JPH0532027B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、α−アミノ酸アミドの製造方法に関
するものである。 生理活性ペプチドの中には、例えば、カルシト
ニンやガストリンのようにカルボキシル末端のα
−アミノ酸がアミドとなつているペプチドが多く
認められる。α−アミノ酸アミドはこのような生
理活性ぺプチドの製造の際に重要な原料である。 α−アミノ酸からα−アミノ酸のアミドを合成
する反応は、多数知られている。例えば、(1)α−
アミノ酸のα−アミノ基及び必要なら側鎖の官能
基を保護基で保護した上で、保護基を含有するα
−アミノ酸誘導体を酸無水物、酸ハロゲン化物あ
るいは酸アジド等の形で活性化し、続いてこの活
性化合物をアミノと反応させ、保護基含有α−ア
ミノ酸アミドに変換し、さらに最終的に保護基を
除く方法、(2)(1)と同様に保護基を含有するα−ア
ミノ酸とアミンとを脱水剤存在下で縮合させてα
−アミノ酸アミドに変換し、最後に脱保護する方
法、あるいは(3)α−アミノ酸を、まずα−アミノ
酸エステルに変換した後、アミンと反応させてα
−アミノ酸アミドに変換する方法などが代表的な
ものである。 これらの反応は、いずれもα−アミノ酸から多
段階の工程を経てα−アミノ酸アミドを合成する
ものである。また、(1)、(2)においては高価な保護
基が必要となるうえ、有機溶媒が通常、必要とな
り、α−アミノ酸アミドを製造する上で複雑な多
工程の設備が必要となる。 一方、安価なα−アミノ酸の混合物を原料に用
いて特定のα−アミノ酸からのみのα−アミノ酸
アミドを合成することは、非常に難しい。従つ
て、α−アミノ酸混合物中から、特定のα−アミ
ノ酸のみのα−アミノ酸アミドを製造するために
は、α−アミノ酸混合物から特定のαアミノ酸を
精製した後、アミド化反応を行うか、あるいは、
α−アミノ酸アミドの混合物中から、特定のα−
アミノ酸アミドを分離精製することが必要であ
る。α−アミノ酸混合物中からの特定のαアミノ
酸を分離するには、各種のα−アミノ酸の物性
が、非常に似かよつていることから、クロマトグ
ラフイー等で分離する場合でも容易ではない。同
様に各種のα−アミノ酸アミドの混合物中から特
定のα−アミノ酸アミドのみを分離精製すること
も、一般に容易ではない。 本発明者らは、これらのα−アミノ酸アミド製
造上の問題点すなわち、保護基が必要であるこ
と、反応が多段階で複雑であること等を解決し、
α−アミノ酸から単一の反応のみで進行し、保護
基の必要がない経済的なα−アミノ酸アミドと製
造方法につき鋭意検討を重ねた結果、α−アミノ
酸を核酸の一種である転移リボ核酸（以後tRNA
と略記。）に結合させてアミノアシル−tRNAを
合成する作用を有する酵素であるアミノアシル−
tRNAシンテターゼを触媒として使用すると、α
−アミノ酸が単一の反応のみで容易にα−アミノ
酸アミドに変換されることを見い出し、しかも安
価な原料であるα−アミノ酸の混合物から目的と
するα−アミノ酸アミドを製造できることを見い
出し、本発明を完成した。 すなわち、本発明は、α−アミノ酸とアンモニ
ア、脂肪族アミン又は芳香族アミンから選択され
るアミンとからα−アミノ酸アミドを製造するに
際し、触媒としてアミノアシル−tRNAシンテタ
ーゼを用いることを特徴とするα−アミノ酸アミ
ドの製造方法である。 本発明の特徴とするところは、触媒としてアミ
ノアシル−tRNAシンテターゼを用いることによ
り、α−アミノ酸を何ら保護することなく、単一
の反応のみでアミド化反応を起せしめてα−アミ
ノ酸アミドを製造することにあり、また、α−ア
ミノ酸は必ずしも純粋なものである必要がなく、
安価な二種以上のα−アミノ酸の混合物であつて
も適当なアミノアシル−tRNAシンテターゼを選
択することにより、目的とする特定のα−アミノ
酸をα−アミノ酸アミドに変換させることにあ
る。 本発明に使用されるアミノアシル−tRNAシン
テターゼは、酵素分類6.1.1に属し、次式 アミノ酸＋ATP＋tRNA→アミノアシル−tRNA ＋AMP＋ピロリン酸 の反応を触媒する酵素であり、例えば、ウサギ、
ウマ、ウシ、ラツト、ニワトリ、ヘビなどの動物
組織より得られるもの、イネ、イモ、トマトなど
の植物組織より得られるもの、カび酵母、キノ
コ、殺菌、放射菌などの微生物及び藻類より得ら
れるものなどがあげられる。なかでも、酵素の取
得が容易であることから、微生物より得られるも
のが好ましく、さらに酵素の安定性からバチル
ス・ステアロサーモフイルス、サーマス・サーモ
フイルス、サーマス・フラバス、クロストリジウ
ム・サーモアセチカム、サーマス・アクアテイカ
スなどの耐熱性殺菌より得られるアミノアシル−
tRNAシンテターゼが最適である。 これらのアミノアシル−tRNAシンテターゼの
特徴は、基質であるα−アミノ酸に対しての特異
性が非常に高いことである。たとえば、チロシル
−tRNAシンテターゼは、各種のα−アミノ酸の
なかでも、特にチロシンに対して特異的であり、
実質上チロシンのみを基質として受け入れること
ができる。したがつて、アミノアシル−tRNAシ
ンテターゼとしては、上記チロシル−tRNAシン
テターゼ以外に、またロイシンに特異性のあるも
のとして、ロイシル−tRNAシンテターゼが、さ
らにバリンに特異性のあるものとして、バリルー
tRNAシンテターゼ、その他イソロシル−tRNA
シンテターゼ、フエニルアラニル−tRNAシンテ
ターゼ、アラニル−tRNAシンテターゼ、グルタ
ミル−tRNAシンテターゼ、アスパラギニル−
tRNAシンテターゼ、メチオニル−tRNAシンテ
ターゼ、ヒスチジル−tRNAシンテターゼ、リジ
ル−tRNAシンテターゼ、トレオニル−tRNAシ
ンテターゼ、セリル−tRNAシンテターゼ、アス
パラチル−tRNAシテターゼ、グルタミル−
tRNAシンテターゼ、システイニル−tRNAシン
テターゼ、プロリル−tRNAシンテターゼ、グリ
シル−tRNAシンテターゼ、アルギニル−tRNA
シンテターゼ、トリプトフエニル−tRNAシンテ
ターゼなどが具体例としてあげられる。 これらの各種アミノアシル−tRNAシンテター
ゼは、上記組織又は細胞をホモジナイザーやダイ
ノミル等で破砕したのち、例えばバイオケミスト
リー誌、13巻、207頁（1974年）に記載されてい
るようにDEAE−セルロ−スカラムクロマトグラ
フイー、ヒドロキシアパタイトカラムクロマトグ
ラフイーなどのクロマトグラフイー及び硫酸アン
モニウムによる分別沈澱法など通常の酵素精製法
を用いて精製することによつて得ることができ
る。 本発明で好まいく用いられるα−アミノ酸とし
ては、例えばチロシン、アラニン、ロイシン、イ
ソロイシン、フエニルアラニン、メチオニン、リ
ジン、セリン、バリン、アスパラギン、アスパラ
ギン酸、グリシン、グルタミン、グルタミン酸、
システイン、アルギニン、シスチン、ヒスチジ
ン、プロリン、トレオニン、トリプトフアンなど
があげられる。 これらα−アミノ酸は必ずしも純粋なものであ
る必要はなく、２種以上の混合物であつてもよ
い。その場合、これらのα−アミノ酸の合計が、
原料の乾燥重量のうち、少なくとも５重量％、好
まくは30重量％占めるものが好ましい。このα−
アミノ酸の混合物中に、脂質、炭水化物、核酸等
の生体由来物質、無機イオン等が混入あるいは混
合されていてもよい。 このα−アミノ酸の混合物の例としては、大豆
かす、綿実かす、ごまかす、落花生かす等と植物
性たんぱく質を加水分解したα−アミノ酸の混合
物、魚かす（アンチヨビー）、人毛、羽毛、生糸
くず等の動物性たんぱく質を加水分解したα−ア
ミノ酸の混合物、酵母エキスやSCP（シングルセ
ルプロテイン）等の微生物由来のたんぱ質を加水
分解したもの等を自然に存在するたんぱく質を加
水分解して得たα−アミノ酸の混合物があげられ
る。また、これらのアミノ酸混合物を荒く精製し
た混合物でもよい。さらに、通常、例えば食品加
工業等から排出される。たんぱく質あるいはアミ
ノ酸を含有する排液なども中和、濃縮、濾過等の
簡単な前処理を行えば、原料として使用すること
が可能である。 このように、天然に存在するたんぱく質から由
来するα−アミノ酸の混合物以外にも、任意の組
成の化学合成されたα−アミノ酸の混合物も原料
として使用することが可能である。 本発明に使用されるアミンは、アンモニア、脂
肪族アミン又は芳香族アミンから選択されるもの
である。 本発明では、α−アミノ酸とアミンとから、、
触媒としてアミノアシル−tRNAシンテターゼを
用いてα−アミノ酸アミドを製造するが、そのと
きにアデノシン三リン酸の存在下で行うことが望
まれる。このアデノシン三リン酸は、反応を進め
るうえでのエネルギー源となる化合物であり、そ
のような化合物であれば、他の類緑体の化合物に
置き換えてもよい。このような化合物としては、
例えば3′−デオキシアデノシン三リン酸、アデノ
シン三リン酸のβ又はγ−チオ類緑体、あるいは
アデニン環に置換基の入つたアデノシン三リン酸
などがあげられる。 本発明において、α−アミノ酸、アミン、アミ
ノアシル−tRNAシンテターゼ及びアデノシン三
リン酸の添加順序はいずれを先に添加してもよい
が、酵素の失活を考えて、アミノアシル−tRNA
シンテターゼを最後に加えるのが望ましい。 このときに、反応に用いる媒体としては、本法
が酵素を触媒とする反応であるため、主成分とし
て水を含有する溶媒が選ばれる。また、酵素の活
性が維持できる限度で、水溶性の有機溶媒を添加
してもよい。水溶性の有機溶媒としては、例え
ば、メタノール、エタノール、アセトニトリル、
ジオキサン、テトラハイドロフラン、Ｎ，Ｎ−ジ
メチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドン、ジ
メチルスルホキシドなどがあげられる。このよう
な有機溶媒の添加は、原料のアミンが水に難溶性
である場合、特に有効である。このときに、反応
を円滑に進行させること、あるいは酵素の失活を
防ぐことを主目的として、反応系にマグネシウ
ム、マンガンなどの二価カチオン、メルカプトエ
タノール、ジチオスレイトールなどのスルフヒド
リル剤、ピロフアフアターゼを単独又は混合して
添加してもよい。各添加剤の好適な濃度として
は、二価カチオン、0.01ｍＭ〜500ｍＭ、スルフ
ヒドリル化剤0.001ｍＭ〜100ｍＭ、ピロホスフア
ターゼ0.001ユニツト／ml〜100ユニツト／mlであ
り、最適な濃度としては、それぞれ二価カチオン
0.1ｍＭ〜10ｍＭ、スルフヒドリル化剤0.01ｍＭ
〜１ｍＭ、ピロホスフアターゼ１ユニツト／ml〜
10ユニツト／mlである。また、酵素の活性を維持
するため、溶媒に緩衝液を添加することが好まし
い。その緩衝液のの濃度としては、100ｍＭ以下
が好ましい。その緩衝液としては、α−アミノ
酸、アミン、アミノアシル−tRNAシンテターゼ
及びアデノシン三リン酸が溶解し、しかも酵素活
性を維持し、所望のPHが得られ、かつ、副反応を
起こさないものであれば、いかなるものを使用し
てもよい。そのような具体例として、例えば、ヘ
ペス緩衝液、トリエタノールアミン緩衝液、マレ
ート緩衝液、リン酸緩衝液、ビシン緩衝液、エツ
ペス緩衝液などがあげられる。 次に反応条件について述べると、アミノアシル
−tRNAシンテターゼは、通常、反応の至適PHを
７〜９付近にもつため、反応液のPHを、上記緩衝
液で５ないし11に、好ましくは６〜10に制御する
ことが好ましい。また、反応の温度としては、ア
ミノアシル−tRNAシンテターゼの触媒活性が維
持できる限り、特に限定されないが、通常０〜70
℃が好ましく、最適には、10〜40℃で行うことが
好ましい。さらに原料の濃度としては、特に限定
されるものではないが、実用的な収量を得るため
には、目的のα−アミノ酸の濃度が0.1ｍＭ以上、
好ましくは１ｍＭ以上とし、アデノシン三リン酸
を、目的とするα−アミノ酸に対し、１〜10倍、
好ましくは１〜５倍相当量を使用し、アミノアシ
ル−tRNAシンテターゼを、目的とするアミノ酸
に対し、1/1〜1/100000相当量、好ましくは1/100
〜1/100000相当量の濃度で、実施することが好ま
しい。また、アミンの濃度は、通常、10ｍＭから
10Mの範囲が好ましい。本発明によれば、α−ア
ミノ酸のアミノ基を保護することなく、常温、常
圧の極めて穏和な条件下でα−アミノ酸のアミド
を合成することが可能である。また、安価な原料
であるα−アミノ酸の混合物から特定のα−アミ
ノ酸のみを、選択的にアミド化することが可能で
ある。 以下、本発明を実施例により具体的に説明す
る。なお、実施例中で、酵素の濃度は、ユニツト
単位で表示しており、このユニツトは、以下のよ
うに定義する。 (1) アミノアシル−tRNAシンテターゼ；１ユニ
ツトは、10分間に30℃で1μmoleのα−アミノ
酸を、アミノアシル−tRNAに変換する能力。 (2) ピロホスフアターゼ；１ユニツトは、ピロリ
ン酸から、1.0μmoleの無機りん酸を、１分間
に25℃で、PH7.2で生成させることができる能
力。 参考例 １ バチルス・ステアロサーモフイルスUK788（微
光研菌寄第5141号）の菌体６Kgを２倍量の100ｍ
Ｍトリス・塩酸緩衝液（PH7.5）に懸濁し、ダイ
ノミルを用いて細胞を破砕後、遠心分離により不
溶物を除去し、ヒスチジンに特異的なヒスチジル
−tRNAシンテターゼを含む粗抽出液を得た。あ
らかじめ５ｍＭメルカプトエタノール、２ｍＭエ
チレンジアミン四酢酸ナトリウム及び0.1ｍＭホ
スホフエニルスルホニルフルオリドを含む50ｍＭ
トリス緩衝液（PH7.5）で平衝化したマートレツ
クスゲルレツドＡ（アミコン社製）を充填したカ
ラムに、上記の粗抽出液をとおし、塩化カリウム
を上記緩衝液に加えた溶液で、線速度60cm・h^-1
で溶出せしめると、ヒスチジル−tRNAシンテタ
ーゼが溶出した。この区分を集め、濃縮、脱塩を
行つた結果、約52％の収率でヒスチジンに特異的
なヒスチジル−tRNAシンテターゼを含む粗酵素
液を得た。上記操作をすべて４℃で行つた。 参考例 ２ バチルス・ステアロサーモフイルスUK788 ５
Kgよりバイオケミストリー誌13巻、2307頁（1974
年）記載の方法に従い、チロシンに特異的な作用
するチロシル−tRNAシンテターゼを精製した。 精製酵素の収率は67％で、総ユニツトは700000
ユニツトであつた。 実施例 １ アデノシン三リン酸・二ナトリウム塩３mg、Ｌ
−ヒスチジン1.6mg、塩化マグネシウム六水和物
10mg、及びジエチルアミン塩酸塩33mgを含む50ｍ
Ｍ−ビシン緩衝液溶液800μlを調整し、PHを水酸
化ナトリウムで8.0とした。これに参考例１で得
られた濃度が10万unit／mlまで濃縮されたヒスチ
ジル−tRNAシンテターゼ200μlを加え、十分撹
拌後、30℃で２日放置して反応を完結させて反応
混合物を得た。 この反応混合物に、0.1N−水酸化ナトリウム
10mlを加え、酢酸エチル20mlで３回抽出した。酢
酸エチル層は、混合して蒸溜水で２回洗浄後無水
硫酸ナトリウムで乾燥させ、しかる後溶媒を減圧
下で蒸発させて除去した。蒸発残渣を、0.5mlの
水と0.5mlのアセトニトリルの混合物に溶解後、
ボンダパツクC₁₈カラム（ウオーターズ社製）を
担体とし、アセトニトリル／50ｍＭ−リン酸カリ
ウム水溶液を展開溶媒として、高速液体クロマト
グラフイーで生成物を分離した。 この生成物は、Ｌ−ヒスチジンジエチルアミド
であり、収量は1.8mgであつた。 この化合物の元素分析（C₁₀H₁₈N₄O＝210.28）
の結果は、次のとおりであつた。 計算値（％） Ｃ＝57.12、Ｈ＝8.63、Ｎ＝26.64 実測値（％） Ｃ＝57.10、Ｈ＝8.59、Ｎ＝26.70 実施例 ２ α−アミノ酸として、Ｌ−ヒスチジン1.6mg、
Ｌ−セリン1.0mgの混合物を使用すること以外は、
実施例１と全く同様にしてＬ−ヒスチジンジエチ
ルアミド1.6mgを得た。 このときに、Ｌ−セリンジエチルアミドの生成
は検出されなかつた。 比較例 １ Ｎ−α−tert−ブトキシカルボニル−im−トシ
ル−Ｌ−ヒスチジン41mgをジメチルホルムアミド
５mlに溶解し、13mgの１−ヒドロキシベンゾトリ
アゾールと８mgのジエチルアミンを加え、−10℃
に冷却した後、20mgの１−エチル−３−（3′−ジ
メチルアミノプロピル）カルボジイミドを滴下し
た。滴下終了後、室温にもどしながら、さらに12
時間撹拌した。反応物に酢酸エチル30mlを加えた
後、IN塩酸水溶液、水、５％NaHCO₃水溶液、
水で順序洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥さ
せた。溶媒を減圧留去し、酢酸エチル−ｎ−ヘキ
サンから結晶を得た。−10℃に冷却した後、トリ
フルオロ酢酸0.5mlを加え、10分間撹拌した。室
温にもどしながら、さらに30分間撹拌した後、溶
媒を減圧留去し、残留物を、エーテルで洗浄した
後、真空乾燥した。0.5mlの水と0.5mlのアセトニ
トリルの混合液に溶解し、ボンダパツクC18カラ
ム（ウオーターズ社製）を担体としアセトニトリ
ル／50ｍＭリン酸カリウム水溶液を展開溶媒とし
て高速液体クロマトグラフイーで精製した。この
生成物は、Ｌ−ヒスチジル−ジエチルアミドであ
り、収量は７mgであつた。原料のヒスチジンを基
として収率は48％であつた。 実施例１、２及び比較例１により、従来の有機
合成法（比較例１）によるＬ−ヒスチジル−ジエ
チルアミドの収率は、原料のヒスチジンを基とし
て48％であつたのに対し、本発明の製造方法（実
施例１、２）によるＬ−ヒスチジル−ジエチルア
ミドの収率は、原料のヒスチジンを基として約90
％以上であつた。 このことは、本発明の製造方法が従来の有機合
成法よりも優れていることを示す。 実施例 ３ アデノシン三リン酸・二ナトリウム塩30mg、Ｌ
−チロシン3.6mg、グリシン1.5mg、Ｌ−バリン2.3
mg、塩化マグネシウム六水和物102mg及びジチオ
スレイトール８mgを、２ｍＭのヘペス緩衝液に溶
解し、水酸化ナトリウムでPHを8.5に調整し、さ
らに20ｍＭのビシン緩衝液を加えて、溶液量を
7.5mlとし、50℃程度に加熱して均一な溶液を得
た。 この溶液を、室温に戻した後、ピロホスフアタ
ーゼ（ベーリンガー・マンハイム社製、20unit／
ml）を、20ｍＭのヘペス緩衝液で透析して得た溶
液0.5ml）0.5ml、塩酸でPHを8.5に調整した5M−
エチルアミン水溶液１ml及び参考例２で得られた
20万unit／mlのチロシル−tRNAシンテターゼで
溶液１mlを混合し、総計10mlとした。この溶液を
30℃の恒温槽中で一日放置して反応を完結させて
反応液を得た。 次いで得られた反応液にアセトン200mlを加え、
沈澱を濾別後、上漬をエバポレーターにて、溶媒
を蒸発乾固した。得られた固体を水に再溶解後、
ポンダパツクC₁₈カラム（ウオーターズ社製）に
供し、アセトニトリル／50ｍＭリン酸カリ水溶液
（５／95）PH6.5を展開溶媒として用いて分離し、
Ｌ−チロシンエチルアミド（MW＝211、２）1.0
mgを得た。 この収率は、チロシンを基として約50％であつ
た。また、グリシン及びバリンのエチルアミドは
認められなかつた。 この化合物の元素分析（C₁₁H₁₆N₂O₂＝208.26）
の結果は、次のとおりであつた。 計算値（％） Ｃ＝63.44、Ｈ＝7.74、Ｎ＝13.45 実測値（％） Ｃ＝63.42、Ｈ＝7.83、Ｎ＝13.41 実施例 ４〜７ 実施例３と同様の条件下でアミノンとして、ｎ
−プロピルアミン、ジメチルアミン、アニリン、
ベンジルアミンの四種のアミンを用い、反応を行
つた。 反応混合液を、そのままゾルバツクスODS（デ
ユボン社製）を担体とし、溶出液としてアセトニ
トリル／50ｍＭ−リン酸カリウム水溶液を使用
し、アセトニトリル濃度を０〜50％にグラデイエ
ントをかけながら、高速液体クロマトグラフイー
で分析した。 それぞれＬ−チロシン−ｎ−プロピルアミド、
Ｌ−チロシンジメチルアミド、Ｌ−チロシンアニ
リド、Ｌ−チロシンベンジルアミドの生成が認め
られた。 グリシン及びＬ−バリンからのアミドは、いず
れの場合も実質上高速液体クロマトグラフイーで
は検出されなかつた。 出発原料中のＬ−チロシン量を基準に収率を計
算する表１の結果となつた。

【表】 実施例 ８ アデノシン三リン酸・二ナトリウム塩５mg、Ｌ
−ピスチジン３mg、塩化マグネシウム六水和物17
mg、及び硫酸アンモニウム55mgを含む30ｍＭ−ビ
シン緩衝液１mlを調整し、PHを水酸化ナトリウム
で、8.0とした。これに参考例１で得られた濃度
が12万unit／mlまで濃縮されたヒスチジル−
tRNAシンテターゼ250μlを加え、十分撹拌後、
30℃で10時間放置して反応を完結させて反応混合
物を得た。 この反応混合物に、0.1N−水酸化ナトリウム
10mlを加え、酢酸エチル20mlで３回抽出した。酢
酸エチル層は、混合して蒸留水で２回洗浄後無水
硫酸ナトリウムで乾燥させ、しかる後溶媒を減圧
下で蒸発させて除去した。蒸発残渣を、0.5mlの
水と0.5mlのアセトニトリルの混合物に溶解後、
ボンダバツクC₁₈カラム（ウオーターズ社製）を
担体とし、アセトニトリル／50ｍＭ−リン酸カリ
ウム水溶液を展開溶媒として、高速液体クロマト
グラフイーで生成物を分解した。 この生成物は、Ｌ−ヒスチジルアミドであり、
収量は2.0mgであつた。 この化合物の、元素分析（C₆H₁₀N₄O＝
154.087）の結果は、次のとおりであつた。 計算値（％） Ｃ＝46.73、Ｈ＝6.54、Ｎ＝36.35、
Ｏ＝10.38 実測値（％） Ｃ＝46.74、Ｈ＝6.60、Ｎ＝36.32、
Ｏ＝10.34

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ α−アミノ酸とアンモニア、脂肪族アミン又
   は芳香族アミンから選択されるアミンとからα−
   アミノ酸アミドを製造するに際し、触媒としてア
   ミノアシル−tRNAシンテターゼを用いることを
   特徴とするα−アミノ酸アミドの製造方法。