JPS61114165A - 免疫複合体の測定法 - Google Patents
免疫複合体の測定法Info
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- JPS61114165A JPS61114165A JP23690984A JP23690984A JPS61114165A JP S61114165 A JPS61114165 A JP S61114165A JP 23690984 A JP23690984 A JP 23690984A JP 23690984 A JP23690984 A JP 23690984A JP S61114165 A JPS61114165 A JP S61114165A
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- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
Ｏ
本発明は、新規な免疫複合体（１ｍｍｕｎｓｌｆｏｍｐ
ｌｅｘ。
ｌｅｘ。
以下１’−ＩＣＪと略称する。）の免疫学的測定法に関
するものである。
するものである。
患者血清などの体液中番こＩＣが検出される疾患を広義
に免疫複合体病と定義づけると、血清病、糸球体腎炎、
血管炎、感染性心内膜炎、感染症（癩）、全身性エリト
マト−デス（Ｓ Ｌ Ｅ ） 、 慢性関節リウマチ（
ＲＡ）、その他の膠原病、肝疾患、炎症性腸疾患、肺疾
患、血液疾患、神経疾徹、ガンなどの数多くの疾患が含
まれる。これらの疾患の中で患者血清中に高濃度のＩＣ
が高頻度に検出されるのはＳＬＥである。ＳＬＥにおい
ては血中のＩＣの値と腎障害との間に相関が認められた
とする成績が多（報告されている。ＲＡについてもＳＬ
Ｅはど血中ＩＣ量は多くはないが、疾患の活動性と相関
関係があることが示されている。−刃杆疾患やガンでは
障害病変部ｌこＪＣの沈着が証明されておらず、またＩ
Ｃを形成する抗原の性質も明らかにはなっていない。
に免疫複合体病と定義づけると、血清病、糸球体腎炎、
血管炎、感染性心内膜炎、感染症（癩）、全身性エリト
マト−デス（Ｓ Ｌ Ｅ ） 、 慢性関節リウマチ（
ＲＡ）、その他の膠原病、肝疾患、炎症性腸疾患、肺疾
患、血液疾患、神経疾徹、ガンなどの数多くの疾患が含
まれる。これらの疾患の中で患者血清中に高濃度のＩＣ
が高頻度に検出されるのはＳＬＥである。ＳＬＥにおい
ては血中のＩＣの値と腎障害との間に相関が認められた
とする成績が多（報告されている。ＲＡについてもＳＬ
Ｅはど血中ＩＣ量は多くはないが、疾患の活動性と相関
関係があることが示されている。−刃杆疾患やガンでは
障害病変部ｌこＪＣの沈着が証明されておらず、またＩ
Ｃを形成する抗原の性質も明らかにはなっていない。
従来知られている血清中のＩＣの測定法は、■分析用超
遠心法、ショ糖密度勾配超遠心法、ポリエチレンゲルコ
ール沈澱法なとの物理化学的方法、舎 ■ＣＩ−などの補体との反応を利用する方法、■モノク
ローナルリウマトイド因子（ｍＲＦ）など抗グロブリン
抗体との反応を利用する方法、■ラジ（ＲａＪｌ）細胞
法なとの細胞表面レセプターへの付着を利用する方法の
４法に大別される。
遠心法、ショ糖密度勾配超遠心法、ポリエチレンゲルコ
ール沈澱法なとの物理化学的方法、舎 ■ＣＩ−などの補体との反応を利用する方法、■モノク
ローナルリウマトイド因子（ｍＲＦ）など抗グロブリン
抗体との反応を利用する方法、■ラジ（ＲａＪｌ）細胞
法なとの細胞表面レセプターへの付着を利用する方法の
４法に大別される。
物理化学的方法における分析用超遠心法、ショ糖密度勾
配超遠心法は１回の分析操作に数十時間を要し、しかも
多数の検体を同時Ｉこ分析できないという欠点がある。
配超遠心法は１回の分析操作に数十時間を要し、しかも
多数の検体を同時Ｉこ分析できないという欠点がある。
またポリエチレンゲルコール沈澱法は操作か容易である
が、ＩＣ以外の高分子蛋白質も含めて測定してしまうた
め、特異性に問題があった。
が、ＩＣ以外の高分子蛋白質も含めて測定してしまうた
め、特異性に問題があった。
補体との反応を利用する方法は、抗原と結合したＩｇＧ
やｒｇＭ抗体が多（の場合補体を結合するという性質を
利用した方法である。補体の第１や ２ 固相ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｃ１１ｌ固も長
期的には失活が起きるという欠点がある。また、血中で
ＩＣか自己補体と結合しているものはそのままでは測定
てきないため、試料に対して測定前にＥＤＴＡ処理や５
０°Ｃ１３０分の加熱処理が必要とされている。
やｒｇＭ抗体が多（の場合補体を結合するという性質を
利用した方法である。補体の第１や ２ 固相ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｃ１１ｌ固も長
期的には失活が起きるという欠点がある。また、血中で
ＩＣか自己補体と結合しているものはそのままでは測定
てきないため、試料に対して測定前にＥＤＴＡ処理や５
０°Ｃ１３０分の加熱処理が必要とされている。
抗グロブリン抗体法については、たとえばその中の慢性
関節リウマチ患者血清中に存在するＲＦを利用する方法
は、そのＲＦがポリクローナルＲＦ（ｐＲＦ）であるた
め、特異性が低く、ＲＦ含有血清ではＩＣの検出率が悪
い。一方、ワルデンストローム マクログロブリネミア
（Ｗａｌｄｅｎｓｔｒ６ｍｍａｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ
ｅｍｉａ 、 １ ｇ Ｍミｘ ｏ −ｖ ） （７）
患者血清中にはモノクローナルＲＦ（ｍＲＦ）が存在し
、このｍＲＦを固相化したものを用いるＲＩＡは感度、
特異性ともにすくれているが、ｍＲＦの入手か困難であ
り、かつｍＲＦが大量に得られないという欠点がある。
関節リウマチ患者血清中に存在するＲＦを利用する方法
は、そのＲＦがポリクローナルＲＦ（ｐＲＦ）であるた
め、特異性が低く、ＲＦ含有血清ではＩＣの検出率が悪
い。一方、ワルデンストローム マクログロブリネミア
（Ｗａｌｄｅｎｓｔｒ６ｍｍａｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ
ｅｍｉａ 、 １ ｇ Ｍミｘ ｏ −ｖ ） （７）
患者血清中にはモノクローナルＲＦ（ｍＲＦ）が存在し
、このｍＲＦを固相化したものを用いるＲＩＡは感度、
特異性ともにすくれているが、ｍＲＦの入手か困難であ
り、かつｍＲＦが大量に得られないという欠点がある。
レセプター法としては、バーキットリンパ腫患者（Ｒａ
Ｊｉ）の腫瘍細胞から得られ、培養株化されたＲａｊｉ
細胞を用いる方法が知られている。
Ｊｉ）の腫瘍細胞から得られ、培養株化されたＲａｊｉ
細胞を用いる方法が知られている。
Ｒａｊｉ細胞の表面に存在する補体の（：ａｂ、Ｃａｃ
ｔのレセプターを利用し、ＩＣと結合した補体を介して
ＩＣを測定する原理に基づく方法であるが、感度はよい
が、細胞の維持が必要であるため特別の設備を要する問
題がある。
ｔのレセプターを利用し、ＩＣと結合した補体を介して
ＩＣを測定する原理に基づく方法であるが、感度はよい
が、細胞の維持が必要であるため特別の設備を要する問
題がある。
以上のように現在までＩＣの測定法は種々開発されてい
るが、感度、特異性、簡便性、測定試薬の１−ｏｔ間に
おける測定値のバラツキの有無などの面ですべてを満足
しつるものはなかった。
るが、感度、特異性、簡便性、測定試薬の１−ｏｔ間に
おける測定値のバラツキの有無などの面ですべてを満足
しつるものはなかった。
一方、ｍＲＦとして、関節炎自然発症マウス（ＭＲＬ／
Ｍｐ−１ｐｒ／ｌｐｒ ）からｌｌ製さｔｔたｍＲＦ産
生牌細胞を用いてミエローマ細胞とのハイブリドーマを
作製し、これからマウスｍＲＦを取得したことが報告さ
れている（ Ｊ、 ＥＸＩ）、 Ｍｅｄ、 Ｖｏｌ。
Ｍｐ−１ｐｒ／ｌｐｒ ）からｌｌ製さｔｔたｍＲＦ産
生牌細胞を用いてミエローマ細胞とのハイブリドーマを
作製し、これからマウスｍＲＦを取得したことが報告さ
れている（ Ｊ、 ＥＸＩ）、 Ｍｅｄ、 Ｖｏｌ。
１５８、ｐｐ ９０１〜９１９ （１９８８））、１ｂ
ｉｄ Ｖｏｌ、 １５９ ｐｐ １４２９〜１４４
０ （１９８４））。しかしながら、このようなマウス
ｍＲＦのヒトのＩＣとの結合反応性については確かめら
れておらず、そのＩＣの測定への応用については全く示
唆されていない。
ｉｄ Ｖｏｌ、 １５９ ｐｐ １４２９〜１４４
０ （１９８４））。しかしながら、このようなマウス
ｍＲＦのヒトのＩＣとの結合反応性については確かめら
れておらず、そのＩＣの測定への応用については全く示
唆されていない。
本発明者らは、ＩＣの測定がＳＬＥ、ＲＡなどの自己免
疫疾患やガンの臨床診断においてきわめて重要であるに
もかかわらず、ＩＣ自体が存する複雑性（抗原の多様性
、ＩＣの大きさの不均一性など）や測定法の未確立に起
因してＩＣの測定値の客観的比較ができない現状を打破
するため、感度、特異性ばかりでなく、測定試薬の安定
性や大量供給の可能性をも満足しつる測定法の開発に鋭
意努力し、本発明を完成するｌ（至った。
疫疾患やガンの臨床診断においてきわめて重要であるに
もかかわらず、ＩＣ自体が存する複雑性（抗原の多様性
、ＩＣの大きさの不均一性など）や測定法の未確立に起
因してＩＣの測定値の客観的比較ができない現状を打破
するため、感度、特異性ばかりでなく、測定試薬の安定
性や大量供給の可能性をも満足しつる測定法の開発に鋭
意努力し、本発明を完成するｌ（至った。
すなわち、本発明者らは、関節炎自然発症マウスの牌細
胞とマウスミエローマ細胞を融合させることにより、マ
ウスＩｎＲＦ産生ハイブリドーマを取得し、均一のマウ
スｍＲＦを大量に作製することに成功した。このマウス
ｍＲＦについてその性質を詳細に検討した結果、マウス
ｍＲＦはヒト熱変性１ｇＧ（ＨＡＧ）と強く反応するか
、ヒトモノマーＩｇＧとは高濃度でのみ反応する知見を
得、マウスｍＲＦがＩＣ−特異性を有していると推定さ
れた。そこで、マウスｍＲＦを抗体試薬としてヒトＩＣ
の免疫学的測定法に応用したところ、従来法のうちで感
度、特異性て最もすくれている■↑ Ｃ測定法であるＣ１−法およびヒ）ｍＲＦ法と同程度の
感度、特異性をもってＩＣの測定が可能であることが判
明した。
胞とマウスミエローマ細胞を融合させることにより、マ
ウスＩｎＲＦ産生ハイブリドーマを取得し、均一のマウ
スｍＲＦを大量に作製することに成功した。このマウス
ｍＲＦについてその性質を詳細に検討した結果、マウス
ｍＲＦはヒト熱変性１ｇＧ（ＨＡＧ）と強く反応するか
、ヒトモノマーＩｇＧとは高濃度でのみ反応する知見を
得、マウスｍＲＦがＩＣ−特異性を有していると推定さ
れた。そこで、マウスｍＲＦを抗体試薬としてヒトＩＣ
の免疫学的測定法に応用したところ、従来法のうちで感
度、特異性て最もすくれている■↑ Ｃ測定法であるＣ１−法およびヒ）ｍＲＦ法と同程度の
感度、特異性をもってＩＣの測定が可能であることが判
明した。
本発明方法は、かかる知見に基づいて完成されたもので
あり、ヒト体液試料中のＩＣを免疫学的測定法により測
定する方法において、試料中のＩＣに対して特異的１こ
結合させる抗体試薬としてマウスｍＲＦを用いることを
特徴とするＩＣの測定法を提供するものである。
あり、ヒト体液試料中のＩＣを免疫学的測定法により測
定する方法において、試料中のＩＣに対して特異的１こ
結合させる抗体試薬としてマウスｍＲＦを用いることを
特徴とするＩＣの測定法を提供するものである。
以下、本発明の詳細な説明する。
本発明方法において使用されるｍＲＦは公知のモノクロ
ーナル抗体の生産方法によって取得されうる。モノクロ
ーナル抗体の製造−法としては、細胞融合法、牌臓フラ
グメント培養法が知られている。抗体の大量生産におい
ては細胞融合法が有利に適用される。以下、細胞融合法
による本発明抗体の製造法について詳述するが、細胞融
合法の一般的な技術手段のより詳細については総説、成
書、たとえば岩崎辰夫ら著、［単クローン抗体−ハイブ
リドーマとＥＬＩＳＡ−Ｊ、株式会社講談社、昭和５８
年２月２０日発行などの記載を参照することかてかる。
ーナル抗体の生産方法によって取得されうる。モノクロ
ーナル抗体の製造−法としては、細胞融合法、牌臓フラ
グメント培養法が知られている。抗体の大量生産におい
ては細胞融合法が有利に適用される。以下、細胞融合法
による本発明抗体の製造法について詳述するが、細胞融
合法の一般的な技術手段のより詳細については総説、成
書、たとえば岩崎辰夫ら著、［単クローン抗体−ハイブ
リドーマとＥＬＩＳＡ−Ｊ、株式会社講談社、昭和５８
年２月２０日発行などの記載を参照することかてかる。
（１）抗体産生細胞の調製
マウスＲＦは、慢性関節リウマチ（ＲＡ）に類似した症
状を有し、ＲＡの動物モデルとして用いられるＭ ＲＬ
７Ｍ ｐ −１ｐｒ／Ｉｐｒ ７ ウスノ血ｆ’ｆ
ｌ中に加齢とともに産生される。このようなＲＦを産生
ずるマウスの牌細胞やリンパ節細胞から、ＲＦ産生細胞
を調製すればよい。
状を有し、ＲＡの動物モデルとして用いられるＭ ＲＬ
７Ｍ ｐ −１ｐｒ／Ｉｐｒ ７ ウスノ血ｆ’ｆ
ｌ中に加齢とともに産生される。このようなＲＦを産生
ずるマウスの牌細胞やリンパ節細胞から、ＲＦ産生細胞
を調製すればよい。
たとえば、ＭＲＬ／Ｍｐ−１ｐｒ／ｌｐｒマウス（メス
、２０〜４０週齢）より血清を採取し、加熱変性ヒトＩ
ｇＧ（Ｉ（ＡＧ）をコートしたマイクロプレートで酵素
標識免疫定量法（Ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｊｋｅｄ（ｍｍｕ
ｎｏ ５ｏｒｂｅｎｔ Ａｓ５ａｙ 、 Ｅ Ｌ Ｉ
Ｓ Ａ ）法により血清中のＲＦの力価を測定し、高力
価のマウスを選択し、そのマウスから常法により牌細胞
またはリンパ節細胞を摘出し、ＲＦ産生細胞を取得すれ
ばよい。
、２０〜４０週齢）より血清を採取し、加熱変性ヒトＩ
ｇＧ（Ｉ（ＡＧ）をコートしたマイクロプレートで酵素
標識免疫定量法（Ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｊｋｅｄ（ｍｍｕ
ｎｏ ５ｏｒｂｅｎｔ Ａｓ５ａｙ 、 Ｅ Ｌ Ｉ
Ｓ Ａ ）法により血清中のＲＦの力価を測定し、高力
価のマウスを選択し、そのマウスから常法により牌細胞
またはリンパ節細胞を摘出し、ＲＦ産生細胞を取得すれ
ばよい。
（２） ミエローマ細胞の調製
ミエローマ細胞としては、マウス、ラット、ウサギ、ヒ
トなどの種々の動物に由来し、当業者が一般に入手可能
な株化細胞を適用することができる。使用する細胞株は
、好ましくは薬剤抵抗性であって、未融合の状態では選
択培地で生存できず、融合した状態でのみ生存できる性
質を有するものであることが望ましい。通常、８−アザ
グアニン抵抗性を有し、ヒボキサンチン−ホスホリボシ
ル） ５ メス７ 工５−４１ （ｈｙｐｏｘａ＠１ｔ
ｈｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓ
ｅ ）を欠損し、ヒボキサンチン・アミノプテリン・チ
ミジン（ＨＡ Ｔ ）培地に生育できない性質を有する
細胞株が用いられる。また、その細胞元来の性質として
免疫グロブリンを分泌しない、いわゆる非分泌型の細胞
株であることが好ましい。使用しうる公知の細胞株の具
体例としてはＰ８−ＮＳＩ−１−Ａｇ４−１ （ＮＳ−
１）、Ｐ８−Ｘ６８−Ａｇ８（Ｐ８）、Ｐ８−Ｘ６８−
Ａｇ８−Ｕｌ （、Ｐ８Ｕ１ ）、Ｐ８−Ｘ６８−Ａｇ
８−６５３（Ｘ６３・６・５・８）、５Ｐ２１０・Ａｇ
１４（ＳＦ３）などのマウスミエローマ細胞株、２１（
ｌＲｃＹ８・Ａｇｌ ・２・８（Ｙ８・１ ・２３）な
どのラットミエローマ細胞株、Ｕ−２６６−ＡＲｌ、Ｇ
Ｍ１５００、ＧＭ１５００６ＴＧ−Ａ１２．５ＫＯ−０
０７などのヒトミエローマ細胞株などを挙げることがで
きる。これらの細胞株はそれぞれ各研究機関において維
持管理されており、一般的に研究者間の交流を通じて分
譲が行われている。したがって、これらの細胞株は一般
ｌこ当業者が入手可能である。
トなどの種々の動物に由来し、当業者が一般に入手可能
な株化細胞を適用することができる。使用する細胞株は
、好ましくは薬剤抵抗性であって、未融合の状態では選
択培地で生存できず、融合した状態でのみ生存できる性
質を有するものであることが望ましい。通常、８−アザ
グアニン抵抗性を有し、ヒボキサンチン−ホスホリボシ
ル） ５ メス７ 工５−４１ （ｈｙｐｏｘａ＠１ｔ
ｈｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓ
ｅ ）を欠損し、ヒボキサンチン・アミノプテリン・チ
ミジン（ＨＡ Ｔ ）培地に生育できない性質を有する
細胞株が用いられる。また、その細胞元来の性質として
免疫グロブリンを分泌しない、いわゆる非分泌型の細胞
株であることが好ましい。使用しうる公知の細胞株の具
体例としてはＰ８−ＮＳＩ−１−Ａｇ４−１ （ＮＳ−
１）、Ｐ８−Ｘ６８−Ａｇ８（Ｐ８）、Ｐ８−Ｘ６８−
Ａｇ８−Ｕｌ （、Ｐ８Ｕ１ ）、Ｐ８−Ｘ６８−Ａｇ
８−６５３（Ｘ６３・６・５・８）、５Ｐ２１０・Ａｇ
１４（ＳＦ３）などのマウスミエローマ細胞株、２１（
ｌＲｃＹ８・Ａｇｌ ・２・８（Ｙ８・１ ・２３）な
どのラットミエローマ細胞株、Ｕ−２６６−ＡＲｌ、Ｇ
Ｍ１５００、ＧＭ１５００６ＴＧ−Ａ１２．５ＫＯ−０
０７などのヒトミエローマ細胞株などを挙げることがで
きる。これらの細胞株はそれぞれ各研究機関において維
持管理されており、一般的に研究者間の交流を通じて分
譲が行われている。したがって、これらの細胞株は一般
ｌこ当業者が入手可能である。
（３）細胞融合
細胞融合にあたっては、ＲＦ産生細胞に適合したミエロ
ーマ細胞を選定する。細胞融合は、イーグル最少基本培
地（ＭＥＭ、ｌ、ダルベツコ変法イーグル培地（ＤＭＥ
Ｍ）、ＲＰＭ１１６４０などの動物細胞培養用培地中で
１０７〜１０８のミエローマ細胞とＲＦ産生細胞を混合
比１：４〜１０に混合して行う。細胞融合を促進させる
ために、融合促進剤として平均分子１１１０００〜６０
００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をはじめ、ポ
リビニルアルコール、ウィルスなどが使用される。
ーマ細胞を選定する。細胞融合は、イーグル最少基本培
地（ＭＥＭ、ｌ、ダルベツコ変法イーグル培地（ＤＭＥ
Ｍ）、ＲＰＭ１１６４０などの動物細胞培養用培地中で
１０７〜１０８のミエローマ細胞とＲＦ産生細胞を混合
比１：４〜１０に混合して行う。細胞融合を促進させる
ために、融合促進剤として平均分子１１１０００〜６０
００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をはじめ、ポ
リビニルアルコール、ウィルスなどが使用される。
（４） 選択培地におけるハイブリドーマの選別細胞
融合処理後の細胞からハイブリドーマを選別する手段と
しては、選択的培地における細胞の選択的増殖を利用す
る方法が用いられる。たとえば、細胞液を１５％ウシ胎
児血清（Ｆｅ２）含有ＲＰＭＩ］６４０培地などて適当
に希釈し、マイクロタイタープレート」二に１０５〜１
０６／ウエル程度まき、各ウェルに選択培地（たとえば
、ＨＡＴ培地など）を加え、以後適当に選択培地を交換
して培養を行う。ミエローマ細胞として８−アザグアニ
ン抵抗性株、選択培地としてＨＡ Ｔ培地を用いた場合
は、未融合のミエローマ細胞は培養１０日ｌ９らいまで
に死滅し、正常細胞であるＲＦ産生細胞もｉｎ ｖｉｔ
ｒｏでは長期間生育できないので培養１０〜１４日目か
ら生育してくる細胞としてハイブリドーマを得ることが
できる。
融合処理後の細胞からハイブリドーマを選別する手段と
しては、選択的培地における細胞の選択的増殖を利用す
る方法が用いられる。たとえば、細胞液を１５％ウシ胎
児血清（Ｆｅ２）含有ＲＰＭＩ］６４０培地などて適当
に希釈し、マイクロタイタープレート」二に１０５〜１
０６／ウエル程度まき、各ウェルに選択培地（たとえば
、ＨＡＴ培地など）を加え、以後適当に選択培地を交換
して培養を行う。ミエローマ細胞として８−アザグアニ
ン抵抗性株、選択培地としてＨＡ Ｔ培地を用いた場合
は、未融合のミエローマ細胞は培養１０日ｌ９らいまで
に死滅し、正常細胞であるＲＦ産生細胞もｉｎ ｖｉｔ
ｒｏでは長期間生育できないので培養１０〜１４日目か
ら生育してくる細胞としてハイブリドーマを得ることが
できる。
（５） マウスｍＲＦ産生ハイブリドーマの検索マウ
スｍＲＦ産生ハイブリドーマの検索は、ＥＬＩＳＡ％Ｒ
ｒＡなどによって行うことができる。
スｍＲＦ産生ハイブリドーマの検索は、ＥＬＩＳＡ％Ｒ
ｒＡなどによって行うことができる。
たとえば、熱変性ＩｇＧを吸着させた９６穴Ｅ ＬＩＳ
Ａ用プレートにハイブリドーマを含む培養上清を添加し
て特異抗体を反応させ、次いで結合し城 た特異一体に酵素標識抗マウス免疫グロブリン抗体を反
応させ、各ウェルに酵素基質を加えて発色させる。かく
して 熱変性１ｇＧと結合力を有する抗体（ＲＦ）を産
生じているハイブリドーマの培養上清のウェルを発色の
有無によって判別することができる。
Ａ用プレートにハイブリドーマを含む培養上清を添加し
て特異抗体を反応させ、次いで結合し城 た特異一体に酵素標識抗マウス免疫グロブリン抗体を反
応させ、各ウェルに酵素基質を加えて発色させる。かく
して 熱変性１ｇＧと結合力を有する抗体（ＲＦ）を産
生じているハイブリドーマの培養上清のウェルを発色の
有無によって判別することができる。
（６） クローニング
ハイブリドーマのクローニングは、限界希釈法、軟寒天
法、フィブリンゲル法、蛍光励起セルソータ法などによ
り行うことができる。
法、フィブリンゲル法、蛍光励起セルソータ法などによ
り行うことができる。
（７） 抗体の生産
このようにして得られるＲＦ産生ハイブリドーマからＲ
Ｆを生産させる方法としては、通常の細胞培養法や腹水
から回収する方法が採用されうる。
Ｆを生産させる方法としては、通常の細胞培養法や腹水
から回収する方法が採用されうる。
細胞培養法においては、ハイブリドーマを１０〜１５％
ＦＣ５含有ＲＰＭＩ １６４０培地、無血清培地などの
動物細胞培養用培地中で培養し、その培養」二清液から
ＲＦを取得することができる。
ＦＣ５含有ＲＰＭＩ １６４０培地、無血清培地などの
動物細胞培養用培地中で培養し、その培養」二清液から
ＲＦを取得することができる。
腹水から回収する方法では、ノ１イブリドーマと主要組
織適合性が一致する動物、ヌードマウス等にプリスタン
（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン）な
どの鉱♂ｌ腹腔内に投与して免疫を抑制し、ハイブリド
ーマを約１０７側腹腔内投与する。ハイブリドーマは１
０〜１８日はどで腹水腫瘍を形成し、血清および腹水中
に高濃度のＲＦを生産する。
織適合性が一致する動物、ヌードマウス等にプリスタン
（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン）な
どの鉱♂ｌ腹腔内に投与して免疫を抑制し、ハイブリド
ーマを約１０７側腹腔内投与する。ハイブリドーマは１
０〜１８日はどで腹水腫瘍を形成し、血清および腹水中
に高濃度のＲＦを生産する。
ＲＦの精製が必要とされる場合には、硫安塩析法、ＤＥ
ＡＥセルロースなとの陰イオン交換体を利用するイオン
交換クロマトグラフィー、熱変性ＩｇＧを結合させたセ
ファロース４Ｂなどを用いるアフイニテイクロマトグラ
フイー、分子ふるいクロマトグラフィーなどの方法を適
宜に選択し、組合せることによって目的を達成すること
ができる。
ＡＥセルロースなとの陰イオン交換体を利用するイオン
交換クロマトグラフィー、熱変性ＩｇＧを結合させたセ
ファロース４Ｂなどを用いるアフイニテイクロマトグラ
フイー、分子ふるいクロマトグラフィーなどの方法を適
宜に選択し、組合せることによって目的を達成すること
ができる。
本発明方法において使用されるｍＲＦは、ヒトＩＣに対
して特異性を有するという性質をもって特徴づけられる
。本発明方法は、このようなマウスｍＲＦがヒトＩＣに
対して特異的に反応しうるという性質を利用して、抗原
の各種の免疫学的測定法における抗体試薬としてマウス
ｍＲＦを利用するものである。したがって、本マウスｍ
ＲＦを抗体試薬として使用しうる免疫学的測定法は、そ
の測定システムが基本的ＩＣ測定すべき抗原をそれに特
異的な抗体を用いて測定するという原理に基づいている
ものであればよい。このような免疫学的測定法は現在ま
で数多く開発されている。たとえば、測定システムとし
ては凝集反応法、凝集阻止法、免疫拡散法、レーザーネ
フロメトリー、比潤性、競合反応法（固相法、第二抗体
法など）、サンドイツチ法、イムノメトリック法などに
大別され、また標識物質を用いる測定ソステムとしては
、標識物質の種類によりＲＩＡ、ＥＩＡ、蛍光イムノア
ッセイ（ＦＩＡ）、化学発光イムノアッセイ、金属イム
ノアッセイ（ＭＩＡ）、スピンイムノアッセイなどが知
られており、これらの各測定法が前述の測定原理に基い
ているものである限り、本発明のマウスｍＲＦによるＩ
Ｃの測定法の適用対象となりうる。これらの個々の免疫
学的測定法の応用１こあたっては、特に本発明において
特すればよい。これらの一般的技術手段の詳細について
は、総説、成書なとを参照すればよい（たとえば、入江
賞編、「ラジオイムノアッセイ」、株式会社講談社、昭
和４９年４月１０日発行、入江１編、［続ラジオイムノ
アッセイ］、株式会社講談社、昭和５４年５月１日発行
、石川栄治ら編、「酵素免疫測定法」第２版、株式会社
医学書院、昭和５７年１２月１５日発行、日本臨休、第
４２巻、春季臨時増刊＜ １９８４ ）［臨床免疫ｈａ
ｎｄ−ｂｏｏｋ Ｊ、株式会社日本臨林社、昭和５９年
８月２０日発行、第１１９８〜１２２７頁、Ｈ，Ｖブナ
キスら著、［Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ Ｊ Ｖｏｌ 、 ７０ 。
して特異性を有するという性質をもって特徴づけられる
。本発明方法は、このようなマウスｍＲＦがヒトＩＣに
対して特異的に反応しうるという性質を利用して、抗原
の各種の免疫学的測定法における抗体試薬としてマウス
ｍＲＦを利用するものである。したがって、本マウスｍ
ＲＦを抗体試薬として使用しうる免疫学的測定法は、そ
の測定システムが基本的ＩＣ測定すべき抗原をそれに特
異的な抗体を用いて測定するという原理に基づいている
ものであればよい。このような免疫学的測定法は現在ま
で数多く開発されている。たとえば、測定システムとし
ては凝集反応法、凝集阻止法、免疫拡散法、レーザーネ
フロメトリー、比潤性、競合反応法（固相法、第二抗体
法など）、サンドイツチ法、イムノメトリック法などに
大別され、また標識物質を用いる測定ソステムとしては
、標識物質の種類によりＲＩＡ、ＥＩＡ、蛍光イムノア
ッセイ（ＦＩＡ）、化学発光イムノアッセイ、金属イム
ノアッセイ（ＭＩＡ）、スピンイムノアッセイなどが知
られており、これらの各測定法が前述の測定原理に基い
ているものである限り、本発明のマウスｍＲＦによるＩ
Ｃの測定法の適用対象となりうる。これらの個々の免疫
学的測定法の応用１こあたっては、特に本発明において
特すればよい。これらの一般的技術手段の詳細について
は、総説、成書なとを参照すればよい（たとえば、入江
賞編、「ラジオイムノアッセイ」、株式会社講談社、昭
和４９年４月１０日発行、入江１編、［続ラジオイムノ
アッセイ］、株式会社講談社、昭和５４年５月１日発行
、石川栄治ら編、「酵素免疫測定法」第２版、株式会社
医学書院、昭和５７年１２月１５日発行、日本臨休、第
４２巻、春季臨時増刊＜ １９８４ ）［臨床免疫ｈａ
ｎｄ−ｂｏｏｋ Ｊ、株式会社日本臨林社、昭和５９年
８月２０日発行、第１１９８〜１２２７頁、Ｈ，Ｖブナ
キスら著、［Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ Ｊ Ｖｏｌ 、 ７０ 。
［（ｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ ’ｌ’ｅｃｈｎｉｑ
ｕｅｓ ｐａｒｔ Ａ Ｊ 、 ７カデミツクプレス、
１９８０、Ｊ、Ｊランボンら著、［Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉ
ｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｊ Ｖｏｌ、 ７ Ｂ、
［Ｊｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕ
ｅｓ ｐａｒｔ ３ Ｊ、同書、ＶＯｌ、 ７４ ［
（ｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ ’ｌ’ｅｃｈｎｉｑｕ
ｅａ ｐａｒｔＣＪ、アカデミツクプレス、１９８１な
ど参照）。
ｕｅｓ ｐａｒｔ Ａ Ｊ 、 ７カデミツクプレス、
１９８０、Ｊ、Ｊランボンら著、［Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉ
ｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｊ Ｖｏｌ、 ７ Ｂ、
［Ｊｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕ
ｅｓ ｐａｒｔ ３ Ｊ、同書、ＶＯｌ、 ７４ ［
（ｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ ’ｌ’ｅｃｈｎｉｑｕ
ｅａ ｐａｒｔＣＪ、アカデミツクプレス、１９８１な
ど参照）。
次にいくつか代表的な免疫学的測定法につ（１て簡単に
説明する。
説明する。
■ 固相ｍＲＦ法
マウスｍＲＦを固相化した試験管に、被検試料抗体類）
を１２５１などで標識したものを加えて反応さゼ、その
標識量を測定して定量するり。Ｑｌｉｎ。
を１２５１などで標識したものを加えて反応さゼ、その
標識量を測定して定量するり。Ｑｌｉｎ。
（ｎｖｅｓｔ、、Ｖｏｌ、 ６５、ｐｐｌ ８６−１．
４５ （１９８０）、を加えて酵素活性を測゛定するこ
とにより定量することも同様に可能である。
４５ （１９８０）、を加えて酵素活性を測゛定するこ
とにより定量することも同様に可能である。
■ ラテックス凝集法
マウスｍＲＦをコートしたラテックスビーズなどと被検
試料とを反応させる。試料中にＩＣが存在すれば凝集す
るので、簡便にＩＣを測定することができる。半定量法
として有意義である。
試料とを反応させる。試料中にＩＣが存在すれば凝集す
るので、簡便にＩＣを測定することができる。半定量法
として有意義である。
■ レーザーネフロメトリー
試料中に一定量のマウスｍＲＦを加え、生じたＩＣとマ
ウスｍＲＦとの大きな粒子をレーザー光線を利用して散
乱光の測定を行い、ＩＣを定量する方法である。
ウスｍＲＦとの大きな粒子をレーザー光線を利用して散
乱光の測定を行い、ＩＣを定量する方法である。
■ ＲＩＡインヒビジョンによる方法
試験管１こマウスｍＲＦを固相化し、放射性同位元素で
標識した熱変性ＩｇＧの結合を試料中のＩＣが阻害する
割合を測定し、ＩＣの定量を行う方法である（コ呻、り
ひプソｔ、、 ＶＯｌ、 ５６、ｐ４５８ （１９７５
）参照）。
標識した熱変性ＩｇＧの結合を試料中のＩＣが阻害する
割合を測定し、ＩＣの定量を行う方法である（コ呻、り
ひプソｔ、、 ＶＯｌ、 ５６、ｐ４５８ （１９７５
）参照）。
５９、ｐ９９０ （１９７７）参照）。
本発明方法においては、マウスｍＲＦは適用されるべき
免疫学的測定法にしたがって、適宜な抗体試薬形態に調
製される。これらの抗体試薬の調製形態としては、ネイ
ティブな状態、固相化物、標識化物の三種が挙げられる
。ネイティブな状態なものは、溶液状態もしくは凍結乾
燥状態で調製される。また、同相化物は、試験管、ビー
ズ、ラテックス、ディスクなとの種々の材質の担体に共
有結合法、架橋法もしくは物理的吸着法により固相化し
たものである。また、標識化物は、放射性同位元素、酵
素、けい光物質、化学発光物質、金属なとの標識物質を
それぞれ公知の方法により結合させたものである。
免疫学的測定法にしたがって、適宜な抗体試薬形態に調
製される。これらの抗体試薬の調製形態としては、ネイ
ティブな状態、固相化物、標識化物の三種が挙げられる
。ネイティブな状態なものは、溶液状態もしくは凍結乾
燥状態で調製される。また、同相化物は、試験管、ビー
ズ、ラテックス、ディスクなとの種々の材質の担体に共
有結合法、架橋法もしくは物理的吸着法により固相化し
たものである。また、標識化物は、放射性同位元素、酵
素、けい光物質、化学発光物質、金属なとの標識物質を
それぞれ公知の方法により結合させたものである。
（効果〕
本発明方法によれば、体液試料（たとえば、血清、関節
液など）中のＩＣをマウスｍＲＦを抗体試薬として用い
る免疫学的測定法により、きわめてず（れた感度、特異
性をもって測定することが可能である。しかも、このマ
ウスｍＲＦは、マウスｍＲＦ産生細胞とミエローマ細胞
とを融合して得られるハイブリドーマにより、均一の品
質で大量に得ることができる。かくして、本発明方法は
１９″ 従来のＩＣの測定法のいずれもが有しえなかったすくれ
た特性をすべて兼備するものであり、ＩＣの一般的測定
法をはしめて確立したところにその意義を有するしので
ある。
液など）中のＩＣをマウスｍＲＦを抗体試薬として用い
る免疫学的測定法により、きわめてず（れた感度、特異
性をもって測定することが可能である。しかも、このマ
ウスｍＲＦは、マウスｍＲＦ産生細胞とミエローマ細胞
とを融合して得られるハイブリドーマにより、均一の品
質で大量に得ることができる。かくして、本発明方法は
１９″ 従来のＩＣの測定法のいずれもが有しえなかったすくれ
た特性をすべて兼備するものであり、ＩＣの一般的測定
法をはしめて確立したところにその意義を有するしので
ある。
参考例 マウスｍＲＦの調製
ＥＭで洗浄した。マウスミエローマＰ３ＵｌヲＭ Ｅ
Ｍで洗浄し、肺細胞とＰ８Ｕ、を１０：１で混合して遠
心後、ベレットに５０％ＰＥＧ１００ＯＭＦ、Ｍ溶液１
ｍｌを徐々に加えて細胞融合を行わせた。さらにＭＥ
Ｍ溶液を徐々に加え、最終的に１０ｇ／とじた。再び遠
心し、ベレットを１５９６ウシ胎児血清含有ＲＰＭ１１
６４０培地にＰ８Ｕ１としてＩ Ｘ １０５ｃｅｌｌ
／ ０．１ ｍｌとなるように懸濁させ、９６ウエルマ
イクロプレートに０．１ ｍｌずつまいた。
Ｍで洗浄し、肺細胞とＰ８Ｕ、を１０：１で混合して遠
心後、ベレットに５０％ＰＥＧ１００ＯＭＦ、Ｍ溶液１
ｍｌを徐々に加えて細胞融合を行わせた。さらにＭＥ
Ｍ溶液を徐々に加え、最終的に１０ｇ／とじた。再び遠
心し、ベレットを１５９６ウシ胎児血清含有ＲＰＭ１１
６４０培地にＰ８Ｕ１としてＩ Ｘ １０５ｃｅｌｌ
／ ０．１ ｍｌとなるように懸濁させ、９６ウエルマ
イクロプレートに０．１ ｍｌずつまいた。
１日後、ＨＡＴ培地を０．１ ｍｌずつ添加し、その後
８〜４日ごとに培地の半分量を新しいＨＡＴ培地で交換
した。７日目あたりから、いくつかのウェルでハイブリ
ドーマの生育が認められた。
８〜４日ごとに培地の半分量を新しいＨＡＴ培地で交換
した。７日目あたりから、いくつかのウェルでハイブリ
ドーマの生育が認められた。
ハイブリドーマか生育してきたウェルの上清０、０５
ｍｌを取り、ハイブリドーマが生育してきたウェルの上
清５０μｅずつをそれぞれ予めヒト熱変性Ｉ ｇＧ （
ＨＡＧ）またはヒトモノマー１ｇＧオキンダーゼ（ベク
ター社製）、基質および発色剤として過酸化水素、４−
アミノアンチピリン、フェノールを用いてＥ Ｌ Ｉ
Ｓ Ａ法により、ＨＡＧとは反応するが、モノマーＩｇ
Ｇとは反応しないものを選び、限界希釈法１こよりクロ
ーニングを行った。
ｍｌを取り、ハイブリドーマが生育してきたウェルの上
清５０μｅずつをそれぞれ予めヒト熱変性Ｉ ｇＧ （
ＨＡＧ）またはヒトモノマー１ｇＧオキンダーゼ（ベク
ター社製）、基質および発色剤として過酸化水素、４−
アミノアンチピリン、フェノールを用いてＥ Ｌ Ｉ
Ｓ Ａ法により、ＨＡＧとは反応するが、モノマーＩｇ
Ｇとは反応しないものを選び、限界希釈法１こよりクロ
ーニングを行った。
その結果、ＨＡＧに特異性を有するｍＲＦを産生ずるハ
イブリドーマとして、Ｃ−２６、Ｃ−２８、Ｄ−１３、
Ｅ−１０、Ｅ−１１、Ｅ−２１、Ｅ−２７、Ｅ−８６の
８株を取得した。
イブリドーマとして、Ｃ−２６、Ｃ−２８、Ｄ−１３、
Ｅ−１０、Ｅ−１１、Ｅ−２１、Ｅ−２７、Ｅ−８６の
８株を取得した。
■ ｍＲＦの生産
前記のハイブリドーマをそれぞれ１５９１）ウシ胎児血
清含有ＲＰＭ１１６４０培地で９６ウエルプｖ−）、２
５ｄフラスコ、７５ｄフラスコとスケールアップしなが
ら培養し、ｍＲＦを含む培養上清を集めた。
清含有ＲＰＭ１１６４０培地で９６ウエルプｖ−）、２
５ｄフラスコ、７５ｄフラスコとスケールアップしなが
ら培養し、ｍＲＦを含む培養上清を集めた。
■ ｍＲＦの性質
一般にヒトＲＦはヒトＩｇＧ１．１ｇＧ２．１ｇＧ４と
反応し、ＩｇＧｇとは反応しないといわれている（粕用
罐司著、「免疫複合体病」、医歯薬出版株式会社、昭和
５７年２月１５日発行、１８頁）。
反応し、ＩｇＧｇとは反応しないといわれている（粕用
罐司著、「免疫複合体病」、医歯薬出版株式会社、昭和
５７年２月１５日発行、１８頁）。
また認識部位はＦＣないしはヒンジ（Ｈｉｎｇｅ）部位
とされている。さらに他動物のＩｇＧと交叉反応性を示
すこともＲＦの特徴の一つとされている。
とされている。さらに他動物のＩｇＧと交叉反応性を示
すこともＲＦの特徴の一つとされている。
本発明で用いられるマウスｍＲＦの性質を調べたところ
、得られた８株すべてが１ｇＭクラスのＲＦを分泌して
いた。またほとんどのＲＦがＩ ｇＧｇサブクラスのヒ
トＩｇＧとは反応しなかった。
、得られた８株すべてが１ｇＭクラスのＲＦを分泌して
いた。またほとんどのＲＦがＩ ｇＧｇサブクラスのヒ
トＩｇＧとは反応しなかった。
他動物のＩｇＧとの交叉反応性については、はとんどの
ＲＦがウサギＩｇＧと反応した。またウマＩｇＧとも反
応するものが多く、ヤギ、ウシとは反応するものか半数
あった。
ＲＦがウサギＩｇＧと反応した。またウマＩｇＧとも反
応するものが多く、ヤギ、ウシとは反応するものか半数
あった。
これらの結果を第１表および第２表に示した。
第１表 ヒ）ＩｇＧに対する特異性
第２表 他動物ＩｇＧとの交叉反応性
■ ｍＲＦの精製
アガロースゲルｆＢ 体（ＣＮＢｒ 活性化−セファロ
ース４Ｂ、ファルーシア社製） １ ｍｌにヒトＩｇＧ
を３ ｍｇをカップリングさせ、カラムに充填してＰＢ
Ｓで平衡化した。このカラムにノ＼イブリド−マＣ−２
８，Ｅ−１０，Ｅ−１１，Ｅ−２７あるいはＥ−３６の
培養上清１００〜２００齢を通過させ、ＰＢＳで十分に
洗浄した後０．１ Ｍグリノン塩酸緩衝２ （１）Ｈ２
，８）を用いて一吸着ｍＲＦを溶出し、８Ｍトリス塩酸
緩衝液（吐 ８．２）を１／１０量加えて中性に戻して
、精製マウスｍＲＦとした。
ース４Ｂ、ファルーシア社製） １ ｍｌにヒトＩｇＧ
を３ ｍｇをカップリングさせ、カラムに充填してＰＢ
Ｓで平衡化した。このカラムにノ＼イブリド−マＣ−２
８，Ｅ−１０，Ｅ−１１，Ｅ−２７あるいはＥ−３６の
培養上清１００〜２００齢を通過させ、ＰＢＳで十分に
洗浄した後０．１ Ｍグリノン塩酸緩衝２ （１）Ｈ２
，８）を用いて一吸着ｍＲＦを溶出し、８Ｍトリス塩酸
緩衝液（吐 ８．２）を１／１０量加えて中性に戻して
、精製マウスｍＲＦとした。
Ｃ−２６については、カラムにアガロースゲル担体（Ａ
ｆｆｉｇｅｌ −１０、バイオラッド社製） １ ｍｌ
ＩＣウマＩｇＧを１０１Ｒ９カツプリングさせたもの
を使い、０．１ Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４，５）で溶
出させ、ＰＢＳに対して透析したものを精製マウスｍＲ
Ｆとした。
ｆｆｉｇｅｌ −１０、バイオラッド社製） １ ｍｌ
ＩＣウマＩｇＧを１０１Ｒ９カツプリングさせたもの
を使い、０．１ Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４，５）で溶
出させ、ＰＢＳに対して透析したものを精製マウスｍＲ
Ｆとした。
精製マウスｍＲＦの１ ｍｇあたりのＨＡＧＩこ対する
ＥＬＩＳＡ法による力価は２０００〜８０００倍であっ
た。なお、力価は、固定化された抗原に対して十分員の
抗体が存在する試料についてＥ ＬＩＳＡ法により得ら
れた吸光度を１００９６とし、その値の５０９６を与え
る抗体試料の原液からの希釈倍率で表わした。
ＥＬＩＳＡ法による力価は２０００〜８０００倍であっ
た。なお、力価は、固定化された抗原に対して十分員の
抗体が存在する試料についてＥ ＬＩＳＡ法により得ら
れた吸光度を１００９６とし、その値の５０９６を与え
る抗体試料の原液からの希釈倍率で表わした。
参考例 １２５Ｉ−ウサギ抗ヒトＩｇＧＦｃフラグメン
ト抗体の（Ｆａｂ’）２フラグメントの調製 ウサギをヒトＩｇＧＦｃフラグメントにて免疫して得ら
れた抗体を硫安分画法−ＤＥＡＥセルロースイオン交換
クロマトグラフィーで精製した。
ト抗体の（Ｆａｂ’）２フラグメントの調製 ウサギをヒトＩｇＧＦｃフラグメントにて免疫して得ら
れた抗体を硫安分画法−ＤＥＡＥセルロースイオン交換
クロマトグラフィーで精製した。
この精製抗体を０．１ Ｍ酢酸緩衝液（１）Ｈ４，５１
１，０、１Ｍ塩化ナトリウム含有）１０■／ ｍｌにな
るよ作製した。ペプソン分解液をゲル口過クロマトグラ
フィー（セファデックスＧ−１５０カラム）に付し、０
．１Ｍホウ酸ナナトリウム緩衝液 ＋）Ｈ８，０）で展
開して（Ｆａｂ’）２ フラグメント分画を得た。
１，０、１Ｍ塩化ナトリウム含有）１０■／ ｍｌにな
るよ作製した。ペプソン分解液をゲル口過クロマトグラ
フィー（セファデックスＧ−１５０カラム）に付し、０
．１Ｍホウ酸ナナトリウム緩衝液 ＋）Ｈ８，０）で展
開して（Ｆａｂ’）２ フラグメント分画を得た。
次に、この（Ｆａｂ’）２フラグメントを／Ａンター（
Ｈｕｎｔｅｒ） らの方法にしたがってクロラミンＴ
によす１２５Ｉテ標識した（Ｎａｔｕｒｅ、 ＶＯｌ、
１９４ 、 ｐＩ） ４９５〜４９６ （１９６２）
）。
Ｈｕｎｔｅｒ） らの方法にしたがってクロラミンＴ
によす１２５Ｉテ標識した（Ｎａｔｕｒｅ、 ＶＯｌ、
１９４ 、 ｐＩ） ４９５〜４９６ （１９６２）
）。
実施例 ｌ
精製？ ＋７ ｙ、 ｍ Ｒｆ？をＰＢＳ−ＥＤＴＡ緩
衝液（０１５Ｍ塩化ナトリウム、１０ｍＭＥＤＴＡ含有
）にて２５μＱ／ｍｅに希釈し、ポリスチレンチューブ
に０．５ ｍｅづつ加え、４°Ｃで一晩放置してコート
した。チューブから内容液を除去し、５−５ｇ５ｍ１ｍ
−１Ｎ１１１１ｔ％ＢＳＡ含有Ｐ Ｂ Ｓ −Ｅ ＤＴ
Ａ！＠。
衝液（０１５Ｍ塩化ナトリウム、１０ｍＭＥＤＴＡ含有
）にて２５μＱ／ｍｅに希釈し、ポリスチレンチューブ
に０．５ ｍｅづつ加え、４°Ｃで一晩放置してコート
した。チューブから内容液を除去し、５−５ｇ５ｍ１ｍ
−１Ｎ１１１１ｔ％ＢＳＡ含有Ｐ Ｂ Ｓ −Ｅ ＤＴ
Ａ！＠。
液でブロックした。
希釈したＨＡＧ、モノマー１ｇＧ、または患者血清試料
を１０１１．ｇ加え、さらに１％ＢＳＡ含有ぎＰＢＳ−
ＥＤＴＡ緩衝液を加えて０５肩ｌとし、４０Ｃで一晩放
置した。
を１０１１．ｇ加え、さらに１％ＢＳＡ含有ぎＰＢＳ−
ＥＤＴＡ緩衝液を加えて０５肩ｌとし、４０Ｃで一晩放
置した。
２ ／７ ＆／ＩＩ／ ）を０．５ｇ／（約１０８ ｃ
ｐｍ／ｎｇ）加えた。
ｐｍ／ｎｇ）加えた。
室温で２時間インキュベーションした後、ＰＢＳ−ＥＤ
ＴＡ緩衝液で３回洗浄し、オートガンマ−カウンターに
て放射能量を測定した。計算はカウント数から１２５１
標識フラグメントが何ｎｑ結合しているかを１０８ Ｃ
ｐｍ／ｎ９ という比活性を使って行った。
ＴＡ緩衝液で３回洗浄し、オートガンマ−カウンターに
て放射能量を測定した。計算はカウント数から１２５１
標識フラグメントが何ｎｑ結合しているかを１０８ Ｃ
ｐｍ／ｎ９ という比活性を使って行った。
Ｓ Ｌ Ｅ ８例、ＲＡＳ例、ガン厘例、健常人１０例
で測定を行ったところ、その測定値はＣ−２６ＲＡ４１
．０±８６． ］ ｎＱ／ｍｌ （８７，５％）、ガン
８５０±８．５ ｎ９７Ｍ１ （５７，１％）、健常人
】７５土６．９ ｎＱ／ｍｌであった。
で測定を行ったところ、その測定値はＣ−２６ＲＡ４１
．０±８６． ］ ｎＱ／ｍｌ （８７，５％）、ガン
８５０±８．５ ｎ９７Ｍ１ （５７，１％）、健常人
】７５土６．９ ｎＱ／ｍｌであった。
この結果からマウスｍＲＦによってヒトＩＣが↑
従来のＣ１１！１法やヒｌ−ｍＲＦ法と同等に測定でき
ることがわかった。また、本実施例では、ガン患者のＩ
Ｃ陽性率が少し高かった。
ることがわかった。また、本実施例では、ガン患者のＩ
Ｃ陽性率が少し高かった。
実施例 ２
ＰＢＳ−ＥＤＴＡ緩衝液で次の濃度に希釈したＣ１１ま
たはマウスｍ ＲＦ ０．５ ｍｌをポリスチレンチュ
ーブＩこ加え、４°Ｃで一晩放置した。
たはマウスｍ ＲＦ ０．５ ｍｌをポリスチレンチュ
ーブＩこ加え、４°Ｃで一晩放置した。
十
Ｃ＋ａｌ ５μｇ／肩ｔ
Ｃ−２６Ａ２８ｏ＝２．８１１を８００倍希釈Ｄ−１８
Ａ２８ｏ＝０．４９５を３００倍希釈Ｅ−１１Ａ２８０
＝０．６５５を３００倍希釈ウサつ抗ヒトＩｇＧＦｃ抗
体（Ｆａｂ’）２フラグメント５μＱ ／ ｍｌ 希釈液を吸引して除去し、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ−ＥＤ
ＴＡ緩衝液を１ ｍｌ加え、１時間室温に放置してブロ
ックした。ＢＳＡ溶液を吸引除去し、？−／＠ ＰＢＳ−ＥＤＴＡ緩衝液１５−２１［奔した。
Ａ２８ｏ＝０．４９５を３００倍希釈Ｅ−１１Ａ２８０
＝０．６５５を３００倍希釈ウサつ抗ヒトＩｇＧＦｃ抗
体（Ｆａｂ’）２フラグメント５μＱ ／ ｍｌ 希釈液を吸引して除去し、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ−ＥＤ
ＴＡ緩衝液を１ ｍｌ加え、１時間室温に放置してブロ
ックした。ＢＳＡ溶液を吸引除去し、？−／＠ ＰＢＳ−ＥＤＴＡ緩衝液１５−２１［奔した。
試料を１０１１１加え、さら１こ１９６Ｂ ＳＡ含有Ｐ
ＢＳ−ＥＤＴＡ緩衝液を加えて０５肩ｌとし、２時間半
室温に放置した。
ＢＳ−ＥＤＴＡ緩衝液を加えて０５肩ｌとし、２時間半
室温に放置した。
時間半放置した。
反応液を吸引除去し、ＰＢＳ−ＥＤＴＡ緩衝液１、５
ｍｌで８回洗浄し、オートガンマ−カウンターで放射能
量を測定して、測定値を求めた。
ｍｌで８回洗浄し、オートガンマ−カウンターで放射能
量を測定して、測定値を求めた。
計算はカウント数から１２５１標識フラグメントが何ｎ
ｇ結合しているかを２６７ ｃｐｍ／ｒｌ という比活
性を使って行った。
ｇ結合しているかを２６７ ｃｐｍ／ｒｌ という比活
性を使って行った。
未治療５ＬＥ２０例、未治療ＲＡ２０例、健常人２９例
で測定を行ったところ、正常値の平均プラス２５Ｄ以上
を異常とするとその割合は次のようであった。
で測定を行ったところ、正常値の平均プラス２５Ｄ以上
を異常とするとその割合は次のようであった。
ｃ＋ｊ Ｃ−２６Ｄ−１８Ｅ−１１ＳＬＥ ７
５％ ４ ０９６ ６０９６ ５０％ＲＡ ４
０％ ５０％ ５０％ ８５９６実施例 ３ ９６穴マイクロプレート （塩化ポリビニル製）にハイ
ブリドーマＥ−２７、Ｄ−１８より調製されたｍＲＦを
それぞれ４．１ ｐｇ／ｍｌ、３．５ ／７９／ ｍｌ
にＰＢＳで希釈したものを２００μｅつつ加え、４℃で
一晩放置し、コートした。
５％ ４ ０９６ ６０９６ ５０％ＲＡ ４
０％ ５０％ ５０％ ８５９６実施例 ３ ９６穴マイクロプレート （塩化ポリビニル製）にハイ
ブリドーマＥ−２７、Ｄ−１８より調製されたｍＲＦを
それぞれ４．１ ｐｇ／ｍｌ、３．５ ／７９／ ｍｌ
にＰＢＳで希釈したものを２００μｅつつ加え、４℃で
一晩放置し、コートした。
次１こ１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを加え、室温で１時間放置
してブロックし、ＢＳＡ液を吸引除去後、患者血清試料
１０１１ｅを加え、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを４０．１（
ｌ加え、室温で２時間放置した。
してブロックし、ＢＳＡ液を吸引除去後、患者血清試料
１０１１ｅを加え、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを４０．１（
ｌ加え、室温で２時間放置した。
反応液を吸引除去し、ＰＢＳて３回洗浄した後、ヤ
西洋ワサビペルオキシダーゼ標識■−ギ抗ヒトーＩｇＧ
Ｆｃフラグメント抗体Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（カ
ペル・ラボラトリーズ社製）を加え、室温で２時間イン
キユベーノヨンした。
Ｆｃフラグメント抗体Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（カ
ペル・ラボラトリーズ社製）を加え、室温で２時間イン
キユベーノヨンした。
反応液を吸引除去し、ＰＢＳで３回洗浄後、４−アミノ
アンチピリン、フェノールおよび過酸化水素を含む基質
溶液を加え、０Ｄ５５０ の吸光度を測定して酵素活
性を算定し、ＩＣの定量を行った。
アンチピリン、フェノールおよび過酸化水素を含む基質
溶液を加え、０Ｄ５５０ の吸光度を測定して酵素活
性を算定し、ＩＣの定量を行った。
ガン患者８例、ＲＡＳ例、５ＬＥ８例、健常人８例ＩＣ
ついて検討した結果、陽性率はＤ−１３ｍＲＦではガン
７５％、ＲＡ １２．５％、Ｓ Ｌ Ｅ３７５％であり
、Ｅ−２７ｍＲＦではガフ７５％、ＲＡ １２．５％、
Ｓ Ｉ−Ｅ １２．５％であった。いずれもガンにおけ
るＩＣの陽性率が高かった。
ついて検討した結果、陽性率はＤ−１３ｍＲＦではガン
７５％、ＲＡ １２．５％、Ｓ Ｌ Ｅ３７５％であり
、Ｅ−２７ｍＲＦではガフ７５％、ＲＡ １２．５％、
Ｓ Ｉ−Ｅ １２．５％であった。いずれもガンにおけ
るＩＣの陽性率が高かった。
特許出願人 （６７７）ヤマサ醤油株式会社手続補正書
（自発） 昭和６１年２月 ８日 １、事件の表示 昭和５９年特許願第２３６９０９号 ２、発明の名称 免疫複合体の測定法 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 郵便番号 ２８８ 住所 千葉県銚子市新生町２丁目１０番地の１４、補正
命令の日付 自発 ５、補正により増加する発明の数 なし６、補正の対
象 明細書の発明の詳細な説明の欄 ７、補正の内容 １）明細書第１８頁下から第３行目と第２行目との間に
次文を加入する。
（自発） 昭和６１年２月 ８日 １、事件の表示 昭和５９年特許願第２３６９０９号 ２、発明の名称 免疫複合体の測定法 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 郵便番号 ２８８ 住所 千葉県銚子市新生町２丁目１０番地の１４、補正
命令の日付 自発 ５、補正により増加する発明の数 なし６、補正の対
象 明細書の発明の詳細な説明の欄 ７、補正の内容 １）明細書第１８頁下から第３行目と第２行目との間に
次文を加入する。
［■ サンドインチ法
マウスｍＲＦを同相化した試験管またはマイクロプレー
トなどの反応容器に被検試料を入れて反応させる。次い
でこれに標識化したマウスｍＲＦを加えて反応させ、結
合したもしくは遊離の標識量を測定して定量する。」 ２）明細書第３１頁第２行目の「塩化ポリビニル」を「
ポリ塩化ビニル」に訂正する。
トなどの反応容器に被検試料を入れて反応させる。次い
でこれに標識化したマウスｍＲＦを加えて反応させ、結
合したもしくは遊離の標識量を測定して定量する。」 ２）明細書第３１頁第２行目の「塩化ポリビニル」を「
ポリ塩化ビニル」に訂正する。
３）明細書第３２頁第６行目以下に次文を加入する。
［実施例 ４
９６六マイクロプレート（ポリ塩化ビニル１Ｍ）に、ハ
イブリドーマＤ−１３より調製されたｍＲＦを６．３ｘ
／ｍｆｉ、あるいはｍＲＦ活性を持たないマウスＩｇＭ
を産生ずるハイブリドーマクローンより調製されたマウ
スＩｇＭ（対照用）を１３．１ｉｔｇ／ＩＩＩａの濃度
にＰＢＳで希釈したものを各ウェルに５０μρずつ加え
、４℃で放置し、コートした。
イブリドーマＤ−１３より調製されたｍＲＦを６．３ｘ
／ｍｆｉ、あるいはｍＲＦ活性を持たないマウスＩｇＭ
を産生ずるハイブリドーマクローンより調製されたマウ
スＩｇＭ（対照用）を１３．１ｉｔｇ／ＩＩＩａの濃度
にＰＢＳで希釈したものを各ウェルに５０μρずつ加え
、４℃で放置し、コートした。
次に］％ＢＳＡ含有を加え、室温で１時間放置してブロ
ックし、ＢＳＡ液を吸引除去後、Ａ緩衝液（０，１Ｍト
リス塩酸ｐＨ８゜０．０．５Ｍ塩化ナトリウム、１％Ｂ
ＳＡ）で１０倍に希釈した血清試料をｍＲＦおよびｍＲ
Ｆ活性を持たないＩｇＭをコートしたウェルに５０μΩ
ずつ加え、室温で２時間放置した。
ックし、ＢＳＡ液を吸引除去後、Ａ緩衝液（０，１Ｍト
リス塩酸ｐＨ８゜０．０．５Ｍ塩化ナトリウム、１％Ｂ
ＳＡ）で１０倍に希釈した血清試料をｍＲＦおよびｍＲ
Ｆ活性を持たないＩｇＭをコートしたウェルに５０μΩ
ずつ加え、室温で２時間放置した。
反応液を吸引除去し、ＰＢＳで３回洗浄した後、ラクト
ペルオキシダーゼによって１２５■標識化したＤ−１３
由来のｍＲＦをＡ緩衝液に溶解させた溶液（０，２０μ
ｇ／ｍＱ、５ Ｑ ０ｃｐｉ／ｎｇ）を５０μＱ加え、
４℃で一夜放置した。
ペルオキシダーゼによって１２５■標識化したＤ−１３
由来のｍＲＦをＡ緩衝液に溶解させた溶液（０，２０μ
ｇ／ｍＱ、５ Ｑ ０ｃｐｉ／ｎｇ）を５０μＱ加え、
４℃で一夜放置した。
反応液を吸引除去し、ＰＢＳで３回洗浄した後、オート
ガンマ−カウンターで放射能量を測定して、ｍＲＦをコ
ートしであるウェルのカウント数から、ｍ ＲＦ活性を
持たない１ｇＭをコートしであるウェルのカラン１−数
を差し引いて計算し、ＩＣを定量した。
ガンマ−カウンターで放射能量を測定して、ｍＲＦをコ
ートしであるウェルのカウント数から、ｍ ＲＦ活性を
持たない１ｇＭをコートしであるウェルのカラン１−数
を差し引いて計算し、ＩＣを定量した。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）ヒト体液試料中の免疫複合体を免疫学的測定法によ
り測定する方法において、試料中の免疫複合体に対して
特異的に結合させる抗体試薬としてマウスモノクローナ
ルリウマトイド因子を用いることを特徴とする免疫複合
体の測定法。 ２）固相化したマウスモノクローナルリウマトイド因子
と試料とを反応させ、次いでその反応物に標識化した抗
ヒトＩｇＧ抗体類またはそのフラグメントを加えて結合
させ、その結合標識量を測定して免疫複合体を測定する
ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３）微粒子に固相化したマウスモノクローナルリウマト
イド因子と試料とを反応させ、生じる疑集の度合を測定
して免疫複合体を測定することを特徴とする特許請求の
範囲第１項記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23690984A JPS61114165A (ja) | 1984-11-09 | 1984-11-09 | 免疫複合体の測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23690984A JPS61114165A (ja) | 1984-11-09 | 1984-11-09 | 免疫複合体の測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61114165A true JPS61114165A (ja) | 1986-05-31 |
| JPH0453263B2 JPH0453263B2 (ja) | 1992-08-26 |
Family
ID=17007548
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP23690984A Granted JPS61114165A (ja) | 1984-11-09 | 1984-11-09 | 免疫複合体の測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61114165A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63255662A (ja) * | 1987-04-13 | 1988-10-21 | Nitsusui Seiyaku Kk | 免疫複合体の測定法 |
| WO2001055724A1 (fr) * | 2000-01-27 | 2001-08-02 | Shibayagi Co., Ltd | Technique de quantification applicable a un anticorps de maladie auto-immune, reactif de quantification et trousse de quantification |
-
1984
- 1984-11-09 JP JP23690984A patent/JPS61114165A/ja active Granted
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| CLIN.EXP.IMMUNOL=1981 * |
| THE JOURNAL OF IMMUNOLOGY=1977 * |
| THE JOURNAL OF INFECTIOUS DISEASE=1980 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63255662A (ja) * | 1987-04-13 | 1988-10-21 | Nitsusui Seiyaku Kk | 免疫複合体の測定法 |
| WO2001055724A1 (fr) * | 2000-01-27 | 2001-08-02 | Shibayagi Co., Ltd | Technique de quantification applicable a un anticorps de maladie auto-immune, reactif de quantification et trousse de quantification |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0453263B2 (ja) | 1992-08-26 |
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Legal Events
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