JPH029800B2

JPH029800B2 -

Info

Publication number: JPH029800B2
Application number: JP9042582A
Authority: JP
Inventors: Kazutomo Imahori; Isao Tomioka; Hiroshi Nakajima; Keiichi Yamamoto; Tatsuo Iwasaki
Original assignee: RIKEN
Current assignee: RIKEN
Priority date: 1982-05-27
Filing date: 1982-05-27
Publication date: 1990-03-05
Also published as: JPS58209991A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、ペプチド又はペプチド誘導体の新規
な合成法に関するものである。

近年、ペプチドに種々の生理活性が存在するこ
とが相ついで知られ、治療、診断などの医薬品と
しての重要性並びに呈味物質としての重要性がま
すます増大しつつある。それに伴いペプチド合成
法の開発も活発である。現在までに知られている
ペプチド合成法の主なものとしては、例えばフア
ルマシア、レビユー、３号、27−47頁（1980年）
にまとめられているように、化学合成法と酵素法
の二つに大別することができる。その化学合成法
としては、アジド法、混合酸無水物法、活性エス
テル法、カルボジイミド法でアミノ酸を逐次的に
縮合する方法とフラグメントで縮合させる方法な
どが代表的なものであるが、これらどの化学合成
法においても、ラセミ化及び副反応が起きやすく
反応時間が長く、末端アミノ基を保護基にて反応
前にあらかじめ保護しておく必要があるなど種々
の問題がある。フラグメント縮合法の場合、特に
ラセミ化が起りやすいという重大な欠点を有する
ものである。

一方、ラセミ化の生起を極力避ける方法として
プロテアーゼを用いる酵素法が提案されているが
この方法においてもやはり、反応時間が長く、末
端アミノ基を保護基にて保護しておく必要がある
など操作の煩雑さを改良するには至らなかつた。
さらに、このプロテアーゼを用いる酵素法では、
用いる酵素が本来ペプチド分解活性を有している
ため、生じたペプチドが合成と併行して分解さ
れ、しばしば目的のペプチドが得られないという
重大な欠点を示すものであつた。特に、オリゴペ
プチドの合成に適用した場合には、一部のアミノ
酸が欠落した目的外のペプチドが得られる重大な
欠点が指摘されている（ジヤーナル・オブ・バイ
オロジカル・ケミストリー誌、256巻、1301頁
（1981年）。また、酵素法によるペプチド合成法と
しては、プロテアーゼ法の他に、特定なアミノ酸
配列を有する単一ペプチドの合成のみを司る特殊
な酵素を用いる方法が知られている。この種の酵
素としては、例えばグルタミン酸／システイン／
グリシンの配列であるトリペプチドを合成するグ
ルタチオン合成酵素（特開昭54−122793号公報。）
やデカペプチドであるグラミシジンＳを合成する
グラミシジンＳ合成酵素（現代化学1974年12月号
12頁）などが報告されている。しかし、これらの
酵素は特殊な酵素であつて、この酵素によつて合
成しうるペプチドは、限定された一種のみのペプ
チドであり、目的とする任意なペプチドを合成す
ることができない。このため、この方法は一般的
なペプチド合成法とはなり得ないのが現状であ
る。

本発明者らは、ペプチドの有用性に鑑み、上記
のような欠点、特にラセミ化、副反応の生起、反
応の煩雑さ等の原因となり、同時に経済性を損う
保護基の必要性を解決し、汎用性のある新規なペ
プチド合成法を提供することを目的として鋭意研
究を重ねた結果、アミノ酸を核酸の一種である
tRNAに結合させる作用を有する酵素で、従来全
くペプチド結合を形成する作用が知られていなか
つたアミノアシル−tRNAシンテターゼに驚くべ
きことに、ペプチド合成能があることを見い出
し、この酵素を縮合剤として用いると、前記の目
的がすべて達成されることを見い出し、先に特許
出願した（特願昭57−10336号）。しかし、この方
法は良好な収率で目的物を得るには、ペプチド又
はペプチド誘導体の原料である。高価なアミノ酸
誘導体を高濃度で反応系に加えており、コストが
高くなる傾向があつた。また、反応後、反応液か
ら合成されたペプチド又はペプチド誘導体を分
離、精製することが煩雑となる場合もあり、改良
が望まれていた。

そこで、本発明者らは上記の点を改良するため
にさらに鋭意研究を重ねた結果、驚くべきことに
アセトニトリルを反応系に加えると、原料のアミ
ノ酸誘導体の濃度を下げても良好な収率でペプチ
ド又はペプチド誘導体の合成が可能になることを
見い出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明はアミノ酸からペプチド又は
ペプチド誘導体を合成するに際し、反応系にアセ
トニトリルを存在させ、かつ縮合剤としてアミノ
アシル−tRNAシンテターゼを用いることを特徴
とするペプチド又はペプチド誘導体の合成法であ
る。

本発明の特徴とするところは酵素法によるペプ
チド合成法において、反応系にアセトニトリルを
存在させ、かつ縮合剤としてアミノアシル−
tRNAシンテターゼを用いることにより、アミノ
基を保護することなく、ペプチド又はペプチド誘
導体を高収率で合成することにある。

本発明に使用されるアミノアシル−tRNAシン
テターゼは、酵素分類6.1.1に属し、次式アミノ酸＋ATP＋tRNA→アミノアシル −tRNA＋AMP＋ピロリン酸の反応を触媒する酵素であり、例えば、ウサギ、
ウマ、ウシ、ラツト、ニワトリ、ヘビなどの動物
組織より得られるもの、イネ、イモ、トマトなど
の植物組織より得られるもの、カビ、酵母、キノ
コ、細菌、放線菌などの微生物及び藻類より得ら
れるものなどがあげられる。なかでも、酵素の取
得が容易であることから、微生物より得られるも
のが好ましく、さらに酵素の安定性からバチル
ス・ステアロサーモフイルス、サーマス、サーモ
フイルス、サーマス・フラバス、クロストリジウ
ム・サーモアセチカム、サーマスマグアテイカス
などの好熱性細菌より得られるアミノアシル−
tRNAシンテターゼが最適である。

これらの各種アミノアシル−tRNAシンテター
ゼは、上記組織又は細胞をホモジナイザーやダイ
ノミル等で破砕したのち、例えばバイオケミスト
リー誌、13巻、2307頁（1974年）に記載されてい
るようにDEAE−セルロースカラムクロマトグラ
フイー、ヒドロキシアパタイトカラムクロマトグ
ラフイーなどのクロマトグラフイー及び硫酸アン
モニウムによる分別沈殿法など通常の酵素精製法
を用いて、精製することによつて得ることができ
る。アミノアシル−tRNAシンテターゼは、種々
のα−アミノ酸に特異性のあるものが用いられ、
例えばチロシンに特異性のあるものとしては、チ
ロシル−tRNAシンテターゼが、またロイシンに
特異性のあるものとしては、ロイシル−tRNAシ
ンテターゼが、さらにバリンに特異性のあるもの
としては、バリル−tRNAシンテターゼ、その他
イソロイシル−tRNAシンテターゼ、フエニルア
ラニル−tRNAシンテターゼ、アラニル−tRNA
シンテターゼ、グルタミル−tRNAシンテター
ゼ、アスパラギニル−tRNAシンテターゼ、メチ
オニル−tRNAシンテターゼ、ヒスチジル−
tRNAシンテターゼ、リジル−tRNAシンテター
ゼ、トレオニル−tRNAシンテターゼ、セリル−
tRNAシンテターゼ、などが具体例としてあげら
れる。

本発明に使用されるアセトニトリルは、酵素の
安定性にもよい結果が得られ、反応液全体に占め
るアセトニトリルの容積の濃度としては、0.5な
いし85％、好ましくは５ないし60％、最適には10
ないし50％の範囲である。さらにアセトニトリル
は、ペプチド化反応時に存在すればよいのであつ
て、その添加時期はいつであつてもかまわない。

以下、アミノ酸からペプチド又はペプチド誘導
体を合成する本発明の方法を具体的に説明する。
本発明によれば、アミノ酸とアミノ酸から誘導さ
れるアミノ酸誘導体とをアミノアシル−tRNAシ
ンテターゼ及びアセトニトリルの存在下で反応さ
せることによつてペプチド又はペプチド誘導体を
合成することができる。さらに本発明によれば、
あらかじめアミノ酸とアミノアシル−tRNAシン
テターゼとを反応させて反応混合物を得、次いで
得られた反応混合物とアミノ酸誘導体及びアセト
ニトリルとを反応させることによつてペプチド又
はペプチド誘導体を合成することができる。この
アミノアシル−tRNAシンテターゼとあらかじめ
反応させるのに好ましく用いられるアミノ酸とし
ては、例えばチロシン、アラニン、ロイシン、イ
ソロイシン、フエニルアラニン、メチオニン、リ
ジン、セリン、バリンなどのα−アミノ酸があげ
られ、Ｌ体、Ｄ体のいずれでもよい。また、上記
反応に好ましく用いられるアミノ酸誘導体として
は、例えば、グリシン、アラニン、ロイシン、イ
ソロイシン、フエニルアラニン、グルタミン酸、
グルタミン、イルロイシン、システイン、チロシ
ン、アルギニン、バリン、リジン、ヒスチジン、
アスパラギン酸、アスパラギン、メチオニン、ト
リプトフアン、トレオニンなどのα−アミノ酸、
β−アラニン、β−アミノイソ酪酸などのβ−ア
ミノ酸、クレアチンなどの含窒素γ−アミノ酸、
ピペリジン酸などのγ−アミノ酸、ε−アミノカ
プロン酸などのε−アミノ酸などの各種アミノ酸
のエステル、チオエステル、アミド、ヒドロキサ
ミドなどがあげられるが、アミノ基が遊離の形で
あるアミノ酸誘導体であれば、上記例示化合物に
限定されるものではない。そのエステルとして
は、例えばメチル、エチル、プロピル、シクロヘ
キシル、フエニル、ベンジルなどの単純な炭化水
素系のエステルから、tRNAの3′−OHで上記ア
ミノ酸がエステル化したものまで、種々のエステ
ルを用いることができる。また、アミドとして
は、遊離のアミドの他、例えば異種あるいは同種
のアミノ酸がアミド結合したオリゴペプチドやポ
リペプチドを用いることもできる。このオリゴペ
プチドやポリペプチドがさらにエステル、チオエ
ステル、ヒドロキサミド、エーテル化したものを
用いることも可能である。また、上記アミノ酸誘
導体は水溶液の状態で用いるか、あるいは固体の
まま用いてもよい。

次に反応混合物を得るには、例えばPH５ないし
PH11好ましくはPH６ないしPH10、最適にはPH７な
いしPH10の緩衝液中、アデノシン三リン酸又はデ
オキシアデノシン三リン酸存在下に、アミノ酸と
アミノアシル−tRNAシンテターゼと混合するこ
とによつて行えばよい。そのときの反応の温度と
しては、酵素活性を維持する観点から一般に０℃
から70℃が好ましく、最適に０℃から30℃で行わ
れる。また、そのときに用いられる緩衝液として
は、アミノ酸、アデノシン三リン酸、デオキシア
デノシン三リン酸及びアミノアシル−tRNAシン
テターゼが溶解し、所望のPHが得られるものであ
れば、いかなるものを使用してもよい。例えば、
トリス塩酸緩衝液、ヘペス緩衝液、トリエタノー
ルアミン緩衝液、マレート緩衝液、リン酸緩衝液
などがあげられる。さらに反応を円滑に進行さ
せ、酵素の失活を防ぐことを主目的として、反応
系にマグネシウム、マンガンなどの二価カチオ
ン、メルカプトエタノール、ジチオスレイトール
などのスルフヒドリル化剤、ピロフオスフアター
ゼを単独又は混合して添加してもよい。各添加剤
の好適な濃度としては、二価カチオン0.01ｍＭ〜
500ｍＭ、スルフヒドリル化剤0.001ｍＭ〜100ｍ
Ｍ、ピロホスフアターゼ0.001ユニツト／ml〜100
ユニツト／mlであり、最適な濃度としては、それ
ぞれ、二価カチオン0.1ｍＭ〜10ｍＭ、スルフヒ
ドリル化剤0.01ｍＭ〜１ｍＭ、ピロホスフアター
ゼ１ユニツト／ml〜10ユニツト／mlである。ま
た、アミノ酸、アミノアシル−tRNAシンテター
ゼ及びアデノシン三リン酸又はデオキシアデノシ
ン三リン酸の使用量は特に制限されないが、実用
的な収量を得るためには、アミノ酸とアミノアシ
ル−tRNAシンテターゼのモル比を１：１〜１：
10、アミノ酸とアデノシン三リン酸又はデオキシ
アデノシン三リン酸とのモル比を１：10〜１：
100の範囲内で行うのが好ましい。前記の条件で
反応を実施すると、反応は円滑に進行し、数秒か
ら30分以内に完結する。

次いで、上記のようにして得られた反応混合物
とアミノ酸誘導体及びアセトニトリルとを混合し
て反応させることにより目的のペプチド又はペプ
チド誘導体を得ることができる。（この段階を以
後ペプチド化を称する。）このときに用いる反応
混合物は、そのままペプチド化反応に用いること
もできるが、Ｇ−25（フアルマシア社製）Ｇ−75
（フアルマシア社製）などのゲルクロマトグラフ
イーを行うことによつて、反応後に混在するアデ
ノシン三リン酸、アデノシン一リン酸あるいはピ
ロリン酸等を除去して用いることもできる。ま
た、ペプチド化反応の温度としては、０℃から70
℃が好ましく、酵素の失活防止と適正な反応速度
を得るという観点から、10℃から50℃、特に20℃
から40℃で行うことが好ましい。PHとしては、既
出の各種緩衝液等を用いて、５ないし11好ましく
は６ないし10、最適には７ないし９で行えばよ
い。

反応混合物とアミノ酸誘導体との混合比として
例えば、容量で１：0.1〜１：100の範囲で行えば
よい。また、この時用いるアミノ酸誘導体の濃度
としては10ｍＭから10Mの範囲であるが、これを
さらに低くして用いることもできる。

上記条件でペプチド化は、数秒から数日で完結
し、目的のペプチド又はペプチド誘導体を得るこ
とができる。

本発明によつて得られるペプチド誘導体は、例
えば血圧降下作用等のあるブラジキニンや内・外
分泌抑制作用等のあるソマトスタチンなどの各種
ホルモン及び抗生物質ペプチド、呈味ペプチドの
ような他の生物学的活性物質として有用である。

本発明によれば、上記有用ペプチド又はペプチ
ド誘導体を保護基を用いることなく、低濃度の原
料を使用しても製造することができるので、製造
コストも安価である。

以下本発明を実施例により具体的に説明する。

実施例１、比較例１、２バチルス・ステアロサーモフイルスよりバイオ
ケミストリー誌、13巻、2307頁（1974年）記載の
方法に従い精製されたチロシンに特異的なチロシ
ル−tRNAシンテターゼ0.5ｇ、塩化マグネシウ
ム0.4ｇ、アデノシン三リン酸二ナトリウム塩0.1
ｇ、Ｌ−チロシン１mg、ピロホスフアターゼ（ベ
ーリンガー・マンハイム社製）200ユニツト及び
ジチオスレイトール0.01mgを140mlの20ｍＭヘペ
ス緩衝液PH8.0に溶解し、４℃で15分間反応させ
て反応混合物を得た。得られた反応混合物にＬ−
フエニルアラニンメチルエステル0.4ｇ及びアセ
トニトリル60ml（30容量％）を加え、反応系をPH
8.0に維持した状態でよく混合し、反応温度を30
℃に保つて１日放置して反応させた。

次いで得られた反応液にアセトン200mlを加え
沈殿を濾別後、上漬をエバポレーターにて約20ml
に濃縮し、ボンダパツクC₁₈カラム（ウオーター
ズ社製）に供し、アセトニトリル／50ｍＭリン酸
カリ水溶液、85／15、PH７を展開溶媒として用い
て分離し、Ｌ−チロシル−Ｌ−フエニルアラニン
メチルエステルを0.4mg得た。

その元素分析（C₁₉H₂₂N₂O₄＝342.39）は、計算値（％）Ｃ＝66.65 Ｈ＝6.48 Ｎ＝8.18 測定値（％）Ｃ＝66.48 Ｈ＝6.52 Ｎ＝8.52 であつた。

また、比較（比較例１）のため、20ｍＭヘペス
緩衝液を200ml、Ｌ−フエニルアラニンメチルエ
ステルを４ｇ使用して、アセトニトリルを共存さ
せなかつたほかは実施例１と全く同様に行つた。

その結果、Ｌ−チロシル−Ｌ−フエニルアラニ
ンメチルエステルの収量は0.4mgであり、実施例
１の収量と同じであつた。この比較例１で用いた
Ｌ−フエニルアラニンメチルエステル４ｇである
のに対し、実施例１ではその1/10の0.4ｇでよか
つた。

さらに比較（比較例２）のため、20ｍＭヘペス
緩衝液を200ml使用して、グリセリンを共存させ
なかつたほかは実施例１と全く同様に行つた。

その結果、Ｌ−チロシル−Ｌ−フエニルアラニ
ンメチルエステルの収量は0.1mgであり、実施例
１の収量の1/4であつた。

実施例２、比較例３、４実施例１で用いたチロシル−tRNAシンテター
ゼ５ｇ、塩化マグネシウム50mg、アデノシン三リ
ン酸二ナトリウム塩300mg、Ｌ−チロシン９mg、
ピロホスフアターゼ（ベーリンガーマンハイム社
製）200ユニツト及びジチオスレイトール0.01mg
を20mlの10ｍＭヘペス緩衝液PH8.5に溶解し、４
℃で20分間反応させたのち、反応混合物をＧ−75
（フアルマシア社製）カラムに供し、同上ヘペス
緩衝液にて溶出し、ボイド容の画分30mlを集め反
応混合物を単離した。単離した反応混合物にＤ−
ロイシンエチルエステル0.5ｇ及びアセトニトリ
ル５ml（14容量％）を加え、反応系をPH8.5に維
持した状態でよく混合し、反応温度を20℃に保つ
て30分間反応させた。

次いで得られた反応液をそのままボンダパツク
C₁₈カラムに供し、実施例１と同様に分離して、
Ｌ−チロシル−Ｄ−ロイシンエチルエステル15mg
を得た。

その元素分析（C₁₇H₂₃N₂O₄＝322.39）は計算値（％）Ｃ＝63.33 Ｈ＝8.13 Ｎ＝8.69 測定値（％）Ｃ＝63.30 Ｈ＝8.08 Ｎ＝8.75 であつた。

次に比較（比較例３）のため、Ｄ−ロイシンエ
チルエステルを４ｇ使用して、アセトニトリルを
共存させなかつたほかは実施例２と全く同様に行
つた。

その結果、Ｌ−チロシル−Ｄ−ロイシンエチル
エステルの収量は16mgであつた。

また、比較（比較例４）のため、アセトニトリ
ルを共存させなかつたほかは、実施例２と全く同
様に行つた。

その結果、Ｌ−チロシル−Ｄ−ロイシンエチル
エステルの収量は５mgであつた。

実施例３、４、比較例５パン酵母よりジヤーナル・オブ・バイオケミス
トリー誌、63巻、434頁（1968年）記載の方法に
従つて調製したチロシル−tRNAシンテターゼ20
mg、塩化マグネシウム60mg、アデノシン三リン酸
二ナトリウム塩５mg、Ｄ−チロシン0.1mg、ピロ
ホスフアターゼ（ベーリンガーマンハイム社製）
10ユニツト及びメルカプトエタノール20μを20
mlの30ｍM2，５−ジメチルイミダゾール緩衝液
PH９に加えて、実施例２と同様に反応したのち、
実施例２と同様に反応混合物を単離し、これにＬ
−ロイシンエチルエステル0.1ｇ及びアセトニト
リル10ml（25容量％）加え、反応系をPH9.0に維
持した状態で20℃で５時間反応させた。得られた
反応物にアセトン20mlを加え生じた沈殿を濾別
し、エバポレーターにて約10mlに濃縮後、実施例
１と同様分離し、Ｄ−チロシル−Ｌ−ロイシンエ
チルエステルを得た（実施例３）。

次にアセトニトリル10mlの代わりにジメチルス
ルホキシド10mlを加えて上記と同様にして行つた
（実施例４）。

さらに、比較（比較例５）のため、アセトニト
リル10mlを共存させなかつたほかは実施例３と全
く同様に行つた。

その結果、Ｄ−チロシル−Ｌ−ロイシンエチル
エステルの収量は以下に示すとおりであつた。

収量（mg）実施例３ 0.16 実施例４ 0.15 比較例５ 0.08

Claims

【特許請求の範囲】

１アミノ酸からペプチド又はペプチド誘導体を
合成するに際し、反応系にアセトニトリルを存在
させ、かつ縮合剤としてアミノアシル−tRNAシ
ンテターゼを用いることを特徴とするペプチド又
はペプチド誘導体の合成法。