JPH0473749B2

JPH0473749B2 -

Info

Publication number: JPH0473749B2
Application number: JP18201586A
Authority: JP
Priority date: 1986-08-04
Filing date: 1986-08-04
Publication date: 1992-11-24
Also published as: JPS6338164A

Description

【発明の詳細な説明】

＜産業上の利用分野＞本発明は抗体タンパクの固定化方法に関する。
更に詳しくは、水溶性抗体タンパクを、その抗原
−抗体反応活性を完全に保持しながら固体基板上
に該タンパクを高密度に固定化する方法に関す
る。＜背景及び従来技術＞抗体タンパクの抗原−抗体反応を利用した診断
技術に於て、抗体タンパクを固体基板上に固定化
する方法がこれまで数多く提案されてきた。これ
らの内、あるものは、抗体タンパクのアミノ基又
はカルボキシル基と反応又は吸着結合できる官能
基を有する固体表面に固定化するものであるが、
この場合、固定化のための反応条件の設定によつ
ては、抗体タンパクの変性や、非特異的反応によ
る活性部位の失活が起りやすいという問題点があ
つた。また、親水性ゲルの中に抗体タンパクを抱
き込ませて、固体基板上に固定化する方法も可能
性のある方法であるが、この場合、抗原タンパク
がゲル中の抗体タンパクに接近でき難くなり、抗
原抗体反応を利用した診断材料としての感度低下
を招き易い。こうした方法に対して近年、水面上
に脂質膜を展開し、これに水中から水溶性酵素
（例、カタラーゼ、フエリチン、ヘミグロビン、
グルコースオキシダーゼ、etc.）や抗体タンパク
［免疫グロブリンＧ（IgG），IgE，etc］を吸着固
定化する試みが報告されている［バイオキミカ・
エト・バイオフイジカ・アクタ（Biochem.Bio−
phys.Acta.）225巻、382（1971）やジヤーナル・
オブ・セルラー・バイオケミストリー（J.Cell.
Biochem.）29，239（1985）等参照］。これらは確かにタンパクを、その活性を保持し
たまま固定化する優れた方法であるが、この方法
に於て従来用いられてきた脂質膜は、ステアリン
酸、アラキン酸及びジパルミトイルホスフアチジ
ルコリン（DPPC）等の如く、水に対して可溶性
（少くとも、1μg／１水の溶解度）のもの、又
は水中で二分子膜ベシクルを形成しやすいもの
（DPPC等）であつた。従つて、水面上で該膜に
吸着された抗体タンパクは、時間が経つにつれ、
脂質膜と共に再び水中に再溶解したり、一旦固体
基板上に累積した後でも抗原水溶液に浸浸した
際、脱離しやすいという問題点を有していた。＜発明の目的＞本発明者らは、かかる従来技術の欠点を克服
し、高い抗原−抗体反応活性の保持率と、高密度
な抗体タンパクの固定化を可能にすべく鋭意検討
の結果、本発明に到達したものである。＜発明の開示＞すなわち本発明は、水相面上に展開された水不
溶性ポリ（オレフイン−無水マレイン酸）単分子
膜に当該水相中に溶解した水溶性抗体タンパクを
接触させることにより当該水相界面で抗体タンパ
ク−単分子膜複合体を形成させ、それを固体基板
上に積層することを特徴とする抗体タンパクの固
定化方法であり、就中、当該ポリ（オレフイン−
無水マレイン酸）がポリ（オクタデセン−無水マ
レイン酸）である上記抗体タンパクの固定化方法
である。本発明でいう抗体タンパクとは、抗原−抗体反
応を起しうる水溶性タンパクの総称であり、その
分子中に抗原認識部位（Fabと略）と疎水性末端
部位（Fcと略）を有している。かかる抗体タンパクの具体例としては、免疫グ
ロブリンＧ（IgGと略称）、IgE，IgM及びこれら
の抗体、絨毛性性腺刺激ホルモン（HCG）抗体、
ガン胎児性抗原（CEA）抗体等があげられる。これらの抗体タンパクの固定化にあたつては、
Fab部分を変性しないようにすることが肝要であ
るが、前述の如く従来の化学反応による固定化の
場合Fab部分も反応に関与して抗体タンパクの活
性低下を招いていた。本発明においては抗体タン
パクは、後述のポリ（オレフイン−無水マレイン
酸）単分子膜の酸無水物基（これは水面下に規則
的に並んでいるものと考えられる）に水中からア
ミノ基を介して、例えば反応等による固定化を起
すものと考えられ、従来の化学反応固定法に比べ
位置特異的に固定化が進行する。また、該単分子
膜の圧縮圧力の制御により、膜中にとりこまれる
抗体タンパク量の制御も容易に行える。また、そ
のような抗体タンパクは色素やケイ光ラベル化剤
又は酵素等で修飾した後に本発明に用いることも
できる。上記の抗体タンパクを固定化するための単分子
膜としては、水不溶性でかつ単分子膜を形成しう
る下記のくり返し単位を有するポリ（オレフイン
−無水マレイン酸）が用いられる。（但し、式中Ｒは炭素原子数８〜20の炭化水素
基を表わし、ｎは２〜10000の整数を表わす）前記の共重合体は、ベンゼンやクロロホルム等
の有機溶媒に溶解させ、0.5〜1.5ミリモル／の
溶液となしたのち、これを蒸留水又は多価金属塩
（例えば、塩化バリウム、塩化カドミウム、塩化
アルミニウム）を含む、PH6.5〜7.5の水溶液表面
上に展開することにより、単分子膜となしうる。
次いで、該単分子膜を、その表面圧力が１〜
30mN（ミリＮ）／ｍになるように圧縮したのち、
そのままの圧縮条件で膜面下の水相に前記の抗体
タンパクを注入する。所定時間（通常、30分〜１
時間）、該免疫タンパクと水面上の単分子膜とを
接触させておくことにより、タンパクと該単分子
膜との複合化が完了する。この時点で抗体タンパ
クとポリマ−単分子膜との複合体膜を、表面圧力
30〜50mN／ｍにて再び圧縮したのち、固体基板
上にラングミユア・ブロジエツト法又は水平付着
法（詳細は新実験化学講座第18巻第439頁参照）
により一層又は複数層積層する。その際の抗体タンパクの固体基板上への固定化
量は、積層時の水面展開膜の基板への転移比及び
UV−吸収スペクトル強度より算出される。かくして得られた基板上の複合体は、抗体タン
パクの抗原−抗体反応活性を酵素免疫診断法
（FIA）により求めた結果、すぐれた活性を示す
ものであつた。以下、実施例により本発明を更に詳しく説明す
る。実施例１ポリ（オクタデセン−１−無水マレイン酸）
（以下［PA−18］と略す）４mgを25mlの蒸留クロ
ロホルムに溶解し、562cm²の水槽表面積を有する
表面圧−面積曲線（以下π−Ａ曲線と略す）測定
用水槽に張つた塩化バリウム３×10^-5Ｍ、炭酸水
素カリウム４×10^-4Ｍの混合水溶液上に、ウルト
ラマイクロピペツトを用いて、上記溶液250μ
を徐々に滴下した。それぞれ１，10，20又は
30mN／ｍの表面圧まで仕切板を移動させること
により圧縮した後、水流からヒトIgG水溶液を濃
度0.02mg／mlになるまで注入するという四種の実
験を行つた。１時間静置した処、いずれの場合も
表面圧の増加が認められ（表−１参照）、ヒト
IgGの吸着が示唆された。

【表】実施例２実施例１と同様にして水面上に展開したPA−
18を30mN／ｍの表面圧下で圧縮しながら水中か
らヒトIgG水溶液を濃度0.1mg／mlになるように注
入した後、１時間静置した。この水面展開膜を疎
水化処理（シランカツプリング処理）を施した石
英板上に水平付着法によつて１層転写した。次いで、この転写膜にペルオキシターゼ標識抗
ヒトIgG抗体（20μ／ml）液を作用させた後、
オルトフエニレンジアミン−過酸化水素混合溶液
中に浸浸した処、呈色（褐色）が認められ、転写
膜中のヒトIgGの抗原活性が保持されていること
がわかつた。

Claims

【特許請求の範囲】１水相面上に展開された水不溶性ポリ（オレフ
イン−無水マレイン酸）単分子膜に当該水相中に
溶解した水溶性抗体タンパクを接触させることに
より当該水相界面で抗体タンパク−単分子膜複合
体を形成させ、それを固体基板上に積層すること
を特徴とする抗体タンパクの固定化方法。２当該ポリ（オレフイン−無水マレイン酸）が
ポリ（オクタデセン−無水マレイン酸）である特
許請求の範囲第１項記載の抗体タンパクの固定化
方法。