JPH0453849B2 - - Google Patents

Description

請求の範囲 １ ミテイルス種又はペクチンイダ種のイ貝の体
液から単離され、カルシウムイオンの存在下で少
なくとも１種のシアル酸と生体特異的に結合しう
ることを特徴とするポリペプチドフラクシヨンを
有効成分として含有する抗菌剤。

２ 細菌が創傷、粘膜及び骨表面を冒すのを防げ
または抑制するために生体空洞の局所治療用、及
び腸感染の予防及び治療用の請求の範囲第１項に
記載の抗菌剤。

３ 担体または稀釈剤と組み合わせて少なくとも
一つのポリペプチドフラクシヨンを含有している
ことを特徴とする請求の範囲第１項に記載の抗菌
剤。

４ 青イ貝（Mytilus edulis）の体液から単離さ
れ、カルシウムイオンの存在下で少なくとも１種
のシアル酸と生体特異的に結合しうることを特徴
とするポリペプチドフラクシヨンを有効成分とし
て含有する抗菌剤。

５ 細菌が創傷、粘膜及び骨表面を冒すのを防げ
または抑制するために生体空洞の局所治療用、及
び腸感染の予防及び治療用の請求の範囲第４項に
記載の抗菌剤。

６ 担体または稀釈剤と組み合わせて少なくとも
一つのポリペプチドフラクシヨンを含有している
ことを特徴とする請求の範囲第４項に記載の抗菌
剤。

７ ミテイルス種またはペクチンイダ種のイ貝の
体液を集め、それから形成された抽出物から、少
なくとも１種のシアル酸と生体特異的に結合しう
る少なくとも一つのポリペプチドフラクシヨンを
単離し、該ポリペプチドフラクシヨンを有効成分
として含有する抗菌剤を製造することを特徴とす
る抗菌剤の製造方法。

明細書 本発明は、イ貝から単離できる特殊のポリペプ
チドフラクシヨンの医薬品としての用途に関する
ものである。本発明は、さらに、このようなポリ
ペプチド フラクシヨンを含有する薬剤に関する
ものである。さらに詳細には、本発明は細菌の生
育を阻止する薬剤、特に細菌感染に対する予防及
び治療用の抗菌性薬剤として、また抗ビールス性
もしくは免疫化薬剤として、特にワクチンとし
て、例えばインフルエンザワクチンなどのような
ミコ（myxo）ビールス感染に対するワクチンと
しての件のポリペプチド フラクシヨンの用途に
関するものである。

流行性インフルエンザは大きな問題であり、公
知の方法、とりわけ鶏卵中での培養を含む方法に
よつて製造されたワクチンの接種により解決する
ことが試みられてきた。しかしながら、これは、
製造されたワクチンが用いられる特定のタイプの
ビールスに対してのみ活性であるため、大きな困
難性を内蔵している。したがつて、それぞれ特定
のタイプのビールス用の特定のワクチンを製造す
る必要がある。これは、インフルエンザビールス
（及び他のビールス）が、件のワクチンにより作
用を受けずに残る新しいタイプに容易に変異する
ため、実際上最も不満足である。さらに、生ビー
ルスから出発するインフルエンザワクチンの製造
は複雑であり、また製造されたワクチンは、望ま
しくない副作用を生じ、さらに得られる免疫化作
用を減少しうる望ましくない汚染物を含有してい
る。これらの問題は、インフルエンザビールス、
血球凝集素及びニユーラミニダーゼ
（neuraminidase）から免疫性成分を単離するた
めに開発された方法において、部分的には解決さ
れている（例えば米国特許明細書第4064232号参
照）。従来のインフルエンザワクチンの部分的な
欠点はこの方法によつて除去されるけれども、ワ
クチンの効力は特定のタイプのビールスに制限さ
れるという問題は依然として残つている。さら
に、製造方法は複雑であり、また同様にこの場合
においては生ビールスを用いて作業する必要があ
る。

細菌感染はしばしば起きており、また解決困難
な問題を生じている。例えば、各種細菌菌種の創
傷感染は、各種のタイプの外科（“病院疾患”）に
おいて最も心配な合併症を形成する。この問題
は、深い空洞及び創傷において最も大きく、抗生
物質での従来の治療を行なうことが極めて困難と
なる。さらに、多くの細菌菌種は突然変異により
抗生物質に対する抵抗を増大する。多くの抗生物
質に対してもその効力は同様に狭い範囲の細菌に
制限される。これまで、これらの問題及び類似の
問題に対する満足な解決は全く見い出されていな
い。同じことが原生動物により生ずる感染に対し
ても当てはまる。

したがつて、各種タイプのビールスに対して効
果的な免疫防禦を提供し、さらに技術的にも経済
的にも可能な方法を用いて充分な量で製造できる
薬剤の必要性は大きい。また、広範囲の病原細菌
の攻撃に対して活性な細菌の生育を阻止する薬剤
の必要性も大きい。本発明は、とりわけこれらの
問題を解決することを目的とする。

本発明により提案される解決は、これらの問題
に全く新しい手法で対応しようとするものであ
る。例えばアンチビールス分野における公知の技
術と対照的に、ビールスは全く使用されず、生き
も殺されもしない。その代りに、本発明は、イ貝
の体液中に、特にミテイウス種（Mytius
species）又はペクチンイダ種中に比較的多量に
存在する或るポリペプチド フラクシヨンを使用
するものである。これらのポリペプチド フラク
シヨンは、カラムクロマトグラフ分離法などそれ
自体公知の比較的簡単な分離方法によつて単離で
きる。

本発明に従つて用いられるポリペプチド フラ
クシヨンは、カルシウムイオンの存在下で生体特
異的にシアル酸（sialic acides）と結合するその
能力により特徴付けられる。これは、件のポリペ
プチド フラクシヨンは、生体特異的にシアル酸
の群から少なくとも１つのアミノ糖と親和結合さ
れうるものでなければならないことを意味する。
“シアル酸”という用語は、ここではその一般に
受け入れられている意味において、すなわちニユ
ーラミン酸のＮ−及び／またはＯ−置換アシル誘
導体（例えば、アセチル及び／またはグリコシル
誘導体）として用いられる（例えば、サイ−サン
グ（Sai−SunNg）及びジヨエル、エイ、ダイン
（Joel A.Dain）、ザ・ナチユラル・オカレンス・
オブ・ザイアリツク・アシツズ（1974）、及び
ザ・マーク・インデツクス、第９版、1976参照）。
ポリペプチド フラクシヨンの実際の化学構造は
知られていない。したがつて、本明細書中におけ
る“ポリペプチド フラクシヨン”という用語
は、厳密な意味におけるポリペプチドまたはタン
パクに限定されるものではなく、本発明はまた、
その大部分がポリペプチド配列からなり、生体特
異的に唾液酸と親和結合しうるイ貝又は青イ貝か
ら単離されたあらゆるフラクシヨンを含むもので
ある。本発明に従つて用いられるポリペプチド
フラクシヨンは、したがつて、例えば糖蛋白体を
含みうる。本発明はまた、カルシウムイオンの存
在下でシアル酸を生体特異的に結合しうる上記ポ
リペプチド フラクシヨンの破片もしくはサブユ
ニツトのようなものの用途をも含み、ここでサブ
ユニツトは、好ましくは、特に抗菌性薬剤として
用いられるときはカルシウムイオンの存在下で投
与される。

本発明に従つて用いられるポリペプチド フラ
クシヨンの粗生成物は、以前に不活性汚染物と共
に例えば青イ貝（Mytilus edulis）のヘモリンパ
（体液）から単離されており、そのシアル酸との
結合能力は述べられている（例えば、ハーデイ
（Hardy）ら、CA85（1976）、90466頁参照）。しか
しながら、このポリペプチド フラクシヨンは、
公知の粗形態においても、またいかなる（これま
で述べられていない）精製形態においても、いか
なる実用上の用途、例えば医薬品として使用も提
案もされていない。

本発明によれば、思いがけなく、上記ポリペプ
チド フラクシヨンでの免疫化は、粘液ビールス
など多くの各種タイプのビールス、特に各種タイ
プのインフルエンザビールスからの攻撃に対する
抵抗（免疫防禦）を増すことが見い出された。し
たがつて、件のポリペプチド フラクシヨンはと
りわけ、同一の生成物が実際上全て（正に全て）
のタイプのインフルエンザビールスに対し、及び
同様に他のタイプのビールスに対し保護する実際
上理想的なインフルエンザ“ワクチン”としての
用途が見い出された。

本発明によれば、さらに思いがけなく、上記ポ
リペプチド フラクシヨンは生体表面（生体空
洞、骨表面等を含む）の治療用の有効な細菌の生
育を阻止する薬剤を形成し、該薬剤は大多数の各
種病原細菌及び他の微生物からの攻撃に対し活性
であるということが見い出された。

上記ポリペプチド フラクシヨンによる免疫化
において、なぜ広範囲のビールス感染に対し有効
な保護が得られるのかという理由は、完全には明
らかにされていない。したがつて、観察された効
果の機構を理論的に説明しようとする以下の試み
は、本発明を限定するものとみなすべきではな
い。機構の説明は特にインフルエンザビールスに
関するものであるが、同様に類似の方法において
他のタイプのビールスにも適用可能である。

インフルエンザビールスは、とりわけシアル酸
と生体特異的に結合しうる能力により特徴付けら
れる。この特性はまた、生体の侵入に際し増殖す
るビールス粒子の能力にとつても重要である。シ
アル酸とこのようになされる際に、特定のビール
スはそれらの膜中にシアル酸を有する各種タイプ
の生体細胞とカツプリングされ、ビールスの血球
凝集粗部分はシアル酸とカツプリングされる。な
ぜビールス粒子が細胞に侵入し得、ついで増殖し
始めるかという理由は、ビールスは酵素ニユーラ
ミニダーゼを含有し、これがいわゆる非常に小さ
な孔を形成しながら、細胞膜から唾液酸基をひき
離すということにある。細胞内のビールス増殖の
ため、患者は通常のインフルエンザ症状となり、
引き続き疾患が促進される。同時に生体もまた件
のビールスに対する抗体を形成し、これらの抗体
の一部はビールス表面上の血球凝集素に向けら
れ、いわゆる抗血球凝集素抗体である。同一タイ
プビールスの後のインフルエンザ発病において
は、これらの抗体はビールス上の血球凝集素と相
互反応するだろう。この相互反応の結果、ビール
スの血球凝集素は細胞上のシアル酸とカツプリン
グしようとすることが抑制される。類似の反応機
構は、従来のインフルエンザワクチンを用いての
インフルエンザに対する接種に適用される。この
ようなワクチンの注射により、生体はとりわけ件
のビールスの血球凝集素に対し向けられる抗体を
形成する。このような接種においては、件のビー
ルスに対する比較的良好な保護が得られるが、ビ
ールス感染に際してはそれ程永続しない。

本発明に従い上記したタイプのシアル酸特異ポ
リペプチド フラクシヨンの注射により、生体は
ポリペプチド フラクシヨンに対して向けられる
抗体を形成するだろう。これらの抗ポリペプチド
−抗体の一部分は、通常のインフルエンザ発病に
おけると同様にあるいは従来の接種と同様に、攻
撃しているビールス上の血球凝集素と相互反応
し、また同様にして生体中の各種タイプの細胞に
存在するシアル酸基との結合からビールス血球凝
集素を妨害する。おそらくポリペプチド フラク
シヨンが非常に初歩的動物から出発しているた
め、抗ポリペプチド−抗体はいかなる特定のビー
ルスに対しても特定的ではないだろうが、広範囲
のビールスの血球凝集素と相互反応するだろう。
各種タイプのビールスに対するワクチンと相互反
応するポリペプチド フラクシヨンの能力は、後
に報告する動物試験において証明された。

上記のポリペプチド フラクシヨンを含有する
本発明に係る免疫化剤は、ビールス感染の発生を
妨げる予防目的に使用できるが、同様に病気の進
行状態の間も治効がある。該薬剤は、その際、従
来の接種におけるように、すなわち例えばあらゆ
る適当な不活性液体稀釈剤と共に、例えばリン酸
塩緩衝剤などにより緩衝されうる0.9％生理食塩
水などの生理学的等張溶液中のポリペプチド フ
ラクシヨンの非経口、好ましくは皮下注射により
投与できる。もし必要であれば、防腐剤等の他の
添加物をそれ自体公知の方法で薬剤に添加するこ
ともできる。薬剤はまた、水酸化アルミニウム、
リン酸アルミニウムなどの従来の免疫佐薬を含有
することもできる。本発明に係るポリペプチド
フラクシヨンの非経口注射においては、1μｇ乃
至１ｇの服用量で通常は充分である。必要であれ
ば、注射は例えば同一量を用いて１あるいは数週
間の間隔で繰り返してもよい。本発明に係るポリ
ペプチド フラクシヨンの注射は、上記不活性液
体稀釈剤中の懸濁液の形態で行なうのが好まし
い。これは、例えば混濁もしくは懸濁液が得られ
る等電点にPHを調節することによつて行なうこと
ができる。適当な他の方法は、例えば他のワクチ
ンに対しては周知の水酸化アルミニウムなどの担
体に結合させることにより、沈着調剤としてポリ
ペプチド フラクシヨンを投与することである。

本発明によればまた、思いもかけず、件のポリ
ペプチド フラクシヨンはまた、例えばスプレー
様式における如く局所服用に際し、上空または粘
液導管（肺を含む）中のビールス感染に対する有
効な局所免疫防禦を提供する。このような服用に
おいては、本発明に係る薬剤は感染の進行中に予
防的にもまた治療的にも用いることができる。好
ましい投与様式は、５〜10日間に１日だけ１〜
1000μｇの好ましい服用量で経鼻服用、すなわち
鼻／口腔中へのスプレーである。この場合の作用
は少なくとも２つの異なる反応機構により起るも
のと推測できる。

繰り返し経鼻服用による予防装置においては、
本発明に係るポリペプチド フラクシヨンは局所
的に作用する抗体を形成し、これらの幾つかは上
記機構説明と同様にして相互反応し、ビールスが
生存し増殖しうるに必要なシアル酸基を発病ビー
ルスが攻撃することを妨げるだろう。ビールス感
染の進行中、本発明に係る薬剤の服用はまたこの
ような抗体を急速に形成し、これにより疾患の進
行促進を緩和する。添加効果は、局所服用におけ
る本発明に係るシアル酸特異ポリペプチド フラ
クシヨンが、空気導管中でしばしば起こる唾液並
びに鼻及び口の分泌物などの中で細胞上のシアル
酸基と結合されるという反応機構によつて起こる
と推測できる。生体細胞のシアル酸基は、これに
より“ブロツク”され、その結果ビールスの生長
に必須であるビールス粒子の血球凝集素がシアル
酸基と結合する能力を妨げまたは低減する。この
機構は本当の意味における免疫反応ではないが、
むしろそのシアル酸基への結合による細胞表面の
直接“塗布”を暗に意味する。

上記ポリペプチド フラクシヨンによる生体面
の治療における（進行中または予期される）広範
囲の細菌の攻撃に対する有効な防禦がなぜかとい
う理由もまた、完全には明らかではない。いずれ
にしても、観察された効果の機構を理論的に説明
をしようとする以下の試みは、したがつて本発明
を何ら限定するものとみなすべきではない。

創傷面などへの病原性細菌の結合についての真
の反応機構は相対的に知られていないが、これも
おそらくシアル酸を含む或る種のカツプリングを
経由して起こる。全ての病原細菌がそれらの細胞
膜にとりわけシアル酸を有することは知られてお
り、それらの接触面（“付着”基）において、こ
れらはおそらく同様に或るシアル酸誘導体と結合
している或る種の血球凝集素を有する。本発明に
係るイ貝からのシアル酸特異ポリペプチド フラ
クシヨンを、新鮮な手術創傷に適用すれば、した
がつてこれらのフラクシヨンはおそらく細胞のシ
アル酸基に結合される。これにより、創傷に侵入
する病原細菌は細胞に結合され得ないだろう（細
胞は既にポリペプチド フラクシヨンにより“ブ
ロツク”されているからである。）。このことは、
細菌は増殖せずに死ぬだろうということを、換言
すればより急速な創傷治療の結果となることを意
味する。

もし既に創傷中に細菌感染があれば、本発明に
係るシアル酸特異ポリペプチド フラクシヨンで
の治療は、おそらくポリペプチドのシアル酸特異
性と細菌の特異性との間に顕著な拮抗を生ずる。
さらに可能な説明としては、ポリペプチド フラ
クシヨンは、細菌（それらの膜にシアル酸を有す
る）凝集を作ることにより細胞壁とさらに反応し
うる細菌の能力を実際上完全に抑制するというこ
とである。

創傷及び他の生体表面の治療においては、ポリ
ペプチド フラクシヨンは、あらゆる適当な稀釈
剤中、例えば生理食塩水または無菌水中の溶液の
形態で各生体表面に局所的に塗布される。このよ
うに行なう場合、凍結乾燥剤を使用するのが好ま
しく、これは塗布に関連する稀釈剤に溶かし、例
えば刷毛塗りまたはスプレーにより行なうことが
できる。治療は、好ましくは感染が止まるまで１
日当り１〜３回、1μｇ乃至１ｇの服用量を用い
て行なうことができる。

本発明に係るポリペプチド フラクシヨンによ
る腸の感染（病原細菌またはギアルジアシス、ア
メービアシス、エントアメーバ、ヒストリテイカ
などの原生動物により生ずる）の治療において
は、創傷治療におけると同様の反応機構が推測で
きる。腸においては、通常各種菌種のＥコリ細菌
が遊離の状態にあり、すなわち腸壁には付着され
ていない。幾つかのＥコリ菌種は、腸壁に付着し
易くする異なる化学構造を持つている。このよう
な付着においてもまた、バクテリオフアージは細
菌を攻撃するだろうし、エンドトキシンは小／大
腸に漏れ出、下痢の条件を造る。本発明に係るポ
リペプチド フラクシヨンを腸に投与すれば、一
方においては病原細菌の凝集を生じこれにより不
活性にし、他方においては腸壁のシアル酸を細菌
が攻撃できないように保護する。相当する反応機
構は、例えば尿導路感染の場合に本発明に係るポ
リペプチド フラクシヨンによる膀胱フラツシン
グにも用いることができる。

本発明に係るポリペプチド フラクシヨンによ
る腸感染の治療においては、ポリペプチド フラ
クシヨンが胃を確実に損傷せずに通過するように
することが必要である。この目的には、ポリペプ
チド フラクシヨン（好ましくは凍結乾燥状態
で）は耐酸性カプセル中に適当に封装される。こ
れは、壊されることなく酸性胃液を通過できる
が、アルカリ性腸駅には溶けてポリペプチド フ
ラクシヨンを放出する。適当な服用量は、例えば
カプセル当りポリペプチド フラクシヨン10μｇ
乃至１ｇである。

上述したように、本発明に係るシアル酸特異ポ
リペプチド フラクシヨンは、イ貝から、好まし
くは青イ貝、（Mytilus edulis）、ミテイルス ペ
ルナ（Mytilus perna）、ミテイルス ガロプロ
ヴインシヤリス（Mytilus galloprovincialis）、
ミテイルス カリフオルニアヌス（Mytilus
californeanus）、ミテイルス スマラグデイヌス
（Mytilus smaragdinus）などのミテイルス種か
ら単離され、ペルナ ペルナ（Perna perna）、
ペルナ カナリキユルス（Peran canaliculus）
などのペルナと密接に関連しているが、他の種も
同様に問題になる。まず第１にこれらの種で関心
あることは、充分に頻繁に生成しまた工業的スケ
ールで製造を可能とすることが容易にできること
である。この関係においては、フアラデイダ
（Phaladidae）、アノドンタ シグネア
（Anodonta cygnea）、ドライセンシイダ
（Dreissensiidae）、スフエリウム コルニユーム
（Sphaerium corneum）、シプリナ イスランデ
イカ（Cyprina islandica）、マコマ バルデイカ
（Macoma baltica）、川イ貝、真球イ貝、カルデ
イダ（Cardiidae）、トリダクナ デレザ（Tri−
dacna deresa）、ペクチンイダ（Pectinnidae）、
ユニオニダ（Unionidae）、ユニオ ピクトルム
（Unio pictorum）、ミア アレナシア（Mya
arenacia）、ピナ（Pinna）、ピルグリム イ貝
（Pilgrim mussel）などを挙げることができる。

件のポリペプチド フラクシヨンは、上述した
動物の体液から単離される。体液とは、ここで
は、高等動物の血液、リンパ系及び線系に相当す
るこれら未発達動物の全系を意味する。最もしば
しば都合のよい単離方法の一つは、これらの体液
の抽出物を形成し、おそらく適当な混合後に、親
和クロマトグラフイーにより所望のポリペプチド
フラクシヨンを分離することであり、例えば特に
青イ貝について以下に報告する単離方法に類似す
る方法である。精製されたシアル酸特異ポリペプ
チド フラクシヨンは、１回服用量で凍結乾燥製
品として適当に包装され、凍結乾燥製品は投与に
関連するあらゆる稀釈剤に溶かすことができる。

本発明の薬剤の毒性については、以下の通りで
ある。

メキシコから帰国し、サルモネラ症様の臨床の
症状を持つ激しい下痢にかかつた旅行者（成人10
人）に、毎日経口で本発明の活性成分3x50μｇを
投与した。コントロール（同じ旅行者群から成人
10人）には、ブランクを投与した。３日後、治療
した10人の内７人（7/10）の患者は治癒したが、
一方コントロール群の誰も（0/10）治癒しなかつ
た。この実験は、150μｇ（3x50μｇ）の１日当た
りの投与量が非常に有効であつたことを示す。

５人の健康な成人のボランテイアに、１週間本
発明の活性物質1.5ｇを経口投与した。臨床上の
観察では、何ら副作用を示さなかつた。血液及び
肝臓のサンプルを、投与期間中及び投与期間後の
２週間採つたが、全てのテストの値は完全に正常
であつた。

要約すると、これらのテストは、本発明の活性
物質が、有効投与量の少なくとも10倍（そして恐
らくそれより揺かに多く）である投与量で無毒で
あることを示す。表の形では、これは以下のよう
に表さられる。

有効投与量 無毒の投与量 無毒量／有効量 0.150ｇ ＞1.5ｇ ＞10 以下に実施例を示して本発明をさらに詳細に説
明するが、本発明の範囲を何ら限定しようとする
ものではない。

実施例 １ 生青イ貝（Mytilis edulis）を開け、全液体及
びイ貝組織を遠心分離器に移し、４℃で9000rpm
で40分間遠心分離した。上澄液を集め、溶解性作
用を破壊するために30分間40℃に加熱した。得ら
れた溶液を再び４℃で9000rpmで30分間遠心分離
した。上澄液を集め、飽和硫酸アンモニウム溶液
を飽和濃度65％まで加えた。得られた沈澱物を室
温で30分間保持し、ついで9000rpmで30分間遠心
分離した。上澄液を廃棄し、沈澱物を0.05Mリン
酸塩緩衝剤、PH7.4、0.05M塩化ナトリウム
（pBS）に溶かし、pBSに対し透析した。生成物
の凍結乾燥試料は無色であり、蒸留水に易溶であ
つた。

牛の顎下のムチン（シアル酸を含む）1.0mgを
臭化シアンで活性化されたセフアロース
（Sepharose：登録商標）4B（スウエーデン国ウプ
サラ、フアーマシア・フアイン・ケミカルズ社か
ら市販されているアガロース）30ｇにそれ自体公
知の方法で結合した。形成されたゲルをついでゲ
ル過カラムに充填し、0.05Mトリス−Hcl、
0.1M塩化ナトリウム、0.01M塩化カルシウム緩
衝剤で平衡させ、前記したように調製され透析さ
れたPH8.5のポリペプチド フラクシヨン40mlを
カラムに入れ、これを上記緩衝剤（添附図面の緩
衝剤Ａ）で溶離した。カラムからの溶出液は続い
て280nｍで吸収され、フラクシヨンを集めた。
タンパクの主フラクシヨンが溶離された後（図面
のピークＡ参照）、溶離緩衝剤を0.05Mトリス−
Hcl、1.0M Nacl、0.01M塩化カルシウム緩衝剤、
PH8.5（図面の緩衝剤Ｂ）に代えた。この緩衝剤で
多くのタンパクフラクシヨンを溶離した（図面の
ピークＢ参照）。最後に、カラムを0.05Mトリス
−Hcl、0.01M Nacl緩衝剤、PH8.5（図面の緩衝剤
Ｃ）で溶離し、存在する少量のタンパクを溶離し
た（図面のピークＣ参照）。集めたフラクシヨン
（Ａ、Ｂ及びＣ）を、血球凝集反応効果について
試験した。血球凝集反応試験は、ハンマルストロ
ーム、エス．（Hammarstrom、S.）及びカバツ
ト、イー．エイ．（Kabat、E.A.）、バイオケミス
トリー（Biochemistry）８、2696（1969）に記載
の方法に従つて行なつた。ミクロ滴定プレート及
び0.9％塩化ナトリウム中の異なる血液群に属す
るヒトの赤血球の２％溶液を用いた。フラクシヨ
ンＣのみが赤血球を凝集した、すなわちシアル酸
特異であつた（図面の曲線“集合、凝集”参照）。

活性ポリペプチド フラクシヨンＣは、限外
過（Amicon UM10フイルター）により10回濃縮
し、0.05Mトリス−Hcl、PH8.5、0.15M塩化ナト
リウム、0.003M塩化カルシウム緩衝剤に対して
平衡になるまで透析した。凍結乾燥後無色生成物
が得られ、これは水に易溶であつた。

単離されたシアル酸特異フラクシヨンの分子量
は、勾配ゲルPAA4／30及び分子量計量キツト
（スウエーデン国、ウプサラ、フアーマシア・フ
アイン・ケミカルズ社製を用いるSDS−ポリアク
リルアミド電気泳動により測定した。電気泳動は
分子量範囲14500〜30000内で４つの帯を示した。
電気泳動におけるこれらの帯は、おそらくカルシ
ウムイオンの存在下で副分類群の再カツプリング
により再形成されうるより大きなタンパクのいわ
ゆる副分類群から派生している。

アミノ酸組成物を通常のアミノ酸分析により調
査した。結果を以下の表に報告する。アミノ糖は
全く検出できなかつた。

【表】 ポリペプチド フラクシヨンの等電点は4.6で
あつた。

実施例 ２ 皮下注射に適する調剤を、実施例１による凍結
乾燥生成物150μｇを蒸留水0.5mlに溶かし、PHを
4.6（混濁）に調節することにより調製した。

実施例 ３ 経鼻服用に適する調剤を、実施例１による凍結
乾燥ポリペプチド フラクシヨン50〜100μｇ
（１回服用量）を無菌蒸留水１〜1.5mlに溶かして
調製される。調剤は、スプレーびんに満たされ、
好ましくは噴射剤ガラスなしでのスプレーにより
服用される。ポリペプチド フラクシヨン及び稀
釈剤の量を比例的に増すことにより多服用量包装
を調製できる。

実施例 ４ 本発明に従つて用いられるポリペプチド フラ
クシヨンでの免疫化における血球凝集反応抑制効
果を、以下のように調査した。

実施例１に従つて調製された凍結乾燥ポリペプ
チド フラクシヨン２mgを整理食塩水（0.9％）
0.4mlとフロインズ佐薬（Freunds adjuvant）0.5
mlの溶液に懸濁し、２匹のウサギ（各３Kg）の背
に多段注入で皮下注射した。14日後、別の２mgを
各ウサギに同様にして注射した。すなわち、ウサ
ギ当りのポリペプチド フラクシヨンの合計は４
mgであつた。血液サンプルは最初の注射前及び３
週間後に採り、血清サンプルをオークテルロニイ
（Ouchterlony）プレート上で試験した。その結
果は、ポリペプチド フラクシヨンと第３週目の
血清との間に沈澱が生じた。これと対照的に、免
疫化前に採取した血清では沈澱は生じなかつた。
各ウサギはしたがつてそれ自身の対照として供し
た。

第３週血清をついで通常の血球凝集反応抑制試
験により試験した。以下の多価インフルエンザワ
クチンをビールス源として用いた：(1)Ａ−USSR
−90、92、97−77（H1N1）、(2)Ａ−イギリス−
864−75（H3N2）、及び(3)Ｂ−ホンコン−８−73。
ワクチン１ml血清凝集素50μｇを含有している。
試験は、対象ガラス上で、ワクチン懸濁液の１
滴、免疫化されたウサギからの第３週血清の１
滴、及び生理食塩水に懸濁された（注意深く洗浄
した）犬の赤血球の１滴（２％Ｗ／Ｖ懸濁液）を
混合することにより行なつた。0.15Mリン酸塩緩
衝剤の１滴及びウサギからのそれぞれゼロ血清
（すなわち免疫化前に採取された血清サンプル）
を、第３週血清の代りに対照として用いた。

免疫化されたウサギからの第３週血清では血球
凝集反応は全く起こらなかつたが、一方、全ての
対照においては直ちに（１分以内に）血球凝集反
応が起こつた。２匹のウサギ間には違いはなかつ
た。これらの結果は、本発明に係るポリペプチド
フラクシヨンは広範囲のビールスに対し活性で
ある抗体の形成を生じたことを明らかに示してい
る。

実施例 ５ 創傷治療用に適する調剤は、実施例１からの凍
結乾燥ポリペプチド フラクシヨン200μｇを無
菌水又は生理食塩水1.5mlに溶かして調製される。

実施例 ６ 腸感染経口治療に適する調剤は、実施例１から
の凍結乾燥ポリペプチド フラクシヨンを耐酸性
カプセル中に封装することにより調製され、これ
は本質的に酸性胃液により作用を受けずに通過
し、小腸及び大腸中のアルカリ性環境に溶け、封
装されていたポリペプチド フラクシヨンを放出
する。適量は例えば200〜300μｇ／カプセルであ
る。

実施例 ７ ２匹のスプラグ−ダウレイ（Sprague−
Dawley）ネズミ（400ｇ）に、背中を筋膜まで
切り下げ２つの創傷をつけた（表面〜2.8cm²）。汚
染を避けるために、簡単な創傷リングを縫合して
取り付け、傷の縁に接着した。創傷の一つは実施
例１に従い単離されたポリペプチド フラクシヨ
ンの0.1％溶液0.2mlで治療し、一方他の創傷は0.9
％生理食塩水0.2mlで治療した。汚染を避けるた
めに、創傷の観察が可能な透明キヤツプを２つの
創傷リング上にネジ止めした。５日間毎日創傷を
それぞれポリペプチド溶液0.2ml及び生理食塩水
0.2mlで治療した。

細菌量を測定するために、ゼラチン注射器を用
い、１、４、６及び８日目に創傷面からサンプル
を採取した。生理食塩水をサンプルに加え、37℃
水浴中で15分間孵化した。サンプルの稀釈系は寒
天プレート上に塗布し、37℃で一夜孵化した。集
落数を計数した。同時に創傷の治療経過を観察し
た。細菌量に関しては重要な差異は示されなかつ
た。これと対照的に、ポリペプチド溶液で治療さ
れた創傷には、より良好で急速な治療経過が観察
された。

実施例 ６ ３cm²の大きな創傷を４匹のスプラグ−ダウレイ
ネズミの背中につけた。２匹のネズミでは、創傷
を実施例１に従つて調製された凍結乾燥生成物の
0.1％溶液0.2mlで洗滌した。15分後、創傷を再び
この溶液で洗滌し、さらに15分後、溶液0.1mlで
洗滌した。他の２匹のネズミの創傷は、相当する
量の0.9％生理食塩水で相当する時間洗滌した。

最後の洗滌20分後、全ての創傷を細菌緑膿菌
1.7×10⁴で汚染した。２匹の被検ネズミについて
は、創傷はポリペプチド フラクシヨン溶液0.2
mlで１日３回、４日間治療したが、対照ネズミは
生理食塩水0.2mlで治療した。ネズミの全般の状
態は毎日７日間観察した。汚染の結果、対照ネズ
ミは鼻血を出し、体重が減少し、全般に悪い健康
状態を示したが、一方、治療群は全般の状態に変
化を示さなかつた。

実施例 ９ 実施例１と同様にして青イ貝からの血液リンパ
を集め、熱処理し、得られた沈澱物を遠心分離に
より除去した。0.2Mトリス−Hcl緩衝剤、PH9.3
の15mlをこのように熱処理された血液リンパに加
え、混合物のPHを8.5に調節した（このPHは８〜
９の範囲にあるべきである）。溶液を磁気撹拌し
ながら−５℃に冷却した。53％冷エタノール15ml
をついで蠕動ポンプにより23.2ml／ｈの速度で磁
気撹拌しながら加えた（沈澱物が形成される）。
懸濁液はさらに30分間−５℃で磁気撹拌しながら
保持された。懸濁液はついで、−５℃で30分間、
9000rpmで遠心分離した。遠心分離した沈澱物
を、室温で0.15M塩化ナトリウム溶液６mlに懸濁
させた。遠心分離した溶液（そのPHは8.0）を
0.22μフイルターを通して過し、凍結乾燥した。
調製した抽出物のシアル酸結合能力を、0.15M塩
化ナトリウム溶液中のヒトの赤血球２％懸濁液を
凝集する能力で測定した。可視血球凝集は、抽出
物の256倍稀釈（１：256）でさえも観察された。