JPH04504663A

JPH04504663A - 蛍光水性バイオアッセイ及び方法

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Publication number: JPH04504663A
Application number: JP2507243A
Authority: JP
Inventors: ヘイエス、ケニス・アール
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1989-04-26
Filing date: 1990-04-24
Publication date: 1992-08-20
Also published as: US5094944A; AU5632090A; WO1990012886A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】蛍光水性バイオアッセイ及び方法発明の分野本発明は、蛍光標識を用いた水的環境における毒性物質アッセイ、本新規アッセイの使用法及び水性分析に用いられるキットに関する。

発明の背景活性及び不活性微生物を測定するために［例えばフリントによるヨーロピアン・ジャーナル・オブ・アプリセディメント・マイクロバイアル・アクティビティ・テスト・フォア・ザ・ディテクション・オブ・トキシカンＳＴＰ　Ｒ，Ｄ、：Ｉ −ルドウエル（Ｃａｌｄｗｅｌｌ）細編、アメリカン・ソサイエティー・フォー・テスティング拳アンド−７タリアルズ（Ａｍｅ「１ｃａｎ　５ｏｃｉｅｔｙ　ｆｏ「Ｔｅｓｔｉｎｇ　ａｎｄＭａｔｅ「１ａｌｓ）　、フィラデルフィア、１９８５年、　２１４乃至２２８頁；エンバイロメンタル・トキシコロジー・アンド・ケミストリー（Ｅｎｖｉ＋ｏ＋＋＋＋＋ｅｔａｌ　Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ　ａｎｄ（１９８９年）；トキシティー・アセスメント、４巻、　２５５巻、１６６頁（１９８５年）；オブストらによるトキシティー・アセスメント、３巻、８１頁（１９８８年）参照］及び生物量を測定するために［例えば、トイバーらによるヨーロピアン・ジャーナル・アプリケーション・オブ・マイクロバイオロジー、４３巻、１２５６頁（１９８２年）；シュニューレル（５ｃｈｎｕ＋ｅ＋）によるアプライド・アンド・エンバイロメンタル−マイクロバイオロジー（Ａｐｐｌｉｅｄ　ａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｍｉｃ＋ｏｂｉｏｌｏｇｙ）　４巻、１８５頁（１９７７年）；Ｂｉｏｌｏｇｙ）　、７６巻、２４７頁（１９８３年）参照１分光測定法又は蛍光測定法を用いる多くの酵素活性試験がある。

蛍光標識は猫や鼠の中枢神経のｐ　Ｈを測定するのに用いられている［例えば、スントらによるウンベリフェロン・アズ・アン・イントラセルラー・ビーエイチーセンシティブ・フルオレッセンツ・インディケータ−・アンド・ブラッド−プレインバリアー・プローブ：インストルメンテーション・カリブレーション・アンド自アナリ米国特許第５．５３４．３１７号には魚の食物消費量を調査するために用いられた蛍光染料が開示されている。

これらの技術のいずれの方法論も、１９７７年（ＰＬ９５−２１７　）の連邦修正水質汚染管理法（Ｆｅｄｅｒａｌ　ＷａｔｅｒＰｏｌｌｕｔｉｏｎ　ＣｏＩＩＩＩＯｌ人ｃｔ　Ａｍｅｎｄｍｅｎｔｓ）　［清浄な水質法（Ｃｌｅａｎ　Ｗａｔｅ「Ａｃｔ　）　］　、セクション１０１（ａ）　（３）により義務づけられた標準ＬＣ６゜及びＥＣ３゜毒性値を決定するために、一連の検査濃度物を用いていない。又、これらの方法論のいずれも、迅速で効率の良い方法で水生生物体における毒性物質を測定する方法も提供していない。

水供給源における水の毒性を測定するための現存する好ましい方法は一般に４８時間ミジンコ（ｄａｐｈｎｉａ　）試験又は９６時間大頭ウグイ（Ｉａｌｈｅａｄ　ｍ１ｎｎｏｖ）試験を用いる。

これらの方法論では、多細胞生物体を２乃至４日間毒性物質にさらし、その後に死亡率を決めるために生存生物体を数える。その他のバイオアッセイで、２４時間乃至２１日間検査を用いるものが、米国環境保護局、ＡＳＴＭ。

５ＥＴＡＣ，０ＥＣＤ及びその他の州及び私的研究グループにより文献に記載されている。本技術分野において、信頼度及び正確度が高く素人か自信をもって用いることができる、迅速かつ安易なバイオアッセイ試験の必要性は明白である。

本発明の目的は、安易で迅速かつ効率の良い方法で、水性源における種々の毒性物質を測定するのに用いられる水性バイオアッセイを供給することである。

さらに本発明の目的は、水性源における毒性物質の致死（急性）濃度及び準致死量（慢性）濃度を検査する新規な水性バイオアッセイを供給することである。

さらに本発明の目的は、迅速かつ効率の良い方法で水性源における種々の毒性物質の濃度を測定する方法を提供することである。

さらに本発明の目的は、水性源における毒性物質を検査するためのバイオアッセイキットを提供することである。

本発明のこれらの目的及び他の目的は、本発明の記載及び実施例を読めば明らかである。

本発明の概要本発明は、水性環境、好ましくは水の供給における毒性物質の量及び効果を測定するための新規アッセイに関する。又、本発明は、水性源における毒性物質の量を検査するためのアッセイを用いる方法に関する。さらに、本発明は、本発明のアッセイを実施する検査キットに関する。

策−に、本発明は、（ａ）　ｉ検査の対象となる１種の毒性物質を含む水性源、１１酵素的変換後に蛍光生成物となる有効量の酵素基質及び１１１蛍光的に識別されるに充分な量の蛍光生成物を生成する酵素基質を酵素的に変換させることのできる酵素系をもつある濃度の生物体から成る少なくとも１つの検査試料及び（ｂ）　ｉある濃度の毒性物質を含む水性源、１１同量の　（ａ）ｉｉの酵素基質、ｉｉｉ同濃度の　（ａ）ｉｉｉの生物体から成る対照標本の少な（とも１つの対照標本と１毒性物質を含まない水性源、１１同量の　（ａ）ｉｉの酵素基質、１１１同濃度の　（１）ｉｉｉの生物体から成る第二の対照標本を含む、水性源中の毒性物質の存在を決定するための水性バイオアッセイに関する。

その他に、上記のバイオアッセイは、好ましくは、各対照標本が異なる濃度の毒性物質を含有する少なくとも３種の対照標本を含む。

本発明のバイオアッセイにおいて、いずれの水性源も毒性物質の濃度又は効果を測定するために分析され得る。

特に、水質安全ガイドラインに合致させる目的で毒性物質の量及び効果を測定するために、飲料水の安全性を測定するために又は廃水処理場での汚泥中の微生物における毒性物質の効果を測定するために、貯水池、河川、湖、小川、池及びその他の水の溜まり場、産業廃水、地方自治体の廃水、浸出水、溶出水、液体相、懸濁粒子相、特定源又は非特定源試料及び純粋化合物からの媒体源及び、塩水水性源を含む水性環境を検査する。

本発明のバイオアッセイは、１種又は複数の毒性物質を分析する水性源を含む検査試料及び、各々が他の対照源（＋ｅｌｅ＋！ｎｃｅ　５ｏｕｒｃｅ）と異なる毒性物質量を含有する数種の対照試料（＋ｃｌｅ＋ｎｃｅ　ｓａｍｐｌｅ）を用いる。検査試料及び対照試料を含むすべての試料は、実質的に等しい酵素基質の濃度及び生物体の数を含んでいるのが好ましい。

一般に、各検査試料及び対照試料を３つずつ分析するのが好ましい。

本発明の方法においては、水性検査試料の一定量を計って分は与え、検査試料にいくつかの生物体を入れることにより、検査試料を用意する。一定の時間が経過した後、酵素基質の測定量を各濃度物質１ご添加する。酵素基質の濃度及び生物体の数は、酵素基質が、標準蛍光測定法を用いて識別できる蛍光生成物へ酵素的変換するのに十分なものである。検査試料の他に数種の対照試料を用意する（好ましくは各３つ）。各々の対照標本は、０からかなり高濃度の範囲である既知量の毒性物質を含有する。各対照試料は、検査試料と同し酵素基質の濃度及び生物体を含有する。

検査試料及び対照標本を用意した後に、対照溶媒（＋ｅｌｅ＋ｅｎｃｅ　５ｏｌｖｅｎｔ　）中、好ましくは蒸留水中の酵素基質を短時間（一般に約３０秒乃至数分）超音波処理をし、検査試料及び対照標本に添加し、その後、酵素基質を蛍光生成物に酵素変換させるのに十分な時間インキュベートした。インキュベーションの時間は、一般に、約１分乃至数時間である。一般に、インキュベーション温度はバイオアッセイに用いる生物体の種類及び基質の変換をする酵素の反応速度による。一般に、検査試料及び対照試料は、約０℃乃至約２５℃の温度でインキュベートされるが、それより高い温度も低い温度も用いられる。酵素が酵素基質を変換するのに十分な時間インキュベーションをした後、その容器（ｃｈａｍｂｅｒ）を紫外（Ｕ　Ｖ）光源にあて、その後に肉眼で又は蛍光計で蛍光を観察することにより各試料を測定する。各試料の蛍光を測定後、検査試料を対照標本の蛍光と比較する。この比較は、単に肉眼で又は、蛍光計［セコイア・データ・モデル（Ｓｅｑｕｉａ−Ｔｕ＋ｎｏ　Ｍｏｄｅｌ）　４５Ｇ、フエランド−７− り（Ｆａ＋＋ｎｄ　ｋｌａｒｋ）分光蛍光計又はギルフォード・フルオロ■スキャニング（Ｇｉｌｆｏ＋ｄ　Ｆｌｕｏ＋ｏ　ＩＶ　Ｓｃａｎｎｉｎｇ　）分光螢光針］等の測定器を用いて行うことができる。

検査試料の蛍光強度を対照標本の蛍光強度を比較することにより、検査した水性源の毒性物質量及び／又は毒性効果を測定できる。この操作を用いて、１種以上の毒性物質の濃度を測定できる。その他に、広範囲の毒性物質のＬＣｌ。及びＥＣ１゜毒性値を容易に予測及び／又は決定できる。

又、本発明は約ｌｐｐｍ乃至約１１００ｐｐの最終濃度を生ずるのに十分な酵素基質及び、その酵素基質を用いるための説明書を含む検査キットに関する。ある種のキットには、測定できる量の蛍光生成物を生成するのに十分な数の生物体［包嚢に包まれた（ｅｎｃｙｓｔｅｄ）ものも含む］も含まれ得る。酵素基質又は基質及び生物体の他に、本発明のキットは、マルチウェルプレート（ｍｕｌｌｉｗｅｌｌｐｌａｔｅ　）又は試験管のような照射（ｅｘｐｏｓｕ＋ｅｃｈａｍｂｅｒｓ）、蒸留水、ピペット（検査媒体及び希釈媒体）、基質混合ガラス瓶、超音波機、説明書、ブラックライト（紫外光源）、蛍光計、紫外安全メガネ又はゴーグル、ライトボックス、オートピペッタ−（ａｌｏｐｉｐｅＨｏ＋）　、安全手袋、記録カード、統計プログラム、関連容器（ｐａｃｋａｇｉｎｇ　）、暗箱及びこれら構成物品の組み合わせの一種以上を含む１図は実施例２のＥ　Ｃ５゜値を４８時時間Ｃ１ｏと相関させたグラフであ。

２図は、実施例２から得たデーターと文献から得たマイクロドックス（Ｍｉｃ＋ｏｆｏｘ）高低ＥＣ６゜純粋化合物値を比較したものである。はとんどすべての場合において、本発明はマイクロドックス試験と同等に又はそれ以上に高感度であった。

図３は、実施例２から得たデーターとピメファレス・関する文献から得た９６時時間Ｃ５，純粋化合物値を比較したものである。この比較において、本発明は、人頭ウグイ試験と同等又はそれ以上に高感度であった。

図４は、従来の４８時間ＥＣ５０方法論及び本発明を用いて数種の複合排出水をバイオアッセイしたときに得られたデーターを比較したものである。得られた結果は優れた相関関係（０，９０乃至０．９６のＲ２値）を示した。この図において、ＥＣ，。値及びＥＣ５０は百分率排出水で示したものである。

発明の詳細な説明本発明を記載する明細書のすべてにわたり以下の定義が用いられる。

「毒性物質」という用語は、生物組織に有害な影響を及ぼす水性源中のいずれの有毒物質をも記載するために明細書全般にわたり用いられており、化学組成物、高分子物質、生化学物質、イオン、放射性物質を含む。

「酵素基質」という用語は、変換後、蛍光生成物を生成する基質を記載するために明細書全般にわたり用いられている。

「生物体」という用語は、本発明の酵素基質を変換し、測定可能な蛍光生成物を生成することのできる酵素系を有する生物体を記載するために明細書全般にわたり用いられている。生物体という用語は活性及び休眠形態のもの及び包嚢生物体（ｅｎｃｙ＋Ｉｅｄ　ｏｒｇａｎｉｓｍｓ）をも含む。

「水性源」という用語は、測定する水性源を記載するのに明細書全般にわたり用いられている。「水性源」という用語はすべてのタイプの淡水及び塩水源を包含する。

本明細書に用いられているｒＬＣｌ。」という用語は、検査生物体の５０％改死率を生ずる毒性濃度を記載する。

ｒＥＣ，。」という用語は、検査生物体が機能するためには有毒な影響を与えそして、検査される生物体の機能の能力における測定可能な損失（すなわち、水泳能力、生殖能力の損失）を与えるような毒性物質の濃度を説明するために用いられている。

本発明には、多くの酵素基質が用いられ、その中には酵素的変換後、蛍光生成物を生成するような蛍光を発するいずれの基質をも含む。本発明において、開裂した（ｃｌｅａｖｅｄ）　ときに蛍光生成物となるものを１部に含む酵素基質が用いられる。しかし、本発明の実施にはウンベリフェロンを生成するウンベリフェリル系が特に有用であることが見出された。本発明に用いられるウンベリフェリル系の酵素基質のなかには、例えば、４−メチルウンベリフェリル　ｂ−Ｄ−ガラクトシド、４−メチルウンベリフェリル　ａ−Ｄ−グルコシド、４−メチルウンベリフェリル　ｂ−Ｄ−キシロシド、４−メチルウンベリフェリルアセテート、４−メチルウンベリフェリルＮ−アセチル−ｂ−Ｄ−ガラクトシドニド、４− メチルウンベリフェリル　Ｎ−アセチル−ａ−Ｄ−グルコサミニド、４−メチルウンベリフェリル−ｂ−Ｄ−グルコサミニド、４−メチルウンベリフェリル−ａ −Ｌ−アラビノフラノシド、４−メチルウンベリフェリル−ａ７Ｌ−アラビノシト、４−メチルウンベリフェリルブチレート、４−メチルウンベリフェリル　ｂ −Ｄ−セロビオシド、４−メチルウンベリフェリル　ｂ−Ｄ−Ｎ、Ｎ−−ジアセチルキトビオシド、４−メチルウンベリフェリルアセテ−ト、４−メチルウンベリフェリル　ｂ−Ｄ−フコシド、４−メチルウンベリフェリル　ａ−Ｌ−フコシド、４−メチルウンベリフェリル　ｂ−Ｌ−フコシド、４−メチルウンベリフェリル　、ａ　−Ｄ−ガラクトシド、４−メチルウンベリフェリル　ｂ−Ｄ−グルコシド、４−メチルウンベリフェリル　ｂ−Ｄ−グルクロニド、４−メチルウンベリフェリルヘプタノエート、４−メチルウンベリフェリル　ａ−Ｄ−マンノピラノシド、４−メチルウンベリフェリル　ｂ−Ｄ−マンノピラノシド、４−メチルウンベリフェリルオレエート、４−メチルウンベリフェリルパルミテート、４ −メチルウンベリフェリルフォスフェート、４−メチルウンベリフェリルプロピオ・ネート、４−メチルウンベリフェリルステアレート、４−メチルウンベリフェリルサルフェート、４−メチルウンベリフェリル　ｂ−Ｄ−Ｎ、Ｎ−、Ｎ′− −１リアセチルキトトリオース及び４−メチルランへりフエリル　２゜３．５− １−リーＯ−ベンゾイルーａ−Ｌ−アラビノフラノシド等がある。

本発明にも用いられる酵素基質の量は、酵素的変換が完了したときに蛍光生成物を生成する量である。約ｌｐｐｍ乃至約ＩＨｐｐｍの少なくとも一種の酵素基質量を含むのが有益であることが見出だされた。しがし、上記範囲外の量も用いることができる。

酵素基質は、検査試料及び対照試料に直接存在させてもよいし、超音波処理をするか、粉砕するか又は使用前に物理的に改変させてもよい。

本発明のバイオアッセイには、酵素基質からの蛍光標識を開裂させ、蛍光生成物を生成する生物体を用いる。

これらの蛍光標識は、検査種の酵素系の生存可能性の機を変換し蛍光生成物を生成できる酵素系を有する生物体ならいずれても本発明に用いることができる。本発明によれば、酵素基質を変換し、蛍光生成物を生成するのに有用な典型的な酵素又は酵素系のなかには、例えば、ＡＭＰデアミナーゼ、アリール炭化水素ヒドロキシラーゼ、７−エトキシクマリン　Ｏ−デエチラーゼ、シトクロムＰ−４５０（一般活性度）、７−アルコキシクマリン０−Ｄ−デアルキラーゼ、Ｏ−デエチラーゼ及びアデニル酸シクラーゼ等がある。

本発明に用いられる生物体のなかには例えば種々の細菌、菌類、原生動物、刺胞動物、例えばヒドラ、プラナリアのような扁形動物門類、紐形動物門類、特に輪生を含む腹毛類（＾ｓｃｈｅ１ｍｉｎｌｈｅｓ　）　、リンゲラ種（Ｌｉｎｇｕｌａｉｐｐ、）のような腕足類、種々の、特に複合試料に混合された酵素基質を食した後のカイツムリ、蛤、イカ及びタコを含む軟体動物、ゴカイ属の原虫（Ｎｅ＋ｅｉｓ　ｓｐｐ、）を含む多毛類、アミエビを含む節足動物門類、昆虫の幼虫、ダフニア種　（Ｄａｐｈｎｉａ　ｓｐｐ、）　、人頭ウグイ（ｆａ！ｈｅａｄｍｉｎｎｏｖｓ）のような魚を含む種々のを椎動物、両生類及び生活サイクルの種々の過程におけるその他のグループがある。

本発明で用いる特に有用な生物体としては、デフニア６マグナ（Ｄａｐｈｎｉａ　ｍａｇｎａ　）　、セリオダ７二７−ドゥビア（Ｃｅ＋１ｏｄａｐｈｎｉａ　ｄｕｂｉａ　）　、ダフニア・ピュレックス（Ｄａｐｈｎｉａ　ｐｕｌｅｘ　）　、自治体の下水や産業廃水処理獲物などの混合種である。上記の生物体の他に、本発明のバイオアッセイとして特に有益な生物体には、蛍光酵素基質にさらした後に体内から蛍光を発する生物体がある。これらの生物体には、ダフニア種の他に、ブラキオｍｉｎｎｏｗｓ）の幼魚及び成魚、及びショウジヨウバエの幼虫等がある。

本発明の試料に用いられる多数の生物体はその用いられる生物体の種類により多岐にわたる。例えば、細菌やその他の微生物の場合、生物体の数は一般に数百万に及ぶが、ダフニア又は人頭ウグイのような多細胞生物体の場合、生物体の数は一般に１０未満、好ましくは約５である。

水性源の毒性を測定するに際し、バイオアッセイの感度は百分率（工場の廃水）から兆分率（ある特定のイオン又は２，３，７．８−ＴＣＤＤ等の化学化合物の量を測定するとき）と多岐にわたる。

一般に毒性物質を測定する際、対照標本を含む各標本は、３つずつ測定される。

検査は、検査に用いられる生物体、酵素基質及び、測定される毒性物質にもよるが、一般に１０分から数時間行われる。

典型的な米国環境保護局（Ｅ　Ｐ　Ａ）の水性毒性物質規約は、毒性物質学者が所定の間隔（すなわち、０．４．８．２４．７２．９６時間）で毒性物質の致死的、準致死的結果を観察することを義務づけている。ＥＰＡの規約を達成するには、（ａ）検査に用いる水性源の一連の検査濃度（ｔｅｓｔ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ）を開発する工程、（ｂ）各々の検査のための生物体を各々の検査用濃度に割り当てる工程及び（ｃ）所定の感覚で検査の致死的及び準致死的影響を観察する工程、の全工程を行なわなければならない。

本発明のバイオアッセイは、毒性物質の生物体に及ぼす致死的及び準致死的影響の観察を簡略化する。ＥＰＡの試験の場合のように、１．２又は４日以上の期間にわたり検査を行なうのではなく、本発明のバイオアッセイでは、研究者が数分のような短時間、一般に１又は２時間以内に毒性物質量を正確に測定できるのである。

上記に加えて、本発明のノくイオア・ソセイ及び方法論では、水生個体群の一般健康状態も決定できるのである。

これにより、魚類岬化場が魚の個体群の相対的健康状態を決定するために重要な利用価値がある。基質を飼料とともに供したり、瞬化場の水柱に直接添加することもできる。さらに、本発明においては、例えば箭化場又（′！貯水所における生物体の健康をより完全（こ把握すること力くできる。又、毒性検査は廃水処理場にお一へで、生物学的に活性化された廃水処理場に既知の毒性物質を入れる許容（無害な程度）量を測定するためにも用ｔ）られる。さらに、本発明は、廃水処理場の効率を測定するのｔこも用いられる。

本発明のバイオアッセイは、多数の毒性物質の濃度を測定するのにも用いられる。基本的に生物体１こ有害な影響を及ぼすいかなる毒性物質、例えば銅、カドミウム、水銀、亜鉛、クロムフェノール、ベンゼン、ホルムアＪレデヒド、トルエン、ポリクロロベンゼン及びポＩＪクロロフェノールナトリウムを含むその他の有機化合物、硫イし物を含む塩類及びその他の毒性物質を性格に測定することができる。

本発明の方法において、水性源の毒性物質力（生物体（こ及ぼす影響を測定するための操作は、１）検査試料水性源を一般に３つずつ用意する工程、２）０から少なくとも約ＬＣ５゜又はＥＣ５ｏの濃度の毒性物質量を含有する各３セ・ソトの対照試料を３つずつ用意する工程、３）生物体を１及び２の工程から得た試料に前記生物体とともにインキュベートした酵素基質から得られた蛍光生成物を測定するのに十分な量を添加し、一定時間インキュベーションする工程、４）工程３から得た試料に酵素基質を、測定可能な蛍光生成物を生成するのに有効な量添加し、その試料を混合し均質にする工程、５）さらに約０℃乃至約３０と℃の温度で約１分間以上インキュベーションする工程及び６）試料に紫外光源をあて、発する蛍光を測定する工程を含む。

本発明の方法に用いられる、加えるその他の工程は、基質溶液を超音波処理し、標準統計的方法を用いてＬＣｌ。値及びＥＣ５０値を算定する工程を含む。これとは別に、環境保護局（ＥＰＡ）は定期的に「移動平均」　「プロビット」又は「２項係数Ｊ　（ＥＰＡから入手できる）と題するコンピュタ−プログラムを提供しているか、当業者は容易にこれらの一般的方法論を知ることができる。

本発明を例示する目的でのみ下記の実施例を提供するが、これらを本発明の範囲の限定として見做すべきではマルチウェルプレート（ｍｕｌｔｉｗａｌｌ　ｐｌａｔｅ　）における本実施例の目的は、検査物質である硫酸銅（Ｃｕ５ｏ４）の通常のミジンコ、ダフニア・マグナに対するＥＣ，。値及び信頼限界を決定することである。

検査種として無を椎動物のダフニア・マグナを用い、対照標本の毒性の硫酸銅を下記の濃度で３つずつ有する１連の検査濃度物（ｔｅｓｔ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ）を用意した。

０−Ａｐｐｍの反復試験物１．２及び３０−Ｂｐｐｍの反復試験物１．２及び３０．０１１）Ｉ）ｍの反復試験物１．２及び３０、ｌｐｐｍの反復試験物１．２及び３１．０ｐｐｍの反復試験物１．２及び３１０．０ｐｐｍの反復試験物１．２及び３上記の各ＣｕＳＯ４溶液の１　ｍｌをピペットでマルチウェルプレートに移した（１濃度当り３つ反復試験、１反復試験物当り１ｍ１）。プレートの１８ウエルの各々にダフニア・マグナを添加し、検査濃度物に５分間さらした。その後、０−Ｂ　１．２及び３を除＜１８ウエルの各々に対して、４−メチルウンベリフェリル　ｂ−Ｄ−ガラクトシド（ＭＵＦ）を各ウェルの表面に滴下した。

粉末が各ウェルの底に沈降した。１分間つけた後に、各試料の数値を読んだ。紫外光（ブラックライト）を暗室内のマルチウェルの上にあてた。対照０−Ａｐｐｍの蛍光強度（最大強度）及び対照０−Ｂｐｐｍの蛍光強度（最小強度）を基準線として用いて、０．０１乃至１０．０ｐｐｍのＣｕＳＯ４の検査濃度の効果を比較した。表１に示したような結果が観察された。ＥＣ５０を３．２ｐｐｍと決定した。

Ｑ−Ａ　ｐｐｍ　Ｃ１１Ｓ０４　発光　発光　発光全て生存　全て生存　全て生存０−Ｂ　ｐｐｍ　Ｃｕ５Ｏ，、発光　発光　発光全て生存　全て生存　全て生存０、Ｏｌｐｐｍ　Ｃｕ５Ｌ　発光　発光　発光全て生存　全て生存　全て生存０、　ｌ　ｐｐｍ　ＣｕＳＯ４発光　発光　発光全て生存　全て生存　全て生存１．０　ｐｐｍ　Ｃｕ５Ｏ，＋　発光　発光　発光全て生存　全て生存　全て生存１０、　Ｏｐｐｍ　ＣｕＳＯ４非発光　非発光　非発光全て生存　全て生存　全て生存この検査により、ＩＯ，ＯｐｐｍのＣｕＳＯ４の濃度て１０分未満に準致死的悪影響が検知された。

実施例　２検査種としてダフニア・マグナを用いて、標準対照毒性物質Ｃ１１ＳＯ４の一連の検査濃度を３つずつ確立した。各反復試験物は１５ｍ１容のガラス試験管中に検査媒体１０ｍ１からなるものであった。５つの生物体を各試験管に入れた。

その後、試験管を周囲の室環境条件下で１時間放置した。

１時間後、０．４ｍｇの４−メチルランへりフエリル　ｂ−Ｄ−ガラクトシド（ＭＵＲ）を添加した。ＭＵＦを添加して１５分後、試験管を暗室に入れた。その後、対照反復試験物を暗室内で観察した。強度に蛍光を発するダフニア・マグナ体の数を記録にとった。すべてのダフニア・マグナ体が強度に蛍光を発した。その後に、これらの生物体を他の３つずつの濃度の各々と比較した。対照と同じ強さで蛍光を発した生物体の数を記録した。

その後、データーを従来の方法［メソッズ・フォア・メジャーリング・ザ・アキュート・トキシティ・オブ・エフルエンツ・ツー・フレッシュウォーター・アンド・マリーン・オーガニズムス（ＭＮｈｏｄｓ　ｔａｒ　Ｍｅｓｕｒｉｎｇ　１）ｉｅＡｃｕｔｅ　Ｔｏｘｉｃｉｔｙ　ｏｆ　Ｅｊｔｌｕｅｎｊ＋　ｔｏ　Ｆｒｅｓｈｗａｌｅ＋　ａｎｄＭａｒｉｎｅ　Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ）　３版、Ｅ　Ｐ　Ａ／　６００／４−８５／（１１３］により統計学的に分析した。対照と同じ程度強く蛍光を発しない各生物体はそのデーターを処理する場合死んでいるものとして処理した。この操作により、ダフニア・マグナを用いての銅のＥＣ５０を［１，２３＋）ｐｍと決定した。

その後、１１の標準対照毒性物質を上記の方法により分析した。その分析結果を表２に示す。

表　２Ｃｕ　０．２３ｐｐｍ　ｌ’１％ＮａＰＣＰ　１．０　８％Ｃｄ　Ｏ，４１１＋％ＮａＬＳ　７４．ｌ　３２％フェノール　３７．１　１９％Ｈｇ　０．０２　２１％ホルムアルデヒド　３９．２　１４．３％トルエン　６．３　１４％注：各毒性物質に対して異なる時間で３回検査を行なった。

上記のＥＣ５０値は、これまでのダフニア・マグナの４８時時間Ｃ５０値と相関関係を有した（Ｒ２＝０．８Ｌ　Ｏ，００４の有意性）。このデーターを図１に示した。この図において、斜めの線は、「同等線（ｌｉｎｅ　ｏｆ　ｅｑｕａｌｉｔｙ）Ｊを表わす。すべてのデーター・ポイントがその線上にあれば本発明により決定したＥＣ１゜値は文献から得られたＬＣｌ。値に全く等しかった。「同等線」の下にある図１の値は、ＬＣ，、、の試験が本発明により得られたＥＣ，。値よりもより感受性があることを示す。図１の値が「同等線」の上である場合は、本発明がより感受性があることを示す。

図２は、本発明のバイオアッセイで得られたダフニア・マグナのデーターと文献から得られたマイクロドックス（Ｍｉｃｒｏ）ｏｘ）高低ＥＣＭ。純粋化合物値との比較である。

マイクロドックスは、マイクロビクス・インコーホレーテッド［（ｌＪｉｃ＋ｏｂｉｃｓ、Ｉｎｃ、　）　、米国力＋）　７　、！−ルニ７州］から入手できる試験である。

端的には、マイクロドックス試験法は、非既知の毒性の試料にさらされた前後の生物発光細菌の光出力を測定する。光の損失の程度−検査生物体の代謝的阻害を表わす−は試料の毒性の程度を表わす。はとんどすべての場合、本発明で得られる値はマイクロドックス試験法から得る調査報告書と同じ程度の感度又はそれ以上の感度を示した。２図では、「０」の水平線（Ｘ軸）の上に出た各バーは、本発明がｒｘＪ倍感度がよ（、「０」線の下に出たバーは、マイクロドックス試験法がｒｘＪ倍感度がよいということを示す。例えば、本発明はマイクロテックス試験法よりＣｕＳＯ４には１５乃至２００倍感度がよかった。

図３は、ダフニア・マグナの感度を、ビメファレス・プロメラス（人頭ウグイ）に関する文献からとった９６時間ＬＬＣｌ純粋化合物値の感度と比較した。はとんどの場合、本発明は、人頭ウグイ試験と同程度又はそれ以上の感度であった。

上記の方法論は、ダフニア・マグナ、ダフニア・ピュレックス、セリオダフニア・ドウビア、アルテミア・サリナ及び魚を含む数種の無を推動物を用いて好結果で達成された。

処理場は汚染物質を劣化する活性汚泥における生物学活性に依存している。活性汚泥における生物学的生命が悪影響をうければ、もはや汚染物質の有効な劣化は行われない。新しい又は別の排水が処理場に持ち込まれる度にいつも、生物学活性が悪影響をうける。下記の検査は、汚泥における処理場の生物社会に対する排水の毒性の程度に関するものである。

蛍光計［セコイア・ターナ−・モデル４５０　（Ｓｅｑｕｏｉａ−Ｔｕ＋ｎｅ＋　Ｍｏｄｅｌ　４５０）　、セコイア−ターナ−（米国、カリフォルニア州）から入手コを用いて、各検査濃度で蛍光の強度を測定した。１５ｍ１の検査量を有する２　０　ｍｌ試験管の全２１本を、検査排水に対する活性汚泥の上澄みの下記の割合を用いて３つ用意した。

よｆｆ１−’＞　検査排水１００％　ａ、ｂ、ｃ　０％　ａ、ｂ、ｃ５０％　ａ、ｂ、ｃ　５０％　ａ、ｂ、ｃ２５％　ａ　％　ｂ　、ｃ　７５％　ａ、ｂ、ｃ１２％　ａ、ｂ、ｃ　８８％　ａ、ｂ、ｃ６％　ａＳｂ、ｃ　９４％　ａ、ｂ、ｃ３％　ａＳｂ、ｃ　９７％　ａ、ｂ、ｃｌ、５　％　ａ、ｂ、ｃ　９ｇ、５％　ａ、ｂ、ｃ検査濃度物を混合後、１ｏ分間放置した後に、各試験管に４−メチルウンベリフェリル−ｂ− Ｄ−ガラクトシド（ＭＵＦ）を２■添加した。その後、各試験管をてのひらの間で回し、試験前立てに置いた。ＭＵＦが生物体により変換するのを５分まって（検査特異的）、試験管を励起させる（ｅｘｃｉｔｅ）ことにより発光の強度を３４６乃至３７５ナノメーターでの蛍光計で測定した。まず、全てのｒａＪ試験管について蛍光測定を行なった。その後に、ｒｂＪ試験管について、最後にｒｃＪ試験管について行なった。ＥＣ６゜値及びその信頼限界を従来法（例えば、上記Ｅ　Ｐ　Ａ／　６００／４−８５／　Ｄ１３参照）ニよす決定した。

実施例　４排水処理用汚泥に対する流入水の毒性効果の測定本実施例は、実施例３におけるような排水処理場での生物学的活性汚泥に流入水の毒性効果を測定することを目的とする。

本実施例において、０．５０．７５及び１００％排水の検査濃度の１０ｍ１の検査量を有する３つの１５ｍ１試験管を用意した。各試料（０，５０及び７５）を加圧滅菌した培養水（ｃｕｌｔｕｒｅ　ｗａｔｅｒ）で希釈した。各々の試験管に２　ｍｌの混合ベース（ＭＢＬ）をピペットで移した。ＭＢＬは微生物個体群（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）を含有する。ＭＢＬを周辺の室温で１時間インキュベートした。その後、ＭＵＦを０．４■添加し、そして試験管を手で回して均質にした。その微生物をＭＵＦ基質に１５分間反応させた。

１５分後に、試験管の副標水を採り（３，０ｍ１）　、蛍光を蛍光計（セコイア −ターナ−・モデル４５ｏ）で測定した。

対照からの蛍光出力を検査濃度物からの発光を判断するための基準線として用いた。試料濃度に対する悪影響百分率をプロットすることによりＥＣ，、値を算定した（ＥＰＡ／　６００／４−８５／　０１３）。

ダフニア・マグナを一連の排水濃度物に入れた。各３つの１０ｍ１試料をピペットで１５ｍ１容試験管に入れた。０％（対照）、６．２５％、１２．５％、２５％、５０％及び１００％の排水検査濃度物をアッセイした。５つのダフニア・マグナ（生まれてからの日数が±１である）を各試験管に添加した。試験管を周辺の室温で１時間放置した。一時間後、各試験管に蒸留水２５０μ！中の超音波処理したＭＵＦを０．４ｍｇ注入した。その試験管を室温でさらに１５分間放置した。１５分後、その−組を実施例２と同じように評価した。このデーターからＥＣ１゜値が算定され、ＬＣ，。

が正確に予測された。

数種の複合排水を従来の４８時間ＬＣ，。方法論及びダフニア・マグナを用いる本発明のバイオアッセイの両方でバイオアッセイした。４図に示したその結果は優れた相関関係（０９０乃至０．９６の範囲のＲ２値）を示した。

図４において、ＥＣ５ｏ及びＬＣ５Ｑ値を百分率排水で表わした。

本発明を特定の実施例や応用例で記載したが、当業者は本教示に照らして、本発明の範囲を逸脱しないその他の実施態様及び改変を生み出すことができる。従って、図面及び本明細書の記載は本発明の理解を容易にするための例として提供されるもので本発明の範囲を制限するものではないことを理解すべきである。

ＬＯＧ　ＬＣ５０ＬＯＧ　ＬＣ５０手続補正書（自発）１　事件の表示国際出願番号　ＰＣＴ／ＵＳ９０１０２２０８２　発明の名称蛍光水性バイオアッセイ及び方法３　補正をする者事件との関係　特許出願人氏　名　へイエス、ケニスΦアール６　補正の対象国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．（ａ）ｉ検査する１種の毒性物質を含む水性源、ｉｉ酵素的変換後に蛍光生成物となる有効量の酵素基質及びｉｉｉ蛍光的に識別されるに十分な量の蛍光生成物を生成する酵素基質を酵素的に変換することのできる酵素系をもつ生物体の濃度物から成る少なくとも１つの検査試料及び（ｂ）ｉ１つの毒性物質濃度物を含む水性源、ｉｉ同量の（ａ）ｉｉの酵素基質、ｉｉｉ同濃度の（ａ）ｉｉｉの生物体から成る対照標本の少なくとも１つの対照標本とｉ毒性物質を含まない水性源、ｉｉ同量の（ａ）ｉｉの酵素基質、ｉｉｉ同濃度の（ａ）ｉｉｉの生物体から成る第二の対照標本を含む、水性源中の毒性物質の存在を決定するための水性バイオアッセイ。
２．前記酵素基質が、４−メチルウンベリフェリルｂ−Ｄ−ガラクトシド、４− メチルウンベリフェリルａ−Ｄ−グルコシド、４−メチルウンベリフェリルｂ− Ｄ−キシロシド、４−メチルウンベリフェリルアセテート、４−メチルウンベリフェリルＮ−アセチル−ｂ−Ｄ−ガラクトサミニド、４−メチルウンベリフェリルＮ−アセチル−ａ−Ｄ−グルコサミニド、４−メチルウンベリフェリル−ｂ− Ｄ−グルコサミニド、４−メチルウンベリフェリル−ａ−Ｌ−アラビノフラノシド、４−メチルウンベリフェリル−ａ−Ｌ−アラビノシド、４−メチルウンベリフェリルブチレート、４−メチルウンベリフェリルｂ−Ｄ−セロビオシド、４− メチルウンベリフェリルｂ−Ｄ−Ｎ，Ｎ−ジアセチルキトビオシド、４−メチルウンベリフェリルエライデート、４−メチルウンベリフェリルｂ−Ｄ−フコシド、４−メチルウンベリフェリルａ−Ｌ−フコシド、４−メチルウンベリフェリルｂ−Ｌ−フコシド、４−メチルウンベリフェリルａ−Ｄ−ガラクトシド、４−メチルウンベリフェリルｂ−Ｄ−グルコシド、４−メチルウンベリフェリルｂ−Ｄ −グルクロニド、４−メチルウンベリフェリルヘプタノエート、４−メチルウンベリフェリルａ−Ｄ−マンノピラノシド、４−メチルウンベリフェリルｂ−Ｄ− マンノピラノシド、４−メチルウンベリフェリルオレエート、４−メチルウンベリフェリルパルミテート、４−メチルウンベリフェリルフォスフェート、４−メチルウンベリフェリルプロピオネート、４−メチルウンベリフェリルステアレート、４−メチルウンベリフェリルサルフェート、４−メチルウンベリフェリルｂ −Ｄ−Ｎ，Ｎ′，Ｎ′′−トリアセチルキトトリオース及び４−メチルウンベリフェリル２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−ａ−Ｌ−アラビノフラノシドから成る群から選択される、請求項１に記載のバイオアツセイ。
３．前記酵素基質が、約１ｐｐｍ乃至約１００ｐｐｍの濃度の４−メチルウンベリフェリル−ｂ−Ｄ−ガラクトシドである、請求項１に記載のバイオアッセイ。
４．前記バイオアッセイが、少なくとも３つの対照標本を含み、その各々の対照標本が、異なる濃度の毒性物質を含む、請求項１に記載のバイオアッセイ。
５．前記生物体が、細菌、菌類、原生動物、刺胞動物、扁形動物門類、軟体動物、多毛類、節足動物門類、昆虫の幼虫、ダフニア種（Ｄａｐｈｎｉａ　ｓｐｐ．）、大頭ウグイ（ｆａｔｈｅａｄ　ｍｉｎｎｏｗｓ）及び両生類から成る群から選ばれる、請求項１に記載のバイオアッセイ。
６．前記生物体が、ダフニア・マグナ（Ｄａｐｈｎｉａ　ｍａｇｎａ）、セリオダフニア・ドゥビア（Ｃｅｒｏｄａｐｈｎｉａ　ｄｕｂｉａ）ダフニア・ピコレックス（Ｄａｐｈｎｉａ　ｐｕｌｅｘ）、ニトロソモナス（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）種、ニトロバクター（Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）種、ダフニア種、ブラキオナス（Ｂｒａｃｈｉｏｎａｓ）種（輪虫類）、アルテミア・サリナ（Ａｒｔｅｍｉａ　ｓａｌｉｎａ）（塩水エビ）、大頭ウグイの幼魚及び成魚、及びショウジョウバエの幼虫から成る群から選ばれる、請求項１に記載のバイオアッセイ。
７．前記生物体がダフニア・マグナであり、前記酵素基質が４−メチルウンベリフェリル−ｂ−Ｄ−ガラクトシドである、請求項１に記載のバイオアッセイ。８１）検査資料の水性源を用意する工程、２）各々の対照試料が、前記毒性物質を０から少なくともおおよそＬＣ５０又はＥＣ５０の濃度を含有する複数の対照試料を用意する工程、３）工程１）及び２）の試料に生物体を、前記生物体とともにインキュベートした酵素基質から測定できる蛍光生成物を生成するのに十分な量添加し、一定時間インキュベーションする工程、４）酵素基質に工程３）で得た試料を、測定できる蛍光生成物を生成するのに有効な量添加し、試料を混合して均質にする工程、５）さらに約０℃乃至約３０℃の温度で約１分以上インキュベーションする工程及び６）試料を紫外光にあて、発する蛍光を測定する工程を含む、水性源の毒性を測定する方法。９前記酵素基質が、４−メチルウンベリフェリルｂ−Ｄ−ガラクトシド、４−メチルウンベリフェリルａ−Ｄ−グルコシド、４−メチルウンベリフェリルｂ−Ｄ −キシロシド、４−メチルウンベリフェリルアセテート、４−メチルウンベリフェリルＮ−アセチル−ｂ−Ｄ−ガラクトサミニド、４−メチルウンベリフェリルＮ−アセチル−ａ−Ｄ−グルコサミニド、４−メチルウンベリフェリル−ｂ−Ｄ −グルコサミニド、４−メチルウンベリフェリル−ａ−Ｌ−アラビノフラノシド、４−メチルウンベリフェリル−ａ−Ｌ−アラビノシド、４−メチルウンベリフェリルブチレート、４−メチルウンベリフェリルｂ−Ｄ−セロビオシド、４−メチルウンベリフェリルｂ−Ｄ−Ｎ，Ｎ′−ジアセチルキトビオシド、４−メチルウンベリフェリルエライデート、４−メチルウンベリフェリルｂ−Ｄ−フコシド、４−メチルウンベリフェリルａ−Ｌ−フコシド、４−メチルウンベリフェリルｂ−Ｌ−フコシド、４−メチルウンベリフェリルａ−Ｄ−ガラクトシド、４−メチルウンベリフェリルｂ−Ｄ−グルコシド、４−メチルウンベリフェリルｂ−Ｄ −グルクロニド、４−メチルウンベリフェリルヘプタノエート、４−メチルウンベリフェリルａ−Ｄ−マンノピラノシド、４−メチルウンベリフェリルｂ−Ｄ− マンノピラノシド、４−メチルウンベリフェリルオレエート、４−メチルウンベリフェリルパルミテート、４−メチルウンベリフェリルフォスフェート、４−メチルウンベリフェリルプロピオネート、４−メチルウンベリフェリルステアレート、４−メチルウンベリフェリルサルフェート、４−メチルウンベリフェリルｂ −Ｄ−Ｎ，Ｎ′，Ｎ′′−トリアセチルキトトリオース及び４−メチルウンベリフェリル２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−ａ−Ｌ−アラビノフラノシドから成る群から選択される、請求項１に記載の方法。１０前記酵素基質が４−メチルウンベリフェリル−ｂ−Ｄ−ガラクトシドである、請求項９に記載の方法。１１前記酵素基質が約１ｐｐｍ乃至約１００ｐｐｍの濃度で存在する、請求項９に記載の方法。１２前記生物体が、細菌、菌類、原生動物、刺胞動物、扁形動物門類、軟体動物、多毛類、節足動物門類、昆虫の幼虫、ダフニア種（Ｄａｐｈｎｉａ　ｓｐｐ．）、大頭ウグイ（ｆａｔｈｅａｄ　ｍｉｎｎｏｗｓ）及び両生類から成る群から選ばれる、請求項９に記載の方法。１３前記生物体が、ダフニア・マグナ（Ｄａｐｈｎｉａ　ｍａｇｎａ）、セリオダフニア・ドゥビア（Ｃｅｒｉｏｄａｐｈｎｉａ　ｄｕｂｉａ）、ダフニア・ピコレックス（Ｄａｐｈｎｉａ　ｐｕｌｅｘ）、ニトロソモナス（Ｈｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）種、ニトロバクター（Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）種、ダフニア種、ブラキオナス（Ｂｒａｃｈｉｏｎａｓ）種（輪虫類）、アルテミア・サリナ（Ａｒｔｅｍｉａ　ｓａｌｉｎａ）（塩水エビ）、大頭ウグイの幼魚及び成魚、及びショウジョウバエの幼虫から成る群から選ばれる。請求項８に記載の方法。１４前記生物体がダフニア・マグナであり、前記酵素基質が４歩メチルウンベリフェリル−ｂ−Ｄ−ガラクトシドである、請求項８に記載の方法。１５前記測定工程が蛍光計により行われる、請求項８に記載の方法。１６前記水性源が卵化場で、前記方法が前記卵化場の魚類の健康状態を測定するために用いられる、請求項８に記載の方法。１７前記水性源が廃水であり、前記方法が、前記毒性物質を含有する水性源の生物学的に活性化した廃水処理場への導入割合を制御するために用いられる請求項８に記載の方法。１８前記水性源が排水処理場からの処理水であり、前記方法が排水処理場の効率を測定するために用いられる、請求項８に記載の方法。１９ａ）酵素的変換後に蛍光生成物を生成する、検査試料中及び数種の対照試料中の最終濃度が約１ｐｐｍ乃至約１００ｐｐｍになるに十分な量の酵素基質及びｂ）前記酵素基質を用いるための説明書を含む、水性源の毒性を検査するための検査キット。２０生物体による前記酵素基質の変換時に蛍光を発する、測定できる量の蛍光生成物を生成するのに十分な数の生物体をさらに含む、請求項１９に記載の方法。２１照射室（ｅｘｐｏｓｕｒｅ　ｃｈａｍｂｅｒ）をさらに含む、請求項２０に記載のキット。２２ブラック（ＵＶ）ライトをさらに含む、請求項２０に記載のキット。２３前記酵素基質が、４−メチルウンベリフェリルｂ−Ｄ−ガラクトシド、４− メチルウンベリフェリルａ−Ｄ−グルコシド、４−メチルウンベリフェリルｂ− Ｄ−キシロシド、４−メチルウンベリフェリルアセテート、４−メチルウンベリフェリルＮ−アセチル−ｂ−Ｄ−ガラクトサミニド、４−メチルウンベリフェリルＮ−アセチル−ａ−Ｄ−グルコサミニド、４−メチルウンベリフェリル−ｂ− Ｄ−グルコサミニド、４−メチルウンベリフェリル−ａ−Ｌ−アラビノフラノシド、４−メチルウンベリフェリル−ａ−Ｌ−アラビノシド、４−メチルウンベリフェリルブチレート、４−メチルウンベリフェリルｂ−Ｄ−セロビオシド、４− メチルウンベリフェリルｂ−Ｄ−Ｎ，Ｎ′−ジアセチルキトビオシド、４−メチルウンベリフェリルエライデート、４−メチルウンベリフェリルｂ−Ｄ−フコシド、４−メチルウンベリフェリルａ−Ｌ−フコシド、４−メチルウンベリフェリルｂ−Ｌ−フコシド、４−メチルウンベリフェリルａ−Ｄ−ガラクトシド、４− メチルウンベリフェリルｂ−Ｄ−グルコシド、４−メチルウンベリフェリルｂ− Ｄ−グルクロニド、４−メチルウンベリフェリルヘプタノエート、４−メチルウンベリフェリルａ−Ｄ−マンノピラノシド、４−メチルウンベリフェリルｂ−Ｄ −マンノピラノシド、４−メチルウンベリフェリルオレエート、４−メチルウンベリフェリルパルミテート、４−メチルウンベリフェリルフォスフェート、４− メチルウンベリフェリルプロピオネート、４−メチルウンベリフェリルステアレート、４−メチルウンベリフェリルサルフェート、４−メチルウンベリフェリルｂ−Ｄ−Ｎ，Ｎ′，Ｎ′′−トリアセチルキトトリオース及び４−メチルウンベリフェリル２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−ａ−Ｌ−アラビノフラノシドから成る群から選択される、請求項２０に記載のキット。２４前記生物体がダフニア・マグナであり、前記酵素基質が４−メチルウンベリフェリル−ｂ−Ｄ−ガラクトシドである、請求項２０に記載のキット。