JPH04506603A - 血漿プロテインの検定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 血漿プロティンの検定方法 本発明は血液凝固および繊維素溶解系における成分のアッセイ、特にこれらの系 に包含されるある種の蛋白質、すなわちプロティンＣおよびプロティンＳと呼ば れる血漿蛋白質の機能的活性または定量に関する。

血液凝固または凝血過程の目的の一つは、出血を効果的に停止させることにある 。この過程は接触活性化、例えば血管の傷害によって開始されるプロ酵素、因子 ■（因子の語は慣行に従い、以下Ｆと略す）の活性酵素ＦＸ［、（接尾記号“ａ ”は活性であることを意味し、この表示方法は一般的に以下の記述に使用される ）への酵素活性化反応の複雑な、いわゆる酵素カスケードに関与している。Ｆ■ ３は以後のプロ酵素の酵素への活性化反応を触媒し、凝血または血餅が一連の酵 素活性化（カスケード）を介し、可溶性フィブリノーゲンの不溶性フィブリンへ の変換によって最終的に形成される。多（の活性化段階すなわちカスケード反応 が迅速な止血を可能にする急速な血餅の形成に寄与する。

逆の過程、すなわち形成された血餅の分解、いわゆる繊維素溶解過程も類似の酵 素反応カスケードからなり、このカスケードの最終段階でプラスミンが形成され る。

形成されたプラスミンは、蛋白分解作用により血餅すなわちフィブリンを速やか に小さな可溶性フラグメントに分解する機能を有する。

これらの系には以下に詳述するように、多数の因子が組み込まれている。

後天的または先天的障害による血液凝固および／または繊維素溶解系におけるこ れらの血中因子の１種または２種以上の量の増加または減少は、病的状態を招来 することが多（、これらは時に致命的であり、またその個体群の症例では例えば 動脈および／または静脈血栓（または血餅）形成の素因があることを意味する場 合がある。

機能的に活性な抗トロンビンおよびプラスミノーゲン量の減少ならびにＦ■、フ ィブリノーゲンおよびプラスミノーゲン活性化因子インヒビター（ＦＡＩ−１） 量の増加は、血栓（または血餅）を生じやすい障害の例である。

最近、プロティンＣ（ＰＣ）およびプロティンＳ　（ＰＳ）と呼ばれる二つの新 しい蛋白質が血漿中に同定された。よく知られている抗トロンビンと同様に、こ れらのビタミンに依存性の蛋白質は抗凝固活性を有し、プロティンＳ（分子量８ ０ｋＤ）が活性化プロティンＣの活性を刺激するという形での両蛋白質の共同作 用により両者で血餅形成を妨害し、すでに形成された血餅の分解を促進する。こ れらの蛋白質またはその一方の量の減少もまた、血液凝固および繊維素溶解系に おける障害を招（。プロティンＳの重要性は、この蛋白質について実施された試 験によって確認されている。これらの試験に基づき、深部静脈血栓に罹患してい る５０歳未満の患者の場合、その５〜８％はプロティンＳの生来の欠損に由来す るものであると信じられている。一方、抗トロンビンの固有の欠損によると考え られる例は全症例の約３％に過ぎない。

したがって、これらの蛋白質の両者または一方の含量を定常的に検定または定量 することが可能であれば、各自の血栓形成の素質をより容易に確立し、適切な時 期に予防的および／または治療的処置を施すことが可能になるので著しい利益が 得られる。

これらの血漿蛋白質、ＰＣおよびＰＳは共同してトロンビン形成の実行に必要な 補因子ＦＶ、およびＦＶｌ、を切断することにより、ＦＸ、およびトロンビンの 形成に影響する。プロティンＳおよびプロティンＣ（活性化された型）の機能の 理解を容易にするために、以下に血液凝固系の主要部分について簡単に説明する 。そのうち、ＦＸＩ［の活性化以降の段階を系統図１に示す。

系統図１ この系統図１から明らかなように、不活性蛋白質プロトロンビン（プロ酵素）は 活性化ＦＸすなわちＦＸ、、Ｃａ”、ＴＦ３と呼ばれ、活性化血小板の表面に出 現するリン脂質（血小板因子３）およびヘルパープロティンＦＶの活性型Ｆｖ、 の影響により、活性なトロンビン（酵素）に変換すれる。トロンビンはフィブリ ノーゲンを酵素的に切断してフィブリンを形成させ、これが酵素、ＦＸＩ［ａの 助力で架橋することにより血餅の構造的骨格が形成される。これらの過程は系統 図１の一部でもある以下の系統図２に例示する。

系統図２ ＦＸａ 一方、ＦＸ、は不活性ＦＸによりＦＩＸａの作用とＴＦ３、Ｃａ２４および別の ヘルパープロティンＦ■の活性型ＦＶＩ。

の補助を介して形成されている。これらの過程は同じく系統図１の一部でもある 以下の系統図３に例示する。

これらの系統図から明らかなように、トロンビンは効率的なトロンビン形成に必 須な活性因子であるＦＶａの活性化（系統図２）と同時に、ＦＸ、とともにＦＶ Ｉ、の活性化（系統図３）にも寄与することにより、また以下に述べるように活 性化された型でプロティンＳとともに因子ＦＶ１．およびＦＶａの切断によりト ロンビン形成を低下させるプロティンＣの活性化に寄与することによりその産生 量を自己調節している。

ＦＩＸ、は不活性ＦＩＸによりＦＸＩａとＣａ２″の作用を介して形成される。

ＦＸ［、はＦＸ［によりＦＸｌ［、の作用を介して産生されている。ＦＸｌ、は 血管傷害等の結果としてＦＸ［により形成され、したがって凝血系における開始 因子になっている。これらの過程は同じく系統図１の一部でもある以下の系統図 ４に例示する。

系統図２および系統図３＋４に開示された過程に加えて、トロンビンの形成は組 繊因子、組織トロンボプラスチンの介助によりヘルパープロティンおよびリン脂 質を供給する外的システムを経由するＦＩＸおよびＦＸのそれぞれＦＩＸａおよ びＦＸａへの活性化により、並びにＣａ”の存在下における酵素ＦＩ１．の作用 により促進される。

活性型の血液凝固および繊維素溶解系因子は、通常は血中には存在せず、必要な 場合にだけ生成する。血液は多数の蛋白質いわゆる酵素インヒビターを含有し、 これらが誤った活性化を防御している。よく知られた一つのインヒビターに抗ト ロンビンがあり、これはトロンビンに結合して蛋白分解作用を欠く複合体を形成 する。

本発明が関与するプロティンＣ（ＰＣ）およびプロティンＳ　（ＰＳ）は、イン ヒビターまたは抗凝固剤としても作用し、これらの蛋白質の作用はプロティンＣ のプロティンＳの介助によりＦｖａを切断する活性型プロティンＣ（ＡＰＣ）へ の活性化に基づくものである。これはプロトロンビンのトロンビンへの変換（系 統図５）を劇的に減少させ、したがって血餅の形成を低下させる。

さらに、ＡＰＣはＰＳとともにＦＶｌ、に対して切断作用を発揮し、これもＦＸ ａの生成を減らすことによりその抗凝固作用を助けることになる。この過程は以 下の系統図６に例示する通りである。

系統図に れらの系統図から明らかなように、プロティンＣの活性化は血餅形成を制限する 目的でトロンビンが組み込まれたある種のフィードバック機構によって制御され ている。血餅が血管内に形成されるとトロンビンは血餅から血管壁に移動し、こ こでトロンビンは内皮細胞の表面に存在する蛋白質であるトロンボモジュリン（ ＴＭ）に結合して、もはや凝固作用をもたない複合体ＴＭ／トロンビンを形成す る。すなわちトロンビンは最早フィブリノーゲンを切断することはできず、代わ って複合体ＴＭ／トロンビンがプロティンＣを急速にＡＰＣに活性化し、これが プロティンＳとの複合体の型でＦｖａとＦＶｌ、を切断することにより凝血を阻 害する。すなわち、この後者の複合体は重要な抗凝血作用を有する。

上述のように、ＡＰＣは血餅の分解も促進する。これは組織プラスミノーゲン活 性化因子（ｔ−ｐ＾）をインヒビターの作用から保護することにより間接的に生 じるものである。このやり方でｔ−ＰＡの作用によるプラスミノーゲンのプラス ミンへの高い変換率は維持される。プラスミンは血餅を小さな可溶性のフラグメ ントに切断することによりフィブリン血餅を溶解する。

プロティンＣおよび／またはプロティンＳの含量が著しく低すぎると、トロンビ ン形成の調節が不十分になる結果生じる血栓症の危険を伴うフィブリンの過剰産 生により個体に血栓性疾患の素因を付与することになる。したがって、サンプル 中のプロティンＣおよび／またはプロティンＳのレベルを定常的様式で測定でき て、血栓症の予防的および／または治療的処置の改善を可能にする簡単かつ安全 な方法がめられている。プロティンＣ欠損に罹患している全患者の約１０％は、 その機能的活性は著しく低下しているかまたは完全に欠損しているにもかかわら ず、プロティンＣの免疫学的レベルは正常であることから、測定されるべき活性 はプロティンＣおよび／またはプロティンＳの特に機能的活性である。プロティ ンＳに関しては、その血漿白濃度は約２２μｇ／ｍｌであるが、その大部公約６ ０％は補体系内の蛋白質、Ｃ４ｂ−結合蛋白質に結合していて、機能的には不活 性である。血漿内に遊離状態で存在する残りの約１０μｇ／ｍｌは生物活性を発 揮する。すなわち活性化プロティンＣに結合して活性な複合体を形成する。プロ ティンＳ欠損に罹患している患者も遊離プロティンＳは欠損しているかまたは著 しく低いレベルを示すにもかかわらず、結合プロティンＳのレベルは正常である ことから、測定されるべきレベルはプロティンＳ欠損の場合も機能的活性である 。

しかしながら、これまで主としてプロティンＳの機能的活性を検定するための満 足できる方法は開発されていない。

プロティンＳの機能的活性は定常的に行えるものではないが、確かに従来の検定 方法の対象にはなっていた。

しかし既知の方法は、多様なレベルの生物活性間の識別に関しては十分に信頼で きるものではない。現在知られている方法はフィブリン血餅が生成する時間の記 録に基づ（ものである。これらの方法はＡＰＴＴ−ベースまたはＦＸ、ベースの 凝固法と呼ばれる。ｒ　ＡＰＴＴＪは「活性化部分トロンボプラスチン時間」の 略である。この点において血漿は最初の段階にリン脂質と接触活性化剤たとえば カオリンまたはエラギン酸を含む試薬によって活性化され、カルシウム依存性凝 固反応（系統図４参照）すなわちＦＸＩ、およびＦｘＩａへの活性化が開始され ている。

第二段階ではＣａ２＋イオンが添加され、ＦＩＸ、ＦＸおよびプロトロンビンが 様々な程度に活性化される。プロティンＳ活性を測定する目的では、既知量の１ 種もしくは２種以上の凝固因子も添加される。

段階１で開始された活性化連鎖が最後まで進行し血餅が形成される。血餅が形成 されるのに要する時間（秒）（ＡＰＴＴ）が記録され、標準サンプルと比較して プロティンＳの機能的活性と関連づけられる。一般的に血漿中の遊離プロティン Ｓ含量が増大するほど、凝固阻害＾ＰＣ／プロティンＳ複合体が多量に形成され るので、血餅の形成に要する時間は延長される。

これらの既知方法において系に添加される活性化凝固因子は、活性化プロティン Ｃ（ＡＰＣ）とＦＸａである（Ｐ。

ＣＯＭＰ　＆　Ｃ，ＥＳＭＯＮ、“Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ　Ｖｅｎｏｕｓ　Ｔｈｒ ｏｉｂｏｅｍｂｏｌｉｓｍｉｎ　Ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ａ　Ｐａｒｔｉ ａｌ　Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｏｆ　ＰｒｏｔｅｉｎＳ”、　Ｎｅｗ　Ｅｎｇ、 　Ｊ、　Ｍｅｄ、　３１１．１５２５−１５２８．１９８４およびＢＤＸＨＬＢ ＡＣＫ、“Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｔｎ　Ｃａ　Ｃｏｆａｃｔ ｏｒ　Ｆｕｎｃ−ｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　ａｎｄ　Ｂｏｖｆｎｅ　Ｐｒｏ ｔｅｉｎ　Ｓ　ｂｙ　Ｃ４ｂ−ＢｉｎｄｉｎｇＰｒｏｔｅｉｎ”、１９８６参照 ）。Ａ、ｄ”＾ＮＧＥＬＯ，Ｓ、ＶＩＧＡＮＯ−ｄ＝ＡＮＧＥＬｏ。

Ｃ，ＥＭＳＯＮ　＆　Ｐ、ＣＯＭＰ、　”Ａｃｑｕｉｒｅｄ　Ｄｅｆｉｃｉｅｎ ｃｉｅｓ　ｏｆ　ＰｒｏｔｅｉｎＳ、　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ 　Ｄｕｒｉｎｇ　０ｒａｌ　Ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ。

ｉｎ　Ｌｉｖｅｒ　Ｄｉｓ−ｅａｓｅ　ａｎｄ　ｉｎ　Ｄｉｓｓｅｎｆｎａｔｅ ｄ　Ｉｎｔｒａｖａｓｃｕ−１ａｒ　ＣｏａｇｕＬａｔｉｏｎ”、　Ｊ、　Ｃ１ １ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　８１．１４４５−１４５４゜１９８８　によればまず 特異的モノクローナル抗体を用いて血漿中遊離プロティンＳを抽出し、ついでそ の抽出蛋白質１：ＡＰｃおよびＦｘ、が添加されティる。Ｋ、５ＵＺＵＫＩ　＆ 　Ｊ。

Ｎｌ５ＩＩＩＯＫＡ、“Ｐｌａｓｍａ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ 　ｂｌｅａｓｕｒｅｄＵｓｉｎｇ　Ｐｒｏｔａｃ、　ａ　５ｎａｋｅ　Ｖｅｎｏ ｍ　Ｄｅｒｉｖｅｄ　Ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ｏｆＰｒｏｔｅｉｎ　Ｃ″、Ｔｈｒ ｏｎｂ、Ｒｅｓ、４９．　２４１−２５１．　１９８８　では、ＡＰＣの代わり に血漿中ＰＣをＡＰＣに活性化する物質、すなわちＰｒｏｔａｃＯＣ（Ｐｅｎｔ ａｐｈａｒＬＩ、　５ｗ１ｔｚｅｒｌａｎｄ）の＾ｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎｃｏｎ ｔｏｒｔｒｉｘからの選択的蛇毒酵素である活性成分を使用している。

しかしながら、これらの既知方法には幾つかの欠点がある。例えば分解能が低く 、すなわち遊離プロティンＳのレベルの差の識別能に限界がある。通常、７０〜 ２００％遊離プロティンＳの範囲内で凝固時間はわずか１０秒まで延長されるの みで、正常血漿すなわち遊離プロティン８１００％での凝固時間は用いられる方 法に依存して４０〜８０秒の範囲にある。更にこれらの方法はルーチンベースで の実施、例えば凝固検査室での実施は困難で標準化が必要であり、また正確度に 関して欠陥がある。

したがって、本発明の目的は簡単に実施可能で、既知方法に伴う欠点を実質的に 回避した機能的に活性なプロティンＳまたはプロティンＣのレベルを検定する方 法を提供することにある。

本発明によればこの目的は、機能的に活性なプロティンＳまたはプロティンＣの 含量を測定する血漿サンプルに凝固酵素Ｆ　Ｘ　ａの形成を促進する酵素である 凝固酵素ＦＩＸａを、更に任意の１種もしくは２種以上の凝固因子とともに添加 し、サンプルをインキュベートし、ＦＸ。

によって触媒される過程でプロトロンビンから誘導されるトロンビンの量を既知 の方法で測定し、標品を用いて既知の方法で測定されたトロンビンの量に基づい て、生成したトロンビンの量に逆相関する機能的に活性なプロティンＳまたはプ ロティンＣの含量を測定することからなる方法によって達成される。

すなわち、生成したトロンビンの量は、存在する機能的に活性なプロティンＳま たはプロティンＣの量の尺度になる。血漿中のトロンビン含量の検定方法はよ（ 知られていて、本発明はその特定の測定方法によって限定されるものではない。

現時点で知られているすべての方法および将来考案されるであろう方法が利用可 能である。

適当な測定方法の例には基質の切断に基づく好ましくは光度測定法による方法、 および凝固に基づく測定方法が包含される。

本発明によれば、生成したトロンビン量に基づく機能的活性なプロティンＳおよ びプロティンＣの測定には、基質切断光度測定法が適していること、そしてこの 方法は特にプロティンＳに関して既知の凝固に基づ（方法で達成される分解能に 比べてかなり大きな分解能を与えることが明らかにされている。本発明の好まし い一態様においてはしたがって、生成したトロンビン量の選択的トロンビン基質 好ましくは色素産生基質を用いる光度測定法による測定が適用される。このよう な基質は通常、アミノ酸好ましくはトロンビンによって容易に選択的に切断され 、ｐ−ＮＡ　（ｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉＬｉｎｅ）のような色素産生マーカーを用 いた場合、例えば光度測定法で容易に測定できる基（マーカー）を与える短いペ プチドに基づ（ものである。これらの基質は市販品を例えば、Ｋａｂｉ　Ｄｉａ ｇｎｏｓｔｉｃａ。

１ｏｔ−ｎｄａｌ、、　Ｓｗｅｄｅｎから入手可能であるか、または本技術分野 の熟練者により容易に製造できるものである。

また驚くべきことに本発明では、選択的トロンビン基質を適当に選択すれば、本 発明の方法を２段階でも１段階でも任意に実施できることが見出されたのである 。適当な選択的基質を選んだならば、この方法を単一工程で行えることは驚くべ きことであり有利である。単一工程方法を可能にする基質は、例えば（Ｓ−２８ ４５）（ＫａｂｉＶｉｔｒｕｍ＾Ｂ、　Ｓｗｅｄｅｎ）およびＨ−Ｄ−ＣＨＧ− ＾１ａ−＾ｒｇ−ｐＮＡ（Ｎｙｃｏｍｅｄ　Ｔｈ−Ｔｈ−１）（Ｎｙｃｏ　Ａｓ 、　Ｎｏｒｗａｙ）である。他方、既知のトロンビン基質、Ｈ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐ ｉｐ−＾ｒｇ−ｐＮＡ（Ｓ−２２３８）　（ＫａｂｉＶｊｔｒｕｍ　ＡＢ。

Ｓｗｅｄｅｎ　）は、特に差の識別能が不十分なことから単一工程には適当では ない。

本発明の方法ではまた生成したトロンビン量を既知の様式での凝固方法を用いて 確立することも可能である。

凝固連鎖を完結するまで進行させ、その血漿サンプルについて血餅の生成に要す る時間を測定し、プロティンＳまたはプロティンＣの機能的活性が既知の血漿に ついての相当する時間と比較する。この方法は１段階、２段階のいずれでも実施 できる。

本発明の方法は多くの先行技術方法がその実施にあたり直接ＦＸ、を添加するの に対して、ＦＸのＦＸ、への活性化を促進するためにＦＩＸ、を添加することに 基づくものである。本発明において使用されるＦＩＸ２は通常、哺乳動物例えば ウシ起源のものである。ヒトまたはブタからのＦＩＸ、も有利に使用できる。

本発明によるＦＩＸａの添加はＦＸのＦＸａへの活性化の調節を可能にするばか りでなく、トロンビンの生成に大きな影響を与える形成されたＦＶａとＦＶｌ、 に対する八ＰＳ／ＰＳの不活性化作用を至適にすることが可能であるという間接 的な利点も提供する。例えば相当する血漿内含量でのＦＸａの添加の場合と比較 して、この方法におけるＦＩＸ、の強力な影響は全く予期できないものであった 。また本発明の目的におけるＦＩｘａの添加はこれまでどこにも記載されていな い。

本発明の方法はＦＩＸａに加えて、ある種の他の凝固因子を添加することによっ て更に改良することができる。

すなわち好ましい一態様によれば、本発明の方法は活性化プロティンＣ１すなわ ちＡＰＣを添加しつつ実施される。

使用されるＡＰＣは通常、哺乳動物起源のもの例えばウシ（ウシ八ＰＣ）　、ブ タ（ブタＡＰＣ）　、好ましくはヒト（ヒト＾ＰＣ）からのものである。使用可 能なＡＰＣは血漿からまたは組換え技術によって製造することが可能で、通常高 度に精製されている。上述の市販製品、蛇毒酵素を含むＰｒｏｔａｃ■ＣをＡＰ Ｃの代わりに使用することもできる。この酵素はプロティンＣをＡＰＣに活性化 し、したがって間接的にへＰＳ／ＰＳ複合体の生成を促進する。この複合体の作 用については既に述べた通りである。

本発明の別の適当な実施態様によれば、血漿サンプルにＦｖａも添加される。Ｆ Ｖａの添加はトロンビンの生成速度の調節のために用いられ、ＦＶａの適当な添 加によりプロトロンビンのトロンビンへの変換は更に迅速に、更に効果的に行う ことができる。好ましくは哺乳動物起源のＦＶ、、例えばヒト起源、ウシ起源ま たはブタ起源のもの、特に好ましくはヒト起源のものが、そして血漿からまたは 組換え技術によって製造されたＦＶ、が用いられる。

本発明の実施に際して、血漿サンプルに適当に添加できる他の凝固試薬はリン脂 質である。この添加はＦＸのＦＸａへのおよびプロトロンビンのトロンビンへの 活性化を加速することができる。リン脂質の起源の選択については特に制限はな い。例えば接触活性化剤例えばカオリンまたはエラギン酸が添加されたまたは添 加されていない市販の両ＡＰＴＴ−試薬および合成リン脂質またはリン脂質混合 物は使用可能であることが見出されている。

プロトロンビン、ＦＸおよび／またはＦ■の添加が有利な場合もあることが見出 されている。本発明で用いられるすべての凝固蛋白質に関して、これらの凝固蛋 白質はその種起源によって限定されるものではなく、それらが血漿から抽出され るか、または組換え技術によって製造された未変異体もしくはその分子生物学的 に改変された変異体であるかには無関係であることを理解すべきである。種起源 に関しては、しかしながら通常は哺乳動物起源のものが好ましく、特にヒト、ウ シまたはブタ起源のものが好ましい。

本発明を適用する場合に存在させる大部分の成分の比率には、特に制限はない。

しかしながら本発明の理解を容易にするために、多数の成分についての適当な濃 度範囲を以下の表１に掲げる。

表　１ 容量％まで８＊ Ｆ　ＩＸａ　Ｉ　Ｘ　１０−”　〜Ｉ　Ｘ　１０−’ｍｏｌ／Ｉ””Ａ　Ｐ　Ｃ ５Ｘ　１０−”〜Ｉ　Ｘ　１０−’ｍｏｌ／ｌｓ好ましくは１×１０”′。〜Ｉ 　Ｘ　１０−’ｍｏｌ＃’ＦＶａ　Ｉ　Ｘ　１０−＋２〜Ｉ　Ｘ　１０−’ｍｏ ｌ／Ａ’、好ましくは２×１０−”〜Ｉ　ＸＩＯＸｌｏ−１ｌ＃！リン脂質　Ｉ 　Ｘｌ０−’〜３　Ｘｌ０−’ｍｏｌ＃、好ましくは３×１０”６〜Ｉ　Ｘ　１ ０−’ｍｏｌ／ＪＣａ”　１　ｘｉｏ−’〜５ＸＩＯ−”ｍｏｌ／Ｉ、好ましく は１×１０−３〜ｌ　Ｘ　１０−２ｍｏｌ、＃””トロンビン基質　２×１０− １〜２×１０″−ｏｌ／１１好ましくは１×（たとえば色　１０”’〜Ｉ　Ｘ　 １０−３ｍｏｌ／ｌ素産生性） ｐＨ６，５〜９．５好ましくは７〜８．５イオン強度　０〜０．６好ましくは０ 〜０．２５ＰｒｏｔａｃＯＣ５Ｘ　１０−３〜１．５Ｕ／ｄプロトロンビン　Ｉ 　Ｘ　１０−’〜２　Ｘ　１０−’ｍｏｌ／ｉ’ＦＸ　１　×ＩＱ−１３〜５Ｘ ＩＯ−’ｍｏｌ、＃Ｆ■　Ｉ　Ｘ　１０−’〜５Ｘ１０−’ＩＵ／肩！本　トロ ンビン基質法、たとえば色素産生基質法＊＊　凝固法 ネ林　Ｆ■および／またはＦｖａを添加しない試験では高い含量林木木　カルシ ウムはＣａＣｌ　２または他の適当な塩の形で添加できるｐｎを好ましい範囲に 維持するには、成分溶液は、慣用の緩衝系たとえばＴｒｉｓ−緩衝液を用いた緩 衝液中に調製する。

本発明には、サンプルのインキュベーションが包含され、温度を１８〜４５℃、 好ましくは３５〜４０℃、さらに好ましくは３７℃として、短時間たとえば０． ５〜１５分、適当には１〜１（１分、とくに０．５〜６分行われる。次いで、プ ロティンＳまたはＣの機能的活性はすべて、いわゆる単一工程法に従って測定さ れる。著しく短い反応時間で行われる系の場合、たとえば好ましくは凝固をベー スとした方法では、導入段階で、所望により凝固因子とともに、サンプルを上述 したと同じ温度に、短時間、通常２〜３分間加熱するのが好ましく、次いでサン プルにＦＩｘａおよび任意の他の凝固因子が添加される。たとえば血漿サンプル 中のプロティンＣの活性化のためにＰｒｏｔａｃＯＣを使用する場合のように、 ２回のインキュベーション期間を導入した２段階法を適用するのが有利な場合も ある。

本発明の方法においては、凝固因子に対するポリクローナルまたはモノクローナ ル抗体を、この因子の影響を除去するために使用することが有利な場合もある。

たとえば、Ｆ■の生物活性は、抗−Ｆ■：Ｃ抗体の添加によって遮断できる。

以上の記述は一般的に、プロティンＳの機能的活性の検定の場合に当てはまる。

本発明の方法をプロティンＣの機能的活性の検定に適用する場合には、一部の改 変が必要である。たとえば、上述のようにＰｒｏｔａｃ［Ｆ］Ｃで有利に行われ る血漿サンプル中のプロティンＣの活性化の前または後に、好ましくはヒト起源 のプロティンＳを血漿サンプル中に添加する。ＦＩＸ３および任意の他の凝固因 子はついで第二段階で添加される。

次に、本発明を以下の実施例によりさらに詳細に説明するが、これらは単に本発 明を例示するものであって、本発明の範囲を限定するものではない。これらの実 施例では、添付の図面も参照しながら説明する。図１は、ＦＩＸ、もしくはＦＸ 、の存在下における色素産生基質単一工程法でのプロティンＳの検定を例示する 。図２は、プロティンＳを検定する場合における、抗−Ｆ■：Ｃ抗体およびウシ ＦＸの添加の効果を例示する。図３は、プロティンＳを検定する単一工程法にお ける各種の基質の効果を例示する。図４は、ＦＩＸ、の添加に基づ（プロティン Ｓの単一工程凝固ベース検定法を例示する。図５は、プロティンＣのＦ　ｒＸ　 ａベース色素産生基質法を例示する。

例１ （ａ）血漿サンプルをＴｒｆｓ−緩衝液Ｉに１＝１５に希釈した。その１００μ ｌをＴｒｉｓ−緩衝液Ｉに溶解したヒトＡＰＣ１００μｉ、色素産生基質、Ｈ− Ｄ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐＮ＾（Ｓ−２８４６）（ＫａｂｉＶｉｔｒｕｍ 　ＡＢ、　Ｓｗｅｄｅｎ）　２０ｈＣならびにＴｒｉｓ−緩衝液■に溶解したヒ トＦＩＸ、　、　Ｃａ（Ｊ’２、Ｔｒｉｓ−緩衝液Ｉに溶解したウシＦｖ、、お よび４０％コレステロール、４０％ホスファチジルコリン、２０％ホスファチジ ルセリンからなるリン脂質混合物、計２００μｌと混合した。

Ｔｒｉｓ−緩衝液Ｉは、ｐＨ７，４、イオン強度（１）０．１５の０、０５ｍｏ １／ｌのＴｒｉｓ−１１Ｃ６および０２％ウシ血清アルブミン（ＢＳ＾）からな る。

Ｔｒｉｓ−緩衝液■は、ｐＨ８，０、Ｉ＝０．１５の０．０５ｍｏｌ／ｌのＴｒ ｉｓ　−ＨＣＩおよび０．２％ＢＳＡからなる。開始溶液の濃度は、各反応試薬 について表１に与えられた最終濃度になるよヒトＡ　Ｐ　Ｃ１０ｈｌｌｒｔｍｏ ｌ／７Ｈ−Ｄ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−２００μ／　０．３３＋＋＋ｍｏｌ＃’＾ｒｇ −ｐＮＡ（Ｓ−２８４６） 混合物を３７℃で４分間インキュベートし、２０％酢酸を加えて、反応の進行を 中断した。次いで、サンプルの４０５ｎｍにおける吸収（Ａ４０５）を、標準装 置たとえば旧ｔａｃｈｉ１００−２０光度計を用いて測定した。Ａ　４　ｏ５は 、正常血漿を混合して調製したサンプルについても測定し、そのプロティンＳ含 量を１００％にセットし、プロティンＳ欠損血漿のプロティンＳ含量を０％にセ ットした。Ａ　４６５は、それぞれＰＳ　１００％およびＰＳ　Ｑ％を含有する 血漿についても測定した。

図１には、得られたＡ　４　（１５の値を％ＰＳに対してプロットした（−■− ）。これらの値から明らかなように、極めて良好な識別能が達成され、これは１ ００％と０％における吸収の大きな差に反映されている。この差は、ΔＡ４゜、 （０〜１００％）と命名され、はぼ０．８５である。また図１から、プロティン Ｓ含量は生成したトロンビン量と逆相関すること、すなわちＰＳ含量が増加する とトロンビンの生成は著しく低下することがわかる。

（ｂ）例１（ａ）においては、検定は血漿サンプルにＡＰＣを添加して行われた 。比較のために、同じ検定を八ＰＣを添加しないで実施した。この場合は、かな り小さく、有意ではない差、△Ａ４０５（０〜１００％）しか得られなかった。

すなわち、この試験での識別程度は低かった。これは図１にプロットした値（− １−）から明白である。例１（ａ）による検定を、サンプルの初期インキュベー ションをプロティンＳに対する抗体（ＰＳ−＾ｂで示す）とともに行い、ＰＳの 生物活性を排除し、それによりへＰＣ／ＰＳ−複合体も除去した場合には、測定 された吸収値は実質的に変化せず、高いレベルに止まった。得られたこの値も、 図１にプロットする（−Ｘ−）。

（ｃ）既知の方法と比較するために、ヒト＾ＰＣを添加しまたは添加しないで、 ただしＦＩＸ、の代わりにＦＸ。

（最終濃度０．４ｐｍｏｌ＃！、　インキュベーション時間５分）を用い、上記 １（ａ）とほぼ同様の検定を実施した。得られた△Ａ４゜５値も図１にプロット する（それぞれ−ム−および一△−）。この場合は有意な△Ａ４０５（０〜１０ ０％）の値は得られず、トロンビンの生成は常に比較的低い値を示すことが明ら かである。

ＦＸａの添加を最終比率で４０ｐｍｏｌ、＃に増大させた場合はインキュベーシ ョン時間はある程度短縮したが、差の識別能はさらに悪くなった。ＡＰＣの添加 量を増加させると、わずかながら結果は改善されるが、八ＰＣの添加量を３倍に 増加させても、△Ａ　４０５（０〜１００％）は例１（ａ）によって得られた値 の３０％を越える程度であった。

例１は、血漿中のＰＳの機能的活性の一工程色素産生基質検定法の例示である。

サンプルにＦＩｘａを添加した場合に達成される驚くべき高い効果は、得られた 結果（図１に示した）により明白に証明されている。ＡＰＣが蛋白分解的切断に よって補因子ＦＶおよびＦ■を分解することは一般によく知られている（Ｗ、　 ＫＩＳＩＥＬ、　Ｗ、　ＣＡＮＦＩＥＬＤ。

Ｌ、　ＥＲＩＣＳＳＯＮ　＆　Ｅ、　ＤＡＶＩＥ、Ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ 　Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｐｌａｓｍａ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　 ＣＦｏｌｌｏｗｉｎｇ　Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｂｙＴｈｒｏｍｂｉｎ、Ｂｉｏ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１６．　５８２４−５８３１．　１９７７およびＲ，ＭＡ ＲＬＡＲ，Ａ、　ＫＬＥＩＳＳ　＆　Ｊ、ＧＲＩＦＦＩＮ、“Ｍｅｃｈａｎｉｓ ｍ　ｏｆ＾ｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｐｒｏｔｅｊ ｎ　Ｃ，ａ　Ｔｈｒｏｍｂｉｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　Ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａ ｎｔ　Ｅｎｚｙｍｅ”、　Ｂｌｏｏｄ　５９．１０６７−１０７２、　１９８２ ）。しかしながら、この過程は、ＦＶおよびＦ■がトロンビンおよび／またはＦ ＸａによってそれぞれＦｖａおよびＦｖＩａに活性化される前には無効である。

したがって、予め形成されたＦＸ、の添加の方が、インキュベーション時におい てＦＸ、の生成を助けるＦＩＸ。

の添加（本発明）よりもかなり低いＡＰＣ／　ＰＳ活性しか生じないことは、い ずれの場合もＦＸａ／トロンビンの影響を介してＦ■の活性化が起こることを考 慮すれば、全く驚くべきことである。

以下の実施例は、トロンビンの生成に対する補因子ＦＶ１．の意義を、その補因 子の遮断によって例示するも正常血漿（１００％ＰＳ）　１容を、０．２μＩ／ 諺ｌのモノクローナル抗−Ｆ■：Ｃ抗体２＾３（Ｋａｂｉ　ＡＢ、　Ｓｗｅｄｅ ｎ）　ｌ容と３７°Ｃで１５分間ブレインキュベートした。これらの抗体はＦ■ に特異的に結合して、それを不活性化する。例１（ａ）と同様に、ただし血漿含 量１，７％でＦＩＸ、を添加して、それぞれＰＳＯ１５０および１００％の血漿 サンプルについて、ウシＦＸ（最終含量０．０２Ｕ　／１１１）を加えてまたは 加えないで３７℃において４分間インキュベーションしたのち、Ａ４゜、を測定 した。得られた値は図２にプロットする。

図から明らかなように、＾ＰＣ／ＰＳは、ＦＶｌ、の不存在下でもＦＸを添加す ると（−■−）、供給されたＦ　Ｖ　ａに対する＾ＰＣ／ＰＳの影響を介して、 依然として効果を発揮する。

ＦＸａの直接添加からなる例１　（ｃ）（図１ニーム−）と比較すると、この場 合も、系へのＦＸａの直接添加に代えて、予め添加したＦＸからインキュベーシ ョン時にＦＸａを生成させた方が有利であることがわかる（図例１（ａ）と同様 にして、正常血漿（１００％ｐｓ）　、ならびにプロティンＳ欠損血漿（０％Ｐ Ｓ）についてＡ　４０５を測定した。しかしながら、ＡＰＣを使用する代わりに 、３７℃で２分間インキュベートするとプロティンＣをＡＰＣに活性化するＰｒ ｏｔａｃ■Ｃ（最終含量０．１７Ｕ／＋＋１）を用い、一方、１２ｐｍｏｌ／ｌ のＦＩＸ、を使用し、インキュベーション時間４．５分を適用した。得られた結 果を表２に示す。

表２ 正常血漿（１００％ＰＳ）　０．１８　１．　にれらの値から、プロティンＳは ＡＰＣの存在下に高い活性を示すことがわかる。ＡＰＣはＰｒｏｔａｃ■Ｃの作 用によってｉｎ　ｖｉｔｒｏで形成されるので、はじめにＡＰＣを供給する必要 はない。

例４ 最終濃度１８μＩｌｏ■／ｌの合成リン脂質混合物を用いたほかは例１（ａ）と 同様にして、正常血漿およびプロティンＳ欠損血漿についてＡ４゜、を測定した 。同様の検定を、リン脂質混合物の代わりに、同様の接触活性化剤すなわちエラ ギン酸を含有するへＰＴＴ−剤、この場合はウソ脳の抽出物からなるＣｅｐｈｏ ｔｅｓｔＯ（ＮｙｃｏＩｌｌｅｄ　ＡＳ、　Ｎｏｒｗａｙ）を使用しても行った 。得られた値は表３に掲げる。

表　３ Ｃｅｐｈｏｔｅｓｔ［Ｆ］と合成リン脂質（ＰＬ）ｆｉ合物間の比較これらのＡ 、。５値は良好な一致を示し、互いに異なる組成の合成リン脂質、また互いに異 なる接触活性化剤を含めて、様々なリン脂質源が使用できることを示している。

例５ 例１（ａ）と同様にして、様々な百分率のＰＳを含有する血漿を、３種の異なる 基質を用い、ウシＦＩｘａを添加して一工程法でインキュベートした。

最終サンプルは、血漿含量１．１容量％、基質含量０．３ｍｍｏｌ／ｌで、Ｆ　 ＩＸ、　Ｏ，１ｎＩｌｌｏｌ、＃、Ｆ　Ｖａ　７５ｐｍｏｌ／／およびＡＰＣ２ ｎｍｏ１／Ａ’を含有した。試験した基質は、Ｓ−２８４６とＳ−２２３８（い ずれもＫａｂｉＮｉｔｒｕｍ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ、　Ｓｗｅｄｅｎ）　、 およびＮｙｃｏｍｅｄ　Ｔｈ−１であり、インキュベーション時間はそれぞれ４ 分、５分、および４分とした。

結果は図３に示す。これらの結果から、Ｓ−２８４６（−ロー）はＳ−２２３８ （−◆−）よりも、はるかに優れた基質であることがわかる。図３からはまた、 基質Ｎｙｃｏｍｅｄ　Ｔｈ−１（−〇−）（Ｎｙｃｏｍｅｄ　ＡＳ、　０ｓｌｏ 、　Ｎｏｒｗａｙ）でも良好な結果が得られることがわかる。

比較の目的で、上述の方法を、基質としてＳ−２８４６とＳ−２２３８を用い、 二段階法で実施した。すなわち、ＡＰＣを添加した血漿サンプルは、基質の添加 前にインキュベートされた。二段階法で得られた△Ａ４Ｑ３（０〜１００％）値 はそれぞれ０．８および０．６であった。すなわち、有効性には著しい差は認め られなかった。以下の基質についても一段階法で試験され、有用なことが見出さ れた〔△Ａ４０５（０〜１００％）＝０．２〜０５〕。

Ｃｈｒｏｍｏｚｙｍ　Ｔｈ：　Ｔｏｓｙｌ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐＮＡ　 （ＰｅｎｔａｐｈａｒｌＩｌ＾Ｂ、　ｅａｓｅｌ　Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）Ｓ ｐｅｃｔｒｏｚｙｍ　Ｔｈ：　ｔｌ−Ｄ−＾１ａ−Ｂｕｔ−＾ｒｇ−ｐＮＡ　（ ＡｍｅｒｉｃａｎＤｉａｇｎｏｓｔｉｃａ、　Ｇｒｅｅｎｗｉｃｈ、　Ｕ、Ｓ、 ＾、）ＣＢＳ　３４．４７：　Ｈ−Ｄ−ＣＨＧ−Ｂｕｔ−＾ｒｇ−ｐＮ＾（Ｄｉ ａｇｎｏｓｔｉｃａＳｔａｇｏ、　Ａｓｎ１ｅｒｅｓ、　Ｆｒａｎｃｅ）Ｂｅｈ ｒｉｎｇのＴｈｒｏｍｂｉｎ基質：　１ｌ−Ｄ−ＣＨ＾−Ｂｕｔ−Ａｒｇ−ｐＮ Ａ（Ｂｅｈｒｉｎｇｗｅｒｋｅ　ＡＧ、　Ｍａｒｂｕｒｇ、　Ｆｅｄｅｒａｌ　 Ｒｅｐｕｂｌｉｃ　ｏｆＧｅｒｍａｎｙ） 上に用いられた記号の意味は次の通りである。

ＣＵＴ　＝シクロへキシルチロシン ＣＨＧ＝シクロヘキシルグリシン Ｂｕｔ＝α−アミノ酪酸 ＣＩ（＾＝シクロへキシルアラニン ｐＮ＾＝ｐ−ニトロアニリン Ｔｏｓｙｌ、＝　ｐ　−トルエンスルホニル例６ ０．９％ＮａＣ１溶液に１：１に希釈した血漿サンプル１００μｌにヒトＡＰＣ １００６１を加え、サンプルを３７℃で２分間インキュベートした。ついで、計 １００ｕ／のウシＦＩＸ、、ウシＦ　Ｖ、　、ＣｅｐｈｏｔｅｓｔＯおよびＣａ Ｃｌ　２を加えた。用いた開始溶液の内容は以下の最終濃度が得られるようにし た。

Ａ　Ｐ　Ｃ１５ｎｍｏｌ＃’ Ｆ　ＩＸ　、　０．４ｒｖｏｌ／ｌ Ｆ　Ｖ　ａ　７５ｐｍｏｌ／Ａ’ Ｃｅｐｈｏｔｅｓｔ＠　４．２容量％ Ｃａ”　４．２ｍｍｏｌ／ｌ 検定には、０．５０および１００％ＰＳの血漿サンプル、すなわちプロティンＳ 欠損血漿（０％）、正常血漿（１００％）およびそれらの１：１混合物を使用し 、これを単一工程の凝固ベースの方法で実施した。これらのサンプルの凝血時間 を記録し、％ＰＳに対してプロットする（図４ニー■−）。

上述の方法と同様にして、八ＰＣで活性化しなかった血漿サンプルについても凝 血時間を記録した（図４；−△−）。

図４から明らかなように、１００％ＰＳでは０％ＰＳに比較して、凝血時間にほ ぼ６０秒の延長が達成された。この結果は、血漿含量に関して上述の方法に最も 近い既知方法（Ｐ、　Ｃｏｒａｐ　ｅｔ　ａｌ、前出：　Ｂ、　Ｄａｈｌｂａｃ ｋ、前出）で得られた結果に対して著しい改善である。上記の方法で八ＰＳの不 存在下には、０％と１００％ＰＳの間の凝血時間には差（すなわち延長）は認め られない（−△−）。

例７ ヒトプロティンＳを添加した血漿サンプルをＴｒｉｓ−緩衝液■で１：１５に希 釈した。このサンプル１００μＩに、Ｐｒ０ｔａＣ［Ｆ］Ｃ１００μ！を、プロ ティンＣを活性化する場合その濃度が０．１７Ｕ／＋１／であるように混合し、 ついでＰＣを活性化するために、サンプルを３７℃で５分間インキュベートした 。

次に、２００μｌのトロンビン基質Ｓ−２８４６を、計２００μｌのＴｒｉｓ− 緩衝液■中つシＦ　ＩＸ、　、Ｔｒｉｓ−緩衝液Ｉ中つシＦ　Ｖａ、　Ｃｅｐｈ ｏｔｅｓｔＯおよびＣａＣ１ｚとともに加えた。濃度は、以下に示す最終濃度が 得られるようにした。得られた試験溶液は３７℃で６分間インキュベートシ、つ いで２０％酢酸２００＋＋４！を加えて反応を中断させた。

この方法は、以下に示す含量のサンプル、添加成分の最終含量で実施した。

０％ＰＣ＝プロティンＣ欠損血漿 ５０％ＰＣ−正常血漿とプロティンＣ欠損血漿の等部混合物１００％ＰＣ−正常 血漿 成　分　含　量 添加プロティンＳ　Ｏ，］、１ｌＩ９／諺！Ｆ　ＩＸａ　１６ｐｍｏｌ／Ｉ Ｆ　Ｖａ７５ｐＩ８ｏ１＃ Ｃｅｐｈｏｔｅｓｔ■　４．２容量％ Ｃａ”　４．２１１１ｍｏｌ／ｌ これらの血漿について、Ａ　４　ｏ５を測定し、得られた値は図５に、ＰＣ含量 （％）に対してプロットする。図から明らかなように、良好な識別能、すなわち 、０．６５の高い△Ａ４０５（０〜１００％）値が得られた。

また、この図は生成したトロンビン量が血漿中のプロティンＣの比率と明瞭に逆 相関することを示している。

これはまた、期待されたように、血漿サンプルを、Ｐｒｏｔａｃ［Ｆ］Ｃで活性 化する前にポリクローナル抗−ＰＣ抗体と５分間ブレインキュベートすると、＾ ＰＣ活性は全く得られなかったという事実によっても支持される。

例８ 例１（ａ）の方法を正常プロティンＳ含量を示す被検者からの血漿および血栓症 患者からの血漿について行い、この方法を臨床的に検討した。比較の目的で、遊 離プロティンＳ含量は、慣用のＲＩＡ−法（「ラジオイムノアッセイ」）でも測 定した。

本発明を実施して得られた結果はそれぞれ１１５％ＰＳおよび５３％ＰＳであり 、ＲＩＡによった値、それぞれ１００％ＰＳおよび４１％ＰＳとよく一致する。

Ｆ旧１ ＦＩＧ、５ 国際調査報告 国際調査報告

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. １．血漿サンプル中の機能的に活性な遊離プロテインＳまたはプロテインＣを定 量する方法において、血漿サンプルに、凝固酵素ＦＸａの生成を促進させる凝固 酵素であるＦＩＸａを、任意に他の凝固試薬とともに添加し、サンプルをインキ ュベートし、ＦＸａによって促進される過程でプロトロンビンから生成するトロ ンビンの量を既知の方法で測定し、標品を用いて既知方法で測定したトロンビン の量に基づいて、生成したトロンビンの量に逆相関する機能的に活性なプロテイ ンＳまたはプロテインＣの比を求める方法。
2. ２．他の凝固試薬として、プロテインＳを定量する場合には、ＦＩＸａを添加す る前に活性プロテインＣ（ＡＰＣ）またはＰｒｏｔａｃ（Ｒ）Ｃを血漿サンプル に添加し、プロテインＣを定量する場合には、Ｐｒｏｔａｃ（Ｒ）Ｃおよびヒト プロテインＳを血漿サンプルに添加し、Ｐｒｏｔａｃ（Ｒ）Ｃの添加後ＦＩＸａ の添加前に血漿サンプルを好ましくはインキュベートする請求項１記載の方法。
3. ３．方法は一段階または二段階に行い、生成したトロンビンの量の測定は基質の 切断に基づく方法または凝固に基づく方法によって行う請求項１または２に記載 の方法。
4. ４．基質の切断に基づく方法を適用する場合には、色素産生トロンビン基質を使 用し、得られたトロンビンの量を光度測光法により測定する請求項１〜３に記載 の方法。
5. ５．方法を一段階で行うことを可能にする色素産生トロンビン基質を用い、その 基質は好ましくはＨ−Ｄ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐＮＡ、Ｈ−Ｄ−ＣＨＧ− Ａｌａ−Ａｒｇ−ＰＮＡ、Ｔｏｓｙｌ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐＮＡ、Ｈ■ Ｄ−ＣＨＴ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ｐＮＡまたはＨ−Ｄ−ＣＨＧ−Ｂｕｔ−Ａｒｇ− ｐＮＡである請求項４記載の方法。
6. ６．基質の切断に基づく方法を適用する場合には、最終血漿含量０．２０〜１０ 容量％、好ましくは０．１〜２容量％の血漿サンプルを使用する請求項３記載の 方法。
7. ７．ＦＩＸａはウシ起源のものである請求項１〜６に記載の方法。
8. ８．リン脂質混合物ならびに、任意に以下の凝固因子、ＦＶ、ＦＶａ、ＦＶＩＩ Ｉ、ＦＶＩＩＩａ、ＦＸおよびプロトロンビンの１種または２種以上を添加する 請求項１〜７に記載の方法。
9. ９．ＦＩＸａおよび他の凝固蛋白質は、哺乳動物起源、たとえばウシ、ヒトもし くはブタ起源のものであるか、または遺伝子組換え技術によって生成されたこれ らの因子の未変体もしくは変異体である請求項１〜８に記載の方法。 １０ＦＶＩＩＩを不活性化するために、血漿サンプルをＦＶＩＩＩに対するポリ クローナルまたはモノクローナル抗体とプレインキュベートする請求項１〜９に 記載の方法。