JPS61234793A - ソーマチン関連物質の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は非修飾及び部分修飾されたプレプロソーマチン
をコードする構造遺伝子、各種対立型の非修飾ソーマチ
ン、各種対立型のプレプロソーマチン及び天然修飾の種
々の段階における天然及び／又は人為的に変異したプレ
プロソーマチンをコードする構造遺伝子を包含する組換
えＤＮＡを使用して常法によりソーマチン関連物質を製
造する方法に関する。

ソーマチンはソーマドコツカス・ダニエリ（Ｔｈａｔｌ
ｌｌｌａｔＯＣＯＣＣｌｌＳ　ｄａｎｉｅｌｌｉｉ）の
果実の仮種皮に由来する蛋白質である。ソーマチンは重
量基準で蔗糖の１６００倍、分子基準で蔗糖の１０５倍
の甘味度がある。西洋社会に於ては糖の過剰消費が多く
の健康上の問題を起している。従って、低力０り一せ味
料で糖を代用する多くの試みがなされている。然し乍ら
此等のうちの数種は副作用の観点から最近禁止されてい
る。従って、天然の低カロリー甘味料及びその経済的な
製造法が必要とされている。最近の分子生物学の進歩は
特定の真核生物の蛋白質をコードする遺伝子を宿主微生
物細胞に導入し、形質転換された宿主細胞の中でその遺
伝子を発現させ、これにより目的とする蛋白質を製造す
ることを可能にした。

天然の状態では、非修飾型の蛋白質をコードする多くの
真核生物の遺伝子は直接には組換えＤＮＡ分子中に適用
することは出来ない。何故なら天然の遺伝子はメツセン
ジャーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）には含まれていないイント
ロン（介在配列）と呼ばれるＤＮＡ配列を含んでいるか
らである。これ等イントロンの上に位置する情報はｍＲ
ＮＡの翻訳過程の前に真核細胞の中で除かれる。本発明
者の知る限り、細菌はＲＮＡレベルではその様なイント
ロンを切除することは出来ないから、真核生物の天然の
遺伝子を原核宿主細胞に使用する前に、此等イントロン
上に位置する遺伝情報をＤＮＡレベルで除く必要がある
。

ｍＲＮＡレベルでイントロンを切除する能力を持つ微生
物宿主細胞に於ては、天然の遺伝子がこの微生物宿主細
胞中で有効であるレギユロンの調節下にあるならば、そ
の天然の遺伝子は原則的に適用出来る。

経済的な理由で、組換えＤＮＡ遺伝子によりコードされ
た蛋白質は最適条件で生産することが肝要である。この
目的を達するための主たる方法は次の通りである。

（１）有効なレギユロンの下流の構造遺伝子を、選択し
た生育条件下で、単位細胞当り生産される蛋白質の量（
最適数の細胞により）が出来るだけ多くなる様に、組込
む。この目的のためには二重＋　ａｃｕｖ５およびＥ、
ｃｏｌｉ　（大１１１６ｍ　）　（Ｄ　ｔｒｐレギユロ
ン、バクテリオファージＭ１３、ｆｄ及びｆｌの■遺伝
子産物のレギユロンの様なレギユロンはとりわけ、天然
の状態又は修飾された形が適している。

（２）微生物宿主細胞による蛋白質の細胞周辺腔及び／
又は培養基中への分泌、すなわちその蛋白質の細胞内分
解を防ぎ、又は蛋白質の細胞内レベルが非常に高くなる
ことによる正常な細胞プロセスを阻害することを防ぐ。

多くの原核及び真核細胞中では、蛋白質の非修飾型の特
殊なＮｂ２−末端アミノ酸配列が蛋白質の分泌過程に関
係しているということが現在一般に受は入れられている
（Ｇ、ＢＩｏｂｅｌ及びＢ９口ｏｂｂｅｒｓｔｅｉｎ（
１９７５）、Ｊ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、、　　６７、８
３５−８５１参照）。

最近、この過程に蛋白質のＣ００Ｈ−末端のアミノ酸配
列も役割を演じていることが証明された（０．にｏｓｈ
ｌａｎｄ及びり、Ｂｏｔｓｅｉｎ　）　　（１９８０）
　、Ｃｅ１ｌ、２０．７４９−７６０参照）。

従って、組換えＯＮ’Ａ分子によりコードされた蛋白質
が、微生物細胞によるその蛋白質の分泌を促進する様な
アミノ酸配列をそのＮｂ２−及び／又はＣ００Ｈ−末端
に持っているがどうがということは大きな経済的重要性
がある。

本発明に於ては、上記の要求を満たす組換えＤＮＡ分子
を構築するために組換えＤＮＡ及びその他の分子生物学
的技法が使用されている。

本発明は更に特定部位の突然変異誘発を使用する構造遺
伝子の遺伝情報の変化に関する。

本発明を更によく理解するため、本明細書中で使用され
る最も重要な用語について以下に定義−する。

レギユロンはプロモーター及びオペレーター領域より成
るＤＮＡ配列である。

構造遺伝子は鋳型（ｍＲＮＡ）を通じて特異なポリペプ
チドに固有のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列であ
る。

プロモーターは転写の開始のためＲＮＡポリメラーゼが
結合するレギユロン中のＤＮＡ配列である。

オペレーターはリプレッサー蛋白質が結合し、その結果
ＲＮＡポリメラーゼが隣のプロモーターに結合すること
を防ぐ、レギユロン中のＤＮＡ配列である。

インジューサーはリプレッサー蛋白質を不活化し、オペ
レーターを解放し、ＲＮＡポリメラーゼをプロモーター
に結合させ、転写を開始させる物質である。

プレプロソーマチンは対立型の非修飾蛋白質の１つを意
味する（配列４）。

クローニングビークルは適当な宿主細胞に形質転換した
後で自己複製をさせるＤＮＡ配列（元のままのレプリコ
ン）を包含する非染色体二重鎮ＤＮＡ、プラスミド又は
ファージ。

ファージ又はバクテリオファージは適当な細菌宿主細胞
中で複製出来る細菌ビールス。

解読わくはｍＲＮＡレベルに於て適当なコドンのポリペ
プチドへの翻訳が起る様なわくへの三つ組ヌクレオチド
（コドン）のグループ化。

転写は遺伝子からＲＮＡを作るプロセス。

翻訳はｍＲＮＡよりポリペプチドを生産するプロセス。

発現は構造遺伝子によりポリペプチドを生産するプロセ
ス。これは少くとも転写及び翻訳を含む多くのプロセス
の組合せである。

プレプロソーマチン遺伝子は非修飾プレプロソーマチン
をコードするメツセンジャーＲＮＡ部分と正しく同じ情
報（コドン配列）を持つ二重鎖のＤＮＡ配列を意味する
。

シグナルペプチドは生物膜に高い親和性を有し及び／又
は、生物膜を通してプレプロ蛋白質の輸送に関与するプ
レプロ蛋白質の一部を意味する。

この様な輸送プロセスはしばしばプレプロ蛋白質の成熟
型の蛋白質の１つへの修飾を伴う。

二重鎖のヌクレオチド配列は便宜上−重鎖として示す。

本発明により組換えプラスミドは次により提供される： （１）　　各種対立型のプレプロソーマチンをコードす
る構造遺伝子又はこれ等構造遺伝子の変異型（配列２．
３．４及び第１図、第２図）。

配列２はプレプロソーマチン及びその構造遺伝子の暗号
鎖に相当するアミノ酸及びヌクレオチド配列のヌクレオ
チド３２−７３６を示し、配列３はプロソーマチン及び
その構造遺伝子の暗号鎖に相当するアミノ酸及びＤＮＡ
配列のヌクレオチド９８−７３６を示し、配列４はプレ
ソーマチン及びその構造遺伝子の暗号鎖に相当するアミ
ノ酸及びＤＮＡ配列のヌクレオチド３２−７１８を示す
。

第１図の上部にはソーマチンの３つのプリカーサの関係
を示しである。この図は変異の可能性を示し、野生型は
配列１に示す。第２図は本発明者に導入された若干の変
異、すなわち４７位のＴ＠Ｃに、５０７位および／又は
５１３位のＡをＣｔ、：ａ換することが示されている。

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＋（ｉｉ）　　この構造遺伝子の発現を調節する特異的
ＤＮＡ配列。これ等の特異的ＤＮＡ配列は誘導可能レギ
ユロンか又は構成的レギユロンより成る。

好ましい誘導可能レギユロンはＧｏｅｄｄｅ１氏等がＮ
ａｔｕｒｅ、２８１．５４４−５４８　＜１９７９）に
記載した二重１　ａｃｔＪＶ５システム、プラスミドｐ
ＵＲ２０１（第３図）より成る。第３図にはプラスミド
ｐＫＢ２６８からＩ　ａｃＵＶ５レギユロンの単離、プ
ラスミドｐＢＲ３２２に挿入およびＥｃｏＲ１部位の１
つを除去し、プラスミドＣ）ＵＲ２０１を得ることを示
す。

もう１つの好ましい誘導可能レギユロンはＥ５Ｌｅｅ氏
等がＪ、Ｈｏ１．Ｂｉｏｌ、、　　１２１．１９３−２
１７（１９７８）及びに、Ｂｅｒｔｒａｎｄ氏等が５ｃ
ｉｅｎｃｅ、　１且、２２−２６　（１９７５）に記載
したトリプトファン系の成分である。

本発明者はこのトリプトファン系を第４図の様な更に適
当な系を得る様に改変した。この改変系に於てはアテニ
ュエーター領域とリーダー転写に於ける１４残基ペプチ
ドのための情報は除かれているが、後者の蛋白質のリポ
ソーム結合部位は保持されている。第４図には、プラス
ミドｐＴＲＰＥＤ−５からｔｒｐレギ１０ンの単離、Ｔ
ａｑＩ制限酵素で処理、ＥｃｏＲＩ制限部位を付着し、
それをプラスミドｐＢＲ３２２に挿入して改変すること
、およびＥｃｏＲ１部位の１つを除去して、プラスミド
ｐＵＲ３０１を得ることが示されている ら 処 ス よ ｆ 本発明による好ましい組換えプラスミドは更にバクテリ
オファージＭ１３、ｆｄ又はｆｌの遺伝子■の改変され
たプロモーター／リボソーム−結合部位（第５図）、（
Ｐ、Ｈ，Ｇ、Ｆ、Ｖａｎ　Ｗｅｚｅｎｂｅｅｋ氏等、Ｇ
ｅｎｅ、　　エユ、１２９−１４８．１９８０参照）よ
り成るＤＮＡ配列を包含し、本発明者の知る限り、これ
は今迄真核遺伝子の発現には使用されたことのないもの
である。第５図にはＭ２Ｓ−遺伝子■レギユロンの単離
、その一部をとり、ＥｃｏＲ１部位を供し、ｐＢＲ３２
２１て挿入、ＥＣｏＲＩ部位の一つを除去し、プラスミ
ドｐＵＲ４０１を得ることが示されている。

本発明による組換えプラスミドに於て、レギユロンは構
造遺伝子に直接結合するか又は新規な開始コドン、及び
ヌクレオチド配列 （５°）　　ＣＡＴ（Ｎ）　　ＧＡＡＴＴＣ（Ｎ’）　
　ＡＴＧ　ｏ、（３’）　（ｎ　＝　Ｏｌｐ　　　ｎ　
　　　　ｎ １．２及び３、Ｎ及びＮ′はヌクレオチドＡ、Ｔ、Ｇ又
はＣのいずれかであるが、二重鎖の構造に於てＮ及びＮ
′は回転対称構造の存在するようなものである）を包含
するＤＮＡリンカ−を含むＥｃｏＲＩを通して間接的に
構造遺伝子に結合することができる。回転対称構造とは
、例えばＮがＡで示されるとすれば、Ｎ′はその相補的
塩基Ｔにより示されることを意味する。

ある場合には、レギユロンと構造遺伝子間のＡＡＴＴ配
列が除かれると、発現の効率が改良することが分った。

本発明によれば、各種対立型のプレプロソーマチンをコ
ードする天然又は変異された構造遺伝子を含む微生物の
クローニングビークルが得られ、多くの工程を経て、各
種プレプロソーマチンが生産される。それ等の工程の最
も主要なものは： （１）　　ソーマチンのメツセンジャーＲＮＡ　（ｍＲ
ＮＡ）の分離と精製、 （２）　　このｍＲＮＡを二重鎖ＤＮＡ　（ｄｓＤＮＡ
）に転換、 （３）　　ポリ−６０尾部を持つｄｓＤＮＡの構築、（
４）　　ｄ　ｓ　Ｄ　Ｎ　Ａ−ポリ−６０分子をＰｓｔ
Ｉ−切断した及びポリーｄＧ−尾部をつけたプラスミド
ｐＢＲ３２２ＤＮＡへ導入、 （５）　　形質転換及びクローンの選択、（６）　　Ｒ
ＮＡ／ＤＮＡバイブリド形成及びインごトロ翻訳による
インサートの性質の決定、（７）　　ＤＮＡ−配列及び
ＲＮＡ−配列分析によるインサートの性質の二重チェッ
ク、 （８ａ）非修飾プレプロソーマチンをコードするＤＮＡ
の生産（配列１．２及び第１図）、（８ｂ）プレソーマ
チンをコードするＤＮＡの生産（配列３）、 （８Ｃ）プレソーマチンをコードするＤＮＡの生産（配
列４）、 （８ｄ）特殊の変異がヌクレオチド配列３２−９７、特
にヌクレオチド３２−４９、に導入された場合を除き、
非修飾プレプロソーマチンをコードするＤＮＡの生産（
配列１及び第２図）、（８ｅ）特殊な変異がヌクレオチ
ド配列３２−７３６、特にヌクレオチド配列３３２−７
１８に導入された場合を除き、（８ａ−８ｄ）に記載さ
れたＤＮＡの生産（配列１及び第２図）、（９）　　Ｄ
ＮＡ配列を調節する特異的転写、およびＤＮＡリンカ−
及びブライマーの化学合成より成るプラスミドの構築、 （１０）構成的又は誘導可能レギユロン及び（８ａ−８
ｅ）に記載された連結したプレプロソーマチン遺伝子よ
り成るプラスミドの構築及びこのプラスミドによるＥ、
　ｃｏｌｉの形質転換。

（１１）　　この組換えプラスミドを含む大腸菌細胞の
培養及びプレプロソーマチン又はそれ等の天然％Ｉ飾型
の検出と分離。

配列１はプレプロソーマチン蛋白質分子の対立型及びｍ
ＲＮＡ／ＤＮＡ分子に相当するアミノ酸及びヌクレオチ
ド配列を示す。このＤＮＡ配列はプラスミドｐＵＲ１０
０に存在するが、このｐＬＩＲｌｏｏは上記ＤＮＡ配列
をプラスミドｐＢＲ３２２のＰｓｔＩ部位に挿入して調
製される。

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１−ペ　　−ペ　　ａＵ　　　Ｃ＜＋４４　　　ＩＪＩ
Ｊ　　　ｍｕＩ＋　　４−←　　−−べ　　ｈ　１３　
＋３　　　＋＋　（ｊ　　　・−ツー噛以下の詳細な記
載により本発明を説明する。

窒素下で磨砕した。フェノールにより蛋白質を抽出した
侵、Ｋ、Ｓ、ｋｉｒｂｙ　　（１９６５）、Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ、Ｊ、、　　９６．２２６−２６９、Ｕ。

Ｗｉｅｇｅｒｓ及びＨ１旧ｌｚ　（１９７２）　ＦＥＢ
Ｓ　Ｌｅｔｔｅｒｓ。

２３．７７−８２に記載された方法によりしｉＣｌを用
いてＲＮＡを選択的に沈澱させた。

メツセンジャーＲＮＡを含むポリ−Ａはオリゴ−ｄＴ−
セルローズカラムを数回通過させて回収し、このメツセ
ンジャー混合物からポリアクリルアミド電気泳動により
、ソーマチンをコードするｍＲＮＡを分離した。これを
Ｈ，Ａｖｉｖ及びＰ、Ｌｅｄｅｒ　　（１９７２）　Ｐ
ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、。

米国Ｕ、１４０８−１４１２、Ｊ、Ｗ、Ｄａｖｉｅｓ及
びＰ、にａｅｓｂｕｒＱ　（１９７３）　、Ｊ、Ｖｉｒ
ｏｌ、、　　ニス。

１４３４−１４４１に記載された小麦胚芽システムの中
でｍＲＮＡの翻訳によりチェックした。

２、ソーマチンｍＲＮＡの二重鎖ＤＮＡへの　換精製し
たソーマチンｍＲＮＡを、Ｇ、Ｎ、Ｂｕｅｌｌ等、Ｊ、
Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　　（１９７８）　２５３．２
４７１−２４８２に記載された方法により、−末鎖ＤＮ
Ａ分子を生じる様にＡＭＶ逆転写酵素を用いてコピーし
た。このＤＮＡは次に、Ａ、Ｒ。

Ｄａｖ　ｉ　ｓ等、Ｇｅｎｅ、１旦、２０５−２１８　
（１９８０）に記載された方法により、Ｅ、ｃｏｌｉ　
　ＤＮＡ−ポリメラーゼを用いて二重鎖分子に転換した
。この二重鎖のＤＮＡコピーのループ構造を８１−ヌク
レアーゼ消化により除去した。

３、ポリ−６０尾部による二重鎖ＤＮＡの構成所望の長
さのＤＮＡ分子は、Ｒ，Ｒｏｙｃｈｏｕｄｈｕｒｙ等、
（１９７６）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅ
ａｒｃｈ等。

旦、８６３−８７７に記載された方法に従い、ポリアク
リルアミドゲル電気泳動、ゲルからの抽出及び末端トラ
ンスフェラーゼによるにジーｄＣ尾部づけにより得た。

４、ｄＳＤＮＡ−ポリーｄＣ分子のプラスミドｐＢＲ３
２２中への組込み プラスミドｐＢＲ３２２を、β−ラクタマーゼ蛋白質を
コードする遺伝子中に存在する認識部位に於てプラスミ
ドを切断する制限エンドヌクレアーゼＰｓｔｌにより処
理し、その後末端トランスフェラーゼによりポリーｄＧ
尾部をｐＢＲ３２２の線状ＤＮＡに供給した。このポリ
−ｄＣＤＮＡ分子をポリーｄＧ尾部を持つプラスミドｐ
ＢＲ３２２にアニーリングした。

５、形質転換及びクローン選択 この様にして得たプラスミドをＣａＣｌ２で処理したＥ
、　ｃｏｌｉ細胞に移した。形質転換後、雑種プラスミ
ドＤＮＡ分子を含むｍｕｍをそのテトラサイクリン耐性
に従って選択した。陽性コロニーは、Ｈ，Ｃ，Ｂｉｒｎ
ｂｏｉｍとＪ、Ｄｏｌｙ、　ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ
　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　　　７．１５１３−１５２３（
１９７９）に記述した迅速プラスミド抽出法及び分離し
たＤＮＡのＰｓｔｌ−消化の組合せにより大きなインサ
ートを持つプラスミドにより選別した。

ハイブリッド形成／インビトロ翻訳 選択したクローンより、１０μ９のプラスミドＤＮＡを
分離し、次いでこれをジアゾ化（ＤＢＭ）ペーパーディ
スクに結合させた。この固定化プラスミドＤＮＡ分子は
、Ｊ、Ｇ、１４ｉ１１ｉａｍｓ等がＣｅ１ｌ、　　１７
．９０３−９１３（１９７９）にＤＮＡインサートの性
質決定の為に記述したハイブリッド形成／インビトロ翻
訳法に使用した。

ソーマチンインサートのヌクレオチド配列解析を、Ａ、
　Ｈ，Ｈａｘａｍ及びＷ、Ｇ１１ｂｅｒｔが）４ｅｔｈ
Ｏｄ　ｉｎＥｎｇｙｍｏｌｏｇｙ、　Ｌ、Ｇｒｏｓｓｎ
＋ａｎｎ及びに、Ｈｏｌｄａｒｅ編ニューヨーク、アカ
デミツクブレス１９８０第６５巻（１）　４９９−５６
０頁に概説した化学的分解法及びＪ、Ｈａａｔ及びＡ、
Ｊ、Ｈ，Ｓ＋ａｉｔｈがＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈ　　５．４５３７−４５４５　（１９７
８）に概説したジデオキシ／ニック翻訳法により行なっ
た。

ソーマチンｍＲＮＡのヌクレオチド配列に関するこれ以
上の情報は、Ｄ、Ｚｉｍｍｅｒｎ及びＰ。

Ｋａｅｓｂｅｒｇ、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ、、　ＵＳＡ　　７５゜４２５７−４２６１　（
１９７８）に記述された、読み終り阻害因子（Ｃｈａｉ
ｎ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｉｎｇｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　）の
存在下で、ソーマチンｍＲＮＡ鋳型に対するＡＭＶ−逆
転写酵素により開始された合成により間接的に誘導され
た。このスクリーニング（選別〉により特にほぼ完全な
ソーマチンｍＲＮＡのコピーを含むプラスミドｐＵＲ１
００が得られた。

ＤＮＡの生産 プラスミドｐＬＪＲ１００を＄り限エンドヌクレアーゼ
ＰｓｔＩで処理し、次いで少くともヌクレオチド３１−
７９３　（配列１）を含むＤＮＡ配列を制限エンドヌク
レアーゼｌ−１ａｅ［ｌで処理し、とりわけ３６−１４
３の位置から始まるＤＮＡ断片を生じた。この断片は平
滑末端でこれに化学的に合成されたリンカ− （５°）、　ＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧｏ、（３°）を連結
し、次いで制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩで処理し
、引続きｐＢＲ３２２の制限エンドヌクレアーゼ８ａｍ
ＨＩ部位に於いて連結し、Ｅ、ｃｏｌｉ中でクローニン
グした。クローン断片を含むプラスミドＤＮＡをｔ−＋
ｐａｍ及びＳ１ヌクレアーゼで処理し、ヌクレオチド配
列 配列は平滑末端で、これを化学的に合成したリンカ−（
５°）　　ＣＡＴ（Ｎ）　　ＧＡＡＴＴＣ（Ｎ’）　　
ＡＴＧ　ｏ、、（３’）ｐ　　　ｎ　　　　　ｎ に連結し、制限エンドヌクレアーゼＥＣＯＲＩで処理し
、次いでｐＢＲ３２２のＥＣＯＲ１部位に組込み、Ｅ、
ｃｏｌｉ中にクローニングした。

プレプロソーマチンインサートを持つプラスミドをＥＣ
ＯＲＩ及び制限エンドヌクレアーゼ５ａｕ３Ａで処理し
、第６図の断片Ａを得た。

プラスミドｐＬＪＲ１００を制限エンドヌクレアーゼｐ
ｓｔＩ及びＥＣＯＲＩでＭ　ｎ　”　（１ミリモル／１
）の存在下で処理した。此の条件下でＥＣＯＲＩは配列
ＡＡＴＴを認識する。Ｓ１ヌクレアーゼ処理後、このＤ
ＮＡ断片は平滑末端で、これを化学的に合成したリンカ
−（５°）　　ＣＣＡＡＧＣＴＴＧＧｏＨ（３°）に連
結し、次いで制限エンドヌクレアーゼｌ−１ｉｎｄｌ及
び５ａｕ３Ａで処理し、断片Ｂを得た（Ｓａｕ３Ａでヌ
クレオチド位置１０９部位で、Ｈｉ　ｎｄｌ［［で７９
１位置後の部位で）。断片Ａ及びＢを連結し、次いでＥ
ｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩ［Ｉ処理したｐＢＲ３２２に組
込み、プラスミドｐｔＪＲ１０１を得たく第７図）。第
６図と第７図には、プレプロソーマチン遺伝子３２−７
３６および末端部位（７３７−７９１）を含む配列１の
ＤＮＡ配列３２−７９１を単離する操作が記述されてい
る。

更に、この遺伝子の開始コドンＡＴＧ（３２−３５）の
上流にＥＣＯＲＩを供し、微生物の宿主にて構造遺伝子
の発現を調節するレギユロンを導入することが可能にな
った。

一本鎖のＤＮＡ鋳型は、グレノう−ＤＮＡポリメラーゼ
による修復合成及びＲＦＭ１３−ｍｐ２のＥＣＯＲ１部
位に於けるＥｃｏＲＩ−リンカ−（５°）、　ＧＧＡＡ
ＴＴＣＣｏＨ（３’）の付加後に、ｐＵＲｌｏｌのＥｃ
ｏＲｌ　−Ｈｉ　ｎｄｌ［［断片をクローニングするこ
とにより得た。

クローンＭ１３−１０１−Ａは、−木調がソーマチンｍ
ＲＮＡと同じ極性を持つような挿入プレプロソーマチン
ＤＮＡを持っている；クローンＭ１３−１０１−８は一
重鎖がソーマチンｍＲＮＡと反対の極性を持っているよ
うな挿入プレプロンーマチンを持っている（第８図）。

第８図には、第７図の断片Ａと８を含むｐ（ＪＲｌｏｌ
のＥｃｏＲＩ　−Ｈｔ　ｎｄＩＩ［の単離、１（ｉｎｄ
ｌ［部位をＥｃｏＲ１部位に変えそして得られた断片を
ファージＲＦＭ１３−ｒｒ１２に挿入して、反対方向（
Ｍ２Ｓ−１０１−ＡとＭ２Ｓ−１０１−８）に挿入され
た断片を有する２つの単一鎖を得ることが示されている
。これら単一鎖は、プレプロソーマチン遺伝子をプレソ
ーマチン遺伝子（ヌクレオチド７１９以上を欠く、第９
図参照）およびブロンーマチン遺伝子（ソーマチンのプ
レ部をコードするヌクレオチド３２−９７を欠く、第１
０図参照）に改変するのに使われる。

８ｂ、プレソーマチンをコードするＤＮＡの生産Ｍ１３
−１０１−Ａの一本鎖ＤＮＡを、化学的に合成したＤＮ
Ａ配列 （５°）　　ＴＣＡＧＧＣＡＧＴＡＧＧＧＣｏ、（３’
）をブライマーとして使い、相補的ＤＮＡの合成の鋳型
として使用した。ｄｓＤＮＡの熱変性後、相補的ＤＮＡ
鎖の合成については８ａに記載した）をブライマートし
て使うＤＮＡ合成用の鋳型として働いた。

次いで、得られたｄｓＤＮＡ断片をＳＩ−ヌクレアーゼ
で処理し、その平滑末端をＥＣＯＲＩ−リンカー （５°）　　ＣＡＴ（Ｎ）　　ＧＡＡＴＴＣ（Ｈ’）　
　ＡＴＧ　ｇＨ（３’）　（第９ｐ　　　　ｎｎ 図）に連結した。このＤＮＡをＥＣＯＲＩで消化し、ｐ
ＢＲ３２２のＥＣＯＲＩ制限部位に組込みプレソーマチ
ンヌクレオチド配列３２−７１８を含むプラスミドｐｔ
ＪＲ１０２を得た。

８Ｃ、プロソーマチンをコー゛するＤＮＡの生産Ｍ１３
−１０１−８の一重鎖ＤＮＡを、化学的に合成したＤＮ
Ａ配列（５°）　　ＧＣＣＡＣＣＴＴＣＧｏＨ（３°）
をブライマーとして使い相補的ＤＮＡの合成の鋳型とし
て使用した。生じたｄｓＤＮＡをＥＣｏＲＩ及びＳＩヌ
クレアーゼで処理し、次いでその平滑末端を化学的に合
成したＥｃｏＲＩリンカ−（５’）　　ＣＡＴ（１４）
　　ＧＡＡＴＴＣ（Ｎ’）。ＡＴＧ　ｏｌ（（３’）ｎ
ｎ に連結した。この断片をＥｃｏＲＩで処理し、次いで１
）ＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ制限部位に組込んだ結果、プ
ロソーマチンヌクレオチド配列９８−７３６　（第１０
図）を含むプラスミドｐｔＪＲ１０３を得た。

Ｍ２Ｓ−１０１−Ｂの一本鎖ＤＮＡを、化学的に合成し
たＤＮＡ配列 （５°）　　ＡＣＣＡＣＴＣＧＣＴＴＣｏ■（３°）を
ブライマーとして使い、相補的ＤＮＡ合成の鋳型として
使用した。

Ｅ、ｃｏｌｉをｄｓＤＮＡで形質転換した後、変異（第
４７位でＴをＣで置換）を持つＤＮＡファージをＤＮＡ
配列解析により選択した。これ等のファージはＭ１３Ｔ
ｈａ４７とコードした（第１１図）。

Ｍ１３−１０１−Ａの一重鎖ＤＮＡを、フレナラＤＮＡ
−ポリメラーゼ及び化学的に合成したブライマー（５°
）　　ＧＣＣＴＴＣＡＧＣＧＴＣＧＣｏ■（３°）、（
５°）　　ＧＣＣＧＴＣＡＧＣＴＴＣＧＣｏ、（３’）
、及び（５°）　　ＧＣＣＧＴＣＡＧＣＧＴＣＧＣｏ、
（３°）を使い、ＤＮＡ合成の鋳型として使用した。

これ等すべての配列は、蛋白質に望ましい変化を導入す
るための１つ又は２つの変性を持つプレプロソーマチン
遺伝子（配列４）のヌクレオチド５０３−５１６に対し
て相補的である。ｄｓＤＮＡによるＥ、ｃｏｌｉの形質
転換の後、目的とする変性を持つファージをＤＮＡ配列
解析により選択した。此等ファージはＭ１３Ｔｈａ５０
７．５１３．５０７１５１３とコードした（第１２図）
。

９ａ、プラスミドｐｔＪＲ２０１の構築ダブルＩａＣレ
ギ１０ン（ｌ　ａｃＬＪＶ５）により成る２８５の塩基
対を含む断片をＤＫＢ２６８の制限エンドヌクレアーゼ
ＥｃｏＲＩ切断により得た（に、　Ｂａｃｋｏ＋ａｎ及
びＨ，Ｐｔａｓｈｎｅ、　Ｃｅ１ｌ。

１３．６５−７１　（１９７８））。この断片は１）Ｂ
Ｒ３２２ＤＮＡのＥＣｏＲＩ部位に連結した。右方向に
１ａＣレギユロンを持つプラスミドＤＮＡ　（第３図）
をＥ、ｃｏｌｉ　　ＲＮ　Ａポリメラーゼの存在下でＥ
ＣＯＲＩにより部分的に切断した。制限エンドヌクレア
ーゼＨｉ　ｎｄｌｌ［切断部位から最も遠いＥｃｏＲＩ
切断部位を選択的にアタックした。直線化したＤＮＡ＠
ＳＩヌ・フレアーゼで処理し、アガロースゲル電気泳動
で精製し、Ｔ４ＤＮＡ−リガーゼにより環状化し次いで
Ｅ、ｃｏｌｉの形質転換に使用した。テトラサイクリン
−耐性形質転換体から正しい構造を持つｐｔＪＲ２０１
（第３図）を得た。

９ｂ、プラスミドｐＵＲ３０１の構築 的５１０の塩基対のＤＮＡ断片をｐｔｒｐ　　ＥＤ５の
制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩ切断により得た（　
Ｒ，Ａ、Ｈａｌ　ｌｅｗｅｌ　ｌ及びＳ、　Ｅｌｌｌｔ
ａ（１ｅ。

Ｇｅｎｅ、９．２７−４７　（１９８０））、この断片
をＥ、ｃｏｌｉ　　ＲＮ　Ａポリメラーゼの存在下で、
制限エンドヌクレアーゼＴａＱ　Ｉで切断した。

ｔｒｐレギ１０ン中のＴａｑ　Ｉ部位（Ｋ。

Ｂｅｒｔｒａｎｄ等、５ｃｉｅｎｃｅ、　　１８９．２
２−２６（１９７５）及びＦ、　Ｌｅｅ等１．Ｊ、Ｈｏ
１．Ｂｉｏｌ、、　　１、λ１，１９３−２１７　（１
９７８）に記載）を選択的に保護し、この様にしてｔｒ
ｐレギユロンより成る２３４塩基対を含む断片を生じた
（第４図）。この断片を次にＳＩヌクレアーゼで処理し
、平滑末端をＥＣ０ＲＩ−リンカ−（５°）　　ＧＧＡ
ＡＴＴＣＣｏ、、（３°）に連結し、ＥｃｏＲＩで切断
し、次いで１）ＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ一部位中でクロ
ーニングした。

右方向にｔｒｐレギユロンを持つプラスミド１）ＵＲ３
００（第４図）を単離した。）ｌｉｎｄ■部位からもつ
とも離れたＥＣ０ＲＩ−切断部位は臭化エチジウムの存
在下で、ＥＣ０ＲＩによる１）ＵＲ３００ＤＮＡの部分
切断及びＳＩヌクレアーゼ処理により除いた。直線状Ｄ
ＮＡ分子はＴ４ＤＮＡリガーゼにより再環化した。テト
ラサイクリン−耐性形質転換体から、第４図に示した構
造を持つｐｌＪＲ３０１を得た。

９Ｃ，リンカ−及びブライマーの化学合成合成は、Ｊ、
Ｆ、Ｈ，ｄｅ　Ｒｏｏｙ等、Ｒｅｃｌ、Ｔｒａｖ、Ｃｈ
ｉｍ。

Ｐａｙｓ　Ｂａｓ、　　９８，５３７−５４８　（１９
７９）に記載されたホスフォトリエステル法により行っ
た。

伝子より成るプラスミドの構築　びこの７２２ミドによ
るＥ、Ｃ０１ｉの形質転換 １０ａ、　　プラスミドｐｌＪＲ１０１のＤＮＡ断片を
コードするプレプロソーマチンは、ｐＬＩＲｌｏｌを制
限エンドヌクレアーゼＥＣＯＲＩとＨｌｎｄｌｌ［で処
理して得た。次いでこのＤＮＡ断片を、プラスミドｐＵ
Ｒ２０１又はｐＵＲ３０１のＥｃｏＲＩ及び）ｌｉｎｄ
ｌ１部位に組込んだ結果、それぞれ発現プラスミドｐＬ
ＩＲ５２１およびｐＵＲ５３１を得た（第１３図）。

１０ｂ、　　プラスミドｐＬＩＲ１０２のＤＮＡ断片を
フードするプレソーマチンは、ｐｔＪＲ１０２を制限エ
ンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩで処理して得、ついでプラ
スミドＤＵＲ２０１又はｐｔＪＲ３０１のＥＣｏＲｌ部
位に組込んだ結果、それぞれ発現プラスミドｐＬＩＲ５
２２および１ＪＲ５３２を得た（第１４図）。

１０Ｃ，プラスミドｐＬＩＲ１０３のＤＮＡ断片をコー
ドするプロソーマチンは、ｐＵＲ１０３を制限エンドヌ
クレアーゼＥＣＯＲｌで処理して得、ついでプラスミド
ｐＵＲ２０１又はｐ（ＪＲ３０１のＥＣＯＲＩ部位に組
込んだ結果、発現プラスミドＤＬＪＲ５２３およびｐＵ
Ｒ５３３を得た（第１５図）。

１０ｄ、ＲＦ　　Ｍ１３Ｔｈａ４７ＤＮＡをＥｃｏＲＩ
で処理し、ついでプレプロソーマチンをコードするＤＮ
Ａ断片はプラスミドｐＬＩＲ２０１又はｐＵＲ３０１の
ＥＣＯＲＩ部位に組込んだ結果、それぞれ発現プラスミ
ドｐＵＲ５２４およびＤＵＲ５３４を得た（第１６図）
。

１０ｅ、　　ＲＦ　　Ｍ１３丁ｈａ５０７又はＲＦ　　
Ｍ１３Ｔｈａ５１３又はＲＦ　　Ｍ１３Ｔｈａ５０７１
５１３ＤＮＡをＥＣ０ＲＩで処理し、ついで変異型プレ
プロソーマチンをコードするＤＮＡ断片をプラスミドｃ
ｌＲ２０１又はｐｔＪＲ３０１のＥＣＯＲ１部位に組込
んだ結果、二重１ａＣ発現プラスミドｐＵＲ５２５−５
２７（それぞれ５０７，５１３．５０７と５１３位で変
異したプレプロソーマチンを含有する）およびｔｒｐ発
現プラスミドｐｔＪＲ５３５−５３７（それぞれ５０７
，５１３．５０７と５１３位で変異したプレプロソーマ
チン含有）を得た（第１７図）。

正しい指向と解読わくに於てレギユロンとプレソーマチ
ン遺伝子間のリンカ−の中にＡＡＴＴ配列を持つ或いは
持たないプラスミドｐＵＲ５２１−５２７およびＤＵＲ
５３１−５３７の１つを含むＥ、ｃｏｌｉｌ［ｌ胞を生
育の最適条件下で培養したー此等の培養条件は細胞中に
存在するプラスミドの型により変化する−然し常に選択
圧力を維持するために適当な抗生物質が存在した。

此等の条件で、プラスミドｐｌＪＲ５２１−５２７、又
はｐＵＲ５３１−５３７のどれかを含む細胞は可成りの
量の各種型のプレプロソーマチンを生産した。

蛋白質の存在は、特異的免疫沈澱、甘味度の生理試験及
び特別に開発された酵素結合免疫−吸収分析（Ｅｌｉｓ
ａ）によりプレプロソーマチン又はその成熟型が分離さ
れる様な細胞抽出物のＳＤＳゲル電気泳動により定性的
に証明した。このテストの抗血清は、植物ソーマトコツ
力スダニ工り（Ｔｈａｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｄａｎｉ
ｅｌｌｉｉ　）により生産されたソーマチンをフロイン
ドアジュバントを補給して羊及び兎に注射して作った。

本発明で使用する微生物はＡＴＣＣに寄託されている。

つぎのプラスミドを含有するＥ、ｃｏｌｉ菌体はＡＴＣ
Ｃに寄託されている。ｐＬＪＲ５２０−ＡＴＣＣ３９０
１４、ｐＵＲ５２２−ＡＴＣＣ３９０１６、ｐＵＲ５２
３−ＡＴＣＣ３９０１７、ｐＵＲ５３０−ＡＴＣＣ３９
０１３、ｐＬＩＲ５３１−ＡＴＣＣ３９０１５゜

【図面の簡単な説明】

第１図はブレプロソーマチン遺伝子における対立型変異
を示す。 第２図はプレプロソーマチンをコードする各種対立遺伝
子牛導入された変異を示す。 第３図はプラスミドｐＬＪＲ２０１を表わす。 第４図はプラスミドｐｔＪＲ３０１を表わす。 第５図はプラスミドｐｕＲ４０１を表わす。 第６図はＧ／Ｃ尾部をもたないプレプロソーマチン遺伝
子の構築を示す。 第７図はｐＵ’Ｒ１０１の構築を示す。 第８図は一重鎖Ｍ１３−ＤＮＡ、鋳型Ｍ１３−１０１−
ＡおよびＭ１３−１０１−８の構築を示す。 第９図はｐＵＲ１０２（プレソーマチンをコードする）
の構築を示す。 第１０図はｐＵＲ１０３（プレソーマチンをコードする
）の構築を示す。 第１１図は４７位置における変異をもつプレプロソーマ
チンをコードする配列を含むＭ１３−Ｔｈａ４７の構築
を示す。 第１２図は５０７および／又は５１３位置での特殊な変
異をもつＭ１３ファージＴｈａ５０７．５１３および５
０７１５１３の構築を示す。 第１３図は転写コントロール下でプレプロソーマチンを
コードするＤＮＡ配列をもつｐＵＲ５２Ｌ５３１および
５４１の構築を示す。 第１４図は転写コントロール下でプレプロソーマチンを
コードするＤＮＡ配列をもつｐＵＲ５２２および５３２
．５４２の構築を示す。 第１５図は転写コントロール下でプロソーマチンをコー
ドするＤＮＡ配列をもつＤｔＪＲ５２３，５３３および
５４３の構築を示す。 第１６図は転写コントロール下で変異プレプロソーマチ
ンＤＮＡ配列をもつｐｌＪＲ５２４，５３４および５４
４の構築を示す。 第１７図は転写コントロール下で変異プレプロソーマチ
ンをコードするＤＮＡ配列をもつｐＬＩＲ５２５，５３
５，５４５，５２８，５３８，５４６，５２７，５３７
および５４７の構築を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 プレプロソーマチン、プレソーマチン又はプロソーマチ
   ンの製造法において、 （Ａ） ｉ）下式（プレプロソーマチン遺伝子）： 【遺伝子配列があります】 に記載の非修飾型プレプロソーマチン、又は上記のプレ
   プロソーマチン遺伝子の式のヌクレオチド９８〜７３６
   の範囲と同一である下式（プロソーマチン遺伝子）： 【遺伝子配列があります】 および上記のプレプロソーマチン遺伝子の式のヌクレオ
   チド３２〜７１８の範囲と同一である下式（プレソーマ
   チン遺伝子）： 【遺伝子配列があります】 に記載の部分的に修飾したプレプロソーマチンをコード
   するＤＮＡ配列、および ｉｉ）上記ｉ）のプレプロソーマチン遺伝子の式と同一
   （但し、２３５位のヌクレオチドＧはヌクレオチドＣと
   置き換り、又は２８４位のヌクレオチドＣはヌクレオチ
   ドＡと置き換り、又は２９６−２９７位のヌクレオチド
   ＣＧはヌクレオチドＡＡと置き換り、又は３２４位のヌ
   クレオチドＡはヌクレオチドＧと置き換り、又は４３４
   位のヌクレオチドＧはヌクレオチドＡと置き換り、又は
   これらの２つ以上の置換の組み合わせである）である、
   下式： ▲数式、化学式、表等があります▼ に記載の各種対立型プレプロソーマチン、およびｉｉｉ
   ）上記ｉ）のプレプロソーマチン遺伝子および上記ｉｉ
   ）の式と同一（但し、４７位のヌクレオチドＴはヌクレ
   オチドＣと置き換り、又は５０７位のヌクレオチドＡは
   ヌクレオチドＣと置き換り、又は５１３位のヌクレオチ
   ドＡはヌクレオチドＣと置き換り、又はこれらの置換の
   ２種以上の組み合わせである）である下式： ▲数式、化学式、表等があります▼ に記載の４７、５０７および５１３位で１つ以上の変異
   を有するプレプロソーマチンをコードする変異型の各種
   対立遺伝子から成る群から選んだＤＮＡ配列およびこの
   ＤＮＡ配列の発現を調節する誘導可能な又は構成的レギ
   ユロンから成る組み換えプラスミドを微生物宿主に導入
   し（形質転換）、（Ｂ）この形質転換した微生物宿主を
   その生育最適条件下、例えば生育促進化合物に富むが、
   アンピンリン又はテトラサイクリンなどの抗生物質の選
   択圧力下、あるいはトリプトフアン又はヒスチジンの不
   存在下の如き生育制限因子に富む培地にて培養し、つい
   で （Ｃ）この細胞により生成したソーマチン様タン白質を
   免疫性又はイオン交換クロマトグラフイ性の如きタン白
   質−単離性により分離することを特徴とする、上記方法
   。