JPH0452760B2

JPH0452760B2 -

Info

Publication number: JPH0452760B2
Application number: JP61068260A
Authority: JP
Inventors: Seodorusu Beritsupusu Korunerisu; Maato Jan; Edensu Rutsuho; Marinusu Redeboeaa Adorianusu
Original assignee: Unilever NV
Current assignee: Unilever NV
Priority date: 1980-12-12
Filing date: 1986-03-26
Publication date: 1992-08-24
Also published as: ATE76901T1; JPS61234793A; PH18602A; DE3177281T2; EP0054331B1; BR8108073A; DE3177281D1; EP0054331A1; US4771000A; JPS62677B2; JPS57206700A; CA1193207A; US4966842A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、全くもしくは部分的にしかプロセツ
シングされていないプレプロソーマチンをコード
する構造遺伝子、天然に存在する各種の対立型遺
伝子、又は人工的に変異を導入した遺伝子を含ん
でなる組換えプラスミドを使用して、常法により
ソーマチン関連物質を製造する方法に関する。ソーマチンは、ソーマトコツカス・ダニエリ
（Thaumatococcus daniellii）の果実の仮種皮か
ら得られるタンパク質である。ソーマチンは、重
量を基準にするとシヨ糖の1600倍、１分子当りで
はシヨ糖の10⁵倍の甘味度を呈する。西洋諸国では糖分の過剰摂取によつて健康に問
題をきたすことが多々ある。従つて、砂糖に代え
て低カロリー甘味料を使用する多くの試みがなさ
れてきた。しかし、これらの低カロリー甘味料の
幾つかは副作用の問題から最近その使用が禁止さ
れている。従つて、天然の低カロリー甘味料並び
にその経済的な製造方法が必要とされている。近
年の分子生物額の進歩に伴つて、特定の真核生物
由来のタンパク質をコードする遺伝子を微生物宿
主に導入し、該形質転換細胞中で遺伝子を発現さ
せて、所望のタンパク質を生産させることが可能
になつた。プロセツシングを受ける前のタンパク質をコー
ドする天然の真核生物遺伝子は、mRNAには含
まれていないイントロと呼ばれるDNA配列（介
在配列ともいう）を含んでいるので、そのままで
は組換えDNA分子中に直接組み込むことはでき
ない。真核生物において、イントロンに存在する
情報はmRNAの翻訳前に取り除かれる。本発明
者等の知る限り、細菌はRNAレベルでイントロ
ンを切除することができないので、かかるイント
ロンに存在する情報を予め取り除いておかないと
真核生物の天然遺伝子を原核生物宿主に使用する
ことはできない。 mRNAレベルでイントロンを切除する能力を
有する微生物宿主細胞においては、該微生物宿主
細胞中で有効に作用するレギユロンの調節下に置
かれていれば、原則的には天然の遺伝子を用いる
ことができる。経済的な観点からすると、組換えDNA遺伝子
にコードされたタンパク質を最適条件下で生産す
ることが重要である。この目的を達成するための
主たる方法は以下の通りである。 (1) 選択生育条件下で（最適の菌体数における）
菌体当りのタンパク質産生量ができるだけ高く
なるような、構造遺伝子の有効レギユロン下流
への組み込み。かかる目的には、なかでも、大腸菌由来の二
重lacUV5及びtrpレギユロン、並びにバクテリ
オフアージM13、fd及びf1の遺伝子産物等の
レギユロンが適しており、これらは天然の状態
でも修飾された状態でもよい。 (2) 微生物宿主細胞による該タンパク質の細胞周
辺腔（ペリプラズミツク・スペース）及び／又
は培地中への分泌。こうすることによつて、細
胞中でのタンパク質分解を防ぎ、或いは該タン
パク質の細胞内濃度が高くなり過ぎて細胞内で
の正常な過程が阻害されないようにする。多数
の原核生物及び真核生物において、プロセツシ
ングを受ける前のタンパク質の特異的なＮ末端
側アミノ酸配列がタンパク質の分泌過程に関与
していることが現在一般的に受け入れられてい
る。G.Blobel及びB.DobbersteinによるJ.Cell
Biol.67，835−851（1975）を参照されたい。さらに、タンパク質のＣ末端側アミノ酸配列
もこの過程に関与することもあることが最近明
らかにされた。D.Koshland及びD.Botsteinに
よるCell 20 749−760（1980）を参照された
い。従つて、組換えDNAにコードされたタンパク
質のＮ末端及び／又はＣ末端に、微生物宿主によ
る該タンパク質の分泌を促進するようなアミノ酸
配列が存在していれば、経済的に多大な利点がも
たらされる。本発明は、ソーマチン前駆体であるプレプロソ
ーマチン、プレソーマチン又はプロソーマチンの
製造方法にして、 (A) 以下の（）〜（）から成る群から選択
されるDNA配列 () プレプロソーマチン構造遺伝子、プロソ
ーマチン構造遺伝子、又はプレソーマチン構
造遺伝子； () 対立型プレプロソーマチン構造遺伝子；
並びに () 変異型プレプロソーマチン構造遺伝子、
及び該DNA配列の発現を調節する誘導又
は構成レギユロンから成る組み換えプラスミ
ドを導入して大腸菌（Escherichiacoli）を
形質転換し、 (B) 上記大腸菌を適当な培養条件下で培養し、か
つ (C) 上記大腸菌の産生するソーマチン前駆体タン
パク質を単離することを特徴とする方法を供す
る。本発明においては、上述の要求を満足する組換
えDNA分子を構築するために組換えDNA技術そ
の他の分子生物学的技術が用いられる。本発明は、また、部位特異的変異導入法を用い
る構造遺伝子の遺伝子情報の変更に関する。本発明の理解を深めるために、本明細書中で用
いる幾つかの重要な用語について以下の通り定義
する。「レギユロン」は、プロモーターとオペレータ
ー領域から成るDNA配列である。「構造遺伝子」は、鋳型（mRNA）を介して
ポリペプチド固有のアミノ酸配列をコードする
DNA配列である。「プロモーター」は、レギユロン内に存在する
DNA配列であり、転写開始のためにRNAポリメ
ラーゼが結合するDNA配列である。「オペレーター」は、レギユロン内に存在する
DNA配列であり、リプレツサータンパク質が結
合することによつて隣接するプロモーターへの
RNAポリメラーゼの結合が阻害されるような
DNA配列である。「インデユーサー」は、リプレツサータンパク
質で不活性化する物質であり、その結果オペレー
ターが開放されてRNAポリメラーゼがプロモー
ターに結合し、転写が開始される。「プレプロソーマチン」は、プロセツシングを
受けていない各種対立型タンパク質を意味する
（第２図参照）。「クローニングビヒクル」は、適当な宿主細胞
中に形質転換した後で自己複製させることのでき
るDNA配列（インタクトなレプリコン）を含ん
でなる非染色体二本鎖DNA、プラスミド又はフ
アージをいう。「フアージ」又は「バクテリオフアージ」は、
適当な宿主細菌中で複製可能な細菌ウイルスをい
う。「解読枠」は、mRNAレベルで、三塩基連鎖
（コドン）ずつに分けられたコドンがポリペプチ
ドに適切に翻訳されるような枠をいう。「転写」は、遺伝子からRNAが作られる過程
をいう。「翻訳」は、mRNAからポリペプチドが作ら
れる過程をいう。「発現」は、構造遺伝子からポリペプチドが産
生する過程をいう。この過程は、少なくとも転写
と翻訳を含めた多数の過程の組合せである。「プレプロソーマチン遺伝子」は、プロセツシ
ングを受けていないプレプロソーマチンをコード
するmRNA部分と全く同一の情報（コドンの配
列）を有する二本鎖DNAを意味する。「シグナルペプチド」は、プレプロタンパク質
の、生体膜に対して高い親和性を有する部分及
び／又は生体膜を通してのプレプロタンパク質の
輸送に関与する部分を意味する。このような輸送
過程は、成熟型タンパク質へのプレプロタンパク
質のプロセツシングを伴う場合が多い。便宜上、二本鎖塩基配列は一本鎖として示す。本発明においては、各種対立型又は成熟型の
プレプロソーマチンをコードする構造遺伝子（配
列２、３、４、並びに第１図及び第２）、及び
該構造遺伝子の発現を調節する誘導又は構成レギ
ユロンから成る組み換えプラスミドが供される。【表】【表】【表】【表】【表】【表】【表】こで、配列２はプレプロソーマチンの構造遺伝子
の塩基配列（32〜736）及びそのアミノ酸配列を
示したものであり、配列３はプロソーマチンの構
造遺伝子の塩基配列（98〜736）及びそのアミノ
酸配列を示したものであり、配列４はプレソーマ
チンの構造遺伝子の塩基配列（32〜718）及びそ
のアミノ酸配列を示したものである。また、第１
図の上段は３種類のソーマチン前駆体の関係を示
したものであり、下段は対立型を示したもので、
配列１に示した配列は野生型のものである。第２
図は、本発明者らによつて導入された変異（塩基
番号47のＴのＣによる置換、塩基番号507及び／
又は513のＡのＣによる置換）を示したものであ
る。好ましい誘導レギユロンは、Nature 281，
544−548（1971）（Goeddel他）に記載された二重
lakUV5系、pUR201（第３図）である。第３図
に、プラスミドpkb268からのlacUV5の単離、
pBR322への挿入、及び１か所のEcoRI部位の除
去によるpUR201の構築法を示した。その他の好ましい誘導レギユロンとしては、J.
Mol.Biol.121，193−217（1978）（F.Lee他）及び
Science 189，22−26（1975）（K.Bertrand他）
に記載されたトリプトフアン系の構成要素があ
る。本発明者らは、さらに適切な系が得られるよう
に第４図に示す通りこのトリプトフアン系を改変
した。この改変系においては、アテニユエーター
領域及びリーダー部位の14残基のペプチドをコー
ドする領域が除去されているが、そのリボソーム
結合部位は残つている。第４図に、プラスミド
pTRPED−５からのtrpレギユロンの単離、TaqI
処理、EcoRI部位の付加、その断片のプラスミド
pBR322への挿入、及び１か所のEcori部位の除
去によるpUR301の構築法を示す。本発明における好ましい組換えプラスミドとし
ては、バクテリオフアージM13、fd又はf1の遺
伝子の改変プロモーター／リボソーム結合部位
（第５図）から成るDNA配列がある。これは、本
発明者らの知る限り、これまで真核生物由来の遺
伝子の発現に用いられたことはない。第５図に、
M13の遺伝子の単離、その一部の切除、EcoRI
部位の付加、その断片のプラスミドpBR322への
挿入、及び１か所のEcoRI部位の除去による
pUR401の構築法を示す。本発明で用いる組換えプラスミドにおいては、
レギユロンは構造遺伝子に直接連結させてもよい
し、以下の新規開始コドンとEcoRIを含有する
DNAリンカーを介して間接的に連結させてもよ
い。該DNAリンカーは、次の塩基配列：（5′）_pCAT（Ｎ）_oGAATTC（N′）_oATG_OH（3
′）（ただし、ｎ＝０、１、２又は３で、Ｎ及び
N′はヌクレオチドＡ、Ｔ、Ｇ又はＣのいずれか
で二本鎖に２回回転対称構造が存在するようなも
のである。）を含んでなるものである。２回回転
対称構造とは、例えばＮが塩基ＡであればN′が
その相補的な塩基Ｔであることを意味する。レギユロンと構造遺伝子との間のAATT配列
を除去すると発現効率が増大する場合もあること
が判明した。本発明では、多くの工程を経て、各
種の対立型プレプロソーマチンをコードする天然
型又は変異型遺伝子を含む微生物クローニングビ
ヒクルを得、各種プレプロソーマチンを生産させ
る。その工程の中で最も重要なものは、 (1) ソーマチンmRNAの単離・精製、 (2) このmRNAの二本鎖DNA（dsDNA）への変
換、 (3) ポリdCテールを有するdsDNAの構築、 (4) dsDNA−ポリdCテール分子の、PstIで切断
しかつポリdGテールを結合させたプラスミド
pBR322DNAへの導入、 (5) 形質転換及びクローン選択、 (6) RNA／DNAハイブリツド形成及びインビト
ロ翻訳による挿入部分の性質の決定、 (7) DNA配列及びRNA配列の解析による挿入部
分の性質の二重チエツク、 (8a) 未プロセツシングプレプロソーマチンをコ
ードするDNA（配列１、配列２及び第１図）
の作成、 (8b) プレソーマチンをコードするDNA（配列
４）の作成、 (8c) プロソーマチンをコードするDNA（配列
３）の作成、 (8d) 塩基配列32〜97、特に塩基配列32〜49に特
定の変異が導入されていること以外は未プロ
セツシングプレプロソーマチンコードDNA
と同一のDNA（配列１及び第２図）の作成、 (8e) 塩基配列32〜736、特に塩基配列332〜718
に特定の変異が導入されていること以外は上
記（8a）〜（8d）のDNA（配列１及び第２
図）と同一の配列を有するDNAの作成、 (9) 特異的な転写調節DNA配列を含んだプラス
ミドの構築、並びにDNAリンカー及びプライ
マーの化学合成、 (10) 構成又は誘導レギユロンとそれに連結した上
記（8a）〜（8e）の（プレ）（プロ）ソーマチ
ン遺伝子によつて構成されるプラスミドの構
築、並びに該プラスミドによる大腸菌の形質転
換、 (11) 組換えプラスミドを含む大腸菌の培養、並び
にプレプロソーマチン又はその各種成熟型の検
出と単離。配列１に、プレプロソーマチンmRNAに基づ
く塩基配列とそれに対応するアミノ酸配列を示
す。配列１に示すDNA配列はプラスミド
pUR100に存在するが、pUR100はプラスミド
pBR322に由来するもので、後で詳述する通り
pBR322のアンピシリン耐性（Amp^r）遺伝子を
PstIで切断し、3′末端の一本鎖部分にdGTPとタ
ーミナルヌクレオチジルトランスフエラーゼポリ
でポリdGテールを付加させて、これに、dCTP
とターミナルヌクレオチジルトランスフエラーゼ
を用いて3′末端にポリdCテールを与えたプレプ
ロソーマチン二本鎖cDNAを連結したもので、ス
クリーニングによつて得られたものである（以下
の(2)〜(7)参照）。次に、本発明をさらに詳細に説明する。 (1) ソーマチンmRNAの単離・精製ソーマトコツカス・ダニエリ
（Thaumatococcus daniellii）から単離した仮
種皮を液体窒素下で磨砕した。フエノールでタ
ンパク抽出した後、K.S.Kirby（Biochm.J96，
266−269（1965）並びにU.Wiegers及びH.Hilz
（FEBS Letters 23，77−82（1972））記載の
手順に従つてLiClを用いてRNAを選択的に沈
殿させた。オリゴdT−セルロースカラムに数回通して
ポリＡ含有mRNAを回収し、このmRNA混合
物をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけて
ソーマチンをコードするmRNAを単離した。
このmRNAを、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.
69，1408−1412（1972）（H.Aviv及びP.Lader）
並びにJ.Virol.12 1434−1441（1973）（J.W.
Davies及びP.Kaesburg）に記載された小麦胚
芽系中でのmRNAの翻訳によりチエツクした。 (2) ソーマチンmRNAの二本鎖DNAへの変換上記の精製ソーマチンmRNAを、J.Biol.
Chem.253，2471−2482（1978）（G.N.Buell他）
に記載された手順に従い、AMV逆転写酵素を
用いてコピーして一重鎖DNA分子を得た。さ
らにA.R.Davis他のGene 10 205−218
（1980）の記載に従つて、この一重鎖DNAを大
腸菌DNAポリメラーゼを用いて二本鎖DNAに
変換した。二本鎖DNAコピーのループ構造を
S1ヌクレアーゼ消化によつて除去した。 (3) ポリdCテールを有するdsDNAの構築所望の長さのDNA分子をポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動により得、ゲルから抽出した
後、R.Roychoudhury他のNucleic Acids
Research ３，863−877（1976）の記載に従つ
てターミナルトランスフエラーゼでポリdCテ
ールを結合させた。 (4) dsDNA−ポリdCテール分子のpBR322への
導入プラスミドpBR322を制御酵素PstIで処理し
て、β−ラクタマーゼをコードする遺伝子（ア
ンピシリン耐性遺伝子）に存在するPstI部位で
プラスミドを切断した。このpBR322の線状化
DNAの3′末端の一重鎖部分に、dGTPとター
ミナルヌクレオチジルトランスフエラーゼポリ
を用いてポリdGテールを付加させた。上記(3)
で得たポリdCテール結合DNA分子を、このポ
リdGテール結合pBR322にアニールし、以下に
詳述するスクリーニングを経てプラスミド
pUR100を得た（以下の(5)〜(7)参照）。 (5) 形質転換及びクローン選択このようにして得たプラスミドを、塩化カル
シウム処理した大腸菌に導入した。形質転換
後、ハイブリツドプラスミドDNAを有する菌
体をそのテトラサイクリン耐性に基づいて選択
した。陽性コロニーを、Nucleic Acids
Research ７，1513−1523（1979）（H.C.
Birnboim及びJ.Doly）に記載された迅速プラ
スミド抽出法と単離DNAのPstI消化を併用し
て、大挿入部を有するプラスミドに関してスク
リーニングした。 (6) 挿入部分の性質の決定（）ハイブリツド形成及びインビトロ翻訳選択クローンから10μｇのプラスミドDNA
を単離し、これをジアゾ化（DBM）濾紙上に
結合させた。この固定化プラスミド分子を用い
て、Cell 17，903−913（1979）（J.G.Williams
他）に記載されたハイブリツド形成及びインビ
トロ翻訳法を行ない、DNA挿入部分の性質を
決定した。 (7) 挿入部分の性質の決定（） DNA配列及びRNA配列の解析ソーマチン挿入部分の塩基配列の解析を、マ
クサム・ギルバート法（A.M.Maxam及びW.
Gilbert、Methods in Enzymology、Vol.65(1)
（1980）、Academic Press社）及びジデオキ
シ／ニツク翻訳法（J.Maat及びA.J.H.Smith、
Nucleic Acids Research ５，4537−4545
（1978））で行なつた。ソーマチンmRNAの塩基配列に関するその
他の情報は、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.75，
4257−4261（1978）（D.Zimmern及びP.
Kaesburg）の記載に従い、伸長反応阻害剤
（chain terminating inhibitor）存在下での
AMV逆転写酵素による鋳型ソーマチンmRNA
上でのプライマー伸長反応から間接的に得た。
このスクリーニングにより、ソーマチン
mRNAのほぼ完全なコピーを有するプラスミ
ドpUR100が得られた。 (8) プレプロソーマチンの各種成熟型をコードす
るDNAの作成 (8a) 未プロセツシングプレプロソーマチンをコ
ードするDNAの作成第６図を参照する。このようにして得たプ
ラスミドpUR100を制限酵素PstIで処理し、
少なくとも31番目の塩基から793番目の塩基
までを含むDNA配列（配列１）を得て、こ
れを制限酵素Haeで処理してDNA断片
（36〜143番目）を得た。この平滑末端を有す
る断片に、化学合成リンカー（5′）_p
CCGGATCCGG_OH（3′）をT4リガーゼで連結
し、次いで制限酵素BamHIで処理した。こ
れを続いてpBR322のBamHI部位に組み込
んで、大腸菌中でクローニングした。クロー
ン化断片を含むプラスミドDNAをHpaで
処理して塩基配列：【式】を得た。この配列をS1ヌクレアーゼ処理して
平滑末端として、これに合成リンカー（5′）_p
CAT（Ｎ）_oGAATTC（N′）_oATG_OH（3′）をT4リ
ガーゼで連結し、次いで制限酵素EcoRIで処理
した。これを続いてpBR322のEcoRI部位に組
み込んで、大腸菌中でクローニングした。プレプロソーマチン挿入部分を有するプラス
ミドをEcoIR及びSau3Aで処理し、第６図に示
す断片Ａを得た。次ぎに第７図を参照する。Mn²⁺（１ミリモ
ル／）存在下で、プラスミドpUR100を制限
酵素PstI及びEcoRIで処理した。この条件下で
EcoRIは配列AATTを認識する。このDNA断
片をS1ヌクレアーゼで処理して平滑末端とし、
これに合成リンカー（5′）_pCCAAGCTTGG_OH
（3′）をT4リガーゼで連結し、次いで制限酵素
Hind及びSa3Aで処理して断片Ｂを得た
（109番目の塩基にSau3A部位、及び791番目の
塩基の後にHind部位を有する）。上記の断片
Ａとここで得られた断片Ｂとを連結し、これを
EcoRIとHindで処理したpBR322に組み込ん
で、プラスミドpUR191を得た（第７図）。第
６図及び第７図に、配列１に示すプレプロソー
マチン遺伝子（32〜736）及び末端部位（737〜
791）を含むDNA配列（32〜791）の単離操作
を示す。さらに、このDNA配列の開始コドン
ATG（32〜34）上流にEcoRI部位を供すること
によつて、微生物宿主中での構造遺伝子の発現
を調節するレギユロンを導入することができ
た。次ぎに第８図を参照する。pUR101のEcoRI
−Hind断片の一本鎖部分をDNAポリメラー
ゼのクレノウフラグメントで修復し、EcoRIリ
ンカー（5′）_pGGAATTCC_OH（3′）を付加させた
後に、RF M13−mp2のEcoRI部位にクローニ
ングすることによつて、一本鎖鋳型DNAを得
た。クローンM13−101−Ａは、一本鎖がソーマ
チンmRNAと同じ極性を有するような挿入プ
レプロソーマチンDNAを有しているのに対し
て、クローンM13−101−Ｂは、一本鎖がソー
マチンmRNAと逆の極性を有するような挿入
プレプロソーマチンDNAを有している（第８
図参照）。これらの一本鎖鋳型を用いて、プレ
プロソーマチン遺伝子を、プレソーマチン遺伝
子（719番目以降の塩基を欠く、第９図参照）
及びプロソーマチン遺伝子（ソーマチンのプレ
部分をコードする配列32〜97を欠く、第１０図
参照）へと改変した。 (8b) プレソーマチンをコードするDNAの作成ここでは第９図を参照して説明する。M13
−101−Ａの一本鎖DNAを鋳型とし、合成
DNA配列（5′）_pTCAGGCAGTAGGGC_OH
（3′）をプライマーとして用いて、相補的
DNAを合成した。このdsDNAを熱変性させ
た後、相補的DNA鎖を、上記（8a）にその
作成法を記載した以下の断片：【式】をプライマーとして用いるDNA合成のための
鋳型として用いた。次いで、得られたdsDNA
断片をS1ヌクレアーゼ処理して平滑末端とし、
これにEcoRIリンカー（5′）_pCAT（Ｎ）_o
GAATTC（N′）_oATG_OH（3′）を連結した。この
DNAをEcoRIで消化し、pBR322のEcoRI部位
に組み込んで、プレソーマチンの塩基配列32〜
718を含むプラスミドpUR102を得た。 (8c) プロソーマチンをコードするDNAの作成次ぎに第１０図を参照する。M13−101−
Ｂの一本鎖DNAを鋳型とし、合成DNA配列
（5′）_pGCCCACCTTCG_OH（3′）をプライマー
として用いて、相補的DNAを合成した。生
じたdsDNAをEcoRI及びS1ヌクレアーゼで
処理して、その平滑末端に合成EcoRIリンカ
ー（5′）_pCAT（Ｎ）_oGAATTC（N′）_oATG_OH
（3′）を連結した。この断片をEcoRIで消化
し、pBR322のEcoRI部位に組み込んで、プ
ロソーマチンの塩基配列98〜736を含むプラ
スミドpUR103を得た。 (8d) 塩基配列32〜97、特に塩基配列32〜49に特
定の変異が導入されていること以外は未プロ
セツシングプレプロソーマチンコードDNA
と同一のDNAの作成次ぎに第１１図を参照する。M13−101−
Ｂの一本鎖DNAを鋳型とし、合成DNA配列
（5′）_pACCACTCGCTTC_OH（3′）をプライマ
ーとして用いて、相補的DNAを合成した。
生じたdsDNAで大腸菌を形質転換した後、
変異（47番目のＴがＣで置換）を有するフア
ージDNAをDNA配列解析によつて選択し
た。このようにして選択した変異フアージを
M13Tha47と名付けた。 (8e) 塩基配列32〜736、特に塩基配列332〜718
に特定の変異が導入されていること以外は上
記（8a）〜（8d）のDNAと同一の配列を有
するDNAの作成第１２図を参照する。M13−101−Ａの一
本鎖DNAを鋳型とし、DNAポリメラーゼク
レノウフラグメントと合成プライマー（5′）_p
GCCTTCAGCGTCGC_OH（3′）、（5′）_p
GCCGTCAGCTTCGC_OH（3′）及び（5′）_p
GCCGTCAGCGTCGC_OH（3′）を用いて、相
補的DNAを合成した。上記のプライマーの
配列は、１個もしくは２個の変異（507及
び／又は513番目の塩基）を有していること
以外はプレプロソーマチン遺伝子の503〜516
番目の配列に相補的である（配列１参照）。
このように適当なプライマーを用いることに
よつてタンパク質に所望の変異を導入するこ
とができる。このようにして得られた
dsDNAで大腸菌を形質転換した後、目的の
変異を有するフアージをDNA配列解析によ
つて選択した。このようにして選択した変異
フアージをそれぞれM13Tha507、513及び
507／513と名付けた。 (9a) プラスミドpUR201の構築第３図を参照する。pKB268をEcoRIで切
断して、285塩基対の二重lacレギユロン
（lacUV5）を含んでなる断片を得た（K.
Bakman及びM.Ptashne、Cell 13，65−71
（1987））。この断片をpBR322のEcoRI部位に
連結した。正しく位置付けられたlacレギユ
ロンを有するプラスミドDNA（第３図）を、
大腸菌RNAポリメラーゼの存在下、EcoRI
で部分的に切断した。これによつてHind
部位から最も遠い位置にあるEcoRI部位が選
択的に切断される。この線状化DNAをS1ヌ
クレアーゼで処理し、アガロースゲル電気泳
動で精製し、T4DNAリガーゼで環状化した
後、大腸菌の形質転換に用いた。テトラサイ
クリン耐性を有する形質転換体から、正しい
構造を有するpUR201を得た。 (9b) プラスミドpUR301の構築次ぎに第４図を参照する。pTRPED−５
をHinfIで切断して、約510塩基対のDNA断
片を得た（R.A.Hallewell及びS.Emtage、
Gene ９，27−47（1980））。この断片を大腸
菌RNAポリメラーゼの存在下で制限酵素
Taqlで切断した。trpレギユロン中のTaqI部
位（K.Bertrand 他、Science 189，22−
26（1975）並びにF.Lee他、J.Mol.Biol.121，
193−217（1978））は選択的に保護されるの
で、234塩基対のtrpレギユロンを含む断片が
得られる。この断片を次ぎにS1ヌクレアー
ゼで処理し、その平滑末端にEcoRIリンカー
（5′）_pGGAATTCC_OH（3′）を連結し、EcoRI
で切断して、pBR322のEcoRI部位にクロー
ン化した。正しく位置付けられたtrpレギユロンを有
するプラスミドpUR300（第４図）を単離し
た。臭化エチジウム存在下でのEcoRI切断及
びS1ヌクレアーゼ処理によつて、pUR300の
Hind部位から最も遠い位置にあるEcoRI
部位を選択的に切断した。この線状化DNA
分子をT4リガーゼで環状化した。テトラサ
イクリン耐性を有する形質転換体から、第４
図に示す構造を有するpUR301を得た。（9c）リンカー及びプライマーの化学合成リンカーとプライマーの合成は、J.F.M.
de Rooy他のホスホトリエステル法（Recl.
Trav.Chim.Pays Bas，98，537−548
（1979））で行つた。 (10) 構成又は誘導レギユロンとそれに連結した上
記（8a）〜（8e）の（プレ）（プロ）ソーマチ
ン遺伝子によつて構成される発現プラスミドの
構築、並びに該プラスミドによる大腸菌の形質
転換 10a 第１３図を参照する。プラスミドpUR101
をEcoRIとHindで処理して、プレプロソ
ーマチンをコードするDNA断片を得た。次
ぎに、このDNA断片をプラスミドpUR201
又はpUR301のEcoRI及びHind部位に組み
込んで、それぞれ発現プラスミドpUR521と
pUR531を得た。 10b 次ぎに第１４図を参照する。プラスミド
pUR102をEcoRIで処理して、プレソーマチ
ンをコードするDNA断片を得た。次ぎに、
このDNA断片をプラスミドpUR201又は
pUR301のEcoRI部位に組み込んで、それぞ
れ発現プラスミドpUR522とpUR532を得た。 10c 第１５図を参照する。プラスミドpUR103
をEcoRIで処理して、プロソーマチンをコー
ドするDNA断片を得た。次ぎに、このDNA
断片をプラスミドpUR201又はpUR301の
EcoRI部位に組み込んで、それぞれ発現プラ
スミドpUR523とpUR533を得た。 10d 第１６図を参照する。RF M13Tha47の
DNAをEcoRIで処理して、プレプロソーマ
チンをコードするDNA断片を得た。次ぎに、
このDNA断片をプラスミドpUR201又は
pUR301のEcoRI部位に組み込んで、それぞ
れ発現プラスミドpUR524とpUR534を得た。 10e 第１７図を参照する。RF M13Tha507、
RF M13Tha513又はRF M13Tha507／513
のDNAをEcoRIで処理して、変異型プレプ
ロソーマチンをコードするDNA断片を得た。
次ぎに、これらのDNA断片をプラスミド
pUR201又はpUR301のEcoRI部位に組み込
んで、pUR201由来の二重lac発現プラスミ
ドpUR525〜527（それぞれ、507、513、
507／513番目の塩基に変異を有するプレプロ
ソーマチン遺伝子を含有する）並びに
pUR301由来のtrp発現プラスミドpUR535〜
537（それぞれ、507、513、507／513番目の塩
基に変異を有するプレプロソーマチン遺伝子
を含有する）を得た。 (11) 組換えプラスミドを含む大腸菌の培養並びに
プレプロソーマチン又はその成熟型の検出と単
離大腸菌の培養方法は周知であり、その具体的
な培養条件は菌体中に含まれるプラスミドによ
つて若干異なるが、菌体収率の良い培養条件
は、例えばBiotechnology and
Bioengineering、Vol XVI 933−941（1974）、
Biotechnology and Bioengineering、Vol
227−239（1975）及び
Biotechnology and Bioengineering、Vol
81−94（1976）等の文献に記載さ
れている。大腸菌の産生する各種ソーマチン前駆体の精製
は公知の各種精製手段を用いて行うことができ
る。ソーマチン前駆体分子はソーマチン分子に類
似した性質を有しているので、Eur.J.Biochem
31，221−225（1972）に記載されたソーマチンの
公知の精製法に従つてこれらのソーマチン前駆体
の精製を行うことができる。ソーマチン前駆体は
ソーマチン同様著しく高い等電点（約12）を有し
ているので等電点沈澱法なども有効な手段であ
る。また、電気泳動法を用いることもできるし、
適当な抗体を結合したアフイニテイークロマトグ
ラフイーやイオン交換クロマトグラフイーなどを
用いることもできる。（プレ）（プロ）ソーマチン遺伝子が解読枠内
に正しく位置付けられたプラスミドpUR521〜
527pUR531〜537（リンカーとレギユロンとの間
にAATT配列が存在ものと存在しないものがあ
る）の内の１つを含む大腸菌を、適当な抗生物質
の存在下、上記の文献に記載された培養条件を用
いて培養した。これらの条件下でプラスミドpUR521〜527及
びpUR531〜537を含む菌体は相当の量の各種
（プレ）（プロ）ソーマチンを生産した。培養した菌体中のタンパク質の存在は、無細胞
抽出液のSDSゲル電気泳動を行つて各種ソーマチ
ン前駆体を単離し、これを特異的免疫沈降反応、
ソーマチン前駆体に特徴的な甘味度による官能試
験、並びにELISA法で定性的に確認した。この
試験に用いた抗体は、ソーマトコツカス・ダニエ
リから得たソーマチンを常法に従つてフロインド
アジユバントと共にヒツジ及びウサギに注射して
得た。特異的蛍光抗体標識で検出したSDS電気泳動の
結果を第１８図に示す。プレプロソーマチン（レ
ーン４）、プロソーマチン（レーン３）、及びプレ
ソーマチン（レーン２）の非常に強いバンドが見
られ、大腸菌内でこれらのタンパク質が発現して
いることが実証された。レーン５は、上記のプラ
スミドpUR301を有する大腸菌から調製した対照
試料である。 trpレギユロンの調節下にはプレプロソーマチ
ン、プロソーマチン又はプレソーマチンをコード
するプラスミド（PUR531〜533）を含む大腸菌
K12・294株を、610nｍにおける吸光度が0.5とな
るまで増殖させて集菌し、フレンチプレス菌体を
破壊し、常法に従つてELISA法を行なつた。下
記の表にELISA法で得られた結果をソーマチン
について得られた結果と共に示す。表Ｃ表現型菌体当りの分子数プレプロソーマチン 500 プロソーマチン 100 プレソーマチン 100ソーマチン 50 以下のプラスミドを含有する大腸菌K12株は
ATCC（American Type Culture Collection）
に寄託されている。 pUR531−ATCC 39015 （ブダペスト条約に基づく国際寄託） pUP522−ATCC 39016 （ブダペスト条約に基づく国際寄託） pUR523−ATCC 39017 （ブダペスト条約に基づく国際寄託）

【図面の簡単な説明】

第１図は、プレプロソーマチン遺伝子の対立型
変異を示したものである。第２図は、プレプロソ
ーマチンをコードする遺伝子中に導入した変異を
示すものである。第３図は、プラスミドpUR201
の構築法を示したものである。第４図は、プラス
ミドpUR301の構築法を示したものである。第５
図は、プラスミドpUR401の構築法を示したもの
である。第６図は、GCテールのないプレプロソ
ーマチン遺伝子の構築法を示したものである。第
７図は、プラスミドpUR101の構築法を示したも
のである。第８図は、鋳型M13−101−Ａ及び鋳
型M13−101−Ｂの構築法を示したものである。
第９図は、プラスミドpUR102（プレソーマチン
をコードする）の構築法を示したものである。第
１０図は、プラスミドpUR103（プロソーマチン
をコードする）の構築法を示したものである。第
１１図は、47番目の塩基に変異を導入したプレプ
ロソーマチンをコードする配列を含むM13Tha47
の構築法を示したものである。第１２図は、507
及び／又は513番目の塩基に変異を導入したプレ
プロソーマチンをコードする配列を含む
M13Tha507、513、及び507／513の構築法を示し
たものである。第１３図は、転写調節されたプレ
プロソーマチンをコードするDNA配列を含むプ
ラスミドpUR521、531及び541の構築法を示した
ものである。第１４図は、転写調節されたプレソ
ーマチンをコードするDNA配列を含むプラスミ
ドpUR522、532及び542の構築法を示したもので
ある。第１５図は、転写調節されたプロソーマチ
ンをコードするDNA配列を含むプラスミド
pUR523、533及び543の構築法を示したものであ
る。第１６図は、転写調節された変異プレプロソ
ーマチン（47番目の塩基）をコードするDNA配
列を含むプラスミドpUR524、534及び544の構築
法を示したものである。第１７図は、転写調節さ
れた変異プレプロソーマチン（507及び／又は513
番目の塩基）をコードするDNA配列を含むプラ
スミドpUR525、535、545、526、536、546、
527、537、及び547の構築法を示したものである。
第１８図は、特異的蛍光抗体標識法で検出した大
腸菌抽出タンパク質のSDSポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動図である。

Claims

【特許請求の範囲】１プレプロソーマチン、プレソーマチン又はプ
ロソーマチンの製造方法にして、 (A) 以下の（）〜（）から成る群から選択
されるDNA配列 () 下記の塩基配列：【表】【表】に示す塩基番号32〜736のコード配列から成
るプレプロソーマチン構造遺伝子、塩基番号
98〜736のコード配列から成るプロソーマチ
ン構造遺伝子、又は塩基番号32〜718のコー
ド配列から成るプレソーマチン構造遺伝子； () 上記（）の塩基配列の塩基番号235の
ＧのＣによる置換、塩基番号284のＣのＡに
よる置換、塩基番号296〜297のCGのAAに
よる置換、塩基番号324のＡのＧによる置換
もしくは塩基番号434のＧのＡによる置換、
又はこれらの２以上の置換の組合わせを含む
ことを除いては、上記（）のプレプロソー
マチン構造遺伝子と同一の塩基配列を有する
対立型プレプロソーマチン構造遺伝子；並び
に () 上記（）の塩基配列の塩基番号47のＴ
のＣによる置換、塩基番号507のＡのＣによ
る置換もしくは塩基番号513のＡのＣによる
置換、又はこれらの２以上の置換の組合わせ
を含むことを除いては、上記（）のプレプ
ロソーマチン構造遺伝子と同一の塩基配列を
有する変異型プレプロソーマチン構造遺伝
子、及び該DNA配列の発現を調節する誘導又は
構成レギユロンから成る組み換えプラスミドを
導入して大腸菌（Escherichia coli）を形質転
換し、 (B) 上記大腸菌を適当な培養条件下で培養し、か
つ (C) 上記大腸菌の産生するソーマチン前駆体タン
パク質を単離することを特徴とする方法。