JPH0454485B2 - - Google Patents

Description

請求の範囲 １ 連続した細孔を有する少くとも１つの膜を有
してなるか或いは少くとも１つのそのような膜か
ら形成された構造体であつて、該膜は平面の、湾
曲した、円筒形の又は小胞状の表面に沿つて延び
且つそれぞれの場合隣接分子、即ち蛋白分子又は
蛋白含有分子、の層の少くとも一つから構成さ
れ、ここで該隣接分子は一緒に結合しそしてこの
結果結晶格子に従つて配列しており、上記のこれ
らの層中には格子に従つて配列した連続細孔が分
子間に開いており、そして、膜は適宜に多孔性の
担体に結合され又は該担体に組込まれ、或いは、
支持されていないフイルムに結合されている、構
造体。

２ その中で蛋白分子又は蛋白含有分子が単層
で、隣接して及び互いに結合して、結晶格子に従
つて配列している膜を特徴とする請求の範囲１の
構造体。

３ その中で蛋白分子又は蛋白含有分子がそれぞ
れ結晶格子に従つていくつかの隣接層に配列し、
そして互いに結合せしめられている膜を特徴とす
る請求の範囲１の構造体。

４ 層中の隣接する蛋白分子又は蛋白含有分子が
非共有結合によつて互いに結合している請求の範
囲１〜３の１つの構造体。

５ 単官能性又は２官能性の異質分子を蛋白分子
又は蛋白含有分子の反応性基に結合させる請求の
範囲１〜４の１つの構造体。

６ 反応性基がカルボキシル基及び／又はアミノ
基及び／又はスルフヒドリル基及び／又はヒドロ
キシル基である請求の範囲５に記載の構造体。

７ 異質分子が同一の反応性の場において本質的
にすべてのこれらの分子に結合している蛋白分子
又は蛋白含有分子の層を有する膜が特徴の請求の
範囲５又は６の構造体。

８ 膜の蛋白分子又は蛋白含有分子が２官能性の
異質分子により分子内的に共有結合で架橋してい
る請求の範囲５〜７の１つの構造体。

９ 同一の膜に属する或いは２つの隣接する又は
隣る膜に属する隣接する又は隣る蛋白分子或いは
蛋白含有分子が適当ならば２官能性の異質分子に
より互いに共有結合的に架橋している膜が特徴の
請求の範囲１〜８の１つの構造体。

１０ 蛋白分子又は蛋白含有分子が適用しうるな
らば２官能性の異質分子によつて担体材料と架橋
している膜が特徴の請求の範囲１〜９の１つの構
造体。

１１ 異質分子が蛋白分子或いは蛋白含有分子間
に開いた膜の細孔域に達する請求の範囲６〜１０
の１つの構造体。

１２ 蛋白分子又は蛋白含有分子及び／又はこれ
に結合する異質分子が解離しうる基を有し、これ
が構造体の使用条件下に解離し、この結果この使
用条件に依存して予じめ決めた電荷を受けること
ができる膜が特徴の請求の範囲１〜１１の１つの
構造体。

１３ 解離しうる基の膜における種類及び／又は
分布に関する限りにおいて、膜の広がりに平行で
ある各表面に関して不斉的に作られている膜が特
徴の請求の範囲１２の構造体。

１４ 連続した細孔を有する少くとも１つの膜を
有してなるか或いは少くとも１つのそのような膜
から形成された構造体であつて、該膜は平面の、
湾曲した、円筒形の又は小胞状の表面に沿つて延
び且つそれぞれの場合隣接分子、即ち蛋白分子又
は蛋白含有分子、の層の少くとも一つから構成さ
れ、ここで該隣接分子は一緒に結合しそしてこの
結果結晶格子に従つて配列しており、上記のこれ
らの層中には格子に従つて配列した連続細孔が分
子間に開いており、そして、膜は適宜に多孔性の
担体に結合され又は該担体に組込まれ、或いは、
支持されていないフイルムに結合されている、構
造体を製造するにあたり、 適当には細胞外被（envelopes）、特に原核細胞
の細胞外被から得られる蛋白分子又は蛋白含有分
子或いはそのような分子の層中に互いに隣接して
結合する分子層の断片を、ある液体、適当にはケ
イオトロピツク（chaotropic）剤、例えばグアニ
ジン塩酸塩又は尿素及び／又は表面活性剤を含有
する夫々液状、適当ならば水性媒体中の溶液又は
懸濁液にし、そして続いて適当にはケイオトロピ
ツク剤及び／又は表面活性剤の濃度を減ずること
により及び／又はPH値を変えることにより、蛋白
分子又は蛋白含有分子及び／又は層断片を自己組
織化させて膜に結合する、即ち蛋白分子又は蛋白
含有分子を結晶格子に従つて隣接して配置し、一
方格子に従う分子間に配置された連続細孔が開い
たままである状態を媒体中に生じさせ、そしてこ
のように生成した膜をそれぞれ担体上に置き、そ
して適当には単官能性及び／又は２官能性異質分
子で処理することにより、膜の蛋白分子又は蛋白
含有分子をその反応性基において置換し及び／又
はこれらの反応性基によつて分子内的に及び／又
は互いに及び／又は担体と架橋させる製造法。

１５ 蛋白分子又は蛋白含有分子及び／又はその
ような分子から作られる層断片の溶液或いは懸濁
液を製造するために、有利には互いに結合し且つ
結晶格子に従つて配列した隣接する蛋白分子又は
蛋白含有分子から形成される、そこでは分子間格
子に従つて配置された連続細孔が開いたままであ
る外部層を有する如き種類の細胞外被の懸濁液を
製造し、適当にはケイオトロピツク剤及び／又は
表面活性剤を添加することにより及び／又は媒体
中のPH値を変えることにより該蛋白分子又は蛋白
該分子或いはこれらの分子からなる層の断片を細
胞外被から分離し、そして細胞外被の残物を媒体
から分離する、請求の範囲１４の方法。

１６ 蛋白分子又は蛋白含有分子或いはこれらの
分子からなる層の断片の分離を、PH値を7.0から
13.0より小さい又はそれに等しい値まで、好まし
くは9.5より小さい又はそれに等しい値まで上昇
させることによつて行なう請求の範囲１５の方
法。

１７ 蛋白分子又は蛋白含有分子或いはこれらの
分子からなる層の断片の分離を、PH値を1.0より
大きい又はそれに等しい値まで、好ましくは2.5
より大きい又はそれに等しい値まで低下させるこ
とによつて行なう請求の範囲１５の方法。

１８ 分離した層断片の膜への自己組織化を誘導
するために行なうべきケイオトロピツク剤及び／
又は表面活性剤の濃度の減少、及び／又は蛋白分
子又は蛋白含有分子及び／又はPH値の変化が透析
を用いて行なう請求の範囲１４〜１７の１つの方
法。

１９ 単官能性及び／又は２官能性異質分子が蛋
白分子又は蛋白含有分子のカルボキシル基、アミ
ノ基、スルフヒドリル基又はヒドロキシル基と反
応する基を示す請求の範囲１４〜１８の１つの方
法。

２０ 蛋白分子又は蛋白含有分子及び／又は層の
断片の、膜への自己組織化が固体と液体の相界面
で起こる請求の範囲１４〜１９の１つの方法。

２１ 蛋白分子又は蛋白含有分子及び／又は層断
片の自己組織化によつて生成した膜がその領域に
おいて実質的にすべてが100μｍより小さい、好
ましくは15μｍより小さい最高寸法を有する請求
の範囲１４〜２０の１つの方法。

２２ 膜の担体への又は担体中への配置を、孔性
担体への沈積によつて行なう請求の範囲１４〜２
１の１つによる方法。

技術分野 本発明は、連続細孔を有する少くとも１つの膜
を含んでなる、或いは該細孔が特に２〜200nｍ
（ナノメータ）の直径の範囲内である構造体に関
する。更に本発明は、この構造体の製造法並びに
該構造体のいくつかの利点のある使用法に関す
る。

背景の技術 ２〜200nｍの直径範囲内の連続した細孔を有
する膜を含む構造体は、例えば異なる分子量を有
する高分子量の有機物質の混合物を分別する又は
濃縮する方法において使用される限界過膜であ
る。現在不斉の（asymmetrical）限外過膜は、
工業的な及び準工業的な目的に対する多くの事例
において使用されている；それらは、膜を通る物
質移動に対して及び分離の選択性に対して不可欠
である、また一般に厚さが100〜200nｍであり且
つ粗い孔性の支持体層を含む非常に薄い分離フイ
ルムからなる。この分離フイルムは種々の重合
体、好ましくはセルコース誘導体又はポリスルホ
ンからなる。そのような限界過膜は相逆転
（phase inversion）膜又は複合膜のいずれかであ
る。相逆転膜においては、均一な重合体溶液を沈
殿剤と接触させ、この時重合体溶液／沈殿剤接触
表面において膜が生成し、この膜において粗い孔
性の支持体フイルムが細かい孔性フイルムに接合
する。複合膜においては分離フイルムと支持体フ
イルムとを別々に製造し、続いて一緒に接合す
る。

公知の限外過膜では、細孔の直径が決つた寸
法を有さずに、平均値付近にランダムに分布す
る。この限外過膜の性質はその保持
（retention）曲線によつて特徴づけられる。この
保持曲線を決定するために、過中の限外過膜
の保持速度（Ｒ）を、種々の分子量（MW）を有
する種々の理想的な試験分子（これらは荷電のな
い状態での球形分子である）に対する％で決定す
る。保持曲線はそれ自体これらの試験値の内挿値
を表わし、保持速度（Ｒ）を分子量の対数〔log
（MW）〕との関係で示す。

第１図は３種の市販されている限外過膜、即
ち −曲線Ａ、ミリポア（Millipore）社（Bedford、
MA、米国）のPSED（ミリポア）膜、 −曲線Ｂ、同一の会社のPSVP1000（ミリポア）
膜、及び −曲線Ｃ、アミコン（Amicon）社（Danvers、
MA、USA）のPM30（アミコン）膜、 に対する保持曲線図を示す。

これらの保持曲線から理解できるように、僅か
に異なる分子量の分子の鋭敏な分離を、これらの
限外過膜を用いて行なうことは可能でない。

限外過膜の性能に対する更なる特性値は、所
謂流速である。これは膜の両側間にかかる設定圧
力差において１m²及び１時間当りに膜を通流する
水の量である。分離フイルムが厚さ約100〜200n
ｍである公知の相逆転膜において、この膜は通流
する水にかなりの抵抗を示す。流速が高いと、膜
の単位面積当りの細孔の数が多くなり、或いは有
効細孔深さ、即ち細孔を形成する通路の長さが短
くなる。限外過膜の更なる重要な性質の特徴は
その化学的及び／又は熱的安定性である。

詳細な記述 本発明は、連続細孔を有する少くとも１つの膜
を含んでなり或いは少くとも１つのそのような膜
からなる構造体を提示するという課題をもつ。こ
こに該細孔は１〜8nｍの直径の範囲内にあり、
またその限外過膜としての使用において僅かに
異なる分子量の分子間で鋭敏な分離が具現化で
き、そしてこの限外過膜を用いれば公知の限外
過膜よりも高流速が達成でき、且つ該膜は良好
な化学的及び熱的安定性を有するものである。

本発明に課せられた課題は、平面の、湾曲し
た、円筒形の、小胞状（vesicular）の表面に沿
つて延びる膜（単数又は複数）がそれぞれの場合
に一緒に結合しそしてこの結果結晶格子に従つて
配列した隣接（contiguous）分子、即ち蛋白分子
又は蛋白含有分子の少くとも１つの層からなり、
この結果これらの層中には格子に従つて配列した
連続細孔が分子間に開いており、また膜が孔性担
体に結合され又は該担体に組込まれ、或いは支持
されていないフイルム中に結合されているという
本発明の構造体において解決される。これらの膜
において、蛋白分子又は蛋白含有分子は単一層に
又はいくつかの隣接する層に、それぞれの場合格
子に従つて配列して有利に結合せしめられる。こ
の時これらの層中の隣接する蛋白分子又は蛋白含
有分子は好ましくは非共有結合によつて互いに結
合する。

本発明の有利な具体例によれば、本発明の構造
体は、単官能性又は２官能性の異質分子が有利に
はカルボキシル基及び／又はアミノ基及び／又は
スルフヒドリル基及び／又はヒドロキシル基であ
つてよい蛋白分子又は蛋白含有分子の反応性基に
結合し、そして有利には蛋白分子又は蛋白含有分
子の層を有し且つその中に異質分子が同一の反応
性部位において本質的にすべてのこれらの分子に
結合している膜を呈すということに特徴がある。

本発明による構造体の更に有利な具体例によれ
ば、膜の蛋白分子又は蛋白含有分子は２官能性の
異質分子を通して分子内的に共有結合的架橋して
いる、及び／又は構造体は同一の膜又は２つの隣
接するもしくは隣る（neighboring）膜に属する
蛋白分子又は蛋白含有分子が適当には２官能性の
異質分子を通して互いに共有結合的に架橋してい
る、及び／又は蛋白分子又は蛋白含有分子は適当
ならば２官能性の異質分子を通して担体材料と架
橋している、ということが特徴である。

本発明の構造体の他の有利な具体例において、
異質分子は蛋白分子又は蛋白含有分子間に作られ
た膜の細孔域に達することが特徴である。

最後の有利な具体例によれば、本発明による構
造体は、蛋白分子又は蛋白含有分子及び／又はそ
れに結合した異質分子が解離しうる基を有し、こ
れが構造体の加工条件下に解離し且つこの結果こ
の加工条件に依存して予じめ決められた電荷を受
けることができる膜によつて特徴づけられる。膜
におけるこれらの解離しうる基の種類及び／又は
分布に関して言えば、これらの膜は有利には膜の
延長方向に平行な各表面に関して不斉的な構造を
している。

本発明は、更に連続細孔を有する少くとも１つ
の膜を含んでなる構造体の製造法及び特に本発明
の構造体の製造法に関する。

この問題は、適当には細胞外被（envelopes）、
特に原核細胞の細胞外被から得られる蛋白分子又
は蛋白含有分子或いはそのような分子の層中に互
いに隣接して結合する分子層の断片を、ある液
体、適当にはケイオトロピツク（chaotropic）
剤、例えばグアニジン塩酸塩又は尿素及び／又は
表面活性剤を含有する水性媒体中の溶液又は懸濁
液にし、そして続いて適当にはケイオトロピツク
剤及び／又は表面活性剤の濃度を減ずることによ
り及び／又はPH値を変えることにより、蛋白分子
又は蛋白含有分子及び／又は層断片を自己組織化
させて膜に結合する、即ち蛋白分子又は蛋白含有
分子を結晶格子に従つて隣接して配置し、一方格
子に従う分子間に配置された連続細孔が開いたま
まである状態を媒体中に生じさせ、そしてこのよ
うに生成した膜をそれぞれ担体上に置き、そして
適当には単官能性及び／又は２官能性異質分子で
処理することにより、膜の蛋白分子又は蛋白含有
分子をその反応性基において置換し及び／又はこ
れらの反応性基によつて分子内的に及び／又は互
いに及び／又は担体と架橋させる、という本発明
の方法で解決される。蛋白分子又は蛋白含有分子
及び／又はそのような分子から作られる層断片の
溶液或いは懸濁液を製造するためには、有利には
互いに結合し且つ結晶格子に従つて配列した隣接
する蛋白分子又は蛋白含有分子から形成される、
但し分子間に格子に従つて配置された連続細孔が
開いたままである外部層を有する如き種類の細胞
外被の懸濁液を製造し、適当にはケイオトロピツ
ク剤及び／又は表面活性剤を添加することにより
及び／又は媒体中のPH値を変えることにより該蛋
白分子又は蛋白含有分子或いはこれらの分子から
なる層の断片を細胞外被から分離し、そして細胞
外被の残物を媒体から分離する。

本発明の方法の有利な具体例によれば、蛋白分
子又は蛋白含有分子の分離は、PH値を約7.0から
13.0より低い又はそれに等しい値まで、特に9.5
より低い又はそれに等しい値まで増加させること
により、或いはPH値を約7.0から1.0より大きい又
はそれに等しい値まで、特に2.5より大きい又は
それに等しい値まで減少させることによつて有利
に行なわれる。

本発明の他の有利な具体例によれば、本発明の
方法は、ケイオトロピツク剤及び／又は表面活性
剤の濃度の減少、及び／又は蛋白分子又は蛋白含
有分子及び／又は分離した層断片の膜への自己組
織化を誘導するために行なうべきPH値の変化が透
析を用いて行なわれることに特徴がある。

本発明による更に有利な具体例において、本発
明の方法は、単官能性及び／又は２官能性異質分
子が蛋白分子又は蛋白含有分子のカルボキシル
基、アミノ基、スルフヒドリル基又はヒドロキシ
ル基と反応する基を示すことが特徴である。

本発明の方法の他の有利な具体例によれば、蛋
白分子又は蛋白含有分子及び／又は層断片の膜へ
の自己組織化は固体と液体の相界面で起こる。

本発明の更に有利な具体例によれば、本発明の
方法は蛋白分子又は蛋白含有分子及び／又は層断
片の自己組織化によつて生成した膜がその領域に
おいて実質的にすべてが100μｍ以下、好ましく
は15μｍ以下の最高寸法を有することが特徴であ
る。

本発明の方法の最後の有利な具体例において、
孔性担体への或いは孔性担体中への膜の配置は担
体上への沈着によつて行なわれる。

最後に、本発明は本発明の構造体の或いは本発
明の方法に従つて製造した構造体の、本発明によ
る次の適用法を含んでなる。すなわち、 −構造体の限外過膜として、或いは気体分離の
分離器官として、或いはイオン交換過程の分離
器官としての利用； −構造体の、その膜の細孔上に広がる他の準透過
性膜の担体としての利用。但し適当にはこれら
の他の準透過性膜は直接に或いは２官能性異質
分子によりカルボキシル基及び／又はアミノ基
及び／又はスルフヒドリル基及び／又はヒドロ
キシル基を通して構造体の膜の蛋白分子又は蛋
白含有分子と架橋している。これらの他の準透
過性の膜は有利にはハイパーフイルトレーシヨ
ン（hyperfiltration）膜、適当には表面活性剤
又は表面活性剤様リポイドのハイパーフイルト
レーシヨン膜、或いはイオン交換過程の分離器
官、或いはパーベーパレーシヨン
（pervaporation）過程の分離器官、或いは溶
液拡散膜であつてよい； −膜を適当には小胞状に成形することによるカラ
ムクロマトグラフイーの分離カラムとしての利
用； −適当には生分解性包装材料として使用できる物
質の外装材料として、或いは経口投与しうる製
薬学的調製剤のカプセル外被剤としての利用。

図面の説明 いくつかの原核細胞、特にいくつかのバチルス
科（Bacillaceae）の細胞外被は外側層を有する。
この層の物質分布は電子顕微鏡で決定されるよう
に、層が結晶構造を有すると結論しうる周期性を
もつている。この外部層は、以下Ｓ層（＝表面
層）と呼ぶが、ケイオトロピツク剤の添加によつ
て細胞外被の下にあるペプチドクリカン
（peptidoclycan）から水性媒体中で分離され、溶
液になる。これらのＳ層は生化学的方法で決定さ
れるように多くの場合に同一の分子、即ち蛋白分
子又は蛋白含有分子からなる。これらのケイオト
ロピツク剤の溶液中の濃度を例えば透析によつて
減ずると、これらの分子から自己組織化によつ
て、元のＳ層と同一の物質分布を示す約10〜15μ
ｍまでの表面寸法をもつ小さな膜の断片が生成す
る。この膜断片を以下Ｐ膜と呼ぶ。更に、ケイオ
トロピツク剤の濃度を再び増大させると、そのよ
うな膜は再度分解し、そして濃度を再度低下すれ
ばＰ膜を再び形成する。従つてＰ膜は隣接し且つ
一緒に結合した、結晶格子に従つて配列する蛋白
分子又は蛋白含有分子から作られ、またＰ膜にお
ける分子の可逆的な溶解及び再組織化の傾向はこ
れらの分子の非共有結合によつて起こるというこ
とが推定される。

予じめ決定された物質分布から、四角、六角又
はだ円であつてよい格子の種類を認識することが
できる。第２〜４図は格子の３つの形を示す。こ
れからは１，１′、及び１″で示される蛋白分子又
は蛋白含有分子の組織化されたＳ層及びＰ膜を想
像することができる。第２図はP4対称性を有す
る四角の格子を示し、第３図はP6対称性を有す
る六角の格子を示し、また第４図はP2の対称性
を有するだ円の格子を示す。電子顕微鏡で決定さ
れるＳ層及び／又はＰ膜の物質分布の情報に基づ
くと、第２〜４図に図的に例示されているよう
に、これらのＳ層及び／又はＰ膜を構成する分子
間に特徴的な形と寸法の連続細孔が存在すると推
定されてきた。この推定は確かめられており、以
下に更に議論されるであろう。

次に第５〜７図の助けを借り、そのようなＰ膜
を用い且つ限外過膜として有利に使用できる組
立てのための構造体の製造を最初の実施例に記述
する。

実施例 １ 本実施例では、細胞外被が細胞質膜、ペプチド
グリカン含有層及びＳ層からなるバチルス・ステ
アロテルモフイルス（Bacillus
stearothermophilus）3c／NRS1536の細胞を用
いた。微生物学ににおいて通常のように、最初に
細胞を超音波処理によつて開裂させ、細胞質膜の
断片を洗剤の助けを借りて崩壊し、そして残りの
細胞膜断片を洗浄によつて細胞に含まれる成分か
らきれいにした。次いで5Mのグアニジン塩酸塩
をケイオトロピツク剤として添加することによつ
て、Ｓ層を水性媒体中においてペプチドグリカン
含有層から分離し、そして溶液にした。次いでこ
の溶液を遠心分離によつてペプチドグリカンの断
片から分離し、透明な溶液を10ｍＭのCaCl₂を含
有する中性の緩衝剤溶液に対して透析した。この
透析の過程で、グアニジン塩酸塩の溶液中の濃度
が実質的に０まで減少し且つCaCl₂の濃度が増加
し、その結果自己組織化によつて、周期性14nｍ
を有する四角形格子（P4対称性）を示し、領域
の最大寸法が約15nｍであり且つ撹拌により水性
媒体中に懸濁状態で保持されるＰ膜が生成した。

限外過膜の製造に対しては、第５図に断面で
示されるような加圧装置２を使用した。これは有
孔焼結板５が配置されている形の底部を含む円筒
形の溝４を有する底部３からなつた；焼結板５の
下の空間は出口通路６を通して出口導管につなが
つていた。この底部部分３の上には、Ｏ−密閉リ
ング８を介してプレキシガラスの円筒形壁９を配
置し、次いでこの壁部分を第２のＯ−密閉リング
１０を介してカバー部分１１に接合した。このカ
バー部分１１には、それぞれ入口導管に或いは加
圧ガス源に対する連結部１３，１４を備えた供給
通路１２を設置した。磁気撹拌装置１５をカバー
部分１１の下側に取りつけた；撹拌装置は撹拌機
１６が円筒形の壁部分９の下端にまで達した。加
圧装置を運転する場合には、底部とカバー部分
を、狭み具によつて１７及び１７′で一緒に保持
した。

限外過膜を製造するために、ククレポア社
（Messrs.Nuclepore、Tuebingen、ドイツ連邦共
和国）製の円形ミクロフイルタ１８を加圧装置中
の焼結板５上に挿入し、製造する限外過膜に対
する担体材料として使用した。このミクロフイル
タ１８は厚さが約10μｍであり且つ孔径0.1μｍの
等しい寸法の孔が全体に存在するポリカーボネー
トフイルムからなつた。次いで上述のＰ膜懸濁液
を、ミクロフイルタ１cm²当り25μｇのＰ膜が懸濁
液中に含有されるような量でカバー部分１１の連
結部１３から注入した。次いで0.5×10⁵Paの過圧
窒素を加圧ガスとして連結部１４から導入し、こ
れによつて懸濁液の液相をミクロフイルタ１８及
び有効焼結板５中を通過させ、Ｐ膜をミクロフイ
ルタ１８上に沈着させた。続いてこの沈着したＰ
膜にグルタルアルデヒドの（0.1Mカコジル酸ナ
トリウム緩衝液、PH7.2中）2.0容量％溶液３mlを
連結部１３から適用した。次いで２×10⁵Paの過
圧をかけ、20℃で20分間にわたりグルタルジアル
デヒドを沈着したＰ膜及びミクロフイルタ１８中
を通過させた。グルタルアルデヒドは両端にカル
ボニル基を有し、この結果２官能性架橋剤とし
て、両εアミノ基が同一の蛋白含有分子に由来す
る時は分子内的に或いは２つのεアミノ基がＰ膜
の２つの異なる蛋白含有分子に由来する時には分
子間的に、Ｐ膜の蛋白含有分子のリシンの２つの
εアミノ基と反応した。

繰返し洗浄した後、ミクロフイルタ１８及び沈
着し且つ架橋したＰ膜からなる限外過膜は本質
的に準備でき、加圧装置２から取り出すことがで
きた。しかしながら、このように製造した限外
過膜を有する加圧装置は、直接限外過装置とし
ても使用することができた。

製造した限外過膜の保持特性を決定する目的
で、この限外過装置を用いて過試験を行なつ
た。この時、試験分子が荷電していない、即ちそ
の等電点（IEP）であるPH値において、一連の試
験分子に対し２×10⁵Paの過圧を窒素によつてか
けた。試験物質としては次の蛋白を使用した。

【表】 第６図はこれらの試験物質の保持速度に対する
試験値から内挿した保持曲線図を示す。この保持
曲線はスブチリシンとオバルブミンの保持速度の
間で鋭い分子量のカツト・オフ（cut−off）を示
す。この保持曲線は、Ｐ膜が均一な寸法の連続細
孔を有することも証明している；保持曲線の形に
基づくと、孔の寸法は４〜5nｍであると推定さ
れる。

この限外過膜を用いて２×10⁵Paの膜過圧で
決定した流速は約480／時・m²であつた。しか
しながら流速は沈着したＰ膜の量に依存する。即
ちそれは沈着したＰ膜量50μｇ／膜表面積cm²の場
合220／時・m²の値まで低下した。

この方法で製造した限外過膜は、更に詳細に
以下に説明する更に有利な性質を有する。

遊離のアミノ基とカルボキシル基は、その周囲
の水性媒体のPHに依存して異なる具合にＳ層断片
又は架橋してないＰ膜の電気的な真の荷電に寄与
した。9.0より小さいPH値まではアミノ基が正の
荷電を与え、またカルボキシル基はPH2.0以上の
範囲において負の荷電を与えた。あるPH値におい
て、即ちその等電点（IEP）においては、負と正
の荷電は互いに相殺し、Ｓ層断片及びＰ膜は見か
けは電気的に中性であるように見えるであろう。
本実施例では、Ｐ膜の電位的に正に荷電する基
は、グルタルアルデヒドの、Ｐ膜の蛋白含有分子
のリシンのε−アミノ基との反応によつて失なわ
れ、この結果架橋したＰ膜のIEPは酸性範囲に移
行し、PH2.0より小さい値を有した。架橋したＰ
膜の負の真の荷電は、多くの場合生理学的条件で
の過において、膜の細孔の閉塞に対する効果的
な保護となる。

第７図は本実施例で製造した限外過膜を、図
式断面により部分的に示す。連続孔１９を備えた
ミクロフイルタ１８の表面上に、２０で示される
Ｐ膜が沈着され、架橋によつて固定されている。
この結果それはＰ膜量の全表面が限外過膜の表
面の約２〜３倍に等しいような量で適用され、従
つてＰ膜は平均して約２層に重なり、部分的に更
に重なるようになる。

実施例 ２ 本実施例では、実施例１の方法と違つて、バチ
ルス・ステアロテルモフイルスpV72の細胞を用
いて行なつた。この場合にも細胞外被は細胞質
膜、ペプチドグリカン含有層及び蛋白含有分子の
Ｓ層からなつた。実施例１に記述したものと同様
に、細胞外被からＰ膜の懸濁液を調製した。この
バチルス属の細胞外被のＳ層及びＰ膜は周期性
18nｍを有する六角格子構造（P6対称性）を示
す。

限界過膜として有用な構造体を製造するため
に、厚さ150μｍの、ポール社（Messrs.Pall、
Cortland、USA）製のウルチポール（Ultipor）
n₆₆T型の円形型のナイロン製ミクロフイルタを
加圧装置２中に挿入し、担体として使用した。こ
のミクロフイルタは１：１の比で遊離のアミノ及
びカルボキシル基を有した。実施例１の方法と同
様に、Ｐ膜の懸濁液を、ミクロフイルタの面積１
cm²当り30μｇのｐ−膜が懸濁液に含まれるような
量でミクロフイルタに適用し、そしてＰ膜を２×
10⁵Paの膜過圧の適用下にミクロフイルターのス
ポンジ様構造体上及び構造体中に沈着させた。

第８図は、不規則なスポンジ構造を有し且つ孔
の寸法が平均値付近にランダムに分布して孔の開
いているミクロフイルタ２１を部分的断面図で示
す。沈降したＰ膜２０も示されている。そして２
×10⁵Paの過圧下において、４℃で60分間、0.1％
ジメチルスベリミデート溶液（1Mトリエタノー
ルアミン緩衝液、PH9.5）１mlをＰ膜２０及びミ
クロフイルタ２１中を通過させた。２官能性イミ
ドエステルとしてのジメチルスベリミデートは、
アルデヒドと同様にＰ膜の蛋白含有分子のリシン
のε−アミノ基と分子内及び分子間的に反応し、
並びにナイロンミクロフイルタ材料のアミノ基と
主に反応にした。繰返し洗浄後、限外過膜は使
用できる状態になつた。

第９図はこの限外過膜の保留曲線図を示す。
これは実施例１に記述した膜と同様に鋭い分子量
のカツト・オフを示した。

ジメチルスベリミデートのε−アミノ基との反
応中に生成するアミジンはリシンのε−アミノ基
と同様の具合に正の荷電を生成し、Ｐ膜の自然の
真の荷電は架橋によつて殆んど変化を受けなかつ
た。

限外過膜として有利に使用しうる上記実施例
１及び２に記述したＰ膜を含む構造体は、２官能
性の異質分子での架橋により高い化学的、熱的及
び機械的安定性を有した。特にそれは蛋白分解に
対して安定であり、それはオートクレーブで取り
扱うことができ、また酸及びアルカリ性媒体（PH
１〜13）中において並びに高濃度のケイオトロピ
ツク剤（5Mグアニジン塩酸塩、8M尿素）と一緒
に使用することもできた。Ｐ膜を含む構造体の重
要な性質はケトン、アルコール及び塩素化炭化水
素のような有機液体に対する耐性であつた。

限外過膜の所望の細孔直径は使用する微生物
を選択することによつて本質的に得られる。それ
はその細胞外被は意図する凡その細孔直径の細孔
を有するＳ層を含むからである。次いで所望の細
孔直径はＰ膜の細孔の領域に達する異質分子の添
加によつて変えることができる。これを以下に更
に議論する。

１つの分子層からなるＰ膜は約５〜20nｍの層
の厚さと１〜8nｍの範囲の細孔直径を示す。

Ｐ膜懸濁液の製造に関して、ケイオトロピツク
剤及び表面活性剤の選択により、Ｓ層断片は細胞
外被断片のペプチドグリカン含有層から単純に分
離され、或いはＳ層断片は崩壊して、溶液になつ
た。例えば2.5Mグアニジン塩酸塩での処理によ
つてＳ層断面の分離だけが得られるならば、Ｓ層
の崩壊は個々の蛋白分子又は蛋白含有分子間の結
合の破壊により5Mグアニジン塩酸塩を用いて達
成できた。Ｓ層の崩壊はＳ層を含む溶液のPH値を
実質的に変えることにより、例えばPH値を約7.0
から2.5へ低下させることにより或いはいくつか
の場合によりPH値を7.0から9.5へ増加させること
により達成することもできた。

自己組織化によつて生ずるＰ膜の表面は形が平
面でも、湾曲していても、円筒形でも、或いは小
胞状でもよい。実施例１及び２によれば、表面が
本質的に平面のＰ膜を使用した。

実施例10及び11はＰ膜２０′が小胞状形である
実施例１及び２に記述した構造体の変化を示す。

第１２図は小胞状及び平面形のＰ膜それぞれ２
０及び２０′を用いて製造した実施例２による構
造体の更なる変化を示す。この製造法では小胞状
のＰ膜を主に孔中に沈着させ、一方平面形のＰ膜
を主にミクロフイルタ２１の表面上に沈着させ
た。

Ｐ膜の架橋に対するいくつかの更なる例は下記
の通りである。

−ヘキサメチレンジイソシアネート はＰ膜において好ましくはアミノ基と、そして
それが飽和された後ヒドロキシル基と反応し、
斯くして両方の官能基により分子間架橋が起こ
りうる。例えばヘキサメチレンジイソシアネー
トを５％テトラヒドロフランを含む１％溶液
（トリエタノールアミン塩酸塩、PH8.0）中で使
用した。この反応時間は例えば20℃で４時間で
あつた。

−Ｎ，N′−ジヨードアセチル−ヘキサメチレン
ジアミン は他の２官能性アルキルハライドと同様にＰ膜
においてスルフヒドリル基を攻撃するが、適当
な反応条件下にはそれはアミノ基も攻撃した。
しかしながら中性又は弱アルカリ性媒体中にお
いて、この架橋剤はスルフヒドリル基に特定さ
れる。架橋に対して、N′，N′−ジヨードアセ
チル−ヘキサメチレンジアミンを好ましくは
0.5％の溶液（0.1M酢酸ナトリウム緩衝剤、PH
7.2）で使用した。反応時間は４℃で３時間で
あつた。

−１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）−カルボジイミド塩酸塩（EDC） EDCのようなカルボジイミドは酸性媒体中
においてＰ膜のカルボキシル、スルフヒドリル
及びヒドロキシル基と反応した。スルフヒドリ
ル基は、反応に関与させないならば前もつて保
護しておかなければならなかつた。カルボキシ
ル基をEDCで処理することによりＰ膜のpK値
はアルカリ性範囲に移行した。例えば蒸留水
（0.02N NaOH、PH8.0）中00.1M EDCを室温
で18時間放置して反応させた。

異質分子の、Ｐ膜の蛋白分子又は蛋白含有分
子への付加に対するいくつかの例を下に示す。
ここにこの異質分子は架橋せしめたＰ膜の細孔
の寸法に適度に影響する： −孔性担体例えばミクロフイルタ上に沈着させた
Ｐ膜を、ポリカチオン化フエリチンの溶液
（H₂O1ml中ポリカチオン化フエリチン5μｇ）
でコーテイングし、５分間20℃に保つた。電子
顕微鏡で決定されるように、１つのフエリチン
分子はこれらの条件下に静電相互作用により各
蛋白分子又は蛋白含有分子と結合した。実施例
１に記述した方法と同様の、グルタルジアルデ
ヒドとの続く架橋により、フエリチン分子は共
有結合的にＰ膜に結合した。

−担体に適用したＰ膜を四酸化オスミウムの１％
溶液でコーテイングし、30分間20℃に保つた。
過剰な溶液を洗い出した後Ｐ膜中に化学的に結
合したオスミウムを電子顕微鏡によつて及びＸ
線ミクロ分析の助けを借りて確認した。次いで
Ｐ膜の架橋を実施例１に従つて行なつた。

−担体に適用したＰ膜を２官能性の架橋剤で処理
した。この架橋剤の橋架けの長さはＰ膜の細孔
の直径の寸法に近かつた。次の物質が種々の橋
架け長の２官能性架橋剤として考慮することが
できた： タートリル−ジ−（グリシラジド）
（TDGA）：橋架け長1.3nｍ タートリル−ジ−（ε−アミノカプロイルア
ジド）（TDCA）：橋架け長2.3nｍ ビス−メチル−３，８−ジアゾ−４，７−ジ
オキソ−５，６−ジヒドロキシデカンビスイミ
デート（DEBE）：橋架け長1.4nｍ、 ビス−メチル−４，９−ジアゾ−５，８−ジ
オキソ−６，７−ジヒドロキシドデカンビスイ
ミデート（DOBE）：橋架け長1.7nｍ −TDGA又はTDCA、DEBE又はDOBE（1Mト
リエタノールアミンを含む蒸留水中0.01M、PH
8.0）の反応を４℃で１時間又は20℃で30分間
行ない、架橋を実施例１に従つて行なうことが
できた。

実施例 ３ 本実施例では、本発明の方法の変化を記述す
る。即ち大きい表面範囲、特に100μｍまでの寸
法を有していてよい且つ単一層Ｐ膜からなるＰ膜
から層を製造した。これに対し、実施例１に記述
した如く且つバチルス・ステアロテルモフイルス
3c／NRS1536の細胞外被から得たＰ膜から懸濁
液を製造した。このバチルス属の細胞外被のＳ層
はこのＳ層を形成する蛋白含有分子（糖蛋白）の
炭水加物残物がさらされている細胞の外側に隣る
表面において電気的に中性であり、一方それは他
の表面において負の真の荷電を有した。上述のＰ
膜の溶液は更に層の遊離の蛋白含有分子も含有し
た。実施例１でも使用したような特に平滑な表面
を有するミクロフイルタを、その１つの表面に対
しアルシアン・ブルー（Alcian Blue）の溶液
（蒸留水中0.1％）で処理し、次いで乾燥した。こ
のアルシアン・ブルーは中性媒体中において、ミ
クロフイルタの表面上に正の荷電を生成した。次
いでこのミクロフイルタに、Ｐ膜の溶液を軽く撹
拌しながら適用した。次いで正の表面荷電に誘導
されて、ミクロフイルタ表面のいくつかの領域に
おいて依然溶液である蛋白分子又は蛋白含有分子
のＰ膜への自己組織化が起こり、これによつて一
方でＰ膜の負に荷電した側が正に荷電したミクロ
フイルタ表面に隣接し、一方で普通10μｍの最大
表面寸法を有することができた。そして懸濁液中
のＰ膜はその負に荷電した面でもつて、好ましく
はミクロフイルタ表面の依然あいている領域に隣
接した。このように生成せしめたＰ膜層を安定化
させるために、これを実施例１に記述したものと
同様の方法で架橋させた。

第１３図は有利には限外過膜として使用でき
る、ミクロフイルタ２１及び自己組織化によつて
固体と液体の相界面で生成したＰ膜を含む上述の
ように製造した構造体を、表面を拡大した部分的
断面図で示す。これを限外過膜として適用する
場合、製造した構造体は実施例１で製造した構造
体と同一の鋭い分子量のカツト・オフと保持特性
を有した。

全く一般的には、また実施例１〜３に記述した
方法を一部変えることにより、Ｐ膜層を生成させ
る担体表面として他の層例えばペプチドグリカン
含有層、プソイドムレイン層、脂質層、重合体
層、ゲルなども使用できた。これらの層が連続孔
を有し、その孔の寸法がＰ膜のそれより大きい場
合、それらはＰ膜層に対する永久担体として使用
することができ、或いはそれらはＰ膜層の生成後
に例えば有機溶媒によつて除去される補助膜でも
あり得た。補助層から分離したＰ膜層は、適当に
は共有結合での架橋後に本発明の構造体の意図す
る用途に対する必要条件に良く合つた最終担体に
適用することができ、次いで適当にはこれらを共
有結合的に架橋させることもできた。

「担体表面」の表面特性例えばその親水性又は
疎水性、及び／又は「担体表面」上の真の荷電及
び荷電分布は、実施例３の方法と同様に、Ｐ膜及
び／又は蛋白分子又は蛋白含有分子の「担体層」
への配向した結合を可能にし、従つてＰ膜層の生
成を可能にする。これらの表面の性質は、中でも
「担体表面」と蛋白分子又は蛋白含有分子との間
の結合強度が、この「担体表面」上で起こるこれ
らの分子のＰ膜への自己組織化を妨害しない位に
弱いというようなものであるべきである。これは
結晶格子にいくつかの乱れをもつＰ膜の生成にと
つて重要である。

上述の実施例及びその変化は、蛋白分子又は蛋
白含有分子が互いに単一層に結合したＰ膜を有す
る構造体に関するものであつた。第１４図は本発
明の構造体の更なる変化を図式的部分断面図で示
す。これでは、実施例２に使用したような孔性ミ
クロフイルタ上にＰ膜層が適用され、Ｐ膜層が蛋
白分子又は蛋白含有分子の２つの層２３，２３′
の、鏡面的具合に形成されたＰ膜２２からなつて
いた。これらの２つの分子層２３，２３′の各は
その内側と外側で異なる表面形態を有し、２つの
層２３，２３′が低い自由エネルギーの配置で互
いに適当に結合した。２つの層２３，２３′は、
Ｐ膜２２とミクロフイルタ２１の場合と同じよう
に他のもので更に共有結合的に架橋させることが
できた。

商業的重要性 本発明の構造体は、限外過膜としての用途の
他に、気体分離の分離器官として或いはイオン交
換過程の分離器官として有利に利用することもで
きる。

更に有利な用途では、本発明による構造体は、
構造体のＰ膜の細孔上に延びる他の準透過性膜に
対する担体として役立つ。これらの他の準透過性
膜は、ハイパーフイルトレーシヨン膜、特に単分
子又は２分子ハイパーフイルトレーシヨン膜であ
つてよい。そのようなハイパーフイルトレーシヨ
ン膜、特に表面活性剤又は表面活性剤様リポイ
ド・ハイパーフイルトレーシヨン膜は一般に厚さ
が２〜6nｍにすぎず、特にこわれやすい。ハイ
パーフイルトレーシヨン膜は、海水の脱塩、下水
処理、有機液体の混合物の分離、特にパーベイパ
レーシヨンによる炭化水素の分離或いはキラルな
分離層による光学的対掌体の分離、の分野におい
て特に利用される。

第１５図は本発明の構造体の部分断面図を示
す。この製造法は実施例２（第８図参照）に記述
した通りであり、Ｐ膜層２４の上にハイパーフイ
ルトレーシヨン膜２５が適用される。本発明によ
る構造体をハイパーフイルトレーシヨン膜の担体
として利用する場合、その過又は分離作用はハ
イパーフイルトレーシヨン膜によつて本質的に決
定される。Ｐ膜層２４における欠陥、例えば小さ
な孔などは必ずしも問題とならない。架橋された
Ｐ膜層は、もろいハイパーフイルトレーシヨン
膜、特に架橋された単層がしつかりと配置され或
いは分離しうるように、通常の限外過膜の担体
層の細孔及び粗い表面にハイパーフイルトレーシ
ヨン膜を広げ且つ細孔を満すのに十分な機械的強
度を有するから、該ハイパーフイルトレーシヨン
膜の担体として特に適当である。更にＰ膜層は十
分に薄く且つ高い孔性を有していて、ハイパーフ
イルトレーシヨン膜との組合せにおいて適度に高
い流速を保証する。

Ｐ膜層の特に平滑な表面は特に次の方法で製造
される。実施例１に記述したものと同様に、Ｐ膜
層を非常に表面の平滑なポリカーボネート上に生
成せしめ、架橋させる。次いでこのポリカーボネ
ート担体をクロロホルムに溶解し、これによつて
接着した厚さ５〜100nｍのＰ膜層を残し、次い
でこれを、その元の非常に平滑な底部面を上にし
て他の孔性担体上に付着させる。このＰ膜層の非
常に平滑な表面上にハイパーフイルトレーシヨン
膜を付着させ、適当にはＰ膜層と架橋させる。

Ｐ膜層とハイパーフイルトレーシヨン膜の化合
物は、「担体表面」として役立つ決つた表面の真
の荷電を有するハイパーフイルトレーシヨン膜上
に、例えば実施例３に記述したものと同様にＰ膜
層を生成し、そしてこれをハイパーフイルトレー
シヨン膜と適当に架橋することでも製造できる。

ハイパーフイルトレーシヨン膜とＰ膜層との間
の共有結合的架橋に対しては、中でもカルボキシ
ル、ヒドロキシル、アミノ及びスルフヒドリル基
が関与する反応を考慮しうる。糖残基を有する糖
蛋白及び単層ハイパーフイルトレーシヨン膜のＰ
膜の場合には、炭水化物の化学反応も使用でき
る。

Ｐ膜層とハイパーフイルトレーシヨン膜の被合
物は、更なるハイパーフイルトレーシヨン膜又は
Ｐ膜層に対する担体又は「担体表面」としても更
に役に立つ。そのような多層複合物は単層の平面
において或いは単層間において共有結合により架
橋させることもできる。２つのハイパーフイルト
レーシヨン膜がＰ膜層の両側にあるサンドウイツ
チ複合物の製造は、そのようなサンドウイツチ複
合物の挙動に実質的に影響しうる異質分子例えば
酵素又は荷電担体を中間に存在させることを可能
にする。

上述の複合物又は多層複合物は、有利には閉じ
た小胞の形をとることもできる。その製造には、
ハイパーフイルトレーシヨン膜又はＰ膜層からな
る「出発小胞」を原料とするとよい。

更なる有利な用途において、本発明の構造体は
カラムクロマトグラフイーの分離カラムとして使
用される。第１６図はそのようなクロマトグラフ
イーのカラム２６を図式断面図で示してある。カ
ラムには、適当に分子内又は分子間架橋されたＰ
膜２０′の、内径１〜3μｍの小胞が充填されてい
る。分離すべき物質をカラムの上部から供給す
る。この物質を通流し且つ流出させた後、より大
きい分子はより小さい分子よりも速くクロマトグ
ラフイーカラムの低端に現われる。このクロマト
グラフイーはＰ膜の細孔径の範囲において鋭い分
画を示す。

有利な変化によると、分離カラムを通る流速
は、Ｐ膜の小胞２０′を形態的に限定された且つ
機械的に安定な凝集体に共有結合的に架橋して組
合せることで増加させることができる。これらの
凝集体を製造するために、Ｐ膜の小胞の濃密なペ
レツト（沈降物）に薄層に急速冷凍し、液体窒素
のもとで小断片に粉砕し、続いてメタノール及び
グルタルジアルデヒドの混合物中において例えば
−80℃で凍結交換し、この温度でグルタルジアル
デヒドにより架橋を起こさせる。このように製造
した凝集体は更に粉砕して、寸法を統一し、特別
な寸法の凝集体だけを分離カラムの充填に使用す
ることもできる。更にカラムに充填する前後のい
ずれかにおいて、凝集体を緩衝剤中に移してもよ
く、及び／又は凝集体を化学的に又は酵素的に変
化させてもよい。

最後の有利な用途では、本発明による構造体
を、多種類の物質の包装材料として使用する。こ
の包装材料は、前述したように補助層又は「担体
表面」上に作られ、補助層が適当に除去された架
橋したＰ膜層であつてよい。このように製造した
フイルムは包装材料として有利に使用することが
でき、またそのままで適当に生分解性であるとい
う利点をもつている。但しこの分解速度は共有結
合による架橋の種類及び程度によつて影響させる
ことができる。

この種のＰ膜層は、最後に経口投与される製薬
学的調製剤に対するカプセル外被としての用途が
あることもわかつている。この結果、消化管での
分泌において蛋白分解によつてだけ所望の内容粉
の分解が引き起こされる。外被膜のＰ膜層の選択
的な化学変化により、その分解速度、従つてカプ
セル内容物の放出時間が決定できる。カプセル内
容物の放出はＰ膜層の溶剤前にもすでに起こりう
る。これに対しては細孔の寸法によつて対処でき
る。更にPHの影響によつても放出を誘導すること
ができる。