JPH09289900A - 核酸配列（β２．７）を利用したサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の核酸増幅ならびに検出用試薬キット - Google Patents

核酸配列（β２．７）を利用したサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の核酸増幅ならびに検出用試薬キット

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JPH09289900A
JPH09289900A JP8107789A JP10778996A JPH09289900A JP H09289900 A JPH09289900 A JP H09289900A JP 8107789 A JP8107789 A JP 8107789A JP 10778996 A JP10778996 A JP 10778996A JP H09289900 A JPH09289900 A JP H09289900A
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nucleic acid
dna
rna
acid sequence
cmv
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English (en)
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Motohiro Kondo
元宏 近藤
Toshiya Aono
利哉 青野
Masaya Segawa
昌也 瀬川
Koichi Yamanishi
弘一 山西
Kazuhiro Kondo
一博 近藤
Kaoruko Taya
馨子 多屋
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Toyobo Co Ltd
Original Assignee
Toyobo Co Ltd
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Publication date
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2531/00—Reactions of nucleic acids characterised by
    • C12Q2531/10—Reactions of nucleic acids characterised by the purpose being amplify/increase the copy number of target nucleic acid
    • C12Q2531/143—Promoter based amplification, e.g. NASBA, 3SR, TAS

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Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 配列番号１記載の核酸配列のうち、少な
くとも連続した１５塩基からなる核酸配列およびプロモ
ーター配列を含む、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼを用
いる核酸増幅反応法（ＮＡＳＢＡ）に適したサイトメガ
ロウイルス（ＣＭＶ）核酸増幅用第１プライマー、配列
番号２、３または４記載の核酸配列のうち、少なくとも
連続した１５塩基からなる核酸配列を含む増幅用第２プ
ライマーおよび配列番号５、６および／または７記載の
核酸配列のうち、少なくとも連続した１５残基からなる
核酸配列および必要により標識物質で修飾されている検
出プローブ及び／又は捕捉プローブ。これらの試薬を含
むＣＭＶ検出用試薬キット。ならびに該試薬キットを使
用した核酸増幅反応法（ＮＡＳＢＡ）。 【効果】 簡便、迅速、特異的且つ高感度にＣＭＶを検
出可能である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、核酸配列（β２．
７）を利用したサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）核酸の
増幅ならびに検出用試薬キットおよびこれらの試薬を用
いてサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）を簡便かつ迅速に
増幅し、検出する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】サイトメガロウイルス（以下、ＣＭＶと
略する）はヘルペス科に属するウイルスであり、宿主細
胞、増殖サイクル及び潜伏様式からβヘルペスウイルス
に属している。ＣＭＶは初感染後に生体内に終生にわた
り潜伏感染し、宿主の生理的変化によって潜伏感染状態
から活性化して感染ウイルスとなって、回帰発症を繰り
返すのが特徴である。また、癌患者、エイズ患者または
将来、増加すると見込まれている臓器移植患者にあって
は、免疫不全状態がＣＭＶの再燃の起因となり、間質性
肺炎、肝炎、網膜炎、脳炎または腎炎などが発症して問
題となる。
【０００３】このように、ＣＭＶの感染や回帰発症は現
代病として大きな問題であり、早期診断法の確立が早期
治療のために重要である。従来、ＣＭＶ感染の診断法と
しては、患者からＣＭＶを分離するウイルス分離法があ
るが、数週間の期間を要して迅速性に欠ける。また、患
者血清中に抗ＣＭＶ抗体を検出する血清診断法では抗体
非特異反応が起きたり、高感度が得られないという問題
があるほか、抗体価が変化するためにウイルスの消長を
追跡するのが難しいという欠点がある。
【０００４】近年の分子生物学の進歩により、in situ
ＤＮＡハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法によるＣＭ
ＶのＤＮＡの検出が可能となってきた。前者はＣＭＶに
特異的な相補的ＤＮＡ断片に標識したＤＮＡプローブを
用い、組織標本や培養細胞とＤＮＡハイブリダイゼーシ
ョンを行ってウイルスＤＮＡを検出する方法である。後
者のＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法は、ＣＭＶに特
異的なプライマーを用い、微量のウイルスＤＮＡをポリ
メラーゼ反応により増幅する方法である。特にＰＣＲ法
はきわめて感度が高いことや迅速性に優れていることが
特徴である。しかし、ＣＭＶは様々な臓器にＤＮＡの形
で潜伏感染するため、ＰＣＲ法で単にＣＭＶのＤＮＡを
検出するだけでは回帰発症と潜伏感染とは区別がつかな
い。
【０００５】そこでＰＣＲ法でセル・フリーである血清
からのＣＭＶのＤＮＡを検出する方法が考案されたが、
早期の診断には有用でない。また、ウイルスの増幅時に
存在するｍＲＮＡを検出する逆転写ＰＣＲ法も検討され
ているが、ＰＣＲ前に検体中に共存するＤＮＡを完全に
除去する操作と、逆転写酵素反応でｍＲＮＡをＤＮＡに
変換する操作が必要であり、煩雑である。しかも、少量
でもＤＮＡが残存するとｍＲＮＡが存在しなくとも陽性
と判断される危険性がある。
【０００６】一方、近年、ＲＮＡを特異的に増幅するＲ
ＮＡポリメラーゼを用いる増幅法として、ＮＡＳＢＡ(N
ucleic Acid Sequence Based Amplification、特開平2-
5864号公報、特表平4-501057号公報参照）法が注目され
てきた。ＮＡＳＢＡ法は基本的に鋳型であるＲＮＡ
（＋）のみからＲＮＡ（−）を増幅するので、潜伏状態
には転写されず、回帰発症時にのみ転写されるｍＲＮＡ
を標的遺伝子として選択することにより、回帰発症時の
ＣＭＶを特異的に検出することが可能となる。ＤＮＡか
ら転写されたｍＲＮＡはゲノムＤＮＡに比較して大量に
存在するので、より高感度な系の構築が期待できる。さ
らには、回帰発症時に将来的なｍＲＮＡの検出系はガン
シクロビル等による治療効果のモニタリングにも有用で
ある。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ＮＡ
ＳＢＡ法で簡便、迅速、特異的、かつ高感度にＣＭＶ核
酸を増幅、検出可能なオリゴヌクレオチドを提供するこ
とにある。詳細には、従来のＣＭＶの臨床検査方法の問
題点を解決すべく、ＮＡＳＢＡ法に適した増幅用プライ
マーと、該プライマーにより得られる増幅産物の判定を
行うための捕捉プローブまたは検出プローブを提供する
ことにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らはＣＭＶの遺
伝子に関する種々の検討を重ねた結果、ＣＭＶのβ２・
７遺伝子のｍＲＮＡが潜伏状態では発現せず、回帰発症
時のみ、大量に発現することに着目し、かつ、ＮＡＳＢ
Ａ法によって、ＣＭＶのβ２．７遺伝子の転写物である
ＲＮＡから、簡便、迅速、特異的かつ高感度に増幅でき
る配列を有する増幅用プライマーおよび捕捉プローブお
よび／または検出プローブを用いた検出方法を確立し、
本発明を完成させるに至った。
【０００９】すなわち、本発明は配列表・配列番号１記
載の核酸配列のうち、少なくとも連続した１５塩基から
なる核酸配列を含むことを特徴とする核酸配列（β２．
７）を利用したサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）核酸増
幅用オリゴヌクレオチドである。
【００１０】また、本発明は配列表・配列番号２、３ま
たは４記載の核酸配列のうち、少なくとも連続した１５
塩基からなる核酸配列を含むことを特徴とする核酸配列
（β２．７）を利用したサイトメガロウイルス（ＣＭ
Ｖ）核酸増幅用オリゴヌクレオチドである。
【００１１】さらに、本発明は上記サイトメガロウイル
ス（ＣＭＶ）増幅用オリゴヌクレオチドの５’末端に、
ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列が結
合していることを特徴とする核酸配列（β２．７）を利
用したサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）核酸増幅用オリ
ゴヌクレオチドである。
【００１２】本発明は、配列表・配列番号１記載の核酸
配列のうち、少なくとも連続した１５塩基からなる核酸
配列を含むサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）核酸増幅用
オリゴヌクレオチドおよび配列表・配列番号２、３また
は４記載の核酸配列のうち、少なくとも連続した１５残
基からなる核酸配列を含むサイトメガロウイルス（ＣＭ
Ｖ）核酸増幅用オリゴヌクレオチドであって、少なくと
も１つの該オリゴヌクレオチドの５’末端に、ＤＮＡ依
存ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列が結合してい
ることを特徴とするサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）核
酸増幅用オリゴヌクレオチドである。
【００１３】さらに、本発明はサイトメガロウイルス
（ＣＭＶ）の核酸配列を増幅するための試薬キットであ
って、（ａ）配列表・配列番号１記載の核酸配列のう
ち、少なくとも連続した１５塩基からなる核酸配列を含
み、かつ、その５’末端側にプロモーター配列を有する
サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）核酸増幅用第１プライ
マー、（ｂ）配列表・配列番号２、３または４記載の核
酸配列のうち、少なくとも連続した１５塩基からなる核
酸配列を含むサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）核酸増幅
用第２プライマー、（ｃ）ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラー
ゼ活性を有する物質、（ｄ）リボヌクレアーゼＨ活性を
有する物質、（ｅ）ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性
を有する物質、（ｆ）ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ活
性を有する物質、（ｇ）リボヌクレオシドトリホスフェ
ートおよび（ｈ）デオキシリボヌクレオシドトリホスフ
ェートを含む試薬キットである。
【００１４】また、本発明はサイトメガロウイルス（Ｃ
ＭＶ）の核酸配列を増幅するための試薬キットであっ
て、（ａ）配列表・配列番号２、３または４記載の核酸
配列のうち、少なくとも連続した１５塩基からなる核酸
配列を含み、かつ、その５’末端側にプロモーター配列
を有するサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）核酸増幅用第
１プライマー、（ｂ）配列表・配列番号１記載の核酸配
列のうち、少なくとも連続した１５塩基からなる核酸配
列を含むサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）核酸増幅用第
２プライマー、（ｃ）ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活
性を有する物質、（ｄ）リボヌクレアーゼＨ活性を有す
る物質、（ｅ）ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を有
する物質、（ｆ）ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ活性を
有する物質、（ｇ）リボヌクレオシドトリホスフェート
および（ｈ）デオキシリボヌクレオシドトリホスフェー
トを含む試薬キットである。
【００１５】また、本発明はサイトメガロウイルス（Ｃ
ＭＶ）の核酸配列を増幅するための試薬キットであっ
て、（ａ）配列表・配列番号１記載の核酸配列のうち、
少なくとも連続した１５塩基からなる核酸配列を含み、
かつ、その５’末端側にプロモーター配列を有するサイ
トメガロウイルス（ＣＭＶ）核酸増幅用第１プライマ
ー、（ｂ）配列表・配列番号２、３または４記載の核酸
配列のうち、少なくとも連続した１５塩基からなる核酸
配列を含み、かつ、その５’末端側にプロモーター配列
を有するサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）核酸増幅用第
２プライマー、（ｃ）ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活
性を有する物質、（ｄ）リボヌクレアーゼＨ活性を有す
る物質、（ｅ）ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を有
する物質、（ｆ）ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ活性を
有する物質、（ｇ）リボヌクレオシドトリホスフェート
および（ｈ）デオキシリボヌクレオシドトリホスフェー
トを含む試薬キットである。
【００１６】本発明は、下記工程（１）〜（１０）を含
むことを特徴とする核酸配列（β２．７）を利用したサ
イトメガロウイルス（ＣＭＶ）核酸増幅方法である。 （１）検体から必要によりＲＮＡ（＋）からなる標的核
酸の抽出操作を行い、 （２）ＲＮＡ（＋）を鋳型として、配列表・配列番号１
記載の核酸配列のうち、少なくとも連続した１５塩基か
らなる核酸配列を含み、かつ、その５’末端側にプロモ
ーター配列を有するサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）核
酸増幅用第１プライマーをハイブリダイズさせ、ＲＮＡ
依存ＤＮＡポリメラーゼにより伸長させて、ＲＮＡ／Ｄ
ＮＡハイブリッド伸長生成物を得る。 （３）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド伸長生成物のＲＮＡ
のみを特異的に分解するリボヌクレアーゼＨにより、Ｒ
ＮＡ／ＤＮＡハイブリッド伸長生成物からＲＮＡを分解
して、１本鎖ＤＮＡを得る； （４）該１本鎖ＤＮＡを鋳型として、配列表・配列番号
２、３または４記載の核酸配列のうち、少なくとも連続
した１５塩基からなる核酸配列を含むサイトメガロウイ
ルス（ＣＭＶ）核酸増幅用第２プライマーをハイブリダ
イズさせ、ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼによりＤＮＡ
伸長反応を行って、５’末端上流に機能可能なプロモー
ター配列を有する２本鎖ＤＮＡ中間体を生成させる； （５）該２本鎖ＤＮＡ中間体から、前記プロモーター配
列を認識することができるＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラー
ゼにより１本鎖ＲＮＡ（−）のコピーを増加ささせる； （６）上記工程で得られた１本鎖ＲＮＡ（−）を鋳型と
して、配列表・配列番号２、３または４記載の核酸配列
のうち、少なくとも連続した１５残基からなる核酸配列
を含むサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）核酸増幅用第２
プライマーをハイブリダイズさせ、ＲＮＡ依存ＤＮＡポ
リメラーゼによりＤＮＡ伸長反応を行って、ＲＮＡ／Ｄ
ＮＡハイブリッド伸長生成物を得る； （７）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド伸長生成物のＲＮＡ
のみを特異的に分解するリボヌクレアーゼＨにより、Ｒ
ＮＡ／ＤＮＡハイブリッド伸長生成物からＲＮＡを分解
して、１本鎖ＤＮＡを得る； （８）該１本鎖ＤＮＡを鋳型として配列表・配列番号１
記載の核酸配列のうち、少なくとも連続した１５塩基か
らなる核酸配列を含み、かつ、その５’末端側にプロモ
ーター配列を有するサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）核
酸増幅用第１プライマーをハイブリダイズさせ、ＤＮＡ
依存ＤＮＡポリメラーゼによりＤＮＡ伸長反応を行っ
て、５’末端上流に機能可能なプロモーター配列を有す
る２本鎖ＤＮＡ中間体を生成させる； （９）該２本鎖ＤＮＡ中間体から、前記プロモーター配
列を認識することができるＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラー
ゼにより１本鎖ＲＮＡ（−）のコピーを増加させる；そ
して （１０）必要により、得られた１本鎖ＲＮＡ（−）を鋳
型として、前記（６）〜（９）を繰り返す。
【００１７】本発明は、下記工程（１）〜（１０）を含
むことを特徴とする核酸配列（β２．７）を利用したサ
イトメガロウイルス（ＣＭＶ）核酸増幅方法である。 （１）検体から必要によりＲＮＡ（＋）からなる標的核
酸の抽出操作を行い、 （２）ＲＮＡ（＋）を鋳型として、配列表・配列番号１
記載の核酸配列のうち、少なくとも連続した１５塩基か
らなる核酸配列を含み、かつ、その５’末端側にプロモ
ーター配列を有するサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）核
酸増幅用第１プライマーをハイブリダイズさせ、ＲＮＡ
依存ＤＮＡポリメラーゼにより伸長させて、ＲＮＡ／Ｄ
ＮＡハイブリッド伸長生成物を得る。 （３）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド伸長生成物のＲＮＡ
のみを特異的に分解するリボヌクレアーゼＨにより、Ｒ
ＮＡ／ＤＮＡハイブリッド伸長生成物からＲＮＡを分解
して、１本鎖ＤＮＡを得る； （４）該１本鎖ＤＮＡを鋳型として、配列表・配列番号
２、３または４記載の核酸配列のうち、少なくとも連続
した１５塩基からなる核酸配列を含み、かつ、その５’
末端側にプロモーター配列を有するサイトメガロウイル
ス（ＣＭＶ）核酸増幅用第２プライマーをハイブリダイ
ズさせ、ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼによりＤＮＡ伸
長反応を行って、５’末端上流に機能可能なプロモータ
ー配列を有する２本鎖ＤＮＡ中間体を生成させる；（こ
こで第１プライマーまたは第２プライマーの核酸配列は
標的核酸配列に対して十分に相補的または相同であり、
第１プライマーの３’末端は相補的鎖上の第２プライマ
ーの３’末端に向けられている） （５）該２本鎖ＤＮＡ中間体から、前記プロモーター配
列を認識することができるＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラー
ゼにより１本鎖ＲＮＡ（−）のコピーを増加ささせる； （６）上記工程で得られた１本鎖ＲＮＡ（−）を鋳型と
して、配列表・配列番号１記載の核酸配列のうち、少な
くとも連続した１５塩基からなる核酸配列を含み、か
つ、その５’末端側にプロモーター配列を有するサイト
メガロウイルス（ＣＭＶ）核酸増幅用第２プライマーを
ハイブリダイズさせ、ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼに
よりＤＮＡ伸長反応を行って、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリ
ッド伸長生成物を得る； （７）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド伸長生成物のＲＮＡ
のみを特異的に分解するリボヌクレアーゼＨにより、Ｒ
ＮＡ／ＤＮＡハイブリッド伸長生成物からＲＮＡを分解
して、１本鎖ＤＮＡを得る； （８）該１本鎖ＤＮＡを鋳型として、配列表・配列番号
２、３または４記載の核酸配列のうち、少なくとも連続
した１５塩基からなる核酸配列を含み、かつ、その５’
末端側にプロモーター配列を有するサイトメガロウイル
ス（ＣＭＶ）核酸増幅用第１プライマーをハイブリダイ
ズさせ、ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼによりＤＮＡ伸
長反応を行って、５’末端上流に機能可能なプロモータ
ー配列を有する２本鎖ＤＮＡ中間体を生成させる； （９）該２本鎖ＤＮＡ中間体から、前記プロモーター配
列を認識することができるＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラー
ゼにより１本鎖ＲＮＡ（−）のコピーを増加させる；そ
して （１０）必要により、得られた１本鎖ＲＮＡ（−）を鋳
型として、前記（６）〜（９）を繰り返す。
【００１８】本発明は、配列表・配列番号５、６および
／または７記載の核酸配列または相補的な核酸配列のう
ち、少なくとも連続した１５塩基からなる核酸配列また
は該核酸配列が必要により修飾されていることを特徴と
するＣＭＶ核酸検出プローブおよび／または捕捉プロー
ブである。
【００１９】また、本発明は上記サイトメガロウイルス
（ＣＭＶ）の核酸配列を増幅するための試薬キットに、
さらに、配列表・配列番号５、６および／または７記載
の核酸配列または相補な核酸配列のうち、少なくとも連
続した１５残基からなる核酸配列または該核酸配列が必
要により修飾されているＣＭＶ核酸検出プローブおよび
／または捕捉プローブを含むことを特徴とするサイトメ
ガロウイルス（ＣＭＶ）の核酸配列を検出するための試
薬キットである。
【００２０】さらに、本発明は上記サイトメガロウイル
ス（ＣＭＶ）増幅方法にて増幅されたＲＮＡ（−）のコ
ピーを、配列表・配列番号５、６および／または７記載
の核酸配列または相補的な核酸配列のうち、少なくとも
連続した１５残基からなる核酸配列または該核酸配列が
標識で修飾されているＣＭＶ検出プローブおよび／また
は必要により修飾されている捕捉プローブを用いて検出
することを特徴とする核酸配列（β２．７）を利用した
サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）核酸の検出方法であ
る。
【００２１】また、本発明は上記サイトメガロウイルス
（ＣＭＶ）増幅方法にて増幅されたＲＮＡ（−）のコピ
ーを、固相担体に吸着または結合した、配列表・配列番
号５、６および／または７記載の核酸配列のうち、少な
くとも連続した１５残基からなる核酸配列が必要により
修飾された捕捉プローブおよび配列表・配列番号５、６
および／または７記載の核酸配列のうち、少なくとも連
続した１５残基からなる核酸配列が標識で修飾された検
出プローブをハイブリダイズさせ、未反応の検出プロー
ブを分離し、捕捉プローブ、ＲＮＡ（−）のコピーおよ
び検出プローブの複合体の標識を測定することを特徴と
する核酸配列（β２．７）を利用したサイトメガロウイ
ルス（ＣＭＶ）核酸の検出方法である。
【００２２】以下に、本発明で使用される用語について
説明する。「プロモーター配列」とは、ＤＮＡ依存ＲＮ
Ａポリメラーゼが特異的に結合する核酸配列である。Ｄ
ＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼは該プロモーター配列に特
異的に結合し、プロモーター配列よりも下流のＤＮＡ配
列と相同なＲＮＡを合成する。「ＤＮＡ依存ＲＮＡポリ
メラーゼを用いる核酸増幅法」とは、標的核酸（ＤＮ
Ａ）から２本鎖ＤＮＡを合成する際に用いるプライマー
に、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ配列のプロモーター
配列を含有させることにより、２本鎖ＤＮＡ合成に引き
続き、合成された２本鎖ＤＮＡを鋳型とし、ＤＮＡ依存
ＲＮＡポリメラーゼによって、標的核酸（ＤＮＡ）に相
当するＲＮＡを合成する。さらに、合成されたＲＮＡか
らＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによってＤＮＡ／Ｒ
ＮＡハイブリッド鎖を合成し、このハイブリッド鎖のＲ
ＮＡ鎖を分解し、１本鎖のＤＮＡを得る。このようにし
て得た１本鎖ＤＮＡと上記プロモーター配列を含有する
プライマーによって、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼの
プロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡ合成を行い、ＲＮ
Ａを合成するＲＮＡ転写反応を行う方法である。
【００２３】「ＮＡＳＢＡ法」とは、標的核酸（ＲＮ
Ａ）からＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ配列のプロモー
ター配列を含有するプライマーにより、ＲＮＡ／ＤＮＡ
ハイブリッド鎖を合成し、このハイブリッド鎖のＤＮＡ
鎖をリボヌレアーゼＨにより分解する。残ったＲＮＡか
らプライマーおよびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼに
よってＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド鎖を合成し、このハ
イブリッド鎖のＲＮＡ鎖をリボヌクレアーゼＨにより分
解し、１本鎖のＤＮＡを得る。このようにして得た一本
鎖ＤＮＡと上記プロモーター配列を含有するプライマー
によって、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼのプロモータ
ー配列を含む２本鎖ＤＮＡ合成を行い、ＲＮＡを合成す
るＲＮＡ転写反応を行う方法である。この方法は標的核
酸（ＤＮＡ）をＲＮＡに転写してから、上記方法を実施
することも含む。このＮＡＳＢＡ法は複製ＲＮＡベース
のＤＮＡの分離の方法において、リボヌレアーゼＨを用
いることを特徴とする。この方法によれば、ＤＮＡ依存
ＲＮＡポリメラーゼにより、１分子の２本鎖核酸（ＤＮ
Ａ）から数十から数千分子のＲＮＡを転写でき、ＰＣＲ
法に比べ、１サイクルあたりの核酸増幅効率が高い。ま
たリボヌクレアーゼＨを用いることで、ＰＣＲ法の際、
必要であった温度サイクルが不要であり、より簡便に核
酸（ＲＮＡ）を増幅することが可能である。
【００２４】「修飾」とは、オリゴヌクレオチド中の少
なくとも１つのヌクレオチドに他のヌクレオチドを付加
または置換することを意味する。付加とはビオチン、リ
ンカーアーム、蛍光物質等を有するヌクレオチド、オリ
ゴｄＧＴＰ、オリゴｄＡＴＰ、オリゴｄＴＴＰ、オリゴ
ｄＣＴＰ等をオリゴヌクレオチド配列の５’末端または
３’末端に結合することである。置換とはビオチン、リ
ンカーアーム、蛍光物質等を有するヌクレオチドをオリ
ゴヌクレオチド中の少なくとも１つのヌクレオチドの替
わりに導入することである。また、オリゴヌクレオチド
の合成後に放射性物質や酵素、蛍光物質など公知の標識
を導入することも含まれる。「標識」とは、放射性物
質、酵素または蛍光物質など、それ自体で検出可能な物
質をいう。また、このような検出可能な物質を結合する
ことが可能な物質も包含される。
【００２５】
【発明の実施態様】本発明の検出しようとする標的核酸
は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。２本鎖の
場合や１本鎖であっても高次構造をとっているような場
合は、予め加熱、酸、アルカリ等の変性処理により１本
鎖として増幅反応に供する。また、標的核酸がタンパク
質、脂質や糖質等の混合物中または生体試料中に存在す
る場合、常法に従い、標的核酸を抽出後、本発明の増幅
および検出に利用できる。具体的な抽出方法としては、
試料にプロテイナーゼや界面活性剤等を含む溶液を加
え、約３０分間インキュベート後、得られる溶液をフェ
ノールやクロロホルム等で抽出し、エタノール沈殿して
核酸を得ればよい。また、別の方法として、Boomらの方
法（J. Clin. Microbiol. 28:495-503）を用いても良
い。例えばＣＭＶ（AD 169株）感染細胞の培養細胞液を
トリトンＸ−１００とグアニジウムチオシアネート（Ｇ
ｕＳＣＮ）を含む溶解用緩衝液中で処理後、シリカを添
加し、ｍＲＮＡを吸着させる。次いでｍＲＮＡ吸着シリ
カをＧｕＳＣＮを含む洗浄用緩衝液で２〜３回洗浄後、
アセトンでＧｎＳＣＮを除去し、乾燥させる。溶出はリ
ボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）やデオキシリボヌクレア
ーゼ（ＤＮａｓｅ）を含まない蒸留水で行う。溶出液
は、同蒸留水で段階希釈してもよい。
【００２６】本発明の増幅用プライマーは、配列表・配
列番号１記載の核酸配列のうち、少なくとも連続した１
５塩基対からなる核酸配列または配列表・配列番号２、
３または４記載の核酸配列のうち、少なくとも連続した
１５塩基対からなる核酸配列を含む。本発明の捕捉プロ
ーブまたは検出プローブは、配列表・配列番号５、６ま
たは７記載の核酸配列のうち、少なくとも連続した１５
塩基対からなる核酸配列または該核酸配列が必要により
修飾されている。図１に、標的核酸配列（ＣＭＶ核酸の
β２．７遺伝子）と配列表・配列番号１〜７に記載され
る塩基配列の位置関係を示す。
【００２７】本発明において使用するＣＭＶ増幅用第１
プライマーは、標的核酸配列に対して十分に相補的な核
酸配列およびその５’末端側にプロモーター配列を有す
る。また、ＣＭＶ増幅用第２プライマーは標的核酸配列
に対して十分に相同な核酸配列であって、その３’末端
は、相補的鎖上の第１プライマーの３’末端に向けられ
ている。捕捉プローブまたは検出プローブは、ＣＭＶ増
幅用第１プライマーと第２プライマーのいかなる組合せ
における増幅産物ともハイブリダイズできるように設定
されている。
【００２８】本発明のＣＭＶ増幅用プライマーは、デオ
キシリボ核酸（ＤＮＡ）でよく、化学合成により調製で
きる。例えばパーキン・エルマー社のＤＮＡシンセサイ
ザー３９１型を用いてホスホアミダイト法により合成で
きる。各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水
で実施する。精製はＦＰＬＣで逆相カラムにて実施して
も良い。他の合成方法としてリン酸トリエステル法、Ｈ
−ホスホネート法、チオホスファイト法等がある。ま
た、標的核酸配列に変異がある場合や他の増幅領域や他
の近縁ウイルスとの共通増幅を目的とする場合、プライ
マー中に欠失、挿入あるいは置換といった点突然変異が
あってもよい。本発明のプライマーは合成物であるか
ら、容易に、かつ大量に一定品質のオリゴヌクレオチド
を得ることが可能である。
【００２９】本発明において使用するＣＭＶ増幅用第１
プライマーのプロモーター配列は特に制限はないが、Ｄ
ＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼが作用するように機能する
必要がある。このようなプロモーター配列として、例え
ば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼならば、 5'-AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG G-3' が知られている。また、プロモーター配列は、複製開始
点までのスペーサーを含んでいても良い。例えば、 5'-AGG A-3' などの配列を必要によりその一部分をプロモーター配列
の３’末端に結合しても良い。その他のプロモーター配
列としては、以下のものがある。Ｔ３ＲＮＡポリメラー
ゼならば、 5'-ATT AAC CCT CAC TAA AG-3' ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼならば、 5'-ATT TAG GTG ACA CTA TA-3'
【００３０】また、本発明におけるＣＭＶ増幅用第２プ
ライマーは、第１プライマー伸長物の核酸配列に対して
相補的な核酸配列を有し、標的核酸配列に対して十分に
相同である。第２プライマーは第１プライマー伸長物の
核酸配列に対して相補的な核酸配列に加えて、必要によ
りその５’末端側にプロモーター配列を有していても良
い。第２プライマーがプロモーター配列を有している場
合、第１プライマーのプロモーター配列と異なっていて
も同一であっても良い。異なる場合には、それぞれのプ
ロモーターに作用するＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ
を必要により複数用いる。たとえば、第２プライマーの
プロモーター配列にＴ７プロモーターを用いる場合には
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを、Ｔ３プロモーターを用いる
場合にはＴ３ＲＮＡポリメラーゼを、ＳＰ６プロモータ
ーを用いる場合にはＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼを用い
る。
【００３１】用いるＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼと付
随するプロモーター配列は上記の三種が好ましいが、こ
れらに限定されない。特に好ましくは、Ｔ７ＲＮＡポリ
メラーゼとそのプロモーター配列を使用するのが好まし
い。さらに好ましくは、第２プライマーがプロモーター
配列を有している場合、第１プライマーも第２プライマ
ーもＴ７ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を結合
せしめ、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いてコピー数を増
加させるのがよい。
【００３２】第１プライマーと第２プライマーの標的核
酸配列、相補配列またはそれぞれのプライマーの伸長物
とハイブリダイズする領域は、配列表の各配列の連続し
た少なくとも１５塩基からなる核酸配列が必要である。
Fahyらの報告によれば（PCR methods and Applications
1991;1:p25-33)、ＮＡＳＢＡ法と同等の技術である３
ＳＲ法では１５塩基から３０塩基が好ましいとの報告が
ある。従って、標的核酸配列の調製法やＲＮＡポリメラ
ーゼを用いる増幅法の実施条件により、１５塩基から３
０塩基の間で最適配列および最適配列長を選択すればよ
い。好ましくは、３’末端側の配列が、配列表に示す配
列の連続した少なくとも１５塩基からなる核酸配列であ
ることが望ましい。ハイブリダイズする領域の理想的な
長さは、１５塩基から配列表に示した全配列長が好まし
く、さらに好ましくは全配列長である。
【００３３】本発明において、増幅用プライマーとして
は、下記の組み合わせがある。
【００３４】
【表１】
【００３５】本発明において使用するＲＮＡ依存ＤＮＡ
ポリメラーゼ（逆転写酵素）は、オリゴデオキシリボヌ
クレオチド・プライマーおよびＲＮＡ鋳型からＤＮＡを
合成しうる酵素をいう。さらに、この酵素はＤＮＡ依存
ＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡポリメラーゼ）およびリボ
ヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）活性を含み得る。この
ような酵素としては、トリ筋芽細胞ウイルスポリメラー
ゼ（ＡＭＶ逆転写酵素）、Ｍａｌｏｎｅｙネズミ白血病
ウイルスのような別のレトロウイルス由来のものがあ
る。また、耐熱性ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ（逆転
写酵素）としては、サーマス・サーモフィラース(Therm
us thermophilus)、サーマス・アクアティカス(Thermus
aquaticus) 由来のＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼにも
該酵素活性があることが知られている。
【００３６】本発明において使用するリボヌクレアーゼ
Ｈ（ＲＮａｓｅＨ）は相補的なＤＮＡにアニーリングさ
れているＲＮＡを加水分解し得る酵素をいう。この酵素
は１本鎖または２本鎖ＲＮＡまたは全てのＤＮＡを加水
分解し得るべきではない。好ましい酵素としては、大腸
菌由来のＲＮａｓｅＨ、ウシ胸腺由来のＲＮａｓｅＨな
どが挙げられる。また、耐熱性ＲＮａｓｅＨとしては、
サーマス・サーモフィラス(Thermus thermophilus)由来
のＲＮａｓｅＨなどが挙げられる。さらに、サーマス・
サーモフィラス(Thermus thermophilus)由来のＤＮＡ依
存ＤＮＡポリメラーゼにもＲＮａｓｅＨ活性があること
が見いだされ、該酵素を使用することにより、耐熱性Ｒ
ＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）と耐熱性Ｒ
ＮａｓｅＨに代えて、１種の物質（酵素）でもって、３
種の酵素活性を利用することが可能となる。
【００３７】本発明において使用するＤＮＡ依存ＤＮＡ
ポリメラーゼ（ＤＮＡポリメラーゼ）は、オリゴデオキ
シリボヌクレオチド・プライマーおよびＤＮＡ鋳型から
ＤＮＡを合成しうる酵素をいう。このような酵素として
は、例えばＡＭＶ逆転写酵素、ウシ胸腺のような哺乳動
物組織から単離されたＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌由来
のＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、バクテリオフ
ァージＴ７由来のＤＮＡポリメラーゼなどがある。ま
た、サーマス・サーモフィラス(Thermus thermophilu
s)、サーマス・アクアティカス(Thermus aquaticus) 、
ピロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus) 、サ
ーモコッカス・リトラリス(Thermococcus litoralis)由
来のＤＮＡポリメラーゼなどが挙げられる。
【００３８】本発明において使用するＤＮＡ依存ＲＮＡ
ポリメラーゼ（ＲＮＡポリメラーゼ）としては、プロモ
ーター配列に結合し、このプロモーター配列の近傍に規
定されている開始部位において、ＲＮＡの合成を特異的
に開始し得る酵素である。該酵素は鋳型に機能的なコピ
ー１つ当たりいくつかのＲＮＡコピーを適度な時間内に
合成し得る。好ましい酵素としては、バクテリオファー
ジＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ、ファージＴ３、ファージ
ＸＩＩ、サルモネラファージｓｐ６またはシュードモナ
ス(Pseudomonas) ファージｇｈ−１のような他のバクテ
リオファージＲＮＡポリメラーゼなどを挙げることがで
きる。また、他の原核細胞または真核細胞由来のＲＮＡ
ポリメラーゼを使用することもできる。例えばサーマス
・サーモフィラス(Thermus thermophilus)、サーマス・
アクアティカス(Thermus aquaticus) 由来のＤＮＡポリ
メラーゼにはＲＮＡポリメラーゼ活性が存在することが
知られており、両活性をもつ１種のＤＮＡポリメラーゼ
を共通に用いることも可能である。
【００３９】本発明を用いてＮＡＳＢＡ法を行う場合
は、文献（J. Virol. Methods 35:273-286）等を参考に
実施すればよい。例えば、２５μｌの反応系において酵
素添加後の終濃度が４０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．
５）；２０ｍＭ ＭｇＣｌ2 ；４０ｍＭ ＫＣｌ；５ｍ
Ｍ ＤＴＴ；１５％ ＤＭＳＯ； １ｍＭ ｄＮＴＰ；
４．１ｍＭ ｒＴＮＰ；０．２μＭ 第１プライマー；
０．２μＭ 第２プライマーになるよう設定し、抽出さ
れたＲＮＡと混ぜて、６５℃で５分間加熱する。続い
て、２．５μｇＢＳＡ、１２Ｕ ＲＮＡ Ｇｕａｒｄ、
２０Ｕ Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、４Ｕ ＡＭＶ逆転写
酵素、０．２Ｕ大腸菌由来リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａ
ｓｅＨ）を添加し、２５μｌとし、３時間インキュベー
トすればよい。この増幅条件において、標的核酸配列の
抽出方法や抽出時の条件等により、プライマーの配列を
変更する必要が生じる場合がある。その場合には、上記
条件中、ＤＭＳＯ濃度やｒＮＴＰ濃度等を最適化すれば
よい。
【００４０】本発明で使用する検出プローブまたは捕捉
プローブは、配列表の配列番号５、６または７に示す核
酸配列の連続した少なくとも１８塩基からなる核酸配列
が必要がある。検出プローブまたは捕捉プローブは、増
幅用プライマーと同じくデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）で
よく、化学合成により調製できる。例えばパーキン・エ
ルマー社のＤＮＡシンセサイザー３９１型を用いてホス
ホアミダイト法により合成できる。脱保護はアンモニア
水で実施する。精製はＦＰＬＣでＭＯＮＯ−Ｑカラムや
逆相カラムにて実施しても良い。他の合成方法としてリ
ン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法、チオホスフ
ァイト法等がある。
【００４１】また、オリゴヌクレオチドの合成時にビオ
チン、リンカーアーム、蛍光物質等を有するヌクレオチ
ドまたはオリゴｄＧＴＰ、オリゴｄＡＴＰ、オリゴｄＴ
ＴＰまたはオリゴｄＣＴＰ等を５’末端または３’末端
に付加しても良い。または、ビオチン、リンカーアー
ム、蛍光物質等を有するヌクレオチドをオリゴヌクレオ
チド中のヌクレオチドの替わりに置換して合成しても良
い。さらに、合成したヌクレオチドに、後から放射性物
質や酵素、蛍光物質など公知の標識を導入しても良い。
このような標識化の例としては、オリゴヌクレオチドを
酵素標識する場合、リンカーアームを有するヌクレオチ
ドをデオキシウリジンから化学合成し、オリゴヌクレオ
チドの一員として置換または付加し（特開昭60-500717
号公報）、アルカリホスファターゼやパーオキシダーゼ
をリンカーに結合させればよい（Nucleic Acids Resear
ch; 14巻6115頁1986年）。また、標的核酸配列や増幅産
物に変異がある場合、プローブ中に欠失、挿入あるいは
置換などの点突然変異があってもよい。
【００４２】本発明の検出プローブは、前記の方法で酵
素、ビオチン、蛍光物質、放射性物質等の標識または該
標識を結合しうる物質により修飾を受けている必要があ
る。そして、それぞれの標識の特性を利用して検出操作
を実施すればよい。１つの検出法では、ＣＭＶ由来の標
的核酸配列からの増幅産物をアガロースゲル電気泳動
後、サザンブロット法により核酸を膜に固定し、標識で
修飾された検出プローブとハイブリダイゼーションを行
い、標識の性質に応じた検出操作を行えば良い。また、
増幅産物を膜上にそのまま固定し、アルカリ変性後、上
記の方法で検出操作を行っても良い。
【００４３】また、別の検出法として、検出プローブと
捕捉プローブを使用したサンドイッチ検出法がある。検
出プローブは前述のように酵素、ビオチン、蛍光物質、
放射性物質等の標識または該標識を結合し得る物質によ
り修飾を受けている必要がある。そして、捕捉プローブ
は、担体に吸着されれば、未修飾のままでも構わない
が、担体の性質に合わせてビオチン、リンカーアーム、
蛍光物質等を有するヌクレオチドを付加または置換、あ
るいはオリゴｄＧＴＰ、オリゴｄＡＴＰ、オリゴｄＴＴ
Ｐ、オリゴｄＣＴＰ等を付加すればよい。実際的な方法
としては、液相で標的核酸、検出プローブおよび担体に
捕捉が可能な修飾を施した捕捉プローブを反応させた
後、担体に結合した捕捉剤で、この修飾された捕捉プロ
ーブを捕捉する液相サンドイッチ法（特開昭61-195699
号公報、同61-274699 号公報、同62-229068 号公報、特
開平1-104200号公報、同1-501399号公報等）；担体に直
接結合した捕捉プローブと標識または標識と結合しうる
物質で修飾した検出プローブを用いる固相サンドイッチ
法（特開昭60-188100号公報、同60-188397 号公報、同6
1-264240 号公報、同62-81564号公報等）等を用いても
よい。特に好ましくは、リンカーアームを含有した捕捉
プローブを固相に固定化し（特開平6-329694号公報）、
増幅産物と検出プローブをハイブリダイゼーションさせ
ることで検出をおこなえばよい。
【００４４】
【発明の効果】本発明のＮＡＳＢＡ法に適した増幅用プ
ライマーと、該プライマーにより得られる増幅産物の判
定を行うための捕捉プローブおよび検出プローブを用い
れば、従来のＣＭＶの臨床検査方法の問題点を解決で
き、簡便、迅速、特異的且つ高感度にＣＭＶを検出可能
である。
【００４５】
【実施例】以下、本発明を実施例を用いて説明する。実施例１ （プライマーの合成）ＡＢＩ社ＤＮＡシンセサイザー 3
91型を用いて、ホスホアミダイト法にて配列表に示され
る配列、すなわち、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのプロモー
ター配列を５’末端に結合したサイトメガロウイルスの
ｍＲＮＡに相補的な配列を有する第１プライマー（配列
番号１）およびサイトメガロウイルスのｍＲＮＡに相同
な配列を有する第２プライマー（配列番号２、３、４）
を合成した。具体的な手法は、ＡＢＩ社マニュアルに従
い、０．２Ｍスケールで実施した。各種オリゴヌクレオ
チドの脱保護はアンモニア水で５５℃で一夜実施した。
精製はファルマシア社製ＦＰＬＣで逆相カラムにて実施
した。
【００４６】（ＣＭＶ培養液からＲＮＡの調製）Boomら
の手法（J. Clin. Microbiol. 28:495-503）に基づき、
ＣＭＶ（AD 169株）感染細胞からＲＮＡを調製した。す
なわち、培養細胞液をトリトンＸ−１００とグアニジウ
ムチオシアネート（ＧｕＳＣＮ）を含む溶解用緩衝液中
で処理後、シリカを添加し、ｍＲＮＡを吸着させた。ｍ
ＲＮＡ吸着シリカをＧｕＳＣＮを含む洗浄用緩衝液で２
〜３回洗浄後、アセトンでＧｎＳＣＮを除去し、乾燥さ
せた。溶出はリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）やデオキ
シリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）を含まない蒸留水で
行った。溶出液は、同蒸留水で段階希釈した。
【００４７】（検出用プローブの調製） （１）リンカーアームを有するＣＭＶ検出オリゴヌクレ
オチドの合成 ＡＢＩ社ＤＮＡシンセサイザー 391型を用いて、ホスホ
アミダイト法にて配列表に示される核酸配列、すなわ
ち、検出プローブ（配列番号５、６、７）を合成した。
この際、特表昭60-500717号公報に掲載された合成法に
より、デオキシウリジンから化学合成した５位にリンカ
ーアームを有するウリジンを上記オリゴヌクレオチドに
導入した。このウリジンはオリゴヌクレオチド内に任意
のＴと置換しうるが、この実施例においては５’末端に
結合した。合成されたリンカーオリゴヌクレオチドの脱
保護はアンモニア水で５５℃で一夜実施した。精製はフ
ァルマシア社製ＦＰＬＣで逆相カラムにて実施した。
【００４８】（２）リンカーオリゴヌクレオチドのアル
カリホスファターゼによる標識化 上記リンカーオリゴヌクレオチドのリンカー部位を介し
て、アルカリホスファターゼを文献（Nucleic Acids Re
search, vol.14, p.6114, 1986）に従って結合した。リ
ンカーオリゴヌクレオチド１．５Ａ260 を０．２Ｍ Ｎ
ａＨＣ０3 １２．５μｌに溶解し、ここへ１０ｍｇスベ
リン酸スクシニミジル（ＤＳＳ）２５μｌを加えて、室
温で２分間反応させた。反応液を１ｍＭ ＣＨ3 ＣＯＯ
Ｎａ（ｐＨ５．０）で平衡化したセファデックスＧ−２
５カラムでゲル濾過して過剰のＤＳＳを除去した。
【００４９】末端のアミノ基が活性化されたリンカーオ
リゴヌクレオチドを、さらにモル比で２倍量のアルカリ
ホスファターゼ (100mM NaHCO3, 3M HClに溶解したも
の）と室温で１６時間反応させることにより、アルカリ
ホスファターゼ標識プローブを得た。得られた標識プロ
ーブはファルマシア製ＦＰＬＣで陰イオン交換カラムを
用いて精製した標識プローブを含む画分を集め、セント
リコン３０Ｋ（アミコン社）を用いて限外濾過法により
濃縮した。
【００５０】（増幅反応）増幅反応は文献（J. Virol.
Methods 35:273-286）に基づき実施した。すなわち、２
５μｌの反応系において酵素添加後の終濃度が４０ｍＭ
Ｔｒｉｓ (pH8.5)；２０ｍＭ ＭｇＣｌ2 ；４０ｍＭ
ＫＣｌ；５ｍＭ ＤＴＴ；１５％ ＤＭＳＯ；１ｍＭ
ｄＮＴＰ；４．１ｍＭ ｒＮＴＰ；０．２μＭ 第１
プライマー；０．２μＭ 第２プライマーになるよう設
定し、抽出したＲＮＡと混ぜて、６５℃で５分間加熱し
た。２．５μｇＢＳＡ、１２Ｕ ＲＮＡ Ｇｕａｒｄ、
２０Ｕ Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、４Ｕ ＡＭＶ逆転写
酵素、０．２Ｕ リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）
を添加して２５μｌとし、３時間インキュベートした。
【００５１】（検出）反応溶液１μｌをナイロン膜に滴
下後、アルカリ性条件下で核酸を固定した。この膜を中
和後、アルカリ性条件下で固定した。この膜を中和後、
ハイブリダイゼーションバックに移し、上記アルカリフ
ォスファターゼ標識核酸プローブを含むハイブリダイゼ
ーションバッファー(5×SSC, 0.5%BSA, 0.5%PVP, 1%SD
S) を加えて、５０℃で１５分間ハイブリダイゼーショ
ンを行った。ナイロン膜をポリバックから取り出し、洗
浄液１(1×SSC, 1%SDS) で５０℃、１０分間浸透洗浄し
た。さらに洗浄液２(1×SSC)で室温１０分間浸透洗浄し
た。膜を新しいハイブリダイゼーションバックに移し、
基質液 (0.1M Tris, 0.1M NaCl, 0.1M MgCl2, 0.3MMgCl
2, ニトロブルーテトラゾリウム、0.3mg/mlブロムクロ
ロフェニルホスフェート、pH7.5)を入れ、シール後、３
７℃で３０分間インキュベートした。
【００５２】（結果）各プライマーとプローブの組合せ
を検討した結果を図２に示す。第１プライマーとして配
列表・配列番号１の配列を用いて、第２プライマーとし
て配列表・配列番号３、４の配列を用いたときが、検出
感度が最も高かった。第２プライマーとして配列番号２
の配列を用いるときは検出感度は低いが、ＣＭＶの検出
においては病態との関連もあり、低感度が好ましい場合
がある。従って、必要な検出感度に合わせて、最適な組
合せを選択すればよい。
【００５３】実施例２ （プライマーの合成）ＡＢＩ社ＤＮＡシンセサイザー 3
91型を用いて、ホスホアミダイト法にて配列表に示され
る配列、すなわち、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのプロモー
ター配列（AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAG GA
）を５’末端に結合したサイトメガロウイルスのｍＲ
ＮＡに相補的な配列を有する第１プライマー（配列番号
１）とサイトメガロウイルスのｍＲＮＡに相同な配列を
有する第２プライマー（配列番号４）を合成した。具体
的な手法はＡＢＩ社マニュアルに従い、０．２Ｍスケー
ルで実施した。各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアン
モニア水で５５℃で一夜実施した。精製はファルマシア
社製ＦＰＬＣで逆相カラムにて実施した。
【００５４】（捕捉用プローブの合成）ＡＢＩ社ＤＮＡ
シンセサイザー 391型を用いて、ホスホアミダイト法に
て配列表に示される配列、すなわち、捕捉用プローブ
（配列番号５、６、７）を合成した。この際、特表昭60
-500717 号公報に掲載された合成法により、デオキシウ
リジンから化学合成した５位にリンカーアームを有する
ウリジンを上記オリゴヌクレオチドに導入した。このウ
リジンはオリゴヌクレオチド内に任意のＴと置換しうる
が、この実施例においては５’末端に結合した。合成さ
れたリンカーオリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア
水で５５℃で一夜実施した。精製はファルマシア社製Ｆ
ＰＬＣで逆相カラムにて実施した。
【００５５】（捕捉プローブの固相担体への結合）固相
担体として、ポリスチレン製のマイクロタイタープレー
ト（マイクロライト２、ダイナテック社）を用いた。捕
捉プローブを５０ｍＭホウ酸緩衝液で１０ｐｍｏｌｅ／
ｍｌに希釈した。その溶液をマイクロタイタープレート
のウェルの１００μｌずつ分注し、室温で一夜インキュ
ベートした。得られたプレートから捕捉プローブ溶液を
アスピレーターで除き、非特異的結合を避けるためにブ
ロックバッファーを１５０μｌずつ分注し、室温で２時
間放置しブロックした。
【００５６】（増幅反応）標的核酸は、実施例１で用い
た核酸段階希釈液の１／１０００希釈液を使用した。標
的核酸は実施例１と同じ方法を用いて増幅反応を行っ
た。
【００５７】（サンドイッチハイブリダイゼーション法
による検出）得られた増幅産物を等量の０．６Ｎ Ｎａ
ＯＨを加え、室温で１分間変性させた。捕捉プローブ結
合プレートよりブロックバッファーを除き、変性させた
試料１０μｌを添加した。次にハイブリダイゼーション
緩衝液を１００μｌ加え、５０℃で６０分間ハイブリダ
イゼーションを行った。溶液をウェルからから除き、洗
浄液１(2×SSC, 1% ラウリル硫酸ナトリウム）を２００
μｌ加えて、５０℃で５分間洗浄した。続いて洗浄液１
を除き、２００μｌの１×ＳＳＣでウェル内をすすぎ、
アルカリ性ホスファターゼ標識プローブ溶液１００μｌ
を加え、５０℃で６０分間ハイブリダイゼーションを行
った。プローブ溶液をウェルから除き、洗浄液１を２０
０μｌ加えて、５０℃で１０分間洗浄し、次に洗浄液２
(1×SSC,0.5% Triton X-100）を２００μｌ加え、室温
で１０分間洗浄した。最後に１×ＳＳＣを２００μｌ加
えて、ウェル内をすすいだ後、アルカリ性フォスファタ
ーゼの基質である化学発光物質、Lumiphos 480（和光純
薬社）を１００μｌ加え、３７℃、暗所で１５分間発光
反応を行った。発光量は、マイクロライト１０００（ダ
イナテック社）で測定した。
【００５８】（効果）各検出プローブと捕捉プローブの
組合せを検討した（表２）。各組合わせにより検出量に
差はあるものの、全ての組合せで増幅産物が検出でき
た。最も高い検出感度を示したのは、配列番号５を捕捉
プローブとし、配列番号７を検出プローブにした場合で
あった。低検出値を必要とする検出系では、検出値の低
い組合せを用いればよい。つまり、必要な検出感度に合
わせて、最適な組合せを選択すればよい。
【００５９】
【表２】
【００６０】
【配列表】
配列番号：１ 配列の長さ：27 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の特徴：サイトメガロウイルスのｍＲＮＡに相補的
な配列を有する。 配列： GGGAATCGTC GACTTTGAAT TCTTCGA 27
【００６１】配列番号：２ 配列の長さ：25 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の特徴：サイトメガロウイルスのｍＲＮＡに相同な
配列を有する。 配列： GTCCCGACTA CCATCAGCAG TACCA 25
【００６２】配列番号：３ 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の特徴：サイトメガロウイルスのｍＲＮＡに相同な
配列を有する。 配列： GGCCGGTCGG CTTCTGTTTT ATTA 24
【００６３】配列番号：４ 配列の長さ：25 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の特徴：サイトメガロウイルスのｍＲＮＡに相同な
配列を有する。 配列： TCCTTTCCTT AATCTCGGAT TATCA 25
【００６４】配列番号：５ 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の特徴：サイトメガロウイルスのｍＲＮＡに相同な
配列を有する。 配列： TTCCCTCTCC TACCTACCAC GAA 23
【００６５】配列番号：６ 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の特徴：サイトメガロウイルスのｍＲＮＡに相同な
配列を有する。 配列： CGCAGATGAT AAACAAGAGG GTAA 24
【００６６】配列番号：７ 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の特徴：サイトメガロウイルスのｍＲＮＡに相同な
配列を有する。 配列： ACAGACATTT GGGTACCTCA GCTT 24
【図面の簡単な説明】
【図１】増幅用第１プライマー、増幅用第２プライマ
ー、検出プローブおよび捕捉プローブの位置関係を示す
図である。
【図２】各プライマーと各プローブの組合せの検討結果
を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 山西 弘一 大阪府豊能郡豊能町光風台２−１−21 (72)発明者 近藤 一博 大阪市平野区平野宮町１−８−３−164 (72)発明者 多屋 馨子 吹田市山田東１−１−31−205

Claims (13)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 配列表・配列番号１記載の核酸配列のう
    ち、少なくとも連続した１５塩基からなる核酸配列を含
    むことを特徴とする核酸配列（β２．７）を利用したサ
    イトメガロウイルス（ＣＭＶ）核酸増幅用オリゴヌクレ
    オチド。
  2. 【請求項２】 配列表・配列番号２、３または４記載の
    核酸配列のうち、少なくとも連続した１５塩基からなる
    核酸配列を含むことを特徴とする核酸配列（β２．７）
    を利用したサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）核酸増幅用
    オリゴヌクレオチド。
  3. 【請求項３】 請求項１または２記載のサイトメガロウ
    イルス（ＣＭＶ）増幅用オリゴヌクレオチドの５’末端
    に、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列
    が結合していることを特徴とする核酸配列（β２．７）
    を利用したサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）核酸増幅用
    オリゴヌクレオチド。
  4. 【請求項４】 配列表・配列番号１記載の核酸配列のう
    ち、少なくとも連続した１５塩基からなる核酸配列を含
    むサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）核酸増幅用オリゴヌ
    クレオチドおよび配列表・配列番号２、３または４記載
    の核酸配列のうち、少なくとも連続した１５塩基からな
    る核酸配列を含むサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）核酸
    増幅用オリゴヌクレオチドであって、少なくとも１つの
    該オリゴヌクレオチドの５’末端に、ＤＮＡ依存ＲＮＡ
    ポリメラーゼのプロモーター配列が結合していることを
    特徴とするサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）核酸増幅用
    オリゴヌクレオチド。
  5. 【請求項５】 サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の核酸
    配列を増幅するための試薬キットであって、（ａ）配列
    表・配列番号１記載の核酸配列のうち、少なくとも連続
    した１５塩基からなる核酸配列を含み、かつ、その５’
    末端側にプロモーター配列を有するサイトメガロウイル
    ス（ＣＭＶ）核酸増幅用第１プライマー、（ｂ）配列表
    ・配列番号２、３または４記載の核酸配列のうち、少な
    くとも連続した１５塩基からなる核酸配列を含むサイト
    メガロウイルス（ＣＭＶ）核酸増幅用第２プライマー、
    （ｃ）ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する物
    質、（ｄ）リボヌクレアーゼＨ活性を有する物質、
    （ｅ）ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する物
    質、（ｆ）ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する
    物質、（ｇ）リボヌクレオシドトリホスフェートおよび
    （ｈ）デオキシリボヌクレオシドトリホスフェートを含
    む試薬キット。
  6. 【請求項６】 サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の核酸
    配列を増幅するための試薬キットであって、（ａ）配列
    表・配列番号２、３または４記載の核酸配列のうち、少
    なくとも連続した１５塩基からなる核酸配列を含み、か
    つ、その５’末端側にプロモーター配列を有するサイト
    メガロウイルス（ＣＭＶ）核酸増幅用第１プライマー、
    （ｂ）配列表・配列番号１記載の核酸配列のうち、少な
    くとも連続した１５塩基からなる核酸配列を含むサイト
    メガロウイルス（ＣＭＶ）核酸増幅用第２プライマー、
    （ｃ）ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する物
    質、（ｄ）リボヌクレアーゼＨ活性を有する物質、
    （ｅ）ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する物
    質、（ｆ）ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する
    物質、（ｇ）リボヌクレオシドトリホスフェートおよび
    （ｈ）デオキシリボヌクレオシドトリホスフェートを含
    む試薬キット。
  7. 【請求項７】 サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の核酸
    配列を増幅するための試薬キットであって、（ａ）配列
    表・配列番号１記載の核酸配列のうち、少なくとも連続
    した１５塩基からなる核酸配列を含み、かつ、その５’
    末端側にプロモーター配列を有するサイトメガロウイル
    ス（ＣＭＶ）核酸増幅用第１プライマー、（ｂ）配列表
    ・配列番号２、３または４記載の核酸配列のうち、少な
    くとも連続した１５塩基からなる核酸配列を含み、か
    つ、その５’末端側にプロモーター配列を有するサイト
    メガロウイルス（ＣＭＶ）核酸増幅用第２プライマー、
    （ｃ）ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する物
    質、（ｄ）リボヌクレアーゼＨ活性を有する物質、
    （ｅ）ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する物
    質、（ｆ）ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する
    物質、（ｇ）リボヌクレオシドトリホスフェートおよび
    （ｈ）デオキシリボヌクレオシドトリホスフェートを含
    む試薬キット。
  8. 【請求項８】 下記工程（１）〜（１０）を含むことを
    特徴とする核酸配列（β２．７）を利用したサイトメガ
    ロウイルス（ＣＭＶ）核酸増幅方法。 （１）検体から必要によりＲＮＡ（＋）からなる標的核
    酸の抽出操作を行い、 （２）ＲＮＡ（＋）を鋳型として、配列表・配列番号１
    記載の核酸配列のうち、少なくとも連続した１５塩基か
    らなる核酸配列を含み、かつ、その５’末端側にプロモ
    ーター配列を有するサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）核
    酸増幅用第１プライマーをハイブリダイズさせ、ＲＮＡ
    依存ＤＮＡポリメラーゼにより伸長させて、ＲＮＡ／Ｄ
    ＮＡハイブリッド伸長生成物を得る。 （３）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド伸長生成物のＲＮＡ
    のみを特異的に分解するリボヌクレアーゼＨにより、Ｒ
    ＮＡ／ＤＮＡハイブリッド伸長生成物からＲＮＡを分解
    して、１本鎖ＤＮＡを得る； （４）該１本鎖ＤＮＡを鋳型として、配列表・配列番号
    ２、３または４記載の核酸配列のうち、少なくとも連続
    した１５塩基からなる核酸配列を含むサイトメガロウイ
    ルス（ＣＭＶ）核酸増幅用第２プライマーをハイブリダ
    イズさせ、ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼによりＤＮＡ
    伸長反応を行って、５’末端上流に機能可能なプロモー
    ター配列を有する２本鎖ＤＮＡ中間体を生成させる； （５）該２本鎖ＤＮＡ中間体から、前記プロモーター配
    列を認識することができるＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラー
    ゼにより１本鎖ＲＮＡ（−）のコピーを増加ささせる； （６）上記工程で得られた１本鎖ＲＮＡ（−）を鋳型と
    して、配列表・配列番号２、３または４記載の核酸配列
    のうち、少なくとも連続した１５残基からなる核酸配列
    を含むサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）核酸増幅用第２
    プライマーをハイブリダイズさせ、ＲＮＡ依存ＤＮＡポ
    リメラーゼによりＤＮＡ伸長反応を行って、ＲＮＡ／Ｄ
    ＮＡハイブリッド伸長生成物を得る； （７）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド伸長生成物のＲＮＡ
    のみを特異的に分解するリボヌクレアーゼＨにより、Ｒ
    ＮＡ／ＤＮＡハイブリッド伸長生成物からＲＮＡを分解
    して、１本鎖ＤＮＡを得る； （８）該１本鎖ＤＮＡを鋳型として配列表・配列番号１
    記載の核酸配列のうち、少なくとも連続した１５塩基か
    らなる核酸配列を含み、かつ、その５’末端側にプロモ
    ーター配列を有するサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）核
    酸増幅用第１プライマーをハイブリダイズさせ、ＤＮＡ
    依存ＤＮＡポリメラーゼによりＤＮＡ伸長反応を行っ
    て、５’末端上流に機能可能なプロモーター配列を有す
    る２本鎖ＤＮＡ中間体を生成させる； （９）該２本鎖ＤＮＡ中間体から、前記プロモーター配
    列を認識することができるＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラー
    ゼにより１本鎖ＲＮＡ（−）のコピーを増加させる；そ
    して （１０）必要により、得られた１本鎖ＲＮＡ（−）を鋳
    型として、前記（６）〜（９）を繰り返す。
  9. 【請求項９】 下記工程（１）〜（１０）を含むことを
    特徴とする核酸配列（β２．７）を利用したサイトメガ
    ロウイルス（ＣＭＶ）核酸増幅方法。 （１）検体から必要によりＲＮＡ（＋）からなる標的核
    酸の抽出操作を行い、 （２）ＲＮＡ（＋）を鋳型として、配列表・配列番号１
    記載の核酸配列のうち、少なくとも連続した１５塩基か
    らなる核酸配列を含み、かつ、その５’末端側にプロモ
    ーター配列を有するサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）核
    酸増幅用第１プライマーをハイブリダイズさせ、ＲＮＡ
    依存ＤＮＡポリメラーゼにより伸長させて、ＲＮＡ／Ｄ
    ＮＡハイブリッド伸長生成物を得る。 （３）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド伸長生成物のＲＮＡ
    のみを特異的に分解するリボヌクレアーゼＨにより、Ｒ
    ＮＡ／ＤＮＡハイブリッド伸長生成物からＲＮＡを分解
    して、１本鎖ＤＮＡを得る； （４）該１本鎖ＤＮＡを鋳型として、配列表・配列番号
    ２、３または４記載の核酸配列のうち、少なくとも連続
    した１５塩基からなる核酸配列を含み、かつ、その５’
    末端側にプロモーター配列を有するサイトメガロウイル
    ス（ＣＭＶ）核酸増幅用第２プライマーをハイブリダイ
    ズさせ、ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼによりＤＮＡ伸
    長反応を行って、５’末端上流に機能可能なプロモータ
    ー配列を有する２本鎖ＤＮＡ中間体を生成させる；（こ
    こで第１プライマーまたは第２プライマーの核酸配列は
    標的核酸配列に対して十分に相補的または相同であり、
    第１プライマーの３’末端は相補的鎖上の第２プライマ
    ーの３’末端に向けられている） （５）該２本鎖ＤＮＡ中間体から、前記プロモーター配
    列を認識することができるＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラー
    ゼにより１本鎖ＲＮＡ（−）のコピーを増加ささせる； （６）上記工程で得られた１本鎖ＲＮＡ（−）を鋳型と
    して、配列表・配列番号１記載の核酸配列のうち、少な
    くとも連続した１５塩基からなる核酸配列を含み、か
    つ、その５’末端側にプロモーター配列を有するサイト
    メガロウイルス（ＣＭＶ）核酸増幅用第２プライマーを
    ハイブリダイズさせ、ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼに
    よりＤＮＡ伸長反応を行って、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリ
    ッド伸長生成物を得る； （７）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド伸長生成物のＲＮＡ
    のみを特異的に分解するリボヌクレアーゼＨにより、Ｒ
    ＮＡ／ＤＮＡハイブリッド伸長生成物からＲＮＡを分解
    して、１本鎖ＤＮＡを得る； （８）該１本鎖ＤＮＡを鋳型として、配列表・配列番号
    ２、３または４記載の核酸配列のうち、少なくとも連続
    した１５塩基からなる核酸配列を含み、かつ、その５’
    末端側にプロモーター配列を有するサイトメガロウイル
    ス（ＣＭＶ）核酸増幅用第１プライマーをハイブリダイ
    ズさせ、ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼによりＤＮＡ伸
    長反応を行って、５’末端上流に機能可能なプロモータ
    ー配列を有する２本鎖ＤＮＡ中間体を生成させる； （９）該２本鎖ＤＮＡ中間体から、前記プロモーター配
    列を認識することができるＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラー
    ゼにより１本鎖ＲＮＡ（−）のコピーを増加させる；そ
    して （１０）必要により、得られた１本鎖ＲＮＡ（−）を鋳
    型として、前記（６）〜（９）を繰り返す。
  10. 【請求項１０】 配列表・配列番号５、６および／また
    は７記載の核酸配列または相補的な核酸配列のうち、少
    なくとも連続した１５塩基からなる核酸配列または該核
    酸配列が必要により修飾されていることを特徴とするＣ
    ＭＶ核酸検出プローブおよび／または捕捉プローブ。
  11. 【請求項１１】 請求項５〜７記載のサイトメガロウイ
    ルス（ＣＭＶ）の核酸配列を増幅するための試薬キット
    に、さらに、配列表・配列番号５、６および／または７
    記載の核酸配列または相補的な核酸配列のうち、少なく
    とも連続した１５塩基からなる核酸配列または該核酸配
    列が必要により修飾されているＣＭＶ核酸検出プローブ
    および／または捕捉プローブを含むことを特徴とするサ
    イトメガロウイルス（ＣＭＶ）の核酸配列を検出するた
    めの試薬キット。
  12. 【請求項１２】 請求項８〜９のいずれか１項記載のサ
    イトメガロウイルス（ＣＭＶ）増幅方法にて増幅された
    ＲＮＡ（−）のコピーを、配列表・配列番号５、６およ
    び／または７記載の核酸配列のうち、少なくとも連続し
    た１５塩基からなる核酸配列または該核酸配列が標識で
    修飾されているＣＭＶ検出プローブ及び／又は必要によ
    り修飾されている捕捉プローブを用いて検出することを
    特徴とする核酸配列（β２．７）を利用したサイトメガ
    ロウイルス（ＣＭＶ）核酸の検出方法。
  13. 【請求項１３】 請求項８〜９のいずれか１項記載のサ
    イロメガロウイルス（ＣＭＶ）増幅方法にて増幅された
    ＲＮＡ（−）のコピーを、固相担体に吸着または結合し
    た、配列表・配列番号５、６および／または７記載の核
    酸配列のうち、少なくとも連続した１５塩基からなる核
    酸配列が必要により修飾された捕捉プローブおよび配列
    表・配列番号５、６および／または７記載の核酸配列の
    うち、少なくとも連続した１５塩基からなる核酸配列
    が、標識で修飾された検出プローブをハイブリダイズさ
    せ、未反応の検出プローブを分離し、捕捉プローブ、Ｒ
    ＮＡ（−）のコピーおよび検出プローブの複合体の標識
    を測定することを特徴とする核酸配列（β２．７）を利
    用したサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）核酸の検出方
    法。
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