JPH0453263B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野］ 本発明は、新規な免疫複合体
（Immunecomplex、以下「IC」と略称する。）の
免疫学的測定法に関するものである。 〔従来技術とその解決すべき課題〕 患者血清などの体液中にICが検出される疾患
を広義に免疫複合体病と定義づけると、血清病、
糸球体腎炎、血管炎、感染性心内膜炎、感染症
（癩）、全身性エリトマトーデス（SLE）、慢性関
節リウマチ（RA）、その他の膠原病、肝疾患、
炎症性腸疾患、肺疾患、血液疾患、神経疾患、ガ
ンなどの数多くの疾患が含まれる。これらの疾患
の中で患者血清中に高濃度のICが高頻度に検出
されるのはSLEである。SLEにおいては血中の
ICの値と腎障害との間に相関が認められたとす
る成績が多く報告されている。RAについても
SLEほど血中IC量は多くはないが、疾患の活動
性と相関関係があることが示されている。一方肝
疾患やガンでは障害病変部にICの沈着が証明さ
れておらず、またICを形成する抗原の性質も明
らかにはなつていない。 従来知られている血清中のICの測定法は、
分析用超遠心法、シヨ糖密度勾配超遠心法、ポリ
エチレングリコール沈澱法などの物理化学的方
法、C1ｇなどの補体との反応を利用する方法、
モノクローナルリウマトイド因子（mRF）な
ど抗グロブリン抗体との反応を利用する方法、
ラジ（Raji）細胞法などの細胞表面レセプターへ
の付着を利用する方法の４法に大別される。 物理化学的方法における分析用超遠心法、シヨ
糖密度勾配超遠心法は１回の分析操作に数十時間
を要し、しかも多数の検体を同時に分析できない
という欠点がある。またポリエチレングルコール
沈澱法は操作が容易であるが、IC以外の高分子
蛋白質も含めて測定してしまうため、特異性に問
題があつた。 補体との反応を利用する方法は、抗原と結合し
たIgGやIgM抗体が多くの場合補体を結合すると
いう性質を利用した方法である。補体の第１成分
であるC1gを精製し、C1gがICと特異的に結合す
る性質を利用する測定法として、C1gバインデイ
ングテスト（binding test）、C1g固相ラジオイム
ノアツセイ（R1A）、C1g固相エンザイムノアツ
セイ（E1A）、C1gデビエーシヨンテスト
（deviation test）などが開発されている。C1g法
は特異性、感度の点ですぐれた方法であるが、
C1gの精製に手間がかかりかつC1gの安定性が低
く、−70℃の条件下でも長期的には失活が起きる
という欠点がある。また、血中でICが自己補体
と結合しているものはそのままでは測定できない
ため、試料に対して測定前にEDTA処理や50℃、
30分の加熱処理が必要とされている。 抗グロブリン抗体法については、たとえばその
中の慢性関節リウマチ患者血清中に存在するRF
を利用する方法は、そのRFがポリクローナルRF
（pRF）であるため、特異性が低く、RF含有血清
ではICの検出率が悪い。一方、ワルデンストロ
ーム・マクログロブリネミア（Waldenstro‥
mmacroglobulinemia、IgMミエローマ）の患者
血清中にはモノクローナルRF（mRF）が存在し、
このmRFを固相化したものを用いるR1Aは感度、
特異性ともにすぐれているが、mRFの入手が困
難であり、かつmRFが大量に得られないという
欠点がある。 レセプター法としては、パーキツトリンパ腫患
者（Raji）の腫瘍細胞から得られ、培養株化され
たRaji細胞を用いる方法が知られている。Raji細
胞の表面に存在する補体のC3b、C3d、のレセプ
ターを利用し、ICと結合した補体を介してICを
測定する原理に基づく方法であるが、感度はよい
が、細胞の維持が必要であるため特別の設備を要
する問題がある。 以上のように現在までICの測定法は種々開発
されているが、感度、特異性、簡便性、測定試薬
のLot間における測定値のバラツキの有無などの
面ですべてを満足しうるものはなかつた。 一方、mRFとして、関節炎自然発症マウス
（MRL／Mp−lpr／lpr）から調製されたmRF産
生脾細胞を用いてミエローマ細胞とのハイブリド
ーマを作製し、これからマウスmRFを取得した
ことが報告されている（J.Exp.Med.Vol.158、
pp901〜919（1983））、ibid Vol.159、pp1429〜
1440（1984））。しかしながら、このようなマウス
mRFのヒトのICとの結合反応性については確か
められておらず、そのICの測定への応用につい
ては全く示唆されていない。 〔問題を解決するための手段〕 本発明者らは、ICの測定がSLE、RAなどの自
己免疫疾患やガンの臨床診断においてきわめて重
要であるにもかかわらず、IC自体が有する複雑
性（抗原の多様性、ICの大きさの不均一性など）
や測定法の未確立に起因してICの測定値の客観
的比較ができない現状を打破するため、感度、特
異性ばかりでなく、測定試薬の安定性や大量供給
の可能性をも満足しうる測定法の開発に鋭意努力
し、本発明を完成するに至つた。 すなわち、本発明者らは、関節炎自然発症マウ
スの脾細胞とマウスミエローマ細胞を融合させる
ことにより、マウスmRF産生ハイブリドーマを
取得し、均一のマウスmRFを大量に作製するこ
とに成功した。このマウスmRFについてその性
質を詳細に検討した結果、マウスmRFはヒト熱
変性IgG（HAG）と強く反応するが、ヒトモノマ
ーIgGとは高濃度でのみ反応する知見を得、マウ
スmRFがICに特異性を有していると推定された。
そこで、マウスmRFを抗体試薬としてヒトICの
免疫学的測定法に応用したところ、従来法のうち
で感度、特異性で最もすぐれているIC測定法で
あるC1g法およびヒトmRF法と同程度の感度、
特異性をもつてICの測定が可能であることが判
明した。 本発明方法は、かかる知見に基づいて完成され
たものであり、ヒト体液試料中のICを免疫学的
測定法により測定する方法において、試料中の
ICに対して特異的に結合させる抗体試薬として
マウスmRFを用いることを特徴とするICの測定
法を提供するものである。 以下、本発明を詳細に説明する。 本発明方法において使用されるmRFは公知の
モノクローナル抗体の生産方法によつて取得され
うる。モノクローナル抗体の製造法としては、細
胞融合法、脾臓フラグメント培養法が知られてい
る。抗体の大量生産においては細胞融合法が有利
に適用される。以下、細胞融合法による本発明抗
体の製造法について詳述するが、細胞融合法の一
般的な技術手段のより詳細については総説、成
書、たとえば岩崎辰夫ら著、「単クローン抗体−
ハイブリドーマとELISA−」、株式会社講談社、
昭和58年２月20日発行などの記載を参照すること
がでかる。 (1) 抗体産生細胞の調製 マウスRFは、慢性関節リウマチ（RA）に
類似した症状を有し、RAの動物モデルとして
用いられるMRL／Mp−lpr／lprマウスの血清
中に加齢とともに産生される。このようなRF
を産生するマウスの脾細胞やリンパ節細胞か
ら、RF産生細胞を調製すればよい。 たとえば、MRL／Mp−lpr／lprマウス（メ
ス、20〜40週齢）より血清を採取し、加熱変性
ヒトIgG（HAG）をコートしたマイクロプレー
トで酵素標識免疫定量法（Enzyme
LinkedImmuno Sorbent Assay、ELISA）法
により血清中のRFの力価を測定し、高力価の
マウスを選択し、そのマウスから常法により脾
細胞またはリンパ節細胞を摘出し、RF産生細
胞を取得すればよい。 (2) ミエローマ細胞の調製 ミエローマ細胞としては、マウス、ラツト、
ヒトなどの種々の動物に由来し、当業者が一般
に入手可能な株化細胞を適用することができ
る。使用する細菌株は、好ましくは薬剤抵抗性
であつて、未融合の状態では選択培地で生存で
きず、融合した状態でのみ生存できる性質を有
するものであることが望ましい。通常、８−ア
ザグアニン抵抗性を有し、ヒポキサンチン−グ
アニンホスホリボシルトランスフエラーゼ
（hypoxanthine guanine phosphoribosyl
transferase）を欠損し、ヒポキサンチン・ア
ミノプテリン・チミジン（HAT）培地に生育
できない性質を有する細胞株が用いられる。ま
た、その細胞元来の性質として免疫グロブリン
を分泌しない、いわゆる非分泌型の細胞株であ
ることが好ましい。使用しうる公知の細胞株の
具体例としてはP3X63Ag8（ATCC TIB−９）
（Nature.256、495−497（1975））、
P3X63Ag8U.1（P₃U₁）（ATCC CRL−1597）
（Current Topics in Microbiology and
Immunology、81、１−７（1978））、
P3X63Ag8.653（ATCC CRL−1580）（J.
Immunology、123、1548−1550（1979））、P2／
NSI／１−Ag4−１（ATCC TIB−18）
（European J.Immunology、６、511−519
（1976））、Sp2／Ｏ−Ag14（ATCC CRL−
1581）（Nature、276、269−270（1978））など
のマウスミエローマ細胞株、210.RCY.Ag1.2.3
（Y3−Ag1.2.3）（ATCC CRL−1631）
（Nature、277、131−133（1979））などのラツ
トミエローマ細胞株、Ｕ−266−AR₁（Proc.
Natl.Acad.Sci.U.S.A.、77、5429（1980））、
GM1500（Nature、288、488（1980）、KR−４
（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.、79、6651
（1982））などのヒトミエローマ細胞株を例示す
ることができる。これらの細胞株はそれぞれ各
研究機関において維持管理されており、一般的
に研究者間の交流を通じて分譲が行われてい
る。したがつて、これらの細胞株は一般に当業
者が入手可能である。 (3) 細胞融合 細胞融合にあたつては、RF産生細胞に適合
したミエローマ細胞を選定する。細胞融合は、
イーグル最少必須培地（MEM）、ダルベツコ
変法イーグル培地（DMEM）、RPMI1640など
の動物細胞培養用培地中で10⁷〜10⁸のミエロー
マ細胞とRF産生細胞を混合比１：４〜10に混
合して行う。細胞融合を促進させるために、融
合促進剤として平均分子量1000〜6000のポリエ
チレングリコール（PEG）をはじめ、ポリビ
ニルアルコール、センダイウイルスなどが使用
される。 (4) 選択培地におけるハイブリドーマの選別 細胞融合処理後の細胞からハイブリドーマを
選別する手段としては、選択的培地における細
胞の選択的増殖を利用する方法が用いられる。
たとえば、細胞液を15％ウシ胎児血清（FCS）
含有RPMI1640倍地などで適当に希釈し、マイ
クロタイタープレート上に10⁵〜10⁶／ウエル程
度まき、各ウエルに選択培地（たとえば、
HAT培地など）を加え、以後適当に選択培地
を交換して培養を行う。ミエローマ細胞として
８−アザグアニン抵抗性株、選択培地として
HAT培地を用いた場合は、未融合のミエロー
マ細胞は培養10日目ぐらいまでに死滅し、正常
細胞であるRF産生細胞もin vitroでは長期間
生育できないので培養10〜14日目から生育して
くる細胞としてハイブリドーマを得ることがで
きる。 (5) マウスmRF産生ハイブリドーマの検索 マウスmRF産生ハイブリドーマの検索は、
ELISA、RIAなどによつて行うことができる。
たとえば、熱変性IgGを吸着させた96穴ELISA
用プレートにハイブリドーマを含む培養上清を
添加して特異抗体を反応させ、次いで結合した
特異抗体に酵素標識抗マウス免疫グロブリン抗
体を反応させ、各ウエルに酵素基質を加えて発
色させる。かくして、熱変性IgGと結合力を有
する抗体（mRF）を産生しているハイブリド
ーマの培養上清のウエルを発色の有無によつて
判別することができる。 (6) クローニング ハイブリドーマのクローニングは、限界希釈
法、軟寒天法、フイブリンゲル法、蛍光励起セ
ルソータ法などにより行うことができる。 (7) 抗体の生産 このようにして得られるmRF産生ハイブリ
ドーマからmRFを産生させる方法としては、
通常の細胞培養法や腹水から回収する方法が採
用されうる。 細胞培養法においては、ハイブリドーマを10
〜15％FCS含有RPMI1640培地、無血清培地な
どの動物細胞培養用培地中で培養し、その培養
上清液からmRFを取得することができる。 腹水から回収する方法では、ハイブリドーマ
と主要組織適合性が一致する動物、ヌードマウ
ス等にプリスタン（２，６，10，14−テトラメ
チルペンタデカン）などの鉱物油を腹腔内に投
与して免疫を抑制し、ハイブリドーマを約10⁷
個腹腔内投与する。ハイブリドーマは10〜18日
ほどで腹水腫瘍を形成し、血清および腹水中に
高濃度のmRFを生産する。 RFの精製が必要とされる場合には、硫安塩
析法、DEAEセルロースなどの陰イオン交換体
を利用するイオン交換クロマトグラフイー、熱
変性IgGを結合させたセフアロース4Bなどを用
いるアフイニテイクロマトグラフイー、分子ふ
るいクロマトグラフイーなどの方法を適宜に選
択し、組合せることによつて目的を達成するこ
とができる。 本発明方法において使用されるmRFは、ヒ
トICに対して特異性を有するという性質をも
つて特徴づけられる。本発明方法は、このよう
なマウスmRFがヒトICに対して特異的に反応
しうるという性質を利用して、抗原の各種の免
疫学的測定法における抗体試薬としてマウス
mRFを利用するものである。したがつて、本
マウスmRFを抗体試薬として使用しうる免疫
学的測定法は、その測定システムが基本的に測
定すべき抗原をそれに特異的な抗体を用いて測
定するという原理に基づいているものであれば
よい。このような免疫学的測定法は現在まで数
多く開発されている。たとえば、測定システム
としては凝集反応法、凝集阻止法、免疫拡散
法、レーザーネフロメトリー、比濁法、競合反
応法（固相法、第二抗体法など）、サンドイツ
チ法、イムノメトリツク法などに大別され、ま
た標識物質を用いる測定システムとしては、標
識物質の種類によりRIA、EIA、蛍光イムノア
ツセイ（FIA）、化学発光イムノアツセイ、金
属イムノアツセイ（MIA）、スピンイムノアツ
セイなどが知られており、これらの各測定法が
前述の測定原理に基いているものである限り、
本発明のマウスmRFによるICの測定法の適用
対象となりうる。これらの個々の免疫学的測定
法の応用にあたつては、特に本発明において特
別の条件、操作の設定は必要とされず、それぞ
れの方法における常法に準じてその方法で使用
されるいずれかの抗体試薬としてマウスmRF
を用いて測定システムを構成すればよい。これ
らの一般的技術手段の詳細については、総説、
成書などを参照すればよい（たとえば、入江寛
編、「ラジオイムノアツセイ」、株式会社講談
社、昭和49年４月10日発行、入江寛編、「続ラ
ジオイムノアツセイ」、株式会社講談社、昭和
54年５月１日発行、石川栄治ら編、「酵素免疫
測定法」第２版、株式会社医学書院、昭和57年
12月15日発行、日本臨牀、第42巻、春季臨時増
刊（1984）「臨床免疫handbook」、株式会社日
本臨牀社、昭和59年３月20日発行、第1198〜
1227頁、H.V.ブナキスら著、「Methods in
Enzymology」、Vol.70、「Immunoshemical
Techniques PartA」、アカデミツクプレス、
1980、J.J.ランゴンら著、「Methods in
Enzymology」Vol.73、「Immunochemical
Techniques Part Ｂ」、同書、Vol.74
「Immunoshemical Techniques PartC」、アカ
デミツクプレス、1981など参照）。 次にいくつかの代表的な免疫学的測定法につ
いて簡単に説明する。 固相mRF法 マウスmRFを固相化した試験管に、被検試
料を入れ、ICをmRFに結合させた後洗浄し、
ウサギ、ヤギ、ウマなどで作製したヒトIgGFc
フラグメントもしくはFabフラグメントに対す
る抗体またはそれらの抗体のＦ（ab′）ｚフラグ
メント（抗ヒトIgG抗体類）を¹²⁵Iなどで標識
したものを加えて反応させ、その標識量を測定
して定量する（J.Clin.Invest.、Vol.65、pp136
〜145（1980）、ibid、Vol.66、pp655〜663
（1980）参照）。標識として放射性同位元素の代
りに、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダー
ゼなどの酵素を用いた酵素活性を測定すること
により定量することも同様に可能である。 ラテツクス凝集法 マウスmRFをコートしたラテツクスビーズ
などと被検試料とを反応させる。試料中にIC
が存在すれば凝集するので、簡便にICを測定
することができる。半定量法として有意義であ
る。 レーザーネフロメトリー 試料中に一定量のマウスmRFを加え、生じ
たICとマウスmRFとの大きな粒子をレーザー
光線を利用して散乱光の測定を行い、ICを定
量する方法である。 RIAインヒビシヨンによる方法 試験管にマウスmRFを固相化し、放射性同
位元素で標識した熱変性IgGの結合を試料中の
ICが阻害する割合を測定し、ICの定量を行う
方法である（J.Clin.Invest.、Vol.56、p458
（1975）参照）。 また、放射性同位元素で標識したマウス
mRFが固相化したIgG（たとえばIgGセフアロ
ース4Bなど）に結合するのを試料中のICが阻
害することを応用し、ICを定量する方法もあ
る（J.Clin.Invest.、Vol.59、p990（1977）参
照）。 サンドイツチ法 マウスmRFを固相化した試験管またはマイ
クロプレートなどの反応容器に被検試料を入れ
て反応させる。次いでこれに標識化したマウス
mRFを加えて反応させ、結合したもしくは遊
離の標識量を測定して定量する。 本発明方法においては、マウスmRFは適用さ
れるべき免疫学的測定法にしたがつて、適宜な抗
体試薬形態に調製される。これらの抗体試薬の調
製形態としては、ネイテイブな状態、固相化物、
標識化物の三種が挙げられる。ネイテイブな状態
なものは、溶液状態もしくは凍結乾燥状態で調製
される。また、固相化物は、試験管、ビーズ、ラ
テツクス、デイスクなどの種々の材質の担体に共
有結合法、架橋法もしくは物理的吸着法により固
相化したものである。また、標識化物は、放射性
同位元素、酵素、けい光物質、化学発光物質、金
属などの標識物質をそれぞれ公知の方法により結
合させたものである。 〔効果〕 本発明方法によれば、体液試料（たとえば、血
清、関節液など）中のICをマウスmRFを抗体試
薬として用いる免疫学的測定法により、きわめて
すぐれた感度、特異性をもつて測定することが可
能である。しかも、このマウスmRFは、マウス
mRF産生細胞とミエローマ細胞とを融合して得
られるハイブリドーマにより、均一の品質で大量
に得ることができる。かくして、本発明方法は従
来のICの測定法のいずれもが有しえなかつたす
ぐれた特性をすべて兼備するものであり、ICの
一般的測定法をはじめて確立したところにその意
義を有するものである。 〔実施例〕 参考例 マウスmRFの調製 ハイブリドーマの取得 関節炎自然発症マウス（MRL／Mp−lpr／
lpr、メス、20〜40週齢）の血清中のRFの力価
が高いものを選択し、脾細胞を取り出し、
MEMで洗浄した。マウスミエローマP₃U₁を
MEMで洗浄し、脾細胞とP₃U₁を10：１で混合
して遠心後、ペレツトに50％PEG1000MEM溶
液１mlを徐々に加えて細胞融合を行わせた。さ
らにMEM溶液を徐々に加え、最終的に10mlと
した。再び遠心し、ペレツトを15％ウシ胎児血
清含有RPMI1640培地にP₃U₁として１×
10⁵cell／0.1mlとなるように懸濁させ、96ウエ
ルマイクロプレートに0.1mlずつまいた。 １日後、HAT培地を0.1mlずつ添加し、その
後３〜４日ごとに培地の半分量を新しいHAT
培地で交換した。７日目あたりから、いくつか
のウエルでハイブリドーマの生育が認められ
た。 ハイブリドーマが生育してきたウエルの上清
0.05mlを取り、ハイブリドーマが生育してきた
ウエルの上清50μずつをそれぞれ予めヒト熱
変性IgG（HAG）またはヒトモノマーIgGでコ
ートした96穴ソフトプレートに添加した。第２
抗体としてビオチン化ウマ抗マウスIgG抗体
（ベクター社製）、アビシンＤ−酵素結合体とし
てアビシンＤ−ペルオキシダーゼ（ベクター社
製）、基質および発色剤として過酸化水素、４
−アミノアンチピリン、フエノールを用いて
ELISA法により、HAGとは反応するが、モノ
マーIgGとは反応しないものを選び、限界希釈
法によりクローニングを行つた。 その結果、HAGに特異性を有するmRFを産
生するハイブリドーマとして、Ｃ−26、Ｃ−
28、Ｄ−13、Ｅ−10、Ｅ−11、Ｅ−21、Ｅ−
27、Ｅ−36の８株を取得した。 mRFの生産 前記のハイブリドーマをそれぞれ15％ウシ胎
児血清含有RPMI1640培地で96ウエルプレー
ト、25cm²フラスコ、75cm²フラスコとスケールア
ツプしながら培養し、mRFを含む培養上清を
集めた。 mRFの性質 一般にヒトRFはヒトIgG₁、IgG₂、IgG₄と反
応し、IgG₃とは反応しないといわれている
（粕川禮司著、「免疫複合体病」、医歯薬出版株
式会社、昭和57年２月15日発行、18頁）。また
認識部位はFcないしはヒンジ（Hinge）部位と
されている。さらに他動物のIgGと交叉反応性
を示すこともRFの特徴の一つとされている。 本発明で用いられるマウスmRFの性質を調
べたところ、得られた８株すべてがIgMクラス
のmRFを分泌していた。またほとんどのRFが
IgG₃サブクラスのヒトIgGとは反応しなかつ
た。 他動物のIgGとの交叉反応性については、ほ
とんどのmRFがウサギIgGと反応した。また
ウマIgGとも反応するものが多く、ヤギ、ウシ
とは反応するものが半数あつた。 これらの結果を第１表および第２表に示し
た。

【表】

【表】 mRFの精製 アガロースゲル担体（CNBr活性化セフアロ
ース4B、フアルマシア社製）１mlにヒトIgGを
８mgをカツプリングさせ、カラムに充填して
PBSで平衡化した。このカラムにハイブリド
ーマＣ−28、Ｅ−10、Ｅ−11、Ｅ−27あるいは
Ｅ−36の培養上清100〜200mlを通過させ、
PBSで十分に洗浄した後0.1Mグリシン塩酸緩
衝液（PH2.3）を用いて吸着mRFを溶出し、
3Mトリス塩酸緩衝液（PH8.2）を1/10量加えて
中性に戻して、精製マウスmRFとした。Ｃ−
26については、カラムにアガロースゲル担体
（Affigel−10、バイオラツド社製）１mlにウマ
1gGを10mlカツプリングさせたものを使い、
0.1Mクエン産緩衝液（PH4.5）で溶出させ、
PBSに対して透析したものを精製マウスmRF
とした。 精製マウスmRFの１mgあたりのHAGに対す
るELISA法による力価は2000〜8000倍であつ
た。なお、力価は、固定化された抗原に対して
十分量の抗体が存在する試料についてELISA
法により得られた吸光度を100％とし、その値
の50％を与える抗体試料の原液からの希釈倍率
で表わした。 参考例¹²⁵ I−ウサギ抗ヒトIgGFcフラグメント抗体の
Ｆ（ab′）₂フラグメントの調製 ウサギをヒトIgGFcフラグメントにて免疫して
得られた抗体を硫安分画法、DEAEセルロースイ
オン交換クロマトグラフイーで精製した。この精
製抗体を0.1M酢酸緩衝液（PH4.5、0.1M塩化ナト
リウム含有）10mg／mlになるように溶解させ、こ
れに４％ペプシン溶液を加えて37℃で一晩インキ
ユベーシヨンし、Ｆ（ab′）₂フラグメントを作製し
た。ペプシン分解液をゲルロ過クロマトグラフイ
ー（セフアデツクスＧ−150カラム）に付し、
0.1Mホウ酸ナトリウム緩衝液（PH8.0）で展開し
てＦ（ab′）₂フラグメント分画を得た。 次に、このＦ（ab′）₂フラグメントをハンター
（Hunter）らの方法にしたがつてクロラミンＴに
より¹²⁵Iで標識した（Nature、Vol.194、pp495〜
496（1962））。 実施例 １ 精製マウスmRFをPBS−EDTA緩衝液
（0.15M塩化ナトリウム、10mMEDTA含有）に
て2.5μｇ／mlに希釈し、ポリスチレンチユーブに
0.5mlづつ加え、４℃で一晩放置してコートした。
チユーブから内容液を除去し、１％BSA含有
PBS−EDTA緩衝液でブロツクした。 １時間後、BSA溶液を除去した後、PBS−
EDTA緩衝液1.5mlで１回洗浄し、段階的に希釈
したHAG、モノマーIgG、または患者血清試料
を10μ加え、さらに１％BSA含有PBS−EDTA
緩衝液を加えて0.5mlとし、４℃で一晩放置した。 反応液を吸引除去し、PBS−EDTA緩衝液1.5
mlで３回洗浄し、次に¹²⁵I化したウサギ抗ヒト
IgGFcフラグメント抗体のＦ（ab′）₂フラグメント
2μｇ／ml）を0.5ml（約103cpm／ng）加えた。室
温で２時間インキユベーシヨンした後、PBS−
EDTA緩衝液で３回洗浄し、オートガンマーカ
ウンターにて放射能量を測定した。計算はカウン
ト数から¹²⁵I標識フラグメントが何ng結合してい
るかを103cpm／ngという比活性を使つて行つ
た。 SLE8例、RA88例、ガンク例、健常人10例で
測定を行つたところ、その測定値はＣ−26株の
mRFでは、SLE21.5±9.9nｇ／ml（正常値の平均
＋2SD以上を異常とするとその割合は25％）、
RA41.0±36.1nｇ／ml（37.5％）、ガン35.0±8.5n
ｇ／ml（57.1％）、健常人17.5±6.9nｇ／mlであつ
た。 この結果からマウスmRFによつてヒトICが従
来のC1g法やヒトmRF法と同等に測定できるこ
とがわかつた。また、本実施例では、ガン患者の
IC陽性立が少し高かつた。 実施例 ２ PBS−EDTA緩衝液で次の濃度に希釈したC1g
またはマウスmRF0.5mlをポリスチレンチユーブ
に加え、４℃で一晩放置した。 C1g 5μｇ／ml Ｃ−26 A₂₈₀＝2.311を300倍希釈 Ｄ−13 A₂₈₀＝0.495を300倍希釈 Ｅ−11 A₂₈₀＝0.655を300倍希釈 ウサギ抗ヒトIgGFc抗体Ｆ（ab′）²フラグメント
5μｇ／ml 希釈液を吸引して除去し、１％BSA含有PBS
−EDTA緩衝液を１ml加え、11時間室温に放置
してブロツクした。BSA溶液を吸引除去し、
PBS−EDTA緩衝液1.5mlで１回洗浄した。 試料を10μ加え、さらに１％BSA含有PBS−
EDTA緩衝液を加えて0.5mlとし、２時間半室温
に放置した。 反応液を吸引除去し、PBS−EDTA緩衝液1.5
mlで３回洗浄し、¹²⁵I化したウサギ抗ヒトIgGFc抗
体のＦ（ab′）²フラグメント（2μｇ／ml）を0.5ml
（約267CPｍ／ｎｇ）を加え、室温で１時間半放
置した。 反応液を吸引除去し、PBS−EDTA緩衝液1.5
mlで３回洗浄し、オートガンマーカウンターで放
射能量を測定して、測定値を求めた。 計算はカウント数から¹²⁵I標識フラグメントが
何ｎｇ結合しているかを267cpm／ｎｇという比
活性を使つて行つた。 未治療SLE20例、未治療RA20例、健常人29例
で測定を行つたところ、正常値の平均プラス2SD
以上を異常とするとその割合は次のようであつ
た。

【表】 この例でもC1ｇ法と同等の結果が得られた。 実施例 ３ 96穴マイクロプレート（ポリ塩化ビニル製）に
ハイブリドーマＥ−27、Ｄ−13より調製された
mRFをそれぞれ4.1μｇ／ml、3.5μｇ／mlにPBS
で希釈したものを200μづつ加え、４℃で一晩
放置し、コートした。 次に１％BSA含有PBSを加え、室温で１時間
放置してブロツクし、BSA液を吸引除去後、患
者血清試料10μを加え、１％BSA含有PBSを
40μ加え、室温で２時間放置した。 反応液を吸引除去し、PBSで３回洗浄した後、
西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒト
IgGFcフラグメント抗体Ｆ（ab′）₂フラグメント
（カペル・ラボラトリーズ社製）を加え、室温で
２時間インキユベーシヨンした。 反応液を吸引除去し、PBSで３回洗浄後、４
−アミノアンチピリン、フエノールおよび過酸化
水素を含む基質溶液を加え、OD₅₅₀の吸光度を測
定した酵素活性を算定し、ICの定量を行つた。 ガン患者８例、RA8例、SLE8例、健常人８例
について検討した結果、陽性率はＤ−13mRFで
はガン75％、RA12.5％、SLE37.5％であり、Ｅ
−27mRFではガン75％、RA12.5％、SLE12.5％
であつた。いずれもガンにおけるICの陽性率が
高かつた。 実施例 ４ 96穴マイクロプレート（ポリ塩化ビニル製）
に、ハイブリドーマＤ−13より調製されたmRF
を6.3μｇ／ml、あるいはmRF活性を持たないマ
ウス１ｇＭを産生するハイブリドーマクローンよ
り調製されたマウス１ｇＭ（対照用）を13.1μｇ／
mlの濃度にPBSで希釈したものを各ウエルに50μ
ずつ加え、４℃で放置し、コートした。 次に１％BSA含有を加え、室温で１時間放置
してブロツクし、BSA液を吸引除去後、Ａ緩衝
液（0.1Mトリス塩酸PH8.0、0.5M塩化ナトリウ
ム、１％BSA）で10倍に希釈した血清試料を
mRFおよびmRF活性を持たない１ｇＭをコート
したウエルに50μずつ加え、室温で２時間放置
した。 反応液を吸引除去し、PBSで３回洗浄した後、
ラクトペルオキシダーゼによつて¹²⁵I標識化した
Ｄ−13由来のmRFをＡ緩衝液に溶解させた溶液
（0.20μｇ／ml、500cpm／ｎｇ）を50μを加え、
４℃で一夜放置した。 反応液を吸引除去し、PBSで３回洗浄した後、
オートガンマーカウンターで放射能量を測定し
て、mRFをコートしてあるウエルのカウント数
から、mRF活性を持たない１ｇＭをコートして
あるウエルのカウント数を差し引いて計算し、
ICを定量した。 SLE7例、健常人６例で測定を行つたところ、
正常値の平均＋2SD以上を異常とすると、陽性率
は57％であつた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ヒト体液試料中の免疫複合体を免疫学的測定
   法により測定する方法において、試料中の免疫複
   合体に対して特異的に結合させる抗体試薬として
   マウスモノクローナルリウマトイド因子を用いる
   ことを特徴とする免疫複合体の測定法。 ２ 固相化したマウスモノクローナルリウマトイ
   ド因子と試料とを反応させ、次いでその反応物に
   標識化した抗ヒトIgG抗体類またはそのフラグメ
   ントを加えて結合させ、その結合標識量を測定し
   て免疫複合体を測定することを特徴とする特許請
   求の範囲第１項記載の方法。 ３ 微粒子に固相化したマウスモノクローナルリ
   ウマトイド因子と試料とを反応させ、生じる凝集
   の度合を測定して免疫複合体を測定することを特
   徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。