JPS62677B2 - - Google Patents
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- JPS62677B2 JPS62677B2 JP56200804A JP20080481A JPS62677B2 JP S62677 B2 JPS62677 B2 JP S62677B2 JP 56200804 A JP56200804 A JP 56200804A JP 20080481 A JP20080481 A JP 20080481A JP S62677 B2 JPS62677 B2 JP S62677B2
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- nucleotide
- gene
- replaced
- preprosomatin
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
- C07K14/43—Sweetening agents, e.g. thaumatin, monellin
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- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
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- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Botany (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
本発明は非修飾及び部分修飾されたプレプロソ
ーマチンをコードする構造遺伝子、各種対立型の
非修飾ソーマチン、各種対立型のプレプロソーマ
チン及び天然修飾の種々の段階における天然及
び／又は人為的に変異したプレプロソーマチンを
コードする構造遺伝子を包含する組換えDNA及
びプラスミド、及び微生物、特にこの遺伝子が発
現されている細菌を形質転換させるためのこの組
換えプラスミドの使用に関する。 ソーマチンはソーマトコツカス・ダニエリ
（Thaumatococcus daniellii）の果実の仮種皮に
由来する蛋白質である。ソーマチンは重量基準で
砂糖の1600倍、分子基準で砂糖の105倍の甘味度
がある。西洋社会に於ては糖の過剰消費が多くの
健康上の問題を起している。従つて低カロリー甘
味料で糖を代用する多くの試みがなされている。
然し乍ら此等のうちの数種は副作用の観点から最
近禁止されている。従つて天然の低カロリー甘味
料及びその経済的な製造法が必要とされている。
最近の分子生物学の進歩は特定の真核生物の蛋白
質をコードする遺伝子を宿主微生物細胞に導入
し、形質転換された宿主細胞の中でその遺伝子を
発現させ、これにより目的とする蛋白質を製造す
ることを可能にした。 天然の状態では、非修飾型の蛋白質をコードす
る多くの真核生物の遺伝子は直接には組換え
DNA分子中に適用することは出来ない。何故な
ら天然の遺伝子はメツセンジヤーRNA
（mRNA）には含まれていないイントロン（介在
配列）と呼ばれるDNA配列を含んでいるからで
ある。これ等イントロンの上に位置する情報は
mRNAの翻訳過程の前に真該細胞の中で除かれ
る。本発明者の知る限り、細菌はRNAレベルで
はその様なイントロンを切除することは出来ず、
従つて真該生物の天然の遺伝子が原核宿主細胞に
使用出来る前に、此等イントロン上に位置する遺
伝情報をDNAレベルで除くことが必要である。 mRNAレベルでイントロンを切除する能力を
持つ微生物宿主細胞に於ては、天然の遺伝子が微
生物宿主細胞中で有効であるレギユロンの調節下
でもたらされるならば、その天然の遺伝子は原則
的に適用出来る。 経済的な理由で、組換えDNA遺伝子によりコ
ードされた蛋白質は最適条件で生産されることが
重要である。この目的を達するための主たる方法
は次の通りである。 (1) 有効なレギユロンの下流の構造遺伝子を、選
択した生育条件下で、単位細胞当り生産される
蛋白質の量（最適数の細胞により）が出来るだ
け多くなる様に、統合する。この目的のために
は二重lacUV5およびE.coli（大腸菌）のtrpレ
ギユロン、バクテリオフアージM13、fd及びfl
の遺伝子生産物のレギユロンの様なレギユロ
ンはとりわけ、天然の状態又は修飾された形に
於て好適なものである。 (2) 微生物宿主細胞による蛋白質の細胞周辺腔及
び／又は培養基中への分泌、すなわちその蛋白
質の細胞内分解を防ぎ、又は蛋白質の細胞内レ
ベルが非常に高くなることによる正常な細胞プ
ロセスを阻害することを防ぐ。多くの原核及び
真核細胞中では、蛋白質の非修飾型の特殊な
NH2−末端アミノ酸配列が蛋白質の分泌過程に
関係しているということが現在一般に受け入れ
られている（G.Blobel及びB.Dobberstein
（1975）、J.Cell.Biol.67、835−851参照）。 最近、この過程に蛋白質のCOOH−末端の
アミノ酸配列も役割を演じていることが証明さ
れた（D.Koshland及びD.Botstein（1980）、
Cell 20、749−760参照）。 従つて、組換えDNA分子によりコードされ
た蛋白質が、微生物細胞によるその蛋白質の分
泌を促進する様なアミノ酸配列をそのNH2−及
び／又はCOOH−末端に持つているかどうか
ということは大きな経済的重要性がある。 本発明に於ては、上記の要求を満たす組換え
DNA分子を構成するために組換えDNA及びその
他の分子生物学的技法が使用されている。 本発明は更に特定部位の突然変異誘発を使用す
る構造遺伝子の遺伝情報の変化に関する。 本発明を更によく理解するため、本明細書中で
使用される最も重要な用語について以下に定義す
る。 レギユロンはプロモーター領域及びオペレータ
ー領域より成るDNAの配列である。 構造遺伝子は鋳型（mRNA）を通じて特異な
ポリペプチドに固有のアミノ酸配列をコードする
DNA配列である。 プロモータは転写の開始のためRNAポリメラ
ーゼが結合するレギユロン中のDNA配列であ
る。 オペレーターはリプレツサー蛋白が結合し、そ
の結果RNAポリメラーゼが隣のプロモーターに
結合することを防ぐ、レギユロン中のDNA配列
である。 インジユーサーはリプレツサー蛋白質を不活化
し、オペレーターを解放し、RNAポリメラーゼ
をプロモーターに結合させ、転写を開始させる物
質である。 プレプロソーマチンは対立型の非修飾蛋白質の
１つを意味する（配列４）。 クローニングビークルは適当な宿主細胞に形質
転換した後で自己複製をさせるDNA配列（元の
ままのレプリコン）を包含する非染色体二重鎖
DNA、プラスミド又はフアージ。 フアージ又はバクテリオフアージは適当な細菌
宿主細胞中で複製出来る細菌ビールス。 解読わく（Reading frame）はmRNAレベルに
於て適当なコードンのポリペプチドへの翻訳が起
る様なわくへの三つ組ヌクレオチド（コードン）
のグループ化。 転写は遺伝子からRNAを作るプロセス。 翻訳はmRNAよりポリペプチドを生産するプ
ロセス。 発現は構造遺伝子によりポリペプチドを生産す
るプロセス。これは少くとも転写及び翻訳を含む
多くのプロセスの組合せである。 プレプロソーマチン遺伝子は非修飾プレプロソ
ーマチンをコードするメツセンジヤーRNA部分
と正しく同じ情報（コード配列）を持つ二重鎖の
DNA配列を意味する。 シグナルペプチドは生物膜に高い親和性を有し
及び／又は、生物膜を通してプレプロ蛋白質の輸
送に関与するプレプロ蛋白質の一部を意味する。
この様な輸送プロセスはしばしばプレプロ蛋白質
の成熟型の蛋白質の１つへの修飾を伴う。 二重鎖のヌクレオチド配列は便宜上一本鎖とし
て示す。本発明により組換えプラスミドは次によ
り提供される： (i) 各種対立型のプレプロソーマチンをコードす
る構造遺伝子又はこれ等構造遺伝子の変異型
（配列２、３、４及び第１図、第２図）。 配列２はプレプロソーマチン及びその構造遺
伝子の暗号鎖に相当するアミノ酸及びヌクレオ
チド配列のヌクレオチド32−736を示し、配列
３はプロソーマチン及びその構造遺伝子の暗号
鎖に相当するアミノ酸及びDNA配列のヌクレ
オチド98−736を示し、配列４はプレソーマチ
ン及びその構造遺伝子の暗号鎖に相当するアミ
ノ酸及びDNA配列のヌクレオチド32−718示
す。 第１図の上部にはソーマチンの３つのプリカ
ーサの関係を示してある。この図は変異の可能
性を示し、野性型は配列１に示す。第２図は本
発明者に導入された若干の変異、すなわち47位
のＴをＣに、507位および／又は513位のＡをＣ
に置換することが示されている。
ーマチンをコードする構造遺伝子、各種対立型の
非修飾ソーマチン、各種対立型のプレプロソーマ
チン及び天然修飾の種々の段階における天然及
び／又は人為的に変異したプレプロソーマチンを
コードする構造遺伝子を包含する組換えDNA及
びプラスミド、及び微生物、特にこの遺伝子が発
現されている細菌を形質転換させるためのこの組
換えプラスミドの使用に関する。 ソーマチンはソーマトコツカス・ダニエリ
（Thaumatococcus daniellii）の果実の仮種皮に
由来する蛋白質である。ソーマチンは重量基準で
砂糖の1600倍、分子基準で砂糖の105倍の甘味度
がある。西洋社会に於ては糖の過剰消費が多くの
健康上の問題を起している。従つて低カロリー甘
味料で糖を代用する多くの試みがなされている。
然し乍ら此等のうちの数種は副作用の観点から最
近禁止されている。従つて天然の低カロリー甘味
料及びその経済的な製造法が必要とされている。
最近の分子生物学の進歩は特定の真核生物の蛋白
質をコードする遺伝子を宿主微生物細胞に導入
し、形質転換された宿主細胞の中でその遺伝子を
発現させ、これにより目的とする蛋白質を製造す
ることを可能にした。 天然の状態では、非修飾型の蛋白質をコードす
る多くの真核生物の遺伝子は直接には組換え
DNA分子中に適用することは出来ない。何故な
ら天然の遺伝子はメツセンジヤーRNA
（mRNA）には含まれていないイントロン（介在
配列）と呼ばれるDNA配列を含んでいるからで
ある。これ等イントロンの上に位置する情報は
mRNAの翻訳過程の前に真該細胞の中で除かれ
る。本発明者の知る限り、細菌はRNAレベルで
はその様なイントロンを切除することは出来ず、
従つて真該生物の天然の遺伝子が原核宿主細胞に
使用出来る前に、此等イントロン上に位置する遺
伝情報をDNAレベルで除くことが必要である。 mRNAレベルでイントロンを切除する能力を
持つ微生物宿主細胞に於ては、天然の遺伝子が微
生物宿主細胞中で有効であるレギユロンの調節下
でもたらされるならば、その天然の遺伝子は原則
的に適用出来る。 経済的な理由で、組換えDNA遺伝子によりコ
ードされた蛋白質は最適条件で生産されることが
重要である。この目的を達するための主たる方法
は次の通りである。 (1) 有効なレギユロンの下流の構造遺伝子を、選
択した生育条件下で、単位細胞当り生産される
蛋白質の量（最適数の細胞により）が出来るだ
け多くなる様に、統合する。この目的のために
は二重lacUV5およびE.coli（大腸菌）のtrpレ
ギユロン、バクテリオフアージM13、fd及びfl
の遺伝子生産物のレギユロンの様なレギユロ
ンはとりわけ、天然の状態又は修飾された形に
於て好適なものである。 (2) 微生物宿主細胞による蛋白質の細胞周辺腔及
び／又は培養基中への分泌、すなわちその蛋白
質の細胞内分解を防ぎ、又は蛋白質の細胞内レ
ベルが非常に高くなることによる正常な細胞プ
ロセスを阻害することを防ぐ。多くの原核及び
真核細胞中では、蛋白質の非修飾型の特殊な
NH2−末端アミノ酸配列が蛋白質の分泌過程に
関係しているということが現在一般に受け入れ
られている（G.Blobel及びB.Dobberstein
（1975）、J.Cell.Biol.67、835−851参照）。 最近、この過程に蛋白質のCOOH−末端の
アミノ酸配列も役割を演じていることが証明さ
れた（D.Koshland及びD.Botstein（1980）、
Cell 20、749−760参照）。 従つて、組換えDNA分子によりコードされ
た蛋白質が、微生物細胞によるその蛋白質の分
泌を促進する様なアミノ酸配列をそのNH2−及
び／又はCOOH−末端に持つているかどうか
ということは大きな経済的重要性がある。 本発明に於ては、上記の要求を満たす組換え
DNA分子を構成するために組換えDNA及びその
他の分子生物学的技法が使用されている。 本発明は更に特定部位の突然変異誘発を使用す
る構造遺伝子の遺伝情報の変化に関する。 本発明を更によく理解するため、本明細書中で
使用される最も重要な用語について以下に定義す
る。 レギユロンはプロモーター領域及びオペレータ
ー領域より成るDNAの配列である。 構造遺伝子は鋳型（mRNA）を通じて特異な
ポリペプチドに固有のアミノ酸配列をコードする
DNA配列である。 プロモータは転写の開始のためRNAポリメラ
ーゼが結合するレギユロン中のDNA配列であ
る。 オペレーターはリプレツサー蛋白が結合し、そ
の結果RNAポリメラーゼが隣のプロモーターに
結合することを防ぐ、レギユロン中のDNA配列
である。 インジユーサーはリプレツサー蛋白質を不活化
し、オペレーターを解放し、RNAポリメラーゼ
をプロモーターに結合させ、転写を開始させる物
質である。 プレプロソーマチンは対立型の非修飾蛋白質の
１つを意味する（配列４）。 クローニングビークルは適当な宿主細胞に形質
転換した後で自己複製をさせるDNA配列（元の
ままのレプリコン）を包含する非染色体二重鎖
DNA、プラスミド又はフアージ。 フアージ又はバクテリオフアージは適当な細菌
宿主細胞中で複製出来る細菌ビールス。 解読わく（Reading frame）はmRNAレベルに
於て適当なコードンのポリペプチドへの翻訳が起
る様なわくへの三つ組ヌクレオチド（コードン）
のグループ化。 転写は遺伝子からRNAを作るプロセス。 翻訳はmRNAよりポリペプチドを生産するプ
ロセス。 発現は構造遺伝子によりポリペプチドを生産す
るプロセス。これは少くとも転写及び翻訳を含む
多くのプロセスの組合せである。 プレプロソーマチン遺伝子は非修飾プレプロソ
ーマチンをコードするメツセンジヤーRNA部分
と正しく同じ情報（コード配列）を持つ二重鎖の
DNA配列を意味する。 シグナルペプチドは生物膜に高い親和性を有し
及び／又は、生物膜を通してプレプロ蛋白質の輸
送に関与するプレプロ蛋白質の一部を意味する。
この様な輸送プロセスはしばしばプレプロ蛋白質
の成熟型の蛋白質の１つへの修飾を伴う。 二重鎖のヌクレオチド配列は便宜上一本鎖とし
て示す。本発明により組換えプラスミドは次によ
り提供される： (i) 各種対立型のプレプロソーマチンをコードす
る構造遺伝子又はこれ等構造遺伝子の変異型
（配列２、３、４及び第１図、第２図）。 配列２はプレプロソーマチン及びその構造遺
伝子の暗号鎖に相当するアミノ酸及びヌクレオ
チド配列のヌクレオチド32−736を示し、配列
３はプロソーマチン及びその構造遺伝子の暗号
鎖に相当するアミノ酸及びDNA配列のヌクレ
オチド98−736を示し、配列４はプレソーマチ
ン及びその構造遺伝子の暗号鎖に相当するアミ
ノ酸及びDNA配列のヌクレオチド32−718示
す。 第１図の上部にはソーマチンの３つのプリカ
ーサの関係を示してある。この図は変異の可能
性を示し、野性型は配列１に示す。第２図は本
発明者に導入された若干の変異、すなわち47位
のＴをＣに、507位および／又は513位のＡをＣ
に置換することが示されている。
【表】
【表】
【表】
【表】
【表】
(ii) この構造遺伝子の発現を調節する特異な
DNA配列。これ等の特異なDNA配列は誘導可
能レギユロンか又は構造的レギユロンより成
る。好ましい誘導可能レギユロンはGoeddel氏
等がNature281、544−548（1979）に記載した
二重lacUV5システム、プラスミドPUR201（第
３図）より成る。第３図にはプラスミド
pKB268からlacUV ５ レギユロンの単離、プ
ラスミドpBR322に挿入およびEcoRI部位の１
つを除去し、プラスミドpUR201を得ることを
示す。 もう１つの好ましい誘導可能レギユロンは
F.Lee氏等がJ.Mol.Biol.121、193−217
（1978）及びK.Bertrand氏等がScience189、22
−26（1975）に記載したトリプトフアンシステ
ムの成分である。 本発明者はこのトリプトフアンシステムを第
４図の様な更に適当なシステムを得る様に改変
した。この改変システムに於てはアテニユエー
ター領域と先導転写（leader transcript）に於
ける14残基ペプチドのための情報は除かれてい
るが、後者の蛋白質のリボソーム結合部位は保
持されている。第４図には、プラスミド
pTRPED−５からtrpレギユロンの単離、TaqI
制限酵素で処理、EcoRI制限部位を付着し、そ
れをプラスミドpBR322に挿入して改変するこ
と、およびEcoRI部位の１つを除去して、プラ
スミドpUR301を得ることが示されている。 本発明による好ましい組換えプラスミドは更に
バクテリオフアージM13、rd又はflの遺伝子の
改変されたプロモーター／リボソームー結合部位
（第５図）、P.M.G.F.Van Wezenbeek氏等、Gene
11、129−148（1980）、より成るDNA配列を包含
し、本発明者の知る限り、これは今迄真核遺伝子
の発現には使用されたことのないものである。第
５図にはM13−遺伝子VIIIの単離、その一部をと
り、EcoRI部位を供し、pBR322に挿入、EcoRI
部位の一つを除去し、プラスミドpUR401を得る
ことが示されている。 本発明による組換えプラスミドに於て、レギユ
ロンは直接に構造遺伝子に結合するか又は新規な
開始コードン及びヌクレオチド配列（5′）pCAT
（Ｎ）oGAATTC（N′）oATGOH（3′）（ｎ＝０、
１、２及び３、Ｎ及びN′はＡ、Ｔ、Ｇ又はＣヌ
クレオチドのいずれかであるが、二重鎖の構造に
於てＮ及びN′は回転対称構造の存在するような
ものである）を包含するDNAリンカーを含む
EcoRIを通して間接的に構造遺伝子に結合するこ
とができる。回転対称構造とは例えばＮがＡで示
されるとすれば、N′はその相補的塩基Ｔにより
示されることを意味する。 ある場合には、レギユロンと構造遺伝子間の
AATT配列が除かれると、発現の効率が改良す
ることが分つた。本発明によれば、各種対立型の
プレプロソーマチンをコードする天然又は変異さ
れた構造遺伝子を含む微生物のクローニングビー
クルが得られ、多くの工程を経て、各種プレプロ
ソーマチンが生産される。それ等の工程の最も主
要なものは： (1) ソーマチンのメツセンジヤーRNA
（mRNA）の分離と精製、 (2) このmRNAを二重鎖DNA（dsDSA）に転
換、 (3) poly−dC尾部を持つdsDNAの構成、 (4) dsDNA−ポリ−dC分子をPstI−切断した及
びポリ−dG−尾部をつけたプラスミド
pBR322DNAへ導入 (5) 形質転換及びクローンの選択、 (6) RNA／DNAハイブリド形成及び生体外翻訳
による挿入物の性質の決定、 (7) DNA−及びRNA−配列分析による挿入物の
性質の二重チエツク、 (8a) 非修飾プレプロソーマチンをコードする
DNAの生産（配列１、２及び第１図）、 (8b) プロソーマチンをコードするDNAの生産
（配列３）、 (8c) プレソーマチンをコードするDNAの生産
（配列４）、 (8d) 特殊の変異がヌクレオチド配列32−97、特
にヌクレオチド32−49、に導入された場合を
除き、非修飾プレプロソーマチンをコードす
るDNAの生産（配列１及び第２図）、 (8e) 特殊な変異がヌクレオチド配列32−736、
特にヌクレオチド配列332−718に導入された
場合を除き、（8a−8d）に記載されたDNAの
生産（配列１及び第２図）、 (9) DNA配列を調節する特定の転写、DNAリン
カー及びプライマーの化学合成より成るプラス
ミドの構成、 (10) 構成的又は誘導可能レギユロン及び（8a−
8e）に記載された連結したプレプロソーマチン
遺伝子より成るプラスミドの構成及びこのプラ
スミドによるE.coliの形質転換。 (11) 組み換えプラスミドを含む大腸菌細胞の培養
及びプレプロソーマチン又はそれ等の天然修飾
型の検出と分離。 配列１はプレプロソーマチン蛋白質分子の対立
型及びmRNA／DNA分子に相当するアミノ酸及
びヌクレオチド配列を示す。このDNA配列はプ
ラスミドpUR100に存在するが、このpUR100は
上記DNA配列をプラスミドpBR322のPstI部位に
挿入して調製される。
DNA配列。これ等の特異なDNA配列は誘導可
能レギユロンか又は構造的レギユロンより成
る。好ましい誘導可能レギユロンはGoeddel氏
等がNature281、544−548（1979）に記載した
二重lacUV5システム、プラスミドPUR201（第
３図）より成る。第３図にはプラスミド
pKB268からlacUV ５ レギユロンの単離、プ
ラスミドpBR322に挿入およびEcoRI部位の１
つを除去し、プラスミドpUR201を得ることを
示す。 もう１つの好ましい誘導可能レギユロンは
F.Lee氏等がJ.Mol.Biol.121、193−217
（1978）及びK.Bertrand氏等がScience189、22
−26（1975）に記載したトリプトフアンシステ
ムの成分である。 本発明者はこのトリプトフアンシステムを第
４図の様な更に適当なシステムを得る様に改変
した。この改変システムに於てはアテニユエー
ター領域と先導転写（leader transcript）に於
ける14残基ペプチドのための情報は除かれてい
るが、後者の蛋白質のリボソーム結合部位は保
持されている。第４図には、プラスミド
pTRPED−５からtrpレギユロンの単離、TaqI
制限酵素で処理、EcoRI制限部位を付着し、そ
れをプラスミドpBR322に挿入して改変するこ
と、およびEcoRI部位の１つを除去して、プラ
スミドpUR301を得ることが示されている。 本発明による好ましい組換えプラスミドは更に
バクテリオフアージM13、rd又はflの遺伝子の
改変されたプロモーター／リボソームー結合部位
（第５図）、P.M.G.F.Van Wezenbeek氏等、Gene
11、129−148（1980）、より成るDNA配列を包含
し、本発明者の知る限り、これは今迄真核遺伝子
の発現には使用されたことのないものである。第
５図にはM13−遺伝子VIIIの単離、その一部をと
り、EcoRI部位を供し、pBR322に挿入、EcoRI
部位の一つを除去し、プラスミドpUR401を得る
ことが示されている。 本発明による組換えプラスミドに於て、レギユ
ロンは直接に構造遺伝子に結合するか又は新規な
開始コードン及びヌクレオチド配列（5′）pCAT
（Ｎ）oGAATTC（N′）oATGOH（3′）（ｎ＝０、
１、２及び３、Ｎ及びN′はＡ、Ｔ、Ｇ又はＣヌ
クレオチドのいずれかであるが、二重鎖の構造に
於てＮ及びN′は回転対称構造の存在するような
ものである）を包含するDNAリンカーを含む
EcoRIを通して間接的に構造遺伝子に結合するこ
とができる。回転対称構造とは例えばＮがＡで示
されるとすれば、N′はその相補的塩基Ｔにより
示されることを意味する。 ある場合には、レギユロンと構造遺伝子間の
AATT配列が除かれると、発現の効率が改良す
ることが分つた。本発明によれば、各種対立型の
プレプロソーマチンをコードする天然又は変異さ
れた構造遺伝子を含む微生物のクローニングビー
クルが得られ、多くの工程を経て、各種プレプロ
ソーマチンが生産される。それ等の工程の最も主
要なものは： (1) ソーマチンのメツセンジヤーRNA
（mRNA）の分離と精製、 (2) このmRNAを二重鎖DNA（dsDSA）に転
換、 (3) poly−dC尾部を持つdsDNAの構成、 (4) dsDNA−ポリ−dC分子をPstI−切断した及
びポリ−dG−尾部をつけたプラスミド
pBR322DNAへ導入 (5) 形質転換及びクローンの選択、 (6) RNA／DNAハイブリド形成及び生体外翻訳
による挿入物の性質の決定、 (7) DNA−及びRNA−配列分析による挿入物の
性質の二重チエツク、 (8a) 非修飾プレプロソーマチンをコードする
DNAの生産（配列１、２及び第１図）、 (8b) プロソーマチンをコードするDNAの生産
（配列３）、 (8c) プレソーマチンをコードするDNAの生産
（配列４）、 (8d) 特殊の変異がヌクレオチド配列32−97、特
にヌクレオチド32−49、に導入された場合を
除き、非修飾プレプロソーマチンをコードす
るDNAの生産（配列１及び第２図）、 (8e) 特殊な変異がヌクレオチド配列32−736、
特にヌクレオチド配列332−718に導入された
場合を除き、（8a−8d）に記載されたDNAの
生産（配列１及び第２図）、 (9) DNA配列を調節する特定の転写、DNAリン
カー及びプライマーの化学合成より成るプラス
ミドの構成、 (10) 構成的又は誘導可能レギユロン及び（8a−
8e）に記載された連結したプレプロソーマチン
遺伝子より成るプラスミドの構成及びこのプラ
スミドによるE.coliの形質転換。 (11) 組み換えプラスミドを含む大腸菌細胞の培養
及びプレプロソーマチン又はそれ等の天然修飾
型の検出と分離。 配列１はプレプロソーマチン蛋白質分子の対立
型及びmRNA／DNA分子に相当するアミノ酸及
びヌクレオチド配列を示す。このDNA配列はプ
ラスミドpUR100に存在するが、このpUR100は
上記DNA配列をプラスミドpBR322のPstI部位に
挿入して調製される。
【表】
【表】
以下の詳細な記載により本発明を説明する。
１ mRNA（ソーマチン）の分離と精製
分離したソーマトコツカスダニエリ
（Thaumatococcus danielli）の仮種皮を液体窒
素下で磨砕した。フエノールによる蛋白質抽出
の後、K.S.kirby（1965）、Biochem.J.96、226
−269、U.Wiegers及びH.Hilz（1972）FEBS
Letters23、77−82に記載された方法により
LiClを用いてRNAを選択的に沈澱させた。 メツセンジヤーRNAを含むポリーＡはオリ
ゴーdT−セルローズカラムを数段階通過させ
て回収し、このメツセンジヤー混合物からポリ
アクリルアミド電気泳動により、ソーマチンを
コードするmRNAを分離した。これをH.Aviv
及びP.Leder（1972）Proc.Natl.Acad.Sci.、米
国69、1408−1412、J.W.Davies及びP.
Kaesburg（1973）、J.Virol.12、1434−1441に
記載された小麦胚芽システムの中でmRNAの
翻訳によりチエツクした。 ２ ソーマチンmRNAの二重鎖DNAへの変換 精製したソーマチンmRNAを、G.N.Buell
等、J.Biol.Chem.（1978）253、2471−2482に
記載された方法により、一本鎖DNA分子を生
じる様にAMV逆転写酵素を用いてコピーし
た。このDNAは次に、A.R.Davis等、Gene
10、205−218（1980）に記載された方法によ
り、E.coli DNA−ポリメラーゼを用いて二重
鎖分子に転換した。この二重鎖のDNAコピー
のループ構造をS1−ヌクレアーゼ消化により
除去した。 ３ ポリーdC尾部による二重鎖DNAの構成 所望の長さのDNA分子は、R.Roychoudhury
等、（1976）Nucleic Acid Research３、863−
877に記載された方法に従い、ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動、ゲルからの抽出及び末端転
移酵素（terminal transferase）によるpoly−
dC尾部づけにより得た。 ４ ds DNA−ポリ−dC分子のプラスミド
pBR322中への統合 プラスミドpBR322を、β−ラクタマーゼ蛋
白質をコードする遺伝子中に存在する認識部位
に於てプラスミドを切断する制限エンドヌクレ
アーゼPstIにより処理し、その後末端転位酵素
によりポリーdG尾部をpBR322の線状DNAに供
給した。このポリ−dC DNA分子をポリ−dG
尾部を持つプラスミドpBR322にアニーリング
（再水素結合）した。 ５ 形質転換及びクローン選択 この様にして得たプラスミドをCaCl2で処理
したE.coli細胞に移した。形質転換後、雑種プ
ラスミドDNA分子を含む細胞をそのテトラサ
イクリン耐性に従つて選択した。陽性コロニー
は、H.C.BirnboimとJ.Doly、Nucleic Acids
Research７、1513−1523（1979）に記述した
迅速プラスミド抽出法及び分離したDNAの
PstI−消化の組合せにより大きな挿入を持つプ
ラスミドにより選別した。 ６ 挿入（）の性質決定 ハイブリツド形成／生体外翻訳 選択したクローンより10μｇのプラスミド
DNAを分離し、次いでこれをジアゾ化
（DBM）ペーパーデイスクに結合させた。この
固定化プラスミドDNA分子は、J.G.Williams
等がCell17、903−913（1979）に挿入DNAの
性質決定の為に記述したハイブリツド形成／生
体外翻訳法に使用した。 ７ DNA及びRNA配列解析による挿入（）の
性質の決定 ソーマチン挿入物のヌクレオチド配列解析
を、A.M.Maxam及びW.GilbertがMethod in
Engymology、L.Grossmann及びK.Moldare編
ニユーヨーク、アカデミツクプレス1980第65巻
(1)499−560頁に概説した化学的分解法及びJ.
Maat及びA.J.H.SmithがNucleic Acids
Research５、4537−4545（1978）に概説した
ジデオキシ／ニツク翻訳法により行なつた。 ソーマチンmRNAのヌクレオチド配列に関
するこれ以上の情報は、D.Zimmern及びP.
Kaesberg、Proc.Natl.Acad.Sci.、USA75、
4257−4261（1978）に記述された、読み終り阻
害因子（Chain Terminating inhibitor）の存
在下で、ソーマチンmRNA鋳型に対するAMV
−逆転写酵素により開始された合成により間接
的に誘導された。このスクリーニング（選別）
により特にほゞ完全なソーマチンmRNAのコ
ピーを含むプラスミドpUR100が得られた。 ８ 各種成熟型のプレプロソーマチンをコードす
るDNAの生産 8a 非修飾型プレプロソーマチンをコードする
DNAの生産 プラスミドpUR100を制限エンドヌクレア
ーゼPstIで処理し、次いで少くともヌクレオ
チド31−793（配列１）を含むDNA配列を制
限エンドヌクレアーゼHaeで処理し、とり
わけ36−143の位置から始まるDNA断片を生
じた。この断片は平滑末端でこれに化学的に
合成されたリンカー（5′）p
CCGGATCCGGOH（3′）を連結し、次いで
制限エンドヌクレアーゼBamH Ｉで処理
し、引続きpBR322の制限エンドヌクレアー
ゼBamH Ｉ部位に於いて連結し、E.coli中で
クローニングした。クローン断片を含むプラ
スミドDNAをHpa及びS1ヌクレアーゼで
処理し、ヌクレオチド配列
（Thaumatococcus danielli）の仮種皮を液体窒
素下で磨砕した。フエノールによる蛋白質抽出
の後、K.S.kirby（1965）、Biochem.J.96、226
−269、U.Wiegers及びH.Hilz（1972）FEBS
Letters23、77−82に記載された方法により
LiClを用いてRNAを選択的に沈澱させた。 メツセンジヤーRNAを含むポリーＡはオリ
ゴーdT−セルローズカラムを数段階通過させ
て回収し、このメツセンジヤー混合物からポリ
アクリルアミド電気泳動により、ソーマチンを
コードするmRNAを分離した。これをH.Aviv
及びP.Leder（1972）Proc.Natl.Acad.Sci.、米
国69、1408−1412、J.W.Davies及びP.
Kaesburg（1973）、J.Virol.12、1434−1441に
記載された小麦胚芽システムの中でmRNAの
翻訳によりチエツクした。 ２ ソーマチンmRNAの二重鎖DNAへの変換 精製したソーマチンmRNAを、G.N.Buell
等、J.Biol.Chem.（1978）253、2471−2482に
記載された方法により、一本鎖DNA分子を生
じる様にAMV逆転写酵素を用いてコピーし
た。このDNAは次に、A.R.Davis等、Gene
10、205−218（1980）に記載された方法によ
り、E.coli DNA−ポリメラーゼを用いて二重
鎖分子に転換した。この二重鎖のDNAコピー
のループ構造をS1−ヌクレアーゼ消化により
除去した。 ３ ポリーdC尾部による二重鎖DNAの構成 所望の長さのDNA分子は、R.Roychoudhury
等、（1976）Nucleic Acid Research３、863−
877に記載された方法に従い、ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動、ゲルからの抽出及び末端転
移酵素（terminal transferase）によるpoly−
dC尾部づけにより得た。 ４ ds DNA−ポリ−dC分子のプラスミド
pBR322中への統合 プラスミドpBR322を、β−ラクタマーゼ蛋
白質をコードする遺伝子中に存在する認識部位
に於てプラスミドを切断する制限エンドヌクレ
アーゼPstIにより処理し、その後末端転位酵素
によりポリーdG尾部をpBR322の線状DNAに供
給した。このポリ−dC DNA分子をポリ−dG
尾部を持つプラスミドpBR322にアニーリング
（再水素結合）した。 ５ 形質転換及びクローン選択 この様にして得たプラスミドをCaCl2で処理
したE.coli細胞に移した。形質転換後、雑種プ
ラスミドDNA分子を含む細胞をそのテトラサ
イクリン耐性に従つて選択した。陽性コロニー
は、H.C.BirnboimとJ.Doly、Nucleic Acids
Research７、1513−1523（1979）に記述した
迅速プラスミド抽出法及び分離したDNAの
PstI−消化の組合せにより大きな挿入を持つプ
ラスミドにより選別した。 ６ 挿入（）の性質決定 ハイブリツド形成／生体外翻訳 選択したクローンより10μｇのプラスミド
DNAを分離し、次いでこれをジアゾ化
（DBM）ペーパーデイスクに結合させた。この
固定化プラスミドDNA分子は、J.G.Williams
等がCell17、903−913（1979）に挿入DNAの
性質決定の為に記述したハイブリツド形成／生
体外翻訳法に使用した。 ７ DNA及びRNA配列解析による挿入（）の
性質の決定 ソーマチン挿入物のヌクレオチド配列解析
を、A.M.Maxam及びW.GilbertがMethod in
Engymology、L.Grossmann及びK.Moldare編
ニユーヨーク、アカデミツクプレス1980第65巻
(1)499−560頁に概説した化学的分解法及びJ.
Maat及びA.J.H.SmithがNucleic Acids
Research５、4537−4545（1978）に概説した
ジデオキシ／ニツク翻訳法により行なつた。 ソーマチンmRNAのヌクレオチド配列に関
するこれ以上の情報は、D.Zimmern及びP.
Kaesberg、Proc.Natl.Acad.Sci.、USA75、
4257−4261（1978）に記述された、読み終り阻
害因子（Chain Terminating inhibitor）の存
在下で、ソーマチンmRNA鋳型に対するAMV
−逆転写酵素により開始された合成により間接
的に誘導された。このスクリーニング（選別）
により特にほゞ完全なソーマチンmRNAのコ
ピーを含むプラスミドpUR100が得られた。 ８ 各種成熟型のプレプロソーマチンをコードす
るDNAの生産 8a 非修飾型プレプロソーマチンをコードする
DNAの生産 プラスミドpUR100を制限エンドヌクレア
ーゼPstIで処理し、次いで少くともヌクレオ
チド31−793（配列１）を含むDNA配列を制
限エンドヌクレアーゼHaeで処理し、とり
わけ36−143の位置から始まるDNA断片を生
じた。この断片は平滑末端でこれに化学的に
合成されたリンカー（5′）p
CCGGATCCGGOH（3′）を連結し、次いで
制限エンドヌクレアーゼBamH Ｉで処理
し、引続きpBR322の制限エンドヌクレアー
ゼBamH Ｉ部位に於いて連結し、E.coli中で
クローニングした。クローン断片を含むプラ
スミドDNAをHpa及びS1ヌクレアーゼで
処理し、ヌクレオチド配列
【式】
を得た。この配列は平滑末端で、これを化学
的に合成したリンカー（5′）pCAT（Ｎ）o
GAATTC（N′）oATGOH（3′）に連結し、制
限エンドヌクレアーゼEcoRIで処理し、次い
でpBR322のEcoRI部位に統合し、E.coli中に
クローニングした。 プレプロソーマチン挿入物を持つプラスミ
ドをEcoRI及び制限エンドヌクレアーゼ
Sau3Aで処理し、第６図の断片Ａを得た。 プラスミドpUR100を制御エンドヌクレア
ーゼPst Ｉ及びEcoRIでMn++（１ミリモ
ル／１）の存在下で処理した。此の条件下で
EcoRIは配列AATTを認識する。S1ヌクレア
ーゼ処理後、このDNA断片は平滑末端で、
これを化学的に合成したリンカー（5′）p
CCAAGCTTGGOH（3′）に連結し、次いで
制限エンドヌクレアーゼHind及びSau3A
で処理し、断片Ｂを得た（Sau3Aでヌクレオ
チド位置109部位で、Hindで791位置後の
部位で）。断片Ａ及びＢを連結し、次いで
EcoRI及びHind処理したPBR322に統合
し、プラスミドpUR101を得た（第７図）。第
６図と第７図には、プレプロソーマチン遺伝
子32−736および末端部位（731−791）を含
む配列１のDNA配列32−791を単離する操作
が記述されている。更に、この遺伝子の開始
コドンAGT（32−35）の上流にEcoRIを供
し、微生物の宿主にし構造遺伝子の発現を調
節するレギユロンを導入することが可能にな
つた。 一本鎖のDNA鋳型は、Klenow−DNAポリ
メラーゼによる修復合成及びRFM13−mp2
のEcoRI部位に於けるEcoRI−リンカー
（5′）pGGAATTCCOH（3′）の付加後に、p
UR101のEcoRI−Hind断片をクローニング
することにより得た。 クローンM13−101−Ａは、一本鎖がソー
マチンmRNAと同じ極性を持つような挿入
プレプロソーマチンDNAを持つている；ク
ローンM13−101−Ｂは一重鎖がソーマチン
mRNAと反対の極性を持つているような挿
入プレプロソーマチンを持つている（第８
図）。第８図には、第７図の断片ＡとＢを含
むPUR101のEcoRI−Hindの単離、Hind
部位をEcoRI部位に変えそして得られた断片
をフアージREM13−mp2に挿入して、反対
方向（M13−101−ＡとM13−101−Ｂ）に挿
入された断片を有する２つの単一鎖を得るこ
とが示されている。これら単一鎖は、プレプ
ロソーマチン遺伝子を遺伝子（ヌクレオチド
719以上を欠く、第９図参照）およびプロソ
ーマチン遺伝子（ソーマチンのプレ部をコー
ドするヌクレオチド32−97を欠く、第１０図
参照）に改変するのに使われる。 8b プレソーマチンをコードするDNAの生産 M13−101−Ａ−の一本鎖DNAを、化学的
に合成したDNA配列（5′）p
TCAGGCAGTAGGGCOH（3′）をプライマ
ーとして使い、相補的DNAの合成の鋳型と
して使用した。ds DNAの熱変性後、相補的
DNA鎖は、断片
的に合成したリンカー（5′）pCAT（Ｎ）o
GAATTC（N′）oATGOH（3′）に連結し、制
限エンドヌクレアーゼEcoRIで処理し、次い
でpBR322のEcoRI部位に統合し、E.coli中に
クローニングした。 プレプロソーマチン挿入物を持つプラスミ
ドをEcoRI及び制限エンドヌクレアーゼ
Sau3Aで処理し、第６図の断片Ａを得た。 プラスミドpUR100を制御エンドヌクレア
ーゼPst Ｉ及びEcoRIでMn++（１ミリモ
ル／１）の存在下で処理した。此の条件下で
EcoRIは配列AATTを認識する。S1ヌクレア
ーゼ処理後、このDNA断片は平滑末端で、
これを化学的に合成したリンカー（5′）p
CCAAGCTTGGOH（3′）に連結し、次いで
制限エンドヌクレアーゼHind及びSau3A
で処理し、断片Ｂを得た（Sau3Aでヌクレオ
チド位置109部位で、Hindで791位置後の
部位で）。断片Ａ及びＢを連結し、次いで
EcoRI及びHind処理したPBR322に統合
し、プラスミドpUR101を得た（第７図）。第
６図と第７図には、プレプロソーマチン遺伝
子32−736および末端部位（731−791）を含
む配列１のDNA配列32−791を単離する操作
が記述されている。更に、この遺伝子の開始
コドンAGT（32−35）の上流にEcoRIを供
し、微生物の宿主にし構造遺伝子の発現を調
節するレギユロンを導入することが可能にな
つた。 一本鎖のDNA鋳型は、Klenow−DNAポリ
メラーゼによる修復合成及びRFM13−mp2
のEcoRI部位に於けるEcoRI−リンカー
（5′）pGGAATTCCOH（3′）の付加後に、p
UR101のEcoRI−Hind断片をクローニング
することにより得た。 クローンM13−101−Ａは、一本鎖がソー
マチンmRNAと同じ極性を持つような挿入
プレプロソーマチンDNAを持つている；ク
ローンM13−101−Ｂは一重鎖がソーマチン
mRNAと反対の極性を持つているような挿
入プレプロソーマチンを持つている（第８
図）。第８図には、第７図の断片ＡとＢを含
むPUR101のEcoRI−Hindの単離、Hind
部位をEcoRI部位に変えそして得られた断片
をフアージREM13−mp2に挿入して、反対
方向（M13−101−ＡとM13−101−Ｂ）に挿
入された断片を有する２つの単一鎖を得るこ
とが示されている。これら単一鎖は、プレプ
ロソーマチン遺伝子を遺伝子（ヌクレオチド
719以上を欠く、第９図参照）およびプロソ
ーマチン遺伝子（ソーマチンのプレ部をコー
ドするヌクレオチド32−97を欠く、第１０図
参照）に改変するのに使われる。 8b プレソーマチンをコードするDNAの生産 M13−101−Ａ−の一本鎖DNAを、化学的
に合成したDNA配列（5′）p
TCAGGCAGTAGGGCOH（3′）をプライマ
ーとして使い、相補的DNAの合成の鋳型と
して使用した。ds DNAの熱変性後、相補的
DNA鎖は、断片
【式】
（この合成については8aに記載した）をプライ
マーとして使うDNA合成用の鋳型として働い
た。次いで、得られたds DNA断片をSI−ヌク
レアーゼで処理し、その平滑末端をEcoRI−リ
ンカー（5′）pCAT（Ｎ）oGAATTC（N′）o
ATGOH（3′）（第９図）に連結した。このDNA
をEcoRIで消化し、pBR322のEcoRI制限部位
に統合し、プレソーマチンヌクレオチド配列32
−718を含むプラスミドpUR102を得た。 8c プロソーマチンをコードするDNAの生産 M13−101−Ｂの一重鎖DNAを、化学的に
合成したDNA配列（5′）pGCCACCTTCGOH
（3′）をプライマーとして使い相補的DNAの
合成の鋳型として使用した。生じたds DNA
をEcoRI及びSIスクレアーゼで処理し、次い
でその平滑末端を化学的に合成したEcoRIリ
ンカー（5′）pCAT（Ｎ）oGAATTC（N′）o
ATGOH（3′）に連結した。この断片をEcoRI
で処理し、次いでpBR322のEcoRI制限部位
に統合した結果、プロソーマチンヌクレオチ
ド配列98−736（第１０図）を含むプラスミ
ドpUR103を得た。 8d 特殊の変異がヌクレオチド配列32−97、特
にヌクレオチド32−94に導入された場合を除
き、非修飾プレプロソーマチンをコードする
DNAの生産 M13−101−Ｂの一本鎖DNAを、化学的に
合成したDNA配列（5′）p
ACCACTCGCTTCOH（3′）をプライマーと
して使い、相補的DNA合成の鋳型として使
用した。E.coliをds DNAで形質転換した
後、変異（第47位でＴをＣで置換）を持つ
DNAフアージをDNA配列解析により選択し
た。これ等のフアージはM13Tha47とコード
した（第１１図）。 8e 特殊な変異がヌクレオチド配列32−736、特
にヌクレオチド配列332−718に導入された場
合を除き、（8a−8d）に記載された任意の配
列をコードするDNAの生産 M13−101−Ａの一重鎖DNAを、クレナウ
DNA−ポリメラーゼ及び化学的に合成した
プライマー（5′）pGCCTTCAGCGTCGCOH
（3′）、（5′）pGCCGTCAGCTTCGCOH（3′）
及び（5′）pGCCGTCAGCGTCGCOH（3′）を
使い、DNA合成の鋳型として使用した。 これ等すべての配列は、蛋白質に望ましい
変化を導入するための１つ又は２つの変性を
持つプレプロソーマチン遺伝子（配列４）の
ヌクレオチド503−516に対して相補的であ
る。ds DNAによるE.coliの形質転換の後、
目的とする変性を持つフアージをDNA配列
解析により選択した。此等フアージは
M13Tha507、513、507／513とコードした
（第１２図）。 9a プラスミドpUR201の構成 ダブルlacレギユロン（lacUV5）により成
る285の塩基対を含む断片をpKB268の制限
エンドヌクレアーゼEcoRI切断により得た
（K.BacKman及びM.Ptashne、Cell13、65−
71（1978））。この断片はpBR322DNAの
EcoRI部位に連結した。正しい指向（第３
図）にlacレギユロンを持つプラスミドDNA
をE.coli RNAポリメラーゼの存在下で
EcoRIにより部分的に切断した。制限エンド
ヌクレアーゼHind切断部位から最も遠い
EcoRI切断部位を選択的にアタツクした。直
線化したDNAをSIヌクレアーゼで処理し、
アガロースゲル電気泳動で精製し、T4DNA
−リガーゼにより環状化し、次いでE.coliの
形質転換に使用した。テトラサイクリン−耐
性形質転換体から正しい構造を持つpUR201
（第３図）を得た。 9b プラスミドpUR301の構成 約510の塩基対のDNA断片をptrp ED5の
制限エンドヌクレアーゼHinfI切断により得
た（R.A.Hallewell及びS.Emtage、Gene
９、27−47（1980））。この断片をE.coli
RNAポリメラーゼの存在下で、制限エンド
ヌクレアーゼTaqIで切断した。trpレギユロ
ン中のTaqI部位（K.Bertrand等、Science
189、22−26（1975）及びF.lee等、J.Mol.
Biol.121、193−217（1978）に記載）を選択
的に保護し、この様にしてtrpレギユロンよ
り成る234塩基対を含む断片を生じた（第４
図）。この断片を次にSIヌクレアーゼで処理
し、平滑末端をEcoRI−リンカー（5′）p
GGAATTCCOH（3′）に連結し、EcoRIで切
断し、次いでpBR322のEcoRI−部位中でク
ローニングした。 正しい指向のtrpレギユロンを持つプラス
ミドpUR300（第４図）を単離した。Hind
部位からもつとも離れたEcoRI−切断部位は
臭化エチジウムの存在下で、EcoRIによる
pUR300DNAの部分切断及びSIヌクレアーゼ
処理により除いた。直線状DNA分子は
T4DNAリガーゼにより再環化した。テトラ
サイクリン−耐性形質転換体から、第４図に
示した構造を持つpUR301を得た。 9c リンカー及びプライマーの化学合成 合成は、J.F.M.de Rooy等、Recl.Trav.
Chim.Pays Bas、98、537−548（1979）に
記載されたフオスフオトリエステル法により
行つた。 10 構造的又は誘導可能レギユロン及び（8a−
8e）に記載された連結プレプロソーマチン遺伝
子より成るプラスミドの構成及びこのプラスミ
ドによるE.coliの形質転換 10a プラスミドpUR101のDNA断片をコードす
るプレプロソーマチンは、pUR101を制限エ
ンドヌクレアーゼEcoRIとHindで処理して
得た。次いでこのDNA断片を、プラスミド
pUR201又はpUR301のEcoRI及びHind部
位に統合した結果、それぞれ発現プラスミド
pUR521およpUR531を得た（第１３図）。 10b プラスミドpUR102のDNA断片をコードす
るプレソーマチンは、pUR102を制限エンド
ヌクレアーゼEcoRIで処理して得、ついでプ
ラスミドpUR201又はpUR301のEcoRI部位に
統合した結果、それぞれ発現プラスミド
pUR522およびpUR532を得た（第１４図）。 10c プラスミドpUR103のDNA断片をコードす
るプロソーマチンは、pUR103を制限エンド
ヌクレアーゼEcoRIで処理し得、ついでプラ
スミドpUR201又はpUR301のEcoRI部位に統
合した結果、発現プラスミドpUR523および
pUR533を得た（第１５図）。 10d RF M13Tha47DNAをEcoRIで処理し、つ
いでプレプロソーマチンをコードするDNA
断片はプラスミドpUR201又はpUR301の
EcoRI部位に統合した結果、それぞれ発現プ
ラスミドpUR524およびpUR534を得た（第
１６図）。 10e RF M13Tha507又はRF M13Tha513又は
RF M13Tha507／513DNAをEcoRIで処理
し、ついで変異型プレプロソーマチンをコー
ドするDNA断片をプラスミドpUR201又は
pUR301のEcoRI部位に統合した結果、二重
lac発現プラスミドpUR525−527（それぞれ
507、513、507と513位で変異したプレプロソ
ーマチンを含有する）およびtrp発現プラス
ミドpUR535−537（それぞれ507、513、507
と513位で変異したプレプロソーマチン含
有）を得た（第１７図）。 11 プラスミドを含むE.coli細胞の培養とプレプ
ロソーマチン及び各種成熟型の検出 正しい指向と解読わくに於てレギユロンとプ
レソーマチン遺伝子間のリンカーの中に
AATT配列を持つ或いは持たないプラスミド
pUR521−527およびpUR531−537の１つを含
むE.coli細胞を生育の最適条件下で培養した−
此等の培養条件は細胞中に存在するプラスミド
の型により変化する−然し常に選択圧力を維持
するために適当な抗生物質が存在した。 此等の条件で、プラスミドpUR521−527、
又はpUR531−537のどれかを含む細胞は可成
りの量の各種型のプレプロソーマチンを生産し
た。 蛋白質の存在は、特異的免疫沈澱、甘味度の
生理試験及び特別に開発された酵素結合免疫吸
収分析（Elisa）によりプレプロソーマチン又
はその成熟型が分離される様な細胞抽出物の
SDSゲル電気泳動により定性的に証明した。こ
のテストの抗血清は、植物ソーマトコツカスダ
ニエリ（Thamatococcus daniellii）により生
産されたソーマチンをフロインドアジユバンド
を補給して羊及び兎に注射して作られた。 本発明で使用する微生物はATCCに寄託されて
いる。 つぎのプラスミドを含有するE.cole菌体はBP
条約に基きATCCに寄託されている。 pUR520−ATCC39014、pUR522−
ATCC39016、pUR523−ATCC39017、pUR530
−ATCC39013、pUR531−ATCC39015。
マーとして使うDNA合成用の鋳型として働い
た。次いで、得られたds DNA断片をSI−ヌク
レアーゼで処理し、その平滑末端をEcoRI−リ
ンカー（5′）pCAT（Ｎ）oGAATTC（N′）o
ATGOH（3′）（第９図）に連結した。このDNA
をEcoRIで消化し、pBR322のEcoRI制限部位
に統合し、プレソーマチンヌクレオチド配列32
−718を含むプラスミドpUR102を得た。 8c プロソーマチンをコードするDNAの生産 M13−101−Ｂの一重鎖DNAを、化学的に
合成したDNA配列（5′）pGCCACCTTCGOH
（3′）をプライマーとして使い相補的DNAの
合成の鋳型として使用した。生じたds DNA
をEcoRI及びSIスクレアーゼで処理し、次い
でその平滑末端を化学的に合成したEcoRIリ
ンカー（5′）pCAT（Ｎ）oGAATTC（N′）o
ATGOH（3′）に連結した。この断片をEcoRI
で処理し、次いでpBR322のEcoRI制限部位
に統合した結果、プロソーマチンヌクレオチ
ド配列98−736（第１０図）を含むプラスミ
ドpUR103を得た。 8d 特殊の変異がヌクレオチド配列32−97、特
にヌクレオチド32−94に導入された場合を除
き、非修飾プレプロソーマチンをコードする
DNAの生産 M13−101−Ｂの一本鎖DNAを、化学的に
合成したDNA配列（5′）p
ACCACTCGCTTCOH（3′）をプライマーと
して使い、相補的DNA合成の鋳型として使
用した。E.coliをds DNAで形質転換した
後、変異（第47位でＴをＣで置換）を持つ
DNAフアージをDNA配列解析により選択し
た。これ等のフアージはM13Tha47とコード
した（第１１図）。 8e 特殊な変異がヌクレオチド配列32−736、特
にヌクレオチド配列332−718に導入された場
合を除き、（8a−8d）に記載された任意の配
列をコードするDNAの生産 M13−101−Ａの一重鎖DNAを、クレナウ
DNA−ポリメラーゼ及び化学的に合成した
プライマー（5′）pGCCTTCAGCGTCGCOH
（3′）、（5′）pGCCGTCAGCTTCGCOH（3′）
及び（5′）pGCCGTCAGCGTCGCOH（3′）を
使い、DNA合成の鋳型として使用した。 これ等すべての配列は、蛋白質に望ましい
変化を導入するための１つ又は２つの変性を
持つプレプロソーマチン遺伝子（配列４）の
ヌクレオチド503−516に対して相補的であ
る。ds DNAによるE.coliの形質転換の後、
目的とする変性を持つフアージをDNA配列
解析により選択した。此等フアージは
M13Tha507、513、507／513とコードした
（第１２図）。 9a プラスミドpUR201の構成 ダブルlacレギユロン（lacUV5）により成
る285の塩基対を含む断片をpKB268の制限
エンドヌクレアーゼEcoRI切断により得た
（K.BacKman及びM.Ptashne、Cell13、65−
71（1978））。この断片はpBR322DNAの
EcoRI部位に連結した。正しい指向（第３
図）にlacレギユロンを持つプラスミドDNA
をE.coli RNAポリメラーゼの存在下で
EcoRIにより部分的に切断した。制限エンド
ヌクレアーゼHind切断部位から最も遠い
EcoRI切断部位を選択的にアタツクした。直
線化したDNAをSIヌクレアーゼで処理し、
アガロースゲル電気泳動で精製し、T4DNA
−リガーゼにより環状化し、次いでE.coliの
形質転換に使用した。テトラサイクリン−耐
性形質転換体から正しい構造を持つpUR201
（第３図）を得た。 9b プラスミドpUR301の構成 約510の塩基対のDNA断片をptrp ED5の
制限エンドヌクレアーゼHinfI切断により得
た（R.A.Hallewell及びS.Emtage、Gene
９、27−47（1980））。この断片をE.coli
RNAポリメラーゼの存在下で、制限エンド
ヌクレアーゼTaqIで切断した。trpレギユロ
ン中のTaqI部位（K.Bertrand等、Science
189、22−26（1975）及びF.lee等、J.Mol.
Biol.121、193−217（1978）に記載）を選択
的に保護し、この様にしてtrpレギユロンよ
り成る234塩基対を含む断片を生じた（第４
図）。この断片を次にSIヌクレアーゼで処理
し、平滑末端をEcoRI−リンカー（5′）p
GGAATTCCOH（3′）に連結し、EcoRIで切
断し、次いでpBR322のEcoRI−部位中でク
ローニングした。 正しい指向のtrpレギユロンを持つプラス
ミドpUR300（第４図）を単離した。Hind
部位からもつとも離れたEcoRI−切断部位は
臭化エチジウムの存在下で、EcoRIによる
pUR300DNAの部分切断及びSIヌクレアーゼ
処理により除いた。直線状DNA分子は
T4DNAリガーゼにより再環化した。テトラ
サイクリン−耐性形質転換体から、第４図に
示した構造を持つpUR301を得た。 9c リンカー及びプライマーの化学合成 合成は、J.F.M.de Rooy等、Recl.Trav.
Chim.Pays Bas、98、537−548（1979）に
記載されたフオスフオトリエステル法により
行つた。 10 構造的又は誘導可能レギユロン及び（8a−
8e）に記載された連結プレプロソーマチン遺伝
子より成るプラスミドの構成及びこのプラスミ
ドによるE.coliの形質転換 10a プラスミドpUR101のDNA断片をコードす
るプレプロソーマチンは、pUR101を制限エ
ンドヌクレアーゼEcoRIとHindで処理して
得た。次いでこのDNA断片を、プラスミド
pUR201又はpUR301のEcoRI及びHind部
位に統合した結果、それぞれ発現プラスミド
pUR521およpUR531を得た（第１３図）。 10b プラスミドpUR102のDNA断片をコードす
るプレソーマチンは、pUR102を制限エンド
ヌクレアーゼEcoRIで処理して得、ついでプ
ラスミドpUR201又はpUR301のEcoRI部位に
統合した結果、それぞれ発現プラスミド
pUR522およびpUR532を得た（第１４図）。 10c プラスミドpUR103のDNA断片をコードす
るプロソーマチンは、pUR103を制限エンド
ヌクレアーゼEcoRIで処理し得、ついでプラ
スミドpUR201又はpUR301のEcoRI部位に統
合した結果、発現プラスミドpUR523および
pUR533を得た（第１５図）。 10d RF M13Tha47DNAをEcoRIで処理し、つ
いでプレプロソーマチンをコードするDNA
断片はプラスミドpUR201又はpUR301の
EcoRI部位に統合した結果、それぞれ発現プ
ラスミドpUR524およびpUR534を得た（第
１６図）。 10e RF M13Tha507又はRF M13Tha513又は
RF M13Tha507／513DNAをEcoRIで処理
し、ついで変異型プレプロソーマチンをコー
ドするDNA断片をプラスミドpUR201又は
pUR301のEcoRI部位に統合した結果、二重
lac発現プラスミドpUR525−527（それぞれ
507、513、507と513位で変異したプレプロソ
ーマチンを含有する）およびtrp発現プラス
ミドpUR535−537（それぞれ507、513、507
と513位で変異したプレプロソーマチン含
有）を得た（第１７図）。 11 プラスミドを含むE.coli細胞の培養とプレプ
ロソーマチン及び各種成熟型の検出 正しい指向と解読わくに於てレギユロンとプ
レソーマチン遺伝子間のリンカーの中に
AATT配列を持つ或いは持たないプラスミド
pUR521−527およびpUR531−537の１つを含
むE.coli細胞を生育の最適条件下で培養した−
此等の培養条件は細胞中に存在するプラスミド
の型により変化する−然し常に選択圧力を維持
するために適当な抗生物質が存在した。 此等の条件で、プラスミドpUR521−527、
又はpUR531−537のどれかを含む細胞は可成
りの量の各種型のプレプロソーマチンを生産し
た。 蛋白質の存在は、特異的免疫沈澱、甘味度の
生理試験及び特別に開発された酵素結合免疫吸
収分析（Elisa）によりプレプロソーマチン又
はその成熟型が分離される様な細胞抽出物の
SDSゲル電気泳動により定性的に証明した。こ
のテストの抗血清は、植物ソーマトコツカスダ
ニエリ（Thamatococcus daniellii）により生
産されたソーマチンをフロインドアジユバンド
を補給して羊及び兎に注射して作られた。 本発明で使用する微生物はATCCに寄託されて
いる。 つぎのプラスミドを含有するE.cole菌体はBP
条約に基きATCCに寄託されている。 pUR520−ATCC39014、pUR522−
ATCC39016、pUR523−ATCC39017、pUR530
−ATCC39013、pUR531−ATCC39015。
第１図はプレプロソーマチン遺伝子における対
立型変異を示す。第２図はプレプロソーマチンを
コードする各種対立遺伝子中導入された変異を示
す。第３図はプラスミドpUR201を表わす。第４
図はプラスミドpUR301を表わす。第５図はプラ
スミドpUR401を表わす。第６図はＧ／Ｃ尾部を
もたないプレプロソーマチン遺伝子の構成を示
す。第７図はpUR101の構成を示す。第８図は一
本鎖M13−DNA、鋳型M13−101−ＡおよびM13
−101−Ｂの構成を示す。第９図はpUR102（プ
レソーマチンをコードする）の構成を示す。第１
０図はpUR103（プレソーマチンをコードする）
の構成を示す。第１１図は47位置における変異を
もつプレプロソーマチンをコードする配列を含む
M13−Tha47の構成を示す。第１２図は507およ
び／又は513位置での特殊な変異をもつM13フア
ージTha507、513および507／513の構成を示す。
第１３図は転写コントロール下でプレプロソーマ
チンをコードするDNA配列をもつpUR521、531
および541の構成を示す。第１４図は転写コント
ロール下でプレプロソーマチンをコードする
DNA配列をもつpUR522および532、542の構成を
示す。第１５図は転写コントロール下でプロソー
マチンをコードするDNA配列をもつpUR523，
533および543の構成を示す。第１６図は転写コン
トロール下で変異プレプロソーマチンDNA配列
をもつpUR524、534および544の構成を示す。第
１７図は転写コントロール下で変異プレプロソー
マチンをコードするDNA配列をもつpUR525、
535、545、528、538、546、527、537および547の
構成を示す。
立型変異を示す。第２図はプレプロソーマチンを
コードする各種対立遺伝子中導入された変異を示
す。第３図はプラスミドpUR201を表わす。第４
図はプラスミドpUR301を表わす。第５図はプラ
スミドpUR401を表わす。第６図はＧ／Ｃ尾部を
もたないプレプロソーマチン遺伝子の構成を示
す。第７図はpUR101の構成を示す。第８図は一
本鎖M13−DNA、鋳型M13−101−ＡおよびM13
−101−Ｂの構成を示す。第９図はpUR102（プ
レソーマチンをコードする）の構成を示す。第１
０図はpUR103（プレソーマチンをコードする）
の構成を示す。第１１図は47位置における変異を
もつプレプロソーマチンをコードする配列を含む
M13−Tha47の構成を示す。第１２図は507およ
び／又は513位置での特殊な変異をもつM13フア
ージTha507、513および507／513の構成を示す。
第１３図は転写コントロール下でプレプロソーマ
チンをコードするDNA配列をもつpUR521、531
および541の構成を示す。第１４図は転写コント
ロール下でプレプロソーマチンをコードする
DNA配列をもつpUR522および532、542の構成を
示す。第１５図は転写コントロール下でプロソー
マチンをコードするDNA配列をもつpUR523，
533および543の構成を示す。第１６図は転写コン
トロール下で変異プレプロソーマチンDNA配列
をもつpUR524、534および544の構成を示す。第
１７図は転写コントロール下で変異プレプロソー
マチンをコードするDNA配列をもつpUR525、
535、545、528、538、546、527、537および547の
構成を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ (i)(a) 下式（プレプロソーマチン遺伝子）： 【表】 【表】 に記載の非修飾型プレプロソーマチン、又は (b) 上記のプレプロソーマチン遺伝子の式のヌ
クレオチド98〜736の範囲と同一である下式
（プロソーマチン遺伝子）： 【表】 および上記のプレプロソーマチン遺伝子の
式のヌクレオチド32〜718の範囲と同一であ
る下式（プレソーマチン遺伝子）： 【表】 【表】 に記載の部分的に修飾したプレプロソーマ
チンをコードするDNA配列、および、 (ii) 上記(i)(a)のプレプロソーマチン遺伝子の式と
同一（但し、235位のヌクレオチドＧはヌクレ
オチドＣと置き換り、又は284位のヌクレオチ
ドＣはヌクレオチドＡと置き換り、又は296−
297位のヌクレオチドCGはヌクレオチドAAと
置き換り、又は324位のヌクレオチドＡはヌク
レオチドＧと置き換り、又は434位のヌクレオ
チドＧはヌクレオチドＡと置き換り、又はこれ
らの２つ以上の置換の組み合わせである）であ
る、下式： 【表】 に記載の各種対立型プレプロソーマチン、およ
び、 (iii) 上記(i)(a)のプレプロソーマチン遺伝子および
上記(ii)の式と同一（但し、47位のヌクレオチド
ＴはヌクレオチドＣと置き換り、又は507位の
ヌクレオチドＡはヌクレオチドＣと置き換り、
又は513位のヌクレオチドＡはヌクレオチドＣ
と置き換り、又はこれらの置換の２種以上の組
み合わせである）である下式： 【表】 に記載の47、507および513位で１つ以上の変異
を有するプレプロソーマチンをコードする各種
対立変異型遺伝子、から成る群から選んだ
DNA配列。 ２ (A)(i)(a) 下式（プレプロソーマチン遺伝
子）： 【表】 に記載の非修飾型プレプロソーマチン、又
は (b) 上記のプレプロソーマチン遺伝子の式の
ヌクレオチド98〜736の範囲と同一である
下式（プロソーマチン遺伝子）： 【表】 および上記のプレプロソーマチン遺伝子の
式のヌクレオチド32〜718の範囲と同一で
ある下式（プレソーマチン遺伝子）： 【表】 【表】 に記載の部分的に修飾したプレプロソーマ
チンをコードするDNA配列、および (ii) 上記(i)(a)のプレプロソーマチン遺伝子の式
と同一（但し、235位のヌクレオチドＧはヌ
クレオチドＣと置き換り、又は284位のヌク
レオチドＣはヌクレオチドＡと置き換り、又
は296−297位のヌクレオチドCGはヌクレオ
チドAAと置き換り、又は324位のヌクレオ
チドＡはヌクレオチドＧと置き換り、又は
434位のヌクレオチドＧはヌクレオチドＡと
置き換り、又はこれらの２つ以上の置換の組
み合わせである）である、下式： 【表】 に記載の各種対立型プレプロソーマチン、お
よび、 (iii) 上記(i)(a)のプレプロソーマチン遺伝子およ
び上記(ii)の式と同一（但し、47位のヌクレオ
チドＴはヌクレオチドＣと置き換り、又は
507位のヌクレオチドＡはヌクレオチドＣと
置き換り、又は513位のヌクレオチドＡはヌ
クレオチドＣと置き換り、又はこれらの置換
の２種以上の組み合わせである）である下
式： 【表】 に記載の47、507および513位で１つ以上の変
異を有するプレプロソーマチンをコードする
各種対立変異型遺伝子、から成る群から選ん
だDNA配列、および (B) このDNA配列の発現を調節する誘導可能又
は構成的レギユロンから成る組み換えプラスミ
ド。 ３ 構造遺伝子の発現を調節する二重lac UV5系
から成る誘導可能なレギユロンを含む、特許請求
の範囲第２項記載の組み換えプラスミド。 ４ pUR521、pUR522（ATCC39016）および
pUR523（ATCC39017）から成る群から選ん
だ、特許請求の範囲第３項記載の組み換えプラス
ミド。 ５ 構造遺伝子の発現を調節する変性トリプトフ
アン系を含む、特許請求の範囲第２項記載の組み
換えプラスミド。 ６ pUR531（ATCC39015）、pUR532および
pUR533から成る群から選んだ、特許請求の範囲
第５項記載の組み換えプラスミド。 ７ プレプロソーマチン遺伝子、プレソーマチン
遺伝子又はプロソーマチン遺伝子又はその対立型
あるいは変異型遺伝子を、下式（プレプロソーマ
チン遺伝子）： 【表】 に記載の非修飾型プレプロソーマチン、又は上記
のプレプロソーマチン遺伝子の式のヌクレオチド
98〜736の範囲と同一である下式（プロソーマチ
ン遺伝子）： 【表】 【表】 および上記のプレプロソーマチン遺伝子の式のヌ
クレオチド32〜718の範囲と同一である下式（プ
レソーマチン遺伝子）： 【表】 に記載の部分的に修飾したプレプロソーマチンを
コードするDNA配列の発現を調節する誘導可能
な又は構成的レギユロンのEcoRI部位に結合させ
る、組み換えプラスミドの製造方法において、 (a) 上記遺伝子の5′末端を、ヌクレオチド配列
（5′）pCAT（Ｎ）oGAATTC（N′）oATGOH（3′）
（式中、ｎは０、１、２又は３であり、Ｎと
N′はヌクレオチドＡ、Ｔ、Ｇ又はＣのいずれ
かであるが、二本鎖構造においてＮとN′は回
転対称構造が存在するようなものである）を有
するリンカーに結合させ、 (b) この結合生成物をEcoRIで処理し、ついで、 (c) EcoRI−処理結合生成物をEcoRI−処理レギ
ユロンと結合させることを特徴とする、上記方
法。 ８ (i) 下式（プレプロソーマチン遺伝子）： 【表】 に記載の非修飾型プレプロソーマチン、又は上
記のプレプロソーマチン遺伝子の式のヌクレオ
チド98〜736の範囲と同一である下式（プロソ
ーマチン遺伝子）： 【表】 【表】 および上記のプレプロソーマチン遺伝子の式の
ヌクレオチド32〜718の範囲と同一である下式
（プレソーマチン遺伝子）： 【表】 に記載の部分的に修飾したプレプロソーマチン
をコードするDNA配列、および (ii) 上記(i)のプレプロソーマチン遺伝子の式と同
一（但し、235位のヌクレオチドＧはヌクレオ
チドＣと置き換り、又は284位のヌクレオチド
ＣはヌクレオチドＡと置き換り、又は296−297
位のヌクレオチドCGはヌクレオチドAAと置き
換り、又は324位のヌクレオチドＡはヌクレオ
チドＧと置き換り、又は434位のヌクレオチド
ＧはヌクレオチドＡと置き換り、又はこれらの
２つ以上の置換の組み合わせである）である、
下式： 【表】 に記載の各種対立型プレプロソーマチン、およ
び (iii) 上記(i)のプレプロソーマチン遺伝子および上
記(ii)の式と同一（但し、47位のヌクレオチドＴ
はヌクレオチドＣと置き換り、又は507位のヌ
クレオチドＡはヌクレオチドＣと置き換り、又
は513位のヌクレオチドＡはヌクレオチドＣと
置き換り、又はこれらの置換の２種以上の組み
合わせである）である下式： 【表】 に記載の47、507および513位で１つ以上の変異
を有するプレプロソーマチンをコードする各種
対立変異型遺伝子、から成る群から選んだ
DNA配列およびE.coli細胞における前記DNA
配列の発現を調節する誘導可能な又は構成的レ
ギユロンから成る組み換えプラスミドを含有す
るE.coli細胞を包含する微生物培養物。 ９ pUR521、pUR522、pUR523、pUR531、pUR532
およびpUR533として組み換えプラスミドの一つ
と含有する、特許請求の範囲第８項記載の培養
物。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB8039854 | 1980-12-12 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS57206700A JPS57206700A (en) | 1982-12-18 |
| JPS62677B2 true JPS62677B2 (ja) | 1987-01-08 |
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| JP61068260A Granted JPS61234793A (ja) | 1980-12-12 | 1986-03-26 | ソーマチン関連物質の製造法 |
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|---|---|---|---|
| JP61068260A Granted JPS61234793A (ja) | 1980-12-12 | 1986-03-26 | ソーマチン関連物質の製造法 |
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| Country | Link |
|---|---|
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