JPH04505705A - 血管内皮細胞成長因子の生産およびそれをコードするｄｎａ - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 血管内皮細胞成長因子の生産およびそれをコードするＤＮＡ本発明は血管内皮細 胞成長因子、およびその治療的に有意な量の生産手段と方法論に関する。

下垂体前翼および下垂体前葉漏斗部の分泌細胞の形態学および生理学について、 かなりの研究が行われてきた。しかし、形態学的にはよく特徴づけられた顆粒状 細胞集団である濾胞細胞あるいは濾胞星状細胞（ＦＣ）の機能については、最近 までほとんどわかっていなかった。ＦＣは分泌細胞間に細胞質突起を送り出す星 状細胞である。

均一なＦＣ集団の培養法についてばＦｅｒｒａｒａ等Ｊｅｔｈ、　Ｅｎｚ、　（ Ｃｏｎｎ、Ｐ。

Ｍｌ）、第１２４巻、２４５−２５３頁（７ｆ＋テミフクプレス、ニューヨーク 、１９８６）に記述されている。

培養ＦＣによる円蓋形成の発現および生育様式、およびその超微細構造は解明さ れている（Ｆｅｒｒａｒａｉ、Ａｍ　Ｊ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　、２５２二Ｅ３ ０４−３１２（１９８７））。さらにＦＣは、腺下垂体細胞索中の間買液のイオ ン組成と容量オスモル濃度の調節に関与するかもしれないイオン輸送因子として 特徴づけられている（ＦｅｒｒａｒａおよσＧｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｔｚ、、Ｂ ｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ、　、ｉ５７　：　１３ ７６−１３８２（１９８８））　、さらに、ＦＣは脈管形成ミトゲン塩基性線維 芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を生産する（Ｆｅｒｒａｒａｉ、Ｐｒｏｅ、Ｎａｔ ｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　、Ｕ、Ｓ、Ａ、　、８４：５７７３−５７７７（１９ ８７））　。

Ａｂｒａｈａｍ等、ＥＩＩＢＯＪ、　５：２５２３−２５２９（１９８６）に開 示されているｂＦＧＦをコードする遺伝子は、古典的な分泌経路に従うタンパク 質の細胞外輸送にとって必要な従来のシグナルペプチドをコードしていな長因子 （ａＦＧＦ）をコードする遺伝子も同様である。したがって、かなりの細胞内濃 度のこのミトゲンを含有しているであろうにもかかわらず、この成長因子はその 培地中に容易に感知できるほどには分泌されず［Ｍｏ５ｃａｔｅｌｌｉｉ、Ｊ、 Ｃｅ１ｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　、１２９：２７３−２７７（１９８６）　；　Ｋ ｌａｇｓｂｕｒｎｉ、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ＾Ｊ ３：２４４８−２４５２（１９８６）］　、また応篭する細胞型は、最適な培養 増殖のためには外因性ｂＦＧＦに依存する（Ｎｅｕｆｅｌｄｉ、Ｅｎｄｏｃｒｉ ｎｏｌｏｇｙ、１２１：５９７−６０２（１９８７）　；　Ｓｃｈｗｅｉｇｅｒ ｅｒ等、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１２０ニア９６−８０２（１９８７）： 　ＳｃｈｖｅｉｇｅｒＬＥｘｐ、Ｅｙｅ　Ｒｅｓ、、匹ニア１−８０（１９８８ ））。ｂＦＧＦは基底膜に取り込まれ、次いで、特異的な酵素の作用に続いてマ トリックスが分解された場合にのみ可溶性の形態で放出されることが示唆されて いる（ｎｏｄａｖｓｋｙ等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ ＳＡ、８４：２２８２−２２８６（１９８７））　、このような放出機構は、器 官の再形成、創傷の治癒あるいは新形成のように基底膜の分解あるいは細胞溶解 を伴う現象において、主として、あるいは専らこの成長因子がその役割を果して いることを示唆している（ＦｏｌｋｍａｎおよσＫｌａｇｓｂｒｕｎ、　５ｃｉ ｅｎｃｅＳ２３５：４４２−４４７（１９８７））。

さらにｂＦＧＦおよびａＦＧＦは共に、血管内皮細胞の強力なミトゲンであると 同時に、角膜内皮細胞、水晶体上皮細胞、ＢＨＫ−２１線維芽細胞、副腎皮質細 胞およびケラ千ノサイトの強力なミトゲンでもある（Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃ ｚ等、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ　Ｒｅｖｉｅｗｓ４：９５−１１４（１９８７）　： 　Ｂａ１ｒｄｏ、Ｒｅｃｅｎｔ　Ｐｒｏ　、　Ｆｌｏｒｍ、　Ｒｅｓ、　、４２ ：１４３−１８６（１９８６））。

血管内皮細胞ミトゲンはＰｌｏｕｅｔおよびＧｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚによっ て単離され、記述された（Ｔｈｅ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｓｙｍｐｏｓ ｉｕｍ　ｏｎ　ｔｈｅ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｔｈｅ　Ｖａｓｃｕｌ ａｒ　Ｓｙｓｔｅｍ、マゾソンｊＩ、１９８９年、４月２３−２６日、Ｉ１ｍｆ 履胞ミトゲンのｌｌおよσ待機づけｘバスクロトロピン”）　。　極く最近、　 血管内皮細胞成長因子と呼ばれるヘパリン結合性内皮細胞成長因子が、ウシ脳下 垂体濾胞あるいは濾胞星状細胞によって調整された培地から同定され、精製され た（ＦｅｒｒａｒａおよびＩｆｅｎｚｅｌ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏ ｍａ＋１．１６１　：８５１（１９８９））。

ａＦＧＦやｂＦＧＦとは対照的に、その供給源細胞内に隔離されることな（むし ろ分泌され、その結果目標細胞に直接接近する成長因子が必要とされている。黄 体のような器官でおこる血管の周期的な成長［Ｂａ５ｓｅｔｔＳＡｔ　１．　Ａ ｎａｔ、　、７３：２５１−２５９（１９４３）コや血管相中の内皮の分化状態 の持続性の維持における、血管内皮細胞増殖の生理学的制御において、そのよう な成長因子はより動的な役割を果すであろう。

また、極めて広域の細胞スペクトルに対して活性なａＦＧＦおよびｂＦＧＦとは 対照的に、血管内皮細胞に特異的な成長因子が必要とされている。そのような特 異性は、過剰な結合組織増殖を伴わない、血管内皮細胞に対する選択的な作用が 望ましい症状（例えば糖尿病性潰瘍あるいは外傷性血管損傷）の治療に有効であ ろう。

上述の必要性を満たす血管内皮細胞成長因子を天然の供給源から単離精製し、使 用することは可能であるが、ＦＣ中の該タンパク質濃度が比較的低いこと、およ びＦＣから商業ベースの量で精製成長因子を回収する時の代価が、手間と費用の 両方に関して高いことは、その広範囲における使用を妨げている。

したがって、血管内皮細胞成長因子をコードするＤＮＡを単離し、商業ベースで 実用的な量の該タンパク質を医薬的に許容され得る供給源から生産することが、 本発明の目的である。

また対応する天然の成長因子に結合しているグリコジル化を伴わない形態で血管 内皮細胞成長因子を入手することも、本発明の目的である。

さらに、血管内皮細胞成長因子のアミノ酸配列、および該タンパク質の生物活性 に本質的に不利な影響を及ぼさないその変種を調製することも、本発明の目的で ある。

また、天然に存在する（供給源の）他のタンパク質を全く含有しない血管内皮細 胞成長因子を生産することも、本発明のもう一つの目的である。

本発明のこれらの目的および他の目的は、本明細書全体から明らかになるであろ う。

本発明のこれらの目的は、血管内皮細胞成長因子をコードする遺伝子の組換え細 胞培養中における発現（この過程は基本的に、該成長因子をコードする核酸の提 供、該成長因子コード核酸による宿主細胞の形質転換、および該成長因子をコー ドする核酸を該宿生細胞培養中で発現させるための該宿主細胞の培養からなる） によって遂行される。

ある特定の態様において本発明は、５ＤＳ−ＰＡＧＥで測定した場合、非還元的 条件下で約４５０００ダルトン、還元的条件下で約２３０００ダルトンの分子量 を有する血管内皮細胞成長因子をコードする配列を含有する、単離された核酸配 列の単離を包含する。

別の側面において本発明は、２０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ。

５０ｍＭ　リン酸ナトリウム（Ｅ）Ｈａ、　８）　、０．１％ピロリン酸ナトリ ウム、５ｘデンハルト液、および５０μｇ／ｍｌ　サケ精子ＤＮＡ中で、次のＤ ＮＡ配列＋　５”ＣＣＴＡＴＧＧＣＴＧＡＡＧＧＣＧＧＣＣＡＧＡＡＧＣＣＴＣ ＡＣＧＡＡＧＴＧＧＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴＧＧＡＣＧＴＧＴＡＴＣＡ−３’、と 共に４２℃でインキユベートシ、２ｘＳＳＣ，０，１％ＳＤＳを用いて４２℃で 洗浄した場合に、このＤＮＡ配列とハイブリッドを形成する配列を含む、少なく とも約１０ヌクレオチドを含有する単離ＤＮＡ配列を提供する。

さらに他の側面において本発明は、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ１５０ｍＭ 　リン酸ナトリウム（ｐＨ６，８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５ｘデン ハルト液、および５０μｇ／ｍｌ　サケ精子ＤＮＡ中で、図２のＤＮＡ配列と共 に４２℃でインキュベー・トし、２ｘＳＳＣ１０，１％ＳＤＳを用いて４２℃で 洗浄した場合に、図２のＤＮＡ配列とハイブリッドを形成する配列を含む、少な くとも約１０ヌクレオチドを含有する単離ＤＮＡ配列を提供する。

まブ：、（ａ）血管内皮細胞の成長を選択的に促進するが、ウシ角膜内皮細胞、 水晶体上皮細胞、副腎皮質細胞、ＢＨＫ−２１線維芽細胞、あるいはケラ千ノサ イトの成長を促進しない、もしくは（ｂ）対応する天然のタンパク質の少な（と も１つのエピトープに対して生じた抗体と免疫学的に交差反応する、という生物 学的性質を有するのに十分に血管内皮細胞成長因子と相同なアミノ酸配列を有す る、血管内皮細胞成長因子をコードするＤＮＡ配列を含有すると、そのＤＮＡ配 列を特徴づけることもできる。

他の態様では、本発明は、（１）標識した検定用ＤＮＡ配列、（２）プロモータ ーに機能するように連結させたＤＮＡ配列、（３）発現ベクターであって、その ベクターで形質転換した宿主細胞によって認識される制御配列に、機能するよう に連結された上述のＤＮＡ配列を含有するもの、および（４）上述の発現ベクタ ーで形質転換した宿主細胞、に関する。

本発明のさらなる側面は、結合した天然のグリコジル化を伴わず、図２あるいは 図１０に示す成熟したタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも約８０％の相同性 を有し、また以下の生物学的性質：　（ａ）血管内皮細胞の増殖を選択的に促進 するが、ウシの角膜内皮細胞、水晶体上皮細胞、副腎皮質細胞、ＢＨＫ・−２１ 線維芽細胞、あるいはケラチ、ノサイトの増殖を促進しない、もしくは（ｂ）対 応する天然のタニ・バク質の少なくとも１つのエピトープに対して生じた抗体と 免疫学的に交差反応する、の内の１もしくは両方を有する該因子を含む、天然に 存在する血管内皮細胞成長因子の新規な形態に関する。このような血管内皮細胞 成長因子は一般に、異種組換え細胞培養における発現の産物として得られる。こ の成長因子は、組換え細胞培養の構成要素としてのどのような形態においても新 規である。

さらに別の態様において本発明は、医薬的に許容され得る担体中の、組換え的に 生産した治療有効量の血管内皮細胞成長因子を含有する、血管内皮細胞昨長の促 進に有効な医薬組成物に関する。

また、血管内皮に影響を及ぼす外傷を負った動物もしくはヒトに有効量の上述の 医薬組成物を投与することからなる、該外傷の治療法も本明細書の７１！、図す るとこうである。

本発明は、組換え技術によって血管内皮細胞成長因子、および５７′またはその 誘導体を生産することを可能にすると同時に、そのような生産に関連する産物お よび方法を提供することを可能にする。

本明細書に記述される方法によって調製されるこの成長因子は、過剰な組織成長 を伴わず、血管内皮細胞に対して選択的に作用することが重要な症状（例えば糖 尿病性潰瘍、および皮下創傷のような外傷の結果性じる血管損傷）の治療におい て有効であると考えられる。

この成長因子の他の用法は当業者に明らかになるであろう。

図１は、本成長因子のｃＤＮＡクローンを得る目的でウシ下垂体濾胞細胞ライブ ラリーをスクリーニングするために使用したオリゴヌクレオチドプローブ配列を 表すと同時に、得られたｅＤＮＡ配列との一致を表す。

図２は、本明細書でｐ、ｖｅｇｆ、６クローンから得られたウシ血管内皮細胞成 長因子の全核酸配列および予想アミノ酸配列を表す。

このタンパク質の予想アミノ酸配列をＤＮＡ配列の下に示し、、そのタンパク質 配列のＮ末端の第一残基から番号を付ける。負のアミノ酸番号は推定される先導 シグナル配列もしくはプレタンパク質を表しており、一方、正の番号は成熟した タンパク質を表している。オリゴヌクレオチドプローブの位置を下線で示す。

図３は、最終の発現ベクターを構築するために使用した、出発発現ベクターｐＦ ８ＣＩＳの構築を表す。

図４は、ＣＩａＩ部位がｄａｍメチル化による変化を受けていない、因子ＶＩＩ 工ノための中間ベクターｐＣＩＳ２．８ｃ２４Ｄの構築を表す。また、融合プラ スミドを構築するための、因子ｖｎｒコード領域の４０８および４１６ｂｐ断片 のサブクローニングをも示している。　図５は、因子ＭＨＩ変種の融合領域をｐ ＵＣベクター中に含有している中間プラスミドｐＵＣ，８ｄ２８の構築を表す。

図６は、因子ｖ　Ｉｎ変種タンパク質をコードする中間発現ベクターｐＣＩＳ２ ．８ｃ２８Ｄの構築を表す。

図７は、血管内皮細胞成長因子をコードするＤＮＡを挿入した、発現ベクターｐ ＲＫ５の構築を表す。

図８は、本成長因子を生産するために形質転換した哺乳類宿主細胞に用いた発現 ベクターｐＲＫ５．ｖｅｇｆ、６の構築を表す。

図９は、異なった細胞型に対する血管内皮細胞成長因子の影響を表す。ＣＥＣ： 角膜内皮細胞、ＢＡＣ：ウシ副腎皮質細胞、ＫＴＣ：ケラチノサイト、ＬＥＣ： 水晶体上皮細胞、ＢＨＫ−２１＋幼ハムスター腎細胞クローン２１、ＡＣＣ：副 腎皮質毛細血管内皮細胞、ＢＢＣ：ウシ脳毛細血管内皮細胞、ＨＵＶＥ：ヒトａ 静脈内皮細胞、ＦＢＡＥ：胎児ウシ大動脈内皮細胞、ＡＢＡＥ：成体ウシ大動脈 内皮細胞。細胞をそれぞれの成長培地に接種し、最大濃度の本成長因子と共にイ ンキュベートし、４日あるいは５日後に計数した。結果を適切な対照に対する率 （％）として表現する。

図１０は、本明細書でｐ、ｖｅｇｆ、２１クローンから得られたヒト血管内皮細 胞成長因子の全核酸配列および予想アミノ酸配列を表す。このタンパク質の予想 アミノ酸をＤＮＡ配列の下に示し、そのタンパク質配列のＮ末端の第一残基から 番号を付ける。負のアミノ酸番号は推定される先導シグナル配列もしくはプレタ ンパク質を表し、一方、正の番号は成熟したタンパク質を表す。

図１１は、本成長因子を生産するために形質転換した哺乳類宿主細胞に用いる発 現ベクターｐ、ｖｅｇｆ、２１の構築を表す。

図１２は、ウシ（ｂ）ＶＥＧＦおよびヒト（ｈ）ｖＥＧＦのアミノ酸配列の比較 を表し、囲んだアミノ酸配列は相同領域を示す。

本明細書で用いられる場合、“血管内皮細胞成長因子”もしくは“ＶＥＧＦ”と いう用語は、図２のアミノ酸配列を有する、ウシ下垂体濾胞細胞由来の哺乳類成 長因子を表すと同時に、対応する天然のＶＥＧＦの生物活性を有するその類縁体 および変種を表し、これには図１０のヒトアミノ酸配列も含まれる。血管内皮細 胞の成長を選択的に促進し得るが、ウシ角膜内皮細胞、水晶体上皮細胞、副腎皮 質細胞、ＢＨＫ−２１線維芽細胞、あるいはケラチノサイトの成長を促進しない か、もしくは対応する天然ＶＥＧＦの少なくとも１つのエピトープに対して生じ た抗体と免疫学的に交差反応する免疫エピトープを有する、あらゆる類縁体ある いはその変種は、天然ＶＥＧＦの生物活性を共有する。

類縁体もしくは変種は、天然ＶＥＧＦのアミノ酸配列、グリコジル化、あるいは 他の性質が共有結合的に、もしくは非共有結合的に修飾された分子と定義される 。したがって、変種は約４５ｋＤの分子量（還元剤（例、β−メルカプトエタノ ールあるいはジチオスレイトール）の非存在下で行う５ＤＳ−ＰＡＧＥによって 決定した場合）を有することもあるし、有さないこともある。例えば、天然の成 熟した配列を有する非グリコジル化ＶＥＧＦは非還元的５ＤＳ−ＰＡＧＥ上でよ り低い分子量を持つであろう。アミノ酸配列変種には図２の配列の対立遺伝子だ けでなく、計画的な突然変異も含まれる。一般にアミノ酸配列の変化は、図２の 天然ＶＥＧＦ　（図１０に示すヒトの配列のように、少なくとも９５％相同な変 種を含む）のアミノ酸配列と少なくとも約８０％相同、より典型的な場合には少 なくとも約９０％相同なアミノ酸配列を有する。以後、ＶＥＧＦという用語は、 他に適切な用語がない限り、天然の配列もしくは変種体を意味する。

したがって、図２に述べるウシＶＥＧＦアミノ酸配列を有するＶＥＧＦ、他の種 から得られる類似のＶＥＧＦタンパク質（例えばヒト、ウマ、ブタ、ヒツジ、イ ヌ、ネズミ、ネコＶＥＧＦなど）、およびこれらのＶＥＧＦ分子の生物学的に活 性なアミノ酸配列変種（■ＥＧＦタンパク質の生物活性を示す、インビトロで生 成した共有結合性のＶＥＧＦ誘導体および対立遺伝子を含む）が、本発明の範囲 内に包含される。

″血管内皮に影響を及ぼす外傷”という表現は、動物あるいはヒト、好ましくは 哺乳類、最も好ましくはヒトが負う、器官の血管網を含む血管あるいは心臓の外 傷（例、損傷）を意味する。このような外傷の例には、創傷、切開、および潰瘍 、最も好ましくは糖尿病性潰瘍、および血管あるいは心臓の裂傷もしくは創傷が 含まれる。

外傷には、血管内皮細胞の成長を促進することによって改善され得る、内因性の 事象によって起こる症状や外因性の物質（例、病原体）によってもたらされる症 状が含まれる。

本明細書の別の項で述べるように、ＶＥＧＦの誘導体およびそのアミノ酸配列変 種は、その生物活性および抗ＶＥＧＦ抗体に対する結合能ゆえに治療的使用に関 して有益である。後者の性質を有する誘導体および変種は、そのような誘導体お よび変種がその治療力のある生物活性を保持しているかどうかにかかわらず、抗 体を精製する際に有効であり、また標識された場合には、ＶＥＧＦの免疫検定に 用いる試薬として有効である。

Ｖ　Ｅ　Ｇ　Ｆ分子の共有結合性の修飾は本発明の範囲内に包含される。

約］００残基までの残基を有する変種ＶＥＧＦ断片はインビトロ合成によって容 易に調製できる。精製あるいは粗タンパク質の目標アミ、ノ酸残基を、選択した 側鎖もしくは末端残基と反応可能な有機誘導体化試薬と反応させることによって 、このような修飾をその分子中に導入することができる。得られる共有結合性誘 導体は、生物活性にとって重要な残基を同定することを目指す計画において有効 である。

システィン残基は一般に、α−ハロアセテート（および対応するアミン）（例え ばクロロ酢酸、あるいはクロロアセタミド）と反応して、カルボキシメチルもし くはカルボキシアミドメチル誘導体を与える。またシスティン残基は、プロモト リフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミドジイル）プロピオン酸、ク ロロアセチルホスフェート、Ｎ−アルキルマレイミド類、３−ニトロ−２−ピリ ジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロメルクリベン ゾエ−１・、２〜・タコロメルクリニトロフェノー・ル、あるいはクロロ−７− 二トロベンゾー２−オキサ−１，３−ジアゾールとの反応によっても誘導体化さ れる。

ジエチルピロカーボネートは比較的ヒスチジン側鎖に特異的であるので、ｐＨ５ ，５−７，０におけるこの試薬との反応によってヒスチ・ジン残基が誘導体化さ れる。バラブロモフェナシルプロミドも有効である（この反応はｐＨ６，Ｏの０ ．１Ｍカコジル酸すＩ・リウム中で行うことが好ましい）。

リジン残基およびアミノ末端残基は、無水コハク酸もしくは他の駿無水物と反応 させる。これらの試薬による誘導体化は、そのリジン残基の電荷を反転させる効 果を持つ。含α−アミノ残基の誘導体化に適する他の試薬には、イミドエステル 類（例、メチルビコリシイミデート）、ビリドキザルリン酸、ピリドキサール、 りＯＯホロヒドリド、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ−メチルイソ尿素、２ ．４−ペンタンジオン、およびトランスアミナーゼによって触媒されるグリオキ シｌノートとの反応が含まれる。

アルギニン残基は、フェニルグリオキサール、２．３−ブタンジオン、１．２− シクロヘキサンジオン、およびニンヒドリンなどの従来の試薬の１もり、＜は残 つかとの反応によって修飾される。グアニジン官能基のｐＫ、が高いので、アル ギニン残基の誘導体化反応は塩基性条件下で行う必要がある。またこれらの試薬 は、アルギニンのε−アミノ基と同時に、リジンのアミノ基とも反応し得る。

チロシン残基の特異的修飾自体は、特に芳香族ジアゾニウム化合物あるいはテト ラニトロメタンとの反応によってチロシン残基中にスペクトル標識を導入する目 的で、詳しく研究されている。一般的にはＮ−アセチルイミジゾールおよびテト ラニトロメタンが、それぞれＱ−アセチルチロシル種および３−ニトロ誘導体を 形成するために用いられる。放射免疫検定に用いる標識タンパク質を調製するた めには、１２５Ｊあるいは＋３１１を用いてチロシン残基をヨー素化する。

上述のクロラミンＴ法が適当である。

カルボキシル側鎖官能基（アスパラギン酸あるいはグルタミン酸残基）は、カル ボジイミド（Ｒ’−Ｎ−Ｃ−Ｎ−Ｒ’）（例えば、１−シクロへキシル−３−（ ２−モルフオリニル−（４−エチル）カルボジイミド、あるいは１−エチル−３ −（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミド）との反応によ って選択的に修飾される。またアスパラギン酸およびグルタミン酸残基は、アン モニウムイオンとの反応によってアスパラギンおよびグルタミン残基に変換され る。

三官能試薬による誘導体化は、抗ＶＥＧＦ抗体の精製法に使用するために、ＶＥ ＧＦを水に不溶性の支持マトリックスもしくは表面に架橋させる際に有効である 。一般に用いられる架橋化剤には、例えば１．１−ビス（ジアゾアセチル）−２ −フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステ ル類（例えば４−アジドサリチル酸とのエステル）、ジスクシンイミジルエステ ル類（例、３．３゛−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート））を含む ホモ三官能イミドエステル類、および三官能マレイミド類（例、ビス−Ｎ−マレ イミド−１，８−オクタン）が含まれる。メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル ）ジチオコプロピオイミデートのような誘導体化試薬は、光の存在下で架橋を形 成することができる、光活性化能を有する中間体を与える。また臭化シアン活性 化炭水化物や、アメリカ合衆国特許番号３９６９２８７　：　３６９１０１６　 、４１９５１２８　；　４２４７６４２　；　４２２９５３７および４３３０４ ４０に記述されている反応性基質のような、水に不溶性で反応性のマトリックス が、タンパク質の固定化に使用される。

グルタミンおよびアスパラギン残基はしばしば脱アミド化されて、対応するグル タミン酸およびアスパラギン酸残基に変換される。またこれらの残基は、穏やか な酸性条件下で脱アミド化される。これらの残基のどちらの形態も本発明の範囲 内に包含される。

他の修飾には、プロリンおよびリジン残基の水酸化、セリンあるいはスレオニン 残基の水酸基のリン酸化、リジン、アルギニンおよびヒスチジン側鎖のａ−アミ ノ基のメチル化（Ｔ、　Ｅ、　Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　：　５ ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、ｆ、 Ｈ，Ｆｒｅｅｍａｎ　＆　Ｃｏ、　、ナン７ランシス］、７９−８６Ｎ［１９８ ３］）　、Ｎ末端アミンのアセチル化、および、幾つかの例では、Ｃ末端カルボ キシル基のアミド化が含まれる。

ＶＥＧＦのアミノ酸配列変種はＤＮＡ中の突然変異によっても調製できる。その ような変種には、例えば図２に示すアミノ酸配列中の残基の削除、挿入あるいは 置換が含まれる。また削除、挿入および置換のどのような組み合わせでも、最終 構築物が目的の活性を有するという条件で、最終構築物を与えるように行うこと が可能である。その変種をコードするＤＮＡ中に作る突然変異は、その配列を読 み枠外においてはならず、また二次ｍＲＮＡ構造を形成する可能性のある相補領 域を生み出さないことが好ましい（ＥＰ　７５４４４Ａ参照のこと）、というこ とは明らかである。

遺伝子レベルでは、これらの変種は通常、ＶＥＧＦをコードするＤＮＡ中のヌク レオチドの部位特異的突然変異導入によって変種をコードするＤＮＡを作成し、 その後そのＤＮＡを組換え細胞培養中で発現させることによって調製される。典 型的にはこれらの変種は、天然に存在する類縁体と同じ性質の生物活性を示す。

アミノ酸配列変異を導入する部位はあらかじめ定められるが、その突然変異自体 をあらかじめ定める必要はない。例えばある部位の突然変異の成果を最適化する ためには、目標コドンあるいは領域において無作為突然変異導入を実施し、目的 の活性の最適な組み合わせを探すために、発現したそのＶＥＧＦ変種をスクリー ニングすることができる。既知の配列を有するＤＮＡ中の計画した部位に置換突 然変異を作るための技術はよ（知られている（例、部位特異的突然変異導入）。

本明細書に従うＶＥＧＦ変種の調製は、先に調製されたそのタンパク質の変種も しくは変化していないそのタンパク質をコードするＤＮＡの部位特異的突然変異 導入によって達成されることが望ましい。部位特異的突然変異導入は、欠失接合 部を横切ってその両側で安定な二本鎖を形成するのに充分な大きさと配列の複雑 さを有するプライマー配列を提供するために充分な数の隣接ヌクレオチドと同時 に、目的の突然変異のＤＮＡ配列をコードする、特別なオリゴヌクレオチド配列 を使用することによって、ＶＥＧＦ変種の生産を可能にする。典型的には、約２ ０ないし２５ヌクレオチドの長さで、変更される配列の接合部の両側に約５ない し１０残基を伴うプライマーが望ましい。Ａｄｅｌｍａｎ等、工情、２：　１８ ３（１９８３’）のような発表によって例証されているように、一般に部位特異 的突然変異導入技術は当技術分野においてよ（知られている。

理解されるであろうが、部位特異的突然変異導入技術は典型的には、−末鎖およ び二本鎖のどちらの形態でも存在するファージベクターを使用する。部位特異的 突然変異導入に有効な典型的ベクターには、例えばＭｅｓｓｉｎｇ等、Ｔｈ１ｒ ｄ　Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ　Ｓｙａ＋ｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　Ｍａｅｒｏｍｏｌｅｃ ｕｌｅｓ　ａ　ｄ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ、Ａ、Ｗａｌｔｏｎｌ、ｚ ルセＥア、ＴムステルダＡ（１９８１）４ｍ開示されているように、Ｍｌ、３フ アージのようなベクターが含まれる。

これらのファージは市販されており、容易に入手可能であり、その使用法は一般 に当業者にはよく知られている。また、−末鎖ＤＮＡを得るために、−重鎖ファ ージ複製起源を含有するプラスミドベクター（Ｖｅｉｒａｉ、Ｍｅｔｈ、　Ｅｎ ｚｙｍｏｌ、　、１５３：３［１９８７］）を使用することもできる。

本明細書に従う部位特異的突然変異導入は一般に、まず、今問題にしているタン パク質をコードするＤＮＡ配列をその配列中に含有する一末鎖ベクターを得るこ とによって行われる。変異した目的の配列を有するオリゴヌクレオチドプライマ ーを、一般的には合成的に、例えばＣｒｅａ等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａ ｄ、　Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）、７５：５７６５（１９７８）の方法に従って、調 製する。次いでこのプライマーを、タンパク質配列を含有する一末鎖ベクターに アニールさせ、変異を含有する鐘の合成を完結させるために、大腸菌ポリメラー ゼＩクレノーフラグメントのようなりＮＡ重合酵素に適用する。したがって、一 本の鎖は元来の非変異配列をコードし、もう一本の鎖は目的の変異を保有してい るヘテロ二本鎖が形成される。次に、このヘテロ二本鎖を使７て適当な細胞（例 えばＪＭＩｏｌ）を形質転換し、変異した配列配置を保有する組換えベクターを 含有するクローンを選択する。

このようなりローンを選択した後、変異したタンパク質領域を取り出し、タンパ ク質生産に適したベクター（一般的には、適切な宿主の形質転換に使用できる型 の発現ベクター）に入れることができアミノ酸配列の削除は一般的には、約１な いし３０残基の範囲であるが、工ないしｌＯ残基がより好ましく、典型的には連 続的に削除する。

アミノ酸配列の挿入には、１残基から本質的に無制限の長さのアミノ末端、およ び／またはカルボキシル末端融合、および１あるいは複数アミノ酸残基の配列内 挿入が含まれる。配列内挿入（即ち、成熟ＶＥＧＦ配列内への挿入）は一般に、 約１ないし１０残基の範囲で可能であるが、工ないし５残基がより好ましい。末 端挿入の例には、成熟ＶＥＧＦの組換え宿主からの分泌を促進するために、ＶＥ ＧＦ分子のＮ末端に、宿主細胞にと７．て異種あるか、同種であるかにかかわら ず、シグナル配列を融合することが含まれる。

変種の第三の群は、ＶＥＧＦ分子中の少なくとも１アミノ酸残基（１残基のみで あることが望ましい）が除去され、異なる残基がその代わりに挿入されている変 種である。ＶＥＧＦ分子の特徴を精密に調節することを望む場合には、次の表１ に従ってこのような置換を行うことが好ましい。

表　１ Ａｌａ　（Ａ）　ｇｌｙ：ｓｅｒ Ａｒｇ（Ｒ）　１ｙｓ Ａｓｎ　（Ｎ）　ｇｉｎ；ｈｉｓ Ａｓｐ（Ｄ）　ｇｌｕ Ｃｙｓ　（Ｃ）　５ｅｒ Ｇｉｎ（Ｑ）　ａｓｎ Ｇｌｕ（Ｅ）　ａミル Ｇｌｙ　（Ｇ）　ａｌａ；ｐｒ。

Ｈｉｓ　（Ｈ）　ａｓｎ：ｇｉｎ ｌｌｅ　（１）　ｌｅｕ；ｖａｌ Ｌｅｕ　（Ｌ）　ｉｌｅ；ｖａｌ Ｌｙｓ　（Ｋ）　ａｒｇ；ｇｉｎ：ｇｌｕＭｅ　ｔ　（Ｍ）　１　ｅｕ　；　ｔ ｙｒ　；目ｅＰｈｅ　（Ｆ）　ｍｅｔ：ｌｅｕ；ｔｙｒＳｅｒ（Ｓ）　ｔｈｒ Ｔｈｒ（Ｔ）　５ｅｒ Ｔｒｐ（Ｗ）　ｔｙｒ Ｔｙｒ　（Ｙ）　ｔｒｐ；ｐｈｅ 表１の置換より保存性の少ない置換を選択することによって、即ち（ａ）置換領 域内のポリペプチド骨格の構造（例えば、シートもしくは螺旋配座）、（ｂ）目 標の部位における分子の電荷あるいは疎水性、もしくは（Ｃ）側鎖の嵩高さ、の 維持に与える影響がより著しく異なる残基を選択することによって、機能あるい は免疫学的同一性が本質的に変化する。一般にＶＥＧＦの性質に最も大きな変化 を与えると期待される置換は次の置換であろう：　（ａ）グリシンおよび／また はプロリン（Ｐ）を他のアミノ酸に置換するか、もしくは削除するか、あるいは これらを挿入する、（ｂ）親水性残基（例、セリンあるいはスレオニン残基）で （を）疎水性残基（例、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリン、 あるいはアラニン残基）を（に）置換する、（Ｃ）システィン残基で（を）他の アミノ酸を（に）置換する、（ｄ）正電荷側鎖を持つ残基（例、リジン、アルギ ニン、あるいはヒスチジン残基）で（を）負電荷を有する残基（例、グルタミン 酸あるいはアスパラギン酸残基）を（に）置換する、あるいは（ｅ）嵩高い側鎖 を持つ残基（例、フェニルアラニン）で（を）そのような側鎖を持たない残基（ 例、グリシン）を（に）置換する。

はとんどの削除および挿入、また特に置換は、ＶＥＧＦ分子に特徴に根本的な変 化を与えないと考えられる。しかし置換、削除あるいは挿入の影響を、あらかじ め正確に予期することが困難な場合には、一般に行われているスクリーニング検 定法によってその影響を見積もることを当業者は望むであろう。例えば典型的に は、天然ＶＥＧＦコード核酸の部位特異的突然変異導入、その変種核酸の組換え 細胞培養中での発現、また場合によっては、例えば（少な（とも１つの残ってい る免疫エピトープに結合させることによってその変種を吸着する）ウサギポリク ローン抗ＶＥＧＦカラムへの免疫親和性吸着によるその細胞培養からの精製、に よって変種を作成する。

ＶＥＧＦは二量体に会合しやすいので、１もしくは両サブユニットが変種である ような、ヘテロニ量体およびホモニ量体を提供することが本明細書の範囲内に含 まれる。両サブユニットが変種である場合、アミノ酸配列中の変化は各サブユニ ット鎖で同じでも良いし、異なっていても良い。ヘテロニ量体の両サブユニット をコードするＤＮＡで宿主細胞を同時形質転換し、必要であれば目的のへテロニ 量体を精製するか、あるいは個別にサブユニットを合成し、そのサブユニットを 解離（例、カオトロピック試薬（尿素、グアニジン塩酸塩など）を用いた処理に よる解離）させ、解離したサブユニットを混合し、次いでカオトロピック試薬を 透析除去してそのサブユニットを再会合させることによって、ヘテロニ量体を容 易に生産できる。

次いで精製ＶＥＧＦ変種あるいはその細胞溶解液の活性を、目的の特徴に適した スクリーニング検定法でスクリーニングする。例えば、ＶＥＧＦ分子の免疫学的 特徴（例、ある抗体に対する親和性）の変化を競争型免疫検定で測定する。候補 変異種による血管内皮成長の促進もしくは抑圧作用の変化を適当な検定法で測定 する。酸化還元もしくは熱的安定性、疎水性、タンパク質加水分解による減成に 対する感受性、あるいは担体との、もしくは多量体への会合傾向などのタンパク 質の性質の変化を、当業者一般によく知られている方法によって検定する。

目的のＶＥＧＦ分子は、組換え法を含むあらゆる技術で調製できる。また、本明 細書において単離ＤＮＡとは、３′および／または５′に隣接領域を伴った（あ るいは伴わない）、化学合成りＮＡ。

ｃＤＮＡ、染色体もしくは染色体外ＤＮＡを意味する。本明細書の目的のＶＥＧ Ｆは組換え細胞培養中で合成することが好ましい。

そのような合成のためには、ＶＥＧＦをコードする核酸を確保することが、まず 必要である。（ａ）ウシ下垂体濾胞細胞からｃＤＮＡライブラリーを調製する、 （ｂ）そのライブラリー中の、相同配列を含有するクローンを検出するために、 ＶＥＧＦあるいはその断片（１００塩基対まで、もしくはそれ以上の長さ）をコ ードする標識されたＤＮＡを用いてハイブリッド形成分析を実施する、さらに（ Ｃ）短縮されていない（フルレングス）クローンを同定するために、制限酵素分 析および核酸配列決定を用いてそのクローンを分析することによって、ウシ下垂 体濾胞細胞からＶＥＧＦ分子をコードするＤＮＡを得ることができる。ストリン ジエンシー（紙密度）の低い条件下でＶＥＧＦコードＤＮＡとハイブリッド形成 することができるＤＮＡは、ＶＥＧＦをコードするＤＮＡを同定する際に有効で ある。高および低厳密的条件については後に定義する。短縮されていないクロー ンがｃＤＮＡライブラリー中に存在しない場合には、本明細書に初めて開示され る核酸配列情報を用いて種々のクローンから適当な断片を回収し、それらのクロ ーンに共通の制限部位で連結して、ＶＥＧＦをコードする短縮されていないクロ ーンを組み立てることができる。あるいは、ゲノムライブラリーが目的のＤＮＡ を提供するであろう。最終的に決定した、ウシＶ　Ｅ　Ｇ　Ｆをコードする配列 を図２に示す。ヒト白血病株化細胞をブロービングすることによって最終的に決 定した、ヒトＶＥＧＦをコードする配列を図１０に示す。

このＤＮＡを同定し、そのライブラリー・から単離したら、次のクローニングの ために、もしくは発現させるために、これを複製可能なベクター中に連結する。

組換え発現系のある実施例では、ＶＥＧＦをコードするＤＮＡを含有する発現ベ クターを用いた形質転換によって、哺乳類細胞中でＶＥＧＦコード遺伝子が発現 する。培養培地もしくは宿主細胞のペリプラズム中のＶＥＧＦ　（即ち、分泌分 子）を得るためのプロセシングを遂行できる宿主細胞を形質転換することが好ま しい。

本明細書に開示されるベクターおよび方法は、原核および真核生物の広範囲にわ たる宿主細胞中での使用に適している。

一般的には、もちろん、ＤＮＡ配列の最初のクローニングおよび本発明において 有用なベクターの構築には、原核生物が好ましい。

例えば、Ｌ並置に１２麗關２９４株（ＡＴＣＣ番号３１４４６）が特に有用であ る。

使用できる他の微生物株には、Ｅ、　ｃｏ■ＢおよびＥ、　ｃｏ■Ｘ１７７６（ ＡＴＣＣ１号３１５３７）のような大腸菌株が含まれる。もちろんこれらの例は 、例示を意図するものであって、これらに限定するものではない。　原核生物を 発現に使用することもできる。前記の株、およびＥ、ｃｏｌｉＷ３１１０株（Ｆ −、ラムグー、原栄養株、ＡＴＣＣＩ鯰７３２５）　、［５７７２（ＡＴＣＣ計 ５３６３５）　、および５ＲＩＯＩ、バチルス（例、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂ ｔｉｌｉｓ）　、および他の腸内細菌ＩｊｌＩ！（例、四１ｍｏｎｅｌｌａ　ｔ ｙ餅練四力岬アルイハとＥ鮎できる。

一般に、その宿主細胞に適合した種から導かれたレプリコンおよび制御配列を含 有するプラスミドベクターが、これらの宿主に関連して使用される。通常そのベ クターは、複製部位、および形質転換された細胞中で表現型の選択を提供する能 力を有する標識配列を保持する。例えば大腸菌は典型的には、大腸菌種由来のプ ラスミドｐＢＲ３２２（例えば、Ｂｏｌｉｖａｒ等、Ｇｅｎｅ４：９５［１９７ ７］を参照のこと）を用いて形質転換される。ｐＢＲ３２２はアンピシリンおよ びテトラサイクリン耐性のための遺伝子を含有しているので、形質転換細胞を容 易に同定するための手段を提供する。このｐＢＲ３２２プラスミド、あるいは他 の微生物プラスミドもしくはファージは、それ自身のタンパク質の発現のために 、その微生物によって使用され得るプロモーターをも含有しなければならない（ もしくは、そのようなプロモーターを含有するように改造されなければならない ）。

組換えＤＮＡ構築の際に最も一般的に使用される１：れらのプロモーターには、 β−ラクタマーゼ（ベニシリナーゼ）およびラクトースプロモーター系（Ｃｈａ ｎｇ等、Ｎａｔｕｒｅ、３７５：６１５［１９７８：ｌ　；　Ｉｔａｋｕｒａｉ 、５ｃｉｅ竪、１９８　：１０５６　［１９７７コ；　Ｇｏｅｄｄｅｌ等、匣籾 仔、２β、￥：５４４［１９７９］）　、およびトリプト７７ン（ｔｒｐ）プロ モーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌ等、Ｎｕｅｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ匙工、旦： ４０５７Ｅ１９８０］　；　ＥＰＯ出震出量公開番号００３６７７６含まれる。

これらは最も一般的に使用されるプロモータであるが、他の微生物プロモーター も発見され、使用されており、その核酸配列に関する詳細が公表されているので 、当業者はそれらを機能するようにプラスミドベクターに連結することができる （例えば、５ｉｅｂｅｎｌｉｓｔ等、Ｃｅ１１．２０：２６９［１９８０］を参 照のこと）。

原核生物に加えて、酵母培養のような真核微生物を使用することもできる。Ｓａ ｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、あるいは一般的なパン酵母は、 真核微生物の中で最も一般的に使用される。ただし、他の株のい（つかも一般に 利用できる。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ中での発現のためには、例えばプラス ミドＹＲｐ　７　（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂｉ、Ｎａｔｕｒｅ、２８２：３９０９ ７９］：　Ｋｉｎｇｓｍａｎ等、Ｇｅｎｅ、７−　：　ｉ４１　ｆ１９７９］　 ：　Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒ等、Ｇｅｎｅ、１０　：１５７　［１９８O］　）） が一般に使用される。このプラスミドは、トリプトファン中での生育能を欠いて いる酵母の変異株（例、ＡＴＣＣ番号４４０７６あるいはＰＥＰ４−１（Ｊｏｎ ｅｓＳＧｅｎｅｔｉｃｓ、８５　：１２　［１９７７］　）のための選択標識を 提供するｔｒｐ１遺伝子を既に含有している。酵母宿主細胞ゲノムの特徴として この抛１遺伝的欠陥が存在することは、トリプトファン非存在下での生育によっ て形質転換を検出するのに効果的な環境を与える。

酵母ベクター中の適切な促進配列には、３−ホスホグリセレートキナーゼ（Ｈｉ ｔｚｅｍａｎｉ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｗ、　、２５５二２０７３［１９８０］ ）　、あるいは他のグルコース分解酵素（Ｈｅｓｓ等、Ｊ、　Ａｄｖ、　Ｅｎｚ ｙｍｅ　Ｒｅｇ、　、ヱ：１４９　［１９６ｇ］　：Ｈｏ１１ａｎｄｉ、Ｂｉｏ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１７：４９００［１９７８コ）（例、エノラーゼ、グリセ ルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベー トデカルボキシラーゼ、ホスホフルクトースキナーゼ、グルコース−６−ホスフ ェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルベートキナーゼ、 トリセホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグル コキナーゼ）のためのプロモーターが含まれる。適切な発現プラスミドを構築す る際には、そのｍＲＮＡのポリアデニル化と終止を提供するために、これらの遺 伝子に伴う終止配列をも、その発現ベクター中の発現させたい配列の３′に連結 する。生育条件によって翻訳が制御されるというもう一つの利点を有する他のプ ロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ１酸性ホスフ ァターゼ、窒素代謝に関与する分解酵素、および前記のグリセルアルデヒド−３ ホスフエートデヒドロゲナーゼ、およびマルトースおよびガラクトースの資化の 原因となる酵素のためのプロモーター領域である。酵母に適合するプロモーター 、複製起源および終止配列を含有するプラスミドベクターはすべて適切である。

微生物のほかに、多細胞生物由来の細胞の培養も宿主として使用できる。原理的 には、を椎動物の培養であるか無を椎動物の培養であるかにかかわらず、そのよ うな細胞培養は利用可能である。しかし、を椎動物細胞が最大の関心事であり、 を椎動物細胞の培養（組うな有用な宿主株化細胞の例は、ＶＥＲ○およびＨｅＬ ａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）株化細胞、およびＷ２Ｂ５、Ｂ ＨＫ。

ＣＯ５−７，２９３、およびＭＤＣＫ株化細胞である。このような細胞のための 発現ベクターは通常、（必要ならば）複製起源、発現するべき遺伝子の前に位置 するプロモーター、および必須のリポソーム結合部位と共に、ＲＮＡスプライス 部位、ポリアデニル化部位、および翻訳終止配列を含有している。

哺乳類細胞中で使用するために、発現ベクター上の制御機能がしばしばウィルス 成分によって提供される。例えば一般的に使用されるプロモーターは、ポリオー マ、アデノウィルス２から、また最も頻繁にシミアンウィルス４０　（ＳＶ４０ ）から導かれる。ＳＶ４０ウィルスの初期および後期プロモーターは、共にＳＶ ４０ウィルス複製起源をも含有する断片として、このウィルスから容易に得られ る［Ｆｉｅｒｓ等、Ｎａｔｕｒｅ、２７３　：　１１３（１９７８）］ので、特 に有用である。旦±ｎｄＩＩＩ部位からこのウィルスの複製起源中に位置する旦 呈上１部位までに広がる約２５０ｂｐが含まれる場合には、より小さいＳＶ４０ 断片、あるいはより大きいＳＶ４０断片も使用できる。さらに、通常目的の遺伝 子配列に通常伴っているプロモーターもしくは制御配列が宿主細胞系に適合する 場合には、これらを使用することも可能であり、またしばしばそれが望ましい。

複製起源は、ＳＶ４０や他のウィルス（例、ポリオーマ、アゾ八ＶＳＶ、ＢＰＶ ）供給源から導かれ得る外来の起源を含有するようにベクターを構築することに よって提供され得るし、あるいは宿主細胞の染色体複製機構によっても提供され 得る。ベクターが宿主細胞染色体に組み込まれる場合には、しばしば後者で充分 である。

十分な量のタンパク質が細胞培養によって生産されるが、二次コード配列を用い る改良は、生産レベルをよりいっそう増大させることに貢献する。ある二次コー ド配列は、メントレキセート（ＭＴＸ）のように外因的に制御されるパラメータ ーの影響を受け、したがってメソトレキセート濃度を制御することによって発現 を制御することができる、ジヒドロフオレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ）を含有 する。

ＶＥＧＦおよびＤＨＦＲタンパク質の両者をコードするＤＮＡ配列を含有する本 発明のベクターによるトランスフェクションにとって好ましい宿主細胞を選択す る際には、使用するＤＨＦＲタンパク質の型に従って宿主を選択することが適切 である。野生型ＤＨＦＲタンパク質を使用する場合には、ＤＨＦＲが欠失してい て、それゆえにハイボキサユ／チン、グリシン、およびチミジンを欠いた選択培 地中での、成功したトランスフェクションのための標識としてＤＨＦＲコード配 列を使用することができる宿主細胞を選択することが好ましい。この場合に適切 な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性が欠失しており、ｔｌｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉ ｎｌＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｅａｄ、　Ｓｅｉ、　（ＶＩＳＡ）　７７：４ ２１６（１９８０）に記述されたように調製され、増殖される、チャイニーズハ ムスター卵巣（ＣＩＯ）株化細胞である。

一方、ＭＴＸに対して低い結合親和性を有するＤＨＦＲを制御配列をして使用す る場合には、ＤＨＦＲ欠失細胞を使用する必要はない。この変異ＤＨＦ″Ｒはメ ソトレキセートに対して耐性であるので、宿主細胞培養かメソトレキセート感受 性である場合には、含ＭＴＸ培地を選択の手段として使用できる。ＭＴＸ吸収能 を有する真核細胞のほとんどは、メソトレキセート感受性であると思われる。こ のように有用な株化細胞の一つはＣＨＯ株、ＣＨＯ−Ｋｌ（＾ＴＣＣＩ顎ＣＬＦ ｉＪ）である。

目的のコード配列および制御配列を含有する適切なベクターの構築には、標準的 なライケーション技術を用いる。単離したプラスミドもしくはＤＮＡＷｒｇ−を 切断し、加工修復し、目的の形態に再連結して、必要なプラスミドを調製する。

平滑末端が必要な場合には、ポリメラーゼＩ（クレノー）１０朧位を用いて１５ ℃で１５分間処理し、フェノール−クロロホルム抽出し、エタノール沈殿させる ことができる。

切断した断片のサイズ分離は、Ｇｏｅｄｄｅｌ等、Ｎｕｅｌｅｉｅ　Ａｃ１ｄｓ 　Ｒｅｓ、　、ｇ：４０５７（１，９８０）に記述されている６％ポリアクリル アミドゲルを用いて行うことができる。

構築したプラスミド中の正しい配列を確認するための分析には、典型的にはその ライゲージジン混合物を、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２２９４株（＾ＴＣＣ３１４４６ ）あるいは他の適当な大腸菌株を形質転換するために使用し、成功した形質転換 体を、それが適当な場合は、アンピシリンもしくはテ］・ラサイクリン耐性によ って選択する。ｌｌｅｓｓｉｎｇ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉ制限マツピングお よび／またはＤ　Ｎ　Ａ配列決定することによって分析する。

ＤＮＡ４哺乳怨細胞宿主に導入し、安定な形質転換体のための培地中で選択した 後、ＤＨＦＲ活性の競争的阻害剤であるメソトレキセート約２００００−５００ ０００ｎＭの存在下で宿主細胞培養を生育させることによって、ＤＨＦＲタンパ ク質コード配列の増幅に影響を与える。濃度の有効範囲はもちろんそのＤＨＦＲ 遺伝子の性質および宿主の特徴に大きく依存ｒる。明らかに、一般的に定”義し た上限および下限を確定することはできない。ＤＨＦＲを阻害する他の葉酸類縁 体もし、くは他の化合物も適切な濃度で使用できる。しかしＭＴＸ自体は便利で あり、容易に入手でき、また効果的である。

他の使用可能な技術については、実施例の直前の項に記述する。

本明細書のＶＥＧＦ分子は、血管内皮に関連するいくつかの治療的使用法を有す る。外傷を取り巻くであろう血管内皮細胞の増殖がＶＥＧＦによって迅速に促進 されることが立証されたので、そのような使用法には血管網に対する外傷の治療 が含まれる。このように治療され得る外傷の例には、外科的切開、特に心臓を含 む外科的切開、血管の裂傷、切開および穿通を含む創傷、および糖尿病性、ヘモ フィルス性、および静脈瘤性潰瘍のような、血管内皮を含む表面潰瘍が含まれる が、これらに限定されない。ＶＥＧＦの選択的ミトゲン性にもとづいて改善され 得る他の生理学的症状も本明細書に含まれる。

上述した外傷の適応のために、治療されるべき特定の障害、各患者の症状、ＶＥ ＧＦを送達する部位、投与法、および医学者の知る他の因子を考慮に入れて良い 診療と一致する方法で、ＶＥＧＦ分子が処方され、投与されるであろう。したが って本明細書の目的のためには、ＶＥＧＦの“治療有効量“とは、治療する症状 の悪化を予防し、軽減させ、またその症状を緩和するか、もしくは直すのに効果 的な量のことであり、特にインビボで血管内皮の成長を促進するのに充分な量を 指す。

天然ＶＥＧＦに対して生じた抗体と免疫学的に交差反応するＶＥＧＦアミノ酸配 列変種および誘導体は、ＶＥＧＦの免疫検定における標品として、また標識した 場合には競争試薬として、有用である。

（以下、余白） 望ましい純度のＶＥＧＦと生理学的に許容され得る担体、添加剤、あるいは安定 化剤を混合することによって、ＶＥＧＦを保存あるいは投与のために調剤する。

そのような成分は、使用される投与量および濃度では被投与者に対して非毒性で ある。ＶＥＧＦが水溶性である場合は、リン酸塩あるいは他の有機酸塩のような 緩衝液（約７ないし８のｐＨが好ましい）中に調剤する。ＶＥＧＦ変種が部分的 にしか水に溶けない場合には、その溶解度を増大させるために、これを非イオン 性の界面活性化剤（例えばツヴイン、プルロニクスあるいはＰＥＧ、（例、０． ０４−０．０５％（ｗ／ｖ）ツヴイン８０））と共に調剤することによってマイ クロエマルジョンとして調剤する。

場合によって、他の処方成分も添加できる（例えば、抗酸化剤（例、アスコルビ ン酸）、低分子量の（約１０残基より小さい）ポリペプチド（例、ポリアルギニ ンあるいはトリペプチド）、タンパク質（例、血清アルブミン、ゼラチン、ある いは免疫グロブリン）、親水性重合体（例、ポリビニルピロリドン）、アミノ酸 （例、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、あるいはアルギニン）、セル ロースあるいはその誘導体、グルコース、マンノース、あるいはデキストリンを 含む単糖類、二糖類、および他の炭水化物、キレート剤（例、ＥＤＴＡ）　、お よび糖アルコール（例、マンニトールあるいはソルビトール））。

治療的投与に使用されるべきＶＥＧＦは、滅菌状態でなければならない。滅菌状 態は、滅菌濾過膜（例、０．２ミクロン膜）を通して濾過することによって容易 に達せられる。ＶＥＧＦは通常、凍結乾燥品として、もしくは熱的あるいは酸化 的変性に対して高度に安定である場合には、水溶液として保存されるであろう。

ＶＥＧＦ製剤のｐＨは典型的には約６ないし８であろうが、ある場合にはより高 いか、もしくはより低いｐＨ値も適切である。前記の添加剤、担体、あるいは安 定化剤のいくつかを使用することによって、ＶＥＧＦの塩が生成することは理解 されるであろう。

ＶＥＧＦが非経口的に使用されるべき場合には、そのＶＥＧＦを含有する治療的 組成物を一般に、滅菌的注入口の付いた容器（例えば、注射用注射針で突き刺せ る栓の付いた静脈内投与用液剤バッグ、もしくはバイアル）に入れる。

一般的に、その障害が許す場合には、部位特異的送達用にＶＥＧＦを調剤し、投 与するべきである。これは創傷および潰瘍の場合に便利である。

徐放性製剤を調剤することもでき、これはマイクロカプセル粒子および植え込み 物の形成を含む。徐放性ＶＥＧＦ組成物を調剤するためには、ＶＥＧＦを生体分 解性のマトリックスもしくはマイクロカプセル内に組み込むことが好ましい。こ の目的に適した素材はポリラクチドであるが、例えばポリ−Ｄ−（−）−３−ヒ ドロキシラフ酸（ＥＰ　Ｌ３３９８８＾）のようなポリ−（α−ヒドロキシカル ボン酸）の他の重合体も使用できる。他の生体分解性重合体には、ポリ（ラクト ン）、ポリ（アセタール）、ポリ（オルトエステル）、あるいはポリ（オルトカ ーボネート）が含まれる。この際最初に考慮しなければならないことは、担体自 体、あるいはその分解産物が目標の組織内で非毒性であること、またその症状を さらに悪化させない、ということである。これは、目標の障害の動物モデル中で 、もしくはそのようなモデルが利用できない場合には正常な動物中で、通常行わ れるスクリーニングを行うことによって決定できる。

徐放性組成物の例とし、では、アメリカ合衆国特許番号３７７３９１９、Ｅ　Ｐ 　５８４８１Ａ、アメリカ合衆国特許番号３８８７６９９、ＥＰ　１５８２７７ ＾、カナダ特許番号１１７６５６５、Ｕ、　５ｉｄｏ＋ａｎ等、”Ｂｉｏｐｏ１ ｙ＋＋＋ｅｒｓ”２２：５４７［１９８３］、およびＲ，Ｌａｎｇｅｒ等、“Ｃ ｈｅｗ、　Ｔｅｃｈ、　”１２：９８［１９８２コを参照のこと。

局所的に適用する場合には、ＶＥＧＦに例えば担体、および／または佐剤のよう な他の処方成分を配合することが適切である。そのような他の処方成分の性質に は制限がないが、ただしそれらは医薬的に許容され得るもので、かつ意図する投 与に有効でなければならず、またその組成物中の活性処方成分の活性を減じる物 であってはならない。適切な賦形剤の例には、軟膏、クリーム、ゲル、あるいは 懸濁液が含まれ、これらは精製コラーゲンを伴っていても良いし、伴わなくても 良い。この組成物を、このましくは液状あるいは半液状で、経皮吸収性のパッチ 、硬膏、および包帯にしみ込ませることもできる。

ゲル製剤を得るためには、局所的に適用するのに適した粘性を形成させるために 、液体組成物中に調剤したＶＥＧＦを有効量の水溶性多糖類、もしくはポリエチ レングリコールのような合成重合体と混合することができる。使用し得る多糖類 には、例えばセルロース誘導体（例、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキル セルロース、およびアルキルヒドロキシアルキルセルロース（例、メチルセルロ ース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシ プロピルメチルセルロース、およびヒドロキシプロピルセルロース）などのエー テル化セルロース誘導体）、デンプンおよび分別したデンプン、寒天、アルギン 酸およびアルギン酸塩、アラビアゴム、プルラン、アガロース、カラゲナン、デ キストラン、デキストリン、フルクタン、イヌリン、マンナン、キシラン、アラ ビナン、キトサン、グリコーゲン、グルカン、および合成生体重合体、またゴム （例、キサンタンゴム、グアーゴム、ローカストビーンゴム、アラビアゴム、ト ラガカントゴム、およびカラヤゴム、およびその誘導体および混合物）が含まれ る。本明細書において好ましいゲル化剤は、生物系に対して不活性であり、装置 性であり、調製が容易で、また流動的すぎず、粘性が高すぎず、その中に含まれ るＶＥＧＦを不安定化しないものである。

多糖類はエーテル化セルロース誘導体であることが好まＩ、ｙ　＜　、特に、定 義が明確で精製されており、またＵＳＰＪ、：挙げられているもの（例えばメチ ルセルロー・スおよびヒドロキソアルキルセルロース誘導体（例、ヒドロキシプ ロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、およびヒドロキシプロピルメ チルセルロース））が、より好ましい。本明細書ではメチルセルロースが最も好 ましい。

ゲル化に使用するポリエチレングリコールは典型的には、適当な粘性を得るため に、低および高分子量のポリエチレングリコールの混合物である。例えば、分子 量４００−６００のポリエチレングリコールと分子量１５００のポリエチレング リコールを、適切な比でペーストが得られるように混合した場合、その混合物は この目的に効果的である。

“水溶性”という用語が多糖類およびポリエチレングリコールに適用される場合 は、コロイド液および分散液を含むことを意味する。

一般にセルロース誘導体の溶解度はエーテル基の置換の程度によって決定され、 本明細書において有用な安定化誘導体は、その誘導体を水溶性にするために、そ のセルロース鎖中の無水グルコース単位あたりに十分量のそのようなエーテル基 を有すべきである。無水グルコース単位あたり少なくとも０．３５エーテル基の エーテル置換度で一般に充分である。また、このセルロース誘導体はアルカリ金 属塩の形！！！（例えば、そのＬｉ、、Ｎａ５Ｋ、あるいはＣｓ塩）でもよい。

メチルセルロースをゲルに使用する場合には、そのゲルの約２−５％、より好ま しくは約３％を含有することが好ましく、またＶＥＧＦはゲル１ｍｌあたり約３ ００−１０００μｇ含まれることが好ましい。

使用する投薬量は上述の因子に依存する。一般的な提案として、０．１ｎｇ／’ ｃｃより多く、有効であるが過度に毒性でない最大投与量までのＶＥＧＦレベル を、その組織内で達成できる投与量で、ＶＥＧＦを調剤し、目標の部位あるいは 組織に送達する。可能であれば、連続的注入、徐放、局所的適用、もしくは実験 的に決定した頻度での注射によって、この組織内濃度を維持する。

ＶＥＧＦを含むあらゆる成長因子の、細胞増殖および修復を促進する活性を増大 させるための、他の新規な、もしくは従来の療法（例えば、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ 、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ、ＮＧＦ、７＋ポリツクステロイド票、ＥＧＦ、あるいはＴ ＧＦ−α）とこのＶＥＧＦ療法を組み合わせることは、本明細書の範囲内に含ま れる。このような同時処置薬が本質的に本発明の組成物中に含まれる必要はない が、そのような薬剤がプロテイナセアスである場合にはこれは好都合であろう。

そのような混合物はＶＥＧＦを単独で使用する場合と同じ方法と目的で投与する のが適切である。ＶＥＧＦの、そのような二次的成長因子に対する有効なモル比 は、典型的には１：０．１−１０であり、約当モル量の使用が好ましい。

実施例および請求の範囲を簡素にするために、頻繁に使用する方法のい（つかを 簡略化した用語で表現する。

“トランスフェクション”は、いずれかのコード配列が実際に発現するかどうか にかかわらず、宿主細胞による発現ベクターの吸収を意味する。数多くのトラン スフェクション法が当業者一般に知られている。例えば、ＣａＰＯ４および電気 穿孔法。成功したトランスフェクションは一般に、このベクターの作用の何らか の兆候がその宿生細胞内に起こる場合に認識される。

“形質転換”は、ＤＮＡが染色体外要素として、もしくは染色体構成要素として 複製されるように、生物内にＤＮＡを導入することを意味する。使用する宿主細 胞に応じて、その細胞に適した標準的技術を用いて形質転換を行うｏ　Ｃｏｈｅ ｎ、　Ｓ、　Ｎ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ ）、６９：２１１０（１９７２）およびＭａｎｄｅｌ等、Ｊ、１ｌｏＬ、Ｂｉｏ ｌ、　５３：１５４（１９７０）に記述されているような塩化カルシウムを使用 するカルシウム処理は、堅固な細胞壁障壁を含有する原核細胞および他の細胞に 一般的に用いられている。そのような細胞壁をもたない哺乳類細胞には、Ｇｒａ ｈａｍ、　Ｆ、およびｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ、＾、　、■正税肛、５２　：４５ ６−４５７（１９７８）のリン酸カルシウム沈殿法が好ましい。哺乳類細胞宿主 系形質転換の一般的側面はＡｘｅｌによってアメリカ合衆国特許番号４３９９２ １６　（１９８３年８肘６日発行）に記述されている。酵母の形質転換は典型的 には、Ｖａｎ　Ｓｏｌｉｎｇｅｎ、　Ｐ、等、Ｊ、　Ｂａｃｔ、　、１３０：９ ４６（１９７７）およびＨｓｉａｏ、　Ｃ，Ｌ、　、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　 Ａｃ■ ｄ、　Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）　７６：３８２９（１９７９）の方法に従って行う 。しかし、核注入あるいはプロトプラスト融合を用いるような、細胞中にＤＮＡ を導入するための他の方法も用いることができる。

本発明の範囲内に包含されるいくつかのＤＮＡ配列を記述するための、“厳密的 条件下でのハイブリッド形成”という表現は、本明細書で用いられる場合には、 低イオン強度でのハイブリッド形成および高温条件下での洗浄を意味する（例え ば、０．１５Ｍ　ＮａＣ１１０，０１５Ｍ　クエン酸ナトリウム１０．１％Ｎａ ＤｏｄＳＯ４（５０℃）、あるいはホルムアミドのような変性剤の存在、例えば 、５０％（ｖ／Ｖ）ホルムアミド、０．１％ウシ血清アルブミン１０．１％フィ コール１０．１％ポリビニルピロリドン１５０ｍＭ　リン酸ナトリウム緩衝液（ ｐＨ６，５）　、７５０ｍＭ　ＮａＣ１，７５ｍＭクエン酸ナトリウム、４２℃ でハイブリッド形成）。“低厳密的（ストリンジエンシーの低い）条件下でのハ イブリッド形成”は、２０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ，５０ｍＭ　リン酸ナト リウム（ｐＨ６゜８）、０．１％ビロリン酸ナトリウム、５Ｘデンハルト液、お よび５０μｇ／ｍ１　サケ精子ＤＮＡ中で、４２℃でハイブリッド形成させ、２ ｘＳＳＣ，０，１％ＳＤＳを用いて４２℃で洗浄することを意味する。

“部位特異的突然変異導入”は、当技術分野において標準的な技術であり、望ま しい突然変異を表現する制限された誤対合以外は、変異が導入されるべき一本鎖 ファージＤＮＡに対して相補的な合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用して 実行する。簡単に述べると、そのファージに相補的な鎖の合成を行うためのプラ イマーとして、その合成オリゴヌクレオチドを使用し、得られた二本鎖ＤＮＡを ファージ支持宿主細菌に導入する。ファージを宿す単一細胞からのプラーク形成 を可能にする上層寒天中に、形質転換された細菌の培養を接種する。理論的には 、新しいプラークの５０％が、変異型を一本鎖として含有するファージを含み、 ５０％は元の配列を含むであろう。そのプラークとキナーゼ処理した合成プライ マーを、正確に対合するが、元の鎖との誤対合がハイブリッド形成を妨害するに は充分であるような温度でハイブリッド形成させる。次いで、このプローブとハ イブリッド形成したプラークを選択し、培養し、ＤＮＡを回収する。

“機能するように連結した′という表現は、構成成分の正常な機能が実施される ような並置を意味する。したがって、制御配列に“機能するように連結した”コ ード配列とは、これらの配列の制御の下でそのコード配列が発現することが可能 であり、連結されたＤＮＡ配列が連続している配座、また分泌先導の場合は、連 続的かつ解読相が一致している配座を意味する。例えば、プレ配列あるいは分泌 先導のためのＤＮＡは、それがそのポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク 質として発現する場合に、ポリペプチドのためのＤＮＡに機能するように連結さ れると言えるし、またプロモーターあるいはユンハンサーは、それがその配列の 翻訳に影響を与える場合に、コード配列に機能するように連結されると言える。

あるいは、リポソーム結合部位は、それが翻訳を促進するように位！するならば 、機能するように連結されると言える。連結は都合の良い制限部位でのライゲー ションによって遂行される。そのような部位が存在しない場合には、合成オリゴ ヌクレオチドアダプターもしくはリンカ−を、従来の慣行に従って用いる。

“制御配列”は、機能するように連結したコード配列が、特定の宿主生物中で発 現するために必要なりＮＡ配列を意味する。原核生物に適した制御配列には、例 えば、プロモーター、場合によってオペレーター配列、リポソーム結合部位、ま た場合によって、まだよく理解されていない他の配列が含まれる。真核細胞がプ ロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサ−を利用することは知 られている。

“発現系”は、これらの配列で形質転換された宿主が、コードされるタンパク質 を生産できるべく、目的のコード配列および制御配列を機能的に連結して含有す る、ＤＮＡ配列を意味する。形質転換を達成するために、発現系をベクター上に 含有することができるが、その場合、いま問題にしているＤＮＡも宿主染色体に 組み込まれるであろう。

本明細書で用いられる場合、“細胞”、“株化細胞”および“細胞培養“は相互 交換可能であり、このような指定はすべて子孫を含む。し７たがって、“形質転 換体”あるいは“形質転換細胞”には、−次的に対象とした細胞、および、その 継代数にかかわらず、それから導かれた培養が含まれる。意図した突然変異、あ るいは偶然の突然変異のために、すべての子孫が正確に同一のＤＮＡを含ス、で いるとは限らないことがわかる。元の形質転換細胞中で選別した場合に同じ機能 性を有する変異子孫が含まれている。異なりノ゛二指定が意図される所は、文脈 から明瞭であろう９、°プラスミドは、先行して置かれた小文字活字ゲースＹ） 、および／′まブ：はそれに続く大文字、および／′または数字によって措定さ れる。＊明細書の出発プラスミドは市販されており、誰にでも無制限に利用可能 であり、あるい：ｊ公表された方法に従って、そのような利用可能なプラスミド から構築できる。、さらに、他の等価なプラスミドも本技術分野において知られ ており、一般の技術者には明白であろう。

ＤＮＡの“消化”は、ＤＮＡ中の一定の位置にしか作用しない酵素による、その ＤＮＡの触媒的切断を意味する。このような酵素は制限酵素と呼ばれており、ま たそのそれぞれが特異的に作用する部位を制限部位と呼ぶ。本明細書で使用する 種々の制限酵素は市販されており、その酵素供給者によって確立された反応条件 、補助因子、および他の必要条件を用いる。制限酵素は一般に、各制限酵素を与 えた元来の微生物を表す、大文字とそれに続く他の文字、および特定の酵素を指 定する数字からｒ、Ｈる略号で指定される。一般的には、約１μｇのプラスミド あるいはＤＮＡ断片を、約２０μｌの緩衝液中で、約１−２Ｗ位の酵素と共に使 用する。特定の制限酵素にＲ１）た緩衝液および基質量は、二の製造者によって 指定さノ１．でいる１９通常３７℃で約１時間のインキュベーションが用いらズ するが、１その供給者の指示に従−７で変更するこ、ｌ：もある、１ンキ１ベー ・・４ン後、フェノールおよびクロロホルム抽出によってタンバケ宵を除去し、 その水層からエタノール沈殿によって、消化した核酸を回収する。

制限酵素による消化の後、１つのＤＮＡ断片中の２つの制限切断末端が、“環化 する”、もしくは閉環を形成する（これはその制限部位への他の断片の挿入を阻 害するであろう）のを阻害するために、末端５°リン酸基の細菌アルカリホスフ ァターゼ加水分解を行うことはめったにない。特に述べない限り、プラスミドの 消化の後、５′末端脱リン酸化を行わない。脱リン酸化の操作法および試薬は常 套制限消化によって得たあるＤＮＡ断片の“回収”あるいは“単離”とは、その 消化物をポリアクリルアミドもしくはアガロースゲル上で、電気泳動によって分 離し、分子量の分かつている標識ＤＮＡ断片の移動度に対するその移動度を比較 することによって、目的の断片を同定し、目的の断片を含有するゲル部分を切り 出し、ゲルをＤＮＡから分離することを意味する。この操作法は一般に知られて いる。例えば、Ｒ，Ｌａｗａｎ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　９ ：６１０３−６１１４（１９８１）、およびり、　Ｇｏｅｄｄｅｌ等、Ｎｕｃｌ ｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　８：４０５７（１９８０）を参照のこと。

“サザン分析”は、標識された既知のオリゴヌクレオチドもしくはＤＮＡ断片と ハイブリッド形成させることによって、消化物あるいは含ＤＮＡ組成物中のＤＮ Ａ配列の存在を確認する方法である。

本明細書の目的のためには、特に述べない限り、サザン分析とは、消化物の１％ アガロース上での分離、変性化、およびＥ、　５ｏｕｔｈｅｒｎ、Ｊ。

Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　９８：５０３−５１７（１９７５）の方法によるニトロセ ルロースへの転移、およびＴ、Ｍａｎｉａｔｉｓ等、Ｃｅ１ｌ　Ｌ５：６８７− ７０１（１９７８）に記述されているようなハイブリッド形成、を意味する。

“ライゲーション”は、２つの二本鎖核酸断片間のホスホジエステル結合の形成 過程を意味する（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓｉ、１９８２ＪＪ、１４６ｉ）、特に述 べない限り、ライゲーションは、既知の緩衝液および条件で、約等モル量の連結 すべきＤＮＡ断片０．５μｇあたり１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（“リガーゼ ”）を用いて遂行する。

形質転換体からのＤＮＡの“調製”とは、プラスミドＤＮＡを微生物培養から単 離することを意味する。特に述べない限りＭａｎｉＢｔｉ５等、１９８２、上述 、９０頁のアルカリ／ＳＤＳ法を使用できる。

“オリゴヌクレオチド”は、既知の方法（例えば、Ｆｒｏｅｈｌｅｒ等、池ｃ、 　ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、　、１４：５３９９−５４０７［１９８６コに記述され ているデオキシヌクレオシドＨ−ホスホネート中間体経由で、もしくはＥＰ特許 公開番号２６６０３２　（１９８８年５月４日公動のような固相法を用いる、ホ スホトリエステル、ホスファイト、もしくはホスホルアミダイトの化学）で化学 的に合成された、長さの短い、−末鎖もしくは二本鎖ポリデオキシヌクレオチド である。次いでこれらをポリアクリルアミドゲル上で精製する。

以下の実施例は、本発明を実施するための、現在知られている最善の方法を例示 することを意図するものであるが、本発明がこれに限定されると見なすべきでは ない。

実施例１ 天然ＶＥＧＦの精製 既に記述された方法で、ウシ脳下垂体ＦＣの一次培養を入手し、確立した（Ｆｅ ｒａｒａ等、Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｔ　、前述；　Ｆｅｒａｒａ等、Ａｍ、　Ｊ 、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　、ｉ述）。

集密的に生育した時点で、細胞を大容量組織培養プレート（Ａｐｐｌｉｅｄｓｃ ｉ、、サンフランシスコ、ＣＡ）に、１０％胎児ウシ血清、２ｍＭグルタミン、 および抗生物質を添加した、低グルコースダルベコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ ）の存在下で、継代した。集密的に生育した少し後に、血清構成成分を除去する ために、その培養をＰＢＳで充分洗浄した。次いで、ＤＭＥＭおよびトランスフ ェリン（１０ｇ／ｍｌ）、インスリン（５μｇ／ｍｌ）、セレン（１０−’Ｍ） 　、２ｍＭグルタミン、および抗生物質からなる、血清を含有しない培地中で、 細胞をインキュベートした。３ないし４日後に培地を集めて、新鮮な、血清を含 有しない培地と入れ換えた。集めた培地を遠心分離（１０００ｘｇ、１５分、４ ℃）して−７０℃で保存した。次に、その培地を３ないし４日ごとに、６週間ま で集めた。ＦＣで調整した培地は、低密度微小血管内皮細胞の増殖速度に刺激を 与えることがわかった。

４ないし６リツトルの調整培地（ＣＭ）を１回分として、硫酸アンモニウム沈殿 に供した。完全に溶液状態になるまで一定に撹拌しながら、硫酸アンモニウム（ ５００ｇ／Ｌ）を加えた。冷室で８−１２時間後、この成分を遠心分離（２００ ００ｘ　ｇ、４５分、４℃）した。上溝を捨て、ベレットをｌＱｍＭ　トリス塩 酸（ｐＨ７，２）、５０ｍＭＮａＣ１に再懸濁させ、同じ緩衝液に対して４℃で ８−１２時間透析した。最終体積は、最初の体積の５０−６０倍小さかった。

濃縮したＣＭを、１０ｍＭ　トリス塩酸（ｐＨ７，２）　、５０ｍＭＮａＣ１で 前平衡させたＨ−Ｓカラム［Ｓｈｉｎｇ等、５ｃｉｅｎｃｅ、２２３　：１２９ ６−１２９９（１９８４）］　（１０ｍ　ｌ　）に適用した。次いで、このカラ ムを同じ緩衝液で、２８０ｎｍの吸光度が無視できる程度になるまで洗浄し、０ ．１５．０．９、および３ＭＮａＣｌを含有する１０ｍＭ　トリス塩酸（ｐＨ７ ，２）で段階的に溶出させた。流速は１．５ｍｌ／分であった。各１．５ｍｌの 分画を集め、一部を０．２％ゼラチンＰＢＳ液中で希釈して、内皮細胞に対する ミトゲン活性について試験し５た。Ｑ、９ＭＮａＣｌの存在下で、約９０％の該 生物活性が溶出した。この生物活性は、その分画を６５℃で５分間加熱しても影 響を受けず、０．１％　トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（ｐＨ２）に２時間暴露し た後では、２５−３０％減少した。Ｍｏｎｏ　Ｐ　カラムを用いた等電点クロマ トグラフィーは、この成長因子のｐ、ｉ、が約８５であることを示した。

最も生物活性の高いＨ−Ｓ分画（０，９ＭＮａＣ１プール）を０゜１％ＴＦＡ水 溶液で４倍に希釈し、０．１％ＴＦＡ／２０％アセトニトリルで前平衡させたバ イダック（Ｖｙｄａｅ）　Ｃ４ＨＰＬＣカラム（１０ｘ２５０ｍｍ）に適用した 。このカラムを、アセトニトリルの直線的勾配（１１５分で２０−４５％）を用 いて、２　ｍ　ｌ　／分の流速で溶出させた。吸光度は２１０ｎｍで監視した。

内皮細胞についての検定のために、各２ｍｌの分画を０．２％ゼラチンＰＢＳ液 中に希釈した。この生物活性は、約２９％のアセトニトリル存在下で単一のピー クとして溶出した。最大生物活性分画についての銀染色［Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ、 Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｅｈｅｍ、　、１１７：　３０７−３１０（１９８７）コ５ ＤＳ−ＰＡＧＥゲルによって、３もしくは４つのバンドの存在が明らかになった 。

最大生物活性分画を貯蔵し、０６１％ＴＦＡ水溶液で２倍に希釈し、０．１％Ｔ ＦＡ／２０％２−プロパツールで前平衡させた２回目のハイダックＣ４ＨＰＬＣ カラム（４，６ｘ　２５　Ｇｍｍ）　ｊ：適用した。このカラムを、２−プロパ ツールの直線的勾配（１１３分間で２０−４５％）を用いて溶出させた。流速は Ｑ、５ｍｌ／分であった。各分画の一部を生物検定のために希釈した。各分画の 残りは、Ｓ　Ｄ　Ｓ　／　Ｐ　ＡＧ　Ｅ　［Ｌａｅｍｍｌｉ、Ｎａｔｕｒｅ、２ ２７：６８０−６８５（１９７０）：ｌおよび構造分相のためにスピード−バク 中で乾燥させた。吸収分析図中の明確な１ビークに対応する、生物活性の単一ピ ークが得られた。

２回目の逆相段階から得られたピーク分画は、銀染色Ｓ　１．、）　Ｓ　−ＰＡ ＧＥ上で、還元的条件下で約２３０００の見かけ上の分子量をもつ単一・バンド を示した。そのバンドの染色強度は、その生物活性分析図全埴で７、そのミｈ　 ’／’ン活性と高度な相関関係（：あった。ＴＳＫＧ３０００ＳＷカラムと共に モレキュラーン−・ブを用いた過去の実験では、４０−４３０００の範囲の分子 量が示唆されたので、この因子は天然の条件下では二量体であるという可能性が 考えられた。

このことは、精製したこの成分が、非還元的条件下での銀染色５ＤＳ−ＰＡＧＥ 中で、約４５０００の見かけ上の分子量を持つという発見によって強く示唆され る。

管内皮細胞、およびウシ副腎皮質細胞を入手して、維持した。Ｓｅｈｗｅｉｇｅ ｒｅｒｉ、Ｅｘｐ、Ｅｙｅ、Ｒｅｓ、ＪＭ　：　Ｊａｆｆｅｉ、Ｊ、Ｃ１ｉｎ、 Ｉｎｖ、−１５ｊ＋４６ａ（１９７２）：　Ｆｏｌｋｍａｎ　Ｐａｔｈｏｂｉｏ ｉｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｃｅ１１、Ｎｏ５ｓｅｌお よσＶｏｇｅ１．Ｉ！ｉ、７９−９３頁（アカデミツクプレス、’−スー３−り 、１９７２）：　Ｄ’　Ａｎｎｒｅ％、Ｐｒｏｅ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｅｊ 、、ＵＳＡ、　、７８：３０６８−３０７２（１９８１）　；　Ｎｅｕｆｅｌｄ ｉ、Ｒｅｇ、　Ｐｅｐｔ、−１１３：２９３−３０５（１９８６）@： Ｐｈｅｅｌおよ１７Ｈａｍ、Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ、１６：５２６−５３８（１，９ ８５）に記述された方法で１、成体、もしくは胎児ウシ大動脈内皮細胞、ヒｈａ 静脈内皮細胞、ウソ角膜内皮細胞、水晶体上皮細胞、、ＢＨＫ−２１線維芽細胞 、およびピトケラチノサイト本培養し、椎杆♀した。グ？物検定のためｉｙ二、 細〃包をそれぞれの生育培地のγ１在下に５．２　ｘ　Ｉ　Ｏ’／　３５％１ｍ ディジ、ｊ、もｉ５べは１ｘｌＯ’、−’ウェル（１２六プレート）の密度で接 種し、た。

分画を５μｍ／ｍｌで細胞に添加した。４もしくは５日後、細胞をトリプシンに 暴露して解離させ、コールタ−計数器（Ｃｏｕｌｔｅｒ　ｃｏｕｎｔｅｒ）で計 数した。

図５に示すように、胎児および成体ウシ大動脈内皮細胞、ウシ脳毛細血管内皮細 胞、およびヒトＩＩ静脈内皮細胞のような血管内皮起源の細胞型のみに、容易に 検出できる活性が観測された。対照的に、副腎皮質細胞、水晶体上皮細胞、角層 内皮細胞、ＢＨＫ−２１線維芽細胞、およびケラチノサイトは、有意のミトゲン 応答を全く示さなかった。

２回目の０４段階から得た最大生物活性分画のタンパク質的２０ｐｍｏｌを、気 相タンパク質シークエネイターＭｏｄｅ１　４７０Ａ（アブライドバイオシステ ムズ）に直接用いた。エドマン分解サイクルをオンラインＨＰＬＣカラムによっ て行い、アミノ酸誘導体をＨＰＬＣりｏｖトゲラム上で同定した（Ｈｅｎｚｅｌ 等、Ｊ、　ＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐＬ１慰１４：４ｌ−５２（１９８７））。

気相微量配列決定によって、単一のＮ末端アミノ酸配列が立証された。最初の３ ９残基は以下の通りである：　Ａ　ｌ　ａ−Ｐ　ｒ　ｏ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｇｌ ｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｉｎ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｈｉ　５−Ｃｙｌｕ−Ｖａ　］ −］Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＭｅｔＡｓｐ−Ｖａ　１−Ｔｙｒ−Ｇｉｎ−Ａｒ ｇ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｉ　１　ｅ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ− Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｉ　１　ｅ−Ｐｈｅ−Ｇｉｎ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｐｒ ｏ、この配列は、完全な分子のＮ末端配列決定を数回行って決定した。コンピュ ーター検索によって、このような配列はいかなる既知のタンパク質とも、有意な 相同性を示さないことがわかった。

精製した成長因子に関する服量反応曲線は、副腎皮質由来の内皮細胞の増殖に関 して、１１００−１５０ｐ／ｍｌで半最大効果を、また１−１，２ｎｇ／ｍｌで 最大効果を示した。これらの値は、タンパク質配列決定から導かれたものであり 、銀染色ＳＤＳ／ＰＡＧＥ中でバンドの相対強度を標準と比較することによって 得られた値とよく一致することが分かった。

表１に、この成長促進活性の精製段階および対応する生物活性収率を要約する。

（μｇ　）　（ｎｇ／ｍｌ）　（％） ＣＭ＊　１９００００　２５００　１　１０ＯＡＳ本　１７５０００　２５００ 　１　９２ＨＳ＊　１３０００　２５０　１０　６８Ｒ−ＰＣ＊　２５　５　５ ００　６ ”ＣＭは調整培地：ＡＳは硫酸アンモニウム沈殿、Ｈ３はヘパリン−セファロー ス、Ｒ−Ｐｉは逆相ＨＰＬＣ段階１；Ｒ−Ｐ２は逆相ＨＰＬＣ段階２゜本タンパ ク質濃度をバイオラッドキットによって決定した。

林タンパク質濃度を銀染色５ＤＳ−ＰＡＧＥ中で、バンドの相対強度を標準と比 較することによって決定した。

＃タンパク質濃度を配列決定によって決定した。

（以下、余白） 実施例２ Ｆｅｒｒａｒａｉ、１ｌｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｎ＋ｏ１．．８Ｍ、およびＦｅｒｒ ａｒａｉ、Ａｍ、　Ｊ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　、前述、の方法で入手したウシ下 垂体濾胞細胞から全ＲＮＡを抽出［Ｕｌｌｒｉｃｈ等、５ｃｉｅｎｃｅＳ１９６ 　：　１３１３−１３１７（１９７７）コ　し、ポリアデニル化されたｍＲＮＡ 分画をオリゴ（ｄＴ）−セルロースクロマトグラフィーで単離した（Ａｖｉｖ等 、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、６９：１４０ｇ−１４１２ （１９７２））　、ｄＴＨ−１８もしくはランダム六量体ｄＮ、をプライマーと して、そのＣＤＮＡを調製した［Ｗｉｃｈｋｅｎｓ等、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈ ｅｗ、　、２５３：２４８３−２４９５（１９７８）］。

アマジャムのｃＤＮＡキットを用いて二本鎖ｃＤＮＡを合成し、ＥｃｏＲＩ切断 したλｇｔｌＯ中に、Ｈｕｙｎｈ等、ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｉｑ ｕｅｓ、Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｇ１ｏｖｅｒ１！（ＩＲ Ｌ、オクス７を一ド、１９８５）　の方法で、得られたｃＤＮＡをサブクローニ ングした。ただし、非対称Ｅｃ。

ＲＩリンカ−［Ｎｏｒｒｉｓ等、Ｇｅｎｅ、ｌ：　３５５−３６２（１９７９） ］を使用することに−スフイルター上に接種した複製に、この組換えファージを 接種した（Ｂｅｎｔｏｎｉ、５ｃｉｅｎｃｅ、１９６：１８０−１８２（１９７ ７））　ｏこれらの複製を、４２℃で、２０％ホルムアミド、５　ｘ　Ｓ　Ｓ　 Ｃ，５０ｍＭ　’ｌｊ　ン酸＋　トリウム（ｐＨ６，８）　、０．１％ビロリン 酸ナトリウム、５ｘデンハルト液、および５０ｐｇ／ｍＩ　サケ精子ＤＮＡ中で 、ｆｆ１２ｐ＠識した［Ｔａｙｌｏｒｉ、Ｂｉｏｅｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、 　Ａｅｔａ、、４２２：３２４−３３０（１９７６）］次の配列の合成オリゴヌ クレオチドプローブ：　５’−ＣＣＴＡＴＧＧＣＴＧＡＡＧＧＣＧＧＣＣＡＧＡ ＡＧＣＣＴＣＡＣＧＡＡＧＴＧＧＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴＧＧＡＣＧＴＧＴＡＴＣ Ａ−３’と、ハイフリット形成させ、２ｘＳＳＣ１０，１％ＳＤＳ中で４２℃で 洗浄した。

図１は、このプローブと実際に得られたｃＤＮＡ配列の比較を表し。

ており、＊は相同なヌクレオチドを示している。

λ、ｖｅｇｆ、６と命名した１つの陽性クローンを同定した。３２ｐで標識した このクローンを、オリゴ−ｄＴをプライマーとして調製したヒト胎盤ｃＤＮＡラ イブラリーをスクリーニングするためのプローブとして使用し、陽性クローンを 観測した。標識した同じクローンでヒト下垂体ｃＤＮＡライブラリーをスクリー ニングした時には、陽性クローンは検出されなかった。

クローンλ、ｖｅｇｆ、５の全ヌクレオチド配列は、ｐＲＫ５ベクター中にサブ クローニングした後、ジデオキシオリゴヌクレオチドチェーンターミネーション 法［ｓａｎｇｅｒ等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、υＳ＾、 ７４：５４６３−５４６７（１９７７）］によって決定した。得られた配列を、 そのシグナル配列を含む帰属アミノ酸配列と共に図２に示す。

ＶＥＧＦコード遺伝子の哺乳類細胞における発現最終的な発現ベクターｐＲＫ５ ．ｖｅｇｆ、６を、λ、ｖｅｇｆ、６およびｐＲＫ５から、図８に示すように構 築した。ｐＲＫ５およびｐＲＫ５．　ｖ　ｅ　ｇ　ｆ、　６の構築について、以 下に詳しく述べる。

Ａ、ｐＲＫ５の構築 Ａ、１．ＤＦ８ＣＩＳの構築 出発プラスミドｐＦ８ｃＩｓの最初の３断片構築を以下に記述し、図３に示す。

１）最終ベクターのアンピンリン耐性標識および複製起源を、プラスミドｐＭ　 Ｌ　（Ｌｕｓｋｙ、　Ｍ、およびＢｏｔｃｈｅｎ、　Ｍ、　、Ｎａｔｕｒｅ、２ ９３ニア９［１９８１］）の変種である出発プラスミドｐＵＣ１３ＤＭＬから導 いた。ｐＵＣ１３ｐＭＬは、ｐＵＣ１３のポリリンカー（Ｖｉｅｉｒａ、　Ｊ、 右よσＭｅｓｓｉｎｇ。

Ｊｌ、蝕凹、圧：２５９（１９８２））をｐＭＬのＥｃｏＲＩおよび旦工旦ｄ　 ＩＩＩ部位に移植することによって構築した。第二の出発プラスミドｐＵＣ８− ＣＭＶは、ＣＭＶエンハンサ−、プロモーターおよびスプライス供与配列の供給 源である。ｐＵＣ８−ＣＭＶは、ＣＭＶエンハンサ−、プロモーターおよびスプ ライス供与配列のための約８００ヌクレオチドを、ｐＵＣ８の平滑化したＰｓｔ Ｉおよび５ｐｈＪ部位に挿入することによって構築した（Ｙｉｅｉｒａ、　Ｊお よびＭｅｓｓｉｎｇ、　、Ｊ、　、、能書中）。

合成り　ａｍＨＩ　−Ｈｉ　ｎ　ｄｌＩＩリンカ−にューイングランドバイオラ ブスから市販されている）を、Ｈｉ　ｎ　ｄＩＩＩ部位を作り出す付着ＢａｍＨ Ｉ末端に連結した。このライゲーションに続いて、Ｈｉ旦ｄ　ｌ１ｉ一旦工旦ｅ ＩＩ消化を行った。この消化によって、ＣＭＶニンハンサー、プロモーターおよ びスプライス供与部位を含有する約５ｏｏｂｐの断片を得た。ケル単離の後、こ の８００ｂｐ断片をｐＵＣ１３ｐＭＬの２９００ｂｐ断片に連結した。上記の中 間プラスミドをΣ且↓Ｉおよび旦土旦ｄ　ｉＩＩで消化することによって、ｐＦ ８ＣＩＳの構築に必要な断片を得た。この３１２３ｂｐは、ｐＵＣ１３ｐＭＬ由 来の複製起源、アンピンリン耐性標識、およびエンハンサ−、プロモーターおよ びスプライス供与部位を含むＣＭＶの制御配列を含有している。

２）Ｉｇ可変領域イントロンおよびスプライス受容配列を、合成オリゴマーを用 いて、図４の中央部に示すように構築した。ＩｇＧインドａンおよびスプライス 受容部位（Ｂｏｔｈｗｅｌｌ等、Ｎａ、ｔｕｒｅ、２９０：６５−６７［１９８ １］）のための以下の配列を有する９９マーおよび３０マーを化学的に合成した ７ １　５　’　ＡＧＴＡＧＣＡＡＧＣＴＴＧＡＣＧＴＧＴＧＧＣＡＧＧＣＴＴＧＡ 、　、　。

３１、ＧＡＴＣＴＧＧＣＣＡＴＡＣＡＣＴＴＧＡＧＴＧＡＣＡＡＴＧＡ、　、　 。

６０　ＣＡＴＣＣＡＣＴＴＴＧＣＣＴＴＴＣＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧＴ、　、　。

８８　ＧＴＣＣＡＣＴＣＣＣＡＧ　３　’１　３　’　ＣＡＧＧＴＧＡＧＧＧＴ ＧＣＡＧＣＴＴＧＡＣＧＴＣＧＴＣＧＧＡ　５　”。

ＤＮＡポリメラーゼ■　（クレノー断片）によってこの合成断片を補充し、二本 鎖断片を調製した（Ｗａｒｔｅｌｌ、　Ｒ，Ｍ、　＃よび１．　Ｓ、　Ｒｅｚｎ ｉｋｏｆｆ、Ｇ弘シ９：３０７（１９８０））。次いで旦鉦Ｉおよび旦±ｎｄＩ ＩＩの二重消化を行った。この合成リンカ−を、ｐＵ　Ｃ１３＜Ｖｅｉｒａおよ びＭｅｓｓｉｎｇ、ｉｌｌ＄）の旦ｓｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニ ングした。この合成オリゴヌクレオチドを含有する、ｐＵｃＩｇ、１０と命名し たこのクローンをＰｓｔＩで消化した。ＰｓｔＩ　−Ｃ１ａ　Ｉリンカ−を使用 して、この断片にＣｌａＩ部位を加えた。旦工旦ｄ　ＩＩＩ消化の後、１ｇイン トロンおよびＩｇ可変領域スプライス受容配列を含有する１１８ｂｐ断片をゲル 単離した。

３）この構築計画の第三の部分では、肝炎表面抗原３′末端を、ＳＶ４０の初期 領域の翻訳終止部位およびポリアデニル化部位に置き換えたゎＳＶ４０配列を含 有するベクターｐＵｃ、５Ｖ４０を、ＶｉｅｉｒａおよびＭｅｓｓｉｎｇ　（前 掲畜牛）が記述したＤＵＣ８のＢａｍＨ１部位に挿入した。次いでｐＵｃ、５Ｖ ４０をＥｃｏＲＩおよび旦２ａｌで消化した。この消化物から、ＳＶ４０ポリア デニル化配列を含有する１４３ｂｐ断片をゲル単離した。さらに２つの断片を、 ｐＳＶＥ、８ｃｌＤ（ヨーロッパ特許公開番号１６０４５７）の消化後にゲル単 離した。Ｅｃ旦ＲＩおよび９土ａＩ消化によって生成した４、８ｋｂ断片は、５ Ｖ４０−ＤＨＦＲ翻訳単位、ｐＭＬの複製起源、およびアンピシリン耐性標識を 含有する。Ｃ１ａＩおよびＨ２互Ｉ消化後に生成する７、５ｋｂ断片は、因子ｖ ＩエエのｃＤＮＡを含有する。３断片ライゲーションによってｐｓＶＥ、８ｃ２ ４Ｄを得た。この中間体プラスミドをＣＩａＩおよび５ａｌｌで消化することに よって、ＳＶ４０ポリＡ部位とそれに続＜５Ｖ４０ＤＨＰＲ翻訳単位を伴った因 子ｖｎｒのｃＤＮＡを含有する９６１１ｂｐ断片を得た。

ｐＦｇＣＩＳを得るための最後の３断片ライゲーションには、ａ）複製起源、ア ンピシリン耐性標識、およびＣＭＶエンハンサ−、プロモーターおよびスプライ ス供与部位を含有する３１２３ｂｐのＳ受容部位を含有する１１８ｂｐの旦工旦 ｄ　ｌｌｌ−Ｃ上ａＩ断片、およびｃ）ＳＶ４０ポリアデニル化部位、５Ｖ４０ ＤＨＦＲ翻訳単位、および因子ＶＩＩＩのｃＤＮＡを含有する９６１１ｂｐの９ 土ａｌ一旦、Ａ、２．ｐｃＩｓ２．８ｃ２８Ｄの構築ｐｃＩｓ２．８ｃ２８Ｄは 、因子ＶｒＩＩノア　３　ｋ　ｄサブユニットニ結合した因子ＶＩＩＩの９０ｋ ｄサブユニツトを含有している。この９０ｋｄはアミノ酸１から７４０までと、 ７３ｋｄサブユニツトアミノ酸１６９０から２３３２までを含有している。この 構築物は以下の断片の３断片ライゲーションによって調製した：ａ）ｐＦ８ＣＩ Ｓの１２６１７ｂｐＣＩａＪ−８ｓｔｌＩ断片（ｄａｍ株から単離してＢＡＰ処 理したもの）、ｂ’）ｐＦ８ＣＩＳの２１６ｂｐ旦！±ＩＩ一旦旦Ｉ断片、およ びＣ）キナーゼ処理した短い旦５ｔｌ一旦上！■合成オリゴヌクレオチド（図５ を参照のこと。ただし＊は変更したヌクレオチドを示す）。

また図４は、ｐｃＩＳ２．８ｃ２８Ｄを作成するために融合されるべき因子ＶＩ ＩＩノ５°オヨヒ３°ＤＮＡ領域を含有する、ｐＳＶＥＦＳ’ＩＩＩ　（ヨーロ ッパ特許公開番号１６０４５７）の４０８ｂｐのＢａｍＨＩ−Ｈｉ　ｎ　ｄＩＩ Ｉ断片、および４１６ｂｐのＢ　ａ　ｍＨＩ　−Ｐｓｔ　Ｉ断片のサブクローニ ングをも示している。

図５は、ｐｃＩｓ２．８ｃ２８Ｄの融合領域を構築するために用いた３断片ライ ゲーションを表している。２つの異なる断片、ＡおよびＢを、同じｐＵｃ１１８ 旦ａｍＨＩ−ＰｓｔＩ　ＢＡＰベクター中にクローニングした。Ａ断片はｐＵｃ ４０８ＢＨの４０８ｂｐ旦且ｍＨＩ−Ｈｉ　ｎ　ｄＩＩＩ断片であり、Ｂ断片は ＨｉｎｄＨＩ−ＰｓｔＩオリゴヌクレオチドである。この二本鎖オリゴヌクレオ チドを図６に示した。この末端制限部位の全ＤＮＡ配列を図５に示すが、実際の オリゴヌクレオチドは、制限部位の線で描いた塩基を含まない。ライゲーション 中の重合を防ぐために、キナーゼ処理せずにこのオリゴヌクレオチドを使用した 。

図５に示すようにＡおよびＢ断片をベクター中にライゲーションした後、期待さ れる接合配列を、そのヌクレオチドによって囲まれている領域のＤＮＡ配列決定 によって確認した。

最終プラスミドｐＣＩＳ２．８ｃ２８Ｄを、４断片ライゲーションによって、図 ６に示すように構築した。図５の融合プラスミドを旦ａｍＨＩおよび旦ｓｔＩで 切断し、４４３ｂｐ断片を単離した。この４断片ライゲージコンの残る３断片は 、１）ｐＳＶＥＦ％’ｒＩＩ　（ヨーロッパ特許公開番号１６０４５７）の１９ ４４ｂｐＣＩａｒ−ＢａｍＨＬ　２）ｐｓＶＥＦＶＨＩの２２０２ｂｐ旦ａｍＨ Ｉ−Ｘｂ旦Ｃｌ５２．８ｃ２８Ｄの正確な融合接合領域における、結果として生 じる変種の翻訳されるＤＮＡ配列を決定し、図５に示す配列に関連させる。

Ａ、３．ｐＲＫ５の構築 ｐＲＫ５の構築を図７に表す。ｐＲＫ５を構築するための出発プラスミドはｐｅ ｘｓ２．８ｅ２８Ｄであった。段落１から６までの塩基番号は、ＣＭＶプロモー ターに先行するＥｃｏＲ１部位の最初のＴを塩基１とするｐｃＩｓ２．８ｅ２８ Ｄを意味している。サイトメガロウィルス初期プロモーターおよびイントロン、 および５ｖ４０起源およびポリＡシグナルを別個のプラスミド上に置いた。

１、サイトメガロウィルス初期プロモーターを、ｐＣＩＳ２．８ｃ２８Ｄ　（９ ９９９−１２０１）から得たＥＣ０ＲＩ断片として、上述の、ＵＣ１１８のＥｃ ｏＲ１部位にクローニングした。１２のコロニーを拾いあげ、ｐＵｃ１１８から 生成した一本鎖ＤＮＡが１２０１のＥｃｏＲＸ部位から９９９９のＥｅｏＲＩ部 位への配列決定を可能にするような配向をスクリーニングした。このクローンを ｐｃＭＶＥ／Ｐと命名した。

２　、Ｓ　Ｐ　６　（Ｇｒｅｅｎ、　ＭＲ等、Ｃｅ１１Ｊ２：６８］、−６９４ ［１９８３コ）プロモーター・を部位特異的突然変位導入法によって挿入するた めに、−末鎖ＤＮＡをｐＣＭＶＥ／Ｐから作成した。ＳＰ６プロモーター（Ｎｕ ｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、　、１２ニア０４１［１９８４］、図１参照の こと）の−６９から＋５までの配列を含有する合成１１０マーを、ＣＭＶＥ／Ｐ 配列に対応するオリゴマーの両末端の１８マ一断片と共に使用した。突然変位導 入は標準的技術によって実行し、標識した１１０マーを用いて、高厳密的および 低厳密的にスクリーニングした。６つの可能性のあるクローンを選択し、配列を 決定した。１つの陽性クローンを同定し、ｐＣＭＶＥ／ＰＳＰ６と命名した。

３、例えばＳＦ３　ＲＮＡポリメラーゼを添加し、適当なサイズのＲＮＡを調べ ることによって、ＳＰ６プロモーターを検査し、活性であることを明らかにした 。

４、ｐＣＭＶＥ／Ｐ　（操作１）およびｐＣＭＶＥ／ＰＳＰ６　（操作２）中の ｐＵ０１１８の旦工互１部位（９］−２）から互恵３工部位までの位置を取り囲 むために、Ｃｌ　ａ−Ｎｏ　ｔ　Ｉ−３ｍａアダプターを合成した。このアダプ ターをｐＵｃ１１８のＣＩａＩ−ＳｍａＩ部位中に連結し、正しいクローンをス クリーニングした。このリンカ−を両プラスミド中で配列決定し、クローンをｐ ＣＭＶＥ／ＰＳＰ６−ＬおよびｐＣＭＶＥ／Ｐ−Ｌと命名した。

５、ｐＣＭＶＥ／ＰＳＰ６−ＬをＳｍａＩ（リンカ−／　ｐ　Ｕ　Ｃ１工８接合 部中）および旦±ｎｄＨＩ　（ｐＵｃ１１８中）で切断した。

以下に記述するｐｓＶＯＲＡＡ△ＲＩＩＩから得た旦旦旦■　（５５をスクリー ニングして１つのクローンを単離し、ｐＣＭＶＥ／ＰＳＰ６−Ｌ−ＳＶＯＲＡＡ △ＲＩと命名した。

ａ）ＳＶ４０起源およびポリＡシグナルを、ｐＣＩＳ２．８ｃ２８Ｄからに工旦 Ｉ　（５４７５）一旦工旦ｄＩＩＩ（６１３６）断片として単離し、Ｔ）　ＵＣ １１９（Ｖｉｅｉｒａ右よびＭｅｓｓｉｎｇ、前掲畜牛に記載）の旦工旦ｄ　Ｉ ＩＩからＳｍ、ａＩ部位までにクローニングした。このクローンをｐｓＶＯＲＡ Ａと命名した。

ンによって得られたコロニーをスクリーニングして正しいクローンを単離し、ｐ ＳＶＯＲＡＡ△ＲＩＩＩと命名した。削除したＥｃ。

Ｒ１部位を配列決定によって検蒼し、正しいことを明らかにした。

ｃ）１）ＳＶＯＲＡＡΔＲ１１１のＨｐａＩ　（５５７３）からＰ６−Ｌ　（上 記４を参照のこと）中に挿入した。

６、ｐＣＭＶＥ／ＰＳＰ６−Ｌ−３ＶＯｒＡＡ△Ｒ１（操作５）ノーで補填し、 再連結した。そのコロニーをスクリーニングした。

１つの陽性クローンを同定し、ｐＲＫΔＢａｍ／Ｓｍａ３と命名した。

限部位を他の制限部位に変換するために用いるＤＮＡ断片である。

９、ｐＲＫ△Ｂａｍ／Ｓｍａ、ＨＩＩＩ一旦ｐａ１１をＰｓｔＩおよびＮｏｔＩ で切断し、ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩリンカ−およびＨｉｎ　ｒＨＩＩ−Ｅ　 ｃ　ｏＲＩリンカ−を連結した。各リンカ−についてのクローンが見つかった。

しかし、含まれているＨｐａｌルミｌコンバーターぎることもわかった（２もし くはそれ以上のコンバーター１０、　ＲＩ−ＨＩＩＩクーロン３およびＨＩＩＩ −ＲＩツク−ン５をＨｐａＩで切断し、希釈し、自己連結させた。陽性クローン を同定した。このＲＩ−ＨＩＩＩクローンをｐＲＫ５と命名した。

Ｂ、ＲＫ５．ｖｅｇｆ、６の構築 図８は、ｐＲＫ５．ｖｅｇｆ、６の構築を表している。クローンλ。

ｖｅｇｆ、６を旦旦旦ＲＩ処理し、このＥｃｏＲＩ挿入物を単離し、ｐＲＫ５を ＥｃｏＲｒで消化してその大断片を単離することによって得たｐＲＫ５のベクタ ー断片中に連結した。これらの断片の２断片ライゲーションによって、プロモー ターに関して正しい配向をもつＶＥＧＦコード配列を選別した、発現ベクターｐ ＲＫ５．Ｖｅｇｆ、６が得られた。

Ｃ，ＶＥＧＦコード遺伝子の発現 アデノウィルスＥ１ａｄｎＥｌｂで形質転換したヒト胚腎細胞（２９３Ｓ）につ いては、Ｇｒａｈａｍ等、Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、　、３６：５９−７３ （１９７７）　ｌこ記述されている。Ｇｏｒ＋ａａｎのリン酸カルシウム法（Ｄ ＮＡ　ＣｌｏｎｉｎｇＸＤ」、　Ｇｌｏｖｅｒｌ、（ＩＲＣブレス、オクス７ｒ Ｆ、１９８５）、１２巻、１４３−１９０頁）　によって、　これらの細胞を上 述の発現ベクター１）ＲＫ５．ｖｅｇｆ、６でトランスフェクションした。２４ 時間後、さらに４８時間インキニベーションするために、細胞を血清を含有しな い培地に移した。次いで、血清を含有しないこの培地を回収し、その上清のＶＥ ＧＦ活性を検定した。

（以下、余白） 実施例３ 前述のタンパク質精製法で使用したものと同じ株化細胞を用いるＶＥＧＦの生物 活性を、上記の実施例２Ｃで作成した形質転換細胞の上清について試験した。そ れぞれの生育培地の存在下に多穴プレート中に接種した種々の細胞型に、この上 清分画を５μｍ／ｍｌの割合で加えた。４ないし５日後、トリプシンに暴露する ことによって細胞を解離させ、コールタ−計数器中で計数した。ＶＥＧＦを含有 するこの細胞上清は、胎児および成体ウシ大動脈内皮細胞、ウシ脳毛細血管内皮 細胞、およびヒト贋静脈内皮細胞の増殖促進には有効であったが、副腎皮質細胞 、水晶体上皮細胞、角膜内皮細胞、ＢＨＫ−２１線維芽細胞、およびケラチノサ イトの成長を支援しなかった。

活性のインビボ検定 精製ＶＥＧＦの脈管形成性の性質を調べるためのインビボ系として、ヒナ漿尿膜 （卵由来、市販されている）を用いた。Ｉｌａｍｂｕｒｂｅｒ。

Ｖ、　、Ａ　１ｌａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｅｍｂｒｙｏ ｌｏｇｙ、シカゴ大学プレス、１４３−１４５頁（１９４２）およびＰｈ１ｌｌ ｉｓ、　ＲおよσＫｕｍａｒ、　Ｓ、　、Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ、２３ ：８２：　（１９７９）に記述されているように、フォールスエアサック（ｆａ ｉｓｅ　ａｉｒ　５ａｃ）　技術によって、漿尿膜を転位させた。受精８日後の 卵の卵殻に２Ｃ１１２の窓をあけた。実施例１に記述したようにして天然の供給 源から精製したＶＥＧＦを乾燥し、ＰＢＳ中に再懸濁させた（５０　ｎ　ｇ）。

この懸濁液、もしくはＰＢＳのみの対照液を、１００μｇのセファデックスＧ５ ０ビーズを含有する１０μｍの液中に使用した。７２時間後、卵を試験して新血 管応答を評価した。

セファデックスＧ５０ビーズに対して放射状の血管成長を伴う著しい脈管形成性 応答（胚陽性の８５％、ｎ＝５９）がＶＥＧＦ処理した卵に観測されたが、対照 卵には観測されなかった（胚陽性の１０％、ｎ＝５０）。組換えＶＥＧＦについ てもこの効果が観測されると期待される。

実施例４ ヒト白血病株化細胞ライブラリーのスクリーニングｃＤＮＡライブラリーを以下 のように調製した。ヒト白血病株化細胞ＨＬ６０　（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ２４０ ）を回転瓶中で生育させた。細胞数は１ｒｎｌあたり０．８ｘｌＯ’細胞であっ た。細胞をＲＰＭ１１６４０　（市販）および胎児ウシ血清中で生育させた。誘 導のために、細胞を紡いで回転瓶中のＲＰＭ１１６４０　５００ｒｎｌに再懸濁 させた。計５００μｌの１００ＯＸ　（ＩＸの１０００倍）誘導物質を添加した 。ただしＩＸ誘導物質は、５０ｎｇ／ｍｌ　フォルポルミリステートアセテート （ＰＭＡ）　、１００μｇ／ｍｌ　ＬＰＳ、ＩＯ−’Ｍインドメタシン、および １００μｇ／ｍｌ　シｙ。

ヘキサミドである。４時間生育後、細胞をベレット状にした。

全ＲＮＡを細胞から抽出（ＣａｔｈａｌａｉＦ、ＤＮＡ、２：３２９−３３５（ １９８３））　Ｌ、ポリアデニル化されたｍＲＮＡ分画を、上述のようにオリゴ （ｄＴ）−セルロースクロマトグラフィーによって単離した。ランダム六量体ｄ Ｎ、（ＯｋａｙａｍａおよσＢｅｒｇ％Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌ ｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、２：１６１（１９８２）　；　Ｇｕｂｌｅｒおよび Ｈｏｆｆｍａｎ、Ｇｅｎｅ、２５　：２６３（１９８３））をプライマーとして 、そのｃＤＮＡを調製した。インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）のｃＤ ＮＡキットを用いて二本鎖ｃ　Ｉ）ＮＡを合成し、平滑末端、他端にＥｃｏＲＩ 部位、および内部に旦上工ＸＩおよびＮ旦工■部位を有するリンカ−を加えた。

得られたｃＤＮＡを、ＥｃｏＲＩ切断したλｇｔｌｏ中に平滑末端連結した。

１　ｘ　１０’クローンのライブラリーを表す、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｃ６００Ｈｆｌ および前述にようにニトロセルロースフィルター上に接種した複製上に、この組 換えファージを接種した。これらの複製を、ウシＶＥＧＦの全長ＤＮＡを表して おり、＄２ｐで標識した［Ｔａｙｌｏｒ等、ｌ述］　クローンλ、ｖｅｇｆ、６ と、４２℃で、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ，５０ｍＭ　リン酸ナトリウム （ｐＨ６，８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５ｘデンハルト液、および５ ０μｇ／ｍ１　サケ精子ＤＮＡ中の厳密条件下で、ハイブリッド形成させた。

このハイブリッド形成混合物を０．２ＸＳＳＣ１０，１％ＳＤＳ中で、４２℃で 洗浄した。

ハイブリッドを形成する５つのクローンを上述のように配列決定し、そのうちの １つをλ、ｖｅｇｆ、２１と命名した。シグナル配列を含む帰属アミノ酸配列と 共に、クローンλ、ｖｅｇｆ、２１の全ヌクレオチド配列を図１０に示す。

ヒトＶＥＧＦコード遺伝子の哺乳類細胞における発現最終発現ベクターｐ、ｖｅ ｇｆ、２１をλ、ｖｅｇｆ、２１およびｐＣＩＳ、ＣＸＲＨＮから構築した。ｐ ＣＩＳ、ＣＸＲＨＮはｐＲＫ５の誘導体であり、異なる１組の制限部位、即ちＣ ＩａＩ、Ｘｈ。

Ｉ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、およびＮｏｔＩが、次の配列の合成りＮＡを 用いて、ｐＲＫ５のポリリンカー領域内に導入されている： ５°−ＣＧＡＴＴＣＴＣＧＡＧＡＡＴＴＣＡＡＧＣＴｒＧＣＧＧＣＣＧＣ−３’ ３　’　−ＴＡＡＧＡＧＣＴＣＴＴＡＡＧＴＴＣＧＡＡＣＧＣＣＧＧＣＧＡＧＣ Ｔ−５’。

これは、まずｐＲＫ５をｐ工ａｒおよびＨｉ旦ｄ　ＩＩＩで切断し、そのベクタ ー断片を単離し、それをＴ４リガーゼを用いて上記のＤＮＡ配列に連結すること によって導入した。

図１１は、ｐ、ｖｅｇｆ、２１の構築を示している。これはｐＲＫ５、ｖｅｇｆ 、６の構築に項似しているが、λ、ｖｅｇｆ、５のかわりにλ、ｖｅｇｆ、２１ を使用する。より具体的に述べると、クローンλ、ｖｅｇｆ、２１をＥｃｏＲＩ で処理してその旦旦旦Ｒ１挿入物を単離し、ｐＣＩＳ、ＣＸＲＨＮをＥｃｏＲＩ で消化してその大断片を単離することによって得たｐｃＩ　Ｓ、ＣＸＲＨＮのベ クター断片中に連結した。これらの断片の２断片ライゲーションによって、ＶＥ ＧＦコード配列の、プロモーターに関して正しい配列を選別した、発現ベクター ｐ、ｖｅｇｆ、２１が得られた。

ヒトＶＥＧＦコード遺伝子の発現 Ｇｏｒｍａｎ、ＤＮＡ　ＣｌｏｎｉｎｇＳＤ、Ｍ、Ｇｌｏｖｅｒｌ、（ＩＲＣブ レス、オクス７ｔ−Ｆ、１９８５）、第２１１１４３−１９ＯＮのリン酸カルシ ウム法を用いて、上述の発現ベクターｐ、ｖｅｇｆ、２１で２９３８細胞をトラ ンスフェクションした。２４時間後、さらに４８時間インキュベーションするた めに、血清を含まない培地に細胞を移した。次いで、この血清を含まない培地を 回収し、その上清のＶＥＧＦ活性を検定した。

実施例５ ＶＥＧＦ活性のインビトロ検定 上記の実施例４で作成した形質転換細胞から得た上清のＶＥＧＦ生物活性を、実 施例３に記述したものと同じ方法を用いて試験した。

ヒトＶＥＧＦを含有するこの細胞上清は、ウシ副腎皮質由来の毛細血管内皮細胞 の増殖促進に有効であった。このことは、この成長因子が単に内皮細胞ミトゲン であるばかりでなく、基底膜の酵素的減成および走化性をも必要とする、新しい 血管形成を導（一連の事象全体を実際に誘発できることを立証している。

要約すると、ウシおよびヒトＶＥＧＦの両者をコードする核酸配列が同定され、 ＶＥＧＦが、等しい見かけ上の分子量（それぞれ２３０００）を有する２つのサ ブユニットからなる二量体であることが決定された。ヒトおよびウシＶＥＧＲＦ はシグナルペプチドを含めて約９５％相同であり、このことはこの分子の進化論 的保存を示している。ヒトＶＥＧＦは、位置８のｇｌｙ残基の挿入のために追加 のアミノ酸を有している。図１２参照のこと。ヒトおよびウシの成長因子は共に 、精製した形態で約２５ｐｇ／ｍｌから約１−１゜２ｎｇ／ｍ１の間の濃度で、 血管内皮細胞の増殖に刺激を与えることができた。分子量が４５０００であると 仮定するとこれらの値はそれぞれ、０．５５　ｐＭおよび２２２−２６ｐに相当 し、これらはｂＦＧＦで得られる値と同じ範囲である（Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉ ｃｚ等、Ｅｎｄｏｃｒｉ［Ｉｓｈｉｋａｗａｉ、Ｎａｔｕｒｅ、３３８：５５７ −５６１（１９８９）コされた内皮細胞成長因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）とは異なる ように思われる。ＰＤ−ＥＣＧＦおよびＶＥＧＦは同じ分子質量を有しているが 、Ｎ末端配列、二次構造、および生物能が異なっている。ＶＥＧＦとは興なり、 ＰＤ−ＥＣＧＦは単一のポリペプチド鎖から構成されており、内皮細胞成長の促 進に関して約１０倍活性が低い。また、ＰＤ−ＥＣＧＦはヘパリン−セファ０− スに結合せず、酸性タンパク質であるが、ＶＥＧＦはヘパリンに結合し、塩基性 ｐ、ｉ、を有している。

ＶＥＧＦのヘパリン結合能は、そのインビボ機能および制御に密接な関係を有し ていると思われる。硫酸ヘパリンは細胞外マトリックスの基本的な構成成分であ り、目標細胞とヘパリン結合性成長刃子の接触を決定するうえで、決定的な役割 を果すのではないかと提案されている。

下垂体ＦＣ中にＶＥＧＦが存在することは、これらの細胞の成長、組織化、およ び膝下垂体の複雑な微小血管系の分化段階の維持における役割を、強く示唆して いる。

ＶＥＧＦが下垂体腺以外の器官中でも発現するかどうかは、いまのところわかっ ていない。しかし、極めて多様な正常および病的増殖における血管内皮細胞の成 長および脈管形成の基本的な役割を考えると、ＶＥＧＦの分布はより広範囲に及 ぶと思われる。

ＶＥＧＦの全アミノ酸配列に関するコンピューター検索によって、ヒトＰＤＧＦ のＢ鎖およびｓｉｓ腫瘍遺伝子産物に、有意な（２１−２５％）相同性が認めら れる。ＰＤＧＦのＡ鎖でも、より低い相同性が認められる。最も有意な相同性を 示した領域は、ＰＤＧＦのＢ鎖のＧ１ｙ５４とＡｒｇ１７５の間、およびＶＥＧ ＦのＧ１ｙ７とＡｒｇ１２８の間に含まれている。興味深いことに、ＦＤＣＦの ＢおよびＡ鎖に認められる８つのシスティン残基すべてが、ＶＥＧＦ中に保存さ れている。しかし、ＶＥＧＦはさらに８つのシスティン残基を含有している。

これらの相同性は、ｓｉｓ腫瘍腫瘍原遺転子びウシＶＥＧＦコード遺伝子に関し て、１つの祖先前駆遺伝子からの共通の起源を示唆している。ＰＤＧＦが間葉起 源の多様な細胞型に対して広く活性で、内皮細胞には不活性であるのに対して、 ＶＥＧＦは血管内皮細胞に対して選択的な、高度に特殊化した分子であるように 思われる。このことは、ｓｉｓ腫瘍原遺伝子産物およびＶＥＧＦ産物の構造上の 相違が、著しい機能上の相違をも伴っていることを示唆している。

ＶＥＧＦのｃＤＮＡには古典的なシグナルペプチドが先行しており、このことは 、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、およびＰＤ−ＥＣＧＦのような他の内皮細胞ミトゲンと は対照的に、ＶＥＧＦが分泌タンパク質であることを示している。このことは、 濾胞細胞で調整した培地中にＶＥＧＦが存在することが、真に分泌過程を表すも のであって、細胞の死滅や溶解の結果ではないことを、強く示唆している。した がってＶＥＧＦは潜在的に、内皮細胞成長および脈管形成の可溶性メディエータ −としての役割を果し得る。ノーザンブロツティングによって、ＶＥＧＦが濾胞 細胞内で３．７ｋｂの単一メツセンジャーＲＮＡによってコードされていること がわかった。

（以下、余白） ｌ　ＣＡＧＣＧｃｒＧＡＣＧＧＡＣＡＣＡＣＡＧ　ＡＣＡ頷ａＣＣＧ　ＣＣＣＣ ＣＴにＣＣＣＣＡＧＣＧＣＣＣＡＣＦＩＧ、　２−２ Ｓａｌ　ｌ Ｓｓｔ　ＩＩ　Ｐｓｔ　１ 工 八 、＼ ロ　１ 八 ＦＩＧ、　８ ＣＭ ＦＩＧ、　９ ｌ　ＣＡＧＴにＴＧＣＴＧ　ＧＣＧＧＣＣＣＧＧＣＧＣＧＡＧＣＣＧＧＣＣＣＧ ＧＣＣＩ：ＣＧｌ’ｆｆ　ＴＣＧＧＧＣＣＴＣＣ国際調査報告 −一−＾峠−−−均　ＰＣＴ／υＳ　９０１０２５８５−に−一−＾−−−１・ ＰＣＴ／υＳ　９０１０２５８５

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した場合、非還元的条件下で約４５０００ダルトン 、還元的条件下で約２３０００の分子量を有する血管内皮細胞成長因子をコード する配列を含有する単離された核酸配列。 ２．該成長因子がウシ由来である請求項１の配列。 ３．該成長因子がヒト由来である請求項１の配列。 ４．ＤＮＡ配列である請求項１の配列。 ５．２０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８ ）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５ｘデンハルト液、および５０μｇ／ｍ１ サケ精子ＤＮＡ中で、以下のＤＮＡ配列： ５．【配列があります】 と共に、４２℃でインキュベートし、２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを用いて４２ ℃で洗浄した場合、このＤＮＡ配列とハイブリッド形成する配列を含有する、少 なくとも約１０ヌクレオチドを含有する単離されたＤＮＡ。 ６．少なくとも約２０ヌクレオチドを含有する請求項５の配列。 ７．２０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８ ）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５ｘデンハルト液、および５０μｇ／ｍｌ サケ精子ＤＮＡ中で、図２のＤＮＡ配列と共に４２℃でインキュベートし、２ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを用いて４２℃で洗浄した場合、図２のＤＮＡ配列とハ イブリッド形成する、少なくとも約１０ヌクレオチドを含有する車離されたＤＮ Ａである、請求項５の配列。 ８．少なくとも約２０ヌクレオチドを含有する請求項７の配列。 ９．少なくとも約３０ヌクレオチドを含有する請求項８の配列。 １０．５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６． ８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５ｘデンハルト液、および５０μｇ／ｍ ｌサケ精子ＤＮＡ中で、図２のＤＮＡ配列と共に４２℃でインキュベートし、２ ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを用いて４２℃で洗浄した場合、図２のＤＮＡ配列と ハイブリッド形成する配列を含有する、少なくとも約１０ヌクレオチドを含有す る単離されたＤＮＡ。 １１．少なくとも約２０ヌクレオチドを含有する請求項１０の配列。 １２．少なくとも約３０ヌクレオチドを含有する請求項１０の配列。 １３．さらに該核酸配列に機能するように連結されたプロモーターを含有する請 求項５の核酸配列。 １４．さらに該核酸配列に機能するように連結されたプロモーターを含有する請 求項１０の核酸配列。 １５．発現ベクターであって、該ベクターによって形質転換された宿主によって 認識される制御配列に、機能するように連結された請求項５の核酸配列を含有す るもの。 １６．発現ベクターであって、該ベクターによって形質転換された宿主によって 認識される制御配列に、機能するように連結された請求項１０の核酸配列を含有 するもの。 １７．請求項１５の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。 １８、該細胞が真核細胞である請求項１７の宿主細胞。 １９．該細胞が原核細胞である請求項１７の宿主細胞。 ２０．請求項１６の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。 ２１．以下の生物字的性質： （ａ）血管内皮細胞の成長を選択的に促進するが、ウシ角膜内皮細胞、水晶体上 皮細胞、副腎皮質細胞、ＢＨＫ−２１線維芽細胞、もしくはケラチノサイトの成 長を促進しない、あるいは（ｂ）対応する天然タンパク質の少なくとも１つに対 して生じた抗体と免疫学的に交差反応する、 の１もしくは両方を有するに十分な、血管内皮細胞成長因子のアミノ酸配列との 十分な相同性を有するアミノ酸配列を持つ血管内皮細胞成長因子をコードするＤ ＮＡ配列を含有する、単離されたＤＮＡ配列。 ２２．ｃＤＮＡ配列である請求項２１の配列。 ２３．該細胞成長因子コード配列のＮ末端に、さらにシグナル配列コード領域を 含有する請求項２１の配列。 ２４．該シグナル配列が哺乳類細胞によって認識される請求項２３の配列。 ２５．ゲノム配列である請求項２１の配列。 ２６．検出可能な部分に共有結合的に結合した請求項２１の配列。 ２７．発現ベクターであって、該ベクターで形質転換された宿主によって認識さ れる制御配列に、機能するように連結された請求項２１のＤＮＡ配列を含有する もの。 ２８．プラスミドである請求項２７のベクター。 ２９．請求項２７の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。 ３０．真核細胞である請求項２９の宿主細胞。 ３１．哺乳類細胞である請求項３０の宿主細胞。 ３２．血管内皮細胞成長因子の生産法であって、該成長因子を宿主細胞培養中で 発現させるために請求項２９の細胞を培養することを含むもの。 ３３．さらに該宿主細胞培養から該成長因子を回収することを含む請求項３２の 方法。 ３４．該成長因子が宿主細胞培養培地から回収される請求項３３の方法。 ３６．随伴する天然のグリコシル化を伴わず、図２に示す成熟したタンパク質の アミノ酸配列と少なくとも約８０％の相同性を有し、以下の生物学的性質： （ａ）血管内皮細胞の成長を選択的に促進するが、ウシ角膜内皮細胞、水晶体上 皮細胞、副腎皮質細胞、ＢＨＫ−２１線維芽細胞、もしくはケラチノサイトの成 長を促進しない、あるいは（ｂ）対応する天然タンパク質の少なくとも１つに対 して生じた抗体と免疫学的に交差反応する、 の１もしくは両方を有する、血管内皮細胞成長因子。 ３７．ウシ起源である請求項３６の細胞成長因子。 ３８．ヒト起源である請求項３６の細胞成長因子。 ３９．供給源のタンパク質を全く含まない血管内皮細胞成長因子。 ４０．ウシ起源である請求項３９の細胞成長因子。 ４１．ヒト起源である請求項３９の細胞成長因子。 ４２．医薬的に許容され得る担体中の治療有効量の請求項３６の成長因子を含有 する、血管内皮細胞成長の促進に有効な医薬組成物。 ４３．さらに他の細胞成長因子を含有する請求項４２の組成物。 ４４．等張である請求項４２の組成物。 ４５．滅菌濾過された請求項４２の組成物。 ４６．血管内皮に影響を及ぼす外傷を負った動物もしくはヒトに有効量の請求項 ４２の組成物を投与することを含む、該外傷の治療法。 ４７．血管内皮に影響を及ぼす外傷を負った動物もしくはヒトに有効量の請求項 ４３の組成物を投与することを含む、該外傷の治療法。 ４８．さらに該動物もしくはヒトに有効量の他の細胞成長因子を投与することを 含む請求項４６の方法。 ４９．該外傷が糖尿病性潰瘍あるいは血管もしくは心臟の創傷である請求項４６ の方法。 ５０．ヒトが治療される請求項４６の方法。