JPH0454648B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は新規なフイブリン吸着性蛋白−ウロキ
ナーゼ複合体を有効成分とする血栓症治療剤に関
する。 血栓溶解酵素ウロキナーゼは、血栓症治療剤と
して広く臨床で使用されているが、血栓を構成し
ている蛋白成分であるフイブリンに対して、ウロ
キナーゼは、吸着性を有しておらず、また静注さ
れたウロキナーゼは速やかに代謝排泄されてしま
う等のために、インビトロ（in vitro）の活性か
ら期待されるほどの治療効果が得られていない。
このため、欧米等においては該ウロキナーゼの大
量投与が行なわれているが、この場合、全身的に
プラスミノーゲンの活性化を引き起こし、フイブ
リノーゲンの分解等による出血傾向等の副作用も
大きい。また流血中にはα₂−プラスミンインヒビ
ター（α₂−Plasmin Inhibitor）やα₂−マクログ
ロブリン（α₂−Macroglobulin）等のブラスミン
阻害剤が多量に含まれており、ウロキナーゼのプ
ラスミン活性化（生成）による血栓溶解作用を阻
止している。 この様な観点から本発明者らはフイブリンに吸
着性のある蛋白をウロキナーゼに結合させて、ウ
ロキナーゼにフイブリン結合性を付与することが
できれば、ウロキナーゼはその治療目的である血
栓に吸着され、代謝排泄されにくくなり、血中半
減期の延長が期待され、又フイブリン上では上記
したプラスミン阻害剤の作用を受けにくくなり治
療効果の増大が期待され、更に血栓存在部位で局
所的にプラスミノーゲンが活性化されるため出血
傾向等の副作用の軽減が期待されるという着想か
ら、上記フイブリンに吸着性を有するウロキナー
ゼを得ることを目的として鋭意研究を重ねた。そ
の結果、フイブリン吸着性蛋白としてプラスミン
由来のヘビーチエイン（以下これを「プラスミン
HC」とする）を使用し、これを特定の蛋白結合
試薬を介してウロキナーゼと結合させて得られる
複合体は、フイブリン吸着能を有し、また所望の
ウルキナーゼ活性を具備し新規な血栓溶解剤とし
て有効であることを見い出した。本発明はこの新
しい知見に基づいて完成されたものである。 即ち、本発明はフイブリン吸着性蛋白とウロキ
ナーゼとを、一般式 〔式中Ｒはフエニレン基又はシクロアルキレン基
を、Ａは低級アルキレン基を、Ｂは置換基として
低級アルキルチオ基又はフエニル低級アルキルチ
オ基を有することのある低級アルキレン基を、
ｌ、ｍ及びｎは各々０又は１を示す。但しｌ、ｍ
及びｎは同時に０であつてはならない。〕 で表わされる蛋白結合試薬の存在下に反応させて
得られるフイブリン吸着蛋白質−ウロキナーゼ複
合体を有効成分として含有することを特徴とする
血栓症治療剤に係る。 本発明血栓症治療剤において有効成分とする上
記複合体は、血栓溶解剤としてウロキナーゼ単独
に比し、より少量の使用で血栓部位に選択的（局
所的）に作用し、代謝排泄が遅延され、しかもプ
ラスミン阻害剤による影響が少なく、充分な血栓
溶解作用を持続発現し得ると共に、全身性の出血
傾向等の副作用も少なく、非常に有効である。本
発明はかかる血栓溶解剤を確立するものであり、
医療品業界、その他の分野において大きく貢献す
るものである。 本発明有効成分化合物において、蛋白結合試薬
として利用する上記一般式〔〕で表わされる化
合物においてＲで示される、フエニレン基として
は、ｏ−フエニレン、ｍ−フエニレン及びｐ−フ
エニレン基を、シクロアルキレン基としては、例
えばシクロプロピレン、１，３−シクロブチレ
ン、１，２−シクロペンチレン、１，３−シクロ
ペンチレン、１，２−シクロヘキシレン、１，４
−シクロヘキシレン、１，３−シクロヘプチレ
ン、１，５−シクロオクチレン基等の炭素数３〜
８のシクロアルキレン基を例示できる。 Ａで示される低級アルキレン基としては、例え
ばメチレン、エチレン、トリメチレン、テトラメ
チレン、ペンタメチレン、ヘキサメチレン、２−
メチル−トリメチレン基等の炭素数１〜６のアル
キレン基を、Ｂで示される置換基として低級アル
キルチオ基又はフエニル低級アルキルチオ基を有
することのある低級アルキレン基としては、上記
と同様の炭素数１〜６のアルキレン基及びメチル
チオメチレン、エチルチオメチレン、ブチルチオ
メチレン、ヘキシルチオメチレン、エチルチオエ
チレン、プロピルチオエチレン、２−メチルチオ
トリメチレン、２−エチルチオエチルメチレン、
２−プロピルチオテトラメチレン、３−エチルチ
オメチルペンタメチレン、３−エチルチオヘキサ
メチレン、ペンジルチオメチレン、ベンジルチオ
メチルメチレン、ベンジルチオエチレン、２−ベ
ンジルチオトリメチレン、２−ベンジルチオエチ
ルエチレン、２−｛２−（２−フエニルエチルチ
オ）エチル｝トリメチレン、３−フエニルプロピ
ルチオメチレン、４−フエニルブチルチオエチレ
ン、３−フエニルペンチルチオメチレン、６−フ
エニルヘキシルチオエチレン、３−ベンジルチオ
プロピルエチレン、２−ベンジルチオメチルペン
タメチレン、３−ベンジルチオヘキサメチレン基
等の炭素数１〜６のアルキルチオ基又はアルキル
部分の炭素数が１〜６のフエニルアルキルチオ基
を置換基として有する炭素数１〜６のアルキレン
基を例示できる。 上記一般式〔〕で示される化合物は、公知又
は新規化合物を含み、これらは例えば文献〔T.
Kitagawa他、J.Biochem.（Tokyo）、79、233
（1976）〕等に記載の方法に準じて容易に合成する
ことができる。具体的には例えば以下の反応行程
式−１に示す方法に従い製造される。 〔式中、Ｒ、Ａ、Ｂ、ｌ、ｍ及びｎは前記に同
じ、R¹は低級アルキル基を示す。〕 上記一般式(2)で表わされるアミノカルボン酸と
一般式(3)で表わされるマレイミド誘導体との反応
は、適当な溶媒中、塩基性化合物の存在下に行な
われる。塩基性化合物としては、例えば炭酸カリ
ウム、炭酸水素ナトリウム、水素化ナトリウム、
炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリ
ウム、炭酸水素カリウム等の無機塩基類を使用で
きる。溶媒としては、反応に悪影響を与えない不
活性のものをすべて用いることができる。代表的
溶媒としては、例えば水、メタノール、エタノー
ル、プロパノール、ブタノール、エチレングリコ
ール等のアルコール類；ジメチルエーテル、テト
ラヒドロフラン（THF）、ジオキサン、モノグラ
イム、ジクライム等のエーテル類；アセトン、メ
チルエチルケトン等のケトン類；Ｎ，Ｎ−ジメチ
ルホルムアミド（DMF）、ジメチルスルホキシド
（DMSO）、ヘキサメチルリン酸トリアミド
（HMPA）等の非プロトン性極性溶媒等が挙げら
れる。アミノカルボン酸(2)とマレイミド誘導体(3)
との使用割合は、とくに限定されず、広範囲の中
から適宜に選択されるが、通常前者に対して後者
を１〜３倍モル、好ましくは１〜1.3倍モル量程
度用いるのがよい。またその反応温度もとくに限
定されないが、通常０〜50℃、好ましくは０〜30
℃程度とするのがよく、反応時間は通常１〜３時
間程度とされる。かくして一般式(4)で表わされる
化合物を収得できる。 上記において、マレイミド誘導体(3)のかわりに
無水マレイン酸を用い、これをアミノカルボン酸
(2)と反応させ、次いで得られるマレイン酸誘導体
を脱水反応に付すことによつても一般式(4)で表わ
される化合物を収得することができる。上記アミ
ノカルボン酸(2)と無水マレイン酸との反応は、前
者に対し後者を約１〜３倍モル、好ましくは約１
〜1.3倍モル用いて、上記アミノカルボン酸(2)と
マレイミド誘導体(3)との反応において用いられる
溶媒と同様の溶媒中で、通常20〜150℃、好まし
くは30〜100℃程度の温度条件下に、約１〜５時
間を要して行なわれる。得られるマレイン酸誘導
体は、これを特に反応混合物より単離精製するこ
となく、引き続き脱水反応に付すことができる。
該反応は、脱水縮合剤の存在下、無溶媒又は適当
な溶媒中にて行なわれる。使用される脱水縮合剤
としては、例えば無水酢酸、無水プロピオン酸、
無水酪酸、無水カプロン酸、無水安息香酸等の酸
無水物等が挙げられる。また使用される溶媒とし
ては、ジメチルエーテル、THF、ジオキサン、
モノグライム、ジグライム等のエーテル類；ベン
ゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素；
塩化メチレン、クロロホルム等のハロゲン化炭化
水素類等が挙げられる。脱水縮合剤の使用量とし
ては、特に限定されず、通常マレイン酸誘導体に
対して、触媒量以上、好ましくは10〜100倍モル
量程度用いるのがよく、溶媒を兼ねて更に大過剰
用いることもできる。上記脱水反応は通常約50〜
150℃、好ましくは約90〜100℃にて約１〜５時間
を要して行なわれる。 かくして得られる一般式(4)の化合物に、Ｎ−ヒ
ドロキシスクシンイミド(5)を反応させることによ
り、一般式(1)で表わされる所望のマレイミド誘導
体が取得される。該反応は、適当な溶媒中、好ま
しくは脱水縮合剤の存在下に行なわれる。脱水縮
合剤としては、例えばジシクロヘキシルカルボジ
イミド（DCC）、トリクロロアセトニトリル、ア
セチレンエチルエーテル、シアン酸エチルエステ
ル等が挙げられ、溶媒としては、例えばジエチル
エーテル、THF、ジメトキシエタン（DME）、
ジグライム等のエーテル類、DMF、ピリジン、
２−メチルピロリドン等が挙げられる。一般式(4)
の化合物に対するＮ−ヒドロキシスクシンイミド
(5)の使用量は特に限定されず、通常、等モル〜３
倍モル、好ましくは等モル〜1.3倍モル程度とさ
れ、反応は一般に約０〜50℃、好ましくは０〜30
℃程度にて１〜３時間程度で終了する。上記にお
いて脱水縮合剤を使用する場合は、通常これを、
一般式(4)の化合物に対して等モル〜３倍モル、好
ましくは等モル〜1.3倍モル程度用い、同様に反
応させればよい。 尚、上記反応においては、一般式(4)の化合物に
代えて、そのカルボキシ基が活性化された化合物
を用いることもできる。該化合物としては、例え
ば一般式(4)の化合物に、アルキルハロカルボン酸
を反応させて得られる混合酸無水物及び酸ハロゲ
ン代等が挙げられる。 混合酸無水物を利用する方法（混合酸無水物
法）は、通常まず一般式(4)の化合物にアルキルハ
ロカルボン酸例えばクロロギ酸メチル、プロモギ
酸メチル、クロロギ酸イソブチル等をシヨツテン
−バウマン反応に従い反応させ、次いで得られる
混合物無水物を、通常反応系より単離することな
く、これにＮ−ヒドロキシコハク酸イミド５を反
応させることにより行なわれる。上記シヨツテン
−バウマン反応は、該反応に慣用される塩基性化
合物、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウ
ム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素ナ
トリウム、炭酸水素カリウム、炭酸銀などの無機
塩基；ナトリウムメチラート、ナトリウムエチラ
ートなどのアルコラート；トリメチルアミン、ト
リエチルアミン、ピリジン、Ｎ，Ｎ−ジメチルア
ニリン、Ｎ−メチルモルホリン、４−ジメチルア
ミノピリジン、１，５−ジアザビシクロ〔４，
３，０〕ノネン−５（DBN）、１，８−ジアザビ
シクロ〔５，４，０〕ウンデセン−７（DBU）、
１，４−ジアザビシクロ〔２，２，２〕オクタン
（DABCO）などの有機塩基の存在下、−20〜100
℃程度、好ましくは０〜50℃において行なわれ、
反応時間は５分〜10時間程度である。得られた混
合酸無水物とＮ−ヒドロキシコハク酸イミド(5)と
の反応は一般に適当な溶媒中で−20〜150℃程度、
好ましくは10〜50℃にて５分〜10時間程度で行わ
れる。用いられる溶媒としては、この種混合酸無
水物法に慣用の溶媒具体的には塩化メチレン、ク
ロロホルム、ジクロルエタンなどのハロゲン化炭
素類；ベンゼン、トルエン、キシレンなどの芳香
族炭化水素類；ジエチルエーテル、THF、DME
などのエーテル類；酢酸メチル、酢酸エチルなど
のエステル類、DMF、DMSO、HMPAなどの非
プロトン性極性溶媒等が挙げられる。上記混合酸
無水物法における一般式(4)の化合物、アルキルハ
ロカルボン酸及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド
(5)の使用割合は通常夫々等モル程度とされるが、
一般式(4)の化合物に対して、アルキルハロカルボ
ン酸及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド(5)を１〜
1.5倍モル程度用いるのが好ましい。 酸ハロゲン化物を利用する方法（酸ハロゲン化
物法）は、通常一般式(4)の化合物にハロゲン化剤
を反応させて、カルボン酸ハライドとし、これを
単離することなく、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ド(5)との反応に供することにより行なわれる。一
般式(4)の化合物とハロゲン化剤との反応は、無溶
媒でもあるいは溶媒の存在下でも行なわれる。溶
剤としては、反応に悪影響を与えないもの、例え
ばベンゼン、トルエン、キシレンなどの芳香族炭
化水素類；クロロホルム、塩化メチレン、四塩化
炭素などのハロゲン化炭化水素類；ジオキサン、
THF、ジエチルエーテルなどのエーテル類；
DMF、DMSOなどを使用できる。ハロゲン化剤
としては、カルボキシ基の水酸基をハロゲンに変
える、通常のハロゲン化剤、例えば塩化チオニ
ル、オキシ塩化リン、オキシ臭化リン、五塩化リ
ン、五臭化リンなどを使用できる。一般式(4)の化
合物とハロゲン化剤との使用割合はとくに限定さ
れず適宜選択されるが、無溶媒下で反応を行なう
場合には、通常前者に対して、後者を大過剰量、
また溶媒中で反応を行なう場合には、通常前者に
対して後者を少なくとも等モル量程度、好ましく
は２〜４倍モル程度とするのがよい。反応はとく
に限定されないが、通常室温〜100℃程度、好ま
しくは50〜80℃にて、30分間〜６時間程度で行な
われる。上記により得られたカルボン酸ハライド
と、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド(5)との反応
は、脱ハロゲン化水素剤の存在下に行なわれる。
脱ハロゲン化水素剤としては、通常塩基性化合物
が用いられる。その具体例としては、水酸化ナト
リウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸
カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウ
ム、炭酸銀などの無機塩基；ナトリウムメチラー
ト、ナトリウムエチラートなどのアルコラート、
トリエチルアミン、ピリジン、Ｎ，Ｎ−ジメチル
アニリン、Ｎ−メチルモルホリン、４−ジメチル
アミノピリジン、１，５−ジアザビシクロ〔４，
３，０〕ノネン−５（DBN）、１，８−ジアザビ
シクロ〔５，４，０〕ウンデセン−７（DBU）、
１，４−ジアザビシクロ〔２，２，２〕オクタン
（DABCO）などの有機塩基が挙げられる。該反
応は無溶媒でもあるいは溶媒の存在下でも行なわ
れる。溶媒としては反応に悪影響を与えない不活
性のものがすべて用いられ、例えばクロロホル
ム、塩化メチレン、四塩化炭素などのハロゲン化
炭化水素類；ジエチルエーテル、THF、ジオキ
サンなどのエーテル類；ベンゼン、トルエン、キ
シレンなどの芳香族炭化水素類；酢酸メチル、酢
酸エチルなどのエステル類；DMF、DMSO、
HMPAなどの非プロトン性極性溶媒などが挙げ
られる。カルボン酸ハライドとＮ−ヒドロキシス
クシンイミド(5)との使用割合は、とくに限定され
ないが、溶媒中で反応を行なう場合には、前者に
対して後者を通常少なくとも等モル量程度、好ま
しくは等モル〜２倍モル量とするのがよい。また
反応はとくに限定されないが、通常−30℃〜100
℃程度、好ましくは０〜50℃にて、0.5〜12時間
程度で行なわれる。 上記反応行程式−１において、一般式(2)で表わ
されるアミノカルボン酸は、例えば以下の反応行
程式に示す方法に従い製造される。 〔式中、Ｒ、Ａ、Ｂ、ｌ、ｍ及びｎは前記に同
じ。Ｘはハロゲン原子、アルカンスルホニルオキ
シ、アニールスルホニルオキシ又はアラルキルス
ルホニルオキシ基を示す。〕 上記一般式(6)においてＸは示されるハロゲン原
子としては、塩素、臭素、沃素原子等を、アルカ
ンスルホニルオキシ基としては、メタンスルホニ
ルオキシ、エタンスルホニルオキシ、イソプロパ
ンスルホニルオキシ、プロパンスルホニルオキ
シ、ブタンスルホニルオキシ、tert−ブタンスル
ホニルオキシ、ペンタンスルホニルオキシ、ヘキ
サンスルホニルオキシ基等を、アリールスルホニ
ルオキシ基としてはフエニルスルホニルオキシ、
４−メチルフエニルスルホニルオキシ、２−メチ
ルフエニルスルホニルオキシ、４−ニトロフエニ
ルスルホニルオキシ、４−メトキシフエニルスル
ホニルオキシ、３−クロルフエニルスルホニルオ
キシ、α−もしくはβ−ナフチルスルホニルオキ
シ基等の置換又は未置換のアリールスルホニルオ
キシ基を、またアラルキルスルホニルオキシ基と
しては具体的にはベンジルスルホニルオキシ、２
−フエニルエチルスルホニルオキシ、４−フエニ
ルブチルスルホニルオキシ、４−メチルベンジル
スルホニルオキシ、２−メチルベンジルスルホニ
ルオキシ、４−ニトロベンジルスルホニルオキ
シ、４−メトキシベンジルスルホニルオキシ、３
−クロルベンジルスルホニルオキシ、α−もしく
はβ−ナフチルメチルスルホニルオキシ基等の置
換又は未置換のアラルキルスルホニルオキシ基を
夫々例示できる。 一般式(2)で表わされるアミノカルボン酸は、上
記反応行程式−２に従い、一般式(6)で表わされる
公知の化合物にフタルイミド(7)を反応させ、次い
で生成する化合物(8)を加水分解することにより収
得される。 上記一般式(6)の化合物とフタルイミド(7)との反
応に当つては、前述のカルボン酸ハライドと、Ｎ
−ヒドロキシスクシンイミド(5)との反応と同様の
反応条件を採用することができる。 上記により得られる一般式(8)で表わされる化合
物の加水分解は、無溶媒又は水、メタノール、エ
タノール、イソプロパノール等のアルコール類、
酢酸等の適当な溶媒中、酸又はアルカリを作用さ
せることにより行なわれる。酸としては塩酸、硫
酸等の鉱酸を、またアルカリとしては水酸化ナト
リウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム、炭酸ナ
トリウム等を使用することができる。酸又はアル
カリは、一般式(8)の化合物に対して、少なくとも
等モル以上、通常大過剰量使用するのがよい。反
応温度は、通常室温〜150℃、好ましくは50〜100
℃程度とするのがよく、一般に0.5〜24時間程度
で反応は終了する。尚上記加水分解反応におい
て、フタルイミド基のアミノ基への変換は、好ま
しくは同様の溶媒中、同様の反応条件下に、少な
くとも等モル量のヒドラジンの存在下に実施する
ことができる。 また上記一般式(2)で表わされるアミノカルボン
酸及びその原料とする一般式(6)の化合物中、ある
種のものは、以下に示す反応行程式−３乃至−５
に従う方法によつても製造することができる。 〔式中、R¹及びＸは前記に同じ。X¹はハロゲン
原子を、R²は低級アルキル基、アリール基又は
アラルキル基を、Ｍは金属原子を夫々示す。〕 上記各式において定義されるハロゲン原子とし
ては塩素、臭素、沃素原子等を、低級アルキル基
としてはメチル、エチル、プロピル、イソプロピ
ル、ブチル、ペンチル、ヘキシル等の炭素数１〜
６の直鎖状もしくは分枝状アルキル基を、アリー
ル基としてはフエニル、２−メチルフエニル、４
−メチルフエニル、４−ニトロフエニル、２−メ
トキシフエニル、３−クロロフエニル、α−もし
くはβ−ナフチル基等を、アラルキル基としては
ベンジル、２−フエニルエチル、４−フエニルブ
チル、４−メチルベンジル、４−ニトロベンジル
基等を、また金属原子としては、リチウム、ナト
リウム、カリウム等のアルカリ金属原子の他、マ
グネシウム、亜鉛原子等を夫々例示することがで
きる。 以下、上記反応行程式−３に示す各行程につき
詳述する。 一般式(6)′で表わされる公知の化合物と、一般
式(9)で表わされる酢酸エステルの金属エノレート
との反応は、例えばTHF、ジメトキシメタン、
ジグライム等のエーテル系溶媒；ベンゼン、トル
エン、キシレン等の芳香族炭化水素系溶媒；
DMF、DMSO、HMPA等の非プロトン性極性溶
媒等の適当な溶媒中、前者に対して後者を約１〜
３倍モル、好ましくは約１〜1.5倍モル用いて、−
78℃〜50℃程度、好ましくは−78℃〜−30℃程度
の温度条件下に約１〜５時間を要して行なわれ
る。かくして一般式(10)で表わされる化合物を得
る。 得られる一般式(10)の化合物の還元反応は、該化
合物１０エステル部分をアルコールに変換する
が、ニトリル基の還元は行なわれない条件下に実
施される。その具体的方法としては例えば化合物
（10）を加水分解して対応するカルボン酸として
後、これにクロロギ酸メチル、プロモギ酸エチ
ル、クロロギ酸イソブチル等のアルキルハロカル
ボン酸を塩基性化合物の存在下に反応させて混合
酸無水物とし、次いでこの混合酸無水物を還元す
る方法を採用することができる。上記方法におけ
る加水分解反応は、塩基性触媒例えば水酸化ナト
リウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム等を
用いても、また酸性触媒例えばギ酸、トリフルオ
ロ酢酸、トリクロロ酢酸、塩化水素、臭化水素、
ｐ−トルエンスルホン酸、カンフアースルホン酸
等を用いても行なうことができる。塩基性触媒を
用いる場合、反応は水、メタノール、エタノー
ル、プロパノール、ブタノール等のアルコール系
溶媒、ジオキサン、THF、ジグライム等のエー
テル系溶媒、DMF、DMSO、HMPA等の非プロ
トン性極性溶媒中で行なわれる。酸性触媒を用い
る場合、反応は塩化メチレン、クロロホルム、ト
リクロロエタン等のハロゲン化炭化水素系溶媒中
で有利に進行する。いずれの触媒を用いる場合
も、触媒は通常化合物（10）に対し過剰量用いら
れ、反応は約20〜100℃の温度下に約１〜48時間
で完結する。かくして得られるカルボン酸とアル
キルハロカルボン酸との反応による混合酸無水物
の製造は、通常のシヨツテン−バウマン反応によ
り行なわれ、その条件等は前述した通りである。
また上記により得られる混合酸無水物は、通常反
応系内より単離することなく引き続く還元反応に
供される。該還元反応は、水、メタノール、エタ
ノール、プロパノール等のアルコール系溶媒、エ
ーテル、THF、ジグライム等のエーテル系溶媒
等の適当な溶媒中、水素化ホウ素ナトリウム、水
素化ホウ素リチウム等の還元剤の存在下で、約０
〜50℃、好ましくは約０〜20℃の温度下に、通常
約１〜12時間を要して行なわれる。還元剤は、原
料混合酸無水物に対し約１〜10倍モル、好ましく
は約１〜３倍モルの範囲で用いられる。かくして
一般式（11）で表わされるアルコールを得る。 一般式（11）で表わされるアルコールと、一般
式（12）で表わされる化合物との反応は、塩基性
化合物の存在下、適当な溶媒中で行なわれる。塩
基性化合物としては、例えば水酸化ナトリウム、
水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウ
ム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭
素銀などの無機塩基；ナトリウムメチラート、ナ
トリウムエチラートなどのアルコラート；トリエ
チルアミン、ピリジン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリ
ン、Ｎ−メチルモルホリン、４−ジメチルアミノ
ピリジン、１，５−ジアザビシクロ〔４，３，
０〕ノネン−（DBN）、１，８−ジアザビシクロ
〔５，４，０〕ウンデセン−７（DBU）、１，４−
ジアザビシクロ〔２，２，２〕オクタン
（DABCO）などの有機塩基が挙げられる。溶媒
としてはTHF、ジオキサン、DME、ジグライム
等のエーテル系溶媒；ベンゼン、トルエン、キシ
レン等の芳香族炭化水素；塩化メチレン、クロロ
ホルム、四塩化エチレン等のハロゲン化炭化水素
等が例示される。アルコール（11）に対する化合
物（12）の使用量は、通常約１〜３倍モル量、好
ましくは約１〜1.5倍モル量とされる。反応は通
常約０〜50℃、好ましくは約０〜20℃の温度下に
行なわれ約１〜12時間で完結する。かくして一般
式(6)″で表わされる化合物を得る。 また一般式(6)″で表わされる化合物は、アルコ
ール（11）に適当なハロゲン化剤、例えば塩化チ
オニル、オキシ塩化リン、オキシ臭化リン、五酸
化リン、五臭化リン等を反応させることによつて
収得される。該反応は、例えばジオキサン、
THF等のエーテル類、クロロホルム、塩化メチ
レン等のハロゲン化炭化水素類等の適当な溶媒
中、アルコール（11）に対しハロゲン化剤を少な
くとも２倍モル量、通常過剰量用い、室温付近〜
約100℃、好ましくは室温〜70℃程度の温度下に、
約１〜24時間を要して行なわれる。 〔式中、X¹、R¹、R²、Ｍ及びＸは前記に同じ。〕 反応行程式−４において、一般式（21）の化合
物と一般式(9)の化合物との反応は、前記反応行程
式−３における一般式(6)の化合物と一般式(9)の化
合物との反応と同様の条件下に実施できるが、一
般式（21）の化合物に対する一般式(9)の化合物の
使用量は、約２〜５倍モル量、好ましくは約２〜
３倍モル量とされるのがよい。 上記により得られる一般式（13）の化合物の還
元反応及びこれにより得られる一般式（14）の化
合物と一般式（12）の化合物又はハロゲン化剤と
の反応も亦、夫々前記反応行程式−３に示す各行
程と同様にして実施することができる。 更に一般式（15）の化合物からの一般式(2)′の
化合物の製造は、前記反応行程式−２における一
般式(6)の化合物からの一般式(2)の化合物の製造と
同様の方法により実施される。 尚上記反応行程式−３及び−４においては、出
発原料を適宜選択することにより、又は之等各行
程式に示す反応を繰返し行なうことによつて、ア
ルキレン鎖の延長された所望化合物を収得するこ
とができる。 〔式中、R¹は前記に同じ。〕 一般式（16）の化合物の酸化反応は、適当な酸
化剤を用いて通常溶媒中で行なわれる。酸化剤と
しては例えばDMSO−無水酢酸、DMSO−トリ
フルオロ酢酸、DMSO−オキザリルクロリド、
DMSO−Ｎ，N′−ジシクロヘキシルカルボジイ
ミド、ピリジニウムクロロクロメート、ピリジニ
ウムジクロメート等を使用できる。溶媒として
は、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭
化水素系溶媒や塩化メチレン、クロロホルム等の
ハロゲン化炭化水素系溶媒等を用いることができ
る。酸化剤は通常一般式（16）の化合物に対して
約１〜５倍モル、好ましくは約１〜３倍モル用い
られるのがよい。反応温度は通常約０〜50℃、好
ましくは約０〜20℃とされ、反応は一般に約５〜
12時間で終了する。かくして一般式（17）で表わ
される化合物が収得される。 得られる一般式（17）の化合物と、一般式
（18）の化合物との反応は、適当な溶媒中で行な
われ、該溶媒としてはエーテル、THF、ジグラ
イム、ジオキサン等のエーテル系、ベンゼン、ト
ルエン、キシレン等の芳香族炭化水素系、塩化メ
チレン、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素
系、DMF、DMSO、HMPA等の非プロトン性極
性溶媒等を例示できる。一般式（17）の化合物に
対する一般式（18）の化合物の使用量は、通常約
１〜５倍モル量、好ましくは約１〜３倍モル量と
され、反応は約20〜100℃、好ましくは約20〜50
℃の温度条件下に、約５〜12時間で完結し、これ
により一般式（19）で表わされる化合物を得る。 該一般式（19）の化合物の還元反応は、一般に
水素雰囲気中、メタノール、エタノール、プロパ
ノール、ブタノール等のアルコール等溶媒中で、
接触還元触媒例えば５％パラジウム−炭素、10％
パラジウム−炭素等を用いて行なわれる。該触媒
は通常一般式（19）の化合物１ｇ当り約50mg〜１
ｇ、好ましくは約50〜200mg用いられ、反応は約
０〜50℃、好ましくは約０〜30℃下に、12〜72時
間程度で完結する。 上記により得られる一般式（20）の化合物の加
水分解反応は、前記反応行程式−３に示した一般
式（10）の化合物の加水分解反応と同様の条件下
に実施することができ、これにより所望の一般式
(2)″で表わされる化合物を取得できる。 前記の各反応行程式において、各々の目的化合
物は、通常用いられている分離手段により容易に
単離精製される。かかる分離手段としては沈殿
法、抽出法、再結晶法、カラムクロマトグラフイ
ー、プレパラテイブ薄層クロマトグラフイー等を
例示できる。 また本発明有効成分化合物において利用される
フイブリン吸着性蛋白としてのプラスミンHC
は、例えば文献〔Eur.J.Biochem、57、441
（1975）〕等に記載の方法に準じて製造され、これ
はプラスミンを部分還元して得られるメルカプト
基を有するものである。更に本発明においてウロ
キナーゼとしては特に限定なく公知の各種のも
の、例えばローモレキユラーウエイト−ウロキナ
ーゼ及びハイモレキユラーウエイト−ウロキナー
ゼ〔Low Molecular Weight−Urokinase、
LMW−UK、平均分子量32000；High
Molecular Weight−Urokinase、HMW−UK、
平均分子量54000、Biochemistry、５、2160
（1966）〕等を使用することができる。 本発明有効成分化合物の製造のための上記フイ
ブリン吸着性蛋白とウロキナーゼとの結合反応
は、例えば水溶液、生理食塩水もしくはPH４〜10
の通常の緩衝液中、好ましくはPH６〜８の緩衝液
中で、０〜40℃好ましくは室温付近で、好ましく
は窒素気流中で行なわれる。該反応は通常数分〜
24時間程度で完結する。上記において用いられる
緩衝液としては、アンモニア及びアミノ基を含有
しない公知の各種のものをいずれも使用すること
ができる。 上記結合反応において、フイブリン吸着性蛋
白、ウロキナーゼ及び一般式〔〕で表わされる
蛋白結合試薬の使用割合は、適宜に決定される
が、通常ウロキナーゼに対してフイブリン吸着性
蛋白を0.3〜４倍モル量程度、好ましくは約0.5〜
２倍モル量、蛋白結合試薬を１〜50倍モル量程
度、好ましくは約３〜20倍モル量用いるのがよ
い。 かくして製造される複合体は、主としてフイブ
リン吸着性蛋白１モルに対してウロキナーゼが１
〜５モル、好ましくはほぼ１モル結合したもので
あり、これは結合反応終了後、常法に従い、例え
ば透析法、ゲル過法、分別沈殿法及びアフイニ
テイークロマトグラフイー等により容易に単離精
製できる。またこれは通常の凍結乾燥法により保
存できる。 上記の如くして得られる複合体は、フイブリン
吸着能及びウロキナーゼ活性を有しており、血栓
溶解剤として血栓症の治療に有効なものである。 本発明血栓症治療剤は、通常の製剤的担体と共
に製剤組成物の形態とされる。該血栓溶解剤の投
与単位形態としては、各種の形態を治療目的に応
じて適宜選択できるが、通常は注射剤として用い
られる。該注射剤は通常の方法で殺菌され、好ま
しくは血液と等張とされる。注射剤の形態に成形
するに際して用いられる希釈剤としては、この分
野において慣用されている各種のもの、例えば
水、生理食塩水等を例示できる。なおこの場合等
張性の溶液を調製するに充分な量の食塩、ブドウ
糖あるいはグリセリンを血栓溶解剤中に含有せし
めてもよく、また通常の溶解補助剤、緩衝剤、無
痛化剤、保存剤等を、更に必要に応じて着色剤、
香料、風味剤、甘味剤等や他の医薬品を該血栓溶
解剤中に含有せしめてもよい。 血栓溶解剤中に含有させるべき有効成分化合物
としての上記複合体の量は、特に限定されず広い
範囲から適宜選択されるが、通常全製剤組成物中
に約0.01〜30重量％含有される量とするのがよ
い。 又上記血栓溶解剤は、その使用に際し、各種形
態に応じた方法で投与されるが、通常は注射剤と
して単独であるいはブドウ等、アミノ酸輸液等の
補液と混合して静脈内投与される。その投与量は
使用目的、症状等により適宜選択されるが、通常
有効成分であるフイブリン吸着性蛋白−ウロキナ
ーゼ複合体として１日当り約1000〜500000単位／
Kgとするのが好ましく、これは２〜４回に分けて
投与してもよい。 以下本発明に用いるフイブリン吸着性蛋白、ウ
ロキナーゼ及び蛋白結合試薬の製造乃至調製例を
参考例として挙げ、次いで本発明血栓症治療剤の
有効成分とする複合体の製造例を実施例として挙
げ、更に実施例で得た複合体の薬理試験例を挙げ
る。尚各例における各種活性の測定法及びその他
物性等の試験法は以下の通りである。 Γウロキナーゼ活性測定 合成基質法；ウロキナーゼサンプルを
0.15M−NaCl及び５ｇ／ポリエチレング
リコール（PEG6000和光純薬）を含む水
溶液で適当濃度に希釈し、その100μに
0.1M−NaClを含有する0.05M−トリス塩酸
緩衝液（PH＝8.4）800μを加え、37℃、１
分加温後、これに基質Ｓ−2444
（PyroGluGly−Arg−ｐ−Nitroanilide、第
１化学薬品社製）の0.3μMを上記緩衝液に加
えた液100μを添加し、37℃、２分インキ
ユベートする。50％酢酸水溶液100μを加
えて反応を停止させ、405nｍにて吸光度を
測定する。標準ウロキナーゼを用い同様に操
作して得られた吸光度より、サンプルの活性
（国際単位として標示）を算定する。 フイブリン平板法； Ａ法；0.3％牛フイブリノーゲン（Poviet
社製）の0.1M−NaCl加0.05Mベロナール緩
衝液（PH＝8.0）６mlに、最終0.02Mの
CaCl₂、最終的3NIH単位／mlの牛トロンビ
ン（持田製薬社製）を加え撹拌後、シヤーレ
（内径8.5cm）にまき、フイブリン平板を調製
する。0.1％ウサギ血清アルブミン（シグマ
社製）の上記緩衝液に溶解したウロキナーゼ
サンプルの10μを、上記フイブリン平板に
スポツトし、37℃、16時間インキユベート
後、溶解円の径を測定する。 Ｂ法；フイブリノーゲン（フラクシヨン
；シグマ社）２ｇを0.1Mリン酸塩緩衝液
（PH＝7.2）200mlに溶解する。牛トロンビン
（持田製薬社製）１バイアル（1000単位）を
同緩衝液200mlに溶解し、この21mlを上記フ
イブリノーゲン溶液20mlに加え撹拌後、フイ
ブリン平板を作成する。以後、ウサギ血清ア
ルブミンの代わりに牛血清アルブミン
（BSA）を使用する以外は、上記Ａ法と同様
にして、サンプルのフイブリン溶解活性を、
溶解円の径として測定する。 ΓSH基の定量 サンプル100μを脱気後、これに脱気N₂置
換した0.2M−トリス塩酸緩衝液（PH＝8.2）１
mlを加え、次いで脱気したメタノールを溶解し
た0.01M−５，5′−ジチオビス（２−ニトロ安
息香酸）100μを添加し、撹拌後、室温にて
約30分放置後、412nｍの吸光度を測定する。
２−メルカプトエタノールを標準としてサンプ
ルのSH基量を換算する。 Γｍ−マレイミドベンゾイル基（MB基）の定量 サンプル100μを脱気後、２−メルカプト
エタノールの水溶液25μ（35nmol）を添加
し、37℃、20分インキユベートする。以下上記
SH基の定量と同様にして、残存２−メルカプ
トエタノール量を測定して、サンプルのMB基
量を換算する。 ΓSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS−
PAGE） サンプルを40％グリセロール及び２％SDSを
含有する0.02Mトリス塩酸緩衝液（PH＝8.0）
に等量混合し、100℃、２分加熱後、12.5％分
離用ゲル及び４％濃縮用ゲルを用いラエメリ
（U.K.Laemmli）らの方法〔Nature
（London）、227、680（1970）〕及びフアルマシ
ア社製グラジエントゲルPAA4/30により泳動
させる。泳動後コマーシーブリリアントブルー
（C.B.B）染色し、標準蛋白（モレキユラーウ
エイトキツト、フアルマシア社製）より分子量
を換算する。 参考例 １ プラスミンHCの製造 リツクリ（E.E.Rickli）らの方法〔Eur.J.
Biochem，59、441（1975）〕に準じて行つた。
すなわちチバー（B.A.K.Chibber）らの方法
〔Methods in Enzymology、34．424（1974）〕
に準じてヒト血液より精製したプラスミノーゲ
ン150mgを、0.1M−NaCl及び25％グリセロー
ルを含有する0.05Mトリス塩酸緩衝液（PH＝
7.8）に溶解し、ウロキナーゼ（日本ケミカル
リサーチ社製）約3000単位を添加し、室温で８
時間インキユベートする。更に1500単位の同ウ
ロキナーゼを添加して、室温下に16時間インキ
ユベートする。この溶液を窒素置換し、２−メ
ルカプトエタノールを最終0.1M濃度となるよ
うに添加し、20℃、20分間放置する。その後氷
冷し、あらかじめ窒素置換した0.15MNaCl、
0.01M−EDTA及び0.001M−２−メルカプト
エタノールを含有する0.01M−リン酸ナトリウ
ム塩緩衝液（PH＝7.2）で充分に平衡化したリ
ジン−セフアロースカラム（５cmφ×10cm）に
付し、該緩衝液約１で洗浄後、0.05M6−ア
ミノヘキサン酸の同緩衝液で溶出き、280nｍ
での吸光度のピーク画分を集め、アミコンPM
−10限外過膜（アミコン社製）にて、窒素加
圧下に濃縮する。これに２−メルカプトエタノ
ールを除いた上記緩衝液を加え再度濃縮する。
この操作を数回繰り返して約60mgのプラスミン
HCを得る。これは窒素置換して−80℃に保存
した。このものは１モル当り約３モルのSH基
が検出された。 ヒト血液より精製したプラスミノーゲン300
mgを0.1M−NaCl及び25％グリセロールを含有
する0.05M−トリス塩酸緩衝液（PH＝7.8）60
mlに溶解し、ウロキナーゼ18000単位を添加し、
25℃で８時間インキユベートする。更に9000単
位のウロキナーゼを添加して25℃で16時間イン
キユベートする。この溶液にｐ−ニトロフエニ
ル−ｐ−グアニジノベンゾエート塩酸塩34mgを
0.4mlのDMFに溶かした溶液を加え、37℃で10
分間撹拌した後、窒素置換し、２−メルカプト
エタノールを最終0.1M濃度となるように添加
し、20℃で20分間撹拌する。その後氷冷し、あ
らかじめ窒素置換した0.2M−NaCl、0.01M−
EDTA及び0.001M−２−メルカプトエタノー
ルを含有する0.01M−リン酸ナトリウム緩衝液
（PH＝7.2）で充分に平衡化したリジンセフアロ
ースカラム（５cmφ×15cm）に付し、同緩衝液
で洗浄し、続いて0.001M−６−アミノヘキサ
ン酸、0.15M−NaCl、0.01M−EDTA及び
0.01M−２−メルカプトエタノールを含む
0.01M−リン酸ナトリウム緩衝液（PH＝7.2）
で洗浄した後、0.003M−６−アミノヘキサン
酸を含む同緩衝液で溶出し、280nｍでの吸光
度のピーク画分を集め、アミコンPM−10限外
過膜（アミコン社製）にて、窒素加圧下に50
mlまで濃縮する。濃縮液をあらかじめ窒素置換
した0.15M−NaCl及び0.01M−EDTAを含む
0.01M−リン酸ナトリウム緩衝液（PH＝7.2）
で平衡化したセフアデツクスＧ−25カラム（５
cmφ×20cm）に付し、同緩衝液で溶出する。
280nｍでの吸光度のピーク画分を集め、アミ
コンPM−10限外過膜にて窒素加圧下に濃縮
し、約100mgのプラスミンHCを得る。このも
のは１モル当り約５モルのSH基が検出された 参考例 ２ 蛋白結合試薬の製造 （2S）−３−ベンジルチオ−２−マレインイ
ミドピロピオン酸スクシンイミドエステル （試薬１）の製造 ケラーら（O.Keller and J.Rudinger）の方
法〔Helv.Chim.Acta、58、531（1975）〕に準じ
てＳ−ベンジル−Ｌ−システイン8.44ｇ（40ｍ
mol）の飽和炭素水素ナトリウム水溶液200ml
−THF100ml溶液中に、０℃でＮ−メトキシカ
ルボニルマレインイミド6.2ｇ（40ｍmol）を
加えた。10分間撹拌後、水300mlとTHF150ml
とで希釈した。反応混合物を室温で30分間、ひ
きつづいて40℃で30分間撹拌した。濃硫酸で中
和後、溶液量が約200mlになるまで減圧濃縮し
た。酢酸エチルで抽出後、無水硫酸ナトリウム
（Na₂SO₄）で乾燥し、濃縮して白色の固体を
得た。これをシリカゲルカラムクロマトグラフ
イー（90：10：５ クロロホルム−酢酸エチル
−酢酸から40：60：５ クロロホルム−酢酸エ
チル−酢酸）に供して（2S）−３−ベンジルチ
オ−２−マレインイミドプロピオン酸2.29ｇを
得た。mp86〜87℃ 次に該（2S）−３−ベンジルチオ−２−マレ
インイミドプロピオン酸2.29ｇ（7.87ｍmol）
に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド995mg
（8.67ｍmol）及びジメトキシエタン（DME）
40mlを混合し、混合物中に、アルゴン雰囲気
下、０℃でジシクロヘキシルカルボジイミド
（DCC）1.79ｇ（8.67ｍmol）を加えた。反応混
合物を０℃で１時間、室温で３時間撹拌した。
０℃に冷却後、数滴の酢酸を加えて、さらに１
時間撹拌した。不溶物を除去後、液を減圧濃
縮し、ついてシリカゲルカラムクロマトグラフ
イー（95：５ 塩化メチレン−酢酸エチルから
80：20塩化メチレン−酢酸エチル）を行なつて
標記化合物（試薬１）2.75ｇ（収率90％）を得
た。 mp；133〜134℃（塩化メチレン−エーテル） IR（KBr）；1832、1800、1755、1724cm^{-1 1}H−NMR（CDCl₃、90MHz）； δppm＝2.70（ｓ、4H）、3.14（ｍ、2H）、3.60
（ｓ、2H）、4.97（ｍ、1H）、6.63（ｓ、2H）、
7.17（ｓ、5H） MS（ｍ／ｘ）＝388（M⁺） 分析値（％）；C55.90 H4.03 N7.39 計算値（％）（C₁₈H₁₆O₆N₂Sとして）； C55.66 H4.15 N7.21 （±）−４−エチルチオ−２−マレインイミ
ド酪酸スクシンイミドエステル（試薬２）の製
造 上記と同様にして（±）−エチオニンから
（±）−４−エチルチオ−２−マレインイミド酪
酸を経て、標記化合物を得た。 mp；57〜59℃（塩化メチレン−エーテル） IR（KBr）；1838、1800、1752、1725cm^{-1 1}H−NMR（CDCl₃、90MHz） δppm＝1.20（ｔ、Ｊ＝6.6Hz、3H）、2.26〜2.66
（ｍ、6H）、2.74（ｓ、4H）、5.21（ｍ、1H）、
6.68（ｓ、2H） MS（ｍ／ｚ）＝340（M⁺） 分析値；ｍ／ｚ＝340.0736 計算値（C₁₄H₁₆O₆N₂として）；Ｍ＝340.07290 （４−マレインイミドフエニル）酢酸スクシ
ンイミド（試薬３）の製造 カバら（M.P.Cava、A.A.Deana、K.Muth
and M.J.Mitchell）の方法〔Org.Synth.、
Coll.Vol.5、944（1973）〕に準じて無水マレイ
ン酸7.14ｇ（72.8ｍmol）のDMF溶液15ml中
に、アルゴン雰囲気下、室温で４−アミノフエ
ニル酢酸10ｇ（66.2ｍmol）のDMF溶液40mlを
加えた。反応混合物を室温で３時間撹拌後、エ
ーテル−ベンゼン（１：１）250mlで希釈し、
析出沈殿を別した。得られた沈殿に酢酸ナト
リウム2.87ｇ（35ｍmol）及び無水酢酸70mlを
混合し、混合物をアルゴン雰囲気下、100℃で
１時間撹拌し、減圧濃縮後、残渣を酢酸エチル
300mlで希釈した。酢酸エチル層を飽和食塩水
で洗浄し、Na₂SO₄で乾燥し、濃縮後、シリカ
ゲルカラムクロマトグラフイー（90：10：５
クロロホルム−酢酸エチル−酢酸から50：50：
５ クロロホルム−酢酸エチル−酢酸）を行な
つて、白色固体として（４−マレインイミドフ
エニル）酢酸8.72ｇ（収率57％）を得た。 上記で得た（４−マレインイミドフエニル）
酢酸2.31ｇ（10ｍmol）を、Ｎ−ヒドロキシス
クシンイミド1.15ｇ（10ｍmol）及びDME30ml
と混合し、混合物中に、アルゴン雰囲気下、０
℃でDCC2.27ｇ（11ｍmol）を加え、反応混合
物を０℃で４時間撹拌した後、不溶物を去
し、液を濃縮後、シリカゲルカラムクロマト
グラフイー（80：20 クロロホルム−酢酸エチ
ル）を行なつて、標記化合物（試薬３）2.85ｇ
（収率87％）を得た。 mp；153〜154℃（塩化メチレン−エーテル） （２−マレインイミドフエニル）酢酸スクシ
ンイミドエステル（試薬４）の製造 上記と同様にして標記化合物（試薬４）を
得た。 mp；158〜159℃（塩化メチレン−エーテル） （３−マレインイミドフエニル）酢酸スクシ
ンイミドエステル（試薬５）の製造 上記と同様にして標記化合物（試薬５）を
得た。 mp；150〜151℃（塩化メチレン−エーテル） ４−マレインイミドメチル安息香酸スクシン
イミドエステル（試薬６）の製造 フタルイミドカリウム37ｇ（0.2mol）の
DMF200ml懸濁液中にアルゴン下、室温でα−
プロモ−ｐ−トルニトリル19.6ｇ（0.1mol）の
DMF溶液50mlを加えた。反応混合物を90℃で
３時間撹拌した後、室温まで冷却した。混合物
を氷−水400ml中にそそぎ込んだ後、ベンゼン
−エーテル（１：１）で抽出した。有機層を飽
和食塩水で洗浄、乾燥（Na₂SO₄）、濃縮して、
４−フタルイミドメチルベンゾニトリル24.9ｇ
（収率95％）を得た。 次いで上記と同様にして得た４−フタルイミ
ドメチルベンゾニトリル26.0ｇ（99ｍmol）
を、ヒドラジン−水和物6.32ml（0.129mol）及
びメタノール300mlと混合し、混合物を１時間
還流した。室温まで冷却後、濃縮した。残渣を
1moldｍ^-3NaOH300mlに溶解させた後、エー
テルで抽出した。エーテル層を飽和食塩水で洗
浄後、乾燥（MgSO₄）、濃縮して４−アミノメ
チルベンゾニトリル11.8ｇ（収率90％）を得
た。 更に得られた４−アミノメチルベンゾニトリ
ル11.2ｇ（86.2ｍmol）を、3moldｍ^-3KOH水
溶液86.2ml及びTHF100mlと混合し、混合物を
アルゴン下24時間還流した。室温まで冷却後、
約100mlになるまで濃縮した。得られた溶液を
濃塩酸で中和した。析出した白色結晶を別し
た。４−アミノメチル安息香酸の11.2ｇ（収率
86％）を得た。 得られた４−アミノメチル安息香酸3.02ｇ
（20ｍmol）を飽和NaHCO₃水溶液100mlと混合
し、混合物中に０℃でメトキシカルボニルマレ
イミド3.1ｇ（20ｍmol）を加えた。０℃で10
分間撹拌後、水200mlを加えた。30℃で１時間
撹拌後、濃硫酸でPH２にした。酢酸エチルで抽
出後、有機層を飽和食塩水で洗浄した。乾燥
（Na₂SO₄）、濃縮して粗４−マレインイミドメ
チル安息香酸3.18ｇ（収率87％）得た。 得られた粗４−マレインイミドメチル安息香
酸2.49ｇ（10.8ｍmol）にＮ−ヒドロキシスク
シンイミド1.61ｇ（14.0ｍmol）及びDME50ml
を加え、混合物に更に０℃でDCC2.88ｇ（14.0
ｍmol）を加えた。反応混合物を０℃で１時
間、室温で３時間撹拌した。０℃に冷却後、酢
酸数滴を加えた。０℃で１時間撹拌後、不溶物
を除いた。液を濃縮後、残渣をシリカゲルカ
ラムクロマトグラフイー（70：30 クロロホル
ム−酢酸エチル）に供し標記化合物（試薬６）
の3.19ｇ（収率90％）を得た。 mp；191〜193℃（塩化メチレン−エーテル） ３−マレインイミドメチル安息香酸スクシン
イミドエステル（試薬７）の製造 上記と同様にして標記化合物（試薬７）を
得た。 mp；132〜134℃（塩化メチレン−エーテル） ４−（３−マレインイミドプロピル）安息香
酸スクシンイミドエステル（試薬８）の製造 ジイソプロピルアミン10.2ml（73ｍmol）と
THF35mlとの混合物中にアルゴン下、０℃で
ブチルリチウムのヘキサン溶液（2.4moldｍ^-3
溶液）27.5ml（66ｍmol）を加え、15分間撹拌
した。−78℃に冷却後、この中に酢酸ｔ−ブチ
ル8.07ml（60ｍmol）のTHF溶液20mlを加え
た。30分間撹拌した後、α−プロモ−ｐ−トル
ニトリル9.8ｇ（50ｍmol）のTHF溶液30mlを
加えた。−78℃で１時間撹拌後、飽和NH₄Cl水
20mlを加えた。室温まで昇温後、水100mlで希
釈した。エーテルで抽出後、乾燥（MgSO₄）、
濃縮してオイルを得た。このオイルをシリカゲ
ルカラムクロマトグラフイー（90：10 ヘキサ
ン−酢酸エチルから60：40 ヘキサン−酢酸エ
チル）に供し、４−（２−ｔ−ブトキシカルボ
ニルエチル）ベンゾニトリルの9.8ｇ（収率85
％）をオイルとして得た。 ４−（２−ｔ−ブトキシカルボニルエチル）
ベンゾニトリル2.31ｇをトリフルオロ酢酸３ml
及び塩化メチレン30mlと混合し、混合物を室温
で13時間撹拌した。濃縮後、得られた残渣をト
ルエンで共沸した。粗な４−（２−ヒドロキシ
カルボニルエチル）ベンゾニトリルの1.75ｇ
（収率100％）を得た。この化合物は、精製する
ことなくつぎの反応に用いた。 粗４−（２−ヒドロキシカルボニルエチル）
ベンゾニトリル3.27ｇ（18.7ｍmol）をトリエ
チルアミン2.86ml（20.6ｍmol）及びTHF40ml
と混合し、混合物中に０℃で塩化ギ酸エチル
1.96ml（20.5ｍmol）を加えた。反応混合物を
室温で３時間撹拌した後、不溶物を除いた。
液を濃縮して、黄色のオイルを得た。このオイ
ルをベンゼ100mlで希釈した。ベンゼン層を飽
和NaHCO₃水で洗浄、乾燥（Na₂SO₄）、濃縮
して黄色のオイルを得た。このオイルをTHF
−H₂O（８：２）40mlに溶解した。この中に０
℃でNaBH₄2.13ｇ（56.1ｍmol）を加えた。反
応混合物を０℃で２時間撹拌後、3moldｍ
^-3HClの100ml中にそそぎ込んだ。酢酸エチル
で抽出後、乾燥（Na₂SO₄）、濃縮して４−（３
−ヒドロキシプロピル）ベンゾニトリルの2.71
ｇ（収率90％）をオイルとして得た。 ４−（３−ヒドロキシプロピル）ベンゾニト
リル16.1ｇ（0.1mol）を、トリエチルアミン
27.8ml（0.2mol）及び塩化メチレン300mlと混
合し、混合物中に０℃でメタンスルホニルクロ
リド15.5ml（0.2mol）を加えた。反応混合物を
室温で12時間撹拌後、濃縮した。残渣をベンゼ
ン500mlで希釈後、飽和食塩水で洗浄した。乾
燥（Na₂SO₄）、濃縮して粗４−（３−メシロキ
シプロピル）ベンゾニトリルの24.0ｇ（収率
100％）をオイルとして得た。 フタルイミドカリウム21.1ｇ（0.114mol）の
DMF懸濁液100ml中に、粗４−（３−メシロキ
シプロピル）ベンゾニトリル13.6ｇ（57ｍ
mol）のDMF溶液50mlを加えた。反応混合物
を90℃で３時間撹拌後、室温まで冷却した。氷
−水200ml中にそそぎ込んだ後、エーテル−ベ
ンゼン（１：１）で抽出した。有機層を乾燥
（Na₂SO₄）、濃縮して４−（３−フタルイミド
プロピル）ベンゾニトリルの14.0ｇ（収率85
％）を得た。 mp；138〜140℃ ４−（３−フタルイミドプロピル）ベンゾニ
トリル10ｇ（30ｍmol）にヒドラジン−水和物
1.89ml（39ｍmol）及びメタノール130mlを加
え、混合物を３時間還流した。室温まで冷却
後、濃縮した。残渣を1moldｍ^-3NaOH200ml
に溶解した後、エーテルで抽出した。乾燥
（K₂CO₃）、濃縮して４−（３−アミノプロピ
ル）ベンゾニトリル4.32ｇ（収率90％）を得
た。 mp 72〜74℃ 得られた４−（３−アミノプロピル）ベンゾ
ニトリルの5.34ｇを、3moldｍ^-3KOH30ml及び
エタノール30mlと混合し、混合物を24時間還流
した。室温まで冷却後、濃縮した大部分のエタ
ノールを除いた。水層を濃塩酸で中和した。析
出した沈殿を別した。４−（３−アミノプロ
ピル）安息香酸4.36ｇ（収率73％）が得られ
た。この化合物は精製することなくつぎの反応
に用いた。 ４−（３−アミノプロピル）安息香酸900mg
（５ｍmol）を飽和NaHCO₃水溶液にとかした
溶液25ml中に０℃でメトキシカルボニルマレイ
ンイミド750mg（５ｍmol）を加えた。０℃で
10分間撹拌後、水50mlで希釈した。30℃で１時
間撹拌後、常法に従つて後処理を行ない、粗４
−（３−マレインイミドプロピル）安息香酸907
ｇ（収率70％）を得た。 粗４−（３−マレインイミドプロピル）安息
香酸3.86ｇ（14.9ｍmol）をＮ−ヒドロキシス
クシンイミド2.23ｇ（19.4ｍmol）、DCC3.97ｇ
（19.4ｍmol）及びDME100mlと混合し、混合物
を０℃で１時間、次いで室温で３時間撹拌し
た。通常の後処理を行なつて白色の固体を得
た。シリカゲルカラムクロマトグラフイー
（90：10 クロロホルム−酢酸エチル）を行つ
て４−（３−マレインイミドプロピル）安息香
酸スクシンイミドエステル（試薬８）の4.77ｇ
（収率90％）を得た。 mp；122〜124℃（塩化メチレン−エーテル） ３−（３−マレインイミドプロピル）安息香
酸スクシンイミドエステル（試薬９）の製造 上記と同様にして標記化合物（試薬９）を
得た。 mp；148〜149℃（塩化メチレン−エーテル） ３−〔４−マレインイミドプロピル）フエニ
ル〕プロピオン酸スクシンイミドエステル（試
薬10）の製造 ジイソプロピルアミン44ml（0.315mol）及
びTHF溶液200ml中にブチルリチウム1.70mold
ｍ^-3のヘキサン溶液168ml（286ｍmol）を０℃
で加えた。０℃で10分間撹拌後、−78℃に冷却
した。この中に酢酸ｔ−ブチル35ml（260ｍ
mol）を加え、１時間撹拌した。α，α′−ジブ
ロモ−ｐ−キシレン26.4ｇ（0.1mol）のTHF
溶液300mlを、リチウムエノラート中に加えた。
反応混合物を−78℃から室温で12時間撹拌後、
飽和シユウ酸水100mlを加えた。有機層を分離
後、エーテルで抽出した。有機層を乾燥
（MgSO₄）、濃縮してオイルを得た。これをシ
リカゲルカラムクロマトグラフイー（90：10
ヘキサン−エーテル）に供して３−〔４−（２−
ｔ−ブトキシカルボニルエチル）フエニル〕プ
ロピオン酸ｔ−ブチルの25.0ｇ（収率75％）を
オイルとして得た。 ３−〔４−（２−ｔ−ブトキシカルボニルエチ
ル）フエニル〕プロピオン酸ｔ−ブチル18.0ｇ
（54ｍmol）をLiAlH₄2.05ｇ（54ｍmol）及び
THF100mlと混合し、混合物を０℃で１時間撹
拌した。エーテル200mlで希釈後、1moldｍ^-3
のNaOH10mlを加えた。不溶物を除いた後、
液を濃縮してオイルを得た。これをシリカゲ
ルカラムクロマトグラフイー（80：20 ヘキサ
ン−酢酸エチル）に供し３−〔４−（３−ヒドロ
キシプロピル）フエニル〕プロピオン酸ｔ−ブ
チルの7.70ｇ（収率54％）をオイルとして得
た。 得られた３−〔４−（３−ヒドロキシプロピ
ル）フエニル）プロピオン酸ｔ−ブチルの4.82
ｇ（18.3ｍmol）にトリエチルアミン5.09ml
（36.6ｍmol）、メタンスルホニルクロリド2.84
ml（36.6ｍmol）及び塩化メチレン50mlを混合
し、これを室温で12時間撹拌した。濃縮後、ベ
ンゼンで希釈した。ベンゼン層を飽和NaCl水
で洗浄、乾燥（Na₂SO₄）、濃縮して３−〔４−
（３−メシロキシプロピル）フエニル〕プロピ
オン酸ｔ−ブチルの6.29ｇ（収率100％）をオ
イルとして得た。精製することなくつぎの反応
に用いた。 上記で得た３−〔４−（３−メシロキシプロピ
ル）フエニル〕プロピオン酸ｔ−ブチルにフタ
ルイミドカリウム6.77ｇ（36.6ｍmol）及び
DMF100mlを混合し、この混合物を90℃で３時
間撹拌した。反応混合物を氷水中に注ぎ込み、
次いでベンゼン−エーテル（１：１）で抽出
し、乾燥（Na₂SO₄）し、濃縮して黄色のオイ
ルを得た。これをシリカゲルカラムクロマトグ
ラフイー（97：３ ベンゼン−酢酸エチル）に
供し３−〔４−（３−フタルイミドプロピル）フ
エニル〕プロピオン酸ｔ−ブチルの5.75ｇ（収
率80％）をオイルとして得た。 上記３−〔４−（３−フタルイミドプロピル）
フエニル〕プロピオン酸ｔ−ブチルの6.88ｇ
（17.5ｍmol）にヒドラジン−水和物1.10ml
（22.8ｍmol）及びメタノール50mlを混合し、
混合物を１時間還流した。これを室温まで冷却
後、濃縮した。残渣を1moldｍ^-3NaOHの200
mlに溶解した後、エーテルで抽出し、乾燥
（K₂CO₃）し、濃縮して３−〔４−（３−アミノ
プロピル）フエニル〕プロピオン酸ｔ−ブチル
の4.14ｇ（収率90％）をオイルとして得た。 上記３−〔４−（３−アミノプロピル）フエニ
ル〕プロピオン酸ｔ−ブチルにトリフルオロ酢
酸６mlおよび塩化メチレン50mlを混合し、混合
物を室温で48時間撹拌した。濃縮後、残渣をト
ルエンで共沸した。ここで得られた残渣にエタ
ノール30mlおよび3moldｍ^-3KOH18mlを加え、
混合物を24時間還流した。室温まで冷却後、濃
縮してエタノールを除いた。水層を濃塩酸で中
和後濃縮して粗３−〔４−（３−アミノプロピ
ル）フエニル〕プロピオン酸3.42ｇを得た。こ
の化合物は精製せずにつぎの反応に用いた。 上記粗３−〔４−（３−アミノプロピル）フエ
ニル〕プロピオン酸を飽和NaHCO₃溶液とし、
この溶液90ml中に、０℃でメトキシカルボニル
マレインイミド2.64ｇ（17.5ｍmol）を加えた。
０℃で10分間撹拌後、水180mlで希釈した。反
応混合物を30℃で１時間撹拌後、濃硫酸でPH２
にした。酢酸エチルで抽出し、飽和NaCl水溶
液で洗浄液、乾燥（Na₂SO₄）、濃縮して３−
〔４−（３−マレインイミドプロピル）フエニ
ル〕プロピオン酸の3.16ｇ（収率70％）を得
た。 得られた３−〔４−（３−マレインイミドプロ
ピル）フエニル〕プロピオン酸2.48ｇ（8.64ｍ
mol）にＮ−ヒドロキシサクシンイミド1.29ｇ
（11.2ｍmol）、DCC2.31ｇ（11.2ｍmol）、およ
びDME50mlを混合し、混合物を０℃で１時間、
ついで室温で３時間撹拌した。反応混合物を０
℃に冷却し、これに数滴の酢酸を加え、更に１
時間撹拌後、不溶物を去した。液を濃縮し
て白色の固体を得た。これをシリカゲルカラム
クロマトグラフイー（70：30 塩化メチレン−
酢酸エチル）に供し３−〔４−（３−マレインイ
ミドプロピル）フエニル〕プロピオン酸サクシ
ンイミドエステル（試薬10）3.0ｇ（収率90％）
を得た。 mp；159〜160℃（塩化メチレン−エーテル） ３−〔２−（３−マレインイミドプロピル）フ
エニル〕プロピオン酸スクシンイミドエステル
（試薬11）の製造 上記と同様にして標記化合物（試薬11）を
得た。 IR（neat）；1822、1792、1740、1710cm^{-1 1}H−NMR（CDCl₃）；δ＝1.85（ｍ、2H）、2.69
（ｓ、4H）、2.69（ｍ、6H）、3.46（ｔ、Ｊ＝
6.2Hz、2H）、6.49（ｓ、2H）、7.03（ｓ、4H） MS（ｍ／ｚ）＝384（M⁺） 分析値；ｍ／ｚ＝384.1325 C₂₀H₂₀O₆N₂としての計算値；Ｍ＝384.1321 ３−〔３−（３−マレインイミドプロピル）フ
エニル〕プロピオン酸スクシンイミドエステル
（試薬12）の製造 上記と同様にして標記化合物を得た。 mp；121〜122℃（塩化メチレン−エーテル） ４−（２−マレインイミドフエニル）酪酸ス
クシンイミドエステル（試薬13）の製造 ２−（２−ニトロフエニル）エタノール5.51
ｇ（33.3ｍmol）、ジメチルスルホキシド50ml、
ベンゼン50ml及びDCC21ｇ（0.1mol）の混合
物中にトリフルオロ酢酸1.31ml（17ｍmol）と
ピリジン2.7ml（33.3ｍmol）とを加えた。反応
混合物を室温で４時間撹拌した後、この中にシ
ユウ酸二水和物8.82ｇ（70ｍmol）の水溶液
300mlを加えた。室温で30分間撹拌した後、酢
酸エチル500mlで希釈した。有機層を分離後、
飽和NaClで洗浄、乾燥（Na₂SO₄）、濃縮して
黄色のオイルを得た。シリカゲルカラムクロマ
トグラフイー（95：５ ベンゼン−酢酸エチ
ル）を行なつて２−ニトロフエニルアセトアル
デヒドを不安定なオイルとして得た。収量は
4.50ｇ（収率81％）であつた。 上記アルデヒド4.50ｇ（27ｍmol）にメトキ
シカルボニルメチレントリフエニルホスホラン
18.0ｇ（53ｍmol）および塩化メチレン100ml
を混合し、これを12時間還流した。室温まで冷
却後、濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフ
イー（97：３ ベンゼン−酢酸エチル）に供し
４−（２−ニトロフエニル）−３−ブテニツク酸
メチルと４−（２−ニトロフエニル）クロトン
酸メチルとの60：40混合物をオイルとして2.58
ｇ（収率43％）得た。 上で得られたニトロエステルの混合物1.71ｇ
（7.74ｍmol）に10％pd−C200mgおよびメタノ
ール30mlを混合し、混合物を室温で水素雰囲気
下３日間撹拌した。不溶物を除いた後、液を
濃縮して４−（２−アミノフエニル）酪酸メチ
ル1.0ｇ（収率67％）をオイルとして得た。 得られたオイル1.0ｇ（5.18ｇｍmol）に
1moldｍ^-3KOH10mlおよびエタノール20mlを
混合し、これを12時間還流した。室温まで冷却
後、濃縮してエタノールを除いた。水層を
1moldｍ^-3HClで中和した後、濃縮して粗４−
（２−アミノフエニル）酪酸1.02ｇを得た。こ
の化合物を精製することなくつぎの反応に用い
た。 上記で得た粗４−（２−アミノフエニル）酪
酸1.02ｇを飽和NaHCO₃に溶かし、NaHCO₃
水溶液26ml中に０℃でメトキシカルボニルマレ
イミド782mg（5.18ｍmol）を加えた。０℃で
10分間撹拌後、水50mlで希釈した。30℃で１時
間撹拌後、０℃に冷却し、これに数滴の酢酸を
加え、０℃で更に１時間撹拌し、不溶物を去
した。液を濃縮して黄色のオイルを得た。こ
れを分取し、TLC（70：30：0.5 酢酸エチル−
クロロホルム−酢酸）に供し、４−（２−マレ
インイミドフエニル）酪酸の367mg（４−（２−
アミノフエニル）酪酸メチルを基準にして収率
27％）をオイルとして得た。 得られた４−（２−マレインイミドフエニル）
酪酸367mg（1.42ｍmol）にＮ−ヒドロキシス
クシンイミド212mg（1.85ｍmol）、DCC381mg
（1.85ｍmol）およびDME20mlを混合し、混合
物を０℃で１時間、室温で３時間撹拌した。次
いで反応混合物を０℃に冷却し、これに数滴の
酢酸を加え、０℃で１時間撹拌し、不溶物を
去後、液を濃縮して黄色のオイルを得た。こ
れを分取TLC（70：30 クロロホルム−酢酸エ
チル）に供して、標記目的化合物379mg（収率
75％）をオイルとして得た。 IR（CHCl₃）；1808、1780、1745、1708cm^{-1 1}H−NMR（CDCl₃）；δ＝2.94（ｍ、2H）、2.46
（ｍ、4H）、2.69（ｓ、4H）、6.69（ｓ、2H）、
7.23（ｍ、4H） MS（ｍ／ｚ）＝356（M⁺） 分析値；ｍ／ｚ＝356.1006 C₁₈H₁₆O₆N₂としての計算値；Ｍ＝356.1008 ４−（３−マレイミドフエニル）酪酸スクシ
ンイミドエステル（試薬14）の製造 上記と同様にして標記目的化合物（試薬
14）をオイルとして得た。 IR（CHCl₃）；1808、1780、1743、1718cm^{-1 1}H−NMR（CDCl₃）；δ＝2.02（ｍ、2H）、2.63
（ｍ、4H）、2.73（ｓ、4H）、6.69（ｓ、2H）、
7.06（ｍ、4H） MS（ｍ／ｚ）＝356（M⁺） 分析値；ｍ／ｚ＝356.1006 C₁₈H₁₆O₆N₂としての計算値；Ｍ＝356.1008 12−マレインイミドドデカン酸スクシンイミ
ドエステル（試薬15）の製造 12−アミノドデカン酸4.30ｇ（20ｍmol）、
無水マレイン酸2.0ｇ（20ｍmol）およびクロ
ロホルム200mlの混合物を室温で２時間、つい
で５時間還流した。反応混合物を室温まで冷却
後、約50mlになるまで濃縮した。０℃に冷却
し、析出した沈殿を別した。このものは、つ
ぎの反応にそのまま用いた。 上で得た固体に酢酸ナトリウム820mg（10ｍ
mol）および無水酢酸20mlを混合し、混合物を
90℃で１時間撹拌した。濃縮後、残渣を酢酸エ
チルで希釈した。飽和食塩水で洗浄、乾燥
（Na₂SO₄）、濃縮して、黄色の半固体を得た。
これをTHF（30ml）−H₂O（50ml）−CH₃COOH
（10ml）に溶解後、混合物を室温で１時間撹拌
した。濃縮後、酢酸エチルで抽出、乾燥
（Na₂SO₄）、濃縮、トルエンで共沸して黄色の
固体を得た。これをシリカゲルカラムクロマト
グラフイー（90：10：0.5 ベンゼン−酢酸エ
チル−酢酸から70：30：0.5 ベンゼン−酢酸
エチル−酢酸）に供して白色の固体を1.23ｇを
得た。この固体1.23ｇ（4.32ｍmol）をＮ−ヒ
ドロキシサクシンイミド595mg（5.18ｍmol）、
DCC1.07ｇ（5.18ｍmol）およびDME30mlと混
合し、混合物を０℃で１時間、次いで室温で３
時間撹拌した後、０℃に冷却し、これに数滴の
酢酸を加え、０℃で更に１時間撹拌後、不溶物
を去し、液を濃縮して、白色の固体を得
た。これをシリカゲルカラムクロマトグラフイ
ー（２：１酢酸エチル−ヘキサン）に供し、12
−マレインイミドドデカン酸スクシンイミドエ
ステル1.52ｇ（収率90％）を得た。 mp；67〜68℃（塩化メチレン−エーテル−ヘ
キサン） 上記各例で得た試薬及びその他の蛋白結合試
薬の構造式を下記第１表に示す。尚表中の既知
化合物は備考の項に引用文献又は製造社名を併
記する。

【表】

【表】

【表】

【表】

【表】

【表】

【表】 実施例 １ LMW−UK（日本ケミカルリサーチ社製）を
アミコンPM−10にて濃縮後0.01M−リン酸ナ
トリウム塩緩衝液（PH＝7.0）にて透析する。
内液を遠心分離（8000rpm×10分）して得た上
清（LMW−UK量約１ミリモル）に6.7ミリモ
ルのｍ−マレイミドベンゾイル Ｎ−ヒドロキ
シサクシンイミドエステル（化合物コード番号
NS2002、Pierce社、以下MBSをいう）の
DMF溶液を撹拌しながら滴下し、室温で30分
撹拌する。これを脱気した0.1Mリン酸ナトリ
ウム塩緩衝液（PH＝6.0）にて平衡化したセフ
アデツクスＧ−25フアインカラム（フアルマシ
ア社製、、1.5cmφ×20cm）に付し、同緩衝液に
て展開する。280nｍでの吸光度のピーク画分
を分取して、MB基が結合したLMW−UK0.9
ミリモルを得る。このものはLMW−UK1モル
に対してMB基が平均2.7モル結合していた。 参考例１のと同一操作により得たプラスミ
ンHC123mg及び上記で得たMB基含有LMW
−UK29.5mgを混合し、充分窒素置換し、室温
下３時間撹拌する。これに２−メルカプトエタ
ノールを最終１ｍＭ濃度となるように加え、10
分撹拌後、Ｎ−エチルマレイミドを最終２ｍＭ
濃度となるように加え室温下に20分撹拌する。
これを0.4M−NaClを含有する0.1M−リン酸ナ
トリウム塩緩衝液にて平衡化したセフアデツク
スＧ−25フアインカラム（フアルマシア社製；
2.6cmφ×30cm）にてゲル過し280nｍの吸光
度のピーク画分を分取し、これを上記緩衝液で
平衡化したベンズアミジン−CH−セフアロー
ス（ホルムベルグ（L.Holmberg）らの方法
〔Biochemica et Biophysica Acta、445、215
（1976）〕に準じて作製した）のカラム（2.5cm
φ×5.8cm）に付し、同緩衝液900mlで洗浄後、
0.1M−NaClを含有する0.1M酢酸水溶液及び
6M−尿素水溶液で溶出し、その280nｍの吸光
度ピーク画分を合わせ、これを0.1M炭酸水素
アンモニウム水溶液で平衡化したセフアデツク
スＧ−25カラム（５cmφ×25cm）にてゲル過
後、得られた吸光度ピークの画分を0.1M−炭
酸水素アンモニウム水溶液で平衡化したリジン
−セフアロースカラム（1.6cmφ×14cm）に付
し、同液400ml、次いで0.2M6−アミノヘキサ
ン酸水溶液100mlで洗浄後、2M−KSCN水溶液
にて溶出する。溶出液の吸光度ピークの画分を
脱塩後、アミコンPM−10にて濃縮して、プラ
スミンHC−LMW−UK複合体（以下「複合体
Ａ」とする）22.3mgを得る。 得られた複合体Ａは、SDS−PAGEにて分子
量８〜９万のバンドとして確認され、LMW−
UK1モルに対してプラスミンHCが約１モル結
合したものである。 実施例 ２〜４ 前記実施例１において蛋白結合試薬として
MBSの代りに、前記第１表に示す以下の各化合
物を使用し、同様にして下記第２表のプラスミン
HC−LMW−UK複合体の夫々を得る。

【表】 得られた各複合体（複合体Ｂ〜Ｄ）は、SDS−
PAGEにて、いずれも８〜９万のバンドとして確
認され、LMW−UK及びプラスミンHCのモル比
は約１：１である。 実施例 ５ LMW−UK（日本ケミカルサーチ社製）をア
ミコンPM−10にて濃縮後0.01M−リン酸ナト
リウム塩緩衝液（PH＝7.0）にて透析する。内
液を遠心分離（8000rpm×10分）して得た上清
（LMW−UK量50万単位／ml）１mlに４ミリモ
ルのMBSのDMF溶液を撹拌しながら滴下し、
室温で30分撹拌する。これを脱気した0.1Mリ
ン酸ナトリウム塩緩衝液（PH＝7.0）にて平衡
化したセフアデツクスＧ−25フアインカラム
（1.5cmφ×20cm）に付し、同緩衝液にて展開す
る。280nｍでの吸光度のピーク画分を分取し
て、MB基が結合したLMW−UK40万単位を
得る。このものはLMW−UK1モルに対して
MB基が平均２モル結合していた。 LMW−UK（日本ケミカルサーチ社製）をア
ミコンPM−10にて濃縮後0.01M−リン酸ナト
リウム塩緩衝液（PH＝7.0）にて透析する。内
液を遠心分離（8000rpm×10分）して得た上清
（LMW−UK量50万単位／ml）１mlに0.7μモル
のMBSのDMF溶液を撹拌しながら滴下し、室
温で30分撹拌する。これを脱気した0.1Mリン
酸ナトリウム塩緩衝液（PH＝7.0）にて平衡化
したセフアデツクスＧ−25フアインカラム
（1.5cmφ×20cm）に対し、同緩衝液にて展開す
る。280nｍでの吸光度のピーク画分を分取し
て、MB基が結合したLMW−UK40万単位を
得る。このものはLMW−UK1モルに対して
MB基が平均２モル結合していた。 参考例１のと同一操作により得たプラスミ
ンHC8mg及び上記又はで得たMB基含有
LMW−UK40万単位（2.05mg）を混合し、充
分窒素置換し、室温下３時間撹拌する。これに
２−メルカプトエタノールを最終１ｍＭ程度と
なるように加え、10分撹拌後、Ｎ−エチルマレ
イミドを最終２ｍＭ濃度となるように加え室温
下に20分撹拌する。これを0.4M−NaClを含有
する0.1M−リン酸ナトリウム塩緩衝液にて平
衡化したセフアデツクスＧ−25フアインカラム
（上記に同じ、2.6cmφ×30cm）にてゲル過し
280ｍｍの吸光度のピーク画分を分取し、これ
を上記緩衝液で平衡化したベンズアミジン−
CH−セフアロース（上記に同じ）に付し、同
緩衝液900mlで洗浄後、0.1M−NaClを含有す
る0.1M酢酸水溶液及び6M−尿素水溶液で溶出
し、その280nｍの吸光度のピーク画分を合わ
せ、これを0.1M炭酸水素アンモニウム水溶液
で平衡化したセフアデツクスＧ−25カラム（５
cmφ×25cm）にてゲル過後、得られた吸光度
ピークの画分を0.1M−炭酸水素アンモニウム
水溶液で平衡化したリジン−セフアロースカラ
ム（1.6cmφ×14cm）に付し、同液400ml、次い
で0.2M6−アミノヘキサン液にて溶出する。溶
出液の吸光度ピークの画分を脱塩後、アミコン
PM−10にて濃縮して、プラスミンHC−LMW
−UK複合体（以下「複合体Ｅ」とする）20万
単位（4.5mg）を得る。得られた複合体Ｅは、
SDS−PAGEにて分子量約９万のバンドとして
確認され、LMW−UK1モルに対してプラスミ
ンHCが約１モル結合したものである。 実施例 ６〜27 前記実施例５において、蛋白結合試薬として
MBSの代わりに前記第１表に示す以下の各化合
物を使用し、同様にして、下記第３表の各プラス
ミンHC−LMW−UK複合体を得る。

【表】

【表】 之等各複合体は、SDS−PAGEにて、いずれも
約９万のバンドとして確認され、LMW−UK及
びプラスミンHCのモル比は約１：１である。 ＜薬理試験＞ (1) フイブリン溶解活性試験 (イ) 実施例１で得た複合体Ａにつき、フイブリ
ン平板法（Ａ法）により、その溶解活性を測
定した。結果を第１図に示す。 第１図中、ヨコ軸は合成基質法により測定
したウロキナーゼ活性（単位／ml）を、タテ
軸は本法による溶解円の直径（mm）を示す。
また第１図において線１は本発明実施例１で
得た複合体Ａを、また線２はLMW−UK（コ
ントロール）をそれぞれ示す。 該図より複合体Ａは、10単位／mlでは、コ
ントロールのLMW−UKと同程度のフイブ
リン溶解活性を保持しており、更に低濃度で
はコントロールよりも高い溶解活性を示すこ
とが明らかである。 (ロ) 実施例５〜27で得た複合体の数種につき、
フイブリン平板法（Ｂ法）により、その溶解
活性を測定した。尚、プラスミンインヒビタ
ーの存在下に同様な溶解活性試験を行つた。 結果を第２図に示す。第２図中、ヨコ軸は
合成基質法により測定したウロキナーゼ活性
（単位／ml）を、タテ軸は、本法による溶解
円の直径（mm）を示す。また第２図において
線３〜８は夫々以下のことを示す。 ３；LMW−UK（コントロール） ４；複合体Ｅ ５；複合体Ｇ ６；複合体Ｎ ７；LMW−UK＋プラスミンインヒビター ８；複合体Ｅ＋プラスミンインヒビター 尚、プラスミンインヒビター添加群は、ヒ
ト血漿より、M.Moroi等の方法〔J.Biol
Chem.251、5956（1976）〕に従つて得たプラ
スミンインヒビターを、サンプル0.5mlに対
して0.5ml加え、同様に測定した。 第２図より、複合体Ｅ，Ｇ及びＮは、ウロ
キナーゼ溶解活性を保持しており、１〜100
単位／mlではコントロールのLMW−UKよ
りも高い溶解活性を示しており、さらに複合
体Ｅはプラスミンインヒビターの存在下でも
４〜20単位／mlではLMW−UKよりも高い
溶解活性を示していることが明らかである。 尚、前記各実施例で得た他の複合体につき
同一試験を行なつた結果、いずれの複合体も
略々同様のウロキナーゼ活性を有しているこ
とが確認された。 (2) フイブリン吸着能試験 (イ) 実施例１で得た複合体Ａのフイブリン結合
能を下記方法により試験した。即ちフイブリ
ン−モノマー−セフアロース6B（ハーネ（D.
L.Heene）らの方法〔Thrombosis
Research、２、137（1973）〕に準じて作成し
た）の３mlを充填したカラムを0.135M
Naclを含有する0.005Mリン酸ナトリウム塩
緩衝液（PH＝7.4）で平衡化後、上記緩衝液
に溶解した複合体Ａ、HMW−UK、プラス
ミノーゲン又はプラスミンHC（各２〜３mg）
をアプライし、上記緩衝液30mlにて洗浄す
る。10ｍＭ−６−アミノヘキサン酸を含有す
る上記緩衝液にて溶出し、プラスミノーゲン
及びプラスミンHCは、溶出画分の280nｍに
おける吸収より、又複合体Ａ及びHMW−
UKは、溶出画分のウロキナーゼ活性を合成
基質法により測定した活性より、夫々の溶出
画分への回収率を求め、これをフイブリン吸
着能とする。 上記試験の結果、複合体Ａは、プラスミノ
ーゲン（24％）の約1/2及びプラスミンHC
（39％）の約1/4のフイブリン吸着能を保持
し、ウロキナーゼ（約１％）に比較して約10
倍の強いフイブリン吸着能（10％）を示し
た。 (ロ) 複合体のフイブリン結合能をまた、下記方
法により試験した。即ちフイブリン−モノマ
ー−セフアロース6B（上記に同じ）の20mlを
充填したカラムの0.135M NaClを含有する
0.005Mリン酸ナトリウム塩緩衝液（PH＝
7.4）で平衡化後、上記緩衝液に溶解した本
発明の各複合体、HMW−UK又はプラスミ
ンHC（各0.5mg）をアプライし、上記緩衝液
200mlにて洗浄する。10ｍＭ−６−アミノヘ
キサン酸を含有する上記緩衝液及び2M−
KSCNを含有する同緩衝液にて溶出し、プラ
スミンHCは、280nｍにおける吸収より、又
各複合体及びHMW−UKは、ウロキナーゼ
活性を合成基質法により測定した活性より、
フイブリン吸着分及び非吸着分を合せた総回
収率に対する吸着分（溶出画分）の百分率を
求め、これをフイブリン吸着能とする。 結果を下記第４表に示す。

【表】 また上記と同一試験を、複合体Ｅ及びＯ以
外の前記各実施例で得た複合体につき繰返し
たところ、いずれの複合体も略々同様の吸着
能（％）を示した。これらのことより試験さ
れた複合体は、プラスミンHCに由来する強
いフイブリン吸着能を保持していることが確
認される。 (3) ウサギ実験肺塞栓症に対する治療効果 この試験は、マツオ（O.Matsuo）らの方法
〔Nature、291、590（1981）〕に準じて行なつ
た。即ち¹²⁵−フイブリノーゲンを混合した
新鮮ヒト血液から人工血栓を調製し、これを麻
酔下にウサギ頚静脈より注入し、肺塞栓症モデ
ルを作成する。実施例１で得た複合体Ａ又はコ
ントロールとしてのHMW−UK又は生理食塩
水を、耳静脈より６時間かけて持続注入し、経
時的に採血してその放射活性を測定し、投与し
た血栓の全放射活性より、その百分率を算定す
る。また、９時間後、肺を取出し、残存血栓を
回収し、その放射活性より、投与血栓の溶解率
を求める。更に肺及び尿中への放射活性の回収
率を算定する。尚、放射活性総回収率は、血
液、尿、肺及び回収血栓の放射活性の合計を、
投与した人工血栓の放射活性に対する百分率と
して算定した。 結果を下記第５表に示す。

【表】

【表】 上記第５表から明らかように、HMW−
UK5万単位／body投与では、生理食塩水のみ
の場合と全く変らないが、複合体Ａの５万単位
投与群では、血中の放射活性は全期間を通じて
有意に高く、また尿中への排泄量も多くなつて
いる。更に回収した血栓の放射活性から換算し
た血栓溶解率も10％程度にまで上昇しており、
有意に高い血栓溶解作用が認められることが判
る。なお複合体Ａ投与群においては出血傾向は
全く見られなかつた。 また上記試験結果は、複合体Ａに代え複合体
Ｂ〜AAのいずれを用いる場合も、略々同様と
なることが確認された。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図は、本発明血栓症治療剤にお
いて有効成分とする複合体のフイブリン溶解活性
を示す図面である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ フイブリン吸着性蛋白質とウロキナーゼと
   を、 一般式 〔式中Ｒはフエニレン基又はシクロアルキレン基
   を、Ａは低級アルキレン基を、Ｂは置換基として
   低級アルキルチオ基又はフエニル低級アルキルチ
   オ基を有することのある低級アルキレン基を、
   ｌ、ｍ及びｎは各々０又は１を示す。但しｌ、ｍ
   及びｎは同時に０であつてはならない。〕 で表わされる蛋白結合試薬の存在下に反応させて
   得られるフイブリン吸着性蛋白質−ウロキナーゼ
   複合体を有効成分として含有することを特徴とす
   る血栓症治療剤。