JPH0451154B2 - - Google Patents

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JPH0451154B2
JPH0451154B2 JP63332213A JP33221388A JPH0451154B2 JP H0451154 B2 JPH0451154 B2 JP H0451154B2 JP 63332213 A JP63332213 A JP 63332213A JP 33221388 A JP33221388 A JP 33221388A JP H0451154 B2 JPH0451154 B2 JP H0451154B2
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JP
Japan
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bacteriocin
listeria monocytogenes
food
pediococcus
pediococcus acidilactici
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JP63332213A
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Ei Bandenbaagu Piitaa
Jei Patsushii Mitsucheru
Esu Kunka Burea
Aaru Bedamusu Ebenezaa
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INDOPUKO Inc
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Publication of JPH0451154B2 publication Critical patent/JPH0451154B2/ja
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23B—PRESERVATION OF FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES; CHEMICAL RIPENING OF FRUIT OR VEGETABLES
    • A23B2/00—Preservation of foods or foodstuffs, in general
    • A23B2/70—Preservation of foods or foodstuffs, in general by treatment with chemicals
    • A23B2/725—Preservation of foods or foodstuffs, in general by treatment with chemicals in the form of liquids or solids
    • A23B2/729—Organic compounds; Microorganisms; Enzymes
    • A23B2/783—Microorganisms; Enzymes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】
〔微生物の寄託〕 この発明を実施するのに使用される好適したバ
クテリオシンは、特許手続上の微生物の寄託の国
際的承認に関するブダペスト条約の規定に基いて
アメリカ合衆国、イリノイ州、ペオリア、アスダ
のノーザン・リイジヨナル・リサーチ・ラボラト
リー（Nothern Regional Research
Laboratory）に寄託されているペジオコツク
ス・アシデイラクテイシイ（Pediococcus
acidilactici）NRRL−Ｂ−18050によつて生産さ
れる。 〔産業上の利用分野〕 この発明はバクテリオシンを用い食品中に産生
する病源体であるリステリア・モノサイトゲネス
（Listeria monocytogenes）を、この病源体によ
つて汚染されうる食品或は他の製品中で抑制する
方法に関するものである。特にこの発明はペジオ
コツクス・アシデイラクテイシイ（Pediococcus
acidilactici）から誘導されるバクテリオシンを
用い、リステリア・モノサイトゲネスによつて汚
染されうる食品或は他の製品中で同病源体を抑制
する方法に係る。 〔従来の技術〕 「バクテリオシン（bacteriocin）」なる用語は
コリシン型のタンパク質であつて生産細菌による
致死生合成、関連菌種中での内部比活性、及び感
受性細菌上での特定受容体の吸収によつて特徴付
けられるものを指す（Tagg、J.R.、A.S.Dajani、
and L.W.Wannamaker、Bacteriol.Rew.40、
722−756（1976））。バクテリオシンは数多くの細
菌によつて生産されると報告されて来ているが、
バクテリオシンによつて抑制される菌株は普通、
バクテリオシンを生産する菌株と関連したもので
ある（Gonzalez C.F.、and B.S.Kunka、Appl.
Environ.Microbiol.53、2534−2538（1987）。 本願出願人の出願に係る特願昭63−27397号に
はペジオコツクス・アシデイラクテイシイ、特に
ペジオコツクス・アシデイラクテイシイ
（Pediococcus acdiclactici）NRRL−Ｂ−18050
から誘導されるバクテリオシンの調製法と同バク
テリオシンを用い変敗性細菌、特にラクトバチル
ス・フアメンツム（Lactobacillus fermentum）
及びラクトバチルス・ビイフアメンツム
（Lactobacillus bifermentum）を抑制する方法
とが、開示されている。これらの変敗性細菌は、
ラクトバチルス属及びペジオコツクス属の乳酸生
産性菌株である、ラクトコツクス・ラクチス
（Lactococcus lactis）、ラクトコツクス・ラクチ
スの亜種ジアセチラクチス（Lactococcus lactis
subsp.diacetylactis）、ラクトコツクス・クレモ
リス（Lactococcus cremoris）（以前はストレプ
トコツクス属に分類）、或はストレプトコツク
ス・サーモフイルス（Streptococcus
thermophilus）、スタフイロコツクス・アウレウ
ス（Staphylococcus aureus）、ミクロコツク
ス・バリアンス（Micrococcus varians）、ミク
ロコツクス・ソドネンシス（Micrococcus
sodonesis）、スタフイロコツクス・キシロサス
（Staphylococcus xylosus）、スタフイロコツク
ス・エピデルミデイス（Staphylococcus
epidermidis）、スタフイロコツクス・カーノサス
（Staphylococcus carnosus）、ラクトバチルス・
アシドフイラス（Lactobacillus acidphilus）、ラ
クトバチルス・ラクチス（Lactobacilluls
lactis）、及びラクトバチルス・ブルガリカス
（Lactobacillus bulgaricus）に対する活性は見
出せなかつた。このため上記したバクテリオシン
はグラム陽性乳酸菌といつた限られた範囲の細菌
に対する抑制活性を有すると、結論された。 リステリア・モノサイトゲネス（Listeria
monocytogenes）は汚染食品中に導入されるこ
とが示されて来ている（J.Appied Bact.63、１
−11（1987））。バクテリオシン培養物はPHに対し
敏感であり酸性下では普通、上記した微生物の成
長を抑制するが、食品についてPHが十分に酸性で
ない場合が多い。 リステリア・モノサイトゲネス（Listeria
monocytogenes）は、動物及び人類に重い病気
を生じさせる。この病気及び本菌種は、J.
Applied Bact.63、１−11（1987）に記載されて
いる。リステリア・モノサイトゲネスは冷凍温度
でもよく成長し、このため冷凍により成長を抑制
するといつた通常の手段はリステリア・モノサイ
トゲネスについては効果がない。このことから流
通市場での問題が生じ、その一例としてはいくつ
かの銘柄のリステリア（Listeria）汚染アイスク
リーム・バーの回収といつた、最近公けになつた
問題がある。Bergey′s Manual of Systematic
Bacteriology、Vol2、1235−1245（1986）による
と、他の属に関連してのリステリアイ
（Listeria）属の分類学上の位置はまだ決定され
ていないとされている。しかしながらリステリ
ア・モノサイトゲネス（Listeria
monocytogenes）がラクトバチルス
（Lactobacillus）、スタフイロコツクス
（Staphylococcus）、ミクロコツクス
（Micrococcus）、ペジオコツクス
（Pediococcus）及びストレプトコツクス
（Streptococcus）属の菌種と全く異なつたもので
あることは明確である。 〔発明課題〕 したがつてこの発明の目的とするところは、リ
ステリア・モノサイトゲネス（Listeria
monocytogenes）によつて汚染されうる食品或
は他の製品中で同病源体を、バクテリオシンを用
いて抑制する方法を提供するにある。またこの発
明は、単純で経済的に実施できる上記病源体の抑
制方法を提供することも目的としている。 〔一般的な説明〕 この発明はリステリア・モノサイトゲネス
（Listeria monocytogenes）により汚染されうる
食品或は他の組成物中でリステリア・モノサイト
ゲネスの生育を抑制する方法に係り、同方法はペ
ジオコツクス・アシデイラクテイシイ
（Pediococcus acidilactici）中でバクテリオシン
生産遺伝暗号を担持するDNAから得られたバク
テリオシンを上記した食品或は他の組成物中に、
リステアリ・モノサイトゲネスを抑制するのに有
効な量だけ導入することを特徴とする。 この発明はまた、リステリア・モノサイトゲネ
ス（Listeria monocytogenes）を汚染物として
含みうる食品中でリステリア・モノサイトゲネス
を抑制する方法に係り、同方法はペジオコツク
ス・アシデイラクテイシイ（Pediococcus
acidilactici）中でバクテリオシン生産遺伝暗号
を担持するDNAを含む細菌から得られたバクテ
リオシンを上記食品中に、リステリア・モノサイ
トゲネスを抑制するのに有効な量だけ添加するこ
とを特徴とする。好ましいバクテリオシンはPA
−１である。 この発明に用いられる好ましいバクテリオシン
PA−１はアメリカ合衆国、イリノイ州、ペオリ
アのノーザン・リイジヨナル・リサーチ・ラボラ
トリー（Nothern Regional Research
Laboratory）に寄託されPAC1.0といつた名称で
も知られているペジオコツクス・アシデイラクテ
イシイ（Pediococcus acidilactici）NRRL−Ｂ
−18050によつて生産される。ペジオコツクス・
アシデイラクテイシイは、食肉の発酵に使用され
ている市販の菌種である。この好ましい菌種は、
バクテリオシン生産遺伝暗号を担持する9.4キロ
塩基対（6.2Mdal）のプラスミドを含んでいる。
周知の遺伝子組換え技術を用い、バクテリオシン
生産遺伝暗号を担持するDNA遺伝子断片を切断
してベクターと結合させ、他の微生物中へと挿入
して該他の微生物にバクテリオシンを生産させる
ことができる。 PA−１のようなバクテリオシンを作製する最
も簡単な方法は、細胞増殖後にバクテリオシンを
含む増殖培地を乾燥して粉末にすることである。
固形分は増殖培地から、過または遠心分離法に
よつて除去できる。低分子量の化合物は膜過、
特に逆浸透法によつて除去できる。無脂乾燥乳
（non−fat dry milk、NFDM）のような食品等
級の乾燥助剤を、バクテリオシンを含む溶液を乾
燥させるために使用することができる。バクテリ
オシンはタンパク質性の物質であり沈澱法によつ
て、或は逆浸透法のような他の公知の方法によつ
て、増殖培地から分離することもでき、その分離
物を次いで純粋な形のものへと乾燥できる。バク
テリオシンは約16500ダルトンの分子量を有し、
試験管内（イン・ビトロ）でプロテアーゼ、パパ
イン或はアルフアーキモトリプシンを混合するこ
とによつて不活性化され、ホスホリパーゼ Ｃ、
リソチーム、DNアーゼ（DNase）及びRNアー
ゼ（RNase）或は水中での100℃への加熱によつ
ては影響を受けず、約４−９間のPH範囲でリステ
リア・モノサイトゲネス（Listeria
monocytogenes）を抑制する。本バクテリオシ
ンの調製法と特性は、前述した特開平１−202277
号公報に述べられている。 食品中で用いるバクテリオシンの望ましい量
は、食品１グラム当りPA−１のようなバクテリ
オシン１−100000任意単位（Arbitrary Unit、
AU）である。バクテリオシンの1AUは寒天平板
上のグラム陽性細菌の指示株（公式にはペジオコ
ツクス・セレビシエー（Pediococcus
cerevisiae）FBB−63として知られているペジオ
コツクス・ペントサセウス（Pediococcus
pentosaceus）FBB−63）の密生地（lawn）に
ついて明白な生育抑制領域（ａ definite zone
of growth inhibition）をなお生じさせるところ
の、培養物上澄液の最大希釈液（highes
dilution）5μと、定義された。 リステリア・モノサイトゲネス（Listeria
monocytogenes）により最も汚染され易い食品
は乳類を基材料とするチーズ、アイスクリーム或
はアイスミルク、及びコテージチーズである。機
械で処理され最終包装時に熱処理されない食品
は、特に汚染され易い。牛肉、豚肉或は家禽肉の
ような肉類は、屠殺中或は屠殺後に汚染されう
る。魚も処理中に汚染されうる。 詰め物、潤滑剤、包帯、培養基等を含む医療用
及び獣医用製品は、リステリア・モノサイトゲネ
ス（Listeria monocytogenes）で汚染されうる。
また化粧品及びそれに関連した他の製品も、本病
源体で汚染されうる。食品及び経口摂取される他
の製品において危害が最大であるも、上述のよう
な製品においてもペジオコツクス・アシデイラク
テイシイ（Pediococcus acidilactici）から誘導
されたバクテリオシンは問題とする病源体を抑制
するのに有用である。これらの製品は全て、生体
外或は生体内で生組織と接触して病気を発生させ
うる。 〔図面に結果を示した試験の説明〕 第１図は指数増殖期のリステリア・モノサイト
ゲネス（Listeria monocytogenes）培養物に対
し、ペジオコツクス・アシデイラクテイシイ
（Pediococcus acidilactici）由来のPA−１と称
してあるバクテリオシンを含む粉末を添加するこ
との効果を示している。リステリア・モノサイト
ゲネス培養物に対しPA−１粉末を200U（単
位）／mlまたは500U／mlの割合で添加し、濁度
（これは細胞の個数を示す指標となる。）を波長
660ナノメータで時間の関数として測定した。記
号中、黒丸は標準（PA−１を添加せず）、白丸は
200U／mlPA−１を、白抜き正方形は500U／ml
PA−１を、それぞれ示している。 第２図は、ペジオコツク・アシデイラクテイシ
イ（Pediococcus acidilactici）NRRL−Ｂ−
18050（PAC1.0ともいう。）中でバクテリオシン
PA−１の生産遺伝暗号を担持するプラスミド
pSRQ11の制限エンドヌクレアーゼ地図を、示し
ている。9.4キロ塩基対のプラスミドpSRQ11は、
数個の制限エンドヌクレアーゼ部位の位置で示さ
れている。バクテリオシンPA−１遺伝子の担持
領域のおおまかな位置が示されている。PA−１
遺伝子中に４個の制限部位Hind、Xba、Cla
、Pvuが見出された。 〔明細な説明〕 バクテリオシンの製造のために用いた方法と材
料は、次の通りであつた。 菌株：ペジオコツクス・アシデイラクテイシイ
（Pediococcus acidilactici）NRRL−Ｂ−
18050を、常法に従い35℃で成長させMRSブロ
ス（アメリカ合衆国、ミシガン州、デトロイト
のDifco社製）で培養した。 バクテリオシンの検定：バクテリオシンの産生
を、細胞或はフイルター滅菌後のブロス試料を
MRS寒天（Difco社製）上に滴下することによ
り検定した。活性度を検定するためフイルター
滅菌後のブロス試料を系列希釈（無菌水中に
１：１、１：２、１：４、１：８、１：16）に
より希釈した。指示細胞（ペジオコツクス・ペ
ントサセウス（Pediococcus pentosaceus）
FBB63C）を接種されている軟寒天（0.75％）
で検定平板をおおつた。これらの検定平板につ
いて32℃で18時間、培養を行なつた。 例 １ 栄養学的な研究 第１表に掲げた培地をそれぞれ、100ml量調製
した。 培地をオートクレーブ処理前にPH6.8に調整し
た。培地にNRRL−Ｂ−18050の８時間培養物を
１％の割合で植菌し、次いで35℃で18時間培養し
た。18時間後に培養物の25mlを４℃で10分間、
12000×ｇで遠心分離処理した。次に上澄液を
0.22ミクロンフイルター（アメリカ合衆国、マサ
チユウセツツ州、ベツドフオードのMillipore社
製）を用いてフイルター滅菌し、指示菌株として
のペジオコツクス・ペントサセウス
（Pediococcus pentosaceus）FBB63Cを阻害す
る最小希釈度（力価）について試験した。 栄養学的な研究の結果を、第１表に要約して掲
げる。
【表】
【表】
【表】 以上の第１表中に掲げたHY−CASE、HY−
SOY、Ｎ−Ｚ AMINE TYPE AS、
PEPTICASE、PRIMATONE、PRIMAGEN、
ALBUTONE、EDAMIN TYPE Ｓ、及び
TRYPTONEはタンパク質補充物である。 バクテリオシンPA−１の生産に対し最も有効
な培地は酵母エキス２％を補充したRMSブロス
であるように考えられる。他の培地はそれほどは
有効でないが、タンパク質補充物は一般にバクテ
リオシンの生産を促進すると認めれられる。ホエ
ー基体の培地はバクテリオシンPA−１の生産に
対し、有効性が最も低い。 例 ２ 乾燥バクテリオシンPA−１の製造 ペジオコツクス・アシデイラクテイシイ
（Pediococcus acdilactici）NRRL−Ｂ−18050
を、酵母エキス（Difco社製）２％を補充した１
のMRSブロス中におき35℃で１晩、増殖させ
た。細胞を遠心分離によりペレツト化し、上澄液
を集めた。乾燥を促進するために無脂乾燥乳粉を
10％（重量／容量）まで添加した。次にこの混合
物を凍結乾燥して乾燥粉末とした。 例 ３ コテージチーズ中のリステリア・モノサイトゲ
ネスに対するペジオコツクス・アシデイラクテ
イシイNRRL−Ｂ−18050由来のバクテリオシ
ン（PA−１）の活性 クリームドレツシングを混合したコテージチー
ズ（PH5.1）に対しその１グラム当り、6.5×
103cfu（コロニー形成単位）の割合でリステリ
ア・モノサイトゲネス（Listeria
monocytogenes）を加えた。例２のバクテリオ
シン粉末（PA−１）を同コテージチーズに対し、
10または50U（単位）／ｇコテージチーズの割合
で添加した。試料を混合し４℃で養生し、複数の
画分を取出しMcBride′s Agar（Difco社）に植菌
して32℃で培養して、リステリア・モノサイトゲ
ネスの生育について調べた。 第２表に結果を示す。
【表】 例 ４ ハーフ・エンド・ハーフ クリーム中のリステ
リア・モノサイトゲネスに対するバクテリオシ
ン（PA−１）の活性 ハーフ・エンド・ハーフ クリーム（PH6.7）
に対しリステリア・モノサイトゲネス（Listeria
monocytogenes）を4.3×103cfu／mlクリームの
割合で加えた。同クリームに対しバクテリオシン
粉末PA−１を、50U／mlクリームの割合で添加
した。試料を混合して４℃で培養し、複数画分を
採取しリステリア・モノサイトゲネスの生育につ
いて調べた。 結果を第３表に示す。
【表】 例 ５ チーズソース中のリステリア・モノサイノゲネ
スに対するバクテリオシン（PA−１）の活性 チーズソース（PH5.25）に対しリステリア・モ
ノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）を、
5.3×103cfu／ｇチーズソースの割合で加えた。
このチーズソースにバクテリオシン粉末PA−１
を10または50U／ｇソースの割合で添加した。試
料を混合して４℃で培養し、複数画分を採取して
リステリア・モノサイトゲネスの生育について調
べた。結果を第４表に示す。
【表】 例３−５から判明するようにバクテリオシン
PA−１は食品中で、種々のPH値においてリステ
リア・モノサイトゲネス（Listeria
monocytogenes）の生育を制御するのに有効で
あつた。クリームに関する例４ではPHが最初6.7
であり、リステリアが抑制された。チーズソース
に関する例５ではPHが5.25で、僅かに酸性であつ
た。これらの２例の両者及びコテージチーズに関
する例において、リステリア・モノサイトゲネス
が抑制された。 例 ６ リステリア・モノサイトゲネスの指数増殖期培
養物に対するバクテリオシン粉末PA−１の効
果 リステリア・モノサイトゲネス（Listeria
monocytogenes）の指数増殖期培養物に対し無
菌のPA−１バクテリオシン粉末を、ブロス１ml
当り200U及び500Uの割合で加えた。リステリ
ア・モノサイトゲネスをAPTブロス中におき32
℃で養生した。660nｍでの吸光度を、時間の関
数として測定した。第１図はその測定結果を示し
ており、培養物に対し無菌のPA−１粉末を加え
たとき3.75時間後に660nｍでの吸光度が減少し始
めたのに対し、対象では増加し続けたこと、つま
り濁度が増して行つたことが示されている。この
結果はリステリア・モノサイトゲネスに対しバク
テリオシンPA−１が、単に阻害生のものである
ばかりでなく殺菌性のものでもあることを示して
いる。 例 ７ リステリア・モノサイトゲネスに対するバクテ
リオシンPA−１の最小抑制濃度（MIC）と最
小殺菌濃度（MBC） バクテリオシンPA−１粉末をAPTブロスに溶
かし、２倍希釈を系列的に行つて1000U／mlから
2.0U／mlの範囲の濃度のものを得た。各試料に
１ml当り約１×103細胞のリステリア・モノサイ
トゲネス（Listeria monocytogenes）を加え、
32℃で24時間培養した。MIC値は視認しうる濁
りを示さない最小濃度の試料の濃度とした。
MBC値は、APT寒天上で平板培養したとき集落
形成単位（CFU）を出現させなかつた最小濃度
の試料の濃度とした。結果を、第５表に要約して
掲げる。
【表】 第５表に示されている通りリステリア・モノサ
イトゲネス（Listeria monocytogenes）はPA−
１バクテリオシンに対し極めて感受性であり、そ
の程度は指示菌株ペジオコツクス・ペントサセウ
ス（Pediococcus pentosaceus）FBB63Cよりむ
しろ大きい。 例 ８ ペジオコツクス・アシデイラクテイシイ
（Pediococcus acidilactici）NRRL−Ｂ−18050
からプラスミドDNAを単離し、既報告の方法
（Gonzalez、C.F.、and B.S.Kunka、Appl.
Environ.Microbiol.46、81−89（1983））に従つて
DNA試料を寒天ゲル電気泳動にかけた。第２図
に示すプラスミドpSRQ11の制限酵素地図を、
（）２種の酵素による消化後に得たDNA断片の
分析、（）0.7％アガロース・5.0％ポリアクリ
ルアミド・ゲル電気泳動法によるDNA断片の分
析といつた手法を組合せて作成した。 16500ダルトンといつたバクテリオシンPA−１
の概略の分子量からしてバクテリオシンPA−１
の生産を司どる遺伝子はプラスミドpSRQ11上
で、1.6kbのNde部位と3.2kbのCla部位との
間の450bp断片にエンコードされていると認めら
れる（第２図）。 バクテリオシン（PA−１）は中性に近いPH値
でさえ有効であつた。バクテリオシン（PA−１）
がリステリア・モノサイトゲネス（Listeria
monocytogenes）を抑制することは、（）リス
テリア・モノサイトゲネスがヒトに対する病源菌
であること、（）リステリア・モノサイトゲネ
スの生態学的地位がペジオコツクス・アシデイラ
クテイシイ（Pediococcus acidilactici）に近接
していないことからして、予想外であつた。
【図面の簡単な説明】
第１図はリステリア・モノサイトゲネスの培養
物について吸光度を測定した試験結果を示すグラ
フ、第２図はベンジオコツクス・アシデイラクテ
イシイ中のプラスミドpSRQ11の制限酵素地図で
ある。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ リステリア・モノサイトゲナス（Listeria
    monocytogenes）によつて汚染されうる食品或
    は他の製品中でリステリア・モノサイトゲネスの
    生育を抑制する方法であつて、ペジオコツクス・
    アシデイラクテイシイ（Pediococcus
    acidilactici）中でバクテリオシン生産遺伝暗号
    を担持するDNAから得られたバクテリオシンを
    上記した食品或は他の製品中に、リステリア・モ
    ノサイトゲネスを抑制するのに有効な量だけ導入
    することを特徴とする方法。 ２ 請求項１に記載の方法において、前記バクテ
    リオシンが約16500ダルトンの分子量を有し、試
    験管内でプロテアーゼ、パパイン或はアルフアー
    キモトリプシンを混合することによつて不活性化
    され、ホスホリパーゼ、Ｃ、リソチーム、DNア
    ーゼ及びRNアーゼ或は水中での100℃への加熱
    によつては影響を受けず、約PH４−９間のPH範囲
    でリステリア・モノサイトゲネス（Listeria
    monocytogenes）を抑制する能力をもつもので
    ある方法。 ３ 請求項１に記載の方法において、前記バクテ
    リオシンが前記したペジオコツクス・アシデイラ
    クテイシイ（Pediococcus acidilactici）用の増
    殖培地から抽出した水溶液の形で生産されたもの
    であり、上記増殖培地がバクテリオシンの生産を
    促進するアミノ酸源を含むものである方法。 ４ 請求項３に記載の方法において、前記した増
    殖培地中のアミノ酸源が酵母エキスである方法。 ５ 請求項３に記載の方法において、前記水溶液
    を乾燥助剤と共に乾燥させて流動性の粉末を得、
    この粉末を食品に添加する方法。 ６ 請求項５に記載の方法において、前記乾燥助
    剤が無脂乾燥乳である方法。 ７ 請求項６に記載の方法において、前記粉末が
    １グラム当り約１−100000AUのバクテリオシン
    を含むものである方法。 ８ 請求項１から７までの何れか一項に記載の方
    法において、前記したペジオコツクス・アシデイ
    ラクテイシイ（Pediococcus acidilactici）が前
    記DNAを、バクテリオシンの生産遺伝暗号を担
    持する9.4キロ塩基対のプラスミドとして含むも
    のである方法。 ９ 請求項１から７までの何れか一項に記載の方
    法において、前記したペジオコツクス・アシデイ
    ラクテイシイがペジオコツクス・アシデイラクテ
    イシイ（Pediococcus acidilactici）NRRL−Ｂ
    −18050である方法。 １０ 請求項１に記載の方法において、前記バク
    テリオシンが、前記したペジオコツクス・アシデ
    イラクテイシイ（Pediococcus acidilactici）を
    増殖させた増殖培地から抽出されたところのバク
    テリオシンを含む水溶液を乾燥させて得られた粉
    末状のものである方法。 １１ 請求項１に記載の方法において、前記バク
    テリオシンが、前記したペジオコツクス・アシデ
    イラクテイシイ（Pediococcus acidilactici）の
    増殖培地を膜過して低分子量化合物を除去し得
    られたものである方法。 １２ 請求項１１に記載の方法において、前記バ
    クテリオシンが凍結乾燥された粉末状のものであ
    る方法。 １３ 請求項１に記載の方法において、前記バク
    テリオシンが、前記したペジオコツクス・アシデ
    イラクテイシイ（Pediococcus acidilactici）の
    水性増殖培地から分離され乾燥されたものである
    方法。 １４ 請求項１に記載の方法において、前記
    DNAがバクテリオシン生産遺伝暗号を担持する
    プラスミドである方法。 １５ リステリア・モノサイトゲネス（Listeria
    monocytogenes）を汚染物として含みうる食品
    中でリステリア・モノサイトゲネスの生育を抑制
    する方法であつて、ペジオコツクス・アシデイラ
    クテイシイ（Pediococcus acidilactici）中でバ
    クテリオシン生産遺伝暗号を担持するDNAを含
    む細菌から得られたバクテリオシンを上記食品中
    に、リステリア・モノサイトゲネスを抑制するの
    に有効な量だけ添加するこを特徴とする方法。 １６ 請求項１５に記載の方法において、前記バ
    クテリオシンを食品中に、前記したペジオコツク
    ス・アシデイラクテイシイ（Pediococcus
    acidilactici）を増殖させた増殖培地から抽出し
    た水溶液の形で添加する方法。 １７ 請求項１５に記載の方法において、前記し
    たペジオコツクス・アシデイラクテイシイ
    （Pediococcus acidilactici）を増殖させた増殖培
    地から抽出され前記バクテリオシンを含む水溶液
    を乾燥助剤と共に、或は乾燥助剤なしで乾燥して
    流動性の粉末を得、この粉末を食品に添加する方
    法。 １８ 請求項１５に記載の方法において、前記バ
    クテリオシンを食品に対し、食品１グラム当り約
    １−100000AUだけ添加する方法。 １９ 請求項１５に記載の方法において、前記し
    た食品が乳、乳誘導物、食肉、またはコテージチ
    ーズを含めてのチーズの何れかを含むものである
    方法。 ２０ 請求項１５に記載の方法において、前記し
    た食品が調製されたサラダ、食肉、コテージチー
    ズを含めてのチーズ、アイスミルク、またはアイ
    スクリームの何れかである方法。
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