JPH04505467A - Ｎ―保護（２ｓ，３ｓ）―３―エチルアスパラギン酸ジアルキル化合物の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｎ−保護（２３，３３）　−３−エチルアスパラギン酸ジアルキル化合物の製造 方法　。

本発明は、エチルフマル酸め酵素的アミノ化によって得られる未精製の（２３， ３Ｓ）　−３−エチルアスパラギン酸から、Ｎ−＠護（２３，３３）　−３−エ チルアスパラギン酸ジアルキルを製造する方法に関するものである。

Ｎ−保護（２Ｓ、　３３）　−３−エチルアスパラギン酸ジアルキル化合物はγ −ラクタム架１ｉｔ２Ｓ、　３Ｒ，２°Ｓ−イソロイシン−アラニンジペプチド を製造するための中間体として有用である（たとえば、Ｊ、Ｐ、１４ｏｌｆ、Ｈ ，Ｒａｐｏ−ｐｏｒｔ、　Ｊ。

Ｏｒｇ、Ｃｈｅｎ、　１９８９、巳、３１６４〜３１７３参照）。

前記および後記の記載において、略語は、下記の意味を有するものとする： Ｆ’ｈＦ１　９−フェニルフルオレニルＥ　−ＧＯ２ＣＨｉ 合成経路１に示されているように、ジメチルエステルエは、Ｊ、Ｐ、Ｗｏｌｆお よびＨ，Ｒａｐｏｐｏｒｔ　（上記刊行物）に従い、Ｎ−９−フェニルフルオレ ニルアスパラギン酸ジメチルのエナンチオ選択性アルキル化によって製造するこ とができる。

合成経ｌ？！１ 分離できる副生成物Ｉ ＫＨＩ４ＤＳ　＝カリウムへキサメチルジシラザンしかしながら、この方法はこ の合成経路を大規模生産に導入することを不可能にする、いくつかの欠点を有す る。

一方、このエナンチオ選択性アルキル化を成功させるために必須である、かさ高 のアミノ保護基、９−フェニルフルオレニルは入手が困難であり、はとんど導入 することはできない、他方、水素化カリウムとジ（トリメチルシリル）アミンと の反応によって製造される塩基、カリウムへキサメチルジシラザンは特別の安全 基準の下で力み、取り扱うことができるというものである。さらにまた、このア ルキル化は３．５：１というエナンチオ選択性をもって行いうるだけであり、結 局、（２Ｓ、３に）エナンチオマーは約２５％生成されるにすぎない。

必須のアルキル化剤として、高価なエチルトリフルオロメタンスルホネートを使 用することもまた、経済的有用性の点で１題がある。

β−エチルアスパラギン酸のジーｔｅｒｔ−ブチルエステルは、また、０．５ｅ ｅｂａｃｈ等：　Ａｎｇｅｗ、Ｃｈｅｌｉｅ　９３　（１９８１）、Ｎｏ、１１ ．１００７〜１００８頁にしたがい、ジーｔｅｒｔ−ブチルＮ−ホルミルアスパ ラギン酸エステルをリチウムジエチルアミドおよびヨー化エチルと反応させるこ とによって得ることができる。しかしながら、この場合には、α−位置でアルキ ル化されている生成物もまた生成する。

Ｍ、　Ａｋｈｔａｒ等：　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　４３．５８９９〜５９０８ 　（１９８７）にしたがえば、（２Ｓ、　３Ｓ）　−３−エチルアスパラギン酸 は、合成経路２にしたがい、クロストリジウムチタノモルファム（Ｃ１ｏｓｔｒ ｉｄｉｕｉ　ｔｅｔａｎｏｍｏｒｐｈｕｎ　）からの３−メチルアスパルターゼ の存在の下に、２−エチルフマル酸をアンモニアと反応させることによって製造 することができる。

自我径路２ 従って、本発明の目的は、公知方法の欠点を有していないか、またはこれらの欠 点を僅かな程度に有しているだけである、Ｎ−保護（２Ｓ、３Ｓ）−３−エチル アスパラギン酸ジアルキル化合物の製造方法を利用できるようにすることにある 。

驚くべきことに、合成経路３に示されているように、酵素的アミノ化によって得 られる（２Ｓ、　３Ｓ）−エチルアスパラギン酸をアルカノールの存在の下に、 ハロゲン死刑と反応させると、（２Ｓ、　３Ｓ）　−３−エチルアスパラギン酸 ジアルキルが得られることが見い出された。

き成経路３ 単離困難 単離容易　単離容易 ＰＧは適当なアミン保護基である。

Ｘは脱離し得る基である。

従って、本発明はエチルフマル酸の酵素的アミノ化によって得られる未精製の（ ２Ｓ、　３Ｓ）　−３−エチルアスパラギン酸からＮ−保護（２Ｓ、３Ｓ）−３ −エチルアスパラギン酸ジアルキルを製造する方法に関するものであり、この方 法においては、酵素的アミノ化から生成される混合物をアルカノールの存在の下 にハロゲン化剤で処理し、得られる２−エチルフマル酸ジアルキルを分離し、次 いでその遊離のアミノ基に保護基を付与する。この方法においては特に、生成す る混合物をメタノールまたはエタノールの存在の下に塩化チオニルで処理する。

本発明はさらにまた、このようにして生成されたＮ−保護（２３，３３）　−３ −エチルアスパラギン酸ジアルキルをγ−ラクタム架橋２Ｓ、　３Ｒ，２’Ｓ− イソロイシン−アラニンジペプチドの製造に使用することに関するものである。

本発明による方法は簡易に行なうことができる。３−エチルフマル酸の酵素的ア ミノ化によって得られる未精製の生成混合物をアルカノール中に取り入れ、次い でハロゲン化剤で処理する。好適なアルカノールとしては、Ｃ原子１〜６個を有 する、非分枝鎖状または分枝鎖状のアルコール、たとえばメタノール、エタノー ル、ｎ−プロパツール、イソプロパツールまたはｎ−ブタノール、特にメタノー ルまたはエタノールが使用される。好適なハロゲン化剤は、塩化チオニル、三塩 化リン、五塩化リン、三臭化リン、五臭化リン、三塩化アンチモン、五塩化アン チモンまたはテトラクロロメタン中めトリ７エ二ルホスフイン、特に塩化チオニ ルである。

一般に、酵素的アミノ化によって得られる未精製の生成混合物を関連アルカノー ル５０−〜２５０ｎＪｔ　、好ましくは１００１１１１〜２００ｍｊｔ中に懸濁 し、次いで使用ハロゲン止剤５〜３０鑓、好ましくは１０〜２５−で処理する。

この添加は、−２０°〜＋２０℃、好ましくは一１０４〜＋１０℃、特に水め凍 点付近で、行なう。

一般に、この反応は、１５〜９６時間、好ましくは４８〜７２時間の反応時間を 使用して、０〜８０℃、好ましくは２０〜６０°Ｃ５特に室温で行なう。

反応混合物を仕上げるためには、この反応混合物を、好ましくは減圧の下に、濃 縮し、このようにして得られる残留物を非極性ないし弱極性の溶剤、好ましくは 炭化水素間、たとえばｎ−ペンタン、ｎ−ヘキサン、シクロヘキサンまたはトル エンを用いて、あるいはエーテル類、たとえばジエチルエーテル、テトラヒドロ フラン、ジオキサンまたはメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルを用いて抽出する。

このようにして得られるｒ液を蒸発させた後に、酵素的アミノ化において未反応 の３−エチルフマル酸がアルキルエステルとして完全に回収される。このアルキ ルエステルは加水分解の後に、酵素的アミノ化において再使用することができる 。

一過残留物は、極性溶剤好ましくはケトン類、たとえばアセトン、シクロヘキサ ノンまたはメチルエチルゲトンを用いて、あるいはアミド類、たとえばジメチル ホルムアミド、を用いて、好ましくは沸とうさせて抽出し、次いで再結晶によっ て精製する。しかしながら、このようにして得られる粗生成物はまた、先に精製 することなく、引き続く反応に使用し、γ−ラクタム架橋２３．３Ｒ。

２’Ｓ−イソロイシン−アラニンジペプチドを得ることもできる。

ＰＧは好ましくは、そこに結合している窒素原子用の保護基であり、この基によ り、たとえばＨ，ＲａｐＯｐＯｒｔおよびＪ、Ｐ、Ｗｏｌｆにより開示された方 法（前記刊行物）を用いて、式１で示される化合物を、その窒素原子がＰＧで保 護されているγ−ラクタム架１１１ｔ２ｓ、　３Ｒ，２°Ｓ−イソロイシン−ア ラニンジペプチドに変換することができる。この保護基は次いで、温和な条件の 下に、選択的に分離することができる。

この種の保護基は当業者に熟知されており（たとえば、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　 Ｇｒｏｕｐｓ　ｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅ１１ｉｓｔｒｙ＋ＰｌｅｎｕｌＩ Ｐｒｅｓｓ　、　Ｎｅｗ　Ｗｏｒｋ、１９７３）　、公知方法によって導入する ことができ、そしてまた分離することができる。好適な保護基ＰＧは、たとえば ベンジル、メトキシベンジル、３．４−ジメトキシベンジル、４−メチルベンジ ル、アリル、メタリル、クロチル、トリメチルシリルまたはｔａｒｔ−ブチルジ メチルシリル、ジフェニルメチル、トリチル、９−　Ｈ−フルオレニル、９−フ ェニルー９−フルオレニル、メトキシメチルまたはホルミルである。

ホルミル基は、たとえばり、　ＩＪｒｉｎｅｎ　：　Ｏｒｇ、５ｙｎｔｈ、５０ ．１　（１９７０）にしたがい、導入することができる。

Ｎ−ｆｆ１ｌ！　（２Ｓ、　３Ｓ）　−３−エチルアスパラギン酸ジアルキル化 合物は、γ−ラクタム架［２３，３Ｒ，２°Ｓ−イソロイシン−アラニンジペプ チドの合成における中間体として有用である。これらの化合物は、エチルフマル 酸の酵素的アミノ化からの生成混合物をアルカノールの存在の下にハロゲン化剤 で処理することによって、容易にかつまた高収率で得ることができる。

次例は本発明を説明する目的で示すものであり、本発明を制限しようとするもの ではない０本発明による方法は、相当程度に変更して行なうことができる。すな わち、たとえば別の有機溶剤を使用することができ、そしてまた反応温度および 反応時間を変えることができる。

出発物質の製造 １、エチルフマル酸 二チルフマル酸は、アセト酢酸エステルから出発して、エチル化、臭素化および 引き続くにＯＨ処理によって、４０％の収率で得られる［Ｄ、Ｇａｎ１等ＨＴｅ ｔｒａｈｅｄｒｏｎ　２４．５９０４（１９８７）　］　。

２、細胞の培養および増殖 クロストリジウム種、０３８５２８の細胞を得るなめに、１００Ｑｄ、綿類エレ ンマイヤーフラスコ中の下記の栄養溶液中で培養を行なった： に２ＨＰＱ４　２．９ｇ に８２ＰＱ４　２．３ｇ ＭｇＳＯ４・７ｈＯ０，０２５ｇ ＣａＣ！ｌｚ　Ｈ２ｈＯ０，０１５ｇ Ｆｅ５Ｏ□Ｈ７Ｈ２００，０１ｇ ＭｎＣｊ□・４Ｈ２００，００２ｇ ＣｏＣｌ２−６Ｈ２００，００２５ｇ Ｎａ２Ｍ００４　・２８２０　０．００２５　ｇグルタミン酸Ｎａ　１７ｇ 酵母エキストラクト　６ｇ チオグリコール酸Ｎａ　Ｑ、５ｇ 残留水により全量を１０００−とする、ｐＨ：　７．１上記培養液をオートクレ ーブ中で１２１℃で２０分間加熱した。

充分に洗浄した、−後培養物を約５−／フラスコの量で接種しな、この培養液を 、連続的におだやかに振りまぜながら、３７℃で４０〜６４時闇、インキュベー トしな、増殖が静まった後に１．Ｗ胞をｅｏｏｏ　ｇの遠心分離によって沈降さ せ、次いで冷０．９％ＮａＣ１で２回、洗浄しな。細胞の収率は平均して、細胞 ４ｇ／培地１１であった０反応実験のために、これらの細胞は直ちに、あるいは −１８℃で冷凍して用いた。

３、細胞を含有していないエキストラクトの製造細胞を含有していないエキスト ラクトを製造するために、洗浄した細胞（または凍結細胞）を、含水重量１ｇ当 りテ０．０１ＨＫＨ２ＰＯ４／　ＫＪＰＯａｌ衝ｉ　（ＤＨ７，４）　１　ｒｓ ｔオヨびガラスピーズ（φ０．０１ｍｇ　）　２　ｇと混合し、Ｂｒａｕｎ、Ｍ ｅｌＳｕｎｇｅｎ　、　ＭＳＫ細胞ホモジナイザー中で、連続ＣＯ２冷却しなが ら４０００ｒｐｍで破壊させた。　６０００ｇの遠心分離を３０分間行ない、ガ ラスピーズおよび細胞残渣を分離した。

この細胞を含有していないエキストラクトを、さらに処理することなく、あるい はβ−メチルアスパルテート−アンモニアリアーゼの部分的精製の後に、フマル 酸エチルのアミン化に使用した。

４、β−メチルアスパルテート−アンモニアリアーゼの部分的精製 プロタミン硫酸塩沈殿法 粗エキストラクトに、新しく調製した１％１０タミン硫酸塩溶液を０℃で滴下し て加え（１−／プロタミン１（ｌｏ＃）　、処理した。この溶液を引続いて１０ ＋闇撹拌し、沈殿を沈降させ、次いで捨てた。

硫酸アンモニウム沈殿法 プロタミン硫酸塩沈殿法により得られた上澄液を、１Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７ ，４）　２　ｃａｔ／　１０−で処理した。

次いで飽和硫酸アンモニウム溶液を添加することによって、５０％飽和とし、こ の混合物を引続いて、１０分間撹拌した。沈殿したタンパク質を遠心分離し、除 去した。

（ＮＨ４）２　ＳＯａ中の飽和度を次いで６０％まで増加し、この混合物を同様 に引続いて１０分間撹拌した。沈殿したタンパク質を遠心分離し、この沈殿を少 量のリン酸塩緩衝液中に再懸濁し、次いで酵素的アミノ化に使用した。

５．３−エチルフマル酸の酵素的アミノ化粗エキストラクトまなは部分的に精製 した酵素調製物を、フマル酸エチルの酵素的アミノ化に使用した。

例 ｔ　ｒ　ｉ　ｓ／ＨＣＪ＋　Ｗ　１１液、０．１Ｍ　、　ｐＨ８，４：　Ａ８０ ｍｅＫＣｊ　、　０．１Ｍ　：　２４ｍｇ １４Ｑ（Ｊ□　・６Ｈ２０：　２４ｍｅＮＨ３（５％）　：　７２ｔｓｅ フマル酸エチル（ｌによる）　：　２．２℃ｍｅ酵素溶液（４による）　：　２ ．５− 反応時間＝３０℃で３０分間、バッチの加熱処理（１００℃、１０分間）による 反応の停止、変性タンパク質を沈殿させ、捨てる。清明な上澄液を凍結乾燥させ る。粗生成物収量は１０．３ｇであった。

例　１ （２３，３Ｓ）−３−エチルアスパラギン酸ジメチル塩酸塩前記の酵素的アミノ 化からの凍結乾燥生成物（１０，３ｇ）をメタノール１６ＱＩＳＪｌ中にほとん ど溶解し、次いで０℃において塩化チオニル１５ｄでゆっくり処理した。この方 法で生成された懸濁液を室温で３日間撹拌し、次いで減圧で濃縮した９、二の固 形残留物（１４ｇ＞をメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル２００ｉｊとともに２． ５時間沸とうさせ、次いで一過るつぼを通して吸引一過した。このｒ液を減圧で ａｌ縮した。３−エチルフマル酸ジメチル１．２ｇ　＜７．０ミリモル、４６％ ）が僅かに褪色の波状物として残る。

このと過残留物をアセトン２００ｉＪとともに２時間沸とうさせ、次いで熱いう ちに一過した。このＰ液を減圧で濃縮した。　（２３，３３）　−３−エチルア スパラキン酸ジメチル塩酸塩１．８ｇ　（７，９ミリモル、５２％）がベージュ 色粉末として残る： ［α］　２％＝＋１ｇ、　３°　（ｃ　Ｑ、１．　ＣＨＣｂ中）：ＩＨ−罪Ｆｌ ｆ２００ＭＨｚ、　ＣＤＣｈ　）　：δ＝７．０５　（ｔ；　３）１．　ＣＨａ ）　；　１．０８−２．１５ｆｎ、２）１．　Ｃ）＋２）　；　３．２５（Ｉｌ ；　１Ｈ，３−１１）　：　３．２０および３．８５　＜　２ｓ；それぞれ３Ｈ ，０ＣＨ３）　；　４．４５　（広いｄ、　ＩＨ，２−１，８，８０（広いＳ； 　３Ｍ、　ＮＨ３”）、　１３Ｃ−ＮＭＲ（５０，３２ＮＨ２，ＣＤＣ１１３） 　：δ＝１１．９６　（Ｑ；　ＣＨｓ）　；　２２．４３　（ｔ；　ＣＨ２）　 ；　４７゜３６　（ｄ；　Ｃ−３）、　５２．６４および５３．４２　ｆ２ｑ； 　ＯＣＨ３）　；　５５．０７　（ｄ；　Ｃ−２）　；１６６．３７および１７ ２．３０　（２ｓ；　Ｃ−１およびＣ４）。

エタノールを使用することによって、（２Ｓ、　３Ｓ）　−３−エチルアスパラ ギン酸ジエチル塩酸塩が同様にして得２−エチルフマル酸の回収 例１からの２−エチルフマル酸ジメチル１．２ｇ　（７，０ミリモル）をＩ　Ｎ 　ＮａＯＨ溶液２０１Ｉｌ！と混合し、この混合物を還流の下に２時間加熱した 。この溶液を冷却し、濃塩酸でｐＨ１にし、次いでジエチルエーテルで抽出した 。この有機相を５ｇ５ｏ、上で乾燥させ、次いで減圧で濃縮した。

軟化点１８０℃の２−エチルフマル酸０．９５ｇ　（６，６ミリモル、９４％） が残る。このようにして得られた２−エチルフマル酸は、上記５に記載されてい るようにして、開題なく再使用することができる。

例　３ （２３，３３）−３−エチルアスパラギン酸例１からの（２３，３３）　−３− エチルアスパラギン酸ジメチル塩酸塩１．０ｇ　（４，４ミリモル）を、濃塩酸 ５０−中で２日間、還流の下に加熱した。この混合物を減圧の下に濃縮した。こ の残留物を水７−中に溶解し、ｌＮＮａＯＨでｐＨ３にし、次いでエタノールｔ ５０ｉｊで稀釈した。

冷蔵庫内で２日の後に、融点２３９〜２４１℃の（２３，３Ｓ）−３−エチルア スパラギン酸０．５ｇ　（３，５ミリモル、８０％）が沈殿した。

［（２］　２ｓ＝＋１９＠（ＩＮ　ＨＣｊ　中ｃ　Ｏ，１）　、’Ｈ−ＮＭＲ（ ２５０ＭＨ２，０２０）　：　δ”１．００　（ｔ；　３Ｈ，ＣＨ３）　；　１ ．６０および１．７５　（２ｉ；それぞれ１Ｈ，ＣＨ２）　；　２．９０　（ｉ ；　ＩＨ，Ｈ−３）　；４．０５　（ｄ；　ＩＨ，Ｈ−２）　、　ＭＳ　（７０ ｅＶ）　；　ｉ／ｅ　＝１１６　（Ｎ”−ＣＯ□Ｈ：５３％）　；　５６　（１ ００）。

例　４ （２Ｓ、　３Ｓ）　−２−（Ｎ−フェニルフルオレニル）−３−エチルアスパラ ギン酸ジメチル 例３に従い製造された生成物３．０ミリモルおよびフェニルフルオレニルブロマ イド３．５ミリモルを、アセトニトリル１５１１ｅ中ノＰｔ１ｉＮＯ３）２２． ５　ミ！Ｊ　モにオよびＫａＰＯｔ　６．０ミリモルの懸濁液に、順次加える。

この反応混合物を室温で３０時間撹拌した後に、ｒ過し、ｒ過残留物をジクロロ メタン４０−で洗浄する。Ｐ液を集め、濃縮する。この残留物をクロマトグラフ ィ処理しくシリカゲル、溶出剤：酢酸エチル／ヘキサン１：５）、純粋な生成物 を得る。この生成物の１８　ＮＭＲデータは、Ｊ。

Ｑｒａ、Ｃｈｅｍ、　５４巻、第１３号、１９８９．３１７２頁に記載のデータ と同一である。

例　５ （２Ｓ、　３Ｓ）　−２−（Ｎ−ベンジル）−３−エチルアスパラギン酸ジメチ ル 例３に従い製造された生成物３．０ミリモルとベンズアルデヒド３．１ミリモル とをメタノール２　Ｓ　ｒａｅ中に懸濁させた懸濁液に、シアノホウ素水素化ナ トリウム３．３ミリモルを加える。この反応混合物を１時間撹拌した後、慣用の 方法で仕上げ処理する。この残留物をクロマトグラフィ（シリカゲル、溶出剤： 酢酸／ヘキサンｌ：４）により処理し、純粋な生成物を得る。

Ｈ−ＮＭＲ（２５０ｔ４Ｈｚ、　Ｃ［１Ｃｊａ）　：δ＝０．５　（ｔ、　３Ｍ 、　ＣＨ３）、０．９−１．１　（ｉ、　２Ｈ，ＣＩ（２）　、２．５　（ｉ、 　ｉＨ，ＣＣＨ）　、　２．９　（ｓ。

３Ｈ，ＱＣ）１３）　、３．６　（Ｓ、　３Ｈ，０Ｃｈ）、３．８　（ｄ、　１ Ｈ，ＩＩ−ＣＩ、４．３−４．６　（ｌ、　２Ｈ，ＰＦＩ−ＣＨ２）、７．３− ７．３５　（ｎ、　５Ｈ，Ｐｈ−旧。

比較例 Ｊ、Ｏｒ！１１．ｃｈ６１１．５４．３１６４〜３１７３　（１９８９）　Ｌ： ｌ：従い製造されなＮ−フェニルフルオレニル−（２Ｓ、　３Ｓ）　−３−エチ ルアスパラギン酸ジメチル２．５ｇ　（５，８ミリモル）を、製塩ａ５０−で処 理し、次いで２日間、加熱還流した。この混合物を冷却し、次いで各回２５ＩＩ Ｉｇのトルエンを用いて２回洗浄した。こめ有機相を捨て、水性相を減圧で濃縮 した。この残留物をＨ２Ｏ５−中に溶解し、ｌ　Ｎ　ＮａＱＨを用いてＤＨを３ に調整し、次いでエタノール１００ｎｌｊでおおう。

０℃で２０時間後に、融点２５２〜２５３℃の（２Ｓ、　３３）　−３−エチル アスパラギン’１１０．４ｇ　（２，８ミリモル、４８％）が沈殿した。［αコ ２′＝　＋　１８°　（ＩＮＨＣＩｌ中、ｃ　Ｏ，１）　；スペクトル分析デー タは、例３に従い得られた化合物のデータと同一である。

要　約　書 エチルフマル酸の酵素的アミノ化によって得られる未精製（２３，３３）−３− エチルアスパラギン酸から、Ｎ−保護（２Ｓ、　３８）　−３−エチルアスパラ ギン酸ジアルキルまたはそれらの塩を製造する方法に関する。

国際調査報告

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. １．エチルフマル酸の酵素的アミノ化によって得られる未精製の（２Ｓ，３Ｓ） −３−エチルアスパラギン酸からＮ−保護（２Ｓ，３Ｓ）−３−エチルアルパラ ギン酸ジアルキルを製造する方法であって、 酵素的アミノ化によって生成した混合物を、アルカノールの存在の下にハロゲン 化剤で処理し、得られる２−エチルフマル酸ジアルキルを分離し、次いで そのアミノ基に保護基を付与する、 ことを特徴とする製造方法。
2. ２．上記生成混合物を塩化チオニルで処理することを特徴とする、請求項１に記 載の方法。
3. ３．上記生成混合物を、メタノールまたはエタノールの存在の下に処理すること を特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
4. ４．γ−ラクタム架橋２Ｓ，３Ｒ，２′Ｓ−イソロイシン−アラニンジペプチド の製造に、請求項１〜３に従い製造される（２Ｓ，３Ｓ）−３−エチルアスパラ ギン酸ジアルキルを使用すること。