JPH0452114B2 - - Google Patents
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- JPH0452114B2 JPH0452114B2 JP59181295A JP18129584A JPH0452114B2 JP H0452114 B2 JPH0452114 B2 JP H0452114B2 JP 59181295 A JP59181295 A JP 59181295A JP 18129584 A JP18129584 A JP 18129584A JP H0452114 B2 JPH0452114 B2 JP H0452114B2
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- Japan
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- enzyme
- glycine
- activity
- manganese
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
〔産業上の利用分野〕
本発明は、酵素の製造方法に関し、更に詳細に
は、グリシンおよび／またはマンガン化合物を培
地に加えて微生物を培養し、微生物が生産する生
理活性物質の生産量を増加させ、特に、該生理活
性物質の菌体外への排出（分泌）を促進する方法
に関する。 〔従来技術〕 一般に、細菌や酵母等の微生物を培養して、酵
素等の高分子生理活性物質を製造する方法は周知
である。このような高分子生理活性物質は、微生
物の菌体内で生産され、通常は、菌体外に排出
（分泌）されることなく、ほとんど菌体内に蓄積
される。このため高分子生理活性物質を取り出す
ためには、集菌した菌体を超音波処理等により破
砕し、遠心分離等により目的物を分離、精製する
必要がある。このような機械的破砕操作は、時間
や労力の損失となるばかりでなく、生産物を変質
させるおそれもあり、好ましくない。 ところで菌体内に生産物が一定量蓄積される
と、その生産は当然停止する。しかし、これが菌
体内に蓄積されることなく、菌体外に排出（分
泌）されれば、その生産は継続して行われるはず
である。このため、菌体内で生産された生産物を
菌体外に排出（分泌）させ、菌体内生産を継続さ
せ、菌体外に著量の生産物を蓄積させようとする
試みがなされている。たとえば、掘越らは、ペニ
シリナーゼ、キシラナーゼ等の高分子物質の菌体
外生産に関与する遺伝情報を担うバチルス属微生
物の染色体DNA断片を組み込んだプラスミドを
含有する前記高分子物質の菌体外生産能を有する
エシエリヒア属の微生物をNa塩又はＫ塩含有倍
地で培養して、前記高分子物質を菌体外に分泌さ
せることに成功している（特開昭59−162874号及
び特開昭60−126077号公報参昭）。 〔発明の目的〕 本発明の目的は、微生物が生産する有用な生理
活性物質の生産量を増大させる方法を提供するこ
とである。さらに本発明の目的は、微生物の菌体
内で生産される有用な生理活性物質を、菌体外に
排出（分泌）させ、それによつて培地中に著量の
生産物を蓄積させる方法を提供することである。 〔発明の構成〕 本発明の目的は、菌体内に酵素を産生する微生
物を、マンガン化合物及びグリシンからなる群か
ら選ばれる少なくとも１種の化合物を含む培地で
あつて、マンガン化合物のみを含む場合にはその
含有量が0.5μM以上であり、グリシンのみを含む
場合にはその含有量が0.5％以上である培地で培
養し、菌体内に産生する酵素量を増加させ、且つ
該酵素の菌体外への排出（分泌）を促進させ、培
地から該酵素を採取することを特徴とする該酵素
の製造方法により達成される。 本発明に使用される微生物として特に好ましい
ものは細菌および酵母である。 細菌としては、たとえば、グラム陽性好アルカ
リ性細菌であるバチルス（Bacillus）No.Ａ−59
（ATCC21591）（アルカリアミラーゼ生産菌とし
て分離された。Agric.Biol.Chem.Vol.36、1819
頁、1972年）、グラム陽性好アルカリ性細菌であ
るバチルス（Bacillus）No.Ｃ−125（FERM BP−
469）（β−ガラクトシダーゼ生産菌、Agric.
Biol.Chem.Vol.43、85頁および1359頁、1979
年）、エシエリヒア・コリ（Escherichia coli）
HB 101（Molecular Cloning ａ laboratory
manual CSH Lab.1982、504頁、Leu、Pro、
Thiamine要求性）、酵母としては、パン酵母
（オリンタル酵母(株)製）などが挙げられる。 本発明に使用することができる微生物は、上記
具体例に限定されるものではなく、グリシンおよ
び／またはマンガン化合物を加えた培地中で培養
することにより、菌体生産物の総生産量を増加
し、菌体生産物を菌体外に排出し、著量に蓄積す
るものであれば、既存の培養菌株、自然界から新
たに分離された菌株、あるいはこれらの菌株の変
異株、さらに、遺伝子組換や細胞融合によつて新
たに酵素等の有用生理活性物質生産能力を獲得す
るに至つた微生物など、いずれも使用することが
できる。 本発明に使用されるマンガン化合物としては、
たとえば、硫酸マンガン、塩化マンガン、硝酸マ
ンガン、炭酸マンガン、ケイ酸マンガン、ピロリ
ン酸マンガン、リン酸水素マンガン等の無機酸
塩、酢酸マンガン、酒石酸マンガン、シユウ酸マ
ンガン、クエン酸マンガン等の有機酸塩などが挙
げられる。 本発明において、グリシンの添加量は、培地に
対して0.5〜10重量％、好ましくは0.5〜3.0重量％
が適当である。これより少ないと目的とする効果
の発現が不十分であり、またこれより多いと逆に
微生物の生育阻害が顕著になり、好ましくない。 一方、マンガン化合物の添加量は、培地に対し
て0.5μM以上であればよい。これより少ないと目
的とする効果の発現が不十分である。なおマンガ
ン化合物の毒性は低いため、かなりの濃度（例え
ば100mM）に増加させても生育阻害は認められ
ない。 本発明に使用する微生物の培養培地としては、
通常、微生物の培養に使用される培地に、グリシ
ンおよび／またはマンガン化合物を添加したもの
で使用される。すなわち、炭素源、窒素源、無機
物、その他栄養物を程良く含有する培地であれ
ば、合成培地、天然培地のいずれもが使用でき
る。炭素源、窒素源は、使用菌が利用可能なもの
であればいずれの種類を用いてもよい。無機塩、
ビタミン類等についても、微生物の培地に通常使
用されるものを使用することができる。 以下、実施例を示し、本発明をさらに詳細に説
明するが、本発明はこれらの実施例の記録に限定
されるものではない。 実施例 １ 好アルカリ性バチルスNo.59（ATCC21591）を使
用し、α−グルコシダーゼ活性について調べた。 900mlの井戸水に、可溶性でんぷん15ｇ、ポリ
ペプトン５ｇ、イーストエキス（デイフコ社製）
５ｇ、リン酸二カリウム１ｇ、硫酸マグネシウ
ム・７水和物0.2ｇおよび所定量のグリシンおよ
び／またはマンガン化合物を加えた培地、および
炭酸ナトリウム水溶液（100ｇ／）を別別に調
製し、殺菌した。植菌時１／10量の炭酸ナトリウ
ム溶液を前記培地に無菌的に加えて、種培地およ
び本培地とする。 300mlの４個ひだ付三角フラスコに培地50mlを
入れ、これに、あらかじめ１晩培養したもの0.2
mlを植菌して、37℃で所定時間、振とう培養（ロ
ータリーシエーカー、200RPM）し、２mlずつ無
菌的にサンプリングする。サンプルの一部をその
まま10〜30倍に希釈して全酵素活性を測定する。
サンプルの残部は遠心分離し、上澄液を５〜30倍
して、培地中に排出（分泌）された酵素の活性を
測定する。 酵素活性は、次のように測定する。まず、ｐ−
ニトロフエニルα−Ｄ−グルコシド2mM、PH7.5
のリン酸緩衝液40mM、酵素液0.03〜0.1mlを含む
総量0.5mlの液に、基質を加えて反応を開始し、
恒温槽中、40℃、10分間往復振とう後、1M炭酸
ナトリウム0.1mlを加えて反応を停止する。これ
に蒸留水３mlを加えて希釈攪拌し、420nmの吸収
を測定し、あらかじめ作成しておいた標準曲線か
ら、酵素活性を求める。１分間に１マイクロモル
のｐ−ニトロフエノールを生産する酵素量を１単
位とする。 全酵素活性すなわち、培地中の酵素と菌体中の
酵素の全活性は、培養液全体を希釈し、細胞膜を
透過性にするためトルエン１滴を加えて、５分後
から、酵素反応を開始し、反応停止後、遠心分離
（3000RPM、５分間）によつて菌体を除去し、上
澄液について酵素活性を測定することにより求め
る。培地中の酵素活性を全酵素活性で除したもの
を排出度とする。結果を第１表に示す。
は、グリシンおよび／またはマンガン化合物を培
地に加えて微生物を培養し、微生物が生産する生
理活性物質の生産量を増加させ、特に、該生理活
性物質の菌体外への排出（分泌）を促進する方法
に関する。 〔従来技術〕 一般に、細菌や酵母等の微生物を培養して、酵
素等の高分子生理活性物質を製造する方法は周知
である。このような高分子生理活性物質は、微生
物の菌体内で生産され、通常は、菌体外に排出
（分泌）されることなく、ほとんど菌体内に蓄積
される。このため高分子生理活性物質を取り出す
ためには、集菌した菌体を超音波処理等により破
砕し、遠心分離等により目的物を分離、精製する
必要がある。このような機械的破砕操作は、時間
や労力の損失となるばかりでなく、生産物を変質
させるおそれもあり、好ましくない。 ところで菌体内に生産物が一定量蓄積される
と、その生産は当然停止する。しかし、これが菌
体内に蓄積されることなく、菌体外に排出（分
泌）されれば、その生産は継続して行われるはず
である。このため、菌体内で生産された生産物を
菌体外に排出（分泌）させ、菌体内生産を継続さ
せ、菌体外に著量の生産物を蓄積させようとする
試みがなされている。たとえば、掘越らは、ペニ
シリナーゼ、キシラナーゼ等の高分子物質の菌体
外生産に関与する遺伝情報を担うバチルス属微生
物の染色体DNA断片を組み込んだプラスミドを
含有する前記高分子物質の菌体外生産能を有する
エシエリヒア属の微生物をNa塩又はＫ塩含有倍
地で培養して、前記高分子物質を菌体外に分泌さ
せることに成功している（特開昭59−162874号及
び特開昭60−126077号公報参昭）。 〔発明の目的〕 本発明の目的は、微生物が生産する有用な生理
活性物質の生産量を増大させる方法を提供するこ
とである。さらに本発明の目的は、微生物の菌体
内で生産される有用な生理活性物質を、菌体外に
排出（分泌）させ、それによつて培地中に著量の
生産物を蓄積させる方法を提供することである。 〔発明の構成〕 本発明の目的は、菌体内に酵素を産生する微生
物を、マンガン化合物及びグリシンからなる群か
ら選ばれる少なくとも１種の化合物を含む培地で
あつて、マンガン化合物のみを含む場合にはその
含有量が0.5μM以上であり、グリシンのみを含む
場合にはその含有量が0.5％以上である培地で培
養し、菌体内に産生する酵素量を増加させ、且つ
該酵素の菌体外への排出（分泌）を促進させ、培
地から該酵素を採取することを特徴とする該酵素
の製造方法により達成される。 本発明に使用される微生物として特に好ましい
ものは細菌および酵母である。 細菌としては、たとえば、グラム陽性好アルカ
リ性細菌であるバチルス（Bacillus）No.Ａ−59
（ATCC21591）（アルカリアミラーゼ生産菌とし
て分離された。Agric.Biol.Chem.Vol.36、1819
頁、1972年）、グラム陽性好アルカリ性細菌であ
るバチルス（Bacillus）No.Ｃ−125（FERM BP−
469）（β−ガラクトシダーゼ生産菌、Agric.
Biol.Chem.Vol.43、85頁および1359頁、1979
年）、エシエリヒア・コリ（Escherichia coli）
HB 101（Molecular Cloning ａ laboratory
manual CSH Lab.1982、504頁、Leu、Pro、
Thiamine要求性）、酵母としては、パン酵母
（オリンタル酵母(株)製）などが挙げられる。 本発明に使用することができる微生物は、上記
具体例に限定されるものではなく、グリシンおよ
び／またはマンガン化合物を加えた培地中で培養
することにより、菌体生産物の総生産量を増加
し、菌体生産物を菌体外に排出し、著量に蓄積す
るものであれば、既存の培養菌株、自然界から新
たに分離された菌株、あるいはこれらの菌株の変
異株、さらに、遺伝子組換や細胞融合によつて新
たに酵素等の有用生理活性物質生産能力を獲得す
るに至つた微生物など、いずれも使用することが
できる。 本発明に使用されるマンガン化合物としては、
たとえば、硫酸マンガン、塩化マンガン、硝酸マ
ンガン、炭酸マンガン、ケイ酸マンガン、ピロリ
ン酸マンガン、リン酸水素マンガン等の無機酸
塩、酢酸マンガン、酒石酸マンガン、シユウ酸マ
ンガン、クエン酸マンガン等の有機酸塩などが挙
げられる。 本発明において、グリシンの添加量は、培地に
対して0.5〜10重量％、好ましくは0.5〜3.0重量％
が適当である。これより少ないと目的とする効果
の発現が不十分であり、またこれより多いと逆に
微生物の生育阻害が顕著になり、好ましくない。 一方、マンガン化合物の添加量は、培地に対し
て0.5μM以上であればよい。これより少ないと目
的とする効果の発現が不十分である。なおマンガ
ン化合物の毒性は低いため、かなりの濃度（例え
ば100mM）に増加させても生育阻害は認められ
ない。 本発明に使用する微生物の培養培地としては、
通常、微生物の培養に使用される培地に、グリシ
ンおよび／またはマンガン化合物を添加したもの
で使用される。すなわち、炭素源、窒素源、無機
物、その他栄養物を程良く含有する培地であれ
ば、合成培地、天然培地のいずれもが使用でき
る。炭素源、窒素源は、使用菌が利用可能なもの
であればいずれの種類を用いてもよい。無機塩、
ビタミン類等についても、微生物の培地に通常使
用されるものを使用することができる。 以下、実施例を示し、本発明をさらに詳細に説
明するが、本発明はこれらの実施例の記録に限定
されるものではない。 実施例 １ 好アルカリ性バチルスNo.59（ATCC21591）を使
用し、α−グルコシダーゼ活性について調べた。 900mlの井戸水に、可溶性でんぷん15ｇ、ポリ
ペプトン５ｇ、イーストエキス（デイフコ社製）
５ｇ、リン酸二カリウム１ｇ、硫酸マグネシウ
ム・７水和物0.2ｇおよび所定量のグリシンおよ
び／またはマンガン化合物を加えた培地、および
炭酸ナトリウム水溶液（100ｇ／）を別別に調
製し、殺菌した。植菌時１／10量の炭酸ナトリウ
ム溶液を前記培地に無菌的に加えて、種培地およ
び本培地とする。 300mlの４個ひだ付三角フラスコに培地50mlを
入れ、これに、あらかじめ１晩培養したもの0.2
mlを植菌して、37℃で所定時間、振とう培養（ロ
ータリーシエーカー、200RPM）し、２mlずつ無
菌的にサンプリングする。サンプルの一部をその
まま10〜30倍に希釈して全酵素活性を測定する。
サンプルの残部は遠心分離し、上澄液を５〜30倍
して、培地中に排出（分泌）された酵素の活性を
測定する。 酵素活性は、次のように測定する。まず、ｐ−
ニトロフエニルα−Ｄ−グルコシド2mM、PH7.5
のリン酸緩衝液40mM、酵素液0.03〜0.1mlを含む
総量0.5mlの液に、基質を加えて反応を開始し、
恒温槽中、40℃、10分間往復振とう後、1M炭酸
ナトリウム0.1mlを加えて反応を停止する。これ
に蒸留水３mlを加えて希釈攪拌し、420nmの吸収
を測定し、あらかじめ作成しておいた標準曲線か
ら、酵素活性を求める。１分間に１マイクロモル
のｐ−ニトロフエノールを生産する酵素量を１単
位とする。 全酵素活性すなわち、培地中の酵素と菌体中の
酵素の全活性は、培養液全体を希釈し、細胞膜を
透過性にするためトルエン１滴を加えて、５分後
から、酵素反応を開始し、反応停止後、遠心分離
（3000RPM、５分間）によつて菌体を除去し、上
澄液について酵素活性を測定することにより求め
る。培地中の酵素活性を全酵素活性で除したもの
を排出度とする。結果を第１表に示す。
【表】
出度を示す。
グリシンとマンガン化合物を併用することによ
り全酵素活性が大きくなり、グリシンを添加する
ことにより培地中の酵素活性すなわち排出度が大
きくなることがわかる。 実施例 ２ 好アルカリ性バチルスNo.Ｃ−125（FERMBP−
469）を使用し、β−ガラクトシダーゼ活性につ
いて調べた。 培地は、実施例１の培地において、可溶性でん
ぷんの代りに、乳糖15ｇを加えたものを使用し
た。実施例１と同様に種培養を行い、本培養は、
２の２個ひだ付三角フラスコに培地400mlをを
入れ、これに、１mlの種培養液を加えて、実施例
１と同様に行つた。３mlずつサンプリングした。 酵素活性は、実施例１においてｐ−ニトロフエ
ニルα−Ｄ−グルコシドの代りに、ｏ−ニトロフ
エニルβ−Ｄ−ガラクトシドを使用するほかは、
同様に行う。１分間に１マイクロモルのｏ−ニト
ロフエノールを生産する酵素量を１単位とする。 結果を第２表に示す。本菌株においては、マン
ガン化合物は酵素の総活性を増加させ、かつ排出
を促進するので、マンガン化合物のみの添加でも
ある程度の良好な結果が得られる。しかしグリシ
ン0.5％を同時添加する事により菌体外に排出さ
れる酵素の収率は改善されるため、共に用いる事
が望ましい。
グリシンとマンガン化合物を併用することによ
り全酵素活性が大きくなり、グリシンを添加する
ことにより培地中の酵素活性すなわち排出度が大
きくなることがわかる。 実施例 ２ 好アルカリ性バチルスNo.Ｃ−125（FERMBP−
469）を使用し、β−ガラクトシダーゼ活性につ
いて調べた。 培地は、実施例１の培地において、可溶性でん
ぷんの代りに、乳糖15ｇを加えたものを使用し
た。実施例１と同様に種培養を行い、本培養は、
２の２個ひだ付三角フラスコに培地400mlをを
入れ、これに、１mlの種培養液を加えて、実施例
１と同様に行つた。３mlずつサンプリングした。 酵素活性は、実施例１においてｐ−ニトロフエ
ニルα−Ｄ−グルコシドの代りに、ｏ−ニトロフ
エニルβ−Ｄ−ガラクトシドを使用するほかは、
同様に行う。１分間に１マイクロモルのｏ−ニト
ロフエノールを生産する酵素量を１単位とする。 結果を第２表に示す。本菌株においては、マン
ガン化合物は酵素の総活性を増加させ、かつ排出
を促進するので、マンガン化合物のみの添加でも
ある程度の良好な結果が得られる。しかしグリシ
ン0.5％を同時添加する事により菌体外に排出さ
れる酵素の収率は改善されるため、共に用いる事
が望ましい。
【表】
を示す。
実施例 ３ エシエリヒア・コリを使用し、β−ガラクトシ
ダーゼ活性を測定した。培地は実施例２で使用し
た培地より炭酸ナトリウムを除いたものを使用
し、本培養は50mlの培地で、300mlの４個ひだ付
三角フラスコを使用した。活性測定法は実施例２
と同じである。 結果を第３表に示す。グリシンは排出に対する
効果のみでなく、全酵素活性を３〜７倍に上昇さ
せる。
実施例 ３ エシエリヒア・コリを使用し、β−ガラクトシ
ダーゼ活性を測定した。培地は実施例２で使用し
た培地より炭酸ナトリウムを除いたものを使用
し、本培養は50mlの培地で、300mlの４個ひだ付
三角フラスコを使用した。活性測定法は実施例２
と同じである。 結果を第３表に示す。グリシンは排出に対する
効果のみでなく、全酵素活性を３〜７倍に上昇さ
せる。
【表】
内の数字は排出度を示す。
実施例 ４ パン酵母を使用し、β−フラクトシダーゼ活性
を測定した。培地は、実施例１の培地から炭酸ナ
トリウムを除いたものを使用した。この培地100
mlを、300mlの三角フラスコに入れ、植菌し、30
〜32℃で48時間、種培養する。種培養液を滅菌水
に懸濁し、600nmの吸収が100付近となるように
調整し、その１mlを本培養培地に植菌し、本培養
を実施例１と同様に行つた。 酵素活性の測定は次のように行つた。５％サツ
カロース0.2ml、0.2Mリン酸緩衝液（PH7.5）0.1
ml、酵素液0.20〜0.1mlを含む、総量0.4mlの試料
液を、恒温槽中、40℃、30分間振とうしながら反
応させる。次にDNS試薬（福井作蔵著「還元糖
の定量法」19頁、1969年）1.0mlを加えて反応を
停止し、混合して100℃、５分間加熱後、水冷し、
蒸留水４mlを加え、500nmの吸収を測定する。対
照として、蒸留水0.4mlにDNS試薬1.0mlを加え、
同様に処理したものを使用する。１分間に還元糖
をグルコースとして１マイクロモル生成する酵素
量を１単位とする。 結果を第４表に示す。
実施例 ４ パン酵母を使用し、β−フラクトシダーゼ活性
を測定した。培地は、実施例１の培地から炭酸ナ
トリウムを除いたものを使用した。この培地100
mlを、300mlの三角フラスコに入れ、植菌し、30
〜32℃で48時間、種培養する。種培養液を滅菌水
に懸濁し、600nmの吸収が100付近となるように
調整し、その１mlを本培養培地に植菌し、本培養
を実施例１と同様に行つた。 酵素活性の測定は次のように行つた。５％サツ
カロース0.2ml、0.2Mリン酸緩衝液（PH7.5）0.1
ml、酵素液0.20〜0.1mlを含む、総量0.4mlの試料
液を、恒温槽中、40℃、30分間振とうしながら反
応させる。次にDNS試薬（福井作蔵著「還元糖
の定量法」19頁、1969年）1.0mlを加えて反応を
停止し、混合して100℃、５分間加熱後、水冷し、
蒸留水４mlを加え、500nmの吸収を測定する。対
照として、蒸留水0.4mlにDNS試薬1.0mlを加え、
同様に処理したものを使用する。１分間に還元糖
をグルコースとして１マイクロモル生成する酵素
量を１単位とする。 結果を第４表に示す。
【表】
排出度を示す。
実施例 ５ 実施例２において、硫酸マンガンの代りに種々
のマンガン化合物を用いて、β−ガラクトシダー
ゼ活性を調べた。培養は、300mlの三角フラスコ
にて、50mlの培地を用いて行い、48時間後に酵素
活性を測定した。結果を第５表に示す。
実施例 ５ 実施例２において、硫酸マンガンの代りに種々
のマンガン化合物を用いて、β−ガラクトシダー
ゼ活性を調べた。培養は、300mlの三角フラスコ
にて、50mlの培地を用いて行い、48時間後に酵素
活性を測定した。結果を第５表に示す。
【表】
出度を示す。
実施例 ６ 遺伝子組換えによりセルラーゼ生産能を獲得し
た大腸菌によるセルラーゼの菌体外生産 大腸菌（E.coli.HB101）に好アルカリ性バチ
ルスNo.Ｎ−４のDNAを組みこみ、セルラーゼを
生産するようになつた大腸菌についてグリシン無
添加時とグリシン1.0％添加の場合の菌体外セル
ラーゼ活性を測定した。使用した好アルカリ性バ
チルスNo.Ｎ−４のセルラーゼ生産については掘越
ら（カナデイアン・ジヤーナル・オブ・マイクロ
バイオロジイ（Canadian Journal of
Microbiology）30巻ｐ−774〜779、1984年）が
記述し、大腸菌へのセルラーゼ遺伝子の組換え実
験と得られたpNK−１、pNK−２株のアルカリ
セルラーゼ生産については指原らの報告（ジヤー
ナル・オブ・バクテリオロジイ（Journal of
Bacteriology）158巻p503〜506、1984年）に記
載されている。 培地はブレイン・ハート・インフユージヨン
（Brain Heart Infusion）培地（デイフコ
（Difco）社製）に30μg／mlのアンピシリンを加
えたものを使用した。培地は300mlの２個ひだ付
三角フラスコに50mlの培地を入れ一晩前培養した
培養液1.0mlを加えて37℃24時間培養後、遠心上
澄液の活性を比較した。活性はカルボキシメチル
セルロースナトリウム塩0.5％水溶液0.25ml、Ｍ
−炭酸ナトリウム0.05mlおよび培養の遠心上澄液
0.2mlを40℃30分反応後、DNS試薬（“還元糖の
定量法”、福井作蔵編、東京大学出版会発行1969
年、19頁）1.0mlを加え、100℃５分煮沸後、水冷
し、3.0mlの蒸留水を加えて混合し、500nmの吸
収を測定し、グルコース量に換算した。この条件
で１分間に1μmoleのグルコースを生産するよう
な酵素量を１単位とした。 指原らの報告によればpNK−１では全活性の
95.6％、pNK−２では86.1％が、菌体内に存在す
る。これらの菌体の活性がグリシン添加培養によ
り培養液中に排出（分泌）されたゝめ、本実施例
での菌体外活性が高くなるものと考えられる。結
果を第６表に示す。
実施例 ６ 遺伝子組換えによりセルラーゼ生産能を獲得し
た大腸菌によるセルラーゼの菌体外生産 大腸菌（E.coli.HB101）に好アルカリ性バチ
ルスNo.Ｎ−４のDNAを組みこみ、セルラーゼを
生産するようになつた大腸菌についてグリシン無
添加時とグリシン1.0％添加の場合の菌体外セル
ラーゼ活性を測定した。使用した好アルカリ性バ
チルスNo.Ｎ−４のセルラーゼ生産については掘越
ら（カナデイアン・ジヤーナル・オブ・マイクロ
バイオロジイ（Canadian Journal of
Microbiology）30巻ｐ−774〜779、1984年）が
記述し、大腸菌へのセルラーゼ遺伝子の組換え実
験と得られたpNK−１、pNK−２株のアルカリ
セルラーゼ生産については指原らの報告（ジヤー
ナル・オブ・バクテリオロジイ（Journal of
Bacteriology）158巻p503〜506、1984年）に記
載されている。 培地はブレイン・ハート・インフユージヨン
（Brain Heart Infusion）培地（デイフコ
（Difco）社製）に30μg／mlのアンピシリンを加
えたものを使用した。培地は300mlの２個ひだ付
三角フラスコに50mlの培地を入れ一晩前培養した
培養液1.0mlを加えて37℃24時間培養後、遠心上
澄液の活性を比較した。活性はカルボキシメチル
セルロースナトリウム塩0.5％水溶液0.25ml、Ｍ
−炭酸ナトリウム0.05mlおよび培養の遠心上澄液
0.2mlを40℃30分反応後、DNS試薬（“還元糖の
定量法”、福井作蔵編、東京大学出版会発行1969
年、19頁）1.0mlを加え、100℃５分煮沸後、水冷
し、3.0mlの蒸留水を加えて混合し、500nmの吸
収を測定し、グルコース量に換算した。この条件
で１分間に1μmoleのグルコースを生産するよう
な酵素量を１単位とした。 指原らの報告によればpNK−１では全活性の
95.6％、pNK−２では86.1％が、菌体内に存在す
る。これらの菌体の活性がグリシン添加培養によ
り培養液中に排出（分泌）されたゝめ、本実施例
での菌体外活性が高くなるものと考えられる。結
果を第６表に示す。
【表】
活性は培養液１リツトル中に排出された酵素単
位。 実施例 ７ トランスアミナーゼの排出（分泌） 標準培地として１中に次の成分を含むものを
使用した。グルコース又は可溶性でんぷん又は乳
糖15ｇ、ポリペプトン５ｇ、イーストエキス５
ｇ、リン酸二カリウム1.0ｇ、硫酸マグネシウム
７水和物0.2ｇ、硫酸マンガン（４又は５）水和
物0.02ｇ、生育に必要な場合は肉エキス3.0ｇ、
好アルカリ性細菌の場合は炭酸ナトリウム10ｇを
別途殺菌して加えた。細菌株は300mlのエルレン
マイヤーフラスコ又は２個ひだ付三角フラスコ又
は４個ひだ付三角フラスコに50mlの培地を入れ、
前培養液0.5mlを植菌し、好アルカリ性細菌およ
びバチルス・サチルス（Bacillus subtilis）は37
℃その他は30〜32℃で回転振とう機（200回転／
分）で培養した。アセトバクダー・パスツリアヌ
ス（Acetobacter pasteurianus）およびグルコ
ノバクター・ロゼウス（Glconobacter roseus）
は初発PH5.7、好アルカリ性細菌は初発PH10.3、
その他はPH7.1とした。グルタミン酸−オキザロ
酢酸トランスフエラーゼ（アミノ基転移酵素、以
下GOT）、グルタミン酸−ピルビン酸トランスア
ミナーゼ（GPT）は和光純薬工業製の測定試薬
を使用した。 すなわちGOT測定は0.2mlの基質液（4mMα−
ケトグルタール酸、200mMのＬ−アスパラギン
酸、0.1Mのリン酸緩衝液を含む）と0.05mlの酵
素液（培養後の遠心上澄液）を40℃15分又は30分
反応させ、0.1mlの発色液（8mMの２，４ジニト
ロフエニルヒドラジン、５％酢酸、95％のジメチ
ルホルムアミドから成る）を加えて40℃10分発色
させ、0.4mlの0.5N−水酸化ナトリウムを加え、
40℃10分後520nmの吸収を測定した。GPTの場
合基質液は2mMのα−ケトグルタール酸、
200mMのDL−アラニン、0.1Mのリン酸緩衝液
を含むものを使用し、GOT、GPT共PH7.4であ
る。この条件で１分間に1μモルのピルピン酸を
生じる酵素量を１単位とした。結果を第７表に示
す。
位。 実施例 ７ トランスアミナーゼの排出（分泌） 標準培地として１中に次の成分を含むものを
使用した。グルコース又は可溶性でんぷん又は乳
糖15ｇ、ポリペプトン５ｇ、イーストエキス５
ｇ、リン酸二カリウム1.0ｇ、硫酸マグネシウム
７水和物0.2ｇ、硫酸マンガン（４又は５）水和
物0.02ｇ、生育に必要な場合は肉エキス3.0ｇ、
好アルカリ性細菌の場合は炭酸ナトリウム10ｇを
別途殺菌して加えた。細菌株は300mlのエルレン
マイヤーフラスコ又は２個ひだ付三角フラスコ又
は４個ひだ付三角フラスコに50mlの培地を入れ、
前培養液0.5mlを植菌し、好アルカリ性細菌およ
びバチルス・サチルス（Bacillus subtilis）は37
℃その他は30〜32℃で回転振とう機（200回転／
分）で培養した。アセトバクダー・パスツリアヌ
ス（Acetobacter pasteurianus）およびグルコ
ノバクター・ロゼウス（Glconobacter roseus）
は初発PH5.7、好アルカリ性細菌は初発PH10.3、
その他はPH7.1とした。グルタミン酸−オキザロ
酢酸トランスフエラーゼ（アミノ基転移酵素、以
下GOT）、グルタミン酸−ピルビン酸トランスア
ミナーゼ（GPT）は和光純薬工業製の測定試薬
を使用した。 すなわちGOT測定は0.2mlの基質液（4mMα−
ケトグルタール酸、200mMのＬ−アスパラギン
酸、0.1Mのリン酸緩衝液を含む）と0.05mlの酵
素液（培養後の遠心上澄液）を40℃15分又は30分
反応させ、0.1mlの発色液（8mMの２，４ジニト
ロフエニルヒドラジン、５％酢酸、95％のジメチ
ルホルムアミドから成る）を加えて40℃10分発色
させ、0.4mlの0.5N−水酸化ナトリウムを加え、
40℃10分後520nmの吸収を測定した。GPTの場
合基質液は2mMのα−ケトグルタール酸、
200mMのDL−アラニン、0.1Mのリン酸緩衝液
を含むものを使用し、GOT、GPT共PH7.4であ
る。この条件で１分間に1μモルのピルピン酸を
生じる酵素量を１単位とした。結果を第７表に示
す。
【表】
【表】
【表】
本発明にしたがい、グリシンおよび／またはマ
ンガン化合物を培地に添加して微生物を培養する
ことにより、微生物が生産する酵素などの有用な
生理活性物質の全生産量（菌体内と菌体外の総
和）を大巾に増大させ、しかも、菌体外に排出さ
れる生産物質の比率を著しく向上することができ
る。 実施例 ８ 更に、マンガン化合物および／またはグリシン
の添加培養により、本来菌体外に生産される酵素
の生産量もまた増加させることができる。好アル
カリ性バチルスをはじめとして一般にバチルス属
の菌株で可能である例として好アルカリ性バチル
スNo.Ｃ−125（FERMBP−469）によるキシラナ
ーゼの生産についての例を第８表に示す。 培地は、１中にキシラン5.0ｇ、ポリペプト
ン10.0ｇ、イーストエキス（デイフコ社製）5.0
ｇ、リン酸二カリウム1.0ｇ、硫酸マグネシウ
ム・７水和物0.2ｇ、炭酸ナトリウム10ｇを含む。
但し炭酸ナトリウムは、別殺菌する。２個ひだ付
300mlのエルレンマイヤーフラスコに50mlの培地
を作り、１晩培養した前培養液0.5mlを植菌し、
37℃24時間培養する。遠心上清の活性を測定す
る。活性は、酵素液（遠心上清液）0.05mlに0.5
mlの0.5％キシラン液（PH7.0の0.05Mリン酸緩衝
液にとかしたもの）を加えて40℃10分反応させ、
DNS試薬1.0mlを加え100℃５分加熱後、水冷、
30mlの蒸留水を加えて510nmの吸収を測定した。
１分間に100μｇのキシロースを生産する酵素量
を１単位とした。 第 ８ 表添加物 培養液上清の活性（単位／ml） 無添加 1.00 硫酸マンガン200μM 3.60 グリシン 0.5％ 4.02 〃 1.0％ 4.08 硫酸マンガン200μM＋グリシン1.0％ 3.46
ンガン化合物を培地に添加して微生物を培養する
ことにより、微生物が生産する酵素などの有用な
生理活性物質の全生産量（菌体内と菌体外の総
和）を大巾に増大させ、しかも、菌体外に排出さ
れる生産物質の比率を著しく向上することができ
る。 実施例 ８ 更に、マンガン化合物および／またはグリシン
の添加培養により、本来菌体外に生産される酵素
の生産量もまた増加させることができる。好アル
カリ性バチルスをはじめとして一般にバチルス属
の菌株で可能である例として好アルカリ性バチル
スNo.Ｃ−125（FERMBP−469）によるキシラナ
ーゼの生産についての例を第８表に示す。 培地は、１中にキシラン5.0ｇ、ポリペプト
ン10.0ｇ、イーストエキス（デイフコ社製）5.0
ｇ、リン酸二カリウム1.0ｇ、硫酸マグネシウ
ム・７水和物0.2ｇ、炭酸ナトリウム10ｇを含む。
但し炭酸ナトリウムは、別殺菌する。２個ひだ付
300mlのエルレンマイヤーフラスコに50mlの培地
を作り、１晩培養した前培養液0.5mlを植菌し、
37℃24時間培養する。遠心上清の活性を測定す
る。活性は、酵素液（遠心上清液）0.05mlに0.5
mlの0.5％キシラン液（PH7.0の0.05Mリン酸緩衝
液にとかしたもの）を加えて40℃10分反応させ、
DNS試薬1.0mlを加え100℃５分加熱後、水冷、
30mlの蒸留水を加えて510nmの吸収を測定した。
１分間に100μｇのキシロースを生産する酵素量
を１単位とした。 第 ８ 表添加物 培養液上清の活性（単位／ml） 無添加 1.00 硫酸マンガン200μM 3.60 グリシン 0.5％ 4.02 〃 1.0％ 4.08 硫酸マンガン200μM＋グリシン1.0％ 3.46
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 菌体内に酵素を産生する微生物を、マンガン
化合物及びグリシンからなる群から選ばれる少な
くとも１種の化合物を含む培地であつて、マンガ
ン化合物のみを含む場合にはその含有量が0.5μM
以上であり、グリシンのみを含む場合にはその含
有量が0.5％以上である培地で培養し、菌体内に
産生する酵素量を増加させ、且つ該酵素の菌体外
への排出（分泌）を促進させ、培地から該酵素を
採取することを特徴とする該酵素の製造方法。 ２ 微生物が細菌又は酵母である特許請求の範囲
第１項記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18129584A JPS6181775A (ja) | 1984-08-30 | 1984-08-30 | 酵素の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18129584A JPS6181775A (ja) | 1984-08-30 | 1984-08-30 | 酵素の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6181775A JPS6181775A (ja) | 1986-04-25 |
| JPH0452114B2 true JPH0452114B2 (ja) | 1992-08-20 |
Family
ID=16098179
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP18129584A Granted JPS6181775A (ja) | 1984-08-30 | 1984-08-30 | 酵素の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6181775A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0695948B2 (ja) * | 1991-06-05 | 1994-11-30 | エム・ディ・リサーチ株式会社 | 培地、およびペプチド又は蛋白質の製造方法 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS4892579A (ja) * | 1972-03-16 | 1973-11-30 | ||
| JPS5443595A (en) * | 1977-09-12 | 1979-04-06 | Showa Electric Wire & Cable Co | Method of forming bridged polyethylene cable connector |
| JPS5612111A (en) * | 1979-07-10 | 1981-02-06 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | Electric power supply unit of electric power amplifier |
| JPS6041587B2 (ja) * | 1979-11-27 | 1985-09-18 | 北里研究所（社団法人） | 抗生物質生産用培地 |
| GR79037B (ja) * | 1982-11-19 | 1984-10-02 | Genex Corp |
-
1984
- 1984-08-30 JP JP18129584A patent/JPS6181775A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6181775A (ja) | 1986-04-25 |
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