JPH0454199A - 機能性ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、新規ポリペプチドに関し、更に詳しくは、ヒ
トフィブロネクチンの細胞接着ドメインポリペプチド、
及びヒトビトロネクチン、又はヒトコラーゲンＸＩ型の
インスリン結合活性部位ポリペプチドを含有する、新規
な人工の機能性ポリペプチドに関する。

〔従来の技術〕

フィブロネクチン（以下、ＦＮと表示する）は血漿や細
胞外マ）　ＩＪソックス存在する糖タンパク質で、多彩
な機能を持つことが知られている〔アニュアル　レビュ
ー　オブ　バイオケミス　ト　リ　−　（Ａｎｎｕａｌ
　　Ｒｅｖｉｅｗ　　ｏｆ　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ）　　　、第５７巻、第３７５〜４１３頁（１９８８
））。

天然のＦＮを創傷治癒、点眼薬等の医薬品や化粧品に利
用する試みがなされているが、血液から採取するために
供給に制限があること、コスト高であること、また、病
原性の細菌やウィルス等による汚染の可能性があるなど
の理由により、実用化されていない。また、天然のＦＮ
の機能ドメインを取出して利用することも同様の理由か
ら実用化されていない。

そこで本発明者らは、ヒ）ＦＮの細胞接着ドメインをコ
ードするｃＤＮＡ断片を発現ベクターに接続して大腸菌
に導入することにより、細胞接着活性ポリペプチド及び
その製造方法を開発し、特許出願した（特開昭１−２０
６９９８号）。

方、ビトロネクチン（以下、ＶＮと表示する）は血中に
多量に存在するタンパク質であり、コラーゲンＸＩ型（
以下、Ｃｏ１ＸＩと表示する）は軟骨に多く存在する細
胞間マトリックスである。

ＶＮは、化学と生物、第２４巻、第３１２頁（１９８６
）に記載されているように多様な生物機能を有し、例え
ばがんの転移防止剤や、細胞の無血清培地用基材等の用
途が期待され、コラーゲンも人工皮膚や止血剤等の医用
材料として近年、注目されてきている。

ＶＮやコラーゲンの新しい生理機能として、本発明者ら
は先に、ＶＮやコラーゲンがインスリン結合活性を有す
ることを見出し、特許出願をした（特開平１−８５９３
４号、特開平１−８６０００号、特願昭６３−２７３１
３９号）〔発明が解決しようとする課題〕 ＶＮやコラーゲンはそれぞれインスリン結合担体として
有用であるが、これに細胞接着活性を合せ持たせれば、
各種細胞への親和性を更に高めることができ、細胞接着
活性を合せ持つインスリン結合担体は、成長因子活性、
及びホルモン活性を有するインスリンのホメオスタシス
を調節することが可能であり、糖尿病患者に代表される
種々の疾患々者にインスリンを投与する時、インスリン
の作用部位へのターゲツティングに優れた、持続時間の
長い、安全で、免疫原性のない医薬品を作ることができ
、インスリンの効果を最大限に発揮させ、かつ、副作用
のない新しい製剤及びドラグデリバリーシステムを構築
することが可能となる。例えば、生化学的研究に有効な
増殖促進試薬が提供され、表皮細胞の増殖を高給、皮膚
の老化を防ぐ有用な化粧品が提供され、更に外傷や外科
手術後の創傷治癒を促進する経皮薬及び治療薬が提供さ
れ、糖尿病の治療に用いる持続性の高い、副作用のない
インスリン製剤が提供される。

すなわち本発明の目的は、細胞接着活性と、インスリン
結合活性とを持つ、新規な人工機能性ポリペプチド、及
びその製造方法を提供することにある。

〔課゛題を解決するための手段〕

本発明を概説すれば、本発明は人工の機能性ポリペプチ
ドに関する発明であって、ヒ）ＦＮの細胞接着ドメイン
ポリペプチドと、ヒトＶＮ若しくはヒトＣｏ１ＸＩのイ
ンスリン結合活性部位ポリペプチドが、直接又は間接に
結合していることを特徴とする。

本発明者らは、インスリン結合活性ポリペプチドとして
、第１図で示される、ヒトＶＮのインスリン結合活性部
位を含有するポリペプチド、及び第２図で示されるヒト
Ｃａ１ＸＩのインスリン結合活性部位を含有するポリペ
プチドを、それぞれ遺伝子工学的に作成した。次いで、
これらのインスリン結合活性ポリペプチドがヒトＦＮの
細胞接着ドメインポリペプチドと、それぞれ、直接又は
スペーサーを介して結合した、新規ポリペプチドの遺伝
子工学発現に成功し、本発明を完成させた。

以下、本発明を具体的に説明する。

ヒ）ＦＮのタンパク質の一次構造については、ジ　エン
ボ　ジャーナル（Ｔｈｅ　ＢＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ）、
第４巻、第１７５５〜１７５９頁（１９８５）に記載さ
れている。また、その細胞接着ドメインをコードするｃ
ＤＮＡクローン（ｐＬＦ５　）についてはバイオケミス
トリー（Ｂｉｏｃｈｅ＋ｎ１ｓｔｒｙ）、第２５巻、第
４９３６〜４９４１頁（１９８６）に記載されている。

本発明者らは、ｐＬＦ５から、細胞接着ドメインに対す
るｃＤＮＡ断片を取出し、これを発現ベクターに接続し
て大腸菌に導入することにより、細胞接着活性ポリペプ
チド及びその製造方法を開発し特許出願した（特開平１
−２０６９９８号）。本発明で必要とされる細胞接着ド
メインのｃＤＮＡは、特開平１−２０６９９８号公報に
記載されている組換え体プラスミドｐＴＦ７０２１を用
いることができる。

ｐＴＰ７０２１はＦＮのＰｒｏ””−Ｍｅｔ”＋７（２
７９アミノ酸残基）を発現するプラスミドである。

ｐＴＦ７０２１の翻訳領域のＣ末端の終止コドンの直前
にクローニングサイト、例えばＮｃｏ　Ｉサイトを導入
することにより、細胞接着ドメインのＣＤＮＡと他のポ
リペプチドをコードするＤＮＡを連結させることができ
る。

本発明による新規な機能性ポリペプチドは、下記一般弐
■： Ｃ２７７−（Ｘ）、−Ｙ−（Ｚ）、。

〔式中、Ｃ２７□はヒトＦＮの細胞接着ドメインのｐ、
Ｃ１２３９−８ｅｒ１５１５に相当する２７７アミノ酸
ポリペプチド残基を示し、下記式■： Ｐｒ。

Ｐｒ。

Ｖａｌ Ａｓｐ ５ｐ Ｐｒ。

Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｌａ Ａｓｐ　　Ｔｈｒ Ｐｒｏ　　Ｓｅｒ Ａｒｇ　　Ｔｙｒ Ｖａｌ　　Ａｌａ Ａｓｎ　　Ａｌａ Ｇｌｙ　　Ｔｈｒ Ｖａｌ　　Ｔｙｒ Ａｒｇ　　Ｇｌｙ Ｐｒｏ　　Ｔｈｒ Ａｌａ　　Ａｓｎ Ｐｒｏ　　Ａｒｇ Ｍｅｔ　　Ａｒｇ ｌｉｅ　　Ａｓｐ Ｓｅｒ　　Ｐｒ。

Ｇｌｕ　　Ｌｅｕ Ｖａｌ　　Ｖａｌ Ｇｌｕ　　Ｔｙｒ Ｇｌｕ　　Ｇｉｎ Ａｒｇ　　Ｇｌｎ Ｇｌｙ　　１ｉｅ Ｓｅｒ　　Ｐｈｅ Ａｌａ　　Ｔｈｒ Ｖａｌ しｅｕ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ ｉｓ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｔｈｒ １ｅ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｌｙｓ １ｅ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｔｒｐ　　Ａｌａ Ａｓｎ　　Ｐｈｅ Ａｓｎ　　Ｇｌｕ Ｓｅｒ　　Ｐｒ。

Ａｓｎ　　Ｌｅｕ Ｓｅｒ　　Ｖａｌ Ｓｅｒ　　Ｔｈｒ Ｇｌｙ　　Ｌｅｕ Ｓｅｒ　　Ａｓｐ １ｉｓ　　Ｔｒｐ Ｇｌｙ　　Ｔｙｒ Ｐｒ。

Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｐｒ。

Ａｓｐ ｌｉｅ １ｅ Ａｒｇ ｅｅ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｐｒ。

Ａｌａ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｌａ １ｅ Ｐｒ。

Ｌｙｓ Ｐｒ。

Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｐｒ。

Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｌｅｕ １ｅ Ｐｒ。

ｐｒ。

Ｐｒ。

Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｓｅｒ ＩＳ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｔｈｒ 八ｌａ Ｔｙｒ Ｇｉｎ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ ｉｓ Ｇｌｕ ｌｉｅ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｇｉｎ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ａｌａ Ａｓｐ １ｙ Ｐｒ。

Ｐｒ。

Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｇｉｎ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ａｒｇ １ｅ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｔｈｒ １ｅ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ ｉｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｖａｌ １ｅ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｓｅｒ ｌｉｅ Ａｓｐ １ｅ Ｐｈｅ Ｐｒ。

Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｔｙｒ １ｙ Ｐｒ。

Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｓｅｒ ｉｓ Ｌｅｕ １ｅ Ｐｒ。

Ｓｅｒ Ａｌａ Ｔｒｐ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｐｒ。

Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ａｌａ Ａｒｇ で表される配列を有し、Ｘはスペーサーを示し、Ｙは第
１図及び第２図でそれぞれ示されるヒトＶＮ若しくはヒ
ト　Ｃｏ１ＸＩのインスリン結合活性部位ポリペプチド
を示し、Ｚは下記式ＣＩ［Ｉ］、Ｌｙｓ−＾５ｎ−３ｅ
ｒ−３ｅｒ−３ｅｒ−Ｖａｌ＝Ｐｒｏ−Ａｌａ　　　°
　°　［ＩＩＩ　］のポポリペブチを示し、ｍ及びｎは
１又は零の数を示す〕で表されることを特徴とする機能
性ポリペプチドである。

式■中におけるスペーサーは、細胞接着活性ポリペプチ
ドとインスリン結合活性ポリペプチドの分子間距離を調
節するための挿入配列でもあり、任意のアミノ酸又はポ
リペプチドを用いることができ、また必要に応じ除去す
ることもできる。本発明の例で示せば、Ｃ２７７とヒ）
ＶＮのインスリン結合活性部位ポリペプチドの間にはＭ
ｅｔ−Ｇｌｙが、Ｃ２７，とヒトＣｏ１Ｘ［のインスリ
ン結合活性部位ポリペプチドの間にはＮｅｔ−Ｖａｌが
挿入されている。

なお、本明細書において、細胞接着活性ポリペプチドの
アミノ酸に付された頁数字は、ＥＭＢＬ　　データバン
ク（ＢＭＢＬ　ＤＡＴＡ　ＢＡＮＫ＞中のＦＮのｃＤＮ
Ａ配列を翻訳して得られるアミノ酸配列に付されたＮ末
からのアミノ酸残基数を示す。

ヒトＶＮのインスリン結合活性部位ポリペプチドとは、
第１図で示されるアミノ酸配列を少なくとも含み、遺伝
子工学的に生産することができる。

ヒ）ＶＮのインスリン結合活性は以下の方法で検出され
る。

すなわち、ヒ）ＶＮ又は例えば化学的に分解したポリペ
プチドを適当な濃度のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電
気泳動（ＳＯ５−ＰＡＧＥ）で分離し、コレラニトロセ
ルロース膜ヘブロッティンクスる。これにパーオキシダ
ーゼ標識したインスリンをＰＢＳ中で反応させ、充分に
洗浄した後に、４−クロロ−１−ナフトールと過酸化水
素を基質として標識パーオキシダーゼ活性を検出する。

ヒトＶＮのインスリン結合活性部位は、ＶＮ分子をブロ
モシアンによって断片化した５ｋｄのポリペプチドにあ
り、このポリペプチドは逆相−０ＤＳカラムＨＰＬＣ（
０，０１％ＴＦＡ、アセトニトリル系）で精製され、Ｎ
末端アミノ酸配列を決定することができる。該ポリペプ
チドはそのＮ末端よりＡｌａ−Ｐｒｏ−＾ｒｇ−Ｐｒｏ
のアミノ酸配列を有する。この配列は既報のＶＮｃＤＮ
Ａ配列しジ　エンボ　ジャーナル、第４巻、第２５１９
〜２５２４頁（１９８５））においてＡ１ａ３４Ｉｐｒ
Ｏ３４４に相当する配列である。

ブロモジＴン処理では、Ｍｅｔ残基の後が切断されるの
で、該５ｋｄポリペプチドはＡｌａ”　’−Ｍｅｔ３８
１に相当する。そこで、この部位に対応するＤＮＡ断片
をヒトジェノミックＤＮＡからＰＣＲ［Ｐｏｌｙｍｅｒ
ａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　：サイキ（Ｓ
ａｉｋｉ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　、第２
３０巻、第１３５０〜１３５４頁（１９８５）　：］に
より増幅し、次いで、増幅されたＤＮＡ断片をＮｃ。

ＩＸＩＥｃｏ）Ｎで処理し、ｐＴＶ１１８Ｎ　　［フェ
ブスレターズ（ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ）、第２２３
巻、第１７４頁（１９８５）　）の同サイトにライゲー
ションすることによりヒトＶＮインスリン結合活性部位
ポリペプチドと大腸菌由来のＩａｃＺ’　　［ジーン（
Ｇｅｎｅ）第３３巻、第１０３〜１１９頁（１９８５）
］の融合タンパク質をコードする遺伝子を含有するプラ
スミドｐＴＶ　ＶＮ−Ｉｎ、を作製することができる。

該プラスミドを第３図に示す。該プラスミドで、微生物
、例えば大腸＠ＪＭＩ　０９株を形質転換し、該形質転
換株を、培養することにより、ヒトＶＮのインスリン結
合活性部位ポリペプチドを含有する１ａｃＺ’　との融
合ポリペプチド（以下、ＶＮ−Ｉｎ、と略称する）を発
現させることができる。該ＶＮ−Ｉｎ、のインスリン結
合活性は前述の方法で確認されている。

今回本発明者らがヒ）ＶＮのインスリン結合活性部位と
して同定した領域は、従来からヒトＶＮのヘパリン結合
部位として報告されている領域とほぼ一致することから
、ヘパリンがＶＮ・Ｉｎ、のインスリン結合性に与える
影響を検討した。その結果、ＶＮ４ｎ、のインスリン結
合性がヘパリンによって阻害されることが明らかになっ
た。このことは本ポリペプチドのインスリン結合性がヘ
パリンによって制御可能であることを示している。

次にヒト　Ｃｏ１ＸＩのインスリン結合活性ポリペプチ
ドとは、第２図で示されるアミノ酸配列を少なくとも含
むもので、遺伝子工学的に生産することができる。

特願昭６３−２７３１３９号明細書記載のようにコラー
ゲンＶ型（以下Ｃｏ１Ｖと略称する）におけるインスリ
ン結合活性部位ポリペプチドのアミノ酸配列の一部が決
定された。一方、Ｃｏ１ＸＩは軟骨に多く存在し、Ｃｏ
１Ｖの軟骨型とされており、Ｃ０ＩＶと高いホモロジー
を有している。そこで前出明細書記載のＣａ１Ｖ由来の
インスリン結合活性部位ポリペプチドのアミノ酸配列と
、　Ｃｏ１Ｖと高い相同性を有するＣｏ１ＸＩのアミノ
酸配列、及びｃＤＮＡ配列〔ザ　ジャーナル　オブバイ
オロジカル　ケミストリー（ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌ　　
　ｏｆ　　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　　Ｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ　　）　　第　２６３巻、第１７１５９〜１７１６６
頁（１９８８）］を比較する。

Ｃｏ１Ｖ中のインスリン結合活性部位のアミノ酸配列は
、Ｃｏ１ＸｒのＧｌｙ２ｇａ　ｐｒ０３５９の部位のア
ミノ酸配列にほぼ対応し、この部分の両者のアミノ酸配
列は約７５％のホモロジーを示す。そこで、この領域を
含み、Ｃｏ　Ｉ　ＸＩのＰｒ　ｏ　２　Ｂ　＋　−Ｇ　
ｌ　ｙ　４２７に対応するポリペプチドをコードするｃ
ＤＮＡ断片をヒト胎盤ｍ　−ＲＮ　ＡよりｃＤＮＡ合成
及びＰＣＲ法によって増幅する。

増幅されたＤＮＡ断片をＮｃｏ　Ｉ　、　ＢｃｏＲＩで
処理し、前出プラスミドｐＴＶ１１８Ｎの同サイトにラ
イゲーションすることによりヒト　［：ｏｌＸＩのイン
スリン結合活性部位ポリペプチドをコードする遺伝子を
含有するプラスミドｐＴＶｃｏｌＸＩを作成する。該プ
ラスミドを第４図に示す。目的ポリペプチドの高発現性
プラスミドを得るた杓に、ｐＴＶｃｏｌＸＩより、目的
ポリペプチドをコードするＤＮＡをＮｃｏ　Ｉ　、　Ｂ
ａｍ）Ｉ　Ｉで切り出し、次いで、高発現性プラスミド
、例えばｐＥＴ８ｃの同サイトに導入し、プラスミドｐ
ＥＴｃｏｌＸＩを作成する。該プラスミドを第５図に示
す。

ｐＥＴ系プラスミドはスタデイ−（Ｓｔｕｄｉｅ）らが
作成したＴ７ＲＮＡポリメラーゼ　プロモーターを有す
るプラスミドで、これをＴ７ＲＮＡポリメラーゼを発現
する大腸菌ＢＬ−２１株に導入することで効果的にタン
パク質を発現することができる。ｐＥＴ’［：ｏｌＸＩ
で大腸菌ＢＬ−２１株を形質転換し、該形質転換株を培
養することにより、目的ポリペプチドを発現させること
ができ、培養菌体の５ＤＳ−ＰＡＧＥにより、分子置駒
２０ｋｄのポリペプチドにインスリン結合活性が確認さ
れる。

次に、前述）ＶＮ−Ｉｎ、発現プラスミ）’　ｐＴＶ　
ＶＮ−Ｉｎ。

のＳｍａ　ｒサイトに終止コドンを含むユニバーサル　
ストップ　コドン（ファルマシア社）を導入し、プラス
ミドｐ’ｒｖ　ＶＮ　Ｉｎ、ｔＡＡを作成する。

該プラスミドを第６図に示す。このプラスミドより　Ｎ
ｃｏ　Ｉ　、　Ｂａｍｔｌ　Ｉを用いてヒトＶＮインス
リン結合活性部位をコードするＤＮＡ断片を切り出し、
前記ｐＴＦ７０２１から誘導されたプラスミドｐＴＦ７
５２０の翻訳領域の３′末端Ｎｃｏ　Ｉ　、Ｂａｍ）Ｉ
　Ｉサイトに接続することにより、ヒトＦＮの細胞接着
ドメインと、ヒトＶＮのインスリン結合活性部位ポリペ
プチドとが連結したポリペプチドを発繞する組換え体プ
ラスミド・Ｉ）ＴＰ７５２０−ｉ−ＶＮＩｎ、ア□が得
られる。該プラスミドを第７図に示す。

一方、前述のＣｏ１）Ｇのインスリン結合活性部位ポリ
ペプチドを発現するプラスミド・ｐＢＴ　［：ｏｌＸＩ
も同様にＮｃｏ　Ｉ　ＳＢａｍＨＩで処理し、Ｃｏ１Ｘ
［由来のインスリン結合活性部位ポリペプチドをコード
するＤＮＡ断片を得る。これを前述のｐＴＦ７５２０の
Ｎｃｏ　Ｉ　、　Ｂａｍ）Ｉ　Ｉサイトに接続すること
により、ヒトＦＮの細胞接着ドメインと、ヒトＣｏ１ｘ
ｒのインスリン結合活性部位ポリペプチドが連結したポ
リペプチドを発現する組換え体プラスミド・ｐＴＦ７５
２０＋Ｃｏ１ＸＩが得られる。該プラスミドを第８図に
示す。

ｐＴＦ７５２０＋　ＶＮ−Ｉｎ、ア□における連結部に
はＭｅｔ−ＧｌｙをコードするＤＮＡが、ｐＴＦ？５２
０＋　Ｃａ１ＸＩにおける連結部にはＮｅｔ−Ｖａｌを
コードするＤＮＡがリンカ−として含まれる。リンカ−
の有無は、本発明の効果を左右するものではないが、必
要とあれば部位特異的変異の手法により、容易に除去す
ることができる。

得られたプラスミドをそれぞれ大腸菌に導入し、適当な
条件下に培養することにより、目的ポリペプチドが大腸
菌内に蓄積される。発現の確認にはイムノブロッティン
グが用いられる。

組換え大腸菌の全菌体タンパク質を５ＤＳ−ＰＡＧＥで
分離した後、泳動パターンをニトロセルロース膜に移し
取る。ヒトＦＮの細胞接着ドメインを認識するモノクロ
ーナル抗体（ＦＮ−１０、宝酒造）及び前出インスリン
結合活性測定方法で検出されるバンドが目的のポリペプ
チドである。

目的ポリペプチドの精製は、例えば次のように行う。組
換え大腸菌をＬ−ブロス等の培地に培養し、集菌した後
、超音波処理により、菌体破砕液を得、これを遠心分離
して上清を得る。

上滑を透析後、ＤＥＡＥイオン交換体のカラムを通過さ
せ、次いでＣＭイオン交換体及び／又はヘパリン−アガ
ロース等のアフィニティクロマトを行う。以上の操作に
より、目的のポリペプチドを精製することができる。

得られたポリペプチドは、ＢＨＫやＮＨＫ細胞に対する
細胞接着活性の測定に用いられる。

細胞接着活性の測定は、例えばルオスラティ（Ｒｕｏｓ
ｌａｈｔｉ）　等の方法（メソッズ　イン　エンザイモ
ロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｂｎｚｙｒｎｏｌｏｇ
ｙ）　、第８２巻、第８０３〜８３１頁（１９８１））
に準じて行う。すなわち、試料をコートした後、ＢＳＡ
でブロッキングしたマイクロタイタープレートに、ＢＨ
Ｋ又はＮＲＫ細胞の懸濁液を添加し、３７℃で約１時間
インキュベートした後、未吸着の細胞を洗浄した後、ホ
ルマリン固定し、伸展した細胞の割合を顕微鏡下に測定
することにより、細胞接着の強さを測定することができ
る。

以上のように、細胞接着活性とインスリン結合活性を有
する、新規な人工機能性ポリペプチドが提供され、該新
規ポリペプチドは、インスリンの多様な効果を細胞へ効
果的に作用させることができ、局所へのドラグデリバリ
ーシステムの構築や、徐放性薬剤の開発等、インスリン
の利用・作用制御等に有用である。

〔実施例〕

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発
明はこれら実施例に限定されない。

実施例１ ヒトＶＮのインスリン結合活性部位ポリペプチドのクロ
ーニング （１−１）インスリン結合活性部位の同定ヒトＶＮ（宝
酒造社製）を、２０ｍｇ／ｒｎｌブロモシアンを含む７
０％ギ酸溶液に５ｍｇ／ｍｌとなる様に溶解し、Ｎ２ガ
スを吹き込み、溶液中の０２を除去した後、室温で２４
時間反応させて断片化した。これに１０倍量の水を加え
、凍結乾燥を行った。サンプルをＰＢＳ　（−）に１ｍ
ｇ／−となる様に溶解し、この溶液１０μｌを５ＤＳ−
ＰＡＧＥにより分離し、ウェスタンプロット法によりニ
トロセルロース膜に転写した後、５μｇ／ｍｌパーオキ
シダーゼ標識インスリン（シグマ社製）を添加した０、
０５％ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０−ＰＢＳ溶液中で室
温、２時間反応させた。

このニトロセルロース膜を０．０５％ツイーン２Ｏ−Ｐ
ＢＳで７回、ＰＢＳで３回洗浄した後に、ニトロセルロ
ース膜に結合したパーオキシダーゼ活性を０．５　ｍｇ
／　ｍｌでＰＢＳ　（−）に溶解した４−クロロ−１−
ナフトールと０．０１％過酸化水素を基質として検出し
た。

この結果、パーオキシダーゼ標識インスリンはヒ）ＶＮ
断片の内、分子置駒５ｋｄのポリペプチドに結合した。

次に逆相−０ＤＳカラム（東京化成）ＨＰＬＣによって
この５ｋｄポリペプチドを以下の条件で精製した。

すなむち、０．１％ＴＦＡ存在下、アセトニトリル０％
→６０％のグラジェントを用い、ＵＶ２２０ｎｍの吸収
を示すピークを５ＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、分子量５ｋ
ｄポリペプチドを得た。

次にこのポリペプチドのＮ末端アミノ酸配列を決定した
ところ、そのＮ端アミノ酸配列はＡｌａ−Ｐｒｏ−Ａｒ
ｇ−Ｐｒｏであった。このアミノ酸配列と既報のヒ）Ｖ
Ｎ　　ｃＤＮＡ　（前述）配列を比較すると、＾１ａｊ
４１．．．ｐｒｏ３４４と一致する。また、ブロモシア
ンで切断されるアミノ酸残基はＮｅｔであり、このこと
から、５ｋｄポリペプチドをＡ１ａ３４１−Ｍｅ１３Ｂ
＋に対応するポリペプチドと同定した。

（１−２）インスリン結合活性部位ポリペプチドをコー
ドするＤＮＡのクローニング及び発現（１−１）のポリ
ペプチドに対応するヒトＶＮＤＮＡ断片を以下のように
クローニングし、次に大腸菌１ａｃＺ’ポリペプチドと
の融合ポリペプチドとして発現させた。

すなわち、ヒト肺ジェノミックＤＮＡをテンプレートと
して下記に示すブライマーをＤＮＡ合成機で合成、精製
し、これを用いて、ＰＣＲを行った。

Ｎｃｏ　１ １１　ｅ　３３５ ＣＡＧＧＣＡＴＧ−３’ ＢｃｏＲＩ ｅｒ３８８ アンダーラインはヒトＶＮのＤＮＡ配列、は対応するア
ミノ酸番号、ニー］　は クローニング用に末端に導入した制限酵素サイトを示す
。

ＰＣＲは宝酒造社ジーン　アンプ（Ｇｅｎｅ　Ａ＋ｎｐ
）キットを用い、テンプレートＤＮＡは１μｇ、温度サ
イクル９４℃、１分→５５℃、２分→７２℃、１分で３
０サイクル行った。反応液のｌ／１０量を４％丁ガロー
スゲル電気泳動にかけ、その結果１８９ｂｐの目的ＤＮ
Ａ断片の増幅を確認した。

この産物をＮｃｏ　Ｉ　、　ＢｃｏＲＩで処理し、プラ
スミドｐＴｖ１１８Ｎの同サイトに１６℃、３０分ライ
ゲーションした（宝酒造社製ライゲーションキットを使
用）。これにより構築されたプラスミ）’　ヲｐＴＶ　
ＶＮ−４ｎ、と命名し、これで大腸菌ＪＭＩ０９を形質
転換した（宝酒造社コンピテントセルＪＭ１０９使用）
。次に、得られた形質転換体中１８クローンについてプ
ラスミドの分析を行った。すなわち、ラピッド法で調製
したプラスミドを８ｃｏＲＩ及びＮｃｏ　Ｉで分解し、
アガロースゲル電気泳動にかけ、予想されるＮｃｏ　Ｉ
　−ＥｃｏＲＩ断片（０，１８ｋｂ）のバンドの生成を
調べた。

その結果、１クローンに目的のバンドが認められた。ま
た、ダイデオキシ法により塩基配列を決定し、目的の配
列を含むことを確認した。このプラスミドを保持する大
腸菌ＪＭＩ　０９をＢｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ
　ＪＭ１０９／ｐＴＶ　ＶＮ−Ｉｎ、　　と命名した。

本菌株を１５０μｇ／−アンピシリン１ｍＭＩＰＴＧ　
（イソ　プロピル　チオーβ−Ｄ−ガラクトシド）存在
下し一培地中で培養し、菌体を１２．５％５ＤＳ−ＰＡ
ＧＥによって分析した。

その結果、分子量的１８ｋｄにヒ）ＶＮポリペプチドと
大腸菌由来１ａｃＺ’が下記のように融合したポリペプ
チドを得た。

Ｇｌｙ−［１１ｅ３３５−３ｅｒ３８８］　−Ｌｙｓ−
［Ａｓｎ”］ヒヒトＮポリペプチド　　　　　　　　　
　　　　１ａｃ２’次に前述のウェスタンプロットを用
いた方法で本融合ポリペプチドのインスリン結合性をチ
エツクした結果、強いインスリン結合活性が確認された
。

（１−３）発現ポリペプチドへのヘパリンの作用今回、
本発明者らがヒトＶＮ由来インスリン結合ポリペプチド
として同定した部分は、従来ヘパリン結合ドメインと呼
ばれたサイトでもあることから、（１−２）で発現させ
た本ポリペプチドに対するヘパリンとインスリンの結合
性について検討した。

すなわち、前述のウェスタンプロット法において、プロ
ッティングの後、０．５μｇ／−のツマ−オキシダーゼ
標識インスリンを反応させる際に０．１μｇ、１．０μ
ｇ１１０μｇ、１００μｇ１１ｍｇ、及び１０ｍｇのヘ
パリンを共存させパーオキシダーゼ発色の変化をみた。

その結果、本ポリペプチドのインスリン結合性は加える
ヘパリンによって強く阻害されることが示された（表表
　　１ ０．１ （÷二強い発色、＋：やや強い発色、 ＋２弱い発色、−二発色を認めず） 実施例２ ヒ）　　Ｃｏ１ＸＩのインスリン結合活性部位ポリペプ
チドのクローニング （２−１）インスリン結合活性部位の同定特願昭６３−
２７３１３９号によって明らかにされたＣｏ１Ｖにおけ
るインスリン結合ポリペプチドのアミノ酸配列は、Ｃｏ
１ＸＩのＧｌｙ２６８−Ｐｒｏ３５９に対応している。

そこでこれを含むＰｒｏ２６’−Ｇｌｙ４２７をインス
リン結合ポリペプチドと同定した。

（２−２）インスリン結合部位をコードするＤＮＡのク
ローニング及び発現 ヒト胎盤ｍ−ＲＮＡ（クローンチック社）よりオリゴｄ
Ｔプライマーを用いて１重鎮ｃＤＮＡを合成した〔メソ
ッズ　イン　エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ
　Ｂｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）第１５２巻、第３１６〜３２
４頁（１９８７）：］。すなわち、反応液２５ｆｆ＋１
）リス（Ｔｒｉｓ）−ＭＣＩ、　ｐＨ８，３，１００ｍ
Ｍ　ＫＣＩ、　１０　ｍＭ　ＭｇＣ１１，５００μＭ　
ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ。

ｄ［：ＴＰ、　ｄＧＴＰＳＴＴＰ　）オリゴｄ（Ｔ）＋
２−＋ｓ　Ｏ，５μｇ（計２０μｌ）を９５℃、５分間
加熱し、その後、０．５　Ｍｇ　ｍ−ＲＮＡを加えた。

更に９５℃、３分間加熱し、水中で急冷した。これに終
濃度５．７６μＭのβ−メルカプトエタノールを加え、
更に２５ユニツトの逆転写酵素（宝酒造社製：ＲＡＶ−
２）を加え（計２５μｊ２）４２℃、６０分反応させた
。

この産物を以下の条件でＰＣＲにかけた。すなわち、下
記プライマーをＤＮＡ合成機で合成し、精製し用いた。

［１ｃｏＲＩ Ｇ１ｙ４２ｆｆ アンダーラインはＣｏ１ＸＩのＤＮＡ配列、ｖ八は対応
するアミノ酸番号、二＝　はクローニング用に末端に導
入した制限酵素サイト、□は新たに導入したストップコ
ドンを示す。

ＰＣＲは宝酒造社製　シーンアンプキットを用い、テン
プレートは前述のｃＤＮＡ産物０．１μβ、温度サイク
ル９４℃、１分→５８℃、２分→７２℃、１分で３０サ
イクル行った。反応液の１７１０量を４％アガロースゲ
ル電気泳動にかけ、その結果５０１　ｂｐの目的ＤＮＡ
断片の増幅を確認した。

二の産物をＮｃｏ　Ｉ　、　ＥｃｏＲＩで処理し、プラ
スミドｐＴＶ１１８Ｎの同サイトに前述の条件でライゲ
ーションした。これによって構築されたプラスミドをｐ
ＴＶ　Ｃｏ１ＸＩと命名し、これを更にＮｃｏ　Ｉ、Ｂ
ａｍＨＩ処理し、約５００ｂｐのＤＮＡ断片をアガロー
スゲル電気泳動を用いて回収した。

次に本ＤＮＡ断片を前述のプラスミドｐＢＴ８ｃの同サ
イトに前述の条件でライゲーションした。

これによって構築されたプラスミドをｐＥＴ　Ｃｏ！刈
と命名して、前述の大腸菌ＢＬ−２１株へ導入し形質転
換体を得た。

次に、得られた形質転換体中１８クローンについてプラ
スミドの分析を行った。すなわち、ラピッド法で調製し
たプラスミドをＮＣＯＩ及びＥｃａＲＩで分解し、アガ
ロースゲル電気泳動にかけ、予想されるＮｃｏ　Ｉ　−
ＢｃｏＲＩ断片（０，５ｋｂ）のバンドの生成を調べた
。その結果、１クローンに目的のバンドが認められた。

また、グイデオキシ法により塩基配列を決定し、目的の
配列を含むことを確認した。このプラスミドを保持する
大腸菌ＢＬ−２１をＢｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ
　ＢＬ−２１／　Ｉ］［ＥＴ　Ｃ０ＩＸｆと命名した。

本菌株を１００μｇ／−アンピシリンを含むＬ−培地中
でＯＤ　ｓｏｏ　、”−０，５まで培養し、更にアンピ
シリン１００μｇ／ｍｊｉ！及び１ｍＭ　　ＩＰＴＧを
加え２時間培養した。

培養菌体を１２．５％５ＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し
たところ、分子量的２０ｋｄにポリペプチドの発現を確
認した。

更に前述のウェスタンプロット法でインスリン結合性を
チエツクしたところ、本ポリペプチドにインスリン結合
活性を認めた。

実施例３ ヒトＦＮ細胞接着ドメインポリペプチドとヒ）ＶＮのイ
ンスリン結合活性部位ポリペプチドの融合ポリペプチド
のクローニング （３−１）プラスミドｐＴ’Ｖ　ＶＮ−Ｉｎ、の改変ヒ
トＶＮ由来インスリン結合活性部位ポリペプチドをコー
ドするｐＴＶ　ＶＮ−Ｉｎ、のインサート３′側のマル
チクローニングサイト内のＳｍａ　Ｉサイトに、ストッ
プコドン（ＴＡＡ）を導入した。

すなわちＳｍａ　Ｉ処理し、脱リン酸化したｐＴＶ　Ｖ
Ｎ−Ｉｎ、にユニバーサル　ストップ　コドン（ファル
マシア社）をライゲーションし、前述の大腸菌ＪＭ１０
９株へ導入した。これを４０μｇ／ｍｌのＸ−Ｇａ１（
５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガ
ラクトピラノシド）　　２００μｇ／−のＩＰＴＧ及び
１５０μｇ／−のアンピシリンを含むし一プレート上に
まき白色コロニを選んだ。これによって構築されたプラ
スミドをｐＴＶ　ＶＮ−Ｉｎ、ＨＡと命名した。

（３−２）融合ポリペプチドをコードするＤＮＡのクロ
ーニング （３−１）のｐＴＶ　ＶＮ−Ｉｎ、ＴＡＡをＮｃｏ　Ｉ
　、　ＢａｍＨＩで処理し、これを前述ｐＴＦ７５２０
のＮｃｏ　Ｉ　、ＢａｍＨＩサイトに前述の条件でライ
ゲーションした。これによって構築されたプラスミドを
ｐＴＦ７５２０十ｐＴＶ　ＶＮ−Ｊｎ、ＴＡＡと命名し
た。次いで該プラスミドを用い、大腸菌ＪＭ１０９を形
質転換した。

得られた形質転換体中１８クローンについてプラスミド
の分析を行った。すなわち、ラピッド法で調製したプラ
スミドをＢａｍＨＩ及びＮｃｏ　Ｉで分解し、アガロー
スゲル電気泳動にかけ、予想されるＮｃｏ　Ｉ　−Ｂａ
ｍＨＩ断片（０，１８ｋｂ）のバンドの生成を調べた。

その結果、１クローンに目的のバンドが認約られた。ま
た、ダイデオキシ法により塩基配列を決定し、目的の配
列を含むことを確認した。このプラスミドを保持する大
腸菌ＪＭＩ　０９をＢｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ
　ＪＭ１０９／ｐＴＦ７５２０＋ＶＮ−４ｎ、ア。と命
名、表示して、工業技術院微生物工業技術研究所に微工
研菌寄第１１５２６号（ＦＥＲＭ　Ｐ−１１５２６）と
して寄託した。上記菌株を１００μｇ／ｒｎｌアンピシ
リン、！ｍＭＩＰＴＧを含むし一培地中で培養し、菌体
タンパク質を１２，５％５ＤＳ−ＰＡＧＥで分析したと
ころ、分子置駒４５ｋｄにポリペプチドの発現を確認し
た。

更に前述のウェスタンプロット法でインスリン結合性を
！認した。

また、泳ｂパターンをニトロセルロースメンプランに転
写した後、ヒ）ＦＮの細胞接着ドメインを特異的に認識
するモノクローナル抗体・ＦＮ−１０を作用させ、ＦＮ
−１０の前記４５ｋｄポリペプチドへの結合を確認した
。

（３−３）　　ｐＴＦ７５２０＋ＶＮ　Ｉｎ−、、、か
らの介在配列の除去 （３−２）で得たプラスミドｐＴＦ７５２０＋ＶＮ　Ｉ
ｎ−ｔＡＡによって発現される融合ポリペプチドの細胞
接着ドメインＰｒｏ１２１９−３ｅｒ１５’５（２７７
アミノ酸残基）とヒトＶＮのインスリン結合活性部位１
１ｅ３３ＳＪｅｒ３８１１　（５４７ミノ酸残基）の間
にはＭｅｔＧｌｙが付加されており、更に５ｅｒ３８Ｂ
の次にはＺが付加されている。

このペプチドスペーサーに対応するＤＮＡ配列を部位特
異的変異の手法により除去し、Ｐｒ。

２３９３ｅｒ１５１５と１１ｅ３３５３ｅｒ３８１１が
直接結合し、２が付加された融合ポリペプチドを発現す
るプラスミドを得、ｆｌＴＦ７５２０／ＶＮ　Ｉｎ、ア
。と命名した。

更にヒ）ＶＮのインスリン結合活性部位ポリペプチドの
後に付加されている前述のＺのポリペプチドをコードす
るＤＮＡを上記の手法で除去し、ｐ　ｒ　ｏ　＋　２３
９３　ｅ　ｒ　Ｉ　５１５と■１ｅ３３５−８ｅｒ３８
８が直接結合し、かつポリペプチド・Ｚを含まない融合
ポリペプチドを発現するプラスミドを得、本プラスミド
をｐＴＦ７５２０／ＶＮ　　Ｉｎ、ＴＡＡ命名した。

実施例４ ヒトＦＮ細胞接着ドメインポリペプチドとヒト　Ｃｏ１
Ｘ［のインスリン結合活性部位ポリペプチドの融合ポリ
ペプチドのクローニング （４−１）融合ポリペプチドをコードするＤＮＡのクロ
ーニング （２−２）のｐＴＶ　Ｃｏ１ＸＩをＮｃｏ　Ｉ　、　Ｂ
ａｍＨＩで処理し、これを前述ｐＴＦ７５２０のＮｃｏ
　Ｉ　、ＢａｍＨＩサイトに前述の条件でライゲーショ
ンした。これによって構築されたプラスミドをｐＴＦ７
５２０＋Ｃｏ１ＸＩと命名し、次いで該プラスミドを用
い、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。得られた形質転
換体中１８クローンについてプラスミドの分析を行った
。すなわち、ラピッド法で調製したプラスミドをＢａｍ
ＨＩ及びよひＮｃｏ　Ｉで分解し、アガロースゲル電気
泳動にかけ、予想されるＮｃｏ　ＩＢａｍＨＩ断片（０
，５ｋｂ）のバンドの生成を調べた。

その結果、■クローンに目的のバンドが認められた。ま
た、グイデオキシ法により塩基配列を決定し、目的の配
列を含むことを確認した。このプラスミドを保持する大
腸菌ＪＭ１０９をＢｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　
ＪＭ１０９／ｐＴＦ７５２０＋　Ｃｏ１ＸＩと命名、表
示して、工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄
第１１５２７号（ＦＥＲＭ　Ｐ−１１５２７）として寄
託した。

上記菌株を１００μｇ７ｍｌアンピシリン、１ｍＭのＩ
ＰＴＧを含むし一培地中で培養し、次いで培養菌体タン
パク質を１２．５％５ＤＳ−ＰＡＧＥで分析したところ
、分子量５８ｋｄにポリペプチドの発現を確認した。

更に、このポリペプチドのインスリン及びＦＮ−１０へ
の結合性を確認した。

（４−２）　ｐＴＦ７５２０＋Ｃｏ１Ｘ■カらノ介在配
列（７）除去（４−１）で得たプラスミドによって発現
される融合ポリペプチドの細胞接着ドメインＰｒｏ１２
３９Ｓｅｒ”１５（２７７アミノ酸残基）とヒト　Ｃｏ
１Ｘ［のインスリン結合活性部位Ｐｒｏ”’−Ｇｌｙ４
２’（１６７アミノ酸残基）との間にはＮｅｔ−Ｖａｌ
が付加されている。このペプチドスペーサーに対応する
ＤＮＡ配列を部位特異的変異の手法により除去し、ｐｒ
ｏ＋２３１＋　３ｅｒ１５１％とｐｒ０２６１　Ｇｌｙ
４２’７が直接結合した融合ポリペプチドを発現するプ
ラスミドを得、１）ＴＰ７５２０／Ｃｏ１ＸＩと命名し
た。

〔発明の効果〕

以上、述べたごとく、本発明により、細胞接着活性とイ
ンスリン結合活性を合せ持つ新規ポリペプチドが提供さ
れる。このポリペプチドはインスリンと細胞との親和性
を高給ることができ、インスリンを用いることに生化学
的ないし医学的意義が見出せる分野に有用な作用、効果
を示すものであり、特にインスリンの新しい製剤及びド
ラグデリバリーシステムに応用されるものである。

【図面の簡単な説明】

第１図はヒ）ＶＮのインスリン結合活性部位ポリペプチ
ドのアミノ酸配列及び遺伝子配列を示す図、第２図はヒ
ト　Ｃｏ１ＸＩのインスリン結合活性部位ポリペプチド
のアミノ酸配列及び遺伝子配列を示す図、第３図はプラ
スミドｐ’ｒｖ　ＶＮ−Ｉｎ、を示す図、第４図はプラ
スミドｐＴＶ　Ｃｏ１ＸＩを示す図、第５図はプラスミ
ドｐＢＴ　Ｃｏ１ＸＩを示す図、第６図はプラスミドｐ
ＴＶ　ＶＮ−Ｉｎ、ア□を示す図、第７図はプラスミド
ｐＴＦ７５２０＋　ＶＮ−Ｉｎ、　ＴＡＡを示す図、第
８図はプラスミ）’　ｐＴＦ７５２０＋Ｃｏ１ＸＩを示
す図である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、ヒトフィブロネクチンの細胞接着ドメインポリペプ
   チドと、ヒトビトロネクチン若しくはヒトコラーゲンＸ
   I 型のインスリン結合活性部位ポリペプチドが、直接
   又は間接に結合していることを特徴とする人工の機能性
   ポリペプチド。