JPH04505420A - 水溶性物質の制御的放出用微小球及びそれらの製造方法 - Google Patents

水溶性物質の制御的放出用微小球及びそれらの製造方法

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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 水溶性物質の制御的放出用微小球及びそれらの製造方法本発明は、内部に水溶性 物質、特にポリペプチドが分散された生体適合性及び生体分解性ポリマーのマト リックスからなる微小球タイプの微粒子に関し、ここにおいて該ポリマーは、上 記物質の放出動態を、微粒子が特に生理学的タイプの水性媒体中におかれた場合 に所定時間にわたり上記物質が漸次的に放出されるように制御する。
本発明は更に上記微粒子の製造方法に関する。
このような微小球は最初ステロイドホルモンを用いて避妊向けに開発された（特 に米国特許第３，７７３．９１９号明細書参照）。
この分野の発明に伴う困難性は、配合される活性成分のタイプの関数として、一 方でその構造及びその化学的性質、他方で望ましい放出動態を考慮して規定され る性質を示すポリマーを決定する必要性である。所定タイプの物質に関して、そ の物質が薬品である場合に選択された期間にわたり最適の治療保護を保証する放 出速度及び充填レベルを決定することも必要である。
更に、ある制限は、ポリマー／薬品ベア、特に諸成分に関する共通溶媒の任意的 存在、後者の熱的性質の存在、それらの混和性等に依存したポリマーへの薬品配 合技術に関する製造プロセスで生じることがある。しがもこの配合は活性成分の 性質に影響してはならない。
本来、本発明の目的は、水溶性ポリペプチド、特にカルシトニンを含有し、カル シトニンに関してそれがヒトに注入された場合に少なくとも８日間にわたり及び ３０日間であっても漸次的かつ継続的にそれを放出する微小球の製造であった。
微小球の形での、ポリマー生体物質内部への活性成分の配合は、いわゆるマイク ロカプセル化技術により行われる。マイクロカプセル化にはサイズが１〜２５０ μｍ範囲内である微小球タイプの個別的粒子を製造しうるすべての技術を含む。
マイクロカプセル化プロセスは伝統的に二群に分類される。
１、コアセルベーション又は相分離によるいわゆるマイクロカプセル化 第−に、カプセル化される生成物がマイクロカプセルのマトリックスを続いて形 成するようなポリマーの溶液中に分散される。第二に、ポリマーのコアセルベー ションが、特に相分離誘導剤による反応媒体の物理化学的修正で誘導される。第 三に、カプセル化される物質の周囲で生成するコアセルベート小滴はポリマーの 非溶媒、例エバヘプタンにより安定化かつ凝固される。この方法の主な欠点は、 コスト圧迫に加えて、用いられるヘプタンのような溶媒に関連した毒性の問題と 共に多量の溶媒の使用である。これはへブタンを用いたコアセルベーションによ る技術がその完全な除去を果たせないからである。
ヘプタン５〜１０％程度の多量の残留溶媒が微小球で観察される。上記とは別に 、この方法によるこれら微小球の生産において高い収率低下を招き、ひいては使 用不能になった一部バッチの全体的拒絶を時々もたらす微小球の凝集物がしばし ば生じることも観察された。微小球の凝集する傾向は、注入用微小球の場合注入 のため微小球を懸濁させるときに更に困難性を増す。
相分離による技術のもう１つの欠点は、不規則的放出、一般に一次相の加速的放 出（“バースト効果″）を伴う微小球中における活性物質の非均−分布である。
これは特に活性物質がポリマー用の溶媒に不溶性であることから、特に活性物質 がポリマー溶液に懸濁された場合に観察される。これは通常例えばポリペプチド にあてはまる。
２、溶媒蒸発によるマイクロカプセル化いわゆる溶媒蒸発による（又は代わりに エマルジョン／蒸発による）プロセスも微小球を生産する。カプセル化される活 性成分は伝統的に揮発性有機溶媒中のポリマー溶液に分散される。この相は非混 和性分散媒体（水又は鉱油）中で界面活性剤により乳化される。有機溶媒は攪拌 下で蒸発する。蒸発後、微小球は濾過又は遠心で回収される。エマルジョン／蒸 発による技術の利点はヘブタンのような毒性溶媒の不存在及び微小球の凝集の欠 如である。エマルジョン／蒸発によるこの技術は相分離又はコアセルベーション による技術よりも工業化するために簡単、柔軟かつ容易な技術である。それは少 量の溶媒の使用で済む。それは微小球のサイズ、活性物質の放出速度及び充填レ ベルのような様々なパラメーターに関して大きな作用自主性を与える。伝統的に 、この技術はステロイド類及びニトロソ尿素のような親油性物質のカプセル化に 主に適用される。親水性活性成分のマイクロカプセル化では鉱油のような無極性 分散相の使用を要する。
アセトン／パラフィン系が常用される。しかしながら、微小球への親水性活性成 分の配合レベルはそのプロセスで用いられる量と比較してかなり低く、しかもこ の系はそれがアセトンに可溶性のポリマーを要する場合に用いられるポリマーの タイプに関して制限を伴うが、それは乳酸ポリマーの場合であって、乳酸及びグ リコール酸コポリマーの場合ではない。したがって、エマルジョン／蒸発による この技術は伝統的に水溶性ペプチド及びすべての水溶性物質に関して不適と認め られる。
以上ノことから、相分離又はコアセルベーションによる方法が水溶性物質、特に 水溶性ポリペプチドに最も適合することから選択された方法である。
エマルジョン／蒸発による方法の欠点を回避するため、二重エマルジョン（水／ 油／水）による方法が欧州特許出願節１９０，８３３号明細書で記載されていた 。しかしながら、それは複雑で、工業化が比較的難しく、本発明による望ましい 放出動態を得ることが不可能である。
本発明の目的は、特に少なくとも８日間にわたりかつ特に−次相の加速的放出（ “バースト効果”）なしに規則的に活性物質を放出できる生体適合性及び生体分 解性ポリマーマトリックスに分散された薬品、特に水溶性ポリペプチドのような 水溶性活性物質の漸次的放出用の微小球タイプ微粒子を提供することである。
更に詳しくは、本発明のもう１つの目的は前記と同じ条件下で約３０日間にわた りカルシトニンの漸次的放出を可能にすることである。
もう１つの目的は、特に微小球形で配合される活性物質の充分に高い配合レベル で経済的かつ工業的に許容されるこれら微小球の製造方法を提供することである 。
もう１つの目的は、溶媒、特に毒性溶媒の残留レベルが非常に低くなるような微 小球及び製造方法を提供することである。
本発明によれば、微小球内への物質配合レベル９０％以上及び非常に低い残留溶 媒レベルでエマルジョン／蒸発による技術を水溶性物質、特に水溶性ポリペプチ ドに適合しうる新規プロセスが発見された。
本出願において、“配合レベル゛とは本プロセスで最初に用いられる物質の量に 対する本プロセスの最後に微小球内でみられる物質のレベルを意味するとして理 解される。
配合される活性物質がペプチドであって、これがポリマー溶液中で微粒子懸濁物 内にいれられる場合の文献で記載された方法とは逆に、本発明によれば活性ペプ チド物質は特徴が以下で示された適切な溶媒に最初に溶解される。
したがって、本発明の主題は以下による水溶性物質、特に水溶性ポリペプチドと この物質の放出動態を制御する生体適合性及び生体分解性ポリマーとの微小球の 製造方法である： ａ）ポリマーは水とジＩ和性の第一揮発性有機溶媒に溶解される； ｂ）水溶性物質は、第一溶媒と混和性で、ポリマー用の溶媒でもありかつ水と混 和性の第二溶媒に別に溶解される（したがって上記第二溶媒はポリマー用の溶媒 及び水溶性物質用の溶媒の双方である第一溶媒と水との第三溶媒を事実上構成し ている）； Ｃ）段階ａ）で得られたポリマー溶液及び段階ｂ）で得られた活性物質の溶液が 混和される；ｄ）ポリマー及び活性物質の有機相が得られ、しかる後これが乳化 剤含有水相からなる非混和性分散媒体中で乳化される； ｅ）次いで２溶媒が攪拌下で形成される微小球から除去されるが、第一溶媒は蒸 発除去され、第二溶媒及びそれと混和性の第一溶媒の一部は相分離メカニズムに より水相中に移る： ｆ）溶媒の除去後、形成された微小球は場合により水洗及び篩分は後に回収され る。
次いで、更に微小球はそれらの保存性を保証しうるように処理されることが好ま しい。
揮発性有機溶媒とは容易に蒸発しうる、即ち空気吸引下減圧及び室温で攪拌しな がら蒸発しうる溶媒を意味すると理解される。
第二溶媒は水相中でポリマーの沈澱が生じないように第一溶媒と関連した割合で 加えられる。これは、上記第二溶媒の量が高すぎると、エマルジョンがもはや得 られず、ポリマー用及び水相が混和して、水相中でポリマーの沈澱が生じるから である。エマルジョンは第二溶媒対第−溶媒の比が容量で７０／３０以内の範囲 である場合に可能である。第一溶媒と比較した第二溶媒の最小割合は、微小球中 の活性物質に関して得ることが望まれる充填レベルと勿論関連している。５／９ ５の割合が最小値として示される。
格別制限されないが、第一溶媒としてクロロホルム又はジクロロメタン及び第二 溶媒としてジメチルアセトアミドＤＭＡ、テトラヒドロフランＴＨＦ、ジオキサ ン、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）又はＤＭＦ　（ジメチルホルムアミド） が挙げられる。
本発明によるプロセスの好ましい態様において、ポリマーはジクロロメタンに溶 解され、水溶性物質はジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）に溶解される。
水溶性物質用の溶媒であってポリマー用溶媒と混和性である第三溶媒の使用はポ リマー相中における活性物質の均一分布を保証する。しかしながら、第三溶媒を 用いる利点は明らかに活性物質の単なる溶解に限定されない。
水相とのその混和性があれば、それは微小球への活性物質の配合プロセスにも寄 与する。
このように、微小球の硬化がＣＨ２Ｃｌ２のようなポリマー溶媒の簡単かつゆっ くりした蒸発で単に行われるエマルジョン／蒸発による常法とは異なり、本発明 による方法におけるその現象はＣＨ２Ｃｌ２のような上記第一溶媒の蒸発及び水 相中へのＤＭＡのような第二溶媒の急速相分離と同時に関連している。２溶媒の 混和性を介して、一部の第一溶媒も、水相中への第二溶媒に付随することにより 、その抽出を著しく強化して促進させる。
こうしてこの方法ではエマルジョン／蒸発による伝統的方法と比較して溶媒の抽 出動態を実質上修正することにより蒸発及び相分離のプロセスを組合せている。
したがって、分布均一性と共に観察される高配合レベルに寄与する配合プロセス の動態が後述されるように修正されている。
本発明によるプロセスの利点の１つは、ジクロロメタンのような毒性溶媒の残留 分か非常に低い（特に１．５％以下）微小球を提供することである。
上記ポリマー用第一溶媒が毒性溶媒である場合に特に有用な本発明によるプロセ スの改良された態様において、残留溶媒のレベルは水性分散相が水と混和性でか つ上記ポリマー用第一溶媒と混和性の第三無毒性溶媒を含むときに減少される。
この第三溶媒はエマルジョンの形成開始前にこのエマルジョンの水性分散相に加 えられる。かかる第三溶媒のこの添加は、ポリマー用第一溶媒の除去を、それが 非混和性である水相への後者の更なる抽出で促進することを可能にする。こうし て微小球におけるポリマー用溶媒の残留レベルは減少される。
上記第三溶媒はこの同じ水相中における乳化剤の溶解とエマルジョンを可能にし 続ける割合で水相に加えられる。
ポリマー用溶媒がジクロロメタンである場合、エタノールが水相中２０容量％以 内の割合で上記第三溶媒として用いられることが有利である。それによって、微 小球中におけるジクロロメタンの残留レベルは、例えば微小球の乾燥重量に対し て０．２％まで著しく減少される。
本発明の具体的な態様において、水溶性物質はポリペプチド又はその薬学上許容 される塩の１つであり、ポリマーはα−ヒドロキシカルボン酸及びラクトンから 選択されるモノマーの縮合で得られるポリマーである。好ましくは、ポリマーは 乳酸及びグリコール酸単位間で様々な割合の以下ＰＬＧＡと略記される乳酸（α −ヒドロキシプロピオン酸）及びグリコール酸（α−ヒドロキシ酢酸）コポリマ ー又はかかるポリマーの混合物である。
これらのポリマーは当業界の水準で周知である。それらは天然で存在しかつ生物 で代謝される生成物を形成することが知られ、したがって正常使用条件下で生体 分解性かつ実質上無毒性と考えられる。しかもそれらはジクロロメタンに可溶性 である。
ＤＭＡは前記ポリマー、特に乳酸及びグリコール酸コポリマーがそれに可溶性で あるならば第二溶媒として必要なすべての特性を示す。ＤＭＡはジクロロメタン と異なり容易に蒸発しない。他方、それは場合によりジクロロメタンの蒸発時に それが混和する水相で抽出されてもよい。
本発明の具体的態様において、好ましくは各々４０：６０〜７５　：　２５範囲 内の乳酸及びグリコール酸単位の割合からなる乳酸及びグリコール酸コポリマー （ＰＬＧＡ）が用いられる。
ポリマーの分子量は好ましくは２０，０００〜１００．０００である。本発明に よる水溶性ポリペプチドは通常２００〜１００，０００の分子量を有する。
このため、本発明によるプロセスはホルモン、サイトカイン、成長因子、神経ペ プチド、凝固因子、酵素、抗酵素、可溶性レセプター又はこれら物質の生物活性 誘導体のようなほとんどの多様なポリペプチドに適用しうる。
格別限定されないが、特にヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）、ウシ成長ホルモン（Ｂ ＧＭ）　、ブタ成長ホルモン（ＰＧＨ）　、ヒツジ成長ホルモン（ＯＧ　Ｈ）等 ；ソマトメジン、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２及びインシュリン；ＬＨ−ＲＨ及びそ の類縁体、ＧＨ−ＲＨ及びその類縁体；ソマトスタチン及びその類縁体、ＡＣＴ ＨＳＡＤＨ。
ＰＴＨ，ＰＴＨＩ　−３４、ＣＲＨ，ＧＨ−ＲＨ，インヒビン、アクチビン、モ チリン、レラキシン、ＡＮＦ、エントチリン、それらの誘導体及び類縁体；ＩＬ Ｌ、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、Ｇ− ＣＳＦ、ＧＭ−Ｃ３Ｆ。
Ｍ−Ｃ５Ｆ、α、β及びγインターフェロン、α及びβＴＮＦ、α及びβＴＧＦ ＳＰＤＧＦ、ＥＧＦＳＦＧＦ。
オステオゲニン、それらの類縁体及び誘導体、ＴＰＡ。
因子■、フォンビルプラント因子、ヒルジン、エチスタチン、トチサチン、α− １−抗トリプシン、スーパーオキシドジスムターゼ、可溶性ＣＤ４、それらの類 縁体及び誘導体；リンパ球レセプター又は主要組織適合性複合体の成分の付着分 子のペプチド誘導体又は類縁体：ヒト、ブタ、サケ、ウナギ又は他の種から得ら れるカルシトニン並びにそれらの類縁体及び誘導体も挙げられる。
本発明のプロセスによれば、ポリマー中における物質の充填レベルは０．０１〜 ４０％高まる。充填レベルとは微小球中におけるポリマー重量に対する物質の重 量比を意味すると理解される。通常、この充填レベルは望まれる治療保護に応じ て１〜１０％であることが好ましい。
このため、カルシトニンの場合で、５０１ｇ／ｉｔであるそのＤＭＡ中溶解度か ら適用可能な７０／３０の最大ＤＭＡ／ＣＨ２Ｃ１２割合を考慮すれば５０　： 　５０ＰＬＧＡ微小球中でサケカルシトニン３１．５％以内の充填レベルとみる ことができる。しかしながら、最良治療保護は、サケカルシトニンに関してわず か１〜２％、それより低活性のヒトカルシトニンに関して１０％の充填レベルで 得られる。したがって、本発明によるプロセスは微小球中における物質の充填レ ベルに関して実質的制限を加えないことは明らかである。
水溶性ポリペプチドとは本出願において水中で０．１−ｇ／自１以上の溶解度を 意味すると理解される。
ポリペプチドの溶解度が標的治療保護を考慮にいれて微小球で得ることが望まれ る充填レベルに関して低すぎる場合には、ＤＭＡ及び水の混合液を第二溶媒とし て用いてよく、容量割合でＤＭＡと比較した水の量に関して５０％まで高めるこ とができる。
本発明によれば、バラスト物質も放出動態を加速かつ調節して放出を促進するた め活性物質と同時にポリマー相に加えてよい。このバラストはポリマー相に溶解 しても又は懸濁してもよい。ＨＳＡ等のタンパク質、ゼラチン、糖、多糖、アミ ノ酸又はポリペプチドのようなほとんどの多様なバラストが使用可能である。バ ラストの充填レベルは５％に達してよい。
本発明のプロセスにおいて、好ましくは乳化はサイズが２００μ以下、好ましく は２５〜２００μの微粒子を得るように激しく攪拌しながら行われる。このため 、注入用微小球はそれらが注入用溶質に処方された場合に得られる。
これは微小球のサイズが攪拌力、特に乳化時にヘリックスに加わる速度（それが 増加すると、サイズは減少する）に依存しているからである。それは水相中にお ける乳化剤の濃度（それが増加すると、サイズは減少する）及び最後に勿論篩メ ツシュのサイズにも依存している。
微小球の平均サイズの最大分布２５〜２００μは上記パラメーターに基づき実施 することで容易かつ再現的に得られる。
ゼラチン、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピ ルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ） 又は代わりにツイーン（Ｔｗｅｅｎ）　８０のような非イオン系界面活性剤もし くはイオン系界面活性剤が水相中に存在する乳化剤として挙げられるが、格別制 限されない。
水相中における乳化剤の濃度は微小球のサイズに影響を与える。後者は乳化剤の 濃度か減少するに従い増加する。本発明によれば、水相中における乳化剤の濃度 は０．１〜１０％（重量／容量）の範囲内である。
具体的態様において、生物に注入してよい生成物として特に充分に許容されるゼ ラチンが乳化剤として用いられた。
本発明によるプロセスは相分離又はコアセルベーション技術と比較してエマルジ ョン／蒸発技術の下記のような通常の利点を発揮するニ ーポリマー用溶媒以外の毒性溶媒の不存在−微小球の非凝集化（容易な工業化及 び注入）−工業的生産時における多量溶媒の取扱い解消−関与する治療分野の関 数として放出動態を容易に調節するため様々なバラメーター二ポリマーの特徴、 バラストの存在、微小球のサイズ、水溶性物質の充填レベルに基づき実施しうる 可能性。
水溶性物質を溶解するため第三溶媒の使用に特有な他の利点は下Ｓ己のとおりで あるニ −９０％以上もの高い物質の配合レベル−ポリマー及び最終微小球中に溶解され る水溶性物質の規則的かつ均一な分布 〜水溶性物質の実質的充填レベルを果たし、同時に高配合レベルを保てる可能性 一最終生成物中におけるポリマー用溶媒の残留レベルの減少 一物質の放出動態時における“バースト“効果の不存在又は減少。
したがって、本発明の主題は少なくとも８日間にわたりかつ特に−次相の加速的 放出なしに規則的に活性物質を放出できる水と非混和性の有機溶媒に可溶性な生 体適合性及び生体分解性ポリマーのマトリックス内に規則的に分散された薬品の ような水溶性活性物質、特に水溶性ポリペプチドの漸次的放出用の微小球タイプ 微粒子でもある。
本発明によれば、微小球は１．５％以下、好ましくは０．５％（ｗ／ｗ）以下の 溶媒残留レベルを示し、特にヘプタンを含何しない。事実上、ＤＭＡのレベルは ０．５％以下、通常は更に０．１％（ν／Ｗ）程度以下であり、ＣＨ２Ｃｌ２の レベルは通常０．５％以下、普通は更に０．２％（Ｖ／Ｖ）以下である。その結 果、本発明による微小球の特徴の１つは微小球の乾燥重量に対して重量で０．５ ％以下、好ましくは０，２％以下の残留毒性溶媒レベルを有することである。
ポリマーはジクロロメタン溶解性ポリマー、特に乳酸及びグリコール酸コポリマ ーであることが有利である。
本発明で得られた微小球はバースト効果の大きな減少で自ら顕在化する活性物質 の均一分布、ペプチドのカブセル化に関して通常記載されるコアセルベーション で得られる微小球からそれらを区別する低い凝集傾向及び実質上低い溶媒残留レ ベルによって更に特徴付けられる。
本発明の他の特徴及び利点は下記例から明らかになる５０１５０ＰＬＧＡ　（乳 酸及びグリコール酸コポリマー：　５０１５０）５ｇをジクロロメタンＣＨ２Ｃ ｌ２４０ｇに溶解する。
サケカルシトニン５Ｂをジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）５ｍｌに溶解する。溶 解されたペプチドをポリマー相と混和する。ゼラチン４％（重量／容量）を含有 したｐＨ８の１０ｍＭリン酸緩衝液１５０１をこの混合液に加える。
エマルジョンは１５００回転／１ｎで１分間回転するヘリックスによりポリマー ／カルシトニン相をゼラチン含有水相と混和することで形成させる。
ポリマー用溶媒ＣＨ２Ｃｌ２の蒸発は乳化混合液中で５００回転／ｓｉｎの攪拌 を維持することにより行う。水相中へのＤＭＡの抽出を並行して行う。この蒸発 は溶媒の完全蒸発まで空気吸引下室温で行う。
次いで乳化された混合液を水で２倍希釈し、３７℃で１時間攪拌する。
次いでこうして得られた微小球は注入するために適したサイズ、即ち２５〜２０ ０μを有したものを選択するため水中で篩分けする。
次いで篩分けされた微小球を真空下室温で乾燥する。
乾燥後、微小球を充分に個別化し、注入用生理学的媒体に簡単に再懸濁する。顕 微鏡試験で微小球の均−性及び凝集の完全不存在について確認する。
微小球中における残留溶媒のレベルはニーポリマー用溶媒 ＣＨ２Ｃｌ２：微小球の乾燥重量に対して０．５％以下−第三溶媒 ＤＭＡ　：微小球の乾燥重量に対して０．１％以下この例は第二溶媒（ＤＭＡ） の存在下における相分離メカニズムによる第一溶媒（ＣＨ２Ｃ１２）の除去の改 良について示す。
一５０１５０ＰＬＧＡ　η−０，８：　２．５　ｇ−０，２％／　ＰＬＧＡのサ ケＣＴ充填レベル＝５−ｇＡ　Ｂ ＣＨ２ＣＩ２容量／ＤＭＡＣＨ２Ｃｌ２容ｉｉｉ　／ＤＭＡ容量−９７１　容ｉ ｔ　−７／３ ＣＨ２Ｃ１２−２０，２５ｇ　ＣＨ２Ｃｌ２−１５．７５ｇ水相水 相孔化剤として４％ゼラチン含有のｐＨ８のＬＯｍＭリン酸緩衝波緩衝液１ 方法 一ペプチドを反応に用いられるＤＭＡに溶解する。
−次いでこの溶液をＣＨ２Ｃｌ２に溶解されたＰＬＧＡに加える。
一水相を１５０　Ｏｒ／ａ＋Ｉｎで１分間回転するヘリックスによりこのＰＬＧ Ａ相と混ぜる。
−５０Ｏｒ／ｓｉｎの攪拌を反応媒体の表面で空気吸引下室温にて１２時間維持 する。
−次いで微小球を篩分けし、水洗する。
−次いでそれらをオーブン内において真空下室温で乾燥これらの微小球中におけ るＣ　Ｈ２Ｃｌ　２の残留レベルはガスクロマトグラフィーで測定する。
ＣＨ２Ｃｌ□容量／ＤＭ＾容Ｊｉｉ　９／ｌ　７／３ＣＨ２Ｃ１２の残留レベル （％）　２．５８％　０．４４％例３：カルシトニンの配合レベル及び“バース ト”効果本発明によるプロセスで得られた微小球はエマルジョン／蒸発による従 来のプロセスと比較して“バースト効果”の減少及び高度に改善された配合レベ ルにより特徴付けられる。
下記表は様々なポリマーに関して本発明の方法と比較したエマルジョン／蒸発に よる従来の方法で得られる製造結果を表す。
“バースト“効果の存在はＰＬＧＡマトリックス中における活性成分の分布の不 均一性に本質的な影響を与える。
追随されるエマルジョン／蒸発による“従来”方法及び本発明による方法におい て、ＣＨ２Ｃｌ２２０ｇに溶解されたポリマー２．５ｇを用いる。サケカルシト ニン５ＩＩｇ及びバラストとしてゼラチン１０１ｇを用いる。
“従来“方法において、カルシトニン及びバラストをポリマー相に懸濁する。本 発明による方法では、バラストが５％ゼラチン水溶液（０、２ｍｌ）の形で加え られたＤＭＡ２．５ｍｌにカルシトニンを溶解する。次いでこのカルシトニン− バラスト−ＤＭＡ混合液を単一均一相を形成するようにポリマー相に加える。
その方法において、水相は水中４％（重量／容ｊｉ）ゼラチン７５１からなる。
２相を１５００回転／■ｉｎで１分間へリックスでの攪拌により乳化させる。一 方でＣＨ２Ｃｌ２の蒸発を促進するため、他方本発明の方法でＤＭＡを水相に抽 出させるため５００回転／ｇｉｎの攪拌を維持し、双方のケースで微小球を水洗 し、篩で集める。
エマルジョン　本発明による ／蒸発による　エマルジョン／ Ｍｙ−５０，００Ｏｎ＝０．５　２９．８％　７９．４％の５０１５０ＰＬＧＡ 例３−２： Ｍｖ＝９Ｌ、（１００ｎ−（１，７３９，７％　８３．８％の５０１５０ＰＬＧ Ａ 例３−３＝ Ｍｗ３−３＝、０００　ｎ＝０．８　５２．６％　９２，４％例３−１：　１２ ％　５％ ポリマーの粘度は文字ｎで表される。それはクーンーマークーホーウィンク（Ｋ ｕｈｎ−Ｍａｒｋ−Ｈｏｕｖｉｎｋ）関係式ｎ−Ｋ　Ｍ−”で分子ｔＭＷと関連 している一Ｋ及びａは固定温度でポリマー−溶媒系に関する定数である。
組成５０１５０のポリマーは他の割合の乳酸及びグリコール酸を何するコポリマ ーよりも急速に分解される〔参考文献：旧１１ｅｒ　Ｒ，Ａ、、Ｂｒａｄｙ　Ｊ 、Ｍ、　ａｎｄ　Ｃｕｔｒｊｇｈｔ　Ｄ。
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ポリマーのサイズに主に依存しているＰＬＧＡの固有粘度も放出動態に関係して いる。このため異なる粘度の５０１５０ＰＬＧＡで製造されたカルシトニン微小 球に関して、カルシトニンのインビトロ放出はＰＬＧＡの固有粘度が高くなるほ ど（ＰＬＧＡの分子量が高くなるほど）外部媒体へのカルシトニンの放出が遅く なることを示している。このため、０．４　（ＧＰＣで測定されたＭｗ：　３６ ，０００）　、０．５　（５０，０００）又は０．７　（９１，０００）に相当 する粘度の５０１５０ＰＬＧＡの配合に関して、１４日後にインビトロで放出さ れたカルシトニンの率は各々７９．５．７５．５又は４３．２％である。
２）微小球のサイズ 影響 カルシトニン微小球を下記操作に従い製造した。
−５０１５０ＰＬＧＡポリ？　−ｎ−０，８：　２．５ｇ−ＰＬＧＡ用溶媒：　 Ｃ）Ｉ２Ｃ１２：　２０．０ｇ−ペプチド：０，４％／ＰＬＧＡのＣＴ（サケカ ルシトニン）充填レベル　：　ｌＯ，ＯＩＩｌｇ −１２５１−標識ペプチド、１２５Ｉ−ＣＴ：　２．３９Ｘ　１０１０６ｃ ｐバラスト：０．２％／ＰＬＧＡのラクトース充填レベル：　５．ＯＢ −“第三溶媒”　：　ＤＭＡ　：　２．５１水相ニ ーゼラチン（乳化剤）４％含有のｐＨ８の１０１Ｍリン酸緩衝液　：　７５．Ｏ ｍｌ 方法ニ ーペプチド、トレーサー及びバラストをＤＭＡに溶解する。
−次いでそれらを均一相のポリマー相を形成するためにＣＨ２Ｃｌ２に溶解状態 のポリマーに加える。
−エマルジョン：次いで水相をポリマー相上にいれ、１５００回転／ｗｉｎで１ 分間回転するヘリックスによりポリマー相と混和する。
一蒸発：５００回転／ｌｌｌ１ｎの攪拌を乳化混合液の表面で空気の吸引上室温 にて１２時間維持する。
−次いでエマルジョンを水で２倍希釈し、３７℃で１時間攪拌する。
一微小球を次第に小さくなるメツシュ　２００−１００−５０−２０μの連ｖｃ 篩により水で回収する。
−次いでそれらをオーブン内において真空下室温で２４時間乾燥する。
−次いでそれらに２．５Ｍ　Ｒａｄで放射線照射する。
結果ニ ー得られた微小球のサイズ： サイ　ズ　２５（Ｘ＜５０μ　５０＜ｘ＜１００μ　１００ｃｘ＜２００μ　ｘ ＞２００μｍ微小球へのカルシトニン配合レベル：それは製造時に導入されたト レーサー（１２５１−ＣＴ）により、用いられるポリマーの重量と比較した微小 球の重量収率を考慮して測定する。配合されたＣＴの全部で８５．１％がみられ る。
−カルシトニンの“インビトロ１放出：微小球２００ｍｇを３７℃で振動浴内に おける０、５％ＢＳＡ含有のｐＨ７の１０５Ｍリン酸緩衝液１０ｉ１にいれる。
下記表は経時的に放出されたカルシトニンの累積率を表す： 微小球のサイズ　２５−５０μ５０−１００μｍ０Ｏ−２００μｍ日後　１１， ２％　３．２％　２．８％３日後　１６．０％　４．５％　４．０％４日後　１ ６．５％　５．０％　４．７％７日後　１９，８％　５．５％　４．９％１０日 後　２５．２％　７．４％　６．４％１４日後　３１．４％　７．７％　７．０ ％２５日後　７３．０％　３１．６％　３１．０％２８日後　１００．０％　４ ０．２％　３９．０％３５日後　６４．５％　５６．０％ ４０日後　８９，０％　７９．０％ ４２日後　１００．０％　８９．０％ −５０１５０Ｐ　Ｌ　Ｇ　Ａ　：　ＣＨ２ＣＬ、　２０ｇに溶解された　２．５ ｇ　：サケカルシトニン：　Ｄ　Ｍ　Ａ　２．５ｍｌに溶解され、しかる後ポリ マー相に加えられた５ａ＋ｇ −水相・水中５％（重量／容量）ゼラチン７５１−２相は ・２０００回転／ｗｉｎで１分間へリックスでの攪拌によるか又は ・５００回転／１０で１分間へリックスでの攪拌により乳化させる。
−ＣＨ２Ｃｌ２の蒸発及びＤＭＡの水中移行を５００回転／１ｎの連続攪拌で行 う。
一数回の水洗後、微小球のサンプルを“フリッチュ粒子サイザー＃（Ｆｒｉｔｓ ｃｈ　ｐａｒｔｉｃｌｅ　５ｊｚｅｒ）　（アナライセット（Ａｎａｌｙｓｅｔ ｔｅ）　２２　）で分析する。
結果 ２０００ｒ／ｌ１ｉｎで　５００ｒ／ｌｌ１ｎで右記サイズ以下の　エマルジョ ン　エマルジョン大きさを有する　微小球サイズ　微小球サイズ微小球の率（重 量）　（μ）　（μ） １０％＜　１８．４　７８．９ ３０％＜　３５．２　１８４．０ ５０％＜　５２．３　２１２．０ ７０％＜　７３．０　２７１．０ −５０１５０　Ｐ　Ｌ　Ｇ　Ａ　：　ＣＨ２Ｃｌ２２０ｇに溶解された　２．５ ｇ　：サケカルシトニン：　Ｄ　Ｍ　Ａ　２．５ａ＋ｌ　に溶解され、しかる後 ポリマー相に加えられた５Ｂ −水相： ・水中５％（重＊／容ｊｌ）ゼラチン７５１又は・水中１％（重量／容Ｅｌ）ゼ ラチン７５１−２相を２０００回転／ｍｉｎで１分間へリックスでの攪拌により 乳化させる。
−ＣＨ２Ｃ１２の蒸発及びＤＭＡの水中移行を５００回転／ｍｉｎの攪拌で行う 。
一数回の水洗後、微小球を“フリッチ二粒子サイザー“（アナライセット２２） で分析する。
結果 乳化剤：　乳化剤： 右記サイズ以下の　５％ゼラチン　１％ゼラチン大きさを有する 微小球の率（重量）　微小球サイズ　微小球サイズ（μ）　（μ） １０％＜　１６．４　３７．４ ３０％＜　３５．２　７３．６ ５０％（５２，３１０４，０ ７０％＜　７３．０　１４０．０ 微小球中におけるバラストの存在又は濃度並びにバラストの性質は下記実験で示 されるようにカルシトニンの放出動態に影響を与える： ポリマー相ニ ー　５０１５０　Ｐ　Ｌ　Ｇ　Ａ　：　Ｃ１（２Ｃ１２２０，０ｇに溶解された ２、５ｇ−サケカルシトニン：　Ｄ　Ｍ　Ａ　２．５＋ａｌに溶解されたｌ　Ｏ ａ＋ｇ−４％（重量／容量）ゼラチン含有のｐＨ８のｌｈＭリン酸緩衝液＝７５ １ 方法ニ −２相を１５００回転／ａｉｎで１分間ヘリックスでの攪拌により乳化させる。
−次いで５００回転／■ｉｎの攪拌をＣＨ２Ｃｌ２の完全蒸発及びＤＭＡの水相 移行まで維持する。
−数回の水洗後、微小球を篩で回収し、真空下で乾燥する。
結果： 例３の２）の場合と同様の条件下で得られた“インビトロ”放出 放出されたＣＴの累積率 １日後　２．０％　２．８６ ２日後　２．２％　４．０８ ７日後　３．４％　５．０　１１ １２日後　４．３％　７　、４．　１５２０日後　１６．０％　２２．０　３６ ２５日後　２５．０％　３１．０　４６３０日後　３２．０％　４１．０　５９ ３５日後　３９．０％　５６．０　８３３７日後　４４．０％　６６．０　８８ ４０日後　５９．０％　７９．０　１００４２日後　６９．０％　１００．０ −５０１５０　Ｐ　Ｌ　Ｇ　Ａ　：　ＣＨ２Ｃｌ２１０ｇに溶解された　０゜５ ｇ−ＤＭＡ：その３１でサケカルシトニンが下記量で溶解−バラスト：なし 水相ニ ー４％（重ｆｆｉ／容量）ゼラチン含有（７）　ｐ　Ｈ８（１）　１０１１Ｍリ ン酸緩衝液＝７５１ 方法 例３の２）の場合と同様の条件下で得られた“インビトロ°放出 放出されたＣＴの累積率 サケカルシトニン　Ａ　Ｂ の充填レベル　２％　５％ １日後　３．０％　６．５％ ４日後　４．８％　１３．０％ ６日後　５．７％　１６．０％ １０日後　７．４％　１８．５％ １５日後　８．６％　２３．０％ −５０１５０Ｐ　ＬＧＡ　：　ＣＨ２Ｃｌ２７　ｇに溶解された１ｇ−サケ力ル シトニン：ＤＭＡ２ｍ１に溶解され、しかる後ポリマー相に加えられた２０Ｂ −水相： ａ、ｐＨ８の１０１１Ｍリン酸緩衝液中５％（重ｊｌ／容量）ゼラチン１００１ 又は す、ｐＨ８の１０ｍＭリン酸緩衝液中５％（重量／容量）ゼラチン８０１＋エタ ノール２０１ 方法 一２相を１５００回転／ｍｉｎで１分間回転するヘリックスにより乳化させる。
一空気吸引下３７℃で５００回転／ｗｉｎの１２時間攪拌でＣ１ｌ□ＣＩ。の蒸 発及びＤＭＡの水相移行を行う。
−微小球を２００及び２５μの連続篩で回収する。
−次いでそれらをオーブン内において真空上室温で２４時間かけて乾燥させ、し かる後２．５Ｍ　Ｒａｄで放射線照射−乾燥微小球（２５〜２００μの分画）中 における残留ジクロロメタンのレベルは水相クロマトグラフィーで決定する。こ れらのレベルは微小球の乾燥重量に対する溶媒率として表示される。
製造方法　ＣＨ２Ｃｌ２の残留レベル ａ、水相中エタノールなし　１．３６％技術の適用は第三溶媒中へのポリペプチ ドの溶解度により条件付けられる。この性質はカルシトニンに関して示されたよ うに多数のポリペプチドに共通である。
例ニーＬＨＲＨ（“黄体形成ホルモン放出ホルモン”）はＤＭＡに５０１ｇ／ａ ＋　１以上で可溶性である。
−ＨＧＨ（“ヒト成長ホルモン”）はＤＭＡに２．８ＩＩｇ／ａｔで可溶性であ る。
−“第三溶媒に不溶性のあるポリペプチドの溶解度を増加させるために、水に当 然混和性の“第三溶媒”にペプチドの水溶液を加えることができる。
−したがって、本発明の技術によれば下記ペプチドをＰＬＧＡ微小球中に配合す ることができた：カルシトニン、ｈＧｈ、ｂＧＨ，ＡＮＦ、ソマトスタチン、Ｌ ＨＲＨ，インシュリン、ソマトメジンＣ，ＡＣＴＨ。
ＡＤＨ，ＴＰＡ並びに様々なサイトカイン類：エリトロポエチン、０ＭＣ５ＦＳ ＧＣ３ＦＳ　ＩＬ３、ＩＬＬ、ＩＬ６、ＬＬ２、ＩＬ４、ＴＮＦ、αインターフ ェロン、βインターフェロン、βＴＧＦ、ＰＤＧＦ及びＧＦ０ 一下記表は各ペプチドについて個別的最適化せずに本発明による下記“標準”操 作を用いて様々なペプチドに関して得られた配合レベルを照合している。したが って、その値は最少配合レベルを表す。用いられた標準操作は下記のとおりであ る： 物質 −５０１５０Ｐ　Ｌ　Ｇ　Ａ　：　ＣＨ２Ｃｌ２２０ｇに溶解された２、５ｇ　 ：第三溶媒：　ＤＭＡ　：その２．５１に活性成分が溶解される。
水相： ｐＨ８のｌ　０ｍＭリン酸緩衝液中４％（重ｊｌ／容量）ゼラチン７５ｍ１ 活性成分が第三溶媒で溶解されたポリマー用を１５００回転／ｌ１ｉｎで１分間 攪拌されたヘリックスにより水相と乳化させる。
−Ｃ１２Ｃ＋。の蒸発及び第三溶媒の水中移行を促進するため５００回転／ｓｉ ｎの攪拌を空気吸引下室温で維持する。
−次いて微小球を充分に水洗した後部で回収する。
−次いでそれらを真空下室温で乾燥する。
微小球中に配合　配合された された活性成分　ペプチドの率 ｈＧＨ（ヒト成長ホルモン）　７７．０％ソマトメジンＣ（ＩＧＦ−１）　５２ ．０％ＴＰＡ　（組織プラスミノーゲンアクチベーター）　９６．０％インシュ リン　９８．０％ ＩＬ４　７７．５％ Ｉ　Ｌ　６　４３．８％ エリトロポエチン　４０．０％ ＴＮＦ　８６゜４％ サケカルシトニン　９２．４％ ヒトカルシトニン　８５．０％ Ｉ　Ｌ　２　７ｇ、５％ ＧＲＨ８４，０％ ＬＨＲＨ７５，Ｑ％ ＧＭＣＳ　Ｆ　５９．０％ Ｐ　Ｔ　Ｈ（１−３４）　５４．０％ ソマトスタチン　８２゜０％ ＡＮＰ　（又はＡＮＦ）７２．０％ 要　約　書 本発明の主題は、水溶性物質と、その水溶性物質が内部に規則的に分散されたポ リマーのマトリックスからなる上記物質の放出動態を制御する生体適合性及び生 体分解性ポリマーとの微小球タイプ微粒子の製造方法であって、 ａ）上記ポリマーが水と非混和性の第一揮発性有機溶媒に溶解される； ｂ）上記水溶性物質が、上記第一溶媒と混和性で、ポリマー用の溶媒であってか つ水と混和性である第二溶媒に溶解される； Ｃ）上記物質の溶液及び上記ポリマーの溶液が混和される； ｄ）ポリマー及び上記物質の有機相が得られ、しかる後これが乳化剤含有水相か らなる非混和性分散媒体中で乳化される； ｅ）次いで２溶媒が攪拌下で形成される微小球から除去されるが、第一溶媒は蒸 発除去され、第二溶媒及びそれと混和性の第一溶媒の一部は相分離メカニズムに より水相への移行で除去される； ｆ）溶媒の除去後、形成された微小球は場合により水洗及び篩分は後に回収され る； ことを特徴とする。
国際調査報告 国際調査報告 ＥＰ　９１００３０７ Ｓ＾　４４４８２

Claims (16)

    【特許請求の範囲】
  1. １．水溶性物質と、その水溶性物質が内部に規則的に分散されたポリマーのマト リックスからなる上記物質の放出動態を制御する生体適合性及び生体分解性ポリ マーとの微小球タイプ微粒子の製造方法であって、ａ）上記ポリマーが水と非混 和性の第一揮発性有機溶媒に溶解される； ｂ）上記水溶性物質が、上記第一溶媒と混和性で、ポリマー用の溶媒であってか つ水と混和性である第二溶媒に別に溶解される； ｃ）上記物質の溶液及び上記ポリマーの溶液が混和される； ｄ）ポリマー及び上記物質の有機相が得られ、しかる後これが乳化剤含有水相か らなる非混和性分散媒体中で乳化される； ｅ）次いで２溶媒が撹拌下で形成される微小球から除去されるが、第一溶媒は蒸 発除去され、第二溶媒及びそれと混和性の第一溶媒の一部は相分離メカニズムに より水相への移行で除去される； ｆ）溶媒の除去後、形成された徴小球は場合により水洗及び篩分け後に回収され る； ことを特徴とする方法。
  2. ２．水性分散相が水と混和性でかつ第一溶媒と混和性である第三溶媒を含む、請 求項１に記載の方法。
  3. ３．第一溶媒がジクロロメタンで、第二溶媒がジメチルアセトアミドである、請 求項１又は２に記載の方法。
  4. ４．第三溶媒がエタノールである、請求項２又は３に記載の方法。
  5. ５．水溶性物質がポリペプチド又はその薬学上許容される塩の１つである、請求 項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  6. ６．ポリマーが乳酸及びグリコール酸コポリマーである、請求項１〜５のいずれ か一項に記載の方法。
  7. ７．ポリマーが各々４０：６０〜７５：２５の乳酸及びグリコール酸単位の割合 からなる乳酸及びグリコール酸コポリマーある、請求項１〜６のいずれか一項に 記載の方法。
  8. ８．水相中における乳化剤の濃度が０．１〜１０％（重量／容量）である、請求 項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
  9. ９．請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法に従い得られた微小球タイプの微 粒子。
  10. １０．水に非混和性の有機溶媒に可溶性であって内部に水溶性物質が規則的に分 配された生体適合性及び生体分解性ポリマーのマトリックスからなる微小球タイ プの微粒子であって、 微小球が特に生理学的タイプの水性環境下におかれた場合に上記物質が一次相の 加速的放出なしに少なくとも８日間にわたり規則的に漸次的に放出されることを 特徴とする微粒子。
  11. １１．溶媒の残留レベルが１．５重量％以下である、請求項９又は１０に記載の 微小球タイプの微粒子。
  12. １２．毒性溶媒の残留レベルが重量で０．５重量％以下、好ましくは０．２％以 下である、請求項１１に記載の微小球タイプの微粒子。
  13. １３．水溶性物質がポリペプチドである、請求項９〜１２のいずれか一項に記載 の徴小球。
  14. １４．ポリマーが乳酸及びグリコール酸コポリマーであり、ポリペプチドがカル シトニン又はその類縁体及び誘導体である、請求項９〜１３のいずれか一項に記 載の微小球。
  15. １５．２５〜２００μのサイズを有する、請求項９〜１４のいずれか一項に記載 の微小球。
  16. １６．水溶性物質の充填レベルが微小球の重量で０．０１〜４０％、好ましくは １〜１０％である、請求項９〜１５のいずれか一項に記載の徴小球。
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