JPH0453515B2

JPH0453515B2 -

Info

Publication number: JPH0453515B2
Application number: JP5318284A
Authority: JP
Inventors: Kazutomo Imahori; Hiroshi Nakajima; Osamu Konishi; Kazutsugu Kitahata; Ryoichi Tsuruya; Keiichi Yamamoto
Original assignee: RIKEN
Current assignee: RIKEN
Priority date: 1984-03-19
Filing date: 1984-03-19
Publication date: 1992-08-26
Also published as: JPS60196197A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、ペプチド又はペプチド誘導体の新規
な合成法に関するものである。

近年、ペプチドに種々の生理活性が存在するこ
とが相ついで知られ、治療、診断などの医薬品と
しての重要性並びに呈味物質としての重要性がま
すます増大しつつある。それに伴い、ペプチド合
成法の開発も活発である。現在までに知られてい
るペプチド合成法の主なものとしては、例えば、
フアルマシア、レビユー、３号、27〜47頁（1980
年）にまとめられているように、化学合成法と酵
素法の二つに大別することができる。その化学合
成法としては、アジド法、混合酸無水物法、活性
エステル法、カルボジイミド法でアミノ酸を逐次
的に縮合する方法とフラグメントで縮合させる方
法などが代表的なものであるが、これらどの化学
合成法においても、ラセミ化及び副反応が起きや
すく反応時間が長く、未端アミノ基を保護基にて
反応前にあらかじめ保護しておく必要があるなど
種々の問題がある。フラグメント縮合法の場合、
特にラセミ化が起こりやすいという重大な欠点を
有するものである。

一方、ラセミ化の生起を極力避ける方法とし
て、プロテアーゼを用いる酵素法が提案されてい
るがこの方法においてもやはり、反応時間が長
く、末端アミノ酸を保護基にて保護しておく必要
があるなど操作の煩雑さを改良するには至らなか
つた。さらに、このプロテアーゼを用いる酵素法
では、用いる酵素が本来ペプチド分解活性を有し
ているため、生じたペプチドが合成と併行して分
解され、しばしば目的のペプチドが得られないと
いう重大な欠点を示すものであつた。特に、オリ
ゴペプチドの合成を適用した場合には、一部のア
ミノ酸が欠落した目的外のペプチドが得られる重
大な欠点が指摘されている〔ジヤーナル・オブ・
バイオロジカル・ケミストリー誌、256巻、1301
頁（1981年〕。また、酵素法によるペプチド合成
法としては、プロテアーゼ法の他に、特定なアミ
ノ酸配列を有する単一ペプチドの合成のみを司る
特殊な酵素を用いる方法が知られている。この種
の酵素としては、例えば、グルタミン酸／システ
イン／グリシンの配列であるトリペプチドを合成
するグルタチオン合成酵素（特開昭54−122793号
公報）やデカペプチドであるグラミシジンＳを合
成するグラミシジンＳ合成酵素（現代化学1974年
12月号12頁）などが報告されている。しかし、こ
れらの酵素は特殊な酵素であつて、この酵素によ
つて合成しうるペプチドは、限定された一種のみ
のペプチドであり、目的とする任意なペプチドを
合成することができない。このため、この方法は
一般的なペプチド合成法とはなり得ないのが現状
である。

本発明者らは、ペプチドの有用性に鑑み、上記
のような欠点、特にラセミ化、副反応の生起、反
応の煩雑さなどの原因となり、同時に経済性を損
なう保護基の必要性を解決し、汎用性のある新規
なペプチド合成法を提供することを目的として鋭
意研究を重ねた結果、アミノ酸を核酸の一種であ
るtRNAに結合させる作用を有する酵素で、従来
全くペプチド結合を形成する作用が知られていな
かつたアミノアシル−tRNAシンテターゼに驚く
べきことに、ペプチド合成能があることを見い出
し、この酵素を縮合剤として用いると、前記の目
的がすべて達成されることを見い出し、先に特許
出願した（特開昭58−146539号公報参照）。しか
し、この方法は良好な収率で目的物を得るには、
高価なアミノアシル−tRNAシンテターゼを高濃
度で反応系に加えており、コストが高くなる傾向
があつた。

また、反応操作中に予期せぬ副反応が起こる場
合が度々認められ、特にトリプトフアン、メチオ
ニン、システイン等をペプチド又はペプチド誘導
体の構成成分に含む場合に、この傾向があつた。
さらに、反応操作中に、アミノアシル−tRNAシ
ンテターゼの活性が失われる傾向もあつた。

そこで、本発明者らは上記の点を改良するため
にさらに鋭意研究を重ねた結果、驚くべきことに
反応を不活性ガス雰囲気下で行なうと、副反応を
おさえ、高価なアミノアシル−tRNAシンテター
ゼの失活を防ぎ、さらに低濃度の原料、特に酵素
の濃度を低くしてもペプチド又はペプチド誘導体
を高収量で合成できることを見い出し、本発明を
完成した。

すなわち、本発明は、アミノ酸とアミノ酸から
誘導されるアミノ酸誘導体とをアミノアシル−
tRNAシンテターゼの存在下で反応させてペプチ
ド又はペプチド誘導体を合成するに際し、該反応
を不活性ガス雰囲気下で行うことを特徴とするペ
プチド又はペプチド誘導体の合成法である。

本発明に使用されるアミノアシル−tRNAシン
テターゼは、酵素分類6.1.1に属し、次式アミノ酸＋ATP＋tRNA→アミノアシル− tRNA＋AMP＋ピロリン酸の反応を触媒する酵素であり、例えば、ウサギ、
ウマ、ウシ、ラツト、ニワトリ、ヘビなどの動物
組織より得られるもの、イネ、イモ、トマトなど
の植物組織より得られるもの、カビ、酵母、キノ
コ、細菌、放射菌などの微生物及び藻類より得ら
れるものなどがあげられる。なかでも、酵素の取
得が容易であることから、微生物より得られるも
のが好ましく、さらに酵素の安定性からバチル
ス・ステアロサーモフイルス、サーマス・サーモ
フイルス、サーマス・フラバス、クロストリジウ
ム・サーモアセチカム、サーマス・マクアテイカ
スなどの耐熱性細菌より得られるアミノアシル−
tRNAシンテターゼが最適である。

これら各種のアミノアシル−tRNAシンテター
ゼは、種々のα−アミノ酸に特異性のあるものと
しては、チロシル−tRNAシンテターゼが、また
ロイシンに特異性のあるものとしては、ロイシル
−tRNAシンテターゼが、さらにバリンに特異性
のあるものとしては、バリル−tRNAシンテター
ゼ、その他イソロシル−tRNAシンテターゼ、フ
エニルアラニル−tRNAシンテターゼ、フエニル
アラニル−tRNAシンテターゼ、アラニル−
tRNAシンテターゼ、グルタミル−tRNAシンテ
ターゼ、アスパラギニル−tRNAシンテターゼ、
メチオニル−tRNAシンテターゼ、ヒスチジル−
tRNAシンテターゼ、リジル−tRNAシンテター
ゼ、トレオニル−tRNAシンテターゼ、セリル−
tRNAシンテターゼ、アスパラチル−tRNAシン
テターゼ、グルタミル−tRNAシンテターゼ、シ
ステイニル−tRNAシンテターゼ、プロリル−
tRNAシンテターゼ、グリシル−tRNAシンテタ
ーゼ、アルギニル−tRNAシンテターゼ、トリプ
トフアニル−tRNAシンテターゼなどが具体例と
してあげられる。

本発明で好ましく用いられるアミノ酸として
は、例えばチロシン、アラニン、ロイシン、イソ
ロイシン、フエニルアラニン、メチオニン、リジ
ン、セリン、バリン、アスパラギン、アスパラギ
ン酸、グリシン、グルタミン、グルタミン酸、シ
ステイン、トレオニン、トリプトフアン、ヒスチ
ジン、プロリン、アルギニンなどのα−アミノ酸
があげられ、Ｌ体、Ｄ体のいずれでもよい。ま
た、好ましく用いられるアミノ酸誘導体として
は、例えばグリシン、アラニン、ロイシン、イソ
ロイシン、フエニルアラニン、グルタミン、イソ
ロインシ、システイン、チロシン、アルギニン、
バリン、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、
メチオニン、トリプトフアン、トレオニンなどの
α−アミノ酸、β−アラニン、β−アミノイソ酪
酸などのβ−アミノ酸、クレアチンなどの含窒素
γ−アミノ酸、ピペリジン酸などのγ−アミノ
酸、ε−アミノカプロン酸などのε−アミノ酸な
どの各種アミノ酸のエステル、チオエステル、ア
ミド、ヒドロキサミドなどがあげられるが、アミ
ノ基が遊離の形であるアミノ酸誘導体であれば、
上記例示化合物に限定されるものではない。その
エステルとしては、例えばメチル、エチル、プロ
ピル、シクロヘキシル、フエニル、ベンジルなど
の単純な炭化水素系のエステルから、tRNAの
3′−OHで上記アミノ酸がエステル化したものま
で、種々のエステルを用いることができる。ま
た、アミドとしては、遊離のアミドの他、例えば
異種あるいは同種のアミノ酸がアミド結合したオ
リゴペプチドやポリペプチドを用いることもでき
る。このオリゴペプチドやポリペプチドがさらに
エステル、チオエステル、ヒドロキサミド、エー
テル化したものを用いることも可能である。

本発明で用いる不活性ガスとしては、非酸化性
の気体であれば、いかなるものでもよい。そのよ
うな好ましい具体例として、炭酸ガス、窒素、ヘ
リウム、アルゴン、ネオンがあげられる。これを
実施するには、例えば、あらかじめ真空ポンプ等
で反応器を脱気し、不活性ガスで常圧にもどした
反応器の中で行うか、もしくは反応器に不活性ガ
スを流通した条件で行うか、あるいは不活性ガス
で置換させた反応器を密閉した条件で行えばよ
い。

本発明でペプチド又はペプチド誘導体を合成す
るには、まず不活性ガス雰囲気下アミノ酸とアミ
ノ酸誘導体との混合物を得るか、あるいは不活性
ガス雰囲気下アミノ酸誘導体とアミノアシル−
tRNAシンテターゼとの混合物を得ることが好ま
しい。そのためには、水又は例えば緩衝液中アデ
ノシン三リン酸又はデオキシアデノシン三リン酸
存在下に、不活性ガス雰囲気下アミノ酸とアミノ
酸誘導体とを混合するか、あるいは緩衝液中アデ
ノシン三リン酸又はデオキシアデノシン三リン酸
存在下に、不活性ガス雰囲気下アミノ酸誘導体と
アミノアシル−tRNAシンテターゼとを混合する
ことによつて行えばよい。このときに、次の反応
を円滑に進行させ、酵素の失活を防ぐことを主目
的として、反応系にマグネシウム、マンガンなど
の二価カチオン、メルカプトエタノール、ジチオ
スレイトールなどのスルフヒドリル化剤、ピロフ
オフアターゼを単独又は混合して添加してもよ
い。各添加剤の好適な濃度としては、二価カチオ
ン0.01mM〜500mM、スルフヒドリル化剤
0.001mM〜100mM、ピロホスフアターゼ0.001ユ
ニツト／ml〜100ユニツト／mlであり、最適な濃
度としては、それぞれ二価カチオン0.1mM〜
10mM、スルフヒドリル化剤0.01mM〜1mM、ピ
ロホスフアターゼ１ユニツト／ml〜10ユニツト／
mlである。また、アミノ酸、アミノアシル−
tRNAシンテターゼ及びアデノシン三リン酸又は
デオキシアデノシン三リン酸の使用量は特に制限
されないが、実用的な収量を得るためには、アミ
ノ酸とアミノアシル−tRNAシンテターゼのモル
比を10⁹：１〜１：１、アミノ酸とアデノシン三
リン酸又はデオキシアデノシン三リン酸とのモル
比１：１〜１：100の範囲内で行うのが好ましい。
さらに、アミノ酸誘導体の濃度としては、10mM
から10Mの範囲が適当であり、100mMから2Mの
範囲が好ましい。また、これよりさらに低くして
も用いることができる。

このときに用いる緩衝液としては、アミノ酸、
アミノ誘導体、アミノアシル−tRNAシンテター
ゼ及びアデノシン三リン酸又はデオキシアデノシ
ン三リン酸が溶解し、しかも酵素活性を維持し、
所望のPHが得られるものであれば、いかなるもの
を使用してもよい。そのような具体例として、例
えばトリス塩酸塩緩衝液、ヘペス緩衝液、トリエ
タノールアミノ緩衝液、マレート緩衝液、リン酸
緩衝液などがあげられる。これら緩衝液に親水性
有機溶媒を加えた混合媒体も上記条件を満たしさ
えすれば、使用可能である。この親水性有機溶媒
としては、ジオキサン、テトラヒドロフランなど
のようなエーテル、さらにジメチルスルホキシ
ド、ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、ア
セトンなどが好ましく用いられる。これら有機溶
媒は、それぞれ単独又は２種以上組み合わせて使
用してもよい。この時の混合液全体に占める有機
溶媒の容積の濃度としては、0.5〜85％、好まし
くは５〜60％、最適には10〜50％の範囲である。

次に、上記で得られれたアミノ酸とアミノ酸誘
導体との混合物とアミノアシル−tRNAシンテタ
ーゼとを不活性ガス雰囲気下に混合し、あるいは
上記で得られたアミノ酸誘導体とアミノアシル−
tRNAシンテターゼとの混合物とアミノ酸とを不
活性ガス雰囲気下に混合し、アミノ酸とアミノ酸
誘導体とをアミノアシル−tRNAシンテターゼの
存在下で反応させる。この反応を行う際のPHとし
ては、５〜11、好ましくは６〜10、最適には７〜
９の範囲である。反応の温度としては、酵素活性
を維持する観点から一般に０℃〜70℃、好ましく
は10℃〜50℃、最適には20℃〜40℃で行われる。

上記条件でペプチド化は、数秒から数日で完結
し、目的のペプチド又はペプチド誘導体を得るこ
とができる。

本発明によつて得られるペプチド誘導体は、例
えばモルヒネ用作用のMet−エンケフアリン、血
圧降下作用などのあるブラジキニンや内・外分泌
抑制作用などのあるソマトスタチンなどの各種ホ
ルモン及び抗生物質ペプチド、呈味ペプチドのよ
うな他の生物学的活性物質として有用である。

本発明によれば、副反応をおさえ、また高価な
アミノアシル−tRNAシンテターゼの失活を防
ぎ、さらに低濃度の原料、特に酵素の濃度を低く
してもペプチド誘導体を製造することができるの
で製造コストも安価である。

以下、本発明を実施例により具体的に説明す
る。

参考例１バチルス・ステアロサーモフイルスUK788（微
工研菌寄第5141号）の菌体６Kgを２倍量の
100mMトリス・塩酸緩衝液（PH7.5）に懸濁し、
ダイノミルを用いて細胞を破砕後、遠心分離によ
り不溶物を除去し、チロシンに特異的なチロシル
−tRNAシンテターゼを含む粗抽出液を得た。あ
らかじめ5mMメルカプトエタノール、2mMエチ
レンジアミン四酢酸ナトリウム及び0.1mMホス
ホフエニルスルホニルフルオリドを含む50mMト
リス緩衝液（PH7.5）で平衡化したマートレツク
スゲルブル−Ａ（アミコン社製）を充填したカラ
ムに、上記の粗抽出液をとおし、塩化カリウムを
上記緩衝液に加えた溶液で、線速度60cm・h^-1で
溶出せしめると、チロシル−tRNAシンテターゼ
が溶出した。この区分を集め、濃縮、脱塩を行つ
た結果、約70％の収率でチロシンに特異的なチロ
シル−tRNAシンテターゼを含む粗酵素液を得
た。上記操作をすべて４℃で行つた。

参考例２サツカロミセス・セルビシアエαS288C 1000Kg
をダイノミルで細胞破砕後、得られた粗抽出液を
硫酸アンモニウム分画、DEAE−セルロースクロ
マトグラフイー、リン酸セルロース（ワツトマン
社製）クロマトグラフイー、DEAE−セフアセル
（フアルマシア社製）クロマトグラフイー、ウル
トロゲルACA34クロマトグラフイー及びCM−セ
ルロース（ワツトマン社製）クロマトグラフイー
でロイシンに特異的なロイシル−tRNAシンテタ
ーゼを3.2gを得た。

参考例３ウサギの肝臓1000Kgをワーリングブレンダーで
破砕後、遠心（15000g）、その上漬をさらに超遠
心（105000g）して可溶性タンパク画分を得、こ
れを硫酸アンモニウム分画セフアデツクスＧ−
200（フアルマシア社製）ゲルクロマトグラフイ
ー、DEAEセフアセルクロマトグラフイー及びハ
イドロキシアパタイトクロマトグラフイーでメチ
オニル−tRNAシンテターゼを4.5g得た。

参考例４エシエリヒア・コリＫ−12株150Kgから参考例
１と同一のカラム操作で、アスパラギン酸に特異
的なアスパラチル−tRNAシンテターゼを1.5gを
得た。

参考例５バチルス・ステアロサーモフイルスNCA1503
株100Kgから参考例１と同一のカラム操作で、ア
ルギニンに特異的なアルギニル−tRNAシンテタ
ーゼを1.1gを得た。

実施例１、比較例１Ｌ−フエニルアラニンエチルエステル8gを含
む20mMピペス緩衝液、PH7.0、45mlに、塩化マ
グネシウム0.15g、アデノシン三リン酸二ナトリ
ウム0.3g、Ｌ−チロシン10mg、ピロホスフアクタ
ーゼ（ベーリンガー・マンハイム社製）200ユニ
ツト及びジチオスレイトール0.01mgを加え、混合
液の容量を50mlに調整した。窒素ガスにより反応
器の中の空気を置換し、この混合液のPHを7.0に
維持した状態で、参考例１で得たチロシル−
tRNAシンテターゼ0.2mgを窒素雰囲気下に加え、
よく混合し、反応温度を30℃に保つて１日放置し
て反応させた。

次いで、得られた反応液をポンダパツクC₁₈カ
ラム（ウオーターズ社製）に供し、アセトニトリ
ル／0.1％トリフルオロ酢酸水溶液の直線勾配で
溶出し、分離し、Ｌ−チロシル−Ｌ−フエニルア
ラニンエチルエステルを18mg得た。

その元素分析（C₂₀H₂₄N₂O₂＝356.42）は計算値（％）Ｃ＝67.39 Ｈ＝6.80 Ｎ＝7.86 測定値（％）Ｃ＝67.28 Ｈ＝6.93 Ｎ＝7.79 であつた。

また、比較（比較例１）のため反応操作を窒素
雰囲気でなく、かつ実施例１で使用したチロシル
−tRNAシンテターゼの量の30000倍に相当する
6gを用い、実施例１と同じ量の塩化マグネシウ
ム、アデノシン三リン酸ナトリウム、Ｌ−チロシ
ン、ピロホスフアターゼ及びジチオスレイトール
を含む20mMピペス緩衝液、PH7.0、50mlに加え、
４℃で15時間反応させ、得られた反応混合物をＧ
−75（フアルマシア社製）カラムに供し、同上ピ
ペス緩衝液にて溶出し、ボイド容の画分を集め、
反応混合物を単離し、これにＬ−フエニルアラニ
ンエチルエステル8gを加え、大気下で30℃に保
つて、１夜放置して反応させた。

その結果、Ｌ−チロシル−Ｌ−フエニルアラニ
ンエチルエステルの収量は４mgであり、実施例１
の収量の約1/4であつた。さらに比較例１で用い
たチロシル−tRNAシンテターゼは、6gであるの
に対し、実施例１ではその30000分の１の0.2mgで
よかつた。

実施例２、比較例２グリシル−グリシル−フエニルアラニル−メチ
オニン1.5gを含む50mMヘペス緩衝液、PH7.9、50
mlに塩化マグネシウム100mg、アデノシン三リン
酸二ナトリウム200mg、¹⁴Cで放射性標識したＬ−
チロシン25mg、ジチオスレイトール0.005mgを、
ヘリウムガスでシールした100mlの三つ口フラス
コに加え、マグネチツクスターラーで撹拌しなが
ら、この混合液に参考例１で得たチロシル−
tRNAシンテターゼ0.1mgを加え、よく混合し、
反応温度を40℃に保つて７時間反応させた。

得られた反応物の一部を採取し、セルロース薄
層クロマトグラフイー（展開溶媒ｎ−ブタノー
ル／ピリジン／酢酸／水＝15／10／３／12）で分
析同定を行つた結果、チロシル−グルシル−グル
シル−フエニルアラニル−メチオニン（以下エン
ケフアリンと呼ぶ）の位置に放射能も検出し、目
的のオリゴペプチド、エンケフアリンの合成を確
認した。本物質をさらに、カルボキシペプチダー
ゼ消化後、上記のセルロース薄層クロマトグラフ
イーで消化物を経時的に分析した。

その結果、放射能はエンケフアリン〔１−４〕、
エンケフアリン〔１−３〕、エンケフアリン〔１
−２〕に時間とともに移行し、本反応で得られた
物質が目的のエンケフアリンであることが確認さ
れた。収率は放射能の測定値より使用したチロシ
ンに対して75％と求められた。

次に比較のため、ヘリウムガスのシールを行わ
ず、実施例２と同じ量の塩化マグネシウム、アデ
ノシン三リン酸二ナトリウム、¹⁴Cで放射能標識を
したＬ−チロシン、ジチオスレイトールを含む
50mMヘペス緩衝液、PH7.9、50mlに実施例２と
同じチロシルtRNAシンテターゼの量の1000倍に
相当する0.1gを加え、よく混合し、４℃で15時間
反応させ、得られた反応混合物を比較例１と同様
の方法で単離し、これに大気下でグリシル−グリ
シル−フエニルアラニル−メチオニン1.5gを加
え、少量の水酸化ナトリウムでPHを7.9に維持し
た状態で、実施例２と同様、40℃で７時間反応さ
せたところ、酵素を多量用いたにもかかわらず、
反応物を実施例２と同様にして薄層クロマトグラ
フイーで分析した結果、副反応のためかコンケフ
アリンの生成は非常に低く、わずかに検出できる
程度であつた。

実施例３、比較例３Ｌ−フエニルアラニンメチルエステル2gを含
む30mM2，５−ジメチルイミダゾール緩衝液PH
7.2、13mlに塩化マグネシウム20mg、アデノシン
三リン酸二ナトリウム50mg、ピロホスフアターゼ
（ベーリンガー・マンハイム社製）10ユニツト、
メルカプトエタノール20μ及び参考例２で得た
ロイシル−tRNAシンテターゼ３mgを加え、混合
液のPHを7.2に窒素気流下に維持しながら容量を
15mlに調整した。これにＬ−ロイシン１mgを加
え、窒素気流下によく混合し、PH7.2、反応温度
20℃に保つて５時間反応させた。

次いで、得られた反応混合物をボンダパツク
C₁₈カラムにより実施例１と同様に分離し、Ｌ−
ロイシル−Ｌ−フエニルアラニンメチルエステル
2.2mgを得た。

その元素分析（C₁₆H₂₄N₂O₃＝292.36）は計算値（％）Ｃ＝65.73 Ｈ＝8.27 Ｎ＝9.58 測定値（％）Ｃ＝65.80 Ｈ＝8.17 Ｎ＝9.49 であつた。

次に、比較（比較例３）のため、実施例３と同
じ量の塩化マグネシウム、アデノシン三リン酸二
ナトリウム、Ｌ−ロイシン、ピロホスフアターゼ
及びメルカプトエタノールを含む実施例３と同一
緩衝液15mlに実施例３と同じロイシルーtRNAシ
ンテターゼの量の1000倍に相当する3gを加え、
よく混合し、４℃で20分間反応させ、得られた反
応混合物を比較例１と同様の方法で単離し、これ
にＬ−フエニルアラニンメチルエステル2gを加
え、実施例３と同様反応を行つた。このとき、全
ての操作は、窒素気流下には行わなかつた。

その結果、Ｌ−ロイシル−Ｌ−フエニルアラニ
ンメチルエステルの収量は1.8mgであり、実施例
３とほぼ同じ収量であるが、ロイシル−tRNAシ
ンテターゼの量は1000倍を要した。

実施例４、比較例４ β−アラニルアミド5gを含む50mMリン酸緩衝
液、PH7.5 35mlに塩化マグネシウム100mg、Ｌ−
メチオニン２mg、ピロホスフアターゼ（ベーリン
ガー・マンハイム社製）100ユニツト、ジチオス
レイトール0.01mgを加えて混合液を得た。この混
合液に参考例３で得たメチオニル−tRNAシンテ
ターゼ１mgを加え、混合液のPHを7.5に維持しな
がら容量を40mlに調整し、これにデオキシアデノ
シン三リン酸二ナトリウム100mgを加え、PH7.5に
し、反応器を一度真空ポンプで１〜0.1mmHg程度
に減圧したのち、アルゴンガスを流入して反応器
を常圧にもどし、速やかに栓をし、実施例３と同
様に反応を行い、分離してＬ−メチオニル−β−
アラニルアミド2.5mgを得た。

その元素分析（C₈H₁₇N₃O₂S＝219.30）は、計算値（％）Ｃ＝43.81 Ｈ＝7.82 Ｎ＝19.16 測定値（％）Ｃ＝43.90 Ｈ＝7.70 Ｎ＝19.13 であつた。

次に、比較（比較例４）のため、脱気及びそれ
に続くアルゴン置換を行わず実施例４と同じ量の
塩化マグネシウム、デオキシアデノシン三リン酸
二ナトリウム、Ｌ−メチオニン、ピロホスフアタ
ーゼ及びジチオスレイトールを含む実施例４と同
一緩衝液40mlに実施例４と同じメチオニル−
tRNAシンテターゼの量の1000倍に相当する1gを
加え、よく混合し、比較例１と同様にしてβ−ア
ラニルアミド5gを加え、実施例４と同様に反応
を行つた。

その結果、Ｌ−メチオニル−β−アラニルアミ
ドの収量は1.3mgであり、酵素を1000倍用いたに
もかかわらず低収率であつた。

実施例５、比較例５Ｌ−フエニルアラニンエチルエステル8gを含
む20mMピペス緩衝液、PH7.1、45mlに塩化マグ
ネシウム150mg、アデノシン三リン酸二ナトリウ
ム300mg、Ｌ−アスパラギン酸２mg、ピロホスフ
アターゼ（ベーリンガー・マンハイム社製）200
ユニツト及びジチオスレイトール0.01mgをヘリウ
ムを雰囲気下に加え、混合液をPH7.1、容量50ml
に調整した。これに参考例４で得たアスパラチル
−tRNAシンテターゼ0.1mgを加え、よく混合し、
ヘリウム雰囲気下にPH7.1、反応温度30℃に保つ
て１日静置反応させた。この反応液を実施例１と
同様に処理して、Ｌ−アスパラチル−Ｌ−フエニ
ルアラニンエチルエステル3.7mgを得た。

次に比較（比較例５）のため、実施例５と同じ
量の塩化マグネシウム、アデノシン三リン酸二ナ
トリウム、Ｌ−アスパラギン酸、ピロホスフアタ
ーゼ及びジチオスレイトールを含む実施例５と同
一緩衝液50mlに、実施例５と同じアスパラチル−
tRNAシンテターゼの量の20000倍に相当する2g
を加え、よく混合し、４℃で20分間反応させ、得
られた反応混合物を比較例１と同様の方法で単離
し、これにＬ−フエニルアラニンエチルエステル
8gを加え実施例５と同様に反応を行つた。この
とき、全操作はヘリウム雰囲気下には行わなかつ
た。

その結果、Ｌ−アスパラチル−Ｌ−フエニルア
ラニンエチルエステル3.0mgを得た。

実施例６，７、比較例６Ｌ−チロシンｔ−ブチルエステル4gを含む
20mMヘペス緩衝液PH8.0、45mlに塩化マグネシ
ウム300mg、アデノシン三リン酸二ナトリウム350
mg、Ｌ−アルギニン１mg、ピロホスフアターゼ
（ベーリンガー・マンハイム社製）200ユニツト及
びジチオスレイトール0.01mgをヘリウム雰囲気下
に加え、混合液のPHを8.0容量を50mlに調整した。
これに参考例５で得たアルギニル−tRNAシンテ
ターゼ0.2mgを加え、よく混合して、PH8.0に保
ち、以下実施例５と同じ操作を行つて、Ｌ−アル
ギニル−Ｌ−チロシンｔ−ブチルエステル0.5mg
を得た。

次に、比較（比較例６）のため、アルギニル−
tRNAシンテターゼ0.2gを使用し、ヘリウム雰囲
気下に行わないこと以外は、実施例６と同じ量を
用いて比較例５と同じ操作でＬ−アルギニル−Ｌ
−チロシンｔ−ブチルエステル0.3mgを得た。

次に、Ｌ−チロシンｔ−ブチルエステルの代わ
りに、Ｄ−チロシンｔ−ブチルエステルを用いて
実施例６と全く同様に反応を行つた（実施例７）。

その結果、Ｌ−アルギニル−Ｄ−チロシンｔ−
ブチルエステル0.4mgを得た。

Claims

【特許請求の範囲】

１アミノ酸とアミノ酸から誘導されるアミノ酸
誘導体とをアミノアシル−tRNAシンテターゼの
存在下で反応させてペプチド又はペプチド誘導体
を合成するに際し、該反応を不活性ガス雰囲気下
で行うことを特徴とするペプチド又はペプチド誘
導体の合成法。