JPH0455680B2 - - Google Patents
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- JPH0455680B2 JPH0455680B2 JP59233421A JP23342184A JPH0455680B2 JP H0455680 B2 JPH0455680 B2 JP H0455680B2 JP 59233421 A JP59233421 A JP 59233421A JP 23342184 A JP23342184 A JP 23342184A JP H0455680 B2 JPH0455680 B2 JP H0455680B2
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
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- G01N2333/904—Oxidoreductases (1.) acting on CHOH groups as donors, e.g. glucose oxidase, lactate dehydrogenase (1.1)
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- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
産業上の利用分野
本発明はグリセリンキナーゼを使用するグリセ
リンの測定法及び測定試薬に関する。 従来技術 グリセリンを、場合によりそのエステルから化
学的又は酵素的鹸化によりあらかじめ遊離させた
後、グリセリンキナーゼ（GK）の存在でATPと
反応させグリセリン−３−リン酸及びADPを形
成させ、少なくとも１種の後続反応によりこれら
の反応生成物の１個を測定することによりグリセ
リンを測定することは公知である（H.U.Berg
meyer著、“Methoden derenzymatischen
Analyse”第３改訂版、第1448頁もしくは第1872
頁）。この酵素によるグリセリン測定法はその特
異性により以前常用されていた化学的測定に対し
著しい進歩をもたらしたが、該方法は迅速で使用
可能な動力学的な実施に今なを好適ではない。反
応経過の最も特異的な部分工程を触媒するグリセ
リンキナーゼのKM値が低いので、該反応はグリ
セリン測定に重要な濃度範囲において１次もしく
は偽１次で進行しない。しかしながら、このよう
な反応経過は、１回の分析あたり必要な時間を従
来必要な終点法もしくは動力学的な方法に対して
著しく短縮することを可能とする、試料空値を必
要としない、迅速で、使用可能な動力学的測定法
には必要である。この際、従来の測光法のために
必要な時間は10分〜６分の間であり：動力学的な
方法では１分〜３分の分析時間が努力して得られ
る。新しい時代の自動分析機は高い試料処理量を
想定しており、グリセリン検出の分野において従
来の方法で達成することのできない非常に短かい
恒温保持時間を可能とする。従つて、今日常用の
高い分析頻度の自動分析機は完全に能力を出しき
ることができていないのです。 従つて、本発明の課題はグリセリンキナーゼ反
応のための、為一次に進行する動力学的測定法を
確立することである。 関与する酵素のKM値が低すぎるこの種の反応
経過を、人工的なKM−値上昇により達成するこ
とが多くの場合可能であるということも公知であ
る。ミハエリス（Michaelis）及びメントン
（Menton）の理論によれば、酵素のミハエチル
定数が最大基室濃度より著しく大である場合酵素
により触媒される１基質反応は広い濃度範囲にわ
たつて１次で進行する。種々の微生物種類、例え
ばバチルス属、大腸菌、カンジダ属、セルロモナ
ス属、ストレプトマイセス属又は酵母から従来公
知のグリセリンキナーゼのKM−値（グリセリン）
はほぼ10-4〜10-5Mol／を示し、低い濃度のグ
リセリンのみが動力学的に測定される。競合的抑
制剤の添加により酵素のKM−値を人工的に高め
ることも公知であるが、GKのための好適な競合
的抑制剤はまだ知られていない。 発明が解決しようとする問題点 従つて、本発明の課題は多工程酵素法の範囲に
おいて動力学的グリセリン測定を可能とし、かつ
高い頻度の自動分析機にも好適である方法及び試
薬を開発することである。この方法は更に程色試
験としての実施可能であり、試験片にも使用可能
であるのが良い。 問題点を解決するための手段 この課題はグリセリンキナーゼ及び場合により
グリセリドのエステラーゼの存在でATPと反応
させグリセリン−３−ホスフエート及びADPを
形成させ、これらの反応生成物の１種の少なくと
も１種の後続の酵素反応を用いて測定することに
より遊離又は結合した形のグリセリンを測定する
方法において、該測定の動力学的に実施する際
に、一般式 〔式中、Ｃ−原子２及び３はＤ−スレオ−配置を
示し、Ｒは炭素原子数１〜３のモノヒドロキシ又
はポリヒドロキシアルキル基を表わす］の糖をグ
リセリンキナーゼの抑制剤として添加し、ATP
との反応を全反応の速度を規定する為一次反応と
して進行させることにより解決する。 本発明は記載した一般式の糖がGKの競合的抑
制剤であり、従つてKMの変化のために著しく好
適であるという従来予想できなかつた確認にもと
ずく。 本発明において使用可能な抑制剤の典型的な例
はＤ−トレオース（Ｒ＝CH2OH）、Ｌ−キシロ
ース、Ｄ−アラビノース（Ｒ＝CHOH−
CH2OH）、Ｌ−フコース（Ｒ＝CHOH−CHOH
−CH3）、Ｌ−ガラクトース、Ｌ−グルコース
（Ｒ＝CHOH−CHOH−CH2OH）である。有利
にＬ−キシロースを使用する。 本発明方法の範囲において一般式の糖を有利
に１〜200ｍMol／の量で使用する。それぞれ
必要な量は一方では必要なKMに、他方ではGKの
量により決まる。GK自体は一般に102〜104U／
の量で使用されるが、これにより、より少量又
は多量であつてもよい。 動力学的な測定は専門家に公知の方法で行なわ
れ、予め決定した時間間隔で少なくとも２回実施
する。この際適な結果は約7.5〜約8.5のPH値範囲
で達せられるが、助酵素により生じる条件に応じ
てこの範囲からはずれてもよい。 どのような助酵素をさらに必要とするかは、速
度規定反応の反応生成物である、グリセリン−３
−ホスフエート又はADPのいずれを測定するべ
きかにより決まる。本発明の有利な実施態様によ
れば、生じたグリセリン−３−ホスフエートをグ
リセリン−３−ホスフエートオキシダーゼと反応
させジヒドロキシアセトンホスフエート及び
H2O2とし、H2O2を定法で測定する。本発明のこ
の実施形式は次のような反応方程式により明らか
となる： (1)トリグリセリド＋3H2OエステラーゼEC3.1.1 ―――――――――――――――→ グリセリン＋脂肪酸 (2)グリセリン＋ATPGK EC2.7.1.30 ―――――――――――→ 一般式の化合物グリセリン−３−ホスフエート＋ADP (3)グリセリン−３−ホスフエート＋O2GPO ――――→ ジヒドロキシアセトンホスフエート＋H2O2 前記の式が示すように、この際H2O2が生じ、
このH2O2を例えばペルオキシダーゼと共に、フ
エノール及び４−アミノアンチピリンの存在下に
グツド（GOOD）−緩衝液中で直接測定可能な色
素に変換する。 前記反応(3)が酸素使用下に経過するので、
H2O2のかわりにジヒドロキシアセトンホスフエ
ート又は酸素消費量を測定することもできる。 更に、生じたADPを測定することもできる。 この測定は前記の反応方程式(3)を次の方程式(4)
及び(5)により変換する。 (4)ADP＋PEPPK ―――→ ピルベート＋ATP (5)ピルベート＋NADHLDH ――――→ ラクテート＋
NAD+ この際UVで直接NADH減少を追跡できる。 この測定の際にADPをホスホエノールピルベ
ートと、ピルベートキナーゼの存在でピルベート
に変換し、このピルベートを再びNADHとラク
テートデヒドロゲナーゼの存在で反応させ、ラク
テート及びNAD+とする。 本発明のもう１つの実施形によれば、生じたグ
リセリン−３−ホスフエートをNAD+とグリセリ
ンホスフエートデヒドロゲナーゼの存在でジヒド
ロキシアセトンホスフエート及びNADHの形成
下に反応させることにより前記グリセリン−３−
ホスフエートを測定する。該NADHは直接UVで
又はジアホラーゼの存在下にテトラゾリウム塩と
反応させることにより測定するが、その際後者の
場合には生じたホルマザン色素を測定する。 この反応は次の反応方程式(6)及び(7)により表わ
され、これは前記反応方程式(3)のかわりである。 (6)NAD+＋グリセリン−３−ホスフエートグリセ
リンホスフエートデヒドロゲナーゼ ――――――――――――――――――――→ NADH＋ジヒドロキシアセトンホスフエート (7)NADH＋テトラゾリウム塩ジアホラーゼ ―――−――――→ NAD+＋ホルマザン 本発明による方法は有利に非イオン界面活性剤
及び場合により付加的にコール酸群の界面活性剤
の存在で実施することができる。 使用したグリセリンキナーゼの由来に関しては
何ら制限はない。本発明の範囲において使用可能
なグリセリンキナーゼの典型的な例はバチルス・
ステアロテルモフイラス（Bacillus
stearotheromphilus）、大腸菌、カンジダ・ミコ
デルマ（Candidf mycoderma）、ストレプトマ
イセス カヌス（Sireptomyces Canus）、セル
ロモナス種（Cellulmonas species）及び酵母か
らの酵素である。他の生産源からの該酵素は市販
されていない。バチルス・ステアロテルモフイラ
スからの酵素を使用するのが有利である。 本発明のもう１つの課題はグリセリンキナー
ゼ、ATP及びグリセリン−３−ホスフエート又
はADPの測定用のシステム及び場合によりグリ
セリドのエステラーゼを含有するグリセリンの動
力学的測定のための試薬において、付加的に一般
式 〔式中、Ｃ−原子２及び３はＤ−スレオ−配置を
示し、Ｒは炭素原子数１〜３のモノヒドロキシ又
はポリヒドロキシアルキル基を表わす］の糖をグ
リセリンキナーゼの抑制剤として含有するグリセ
リンの動力学的測定試薬である。 本発明による試薬の組成はグリセリン−３−ホ
スフエート又はADPの測定のためにそれぞれ使
用したシステムにより性質的に決められる。 組成の量に関しては方法と関連させた前記の説
明と同じことが言える。こうして該試薬は有利に
一般式の化合物１〜200ｍMol／が得られる。
一般式の有利な化合物はＬ−キシロースであ
る。 グリセリン−３−ホスフエートの測定用システ
ムは有利にグリセリン−ホスフエート−オキシダ
ーゼ及びH2O2又はジヒドロキシアセトンホスフ
エート測定用システムとからなつているか、又は
グリセリンホスフエートデヒドロゲナーゼ、
NAD+、テトラゾリウム塩及びジアホラーゼから
なつている。 H2O2を測定するためのシステムは有利に４−
アミノアンチピリン、フエノール又はフエノール
誘導体、緩衝剤及び界面活性剤からなつている。 本発明による試薬がADPを測定するためのシ
ステムを含有するならばこのシステムは有利にホ
スホエノールピルベート、ピルベートキナーゼ、
NADH及ラクテートデヒドロゲナーゼからなる。 特に有利な組成において、反応方程式１〜３に
相応する本発明による試薬は グリセリンキナーゼ 102〜104U／、 グリセリンホスフエートオキシダーゼ
102〜104U／、 コレステリン・エステラーゼ
103〜２×104U／、 ペルオキシダーゼ 102〜104U／、 Ｌ−キシロース １〜20ｍMol／、 ４−アミノアンチピリン 0.1〜１ｍMol／、 フエノール又はフエノール誘導体
１〜10ｍMol／、 非イオン界面活性剤 １〜20ｇ／、 コール酸群の界面活性剤 ０〜15ｍMol／、 緩衝剤、PH7.5〜8.5 50〜200ｍMol／、 からなる。 緩衝物質としては記載したPH範囲で作用を有す
る緩衝剤を使用する。有利にはグツド（GOOD）
緩衝剤である。 本発明による試薬は常用の分析装置及び自動分
析機での実施に使用することができ、このことに
関しては例において詳説する。この試薬は固体担
体例えば紙テープに含浸させて存在させることも
できる。この場合には色素形成が同様に定量的に
動力学的に測定される。 本発明により使用した抑制剤の作用は添付した
図面からも明らかである。 本発明は血清又は血漿、例えばヘパリン−又は
EDTA血漿中のグリセリンもしくはトリグリセ
リドを測定するために使用することができる。 実施例 例 １ 使用した試薬： トリス／HCl−緩衝剤、PH7.6 0.15Mol／ MgSO4×7H2O 17.5ｍMol／ EDTA、ジナトリウム塩 10ｍMol／ ４−クロルフエノール 3.5ｍMol／ コール酸ナトリウム 0.15％ 界面活性剤 0.12％ ATP ≧0.5ｍMol／ ４−アミノアンチピリン＝0.35ｍMol／ エステラーゼ ≧3U／ml グリセリンホスフエートオキシダーゼ
≧2.5U／ml グリセリンキナーゼ ≧0.2U／ml ペルオキシダーゼ ≧0.15U／ml 測定条件： 波長：Hg546分光光度計：500nｍ キユベツト：層厚１cm 恒温保持温度：20〜25℃又は37℃ RLに対する測定：（吸光上昇） それぞれの測定列に１つの試薬空値（RL）及
び１つのスタンダードで十分である。
リンの測定法及び測定試薬に関する。 従来技術 グリセリンを、場合によりそのエステルから化
学的又は酵素的鹸化によりあらかじめ遊離させた
後、グリセリンキナーゼ（GK）の存在でATPと
反応させグリセリン−３−リン酸及びADPを形
成させ、少なくとも１種の後続反応によりこれら
の反応生成物の１個を測定することによりグリセ
リンを測定することは公知である（H.U.Berg
meyer著、“Methoden derenzymatischen
Analyse”第３改訂版、第1448頁もしくは第1872
頁）。この酵素によるグリセリン測定法はその特
異性により以前常用されていた化学的測定に対し
著しい進歩をもたらしたが、該方法は迅速で使用
可能な動力学的な実施に今なを好適ではない。反
応経過の最も特異的な部分工程を触媒するグリセ
リンキナーゼのKM値が低いので、該反応はグリ
セリン測定に重要な濃度範囲において１次もしく
は偽１次で進行しない。しかしながら、このよう
な反応経過は、１回の分析あたり必要な時間を従
来必要な終点法もしくは動力学的な方法に対して
著しく短縮することを可能とする、試料空値を必
要としない、迅速で、使用可能な動力学的測定法
には必要である。この際、従来の測光法のために
必要な時間は10分〜６分の間であり：動力学的な
方法では１分〜３分の分析時間が努力して得られ
る。新しい時代の自動分析機は高い試料処理量を
想定しており、グリセリン検出の分野において従
来の方法で達成することのできない非常に短かい
恒温保持時間を可能とする。従つて、今日常用の
高い分析頻度の自動分析機は完全に能力を出しき
ることができていないのです。 従つて、本発明の課題はグリセリンキナーゼ反
応のための、為一次に進行する動力学的測定法を
確立することである。 関与する酵素のKM値が低すぎるこの種の反応
経過を、人工的なKM−値上昇により達成するこ
とが多くの場合可能であるということも公知であ
る。ミハエリス（Michaelis）及びメントン
（Menton）の理論によれば、酵素のミハエチル
定数が最大基室濃度より著しく大である場合酵素
により触媒される１基質反応は広い濃度範囲にわ
たつて１次で進行する。種々の微生物種類、例え
ばバチルス属、大腸菌、カンジダ属、セルロモナ
ス属、ストレプトマイセス属又は酵母から従来公
知のグリセリンキナーゼのKM−値（グリセリン）
はほぼ10-4〜10-5Mol／を示し、低い濃度のグ
リセリンのみが動力学的に測定される。競合的抑
制剤の添加により酵素のKM−値を人工的に高め
ることも公知であるが、GKのための好適な競合
的抑制剤はまだ知られていない。 発明が解決しようとする問題点 従つて、本発明の課題は多工程酵素法の範囲に
おいて動力学的グリセリン測定を可能とし、かつ
高い頻度の自動分析機にも好適である方法及び試
薬を開発することである。この方法は更に程色試
験としての実施可能であり、試験片にも使用可能
であるのが良い。 問題点を解決するための手段 この課題はグリセリンキナーゼ及び場合により
グリセリドのエステラーゼの存在でATPと反応
させグリセリン−３−ホスフエート及びADPを
形成させ、これらの反応生成物の１種の少なくと
も１種の後続の酵素反応を用いて測定することに
より遊離又は結合した形のグリセリンを測定する
方法において、該測定の動力学的に実施する際
に、一般式 〔式中、Ｃ−原子２及び３はＤ−スレオ−配置を
示し、Ｒは炭素原子数１〜３のモノヒドロキシ又
はポリヒドロキシアルキル基を表わす］の糖をグ
リセリンキナーゼの抑制剤として添加し、ATP
との反応を全反応の速度を規定する為一次反応と
して進行させることにより解決する。 本発明は記載した一般式の糖がGKの競合的抑
制剤であり、従つてKMの変化のために著しく好
適であるという従来予想できなかつた確認にもと
ずく。 本発明において使用可能な抑制剤の典型的な例
はＤ−トレオース（Ｒ＝CH2OH）、Ｌ−キシロ
ース、Ｄ−アラビノース（Ｒ＝CHOH−
CH2OH）、Ｌ−フコース（Ｒ＝CHOH−CHOH
−CH3）、Ｌ−ガラクトース、Ｌ−グルコース
（Ｒ＝CHOH−CHOH−CH2OH）である。有利
にＬ−キシロースを使用する。 本発明方法の範囲において一般式の糖を有利
に１〜200ｍMol／の量で使用する。それぞれ
必要な量は一方では必要なKMに、他方ではGKの
量により決まる。GK自体は一般に102〜104U／
の量で使用されるが、これにより、より少量又
は多量であつてもよい。 動力学的な測定は専門家に公知の方法で行なわ
れ、予め決定した時間間隔で少なくとも２回実施
する。この際適な結果は約7.5〜約8.5のPH値範囲
で達せられるが、助酵素により生じる条件に応じ
てこの範囲からはずれてもよい。 どのような助酵素をさらに必要とするかは、速
度規定反応の反応生成物である、グリセリン−３
−ホスフエート又はADPのいずれを測定するべ
きかにより決まる。本発明の有利な実施態様によ
れば、生じたグリセリン−３−ホスフエートをグ
リセリン−３−ホスフエートオキシダーゼと反応
させジヒドロキシアセトンホスフエート及び
H2O2とし、H2O2を定法で測定する。本発明のこ
の実施形式は次のような反応方程式により明らか
となる： (1)トリグリセリド＋3H2OエステラーゼEC3.1.1 ―――――――――――――――→ グリセリン＋脂肪酸 (2)グリセリン＋ATPGK EC2.7.1.30 ―――――――――――→ 一般式の化合物グリセリン−３−ホスフエート＋ADP (3)グリセリン−３−ホスフエート＋O2GPO ――――→ ジヒドロキシアセトンホスフエート＋H2O2 前記の式が示すように、この際H2O2が生じ、
このH2O2を例えばペルオキシダーゼと共に、フ
エノール及び４−アミノアンチピリンの存在下に
グツド（GOOD）−緩衝液中で直接測定可能な色
素に変換する。 前記反応(3)が酸素使用下に経過するので、
H2O2のかわりにジヒドロキシアセトンホスフエ
ート又は酸素消費量を測定することもできる。 更に、生じたADPを測定することもできる。 この測定は前記の反応方程式(3)を次の方程式(4)
及び(5)により変換する。 (4)ADP＋PEPPK ―――→ ピルベート＋ATP (5)ピルベート＋NADHLDH ――――→ ラクテート＋
NAD+ この際UVで直接NADH減少を追跡できる。 この測定の際にADPをホスホエノールピルベ
ートと、ピルベートキナーゼの存在でピルベート
に変換し、このピルベートを再びNADHとラク
テートデヒドロゲナーゼの存在で反応させ、ラク
テート及びNAD+とする。 本発明のもう１つの実施形によれば、生じたグ
リセリン−３−ホスフエートをNAD+とグリセリ
ンホスフエートデヒドロゲナーゼの存在でジヒド
ロキシアセトンホスフエート及びNADHの形成
下に反応させることにより前記グリセリン−３−
ホスフエートを測定する。該NADHは直接UVで
又はジアホラーゼの存在下にテトラゾリウム塩と
反応させることにより測定するが、その際後者の
場合には生じたホルマザン色素を測定する。 この反応は次の反応方程式(6)及び(7)により表わ
され、これは前記反応方程式(3)のかわりである。 (6)NAD+＋グリセリン−３−ホスフエートグリセ
リンホスフエートデヒドロゲナーゼ ――――――――――――――――――――→ NADH＋ジヒドロキシアセトンホスフエート (7)NADH＋テトラゾリウム塩ジアホラーゼ ―――−――――→ NAD+＋ホルマザン 本発明による方法は有利に非イオン界面活性剤
及び場合により付加的にコール酸群の界面活性剤
の存在で実施することができる。 使用したグリセリンキナーゼの由来に関しては
何ら制限はない。本発明の範囲において使用可能
なグリセリンキナーゼの典型的な例はバチルス・
ステアロテルモフイラス（Bacillus
stearotheromphilus）、大腸菌、カンジダ・ミコ
デルマ（Candidf mycoderma）、ストレプトマ
イセス カヌス（Sireptomyces Canus）、セル
ロモナス種（Cellulmonas species）及び酵母か
らの酵素である。他の生産源からの該酵素は市販
されていない。バチルス・ステアロテルモフイラ
スからの酵素を使用するのが有利である。 本発明のもう１つの課題はグリセリンキナー
ゼ、ATP及びグリセリン−３−ホスフエート又
はADPの測定用のシステム及び場合によりグリ
セリドのエステラーゼを含有するグリセリンの動
力学的測定のための試薬において、付加的に一般
式 〔式中、Ｃ−原子２及び３はＤ−スレオ−配置を
示し、Ｒは炭素原子数１〜３のモノヒドロキシ又
はポリヒドロキシアルキル基を表わす］の糖をグ
リセリンキナーゼの抑制剤として含有するグリセ
リンの動力学的測定試薬である。 本発明による試薬の組成はグリセリン−３−ホ
スフエート又はADPの測定のためにそれぞれ使
用したシステムにより性質的に決められる。 組成の量に関しては方法と関連させた前記の説
明と同じことが言える。こうして該試薬は有利に
一般式の化合物１〜200ｍMol／が得られる。
一般式の有利な化合物はＬ−キシロースであ
る。 グリセリン−３−ホスフエートの測定用システ
ムは有利にグリセリン−ホスフエート−オキシダ
ーゼ及びH2O2又はジヒドロキシアセトンホスフ
エート測定用システムとからなつているか、又は
グリセリンホスフエートデヒドロゲナーゼ、
NAD+、テトラゾリウム塩及びジアホラーゼから
なつている。 H2O2を測定するためのシステムは有利に４−
アミノアンチピリン、フエノール又はフエノール
誘導体、緩衝剤及び界面活性剤からなつている。 本発明による試薬がADPを測定するためのシ
ステムを含有するならばこのシステムは有利にホ
スホエノールピルベート、ピルベートキナーゼ、
NADH及ラクテートデヒドロゲナーゼからなる。 特に有利な組成において、反応方程式１〜３に
相応する本発明による試薬は グリセリンキナーゼ 102〜104U／、 グリセリンホスフエートオキシダーゼ
102〜104U／、 コレステリン・エステラーゼ
103〜２×104U／、 ペルオキシダーゼ 102〜104U／、 Ｌ−キシロース １〜20ｍMol／、 ４−アミノアンチピリン 0.1〜１ｍMol／、 フエノール又はフエノール誘導体
１〜10ｍMol／、 非イオン界面活性剤 １〜20ｇ／、 コール酸群の界面活性剤 ０〜15ｍMol／、 緩衝剤、PH7.5〜8.5 50〜200ｍMol／、 からなる。 緩衝物質としては記載したPH範囲で作用を有す
る緩衝剤を使用する。有利にはグツド（GOOD）
緩衝剤である。 本発明による試薬は常用の分析装置及び自動分
析機での実施に使用することができ、このことに
関しては例において詳説する。この試薬は固体担
体例えば紙テープに含浸させて存在させることも
できる。この場合には色素形成が同様に定量的に
動力学的に測定される。 本発明により使用した抑制剤の作用は添付した
図面からも明らかである。 本発明は血清又は血漿、例えばヘパリン−又は
EDTA血漿中のグリセリンもしくはトリグリセ
リドを測定するために使用することができる。 実施例 例 １ 使用した試薬： トリス／HCl−緩衝剤、PH7.6 0.15Mol／ MgSO4×7H2O 17.5ｍMol／ EDTA、ジナトリウム塩 10ｍMol／ ４−クロルフエノール 3.5ｍMol／ コール酸ナトリウム 0.15％ 界面活性剤 0.12％ ATP ≧0.5ｍMol／ ４−アミノアンチピリン＝0.35ｍMol／ エステラーゼ ≧3U／ml グリセリンホスフエートオキシダーゼ
≧2.5U／ml グリセリンキナーゼ ≧0.2U／ml ペルオキシダーゼ ≧0.15U／ml 測定条件： 波長：Hg546分光光度計：500nｍ キユベツト：層厚１cm 恒温保持温度：20〜25℃又は37℃ RLに対する測定：（吸光上昇） それぞれの測定列に１つの試薬空値（RL）及
び１つのスタンダードで十分である。
【表】
希釈限界は1000mg／dlもしくは11.4ｍMol／
である。より高濃度の試料においては塩化ナトリ
ウム溶液（0.9％）で希釈し（１＋５）、測定を繰
り返す：結果×６。 スタンダードとしてはトリグリセリド200mg／
dlに相当するグリセリン溶液を使用する。 計算： スタンダードによる分析； ｃ〔mg／dl〕＝Ｅ 試料／Ｅ スタンダード×20
0 フアクターによる評価； 試料中のトリグリセリドの濃度を次により計算
である。より高濃度の試料においては塩化ナトリ
ウム溶液（0.9％）で希釈し（１＋５）、測定を繰
り返す：結果×６。 スタンダードとしてはトリグリセリド200mg／
dlに相当するグリセリン溶液を使用する。 計算： スタンダードによる分析； ｃ〔mg／dl〕＝Ｅ 試料／Ｅ スタンダード×20
0 フアクターによる評価； 試料中のトリグリセリドの濃度を次により計算
【表】
例 ２〜７
種々の由来のGKを用いて種々の本発明による
抑制剤を比較実験した： 試薬組成： トリス／HCl、PH7.6 0.1Mol／ グリセリン−ホスフエート−オキシダーゼ
10U／ml ペルオキシダーゼ 1.5U／ml グリセリンキナーゼ 2.0U／ml MgSO4×7H2O 17.5ｍMol／ 抑制剤 表を参照 ４−クロルフエノール 3.5ｍMol／ ４−アミノアチピリン 0.35Mol／ ATP １ｍMol／ 試料：グリセリン水溶液 ６ｍMol／ 試料／試薬の比：１：100（20μ／２ml） 温 度 ：25℃ 測定波長 ：546nｍ （ΔE／分はそれぞれ直線範囲から読みとる）
Ｌ−キシロース、Ｌ−フコース及びＬ−アラビノ
ースを用いバチルス・スチアロテルモフイラスも
しくは大腸菌からの酵素における結果を次の表１
及び２に示す。
抑制剤を比較実験した： 試薬組成： トリス／HCl、PH7.6 0.1Mol／ グリセリン−ホスフエート−オキシダーゼ
10U／ml ペルオキシダーゼ 1.5U／ml グリセリンキナーゼ 2.0U／ml MgSO4×7H2O 17.5ｍMol／ 抑制剤 表を参照 ４−クロルフエノール 3.5ｍMol／ ４−アミノアチピリン 0.35Mol／ ATP １ｍMol／ 試料：グリセリン水溶液 ６ｍMol／ 試料／試薬の比：１：100（20μ／２ml） 温 度 ：25℃ 測定波長 ：546nｍ （ΔE／分はそれぞれ直線範囲から読みとる）
Ｌ−キシロース、Ｌ−フコース及びＬ−アラビノ
ースを用いバチルス・スチアロテルモフイラスも
しくは大腸菌からの酵素における結果を次の表１
及び２に示す。
【表】
第１図及び第２図はそれぞれグリセリンキナー
ゼを使用するグリセリン測定法における測定反応
速度を示したグラフの図である。第１図はバチラ
ス・ステアロテルモフイラスからの酵素を用いて
競合的抑制剤を添加しない場合、及び種々の濃度
の一般式（Ｌ−キシロース）の化合物を添加し
た場合の測定反応速度をグラフで表わした図であ
る。反応試薬の組成は次のようであつた： Ｇ Ｋ 2.0U／ml、 POD 1.5U／ml、 GPO 10U／ml、 ATP １ｍMol／、 ４−クロルフエノール 3.5ｍMol／、 ４−アミノアンチピリン 0.35ｍMol／、 トリス−／HCl−緩衝剤、PH7.6
0.1ｍMol／、 温度25℃；測定波長546nｍ。 この曲線から抑制剤なしのKM0.052ｍMol／
が得られる。抑制剤５ｍMol／ではKM0.24
ｍMol／、抑制剤10ｍMol／ではKM0.43ｍ
Mol／である。第２図は第１図に相当する図で
あるが、大腸菌からの酵素を使用している。抑制
剤を添加しない場合KMは0.042ｍMol／を表わ
し、抑制剤10ｍMol／を添加した場合はKMは
0.16ｍMol／及び抑制剤30ｍMol／を添加し
た場合は0.28ｍMol／を示す。
ゼを使用するグリセリン測定法における測定反応
速度を示したグラフの図である。第１図はバチラ
ス・ステアロテルモフイラスからの酵素を用いて
競合的抑制剤を添加しない場合、及び種々の濃度
の一般式（Ｌ−キシロース）の化合物を添加し
た場合の測定反応速度をグラフで表わした図であ
る。反応試薬の組成は次のようであつた： Ｇ Ｋ 2.0U／ml、 POD 1.5U／ml、 GPO 10U／ml、 ATP １ｍMol／、 ４−クロルフエノール 3.5ｍMol／、 ４−アミノアンチピリン 0.35ｍMol／、 トリス−／HCl−緩衝剤、PH7.6
0.1ｍMol／、 温度25℃；測定波長546nｍ。 この曲線から抑制剤なしのKM0.052ｍMol／
が得られる。抑制剤５ｍMol／ではKM0.24
ｍMol／、抑制剤10ｍMol／ではKM0.43ｍ
Mol／である。第２図は第１図に相当する図で
あるが、大腸菌からの酵素を使用している。抑制
剤を添加しない場合KMは0.042ｍMol／を表わ
し、抑制剤10ｍMol／を添加した場合はKMは
0.16ｍMol／及び抑制剤30ｍMol／を添加し
た場合は0.28ｍMol／を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ グリセリンキナーゼ及び場合によりグリセリ
ドのエステラーゼの存在でATPと反応させグリ
セリン−３−ホスフエート及びADPを形成させ、
これらの反応生成物の１種を少なくとも１種の後
続の酵素反応を用いて測定することにより遊離又
は結合した形のグリセリンを測定するために、該
測定を動力学的に実施する際に、一般式 ［式中、Ｃ−原子２及び３はＤ−スレオ−配置を
示し、Ｒは炭素原子数１〜３のモノヒドロキシ又
はポリヒドロキシアルキル基を表わす］の糖をグ
リセリンキナーゼの抑制剤として添加し、ATP
との反応を全反応の速度を規定する為一次反応と
して進行させることを特徴とするグリセリンの測
定法。 ２ 一般式の化合物１〜200ｍMol／を添加
する特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ 一般式の化合物としてＬ−キシロースを使
用する特許請求の範囲第１項又は第２項記載の方
法。 ４ 微生物バチルス・ステアロテルモフイラスか
らのグリセリンキナーゼを使用する特許請求の範
囲第１項から第３項までのいずれか１項記載の方
法。 ５ グリセリンキナーゼ102〜104U／を使用す
る特許請求の範囲第１項から第４項までのいずれ
か１項記載の方法。 ６ 予め決定した時間間隔で少なくとも２回の測
定を行う特許請求の範囲第１項から第５項までの
いずれか１項記載の方法。 ７ 反応を6.5〜8.5のPH値で緩衝液中で実施する
特許請求の範囲第１項から第６項までのいずれか
１項記載の方法。 ８ 生じたグリセリン−３−ホスフエートをグリ
セリン−３−ホスフエートオキシダーゼを用いて
ジヒドロキシアセトンホスフエート及びH2O2に
変換し、H2O2を測定する特許請求の範囲第１項
から第７項までのいずれか１項記載の方法。 ９ 生じた過酸化水素の測定のために４−アミノ
アンチピリン、フエノール、ペリオキシダーゼ及
びグツド緩衝剤を添加する特許請求の範囲第８項
記載の方法。 １０ 生じたADPをホスホエノールピルベート
とピルベートキナーゼの存在でピルベートの形成
下に反応させ、該ピルベートをNADHとラクテ
ートデヒドロゲナーゼの存在で反応させ、ラクテ
ートとNAD+とし、NADH-減少を測定すること
により、前記ADPを測定する特許請求の範囲第
１項から第７項までのいずれか１項記載の方法。 １１ 生じたグリセリン−３−ホスフエートを
NAD+とグリセリンホスフエートデヒドロゲナー
ゼの存在でジヒドロキシアセトンホスフエート及
びNADHの形成下に反応させ、該NADHをテト
ラゾリウム塩を用いてジアホラーゼの存在で酸化
してホルマザン色素を形成させることにより前記
グリセリン−３−ホスフエートを測定する特許請
求の範囲第１項から第７項までのいずれか１項記
載の方法。 １２ 非イオン界面活性剤及び場合により付加的
にコール酸群の界面活性剤を添加する特許請求の
範囲第１項からの第１１項までのいずれか１項記
載の方法。 １３ グリセリンキナーゼ、ATP、及びグリセ
リン−３−ホスフエート又はADPの測定用シス
テム及び場合によりグリセリドのエステラーゼを
含有するグリセリンの動力学的測定のための試薬
において、付加的に一般式 ［式中、Ｃ−原子２及び３はＤ−スレオ−配置を
示し、Ｒは炭素原子数１〜３のモノヒドロキシ又
はポリヒドロキシアルキル基を表わす］の糖をグ
リセリンキナーゼの抑制剤として含有するグリセ
リンの動力学的測定試薬。 １４ 一般式の化合物１〜200ｍMol／を含
有する特許請求の範囲第１３項記載の試薬。 １５ 一般式の化合物としてＬ−キシロースを
含有する特許請求の範囲第１３項又は第１４項記
載の試薬。 １６ 微生物バチルス・ステアロテルモフイラス
からのグリセリンキナーゼを含有する特許請求の
範囲第１３項から第１５項までのいずれか１項記
載の試薬。 １７ グリセリン−３−ホスフエートを測定する
ためのシステムとしてグリセリンホスフエートオ
キシダーゼと、H2O2又はジヒドロキシアセトン
ホスフエートの測定用システムとを含有する特許
請求の範囲第１３項から第１６項までのいずれか
１項記載の試薬。 １８ H2O2の測定用システムが４−アミノアン
チピリン、フエノール又はフエノールの誘導体、
緩衝剤及び界面活性剤を含有する特許請求の範囲
第１７項記載の試薬。 １９ グリセリン−３−ホスフエートの測定用シ
ステムがグリセリンホスフエートデヒドロゲナー
ゼ、NAD+、テトラゾリウム塩及びジアホラーゼ
からなる特許請求の範囲第１３項から第１６項ま
でのいずれか１項記載の試薬。 ２０ ADPの測定用システムがホスホエノール
ピルベート、ピルベートキナーゼ、NADH及び
ラクテートデヒドロゲナーゼからなる特許請求の
範囲第１３項から第１６項までのいずれか１項記
載の試薬。 ２１ 非イオン界面活性剤を単独で又はコール酸
群の界面活性剤と共に含有する特許請求の範囲第
１３項から第２０項までのいずれか１項記載の試
薬。 ２２ グリセリンキナーゼ 102〜104U／、 グリセリンホスフエートオキシダーゼ
102〜104U／、 コレステリン・エステラーゼ
103〜２×104U／、 ペルオキシダーゼ 102〜104U／、 Ｌ−キシロース １〜20ｍMol／、 ４−アミノアンチピリン 0.1〜１ｍMol／、 フエノール又はフエノール誘導体
１〜10ｍMol／、 非イオン界面活性剤 １〜20ｇ／、 コール酸群の界面活性剤 ０〜15ｍMol／、 緩衝剤、PH6.5〜8.5 50〜200ｍMol／、 を含有する特許請求の範囲第１７項又は第２１項
記載の試薬。 ２３ グツド緩衝剤を含有する特許請求の範囲第
１３項から第２２項までのいずれか１項記載の試
薬。 ２４ 固体担体に含浸されて存在する特許請求の
範囲第１３項から第２３項までのいずれか１項記
載の試薬。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3340709.6 | 1983-11-10 | ||
| DE19833340709 DE3340709A1 (de) | 1983-11-10 | 1983-11-10 | Kompetitiver inhibitor fuer gk |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60118199A JPS60118199A (ja) | 1985-06-25 |
| JPH0455680B2 true JPH0455680B2 (ja) | 1992-09-04 |
Family
ID=6213998
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59233421A Granted JPS60118199A (ja) | 1983-11-10 | 1984-11-07 | グリセリン測定法及び測定試薬 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4705749A (ja) |
| EP (1) | EP0144798B1 (ja) |
| JP (1) | JPS60118199A (ja) |
| AT (1) | ATE54170T1 (ja) |
| CA (1) | CA1235635A (ja) |
| DD (1) | DD228566A5 (ja) |
| DE (2) | DE3340709A1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| BE1000913A3 (fr) * | 1987-09-17 | 1989-05-16 | Univ Wayne State | Composition et procede pour determiner le taux de magnesium de liquides. |
| US5492815A (en) * | 1990-02-20 | 1996-02-20 | Iatron Laboratories, Inc. | Method of determining glucose-6-phosphate and composition therefor |
| CA2037562A1 (en) * | 1990-06-18 | 1991-12-19 | Robert P. Hatch | Detection assays having chromogenic and nonchromogenic, hypochromogenic, bathochromogenic or hypsochromogenic substrates |
| US5334507A (en) * | 1991-09-20 | 1994-08-02 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | Composition for measurement of potassium ion concentration and composition for elimination of ammonium ions |
| US20200300836A1 (en) | 2018-10-12 | 2020-09-24 | Polymer Technology Systems, Inc. | Systems and methods for point-of-care detection of potassium |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2349819A1 (de) * | 1973-10-04 | 1975-04-17 | Eppendorf Geraetebau Netheler | Verfahren zur enzymkinetischen konzentrationsbestimmung eines substrats |
| DE2558536B2 (de) * | 1975-12-24 | 1979-07-12 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren zur kinetischen Substratbestimmung und Reagens zu seiner Durchführung |
| US4218535A (en) * | 1976-03-16 | 1980-08-19 | Beckman Instruments, Inc. | Determination of enzyme substrate concentration |
| DE2950381A1 (de) * | 1979-12-14 | 1981-06-19 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren und reagens zur bestimmulng von triglyceriden |
| US4309502A (en) * | 1980-06-30 | 1982-01-05 | Beckman Instruments, Inc. | Enzymatic assay for glycerol and triglycerides and a reagent for use therein |
| US4338395A (en) * | 1980-07-21 | 1982-07-06 | Technicon Instruments Corporation | Method for the analysis of triglycerides |
| EP0045031A1 (en) * | 1980-07-22 | 1982-02-03 | Baker Instruments Corporation | Glycerol detection reagent and its use |
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- 1983-11-10 DE DE19833340709 patent/DE3340709A1/de not_active Withdrawn
-
1984
- 1984-10-15 CA CA000465463A patent/CA1235635A/en not_active Expired
- 1984-11-01 US US06/667,279 patent/US4705749A/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-11-07 JP JP59233421A patent/JPS60118199A/ja active Granted
- 1984-11-09 DE DE8484113533T patent/DE3482595D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1984-11-09 EP EP84113533A patent/EP0144798B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1984-11-09 AT AT84113533T patent/ATE54170T1/de not_active IP Right Cessation
- 1984-11-09 DD DD84269322A patent/DD228566A5/de not_active IP Right Cessation
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