはＤの形成反応は新しく形成された核酸ＣまたはＤｆＪ ＜複合体を形成することもできるので連続して数回生起することができ、該反応 は、分離中間反応工程を用いず、酵素によってさらに核酸りおよびＣに導く。理 想的な場合、核酸ＣおよびＤの量の指数的増加が達成される。核酸ＣおよびＤの 形成のためにさらなるアダプターは必要ではない。形成された核酸ＣまたはＤは 、特に、各々の場合、アダプターの少なくとも１つのヌクレオチド配列および核 酸Ａもしくはその一部分と実質的に相補的または相同である少なくとも１つのヌ クレオチド配列を含有する。このヌクレオチド配列の長さは、アダプターの一本 鎖末端間にある領域中の核酸Ａと一致する。したがって、形成された核酸Ｂ、Ｃ およびＤは、核酸Ａの一部分だけを含有するのが好ましい。

所望の数の核酸ＣおよびＤが形成されると、該反応を停止することができる。こ れは、停止剤、例えばＥＤＴＡの添加によって生起するのが好ましい。核酸の製 造に必要な反応時間は、従来技術の方法と比較すると、本発明の方法によって非 常に短縮される。公知の方法の場合、とりわけ、形成された核酸の長さに依存す る。

核酸ＣおよびＤならびにそれらから形成された複合体は、さらなる反応の対象で あり得る。例えば、それらから形成された二本鎖は、制限酵素によって切断され 得る。この場合、二本鎖領域に制限酵素に対する切断部位を有するアダプターが 好ましい。

該アダプターは、Ｍ１３ユニバーサル配列決定プライマーおよび／またはＭ１３ ユニバーサル逆配判決定プライマーとのハイブリダイゼーションのための配列を 含有することもできる。

核酸ＣおよびＤは、該核酸ＣおよびＤが容易に検出され得るように放射性または 非放射性標識を導入するための反応の対象でもあり得る。

所望の数の核酸ＣおよびＤが形成されたか否かは、公知の方法、例えばゲルクロ マトグラフィーによって測定し得る。

原則的に、本発明の方法によって、核酸製造用の同一試料培地において、核酸Ａ 以外に、異なるヌクレオチド配列を有するさらなる核酸またはその一部分を使用 し得る。各核酸一本鎖に関して、対応するアダプターが存在することが予め必要 とする条件である。さらなる核酸のヌクレオチド配列における違いが核酸Ａとの ハイブリダイゼーション条件下でアダプターがさらなる核酸ともハイブリダイズ する程度の場合、例えば、アダプターと相捕的な領域の内部領域において１つの 塩基だけが異なる場合、さらなる核酸に対して特異的なアダプターは必要ではな い。試料中の核酸が初めから二本鎖核酸である場合、それらが単一の鎖として存 在するならば、鎖側々の鎖は共に増殖され得る。該ヌクレオチド配列が同一のヌ クレオチド配列を有する領域を有しない場合、好ましくは別の非相補的配列に結 合する少なくとも４つのアダプターが必要である。

本発明の方法は、種々の長所を有する：例えば、ファージφ２９の複製システム の使用の場合、反応配列は低温で行われ得る；変性のための高温は必要ではない 。ｉｎ　ｖｉｔｒｏ複製は１９ｋｂまで（φ２９　ＤＮＡに関する）の長いＤＮ Ａフラグメントおよび少なくとも７ｋｂまで（Ｍ１３ゲノム）の異種ＤＮＡによ って機能する。それらについて比較すると、欧州特許出願公開ＥＰ−Ａ−０２０ ’１１８４号公報に従って増殖され得る配列のサイズはせいぜい３〜４ｋｂであ る。

増殖速度が理論的に速いか、あるいは他の標的増幅方法の場合よりも核酸の増殖 が迅速である。これは、好ましくは２５℃〜４５°Ｃ１特に好ましくは３０〜３ ７°Ｃの範囲で行われるので、該方法は、ｉｎ　５ｉｔｕハイブリダイゼーシク ン実験において、例えば細胞スミア、固定細胞もしくは組織片において、または 単離染色体上で、増殖のために使用され得る。比較的短いアダプターは、組織そ のものおよびオリゴヌクレオチド中に拡散する。

本発明の方法の長所は、ポリメラーゼの高いプロセッシビテイ（ｐｒｏｃｅｓｓ ｉｖｉｔｙ）および鎖置換活性のため、複製工程が複合体全体の二次構造に依存 しない点である。したがって、長い核酸を製造するのが可能である。

一本鎖領域（核酸Ａに対して特異的）および複製システムに対して特異的な領域 の間のアダプターにおける制限酵素切断部位の導入によって、得られた生成物は 、例えば、クローン化されるかまたはそのまま配列決定されるか、あるいは試料 としてアダプター配列から切断して遊離され得る。これは、転写増幅方法からの 生成物については可能ではない。

本発明の核酸製造方法は、非常に時間を節約し、かつ非常に敏感である。核酸Ａ の１００ヌクレオチド含有部分について、アダプターハイブリダイゼーション、 ギャップ充填および複製を含めて、理論的増幅速度２６ｓ！で約１時間までの時 間が必要である；従来技術の方法は、最も有利な場合、このために２〜４時間を 必要とするであろう。本発明の方法は、１バイアル反応として、好ましくはまず ギャップ充填反応の成分、次いでｉｎ　ｖｉｔｒｏ複製のための成分を連続添加 することによって行われ得る 増殖反応で得られる核酸Ｂ、ＣおよびＤは同一の長さを有するのが好ましい。こ れは、例えばハイブリダイゼーションの場合、均−核酸群がそれらの検出のため のより均一な条件を可能にするので優れている。

核酸Ｂ、ＣおよびＤはＤＮＡ’ｓである。これは、それらから形成された核酸Ｃ およびＤを、中間分離反応工程を用いずに同一反応においてＤおよびＣの形成の ための鋳型として再度使用することができる。新しく形成された核酸Ｂ、Ｃおよ びＤが複製システムに対して特異的な少なくとも１つの配列を既に有する場合、 アダプターのさらなる添加は不必要である。

本発明の方法は、核酸Ａもしくはそれらの一部分またはそれらと相補的な核酸の 複数のコピーの製造のために使用され得る。これは、分子生物学および遺伝学的 基礎研究において、臨床診断学において、ならびに生物工学において、またはレ ア遺伝子（ｒａｒｅ　ｇｅｎｅｓ）の構造および機能の研究のために特に重要で ある。

本発明の課題は、上記の核酸製造方法を含む核酸Ａの検出方法でもある。

この目的のため、検出されるべき核酸を含むと仮定される試料を上記の核酸製造 方法に課し、検出されるべき核酸を核酸Ａに関する上記と同一の方法で処理する 。

次いで、修飾または非修飾ヌクレオシド三リン酸の助けによって核酸Ｂ、Ｃおよ びＤを製造し得る。修飾ヌクレオシド三リン酸を使用するのが好ましい。このよ うな修飾ヌクレオシド三リン酸は公知である。修飾は、例えば、放射性基、蛍光 性基、着色基、免疫反応性基、生物特異的に結合可能な基または化学的反応性基 によるヌクレオシド三リン酸の１またはそれ以上の残基の置換で構成される。

適切な免疫反応性基は、例えば、ジゴキシゲニンのようなノーブテン、またはス ルホン酸残基であり、生物特異的に結合可能な基は、例えば、ビオチンのような ビタミンであり、化学的反応性基は、例えばおそらくスペーサーを介してヌクレ オチド三リン酸に結合されるさらなるアミ７基またはスルフヒドリル基である。

修飾ヌクレオシド三リン酸の使用の場合、核酸Ａの存在または量を検出するため には、未反応ヌクレオシド三リン酸の分離除去後、取り込まれた修飾を介して核 酸Ｂ、ＣまたはＤの存在または量が簡単に測定される。既に修飾されたヌクレオ チドの取込みを介する方法は、標識核酸プローブによる通常のさらなるハイブリ ダイゼーション工程または伸長反応が省略され得るので特に好都合である。

修飾ヌクレオチドリン酸を取込む核酸の検出方法は、ノ・ブテン標識化の場合は 例えば欧州特許出願公開ＥＰ−Ａ−０３２４４６８号公報から、ビオチン標識化 の場合はドイツ特許出願公開ＤＥ−Ａ−２９１５０８２号公報から公知である。

この目的のため、ハイブリダイズされた核酸は、モレキュラーシーブ、または二 本鎖核酸もしくは例えばｐ３のような核酸の残基を認識および結合する親和性物 質上で未反応成分と分離される。次いで、標識の量を測定する。

しかし、特に非修飾ヌクレオシド三リン酸の場合、少なくともそれらの一部分と 実質的に相補的な修飾核酸とのハイブリダイゼーションによって形成された核酸 ＣまたはＤを検出するのが可能である。

これらの核酸は検出可能であり得るかまたは検出可能にされ得る。

このような方法も公知である。このような方法は、例えば、米国特許ＵＳ−Ａ− ４３５８３５号明細書または欧州特許出願公開ＥＰ−Ａ−０１９２１６８号公報 に開示されている。

修飾ヌクレオシド三リン酸の可能な取込みのため、本発明の核酸製造方法は修飾 核酸、特に修飾ＤＮＡの製造方法としても顕著に適している。このような修飾核 酸は、ＤＮＡ診断におけるいわゆるプローブとしての使用を見出す。修飾が検出 可能な基または検出可能な基に転換され得る基である場合、例えば米国特許ＵＡ −Ａ−４３５８５３５号明細書における検出プローブとして使用され得る核酸が 得られる。修飾が結合可能な基、例えば免疫反応性基またはビオチンである場合 、欧州特許出願公開ＥＰ−Ａ−００９７３７３号公報に開示されているような核 酸が得られる。それらは、例えば欧州特許出願公開ＥＰ−Ａ−０１３９４８９号 公報の方法における捕捉（ｃａｐｔｕｒｅ）プローブとして使用され得る。

本発明の核酸検出方法は、核酸またはその一部分の増殖方法の長所に増殖の間の 標識化の長所を兼ね合わせている。

この方法に関して、ＤＮＡだけではなくＲＮＡも検出することがあるのでｒＲＮ Ａの検出が好ましい。この方法で、例えば種診断が可能になる。アダプターの一 本鎖のハイブリダイジング領域は、米国特許ＵＳ−Ａ−４，８：５１，３３０号 明細書に従ってコ！択され得る。

しかし、この種診断は、毒素原または病原性因子のような細菌特異的遺伝子によ っても可能である。

本発明の方法は、突然変異誘発アダプター、またはハイブリダイジング−末鎖領 域において少なくとも１つのミス対合を有するアタブターによる突然変異誘発の ため、あるいはハイブリダイジング−末鎖領域において少なくとも１つのミス対 合を有するアダプターを介する突然変異体の検出のために使用され得る。

本発明の核酸製造方法の特に好ましい具体例は、核酸ＡおよびＢの複合体から核 酸ＣまたはＤを形成するためのファージφ２９の複製システムの１ｎｖｉｔｒｏ 使用によって可能になる。この複製システムは、例えば、ビオンミ力・エト・ビ オフィジ力・アクタ（Ｂ　ｉｏｃｈｉｍ。

Ｂ　１ｏｐｈｙｓ、　Ａ　ｃｔａ）、９５１（１９８８）、４１７〜４２４に開 示されている。

開始については、配列特異的増幅のために２つのアダプターを使用する。これら のアダプターは１．二本鎖としてのファージφ２９の左右の複製起源（ｏｒｉ） 、および−末鎖標的特異的領域を含有する。

ｉｎ　ｖｉｔｒｏ複製については、ヌクレオシド三リン酸以外に、ＤＮＡポリメ ラーゼｐ２およびアダプターの５゛−末端に正しく結合した蛋白ｐ３および遊離 ｐ３ならびにｄＡＴＰが必要とされるだけなので、φ２９の複製システムが選択 された。アダプターのハイブリダイゼーションの後、両アダプター間の一末鎖ギ ャップは、ｄＮＴＰｓおよびＴ４　ＤＮＡポリメラーゼまたはクレノウボリメラ ーセでふさがれ、イー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）ＤＮＡリガーゼまたはＴ４ＤＮＡ リガーゼによって完全な鎖に結紮される。その後、複製反応がｐ２およびｐ３に よって開始され、該複製はｄＮＴＰｓによって行われる。

φ２９ＤＮＡボソメラーゼは、適当な反応時間（鋳型の長さに依存する）の後、 ＥＤＴＡによって抑制される。増幅生成物の検出は、標識核酸プローブとのハイ ブリダイゼーションによってゲル中だけではなく、増幅反応の間に取込まれた標 識ヌクレオチドによって可能である。

以下の条件が優れていることが判明した。ギヤノブ充填反応ニアタブター濃度１ ００〜５００μＭ、温度２５〜４５°Ｃ１好ましくは３０〜３７°Ｃ：試料容量 ２０〜５０μＱ；緩衝物質、好ましくはＴｒｉｓ　ＨＣｆ２（ｐＨ７，５〜８． ０）、２０〜１００１１Ｍ；塩、好ましくはＭｇＣρ、２ｍＭ〜１５ｘＭ、（Ｎ Ｈ４）！３０４５〜５０ｘＭ＋アジュバント　ＤＴＴ　１〜１０ｘＭＳＢＳＡ　 ５０〜２５０μ９／好；ヌクレオシド三リン酸：５０〜２５０μＭ；ハイブリダ イゼーション時間５分〜１５分、ポリメラーゼ２〜５Ｕ；リガーゼ２〜５０．イ ンキュベーション５分〜３０分。

？！製：好ましい温度２５〜４５℃、特に好ましくは３０〜３７℃、ギャップ充 填の場合と同じ温度が特に優れている（しかし、ギヤ。

ブ充填と複製の温度は互いに異なり得る）；容量２０〜５０μａ；ｐ３　：　２ ０〜４００ｎｌ　ｐ３　：　２〜３００ｎｌＦ：緩衝液：　Ｔｒｉｓ（ｐＨ７゜ ５）、２Ｃ）〜］ＯＯｘＭ；塩ＭｇＣ（ｂ　：　２〜１５ｘＭ、　（ＮＨＪｚＳ 　０４：２０〜５０ｘＭ；アジュバント：スペルミジン１〜５ｘＭ、インキュベ ーション時間１５分（非常に短い領域について）〜９０分（長い領域について） 。ヌクレオチド、前記のとおりであるが、他に５ｔｐ−ｄ　ＮＴ　Ｐ　ｓ　１　 ビオチア−ｄＮＴＰｓまたはシゴキ／ンーｄＮＴＰｓ０検出： ａ）直接標識された核酸の場合、アガロースゲルｂ）放射性−または非放射性標 識試料Ｄ　Ｎ　Ａとのハイブリダイゼーションは、例えば １）ＵＶ２５０ｎｍで固定しているか、または２）壁に結合された相補的核酸と のハイブリダイゼーションによって固定している膜上で、 あるいは微量滴定プレート、管（ナイロン、ＮＣ，合成物質、ストレプトアビジ ン被覆合成物質、カラムまたはビーズなどの）中におけるドツト、サザーンブロ ノト。

所定の値が推奨として役立つ。当業者が変え得るのは明白である。

理論的に、本発明の検出方法は、如何なる成分も分離せずに溶液中で完全に検出 まで行われ得る。過剰の標識化剤の分離が必要なだけである。

本発明の課題は、増殖されるべき核酸のヌクレオチド配列の少なくとも一部分と 実質的に相補的である少なくとも１つの一本鎖核酸領域およびＤＮＡポリメラー ゼの認識のための配列を含有する二本鎖領域からなる上記方法で使用したアダプ ターである。アダプターは、結合された蛋白をさらに含有するのが好ましい。

第１図および第２図において、ファージφ２９の複製システムの助けによって蛋 白活性された（ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｉｍｅｄ）ｉｎ　ｖｉｔｒｏ複製の例を使 用して、本発明の核酸製造方法が略図的に示される。

第１図は、−重鎖領域（６，５）において−重鎖核酸への異なる領域とハイブリ ダイズする２つのアダプター（２，３）と核酸Ａ（１）との反応を示す。さらに また、アダプター３および２は、各々、複製システムの特異的結合のためのヌク レオチド配列（４，７）を含有する。さらにまた、アダプターが５′−末端で共 有的に結合された蛋白ｐ３を含有する場合が示される。ギャップ充填によって複 合体（８）が生成される。

第２図においては、複合体（８）の複製が示される。特に蛋白ｐ２およびｐ３な らびにｄＡＴＰおよび他のヌクレオシド三リン酸を含有するファージφ２９の複 製システムによって、複合体（８）と同様に複製についての基礎であり得る複合 体（９）を再度形成する核酸ＣおよびＤが、各々（１０および１１）、形成され る。かくして、新しい複製の場合、新しい核酸ＣおよびＤが形成される。所望の 数の核酸が達成されるとすぐに、該方法は停止され得る。

第３図は、互いにおよび核酸Ａに対するアダプターの配置の１つの可能性を示す 。

第４図は、互いにおよび核＃Ａに対するアダプターの別の配置を示す。この配置 は、鋳型核酸が、例えば制限エンドヌクレアーゼによって増幅のために消化され るという点で達成され得る。

以下の実施例によって本発明をさらに説明する。

実施例１ａ アダプターとして４個のオリゴヌクレオチドを使用する。左側のアダプターは６ ６ｎ　ｔの核酸鎖からなり、４６ｎｔはＰＮＡＳ　［ユ〜１１．１９８８］　、 ＮＡＲ［１６／１３．５８９５〜５９１３．１９８８］からのφ２９の左側の複 製起源配列の５°−末端に一致し、２０ｎ　ｔはＨＢＶ特異的配列［欧州特許公 告ＥＰ−Ｂ−００１３８２８号公報、ヌクレオチド１２７８〜１２９７］に一致 し、相補鎖は４６ｎｔのｏｒｉ領域に一致する。右側のアダプターは、７９ｎｔ の核酸鎖からなり、５９ｎ　ｔはφ２９の右側ｏｒｉ配列の３°−末端に一致し 、２０ｎ　ｔはＨＢＶ特異的配列［欧州特許公告ＥＰ−Ｂ−００１３８２８号公 報、ヌクレオチド１４０３〜１４２２コに一致し、相補鎖は５９ｎ　ｔのｏｒｉ 領域に一致する。ＨＢＶ配列はＨＢＶゲノムにおける一本鎖領域と相補的であり 、１０６ｎｔの領域をカバーする。

アダプターが２ｉ：＋ＯｎＭの濃度で存在するように、Ｔｒｉｓ−ＨＣ（ｌ（ｐ Ｈ７，ｉ：＋）５０ｎＭ；ＭｇＣＱｔ、１０肩Ｍ；（ＮＨ−）ｔＳＯ４，２０麓 Ｍ；ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、２ｉＭ：ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、 ２００μ９／ｘ（１：　ｄＡＴＰ、１５０ｎＭ；ｄｃＴＰ、１５０ＭＭ；　ｄＧ ＴＰ、１５０ｎＭ、ｄＴＴＰ、１５０μＭ；　ＮＡＤ、２６ｎＭにおいて、アダ プターと容１２０μｇでＨＢＶ鋳型（ＨＢＶゲ／ゲノ０．５μ９〜ｏ、５ｒ９） を混合する。アダプターの結合のために、この溶液を３０℃で１５分間インキュ ベートする。２つの結合アダプター間のギャップを充填するため、上記緩衝液５ μσ中で２ＵＴ４　ＤＮＡポリメラーゼおよび２Ｕイー・コシ（Ｅ、ｃｏｌｉ） ＤＮＡリガーゼを添加し、３０℃で１０分間インキュベートする。

その後、複製の開始のため［ＰＮＡＳ、ヱ旦、５５２２〜５５２６．１９８２． ＰＮＡＳ、８０，４２８２〜４２５２、Ｉ　９８３　；ＰＮＡＳ１８１．５３７ ４〜５３７８．１９８４　；　ＰＮＡＳ、８１．８０〜８４．１９８４　、ＰＮ ＡＳ、８２．６４０４〜６４０８．１９８５；ジャーナル・オブ・バイオロジカ ル・ケミストリー（Ｊ。

Ｂ　ｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　）、２６４／１５．８９３５〜８９４０，１９８９ ］、Ｔｒｉｓ　ＨＣｌ２（ｐＨ７，５）、５０ｉＭ　；　Ｍｇ（Ｊ！ｔ、１０１ １Ｍ　；スペルミジン、２ｉＭ；（ＮＨ，）、Ｓｏ、、２０ｎＭの２５μ１２ｉ ｉ：入れたφ２９の末端蛋白（Ｐ３）１５０ｎ？およびφ２９ポリメラーゼ（ｐ ２）８０ｎｌＦを添加し、３０℃で３０分間インキュベートする。ＩＯＪＩＭＥ ＤＴＡおよび０゜１％ＳＤＳによって反応を停止する。検出のため、０．８％ア ガロースゲル中で複製生成物を分離し、臭化エチンウム染色によって可視化する 。

実施例１ｂ 実施例１ａと同一のアダプターを使用する。実施例１ａと同様のＨＢＶ鋳型を使 用し、Ｔｒｉｓ−ＨＣｆｆ（ｐＨ７，５）、２５＋Ｍ；ＫＣｌ２．６　、３　Ｊ ＡＭ　；　Ｍ　ｇ　ＣＱ　ｘ、１５ｚＭ；ジチオエリスリトール（ＤＴＥ）、２ 肩Ｍ；ＡＴＰ、５０μＭ；ｄＡＴＰ、２５μＭ、ｄＣＴＰ、２５μＭ、ｄＧＴＰ 、２５μＭ、ｄＴＴＰ、２５μＭ中、２つの結合したアダプター間のギャップを 充填するために、各２５０ｎＭのアダプターオリゴヌクレオチドならびに２Ｕク レノウＤＮＡポリメラーゼおよび２ＵＴ、４−リガーゼと一緒に容量３０μａ中 で３０°Ｃで３０分間インキュベートする。複製反応開始のために、Ｔｒｉｓ− ＨＣｌ２（ｐＨ７，５）、８７．５にＭ；　ＭｇＣ（！！、２．５ｘＭ＋スペル ミジン、５　ｘＭ　；　（Ｎ　Ｈ４）　ｔ　ＳＣ２，５０ｘＭノ２０　ｕ（ｌ中 、φ２９の末端蛋白（ｐ３）１５０ｎｉ！およびφ２９−ＤＮＡ−ポリメラーゼ （ｐ２）８０ｎ９を添加し、３０’Ｃで３０分開インキュベートする。該反応は 、実施例１ａと同様に１０ｘＭＥＤＴＡおよび１％ＳＤＳによって停止され、ア ガロースゲル中で検出される。

実施例１ｃ 実施例１ａおよび１ｂと同様に、Ｔｒｉｓ　ＨＣｆｆ（ｐＨ８）、５０ｚＭ；Ｍ ｇ（Ｊ２．５ｚＭ；酢酸ＮＨ，，６０ｘＭ；　ＤＴＴ、５ｘＭ；　ｄＡＴＰ、２ ５０ｔ１Ｍ：ｄＣＴＰ、２５０μＭ：ｄＧＴＰ、２５０μＭ；ｄＴＴＰ、２５０ μＭ；ＮＡＤ、２００μＭ中３０μＱの容量で各々２５０ｎＭのアダプターオリ ゴヌクレオチド、２Ｕイー・コリ（Ｅ。

ｃｏｌ　ｉ）−リガーゼおよび２０　Ｔ４−ＤＮＡ−ポリメラーゼと一緒に、３ ０℃で３０分間、ＨＢＶ−ＤＮＡをインキュベートする。次に、複製反応のため に、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２（ｐＨ７，５）、５０ｚＭ；ＭｇＣＬ、１７．５ＪＩＭ ；スペルミジン、５ｘＭの２０ａａ中、１ＢＯｎ９のｐ３および８０ｎ９のｐ２ を添加し、３０℃で３０分間インキュベートする。

実施例１ａおよび１ｂと同様に反応を停止させ、反応生成物を検出する。

実施例１ｄ アダプターの濃度が各々１μＭである以外は、実施例１ａ〜ＩＣと同様の開始ギ ヤノブ充填反応で反応を行う。実施例１ａ−１ｃと同様に、次の複製反応を再度 行う。

大塵然土至 反応において使用する前にアダプターオリゴヌクレオチドを９５°Ｃで１０分間 加熱し、氷上で急速冷却する以外は、実施例１ａ〜１ｄと同様に実験を行う。

Ｋ皇二上工 反応温度が各々３７℃である以外は、実施例１ａ〜１ｅと同様に出発ギで、ブ充 填反応および複製反応を行う。

実施例２ この目的のため、φ２９蛋白ｐ３を有するφ２９−特異的ｏｒｉ配列の５′−末 端にアダプターを結合するＥＰＮＡＳ、ヱｌ、６４２５〜６４２８．１９８０； ＮＡＲ，１３／２１．７７１５〜７７２８．１９８５］。実施例１に記載の複製 条件下、問題のオリゴヌクレオチドおよびその相補鎖のｉｎ　ｖｉｔｒｏ複製に よって、特異的５゛−末端へのｐ３の結合を行う。二本鎖の場合、オリゴヌクレ オチドは、１つの末端だけにｏｒｉ特異的配列を含有する。したがって、ｐ３は 、５′−末端だけに結合し得、第２鎖は９３分子を含有しない。例えばｐ３に対 する抗体によるアフィニティークロマトグラフィーによって、混合物からこれら の鎖が表面に結合され、ｐ３遊離鎖を洗浄除去した後、溶離する。次いで、表面 をストレプトアビジンで飽和し、〈ｐ３〉抗体をビオチンと結合させることがで きる。次いで、実施例１ａ−ｆと同様に、適当な鋳型ＤＮＡとの増幅反応におい てアダプター−９３分子が使用される。しかし、ｐ３含有鎖は、セファデックス （Ｓ　ｅｐｈａｄｅｘ）Ａ　ＣＡ　５００上で分離され得る。

実施例３ａ 実施例１ａ−ｆと同様に、アダプターハイハブリダイゼーションを用いて、共有 結合したｐ３だけを有しないか、またはｐ３を含有もしないアダプターによって 反応を開始する。しかし、左右のアダプター間のギヤノブを充填するためのｃｌ ＮＴＰ！１度は各デオキシヌクレオチドについて３３μＭに達する。３０℃で１ ０分間伸長した後、複製の開始のため、実施例１ａｘｆに記載の物質以外に、２ ５μｃｉ　［ａ”ＰコｄＡＴＰ（＝３０００Ｃｉ／ｚＭ）および各々１５０μＭ のｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰを添加し、実施例１ａ〜ｆと同様に再度イ ンキュベートする。

実施例１ａ−ｆと同様に反応を停止させる。反応生成物は、ゲル電気泳動の後に Ｘ線フィルム上の特異的な黒化として、またはナイロン膜への滴下し、ＵＶ放射 によって固定し、次いで該乾燥膜にＸ−線フィルムを暴露することによって検出 される。ナイロン膜への滴下の前に、セファデックス（Ｓ　ｅｐｈａｄｅｘ）　 Ｇ　５０カラムを用いてゲル濾過によって、増幅生成物を、取り込まれていない ｄＮＴＰｓから分離し、エタノール沈殿によって濃縮する。

大皇豊且１ ｄＮＴＰ濃度が各デオ牛ジヌクレオチドについて３３μＭに達する以外は、実施 例１ａ−１ｆと同じ開始緩衝液中、および反応温度で、アダプターによって反応 を開始する。ギャップ充填反応が終わつた後、複製開始のために、５０μＭジゴ 牛シゲニ７−１１−２’−デスオキシすリジン５°−三リン酸（ＤＩＧ−１１− ｄＵＴＰ）、１００μＭ　ｄＴＴＰおよび各々１５０μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ およびｄＧＴＰを含む実施例１ａ〜１ｆに記載の物質を添加する。該反応の終了 および該反応の停止の後、該生成物を、アガロースゲル中で分離し、ナイロンま たはニトロセルロース膜に移すか、あるいは対応する膜上にスポットして、ＵＶ 放射または加熱処理によって固定する。その後、ベーリンガー・マンハイム・バ イオケミカル・マニュアル（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｂｉｏ ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｍａｎｕａｌ）第９６〜１１５頁［ベーリンガー・マンハイ ム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、バイオケミカルズ・フォー・ モレキュラー・バイオロジー（Ｂｉｏ−ｃｈｅｍｉｃａｌｓ　ｆｏｒ　Ｍｏ１ｅ ｃｕｌａｒ　Ｂ　ｉｏｌｏｇｙ）　１９９０コまたはシー・ケスシー（Ｃ，Ｋｅ ｓｓｌｅｒ）ら［ジゴキシゲニンに基づく非放射性標識および検出システム＝１ ．ジゴキシゲニンに基づく新規なりＮＡ標識化および検出システム：抗−ジゴキ シゲニンＥＬ　Ｉ　ＳＡ則（ジゴキシゲニン・システム）（Ｎｏｎ−ｒａｄｉｏ ａｃｔｉｖｅ　Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ　ａｎｄ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆ　Ｎｕｃ ｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ：　１．　Ａ　Ｎｏｖｅｌ　ＤＮＡ−Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ 　ａｎｄＤｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓ　ｙｓｔｅｍ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　Ｄ　ｉｇｏ ｘｉｇｅｎｉｎ　：　Ａ　ｎｔｉ−Ｄ　ｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎＥ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　 Ａ　Ｐ　ｒｉｎｃｉｐｌｅ（Ｄ　ｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ　Ｓ　ｙｓｔｅｍ）、１ ９９１　、　ノゞイオロジカル・ケミストリー・ホップーセイラー（Ｂ　ｉｏｌ ｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ）発行］における 記載に従ってＤＩＧ標識ＤＮＡを検出する。

実施例４ａ アダプターのハイブリダイゼーション反応について、左側アダプターと一致する ２つのオリゴヌクレオチド（共有結合された＋／−ｐ３）およびＨＢＶ特異的配 列および右側φ２９ｏｒｉ領域の３′−末端を含有するオリゴヌクレオチドを添 加するだけである以外は、実施例１〜３と同様に実験を行う。実施例１〜３と同 様にギヤ、ノブ充填反応後、反応混合物によって複製反応を開始するため、オリ ゴヌクレオチドの濃度が２５０ｎＭに達するように、ｏｒｉ領域との相補鎖を右 側アダプター（共有結合される＋／−ｐ３）に添加する。

実施例１〜３と同様にインキュベーション、反応停止および検出を行う。

実施例４ｂ ギャップ充填反応について、ｏｒｉ領域との相補鎖を含有しない左側アダプター およびｏｒｉ領域との相補鎖を含有する右側アダプターを添加する以外は、実施 例１ａ〜１ｆ、２および３と同様に実験を行う。この相補鎖は３”−末端にジデ オキシヌクレオチドを含ギヤツブ充填反応について、各々３′−末端にジデオキ シヌクレオチドを有する左側アダプターのｏｒｉ領域との相補鎖、右側アダプタ ーおよびそのｏｒｉ相補鎖を添加する以外は、実施例１ａ〜１ｆ、２および３と 同様に再度実験を行う。

実施例４ｄ 実施例１ａ〜１ｆ、２および３と同様に再度実験を行う。ギヤツブ充填反応につ いて、ｏｒｉ相補鎖を含有しない左側アダプターおよび３°−末端にジデオキシ ヌクレオチドを有する右側アダプターならびに３“−末端にジブオキ／ヌクレオ チドを有する対応するＯｒｉ相補鎖を添加する。

実施例５ 実施例３ａと同様にセファデックスＧ−５０によるゲル濾過によって”ＰｔＵｉ 増幅生成物を、取ｊ）込まれていないデオキシヌクレオチドから分離する。その 後、増幅生成物を９５℃で１０分間インキュベートして変性させ、４５°Ｃで、 ストレプトアビジン被覆管中、ホルムアミド、］Ｏ％、ＳＳＣ，５ｘ；デンハー ト（Ｄ　ｅｎｈａｒｄｔ）溶液、１　ｘ　；　’）　７酸ナトリウム、ｐＨ６， ８，５０，ＩＩＭ（７）２００　ｕ（ｌ中、ビオチンで標識される（欧州特許出 願公開ＥＰ−Ａ−００９７３７３号公報）増幅領域と配列相同の４０ｎｔのオリ ゴヌクレオチド２０ｎ９と一緒に４時間ハイブリダイズする。オリゴヌクレオチ ドの濃度は、８ｘＭに達する。ハイブリダイゼーション／壁結合の後、３７°Ｃ で３０分間、ＳＳＣ，２ｘ：および５ＤＳＳＯ，２％の２００μｇで２回洗浄し 、結合された放射性増幅生成物をシンチレーションカウンターで測定する。

実施例６ 実施例１．２または４と同様に製造した非標識増幅生成物は、実施例５と同様の ゲル濾過の後、４５℃で、増幅領域の一部分と相同の４０ｎｔのビオチン標識オ リゴヌクレオチドだけでなく、この領域の別の部分と相同の４０ｎｔの第２のオ リゴヌクレオチドとハイブリダイズする。したがって、これらのオリゴヌクレオ チドは、交差ハイブリダイゼーションを示さない。２００μａのハイブリダイゼ ーションのバッチは、各々８ｎＭの２つのオリゴヌクレオチド、ホルムアミド、 １０％Ｈ８５Ｃ，５ｘ：デンハート（Ｄ　ｅｎｈａｒｄｔ）溶液、ＩＸ；リン酸 ナトリウム、ｐＨ６，８，５０ＪＩＭを含有する。ストレプトアビジン被覆微量 滴定プレート中で、４時間、ハイブリダイゼーシヨンを行い、その後、３７°Ｃ で、コンジュゲート緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２、ｐＨ７，５，１００ＲＭ：　 ＮａＣ（２０，９％；　Ｂ５Ａ１％；ブルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）　Ｔ　 ６８　０．５％）で１×１０分間洗浄する。次いで、３７℃で３０分間、４０Ｕ 〈ジゴキシゲニン〉アルカリホスファターゼコンジュゲート体と一緒にインキュ ベートし、その後、毎回、Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、１００１！Ｍ：およびＮａＣρ、 １５０１ＲＭの２００μａで５回洗浄する。次いで、３７℃で３０分間、リン酸 ４−メチルウンベリフェリル（０，１ｘＭ）と−緒にインキュベートし、ダイナ テ、り・ミクロフルオローリータ−（ＤＶｎａｔｅｃｈＭ　１ｃｒｏｆ　１ｕｏ ｒ−Ｒｅａｄｅｒ）で測定する〇ＦＩＧイ ＦＩＧ２．− 国際調査報告 ＩＲＩ＠ｆｆｍｍＭＩ　Ａ。。１４６１１９１１＋。ＰＣＴ／ＥＰ　９０１０１ ４２３【ＩＧ３ イ ｒ／Ｇ（−１ 国際調査報告 ＰＣＴ／ＥＰ　９０１０１４２３

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. （１）核酸Ａの少なくとも一部分と実質的に相補的であり、かつ複製システムに 対して特異的なヌクレオチド配列を有する少なくとも１つのアダプターを含有す る核酸が形成される条件下で、核酸Ａを、該核酸Ａの鎖の一部分とハイブリダイ ズすることができ、かつその少なくとも１つが複製システムに対して特異的なヌ クレオチド配列を含有する少なくとも２つのアダプターと反応させ、次いで、複 製反応に適した条件下で、核酸Ａおよび前工程で形成された核酸の複合体を、複 製システムに対して特異的なヌクレオチド配列および核酸Ａのヌクレオチド配列 の少なくとも一部分と実質的に相同または実質的に相補的なヌクレオチド配列を 含有するアダプターの少なくともヌクレオチド配列を含有する核酸配列の形成を 単独でまたは一緒に触媒する複製システムの１またはそれ以上の蛋白と反応させ ることを特徴とする核酸Ａの使用による核酸の製造方法。
2. （２）複製が少なくとも１つの蛋白によって開始される請求項（１）記載の方法 。
3. （３）相補的核酸を形成させる条件がヌクレオシド三リン酸、ポリメラーゼおよ びリガーゼの使用からなる請求項（１）〜（２）いずれか１項記載の方法。
4. （４）アダプターが同一のヌクレオチド配列と相補的ではない請求項（１）〜（ ３）いずれか１項記載の方法。
5. （５）アダプターが、少なくとも１個のヌクレオチドによって互いに隔てられて いる増殖されるべき核酸のヌクレオチド配列と相補的である請求項（１）〜（４ ）いずれか１項記載の方法。
6. （６）各アダプターが増殖されるべき核酸の一部分と実質的に相補的である一本 鎖核酸領域を有し、核酸のこの部分とハイプリダイズすることができ、該アダプ ターの少なくとも１つが増殖されるべき核酸と実質的にハイプリダイズすること ができない二本鎖核酸領域を有するが、上記酵素の認識のための配列を有する請 求項（１）〜（５）いずれか１項記載の方法。
7. （７）核酸と相補的でない領域が複製のためのｏｒｉ配列である請求項（６）記 載の方法。
8. （８）アダプターの少なくとも１つが二本鎖領域に少なくとも１つの制限酵素切 断部位を有する請求項（１）〜（７）いずれか１項記載の方法。
9. （９）アダプターの少なくとも１つが、二本鎖領域に、Ｍ１３ユニバーサル配列 決定プライマーおよび／またはＭ１３ユニバーサル逆配列決定プライマーとのハ イブリダイゼーションのための少なくとも１つの配列を有する請求項（１）〜（ ８）いずれか１項記載の方法。
10. （１０）増殖方法として請求項（１）〜（９）いずれか１項記載の方法を使用す ることを特徴とする、検出されるべき核酸またはその一部分を増殖させ、形成さ れた核酸を測定することによる核酸の検出方法。
11. （１１）増殖されるべき核酸のヌクレオチド配列の少なくとも一部分と実質的に 相補的である少なくとも１つの一本鎖核酸領域および複製システムに対して特異 的なヌクレオチド配列を含有する二本鎖領域からなることを特徴とするアダプタ ー核酸。
12. （１２）少なくとも１つの蛋白がそれに結合される請求項（１１）の記載アダプ ター核酸。
13. （１３）ファージφ２９のｏｒｉ配列を含有することを特徴とする請求項（１１ ）および（１２）のいずれか１項記載のアダプター核酸。
14. （１４）少なくとも１つの制限酵素切断部位を有する請求項（１１）〜（１３） いずれか１項記載のアダプター核酸。