JPH04504428A - 細胞外形態のヒト線維芽細胞成長因子レセプター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 細胞外形態のヒト繊維芽細胞成長因子レセプター本発明はヒト成長因子レセプタ ーに係わる。 多くの重要な生物学的プロセス、例えば器官の成長及び傷の治癒のような生理学 的プロセス又は腫瘍の成長のような病理学的プロセスでは、毛細血管の形成が起 こる。新生血管につながる一連の事象の形態学特徴は既に知られているが、この プロセスを生起させる分子メカニズムはまだ殆ど解明されていない０毛細管の内 皮における成長は極めて厳密に制御されているように思われる。というのも、こ れらの細胞は通常は静止単層を構成しており、血管形成（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｅ ）プロセスで増殖が誘発されるからである。内皮細胞が通常静止性を示す理由の １つは、内皮細胞成長因子が血漿中に明らかに欠失していることにあろう、実際 、主要内皮細胞マイトジェンは、検査した殆ど総ての組織の抽出物並びに多くの 正常細胞系及び鳳瘍細泡系には存在するが、血漿中には存在しない、従って、急 速な内皮細胞増殖の局部的な誘発は、環境的刺激に応答した細胞がらの内皮細胞 マイトジェンの放出と関係していると考えられる。 内皮ｍｍマイトジェンのうち最もよく特徴分析されているのは、ヘパリンへの親 和性が大きいことがらヘパリン結合成長因子としても知られている塩基性繊維芽 細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を含むポリペプチド成長因子票である。塩基性ＦＣＦ は大部分の中胚葉由来又は神経外胚葉山釆の組織又は細胞から精製されてきた。 構造分析の結果、ｂＦＧＦは１４６個のアミノ酸からなる単−頒ボリペプチドで あることが判明している。このｂＦＧＦは、最初の１０〜２０個のアミノ酸を欠 失′したＮＬ末端切断形態でも存在し得る。ラジオレセプター結合アッセイ及び 生物学的アッセイによって立証されるように、この末端切断形態のｂＦにＦは天 然型！１ＦＣＦと同じくらい有力である。また、精製プロトコルを均質化組織か らの抽出を酸性ではなく中性で行うように改変し且つプロテアーゼ阻害物質を含 ませるようにすると、より長い１５４残基形態が得られた。ＦＣＦに観察される 微細な相異（ｍｉｃｒｏｈｅｔｅｒｏ−ｇｅｎｅｉｔｙ）は、少なくとも部分的 には、　ｉｎ　ｖｉｖｏか又は精製中に生じるアミノ末端近傍の部分的タンパク 質加水分解に起因すると考えられる。しかしながら、種々の形態のＦＧＦはいず れも同様に活性であるため、このような微細な相異は生理学的には問題にならな いと思われる。 塩基性ＦＧＦは進化の過程で殆ど変化しなかったように見える９例えば、ウシ及 びヒトｂＦｃＦは１４６個のアミノ酸のうち２つが異なるだけであり、全体的ア ミノ酸配列相同度は９８．７％に及ぶ、　ｂＦＧＦと同類の酸性ＦＧＦ（ａＦＧ Ｆ）はｂＦＧＦに対する全体的配列相回度が５５％である。酸性ＦＧＦはアミノ 酸敗１４０個のポリペプチドであり、最初の６つのアミノ酸を欠失したＮ［２末 端切断形態でも存在し得る。塩基性ＦＧＦ及び酸性ＦＧＦは相同度が高いため、 両方とも同じ細胞表面レセプターと相互作用すると考えられる。これら２Ｎ想の ＦＧＦが共通のターゲットＩ［患範囲及び生物学的活性スペクトルを有するのは そのためである。 最近になってＬｅｅらにより（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４５．５７−６０．１９８９ ＞、塩基性ＦＧＦに特異的に結合し得る新しい膜タンパク質のニワトリ胚からの 精製が開示された。この新しいタンパク質は、その生化学的特性及び他の公知の レセプターに対する相同性に鑑みて塩基性ＦＣＦレセプターであると考えられて いる。　Ｌｅｅらは同じ論文中で、前記タンパク質をコードするニワトリ全長ｃ ＤＮ＾クローンの単離についても記述している。しかしながら、このクローンの ヌクレオチド配列は開示されていない。 Ｌｅｅらは、ニワトリｂＦＧＦレセアターが、ｆ１ｇ遺伝子の産物である既に同 定されたヒトポリペプチド配列（Ｒｕｔａら。 Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　、亀、９−１５．１９８８＞に対してがなりのアミノ酸類似 性を示すことを特記した。ニワトリｂＦ（：Ｆレセプターと同様に、ｆ１８分子 はチロシンキナーゼであると思われ、典型的疎水性トランスメンブラン領域を有 するため、前記ヒト配列はヒトｂＦＧＦレセアターの一部分であり得ると考えら れる。 Ｒｕｔａらはｆｌ、分子のアミノ酸配列を部分的ｃＤＮΔＤＮＡンの読取り枠の 翻訳によって推論した。Ｒｕｔａｔらは、チロシンキナーゼ腫瘍遺伝子をコード するＯＮ＾フラグメントを７０−プとして使用してヒト内皮＃！ＩＪ１１ｃＤＮ ＾ライブラリーの低ストリンジェントスクリーニングを行うことによりｆｌｇ　 ｅＤＮＡ配列を得た。しかしながら、これまでに開示されてきたｆｌｇ　ｃＤＮ ＾ＤＮＡンは部分的なものにすぎず、ヒトｂＦＧＦレセプターのａ取外部分をコ ードするヌクレオチド配列を欠失している。 要約すれば、本発明以前に入手できたアミノ酸又はヌクレオチドの配列は、完全 ニワトリｂＦＧＦレセプターに対応するもの及びヒト塩基性ＦＧＦレセプターの 一部分に対応するものだけであり、ヒト塩基性ＦＧＦ及び酸性ＦＣＦと特異的結 合を起こすヒトｂＦＧＦレセプターの完全ｉａｍ外アミノ酸配列は知られていな かった。 本発明者らは、ヒトｂＦＧＦレセプターをクローン化し、その細胞外部分を同定 した。このレセプター及びその細胞外部分はｂＦにＦ又はａＦＧＦのアンタゴニ ストとして使用し得る。 そこで本発明では、ヒト塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）及びヒト酸性繊 維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）と特異的に結合することができ、 （ａ）第３区に示す配列もしくはその一部分、又は（ｂ）１つ以上のアミノ酸の 置換、挿入及び／又は欠失、及び／又は一端もしくは両端での延長によって修飾 した前記配列（ａ）を有するポリペプチドを提供する。゛好ましいポリペプチド は、 （ａ、）第３図の下線の配列もしくはその一部分、又は（ｂ＋＞ｔつ以上のアミ ノ酸の置換、挿入及び／又は欠失、及び／又は一端もしくは両端での延長により 修飾した前記、配列（ａ、）を有する。 本発明は、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列も提供する。このＤＮ Ａ配列は、 （ａ２）第２図に示す配列もしくはその一部分、又は（ｂｚ）１つ以上のヌクレ オチドの置換、挿入及び／又は欠失、及び／又は一端もしくは両端での延長によ り修飾した前記配列（ａ２）であり得る。 適当なりＮ＾配列は、 （ａ、）第２図に示すヌクレオチド６４〜ヌクレオチド１１２８の配列もしくは その一部分、又は （ｂ３＞１つ以上のヌクレオチドの１損、挿入及び／又は欠失、及び／又は一端 もしくは両端での延長により修飾した前記配列（ａ、〉である。 本発明は、本発明のＤＮＡ配列を包含し、形質転換宿主中に導入されたときに前 記ＤＮＡ配列によりコードされる本発明のポリペプチドを発現できるベクターも 提供する。このようなベクターで形質転換した宿主も本発明の範囲内に含まれる 。 本発明のポリペプチドは、そのポリペプチドが発現されるような粂件で本発明の 形質転換宿主を培養することを含む方法によって製造される０発現されたポリペ プチドは単離すればよい、このポリペプチドは生物学的に純粋な形態で取出し得 る。 添付図面中、 第１図はクローンＰＬ５及びＰＬＩＯを層単に示す説明図である。 第２図はｂＦＣＦレセプター分子のヌクレオチド配列を示す説明図である。 第３図はｂＦＧＦレセプターのアミノ酸配列を示す説明図である。推定上のリー ダーペプチドはイタリックで示した。 以前に知られていなかった細胞外部分は下線で示した。成熟分子の最初のアミノ 酸であると考えられるアルギニン（Ｒ）残基は太字で示した。 第４図は２つの中間構築物（プラスミドＬ２３及びｐＦＣ４２）と、細胞外形態 のＦＧＦレセプターをコードする配列を担持する２つの最終発現プラスミド（ｐ Ｆｃ１３８及びｐＦｃ１６４）とを示す説明図である。詳細については後述の実 施例２を９照されたい。 従って、第３ｒｆ！Ｉに示す配列を有する本発明のポリペプチドはヒトｂＦｃＦ レセプターである。第３図の配列の一部分からなり且つヒトｂＦＧＦ及びヒトａ ＦＧＦと特異的に結合できるポリペプチドも本発明の範囲に含まれる０本発明の ポリペプチドとしてはその他に、第３＠の配列を修飾したもの又は第３図の配列 の一部分を修飾したものからなり且つヒトｂＦ（：Ｆ及びヒトａＦＧＦと特異的 に結合できるものが挙げられる。 適当なレセプター結合テストについては、Ｄｏｗｅｒら、Ｊ。 好ましいポリペプチドの１つは第３図のアミノ酸１〜アミノ＠　３７６の配列を 有するポリペプチドである。これは、推定上のリーダー配列を有するｂＦＧＦレ セプターの細胞外部分の配列である。別の好ましいポリペプチドは第３図の下線 の配列即ちアミノ酸２２〜アミノ！！！３７６の配列を有するポリペプチドであ る。これは、推定上のリーダー配列をもたないｂＦ（：Ｆし七ブタ−の細胞外部 分の配列である。 第３図に示した配列又はその適当な一部分は、１つ以上のアミノ酸の置換、挿入 及び／又は欠失、及び／又は一端もしくは両端での延長によって修飾し得る。勿 論、このような修飾配列からなるポリペプチドはヒトｂＦｃＦ及びａＦＧＦ結合 能力を保持していなければならない、第３図の配列又はその一部分、即ち未修飾 配列を修飾するとき、通常は修飾配列と未修飾配列との間の相同度は７５％以上 である。この相同度は８５％以上又は９５％以上になり得る。 例えば、第３図の配列又はその一部分の１つ以上のアミノ酸残基を置換もしくは 欠失させるか、又は１つ以上の別のアミノ酸残基を挿入し得る。但し、元の配列 の物理化学的特性、即ち荷電密度、疎水性／親水性、サイズ及びコンフィギユレ ーションは保持されなければならない、Ｎ換とじては下記のようなフンレターコ ード（ｏｎｅ−ｌｅｔｔｅｒ　ｅｏｄｅ）に基づくものが可能である（Ｅｕｒ、 Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１３８．９−３７，１９８４）。 Ｇｔ−Ａで置換、及びその逆、 ＶをＡ、Ｌ又はＧで置換、 ＫをＲで置換、 ＳをＴ″ｃＮ換、及びその逆、 ＤをＥで置換、及びその逆、並びに Ｑｔ−Ｎで置換、及びその逆。 延長については、アミノ酸残基５０個以下の短い配列を一端又は両端に付加し得 る。この配列はアミノ酸残基を３０個まで、例えば２０個又は１０個まで有し得 る。あるいは、これより遥かに長い延長部分を付加していもよい、より長いアミ ノ酸配列は一端又は両端に融合し得る。従って、一端又は両端の延長部が異種（ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）アミノ酸配列、即ち第３図から誘導される配列に自 然に結合しない配列であるキメラタンパク質（ｃｈｉｍａｅｒｉｃ　ｐｒｏｔｅ ｉｎ）を与え得る。このようなキメラタンパク質は従って、ｂＦＧＦ及びａＦＧ Ｆに特異的に結合する能力と別の機能とを併有し得る。 本発明のポリペプチドは組換ＤＮＡ技術によって製造される。従って、これらの ポリペプチドの製造は当該ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の供給に依穿す る。第２図の配列をもつＤＮＡはヒト胎盤ｃＤＮ＾ライブラリー、例えば＾ｇｔ ｌｌライブラリーをプローブで調べることによって得られる。このようなライブ ラリーはＣ１ｏｎｔｅｃｈから入手できる。適当なプローブとしては下記のもの が挙げられる。 第２図に示したものより雉い配列は、制限エンドヌクレアーゼ及び／又はエキソ ヌクレアーゼを用いて得ることができる。ヌクレオチド１〜ヌクレオチド１１２ ８又はヌクレオチド６４〜ヌクレオチド１１２８の口Ｎ＾配列を形成し得る。修 飾配列はエンドヌクレアーゼでの制限、リンカ−の挿入、エキソヌクレアーゼ及 び／又はポリメラーゼの使用並びに部位特定変異の誘発（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃ ｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を含む適当な技術を使用することによって得 られる。短縮及び／又は修飾ＤＮＡ配列が本発明のポリペプチドをコードするか 否かは容易に確認できる。前記配列によってコードされるポリペプチドは適当な 宿主中で発現され得、ヒトｂＦＧＦ及びａＦＧＦと特異的に結合する能力につい てテストすることができるからである。 本発明のポリペプチドを発現させるには、発現ベクターを構築する。発現ベクタ ーは、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含み且つ適当な宿主中に 挿入されたときにそのポリペプチドを発現することができるように形成する。適 当な転写及び翻訳制御エレメント、例えばＤＮＡ配列のプロモーター、転写終結 部位並びに翻訳開始及び停止コドンを与える。ＤＮＡ配列は、そのベクターに適 合した宿主中でポリペプチドの発現が発生し得るように正確な枠内で与える。 次いで、発現ベクターを適当な宿主中に与える。このベクターを抱えた細胞を、 発現が生起し得るように増殖させる。このベクターはプラスミド又はウィルスベ クターであり得る。任意の適当な宿主−ベクターシステムを使用し得る。 形質転換宿主は原核又は真核宿主であり得る。細菌又は酵母宿主、例えば大腸菌 （Ｅ、ｃｏｌｉ）又はＳ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｇを使用し得る。あるいは、昆虫 細胞を使用することもでき、その場合はバキュロウィルス発現システムが適当で あり得る。 更に別の宿主として、哺乳動物、１１１ｍ系、例えばチャイニーズハムスター卵 巣（Ｃ）１０）細胞を形質転換してもよい。 本発明のポリペプチドは単離し且つ精製し得る。このポリペプチドはヒトｂＦに Ｆ又はａＦ（：Ｆアンタゴニストとして使用できる。このポリペプチドはｉｎ　 ｖｉｖｏでｂＦにＦを封鎖してｂＦＧＦの生物学的活性を妨害し得、ｂＦＧＦ活 性阻害物質として機能し得る。ｂＦｌｌ；Ｆ及びａＦＧＦ活性のアンタゴニスト は、異常な血管形成に関連した幾つがの病気、例えば糖尿病性網膜症、血管新生 緑内障、慢性関節リウマチ、乾瘍、動脈硬化等に関して臨床的に使用し得ると共 に避妊薬として使用し得る。また、成る種の充実性腫瘍が新生血管の成長を必要 とすることから、ＦＣＦアンタゴニストはこれらの疾患を処置すべく治療面で有 効に使用し得ると考えられる。 そのためには、本発明のポリペプチドを別の物質と化学的に結合させて結合体を 形成し得る。前記別の物質はキャリヤー分子又は別の生物学的機能を有する分子 であり得る。 本発明のポリペプチドは医薬組成物として配合することもできる。この医薬組成 物は医薬的に許容し得るキャリヤー又は希釈剤も含む、この医薬組成物は本発明 のポリペプチドを結合体の形態で含み得る。 本発明のポリペプチドは任意の経路で患者に投与し得る。 経口投与にするか、又は皮下注射、静脈注射もしくは筋向注射のような非経口投 与にするかの選択、用量の選択、並びに投与頻度の選択は種々の要因に依存する 。これらの要因は例えば、投与の目的、治療を受ける患者の年令、体重及び体調 等である。但し通常はいずれの投与経路でも、−回の投与当たりのポリペプチド 量は１〜１１００ｈ、より好ましくは１０〜１００．Ｈにする。 以下に実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。 え東１Ｌ ヒト胎盤λｇｔｌｌ　ｃＤＮ＾ライブラリーをスクリーニングすることによって 、塩基性ＦＧＦレセプターをコードするｃＤＮ＾クローンを単離した。前記ライ ブラリーはＣｌｏｎｔｅｃｈ社から市販されているものである。 ヒトｂＦＧＦレセプターの二部分をコードすると考えられる部分的ｅＤＮ＾クロ ーンは既に文献で開示されている（Ｒｕｔａら。 、１９８８）、この文献に従い、本発明者らは下記の配列をもつ２つのオリゴヌ クレオチドプローブを設計した。 Ｓ　’　ＡＴＡＡＣＧＧＡＣＣＴＴＯＴＡＧＣＣＴＣＣＭＴＴＣＴＧＴＧ　３　 ’　（名称　０Ａ８９６５）　及びＳ’　ＧＧＧＴＣ’ｌ’Ｃ？ＧＴＧＡＧＧＧ ＣＡＣＴＧＣＡＴＧＣＣＡＧＣＡ　３’　（名称　０ＡＢ９１１４１゜第１のス クリーニングは１０−ブ０＾Ｂ９６５だけを用いて行った。このオリゴヌクレオ チドは（γ５２Ｐ）＾ＴＰを用いてキナーゼ処理し且つＮｅｎ５ｏｒｂカラム（ Ｎｅｎ）で精製した。、ｃＤＮ＾ライブラリーのタイターを測定した後（２ｘ　 １０’ｐｆｕ／ｍｌ）、適当な希釈物を調製し、大腸菌株Ｙ１０９０を用いてプ レートした。 Ｙ１０９０の一晩培養物を０．０５ｍ１とり、前記ライブラリーの４ｘｔｏ−’ 希釈物を含む０．１ｍｌの滅菌ラムダ希釈剤（！Ｏａ＋Ｍ　）リス−〇ＣＩ％　 ｐＨ７，５，１０＋＊Ｍ　８ｇＣＩ２、Ｏ，ＬＩＩＮ　ＥＤＴ＾）と混合し、３ ７℃で１５分間インキュベートしてファージを吸着させた。ブレーティングはア ンピシリンを１００μｇ／＋ｅｌ含む２０個のＬＢベトリ皿上に行った。 公知の方法に従い（Ｍａｎｉａｊｉｓら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｔｏｎｉｎｇ 　：　ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１ａ ｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｂｏｒ、Ｎｅｗ　 Ｙｏｒｋ、１９８２）、１０“のプラークをニトロセルロースフィルタに移動さ せ、低ストリンジェント東件（５ｘＳＳＣ，０，１％ＳＯＳ、５ｘ　Ｄｅｎｈａ ｒｄｔ溶液、０．１ｍｇ／ｍｌサケ精子ＤＮ＾）で−晩６５℃でハイブリッド形 成させた。標議したプローブを１０＠ｃｐｍ／ｍｌで加えた。洗浄を６ｘＳＳＣ １０８１％ＳＤＳ及び３ｘＳＳＣ１０，１％ＳＯＳにより、６５℃で行った。　 Ｅｍｅｒｓｈｔｓ　Ｈｙｐｅｒ−ｆｉｌｍ−ＭＰに一晩暴露した後で、３つの陽 性クローン、即ちＰＬ３、ＰＬＩＯ及びＰＬＩＯが検出された。これらの陽性シ グナルを、同一プローブを用いて別層のスクリーニングで確認した。 次いで、２つのプローブ０＾Ｂ９６５及び０＾Ｂ９８４を用いて二つ組のフィル タでＰＬ３、ＰＬＩＯ及びＰＬＩＯを第２のスクリーニングにかけた。興味深い ことに、これらのクローンは前記プローブの両方によって認識された。 これら３つのクローンをプラーク精製し、更に分析した。 Ｌａｍｄａｓｏｒｂファージ吸着剤（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてＰＬ３、ＰＬＩ Ｏ及びＰＬＩＯのファージＯＮ＾を精製し、ＥｃｏＲｒで消化した１種々の消化 物の中からＰＬｌｏに由来する２、８にｂ及び０．６にｂの２つの挿入物を選択 し、これらをＭｌ（ｍｐ１９にサブクローンした。 ５ｅｑｕｅｎａｓｅ（Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｅｂｅｍｉｃａｌ　 Ｃｏｒｐ、ＣＬｅｖｅｌａａｄ。 ０ｈｉｏ）を用いて、ジデオキシヌクレオシドトリホスフェートの存在下で一重 鎖ＤＮＡ鋳型での１ライマ一開始ＤＮＡ合成を行うことにより、ヌクレオチド配 列を分析した（Ｓｉｎｇｅｒら。 Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ　７４，５４６３−５４６７． １９７７）、形成された配列に基づき普遍的又は特異的プライマーオリゴヌクレ オチドを用いてサブクローンの２つの鎖の配列決定を行った。 終結コドンを有する８１７個のアミノ酸については単一の読取り枠が検出され得 る。成熟ｂＦＧＦレセプターの最初の１９６個のアミノ酸を０．６ｋｂ揮入物に よってコード化する。このフラグメントの最終配列はＥｃｏＲＩ部位を含み、第 １図に簡単に示すように、Ｃ００ト末端の６２６個のアミノ酸が２．８ｋｂ挿入 物によってコード化され、その後に３′末端非翻訳領域が、続く。 ｂＦＧＦニワトリレセプターは、Ｌｅｅら（１９８９）が記述しているように、 アミノ酸２１個のリーダーペプチドとそれに続くアミノ酸７９８個の成熟タンパ ク質とを含むアミノ酸数８１９のタンパク質である。この配列に対する相同によ って、本発明のクローンはリーダーペプチドの１６個のアミノ酸の後に完全成熟 ｂＦＧＦレセプター分子を含んでいた。リーダーペプチドの先頭のメチオニンを 含む残りの５つのアミノ酸をみつけるために、本発明者゛らはＰＬＩＯの０．６ ｋｂ挿入物から誘導した下記の配列をもつ新規のオリゴヌクレオチドプローブを 合成した。 ５’　ＡＣＧＧＣＣ’Ｉ’ＡＧＣＧＧＴＧＣＡＧＡＧＴＧＴＧＧＣＴＧＴＧＡ　 ３’　（名称　０＾Ｂ　１０８１３１このプローブを用いてライブラリーをスク リーニングすることにより、ＰＬ５と称する新規のクローンを選択した。 このクローンは０．７ｋｂ　ＥｃｏＲＩフラグメントを含んでいた。 このフラグメントの配列決定を行ったところ、ＰＬＩＯ由来の０．６ｋｂ配列を 含んでいたが、５°末端で更に延長され□ていた。 より正確には、ＰＬ５由来のｏ、′２ｋｂ配列が、ＰＬＩＯ中にも存在し且つメ チオニンから始まるり〒ダーペプチドの２１個のアミノ酸の後に続＜ＮＨ，末端 配列の１９６個のアミノ酸をコードする。クローンＰＬ５及びＰＬＩＯを第１図 に簡単に示した。　・、・２つの重なり合うクローンＰＬ５及びＰＬＩＯから得 られるようなりＦＧＦレセプターの完全長ＤＮＡ配列を第２図に示した。対応す るアミノ酸配列は第３ｒ５！ｉに示した一二の配列では、アミノ酸２１個の推定 上のリーダーペプチドがイタリックで示されている。成熟分子の最初のアミノ酸 と考えられるアルギニン（Ｒ）残基は太字で示した。以前に知られて、いなかっ た細胞外部分は下線で示した。 完全長クローン及び細患外領域は哺乳動物細胞及び細菌細胞の両方で発現された 。標識した塩基性及び酸性ＦＧＦでの架橋実験の結果、組換完全レセプター及び 細胞外部分は確かに塩基性及び酸性ＦＧＦと特異的に結合できることが判明した 。 寒」１阻」工 大腸直中でヒトＦＣＦレセプターの細胞外部分を発現させるべく、調節シグナル として大腸菌のトリプトファンプロモーターとラムダＣ１ｌタンパク質（Ｈｅｎ ｄｒｉｘ　ＲＪ、、Ｒｏｂｅｒｔｓ　Ｊ。 Ｍ、、５ｔａｈｌ　ＦＪ、及びｌｌｌｅｉｓｂｅｒｇＲ，＾、：Ｌａｍｂｄａ　 ＩＩ、Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｕｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏ１ ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９８３）のリポソー ム結合部位領域とを用いてベクターを構築した。 このレセプター配列の５°末端を合成により再構築して発現ベクターにクローン した。そのために、相補オリゴヌクルオチドを用いて、Ｃ１ｌリポソーム結合部 位とそれに続くへＴＧコドン及び成熟レセプター配列の最初の９５個のヌクレオ チド（第２図：ヌクレオチド６１〜１５５）とをコードするＨｉｎｄＩＩＩ−Ｐ ｓＬＩ合成ＯＮ＾フラグメントを合成した。このような合成フラグメントの完全 配列は下記の通りである：ＡＧＣＣＣＣＴＧＴＧＱＡＡＯＴＧＧＡＧＴＣＣＴＩ ’ＯＣＴ’ＧＧＴＣＣＡＣＣＣＣＧＧｒＣ−ＡＣＣＴＧＣｒＧＣＡ３“ この旧ｎｃｌｌｌＩ−ＰｓｔＩフラグメントを、第２図のヌクレオチド１５６〜 ５８６に対応するレセプター配列を有するＰＬ５由来のＰｓｔｌ−ＥｃｏＲＩフ ラグメントと共に、予めＨｉｎｄｌＩＩ及びＥｃｏＲＩで切断しておいたＭｌ： Ｊ＋ｐ１８にサブクローニングした。得られたプラスミドＬ２３はＣＩＩリポソ ーム結合部位を担持し、この部位の次には成熟タンパク質の最初の１７５個のア ミノ酸に対応するレセプター配列のヌクレオチド６１〜５８６が続く（第４図参 照＞、　ＦＧＦレセプターの完全細胞外部分を得るべく、ＰＬＩＯでのポリメラ ーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりＥｃｏＲＩＢａｍｆ！Ｉフラグメントを回収した 。この反応はＰｅｒｋｉｎ　ＥＩｉ＊ｅｒ　ＤＮ＾サーマルサイクラ−（ｔｈｅ ｒｍａｌ　ｅｙａｌｅｒ）で、Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅ１ｍｅｒ＾ｍｐ−１ｉｔｉｑＤ Ｎ＾ポリメラーゼを用いて、９４℃・で２’　３０”のサイクル、９４℃で１゛ ３０”の第１ステツプと、７２℃で２゛３０″の第２ステツプの３０サイクル、 ７２℃で７゛の最終サイクルによって実施した。 この反応に使用したプライマー０＾ＢＩＬ９２及び０＾Ｂ１１９５は下記の通り である： ＯＡＢ　１１９２　：　５°ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ　３゜ＯＡＢ 　１１９５　：　５°ＡＴＧＡＧＧＡＴＣＣＴＣＡＣＴＣＣＡＧＧＴＡＣＡＧＧ ＧＧＣＧＡＧＧＴＣＡ　３’増幅した産生物をＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消化 して、第２図で成熟レセプター配列のヌクレオチド５８７〜１１２８に対応する ５４６ｂｐフラグメントを得た。 成熟ＩＩＩＩ胞外レセプし−タンパク質の発現プラスミドて構築した： １　）　Ｌ２３に由来するＨｉｎｄｌＴＩ−ＥｃｏＲＩフラグメント、２　）　 ＰＬＩＯに由来するＥｃｏＲＩ−Ｂａ＋ｍ［ＩＩフラグメント、３）プラスミド ９ＦＣ４２に由来する旧＋ｘｄｌｌｌ−Ｂａｍ＋ＦＩＩ大フラグメント。 この大フラグメントは我々の研究所で予め形成したものであり（Ｉｓａｃｃｈｉ ＾、、Ｓａｒｍｉｅｎｔｏｓ　Ｐ、、Ｌｒｅｎｚｅｔｔｉ　Ｒ，及びＳｏｒｉｎ Ｍ、　：　Ｎａｔｕｒｅ　ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ＾Ｉ　ａｎｄ　ｉｔｓ 　ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｐｒｏ　＾ｐＯ＾Ｉ　：　１ｎｆｌｕｅｎｅｅ　ｏｆ　ｔ ｈｅ　５ｅｑｕｎｅｅ　ａｔ　ｔｈｅ　５’ｅｎｄ　ｏｆｔｈｅ　ｇｅｎｅ　ｏ ｎ　ｔｈｅ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｏｆ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　Ｅｓ ｃｈｅｒｉ−ｅｈｉａ　ｃｏｌｉ、Ｇｅｎｅ　８１．ｐ、１２９−１３７．１９ ８９）、トリプトファンプロモーターとアンピシリン耐性用β−ラクタマーゼ遺 伝子とを含んでいる。 成熟細砲外ＦＧＦレセプタータンパク質の発現には大腸菌８株（Ｄｅｌｂｒｕｅ ｋ　Ｎ、　：　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｖｉｒｕｓｅｓ　ｏｒ　ｂａｔｅｒｉｏｐ ｈａｇｅｓ。 Ｂｉｏｌ、　Ｒｅｖ、　２１．ｐ、３０−４０．１９４６）を使用した。 タンパク質発現の誘導及び分析は記述通りに行った（（３ｓ１ｃｃｈｉ＾、ら） 。 タンパク質はウェスターンプロットでウサギの抗ヒトＦＣＦレセプターポリクロ ーナル抗体（Ｐｒｏｓｅｇａ）によって認識された。 あるいは、組換細胞外領域を、別のアミノ酸残基が成熟細胞外領域のＮＨ，末端 又はＣ０ＯＨ末端に存在するタンパク質融合体として合成することもできる。 この方法は、一般に、細胞内タンパク質安定性、収率、検出及び単離を良好にす るために用いられる。 特許及び化学文献の両方に、融合タンパク質に基づいた種々の発現系が報告され ている９例えば、国際特許出願ＰＣＴ／１１０８４１００３８０　；欧州特許出 願ＥＰ　２４３３３３　、■ａｒｒｒｓ、Ｔ、Ｊ、Ｒ。 １９８３、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　ｇｅｎｅ　ｉ ｎ　Ｅ、ｃｏｌｉ、　；Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ、Ｒ，編Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇ ｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｖｏｌ、４．＾ｅａｄ’ｅｓｉｃＰｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ 中ｐｐ、Ｌ２７−１８５　；　Ｈｅ１ｌｅｂｕｓｔ、Ｍ、ら１９８９．　Ｂｉｏ −ｔｅｅｈｎｏｉｏｇｙ　ｖｏｌ、７．ｐｐ１６５−１６８を参照。 第４図に示す新規の１ラスミドｐＦＣ１６４を形成した。このプラスミドでは、 大腸菌β−ガラクトシダーゼのアミノ酸９〜２３がＦＧＦレセプターの成熟細胞 外領域の上流に挿入されている。プラスミドＰＦＣ１６４はｐＦｃ１３８と同様 の方法で構築されるものであり、これを大腸菌宿主株Ｂ中に導入すると、ＦＧＦ レセプターの細胞外領域の高いレベルの発現が生じる。 β−ガラクトシダーゼ部分はまた、融合タンパク質の細泡内安定性を良好にする 。 従って、プラスミドｐＦＣ１３８及びｐＦＣ１Ｂ４は本発明の対象である。 ＡＴＧ　ＴＧＧ　ＡＧＣＴＧＧ　ＡＡＧ　ＴＧ：　ＣＫ：　ＣＫ：　ＴＩＣＴＧ Ｇ　ＧＣｒ　（ＴＧ　ＣＴＧ　ＧｒＣＡＣＡ　４５αＩ：　ＡＣＡ　ｆ！　ＴＧ ｒ：ＡＣＣ（０Ａｍα：Ｇ　’ＩＯ：　Ｏ）ｌ；　ＡＣＣＴ１℃ＣＣＴＧＡＡＣ ＡＡ　９０α）：　ＣＡＧ　ＯＩ：　ＴＧ：ｙα込αＩ：　ＣＣｒ　ＧＫｙ　Ｇ ＩＡ　島ＧＡＧ　’１’Ｃｊ：：　Ｔ１℃Ｃ’［ｇ　１３５ＣＡＣＣＯ：απＧ ＡＣＣＩＩＧＣＴＧ　ＯＩｉＧ　ｃ’ｒ’ｔ’　ＣＩＩＸ：　ＴＵＩ’　ＣＸＫ １　Ｃ１’Ｇ　ＣＧＧ　ＧＡＣＧＡＴ　P８０ 羽あＣＡＧχ℃に℃Ｎにπ刀ａぢα追ＧＣαるσ℃ａ「口℃α℃−２２５ＡＧＣ ＡＡＣｃｘｒ：ＡＣＣ！　ＡπにスαＤＧｉＧＧＡＧＧＩＧＧｉＧＧｍ（７ｉＧ ＧＣ２７０Ｔｌ）ＣＧＴＧα℃αｍＡ　ＧＡＣＴＣＣ（ｍ　ＣＴＣＴＡＩ’α： ＴＴＧ：ＧＴＡＡＯＡＧ：ＡｌｌＩＣ３１５αＩ：ＴＣＧＧＧ：ＡＧＴＧＡＣＸ Ｘ：ＡＣＣ’ＩＮ：Ｔ？ＣＴＣＣＧＴＣＡＡＴＧＴｒＴＣＡＧＡＴ　３６０ＧＣ Ｔ　ＣＴＣＣＥ　ＴＣＣＴＣＧ　Ｇ！ＩＧ　ＧＡＴ　ＧＪｋＴ　ＧＡＴ　（ＡＴ 　ＧＡＴ　ＧＡＴ　（＆　’！；　ｒ　４０５ＴＣＡ　ＧＡＧ　ＧＡＧ　ＡＡＡ 　Ｇｋｌ　ＡＣＡ　ＧＡＴ　ＡＫ：　ＡＣＣＡＡＡ　ＣＣＡ　Ｎ’Ｃ０１１；Ｔ 　ＡＴＧ　Ｃｏ：　４５０ＧＴＡ　ＧＣＴ　ＣＣＡ　’ｒＡＴ　’Ｉｍ　ＡＣＡ 　’１’ｏ：α：Ａ　ＧＡＡ　ＡＡＧ　ＡＴＧ　ＧＡＡ　Ａ％Ｇ　ＡＡＡ　Ｔｒ Ｇ　４X５ ＣＡＴαスσ刀α万αズα工ＡＡＧにスｃｚ　ＡＡＧ　７１℃ＭＡＴＧＣ（Ｉｌ ｌＴｌｍ　５４０ＡＧ？　ＧＧＧ　Ａ工αｘｐ＜αＩ：　ＡＣＡ　Ｃ３１；　Ｏ ｊＣ’ｍ　ＴＩ’Ｇ　ＡＡＡ　ＡＡＴ　（ｍ　ＭＡ　５８５ＧＡＡ　ＴＴＣＡＡ Ａ　０ＣＩＴ　ＧＡＣ：　ＣＡＣに込ＡＴＴα込Ｇ’に：　ＴＡＣＡＡＧ　Ｇｒ ＣＣＧＴ　ＴＡＴ　６３０α℃にＣＫ追に℃に℃Ａｎに℃ｙＣππσ店σ刀α℃ πゴタＣＡＡＧ　６７５ＧＧＣＡＡＣＴＡＣ：　ＡＣＣＴＧ：　ＡＴＴ　Ｃ−％ 　ＧＡＧ　ＡＡＴ　ＧＡＧ　ＴＡＣＧ３：　ＸＫ：　ＡＴＣＡＡＣ７２０ＣＡＣ ＡｏＡＴＡＣＣＡＧ　ＣＴＧ　ＧＡＴ　ＧＴＣＧＩ’ＧＧＡＳ　ＣＧＧ　Ｔｏ： 　ＣＣｒ　Ｏ’ＣＣＧＧＣＤ：、　フロ５ＡＴＣＣＴＧ　ＣＡＡまスαる一℃α ℃α℃ＮＣ黒へασ店α℃ロ℃印Ｔ８工ＯＡＧ：　ＡｌＩＣＧＴＧ　ＧｋＧ　Ｔ ｒＣＡＴＧ　’ＩＮ？ｌ’　ｊ’ＡＧσ℃χにπｘｃｘｘ；ｃｘ；ｃｘｂ　ａｓ ｓＣＡＣＡＴＣＣＡＧ　’ＩＷ　ＣｒＡ　ＡＡＧσＣＡＴＣＣｓ’４σ％　ＡＡ Ｔαｎ　ＡＧＣＲＡＮＧ　ＡＴＴ　９００ＧＩＺ　ＣＣＡ　ＧＡＣＡＡＣＣＩ’ Ｇ　ＣＣＴ　ＴＡＴ　ＧｒＣＣＡＧ　ＡＴＣ’よ’ｍ　ＭＧ　ＡＣＴ　ＧＣｒ　 （ｎ　９４５ＧＴＴ　ＡＡＴ　ＡＣＣＡＣＣＧＡＣＭＡ　ＧＡＧ　Ａ’ｌ１３　 Ｇ１１ｉＧ　ＧＴＧ　ＣＴＴ　ＣＡＣＡＡＣＡＭＴ　９９０口℃ＴＣＣＴｒＴω Ｇズαスα刀％フＪ窃π℃７℃α刀απＡＡＣ頴６ＴＣＴ　ＡＴＣＧＧＡ　ＣＴ ＣＴＣＣＣＡＴ　（！　ＴＣＴα：ＡＴＧＧ’１−ＩＧＡｃｃＧＩＴｃＴＧＧＡ Ａ　ｉ艶０ＴＸＧ、２ Ｇ）：　ＣｒＧ　ＧＡＡズ号圧■瞑υｌ冷割万α番ωの×冗χ口　１１２５（＆ 　ＡＴＣＪＴＣＡＴＣＴＡＴ　’１１［ＡＣＡ　ＧＺの：　’；　（：’［ＡＩ ＣＴＣＣ’ｇ　Ａ’ＩＯ！１７０ＣＺα’ｉｓ　ＴＯＧ　ＧＩＣＡＴＣＧＩ’Ｃ ＴＡＣＡＡＧ　ＡＴＧ　蔀罎后１”　ＣＧｒ　にΣＡ”ＩＧ　ＡＡＧ　１２１５ 雇ＧＡＣπ×χ廼×ｘ靜吋東１謔ユコ石−肛店υ工　１２６゜に：’ｃ　ＣＯＴ 　ＣＴＧ　Ｃ哀旭■λに一島のＩ口Ｘ■に℃コａαス　１３０５′ｙｘにｆ１Ｍ ｃＴｃ’ｒ（ｍＧ１’ｌ’ｃＩＴｃＴＧＧＴｒｃ！ＤｐＴＣＡＣＫＤ（！’ｆｆ 　１３５０つコζ×江ＡＣＴ　（り：　Ａ冗σ１刀ばｍ＝τ■に買Ｌλに貫　１ 叱５の頁粘ＧＡｃ■Ｘ哀π圓αのバ哀−シＧじに１買Ａ　１４４０ＧＧＣＭＡ■ ×πωＬχバＣπ×π■哩ズＫｍ罵−コ　１４８５―頁ロＡＴＣ知−−コＩＡＧ Ｇに島＝詰頁て島肛島　１５３０口Ｘに■界超ＡＮロ万Ｗｉ艶鎮×ＣｉユＸ詰屓 に淋　１５７５コ鎮×−底筒−Ｅ可λ」工薫；蔀壊αｉに算ｉ賜　１ε２０Ｃｋ 諭眉ＡＡＴ　ＡＴＣＡ’ｒＣＡＣＣＥｙ　ＣＩＧ　ＧＧＧ　ＧＣＣＴＣＣＡＣＧ 　ＣＡＧ　（ＡＴ　苅１６６５００：　ＴＴＧ　ＴＡＴ　ＧＩＣＡＴＣＧｒＧ　 ＧｋＧ　ＴＡＸ　＝Ｔｏ：　ＡＡＧ　ノコにＣＩＧ　ＣＧＧ　Ｌ７ＬＯＧｋＧ　 ＴＡＣＣＫ＝　ＣＡＧ　ＧＣＣＣＧＧ　にオＱＩ：　ＣＣＡ　ＧＡＧ　Ｃ’ＥＧ 　ＧＡＡ　Ｔ）ＣＴＧ：　’ＩＡＣ１７５５ＭＣＣＣＣＡＳＣＣＡＣＭＣＣＣＡ 　ＧＡＧ　ＧＡＧ　ＣＡＧ　Ｃ’Ｊ℃ＴＣＣ’ｆｆＡＡＧＧＡＣＣＩ’Ｇ　１８ ００ＧｒＧ肛πω※にσＧ６ロＸ江コ戎に℃ズχロｉ江　１８４５ＴＣＣＡＡＧ 　ＡＡＧ　ＴＣＣＡＴＡ　Ｏ’ｌＣＬＪＪＡ　ＧｘｘＩＣＡ　魚ＡＧＧ　ＡＡＴ 　ＧｒＣＣｍ　１８９０ＧＩ’Ｇ　ＡＣＡ　ＧＡＧ　ＧＡＣＡＡＴ　ＧｒＧ　Ａ ＴＧ　ＡＡＧ　ＡＴＡ　ＧＣＡ　ＧＡＣＴｒＴ　ＱｌｉＣＣＩＣＧＣＡ　１９３ ５α７５　ＧＡＣＡＴＴ　ＣＡＣＣＡＣＡＴＣＧＡＣＴＡＣＴＡＴ　ＡＭ　ＡＡ Ｇ　ＡＣＡ　ＫＣＭＣα℃１９１３０α込σ℃αゴａもＭＧπ℃に℃αスα℃り Ｇαスー＝ａＣαｉ　２０２５ＡＴＣＴＡＣＡＯＣＣＡＣ（Ｘ；　ＡＧｒ　Ｇへ ｒｍ’ｍ　ＴＣＴ’ｌ！ＧＺＧＴＧＣＴＣＣ’ｍ　２０）０’ｍｍに℃Ｔｉ１ｅ 　ＡＣＴ　ＣＴＧα℃αＣ’ｆｆαス゛ｘα）：ＧＧＴＧＴＧＣＣＴ　２１１５ ＧＴＧ　ＧＡＧ　Ｑ”ｌＡ　ＣＴｒ　ＴＩＣＮ’ｉＧ　ＣＴＧ　（？ＩＧ　ＡＡ Ｇ　ＧＡＧα７ＣＡＣＣＧ：ＡＴＧＧＡＣ２！！０Ｆｉｇ、　４ 要約嘗 ヒト繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）及びヒト酸性繊維芽細胞成長因子（ａＦｃ Ｆ）と特異的に結合することができ、（ａ）第３図に示す配列もしくは該配列の 一部分、又は（ｂ）１つ以上のアミノ酸の置換、挿入及び／又は欠失、及び／又 は一端もしくは両端での延長によって修飾した前記配列（ａ）を有するポリペプ チドを開示する。また、該ポリペプチドの製造方法、それを含む医薬組成物及び それをコードするＤＮ＾配列も開示する。 国際調査報告 −１１，＾―１．Ｈ０とπ／ＥＰ　９１１００１０３

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ヒト線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）及びヒト酸性線維芽細胞成長因子（ａ ＦＧＦ）と特異的に結合することができ、（ａ）第３図に示す配列もしくは該配 列の一部分、又は（ｂ）１つ以上のアミノ酸の置換、挿入及び／又は欠失、及び ／又は一端もしくは両端での延長によって修飾した前記配列（ａ）を有するポリ ペプチド。 ２．（ａ１）第３図の下線の配列もしくは該下線の配列の一部分、又は （ｂ１）１つ以上のアミノ酸の置換、挿入及び／又は欠失、及び／又は一端もし くは両端での延長により修飾した前記配列（ａ１）を有する請求項１に記載のポ リペプチド。 ３．請求項１又は２に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列。 ４．（ａ２）第２図に示す配列もしくは該配列の一部分、又は （ｂ２）１つ以上のヌクレオチドの置換、挿入及び／又は欠失、及び／又は一端 もしくは両端での延長により修飾した前記配列（ａ２）である請求項３に記載の ＤＮＡ配列。 ５．（ａ３）第２図に示すヌクレオチド６４〜ヌクレオチド１１２８の配列もし くは該配列の一部分、又は（ｂ３）１つ以上のヌクレオチドの置換、挿入及び／ 又は欠失、及び／又は一端もしくは両端での延長により修飾した前記配列（ａ３ ）である請求項４に記載のＤＮＡ配列。 ６．請求項３から５のいずれか一項に記載のＤＮＡ配列を包合し、適当な宿主中 に導入された時に前記ポリペプチドを発現することができるベクター。 ７．プラスミドである請求項６に記載のベクター。 ８．　プラスミドｐＦＣ１３８。 ９．　プラスミドｐＦＣ１６４。 １０．請求項６から９のいずれか一項に記載のベクター又はプラスミドで形質転 換した宿主。 １１．哺乳動物細胞系である請求項１０に記載の宿主。 １２．細菌である請求項１０に記載の宿主。 １３．請求項１０から１２のいずれか一項に記載の形質転換宿主を前記ポリペプ チドが発現されるような条件で培養することを含む請求項１又は２に記載のポリ ペプチドの製造方法。 １４．キャリアータンパク質又はポリペプチドに結合した請求項１又は２に記載 のポリペプチドを含む融合タンパク質。 １５．医薬的に許容し得るキャリヤー又は希釈剤を含み、且つ有効成分として請 求項１又は２に記載のポリペプチドを含む医薬組成物。 １８．前記ポリペプチドが請求項１４に記載の結合体の形態を有する請求項１５ に記載の組成物。 １７．ヒトｂＦＧＦ又はヒトａＦＧＦのアンクゴニストとして使用される請求項 １又は２に記載のポリペプチド。